JP7108318B2 - Biological cell cryopreservation device and biological cell cryopreservation device - Google Patents

Biological cell cryopreservation device and biological cell cryopreservation device Download PDF

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    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology

Description

本発明は、哺乳動物の卵子、胚などの卵、精子、造血幹細胞、多能性幹細胞等の幹細胞などの生体細胞を凍結保存する際に使用する生体細胞凍結保存具および生体細胞凍結保存用具に関する。 The present invention provides a biological cell cryopreservation device and a biological cell cryopreservation device used for cryopreserving biological cells such as mammalian eggs, eggs such as embryos, sperm, hematopoietic stem cells, and stem cells such as pluripotent stem cells. Regarding.

哺乳動物胚の凍結保存は、特定の系統や品種の遺伝資源の保存を可能とする。また、絶滅の危機に瀕している動物種の維持にも有効である。さらに、ヒトの不妊治療においても有用である。
哺乳動物胚の凍結保存方法としては、特開２０００－１８９１５５公報（特許文献１）において、哺乳動物胚または卵子を滅菌処理した凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、これらの胚または卵子を包被するに充分な最少量のガラス化液で貼り付け、この凍結保存用容器を密封し、この容器を液体窒素に接触させて急速に冷却することが提案されている。そして、融解方法では、前記の方法で保存した凍結保存用容器を液体窒素から取り出し、容器の一端部を開口し、この容器内に３３～３９℃の希釈液を直接注入し、胚または卵子の凍結を融解希釈するものである。この方法によれば、哺乳動物胚または卵子をウイルスや細菌による感染のおそれがなく高い生存率で保存および融解希釈することができるという優れた効果を備えている。
しかし、凍結ストロー、凍結バイアルまたは凍結チューブ等の凍結保存用容器の内面に、胚または卵子などの卵を包被するに充分かつ少量のガラス化液で貼り付ける作業が必ずしも容易ではなかった。 Cryopreservation of mammalian embryos allows the preservation of genetic resources of specific strains and breeds. It is also effective in maintaining endangered animal species. Furthermore, it is also useful in treating human infertility.
As a method for cryopreserving mammalian embryos, in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-189155 (Patent Document 1), on the inner surface of a cryopreservation container such as a freezing straw, a freezing vial, or a freezing tube in which mammalian embryos or eggs are sterilized, It has been proposed to apply a minimal amount of vitrification fluid sufficient to envelop the embryos or eggs, seal the cryopreservation container, and rapidly cool the container by contacting it with liquid nitrogen. . Then, in the thawing method, the cryopreservation container preserved by the above method is removed from liquid nitrogen, one end of the container is opened, and a diluent at 33 to 39°C is directly injected into this container to obtain embryos or eggs. Freezing is to thaw and dilute. According to this method, mammalian embryos or eggs can be stored and thawed and diluted with high viability without risk of viral or bacterial infection.
However, it has not always been easy to attach a small amount of vitrifying fluid sufficient to cover an egg such as an embryo or an egg to the inner surface of a cryopreservation container such as a freezing straw, a freezing vial or a freezing tube.

特開２０００－１８９１５５JP 2000-189155 特開２００２－３１５５７３（ＷＯ公開０２－０８５１１０）Japanese Patent Application Laid-Open No. 2002-315573 (WO Publication No. 02-085110) 特開２００４－３２９２０２（ＵＳ公開２００４－０２５９０７２）JP 2004-329202 (US publication 2004-0259072) 特開２０１６－１０３５９（ＵＳ公開２０１７－０１３５３３５）JP 2016-10359 (US publication 2017-0135335)

そこで、本願発明者は、特許文献２（特開２００２－３１５５７３、ＷＯ公開０２－０８５１１０）を提案している。特許文献２の卵凍結保存具１は、耐寒性材料により形成された本体部２と、本体部２の一端に取り付けられ、可撓性かつ透明性かつ液体窒素耐性材料により形成された卵付着保持用ストリップ３と、卵付着保持用ストリップ３を被包可能に本体部２に着脱自在に取り付けられる一端が封鎖され、かつ耐寒性材料により形成された筒状部材４とからなるものである。 Therefore, the inventor of the present application has proposed Patent Document 2 (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2002-315573, WO Publication No. 02-085110). The egg cryopreservation device 1 of Patent Document 2 includes a body portion 2 formed of a cold-resistant material, and an egg attachment holding device attached to one end of the body portion 2 and formed of a flexible, transparent, and liquid nitrogen-resistant material. and a tubular member 4 which is detachably attached to the main body 2 so as to enclose the strip 3 for retaining the adherence of eggs, and which is closed at one end and made of a cold-resistant material.

また、本願発明者は、特許文献３（特開２００４－３２９２０２、ＵＳ公開２００４－０２５９０７２）も提案している。特許文献３の卵凍結保存具１は、耐液体窒素材料で形成された卵凍結保存用チューブ２と、チューブ２を保護するための金属製筒状保護部材３とを備える。チューブ２は、本体部２１と、内径が０．１ｍｍ～０．５ｍｍの卵保存用細径部２２とを備えるとともに、細径部の先端側にてヒートシール可能であり、本体部２１にてヒートシール可能である。筒状保護部材３は、チューブ２の細径部２２の先端部を収納する筒状部３１と、細径部２２の筒状部３１に収納されない部分および本体部２１の先端部２１ａを収納する半筒状部３２とを備えている。
また、特開２０１６－１０３５９（特許文献４、ＵＳ公開２０１７－０１３５３３５）には、支持体上に、接着層とガラス化液吸収層を少なくともこの順に有するガラス化液吸収体を有し、ガラス化液吸収層の細胞又は組織を載置する部分と支持体の間に接着層が存在しない部分を有する細胞又は組織のガラス化凍結保存用治具が開示されている。The inventor of the present application has also proposed Patent Document 3 (Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-329202, US Publication No. 2004-0259072). An egg cryopreservation device 1 of Patent Document 3 includes an egg cryopreservation tube 2 made of a liquid nitrogen-resistant material, and a metallic cylindrical protective member 3 for protecting the tube 2 . The tube 2 includes a body portion 21 and a small diameter portion 22 for storing eggs having an inner diameter of 0.1 mm to 0.5 mm. It is heat sealable. The tubular protection member 3 accommodates a tubular portion 31 that accommodates the distal end portion of the small diameter portion 22 of the tube 2, a portion of the small diameter portion 22 that is not accommodated in the tubular portion 31, and the distal end portion 21a of the body portion 21. and a semi-cylindrical portion 32 .
Further, in JP 2016-10359 (Patent Document 4, US Publication 2017-0135335), a vitrification liquid absorber having at least an adhesive layer and a vitrification liquid absorption layer in this order is provided on a support, and vitrification Disclosed is a jig for vitrification and cryopreservation of cells or tissues, which has a part without an adhesive layer between a part of a liquid-absorbing layer on which cells or tissues are placed and a support.

特許文献２、３および４の卵凍結保存具は、有効である。また、特許文献４のものでは、ガラス化液吸収層が透明でないため、透過型顕微鏡を用いて、細胞の載置作業を行う際、ガラス化液吸収層の上面にピペットの先端部を配置したとき、その先端が視認しにくく、作業性が悪いものであった。このため、より容易に卵凍結操作が行える卵凍結保存具が望まれている。 The egg cryopreservation devices of Patent Documents 2, 3 and 4 are effective. In Patent Document 4, since the vitrification liquid absorption layer is not transparent, the tip of the pipette was placed on the upper surface of the vitrification liquid absorption layer when performing the cell mounting operation using a transmission microscope. At that time, the tip was difficult to visually recognize, resulting in poor workability. Therefore, there is a demand for an egg cryopreservation tool that allows easier egg freezing operations.

本発明の目的は、生体細胞凍結保存具への生体細胞載置操作が容易であり、かつ、過剰なガラス化液が滴下されても、その除去操作が不要であり、生体細胞の凍結を迅速に行うことができる生体細胞凍結保存具を提供するものである。 An object of the present invention is to facilitate the operation of placing living cells on a living cell cryopreservation device, and to eliminate the need for removing the excess vitrification liquid even if it is dropped, and to quickly freeze the living cells. To provide a living cell cryopreservation device that can be used for

上記目的を達成するものは、以下のものである。
耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
前記生体細胞保持部は、光透過性を有するベース部と、前記ベース部の表面に固定された吸水部と、前記吸水部により取り囲まれた欠損部とを備え、
前記吸水部は、光難透過性シートからなり、前記ベース部は、細長い平坦シート状であり、前記欠損部は、光難透過性シートである前記吸水部により取り囲まれた円状または多角形状となっており、さらに、前記欠損部は、前記ベース部の前記表面が露出した光透過性を有する平坦な生体細胞載置部位を形成しており、かつ、透過型顕微鏡を用いた生体細胞の載置作業を行う際に、光難透過性である前記吸水部により取り囲まれ、光が透過する前記生体細胞載置部位が前記生体細胞を載置するターゲットを形成する生体細胞凍結保存具。 What achieves the above objectives is the following.
A biological cell cryopreservation device comprising a body portion made of a cold-resistant material and a biological cell holding portion made of a cold-resistant material,
The biological cell holding portion includes a base portion having optical transparency, a water absorbing portion fixed to the surface of the base portion, and a defective portion surrounded by the water absorbing portion,
The water-absorbing portion is made of a light-impermeable sheet, the base portion is in the shape of an elongated flat sheet, and the missing portion has a circular or polygonal shape surrounded by the water-absorbing portion, which is the light-impermeable sheet. Further, the defective portion forms a flat living cell placement portion having light transmissivity in which the surface of the base portion is exposed, and the living cell can be examined using a transmission microscope. A biological cell cryopreservation device , wherein the biological cell mounting portion, through which light is transmitted, surrounded by the light-impermeable water absorbing portion forms a target on which the biological cells are mounted when the mounting work is performed .

また、上記目的を達成するものは、以下のものである。
上記のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具と、前記生体細胞凍結保存具を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材とを備える生体細胞凍結保存用具。Moreover, what achieves the above purpose is as follows.
A biological cell cryopreservation device, comprising: the biological cell cryopreservation device according to any one of the above; and a cylindrical storage member which is capable of containing the biological cell cryopreservation device and which is made of a cold-resistant material and whose one end is closed.

図１は、本発明の実施例の生体細胞凍結保存具の正面図である。FIG. 1 is a front view of a biological cell cryopreservation device according to an embodiment of the present invention. 図２は、図１に示した生体細胞凍結保存具の左側面図である。2 is a left side view of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 1. FIG. 図３は、図１に示した生体細胞凍結保存具の縦断面図である。3 is a longitudinal sectional view of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 1. FIG. 図４は、図１に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大図である。4 is an enlarged view of the biological cell holding portion of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 1. FIG. 図５は、図２に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大図である。5 is an enlarged view of the biological cell holding portion of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 2. FIG. 図６は、図５に示した生体細胞凍結保存具の縦断面図である。6 is a longitudinal sectional view of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 5. FIG. 図７は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大正面図である。FIG. 7 is an enlarged front view of a living cell holding portion of a living cell cryopreservation device according to another embodiment of the present invention. 図８は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大正面図である。FIG. 8 is an enlarged front view of a biological cell holding portion of a biological cell cryopreservation device according to another embodiment of the present invention. 図９は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大断面図である。FIG. 9 is an enlarged cross-sectional view of a biological cell holding portion of a biological cell cryopreservation device according to another embodiment of the present invention. 図１０は、本発明の生体細胞凍結保存用具に使用される一例の筒状収納部材の正面図である。FIG. 10 is a front view of an exemplary cylindrical storage member used in the biological cell cryopreservation tool of the present invention. 図１１は、本発明の実施例の生体細胞凍結保存用具の正面図である。FIG. 11 is a front view of the biological cell cryopreservation tool of the example of the present invention. 図１２は、図１１のＡ－Ａ線断面図である。12 is a cross-sectional view taken along the line AA of FIG. 11. FIG. 図１３は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の正面図である。FIG. 13 is a front view of a living cell cryopreservation device according to another embodiment of the present invention. 図１４は、図１３に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大正面図である。14 is an enlarged front view of the biological cell holding portion of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 13. FIG. 図１５は、図１３に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大左側面図である。15 is an enlarged left side view of the biological cell holding portion of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 13. FIG. 図１６は、図１５に示した生体細胞凍結保存具の縦断面図である。16 is a longitudinal sectional view of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 15. FIG. 図１７は、図１３に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大図である。17 is an enlarged view of the biological cell holding portion of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 13. FIG. 図１８は、図１３に示した生体細胞凍結保存具を先端側から見た拡大作用説明図である。FIG. 18 is an explanatory view of the action of enlarging the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 13 as seen from the distal end side. 図１９は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存用具の説明図である。FIG. 19 is an explanatory diagram of a biological cell cryopreservation tool according to another embodiment of the present invention. 図２０は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具を先端側から見た拡大作用説明図である。FIG. 20 is an explanatory view of the enlarged action of the biological cell cryopreservation device of another embodiment of the present invention, viewed from the distal end side. 図２１は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の正面図である。FIG. 21 is a front view of a biological cell cryopreservation device according to another embodiment of the present invention. 図２２は、図２１に示した生体細胞凍結保存具の左側面図である。22 is a left side view of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 21. FIG. 図２３は、図２１に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大図である。23 is an enlarged view of the biological cell holding portion of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 21. FIG. 図２４は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の正面図である。FIG. 24 is a front view of a living cell cryopreservation device according to another embodiment of the present invention. 図２５は、図２４に示した生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大図である。25 is an enlarged view of the biological cell holding portion of the biological cell cryopreservation device shown in FIG. 24. FIG. 図２６は、本発明の他の実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部の拡大正面図である。FIG. 26 is an enlarged front view of a biological cell holding portion of a biological cell cryopreservation device according to another embodiment of the present invention.

本発明の生体細胞凍結保存具を図面に示す実施例を用いて説明する。
本発明の生体細胞凍結保存具１は、耐寒性材料により形成された本体部２と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部３とを備える。生体細胞保持部３は、光透過性を有するベース部３１と、ベース部３１の表面に固定された吸水部３２とを備える。吸水部３２は、吸水部３２により取り囲まれた欠損部（言い換えれば、吸水部３２の中に設けられた欠損部）３３を備え、欠損部３３において、ベース部３１の表面が露出し、光透過性を有している。
特に、この実施例の細胞凍結保存具１は、卵凍結保存具であり、生体細胞保持部３は、卵保持部となっている。なお、本発明の細胞凍結保存具は、胚などの卵、卵子、精子、造血幹細胞、多能性幹細胞等の幹細胞などの細胞、特に上記のような生体細胞を凍結保存するために用いることができる。
また、本発明の生体細胞凍結保存用具１０は、上記の生体細胞凍結保存具１と、生体細胞凍結保存具１を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材４とを備える。
なお、本発明の生体細胞凍結保存具１は、筒状収納部材４を使用せず、生体細胞凍結保存具単独としても卵凍結保存に使用することができる。 The biological cell cryopreservation device of the present invention will be described using the examples shown in the drawings.
A biological cell cryopreservation device 1 of the present invention includes a body portion 2 made of a cold-resistant material, and a biological cell holding portion 3 made of a cold-resistant material. The biological cell holding portion 3 includes a base portion 31 having optical transparency and a water absorbing portion 32 fixed to the surface of the base portion 31 . The water absorbing portion 32 includes a cutout portion 33 surrounded by the water absorbing portion 32 (in other words, a cutout portion provided in the water absorbing portion 32). have a sexuality.
In particular, the cell cryopreservation device 1 of this embodiment is an egg cryopreservation device, and the biological cell holding section 3 is an egg holding section. The cell cryopreservation device of the present invention can be used for cryopreserving cells such as eggs such as embryos, ova, sperm, hematopoietic stem cells, stem cells such as pluripotent stem cells, and particularly the above-described biological cells. can.
Further, the biological cell cryopreservation device 10 of the present invention comprises the above-described biological cell cryopreservation device 1, and a cylindrical storage member 4 which is capable of containing the biological cell cryopreservation device 1 and which is formed of a cold-resistant material and whose one end is closed. Prepare.
The biological cell cryopreservation device 1 of the present invention can be used for cryopreservation of eggs even as a biological cell cryopreservation device alone without using the cylindrical housing member 4 .

生体細胞凍結保存具１は、図１ないし図６に示すように、耐寒性材料により形成された本体部２と、本体部２の一端に取り付けられた耐寒性材料により形成された生体細胞保持部３とを備える。生体細胞保持部３は、光透過性を有するベース部３１と、ベース部３１の表面に固定された吸水部３２とを備える。吸水部３２は、吸水部３２により取り囲まれた欠損部３３を備える。 As shown in FIGS. 1 to 6, the biological cell cryopreservation device 1 includes a main body 2 made of a cold-resistant material, and a biological cell holder made of a cold-resistant material attached to one end of the main body 2. 3. The biological cell holding portion 3 includes a base portion 31 having optical transparency and a water absorbing portion 32 fixed to the surface of the base portion 31 . The water absorbing portion 32 has a cutout portion 33 surrounded by the water absorbing portion 32 .

この実施例の生体細胞凍結保存具１では、図１ないし図３に示すように、本体部２は、細長い棒状の本体部となっている。また、この実施例の生体細胞凍結保存具１では、生体細胞保持部３の光透過性を有するベース部３１は、可撓性かつ透明性かつ耐寒性（具体的には、液体窒素耐性）材料により形成されており、この実施例では、細長い平坦シート状のものとなっている。 In the biological cell cryopreservation device 1 of this embodiment, as shown in FIGS. 1 to 3, the main body 2 is an elongated rod-shaped main body. Further, in the biological cell cryopreservation device 1 of this embodiment, the base portion 31 of the biological cell holding portion 3 having optical transparency is made of a flexible, transparent and cold-resistant (specifically, liquid nitrogen-resistant) material. , and in this embodiment is in the form of an elongated flat sheet.

本体部２は、図１ないし図３に示すように、生体細胞保持部３（ベース部３１）の一端を保持している。本体部の長さとしては、５０～２００ｍｍ程度が好適である。また、本体部の幅としては、２～７ｍｍ程度が好適であり、厚さは、１～７ｍｍ程度が好適である。本体部２は、主軸部２１と、主軸部２１の先端部に設けられた生体細胞保持部３（ベース部３１）を保持する保持部２２と、本体部２の後端部に設けられた把持部２３と、主軸部２１と把持部２３間に設けられたテーパー部２４とを備えている。この実施例の生体細胞凍結保存具１では、把持部２３を除き、後述する筒状収納部材４内に、収納可能であり、テーパー部２４は、筒状収納部材４の開口部と係合可能なものとなっている。 As shown in FIGS. 1 to 3, the body portion 2 holds one end of the living cell holding portion 3 (base portion 31). The length of the main body is preferably about 50 to 200 mm. The width of the main body is preferably about 2 to 7 mm, and the thickness is preferably about 1 to 7 mm. The body portion 2 includes a main shaft portion 21 , a holding portion 22 that holds a biological cell holding portion 3 (base portion 31 ) provided at the distal end portion of the main shaft portion 21 , and a grip provided at the rear end portion of the main body portion 2 . and a tapered portion 24 provided between the main shaft portion 21 and the grip portion 23 . The biological cell cryopreservation device 1 of this embodiment can be stored in a cylindrical storage member 4 described later, except for the grip portion 23, and the tapered portion 24 can be engaged with the opening of the cylindrical storage member 4. It is a thing.

本体部２は、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート、ポリブチレンテレフタレート）、ポリオレフィン（例えば、ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン、ポリプロピレン、エチレン－プロピレン共重合体、エチレン－酢酸ビニル共重合体）、スチレン系樹脂（例えば、ポリスチレン、メタクリレート－スチレン共重合体、メタクリレート－ブチレン－スチレン共重合体）、ポリアミド（例えば、６ナイロン，６６ナイロン）、ポリサルホン、フッ素樹脂、ポリイミド等の耐寒性樹脂が使用され、特に、液体窒素の温度に耐え得るものが好ましい。 The main body 2 is made of polyester (eg, polyethylene terephthalate, polybutylene terephthalate), polyolefin (eg, polyethylene, ultra-high molecular weight polyethylene, polypropylene, ethylene-propylene copolymer, ethylene-vinyl acetate copolymer), styrene resin ( For example, cold-resistant resins such as polystyrene, methacrylate-styrene copolymer, methacrylate-butylene-styrene copolymer), polyamide (eg, 6 nylon, 66 nylon), polysulfone, fluororesin, and polyimide are used. Those that can withstand the temperature of nitrogen are preferred.

この実施例では、ベース部３１は、細長い平坦シート状のものとなっている。ベース部３１は、生体細胞（例えば、卵）の付着作業を容易にするために、光透過性、好ましくは、透明性を有する平坦シート状のものが好ましい。特に、無色透明の平坦シートが好ましい。さらには、可撓性を有するものであってもよい。 In this embodiment, the base portion 31 is in the form of an elongated flat sheet. The base portion 31 is preferably in the form of a flat sheet having light transmittance, preferably transparency, in order to facilitate attachment of living cells (for example, eggs). A colorless and transparent flat sheet is particularly preferred. Furthermore, it may have flexibility.

生体細胞保持部３の先端部には、マーカー３４が設けられている。マーカー３４は、生体細胞保持部３の先端部の一方の表面（具体的には、吸水シートまたはベース部の表面）に、有色を付する（油性インクで着色する）ことにより形成される。ベース部３１の長さは、１０～７０ｍｍ程度、幅０．５～４．０ｍｍ程度、厚さが０．０１～０．５ｍｍ程度のものが用いられる。そして、ベース部３１は、基端部が、上述した本体部２の保持部２２に固着されている。 A marker 34 is provided at the tip of the biological cell holding section 3 . The marker 34 is formed by coloring one surface (specifically, the surface of the water-absorbing sheet or the base portion) of the tip portion of the living cell holding portion 3 (coloring with oil-based ink). The length of the base portion 31 is about 10 to 70 mm, the width is about 0.5 to 4.0 mm, and the thickness is about 0.01 to 0.5 mm. The base portion 31 has its base end portion fixed to the holding portion 22 of the main body portion 2 described above.

ベース部３１に使用されるシート形成材料としては、光透過性を有する樹脂シート、例えば、３－フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル（例えば、ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂からなるフィルムあるいはそれらの積層体が挙げられる。特に、耐寒性、具体的には、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。 The sheet-forming material used for the base portion 31 includes a resin sheet having optical transparency, such as 3-fluoropolyethylene, low-density polyethylene, medium-density polyethylene, high-density polyethylene, polycarbonate, nylon, polysulfone, polyester (for example, , PET), polystyrene, polyimide, ultra-high molecular weight polyethylene, ethylene-vinyl acetate copolymer, and other synthetic resin films or laminates thereof. In particular, cold-resistant, specifically liquid nitrogen-resistant materials, in other words, materials that do not become embrittled when in contact with liquid nitrogen are preferred.

そして、本発明の生体細胞凍結保存具１では、図１、図４ないし図６に示すように、光透過性を有するベース部３１表面に固定された吸水部３２を備える。さらに、吸水部３２は、吸水部３２により取り囲まれた欠損部３３を備える。そして、欠損部３３において、ベース部３１の表面が露出し、光透過性を有している。欠損部３３におけるベース部３１の表面が、生体細胞載置部位として有効に使用できる。吸水部３２の幅は、ベース部の幅と同じ～２／３程度であることが好ましい。また、吸水部３２の長さは、５～７０ｍｍが好ましく、特に、１０～５０ｍｍが好ましい。 As shown in FIGS. 1 and 4 to 6, the biological cell cryopreservation device 1 of the present invention includes a water absorbing portion 32 fixed to the surface of the base portion 31 having optical transparency. Furthermore, the water absorbing portion 32 has a cutout portion 33 surrounded by the water absorbing portion 32 . The surface of the base portion 31 is exposed at the cutout portion 33 and has light transmission properties. The surface of the base portion 31 in the defect portion 33 can be effectively used as a biological cell mounting portion. The width of the water absorbing portion 32 is preferably about 2/3 the width of the base portion. Moreover, the length of the water absorbing portion 32 is preferably 5 to 70 mm, particularly preferably 10 to 50 mm.

また、この実施例の生体細胞凍結保存具１では、図５に示すように、生体細胞保持部３は、複数の欠損部（細胞載置部位）３３を備えている。具体的には、生体細胞保持部３の長手方向に、複数設けられている。具体的には、５つの欠損部（細胞載置部位）３３が設けられている。欠損部（細胞載置部位）３３の数としては、１～７程度が好ましく、特に、２～５が好適である。欠損部の大きさとしては、円形の場合、直径が．０．５～１．５ｍｍ程度が好適である。 In addition, in the biological cell cryopreservation device 1 of this embodiment, the biological cell holding section 3 has a plurality of defective sections (cell placement sections) 33, as shown in FIG. Specifically, a plurality of them are provided in the longitudinal direction of the biological cell holding section 3 . Specifically, five defective parts (cell placement parts) 33 are provided. The number of defective portions (cell placement sites) 33 is preferably about 1 to 7, particularly preferably 2 to 5. As for the size of the defect, in the case of a circular shape, the diameter is . About 0.5 to 1.5 mm is suitable.

また、欠損部３３は、円状または多角形状であることが好ましく、特に、円形、楕円形であることが好ましい。さらに、吸水部３２は、光難透過性シートであることが好ましい。このようなものとすることにより、透過型顕微鏡を用いた生体細胞の載置作業を行う際に、吸水部３２が難透過性であり、欠損部３３には光が透過するため、細胞を載置するターゲットである欠損部（細胞載置部位）３３が浮かび上がるように見え、ターゲットの認識が極めて容易である。 Moreover, the cutout portion 33 is preferably circular or polygonal, and particularly preferably circular or elliptical. Furthermore, the water absorbing portion 32 is preferably a light-impermeable sheet . With such a configuration, when a living cell is placed using a transmission microscope, the water absorbing portion 32 is impermeable and the defective portion 33 allows light to pass through, so that the cell can be placed. A defective portion (cell placement site) 33, which is a target to be placed, appears to emerge, and recognition of the target is extremely easy.

また、この実施例の生体細胞凍結保存具１では、図５に示すように、吸水部３２は、欠損部３３を除き、ベース部３１の先端部の一方の表面の全体を覆うものとなっている。このようなものとすることにより、欠損部（細胞載置部位）３３の認識がより容易となる。 Moreover, in the biological cell cryopreservation device 1 of this embodiment, as shown in FIG. there is By doing so, recognition of the defective portion (cell placement portion) 33 becomes easier.

吸水部３２は、その全体もしくは一部が、ベース部３１の表面に固定されている。吸水部３２は、耐寒性材料により形成されている。吸水部３２のベース部３１への固定は、接着剤、両面テープなどの接着性物質により行うことが好ましい。なお、部分的なヒートシールによって、固定してもよい。 The water absorbing portion 32 is fixed to the surface of the base portion 31 in whole or in part. The water absorbing portion 32 is made of a cold-resistant material. It is preferable to fix the water absorbing portion 32 to the base portion 31 with an adhesive substance such as an adhesive or double-sided tape. In addition, you may fix by a partial heat seal.

吸水部としては、繊維からなるシート、多孔性樹脂シートなどの各種シートが使用できる。吸水部の厚みは１０μｍ～５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２０μｍ～２．５ｍｍである。そして、繊維からなるシートとしては、紙又は不織布が使用できる。 Various sheets such as a fiber sheet and a porous resin sheet can be used as the water absorbing portion. The thickness of the water absorbing portion is preferably 10 μm to 5 mm, more preferably 20 μm to 2.5 mm. Paper or non-woven fabric can be used as the sheet made of fibers.

吸水部として紙を用いる場合、紙としては、密度が０．１～０．６ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０～１３０ｇ／ｍ２の紙であることが好ましい。特に密度が０．１２～０．３ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０～１００ｇ／ｍ２である紙は、保存液の吸収性に優れ、さらには、透過型顕微鏡を用いて載置部上に載置した細胞又は組織を観察することができるような、細胞又は組織の視認性に優れた凍結保存用治具を提供することが可能となるため好ましい。When paper is used as the water absorbing portion, the paper preferably has a density of 0.1 to 0.6 g/cm 3 and a basis weight of 10 to 130 g/m 2 . In particular, paper with a density of 0.12 to 0.3 g/cm 3 and a basis weight of 10 to 100 g/m 2 is excellent in the absorption of the storage solution, and furthermore, it can be measured by using a transmission microscope. It is preferable because it is possible to provide a jig for cryopreservation with excellent visibility of cells or tissues such that the cells or tissues placed thereon can be observed.

吸水部として不織布を用いる場合、不織布を形成する繊維としては、セルロース繊維、セルロース繊維からなる再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、さらにはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維、ポリエステル繊維、ナイロン繊維、アクリル繊維、ポリプロピレン繊維、ポリエチレン繊維、ポリ塩化ビニル繊維、ビニリデン繊維、ポリウレタン繊維、ビニロン繊維、ガラス繊維、絹繊維などが挙げられ、これら繊維を各種混合した不織布も用いることができる。中でもセルロース繊維、セルロース繊維由来の繊維でセルロース再生繊維であるレーヨン繊維やキュプラ繊維、更にはセルロース繊維からの半合成繊維であるアセテート繊維が好ましい。また、不織布としては、密度が０．１～０．４ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０～１３０ｇ／ｍ２の不織布であることが好ましい。特に密度が０．１２～０．３ｇ／ｃｍ３であり、坪量が１０～１００ｇ／ｍ２であるものが好ましい。When a nonwoven fabric is used as the water absorbing portion, the fibers forming the nonwoven fabric include cellulose fibers, rayon fibers and cupra fibers that are regenerated fibers made of cellulose fibers, acetate fibers that are semi-synthetic fibers made from cellulose fibers, polyester fibers, Examples include nylon fibers, acrylic fibers, polypropylene fibers, polyethylene fibers, polyvinyl chloride fibers, vinylidene fibers, polyurethane fibers, vinylon fibers, glass fibers, silk fibers, etc. Non-woven fabrics in which various types of these fibers are mixed can also be used. Among them, cellulose fibers, rayon fibers and cupra fibers, which are regenerated cellulose fibers derived from cellulose fibers, and acetate fibers, which are semi-synthetic fibers from cellulose fibers, are preferable. The nonwoven fabric preferably has a density of 0.1 to 0.4 g/cm 3 and a basis weight of 10 to 130 g/m 2 . In particular, it is preferable that the density is 0.12 to 0.3 g/cm 3 and the basis weight is 10 to 100 g/m 2 .

吸水部として、使用可能な多孔性樹脂シートとしては、例えば特公昭４２－１３５６０号公報や、特開平０８－２８３４４７号公報に記載される、少なくとも一軸方向に延伸し、樹脂の融点以上に加熱し焼結することで得た微細繊維状構造により多孔質構造を形成した樹脂シート、特開２００９－２３５４１７号公報（ＷＯ公開０３－０１４２０５、ＵＳＰ７７５８９５３、ＵＳＰ８１１０２８９）に記載される、乳化重合又は粉砕等の方法によって得られた熱可塑性樹脂の固体粉末を金型に充填し、加熱、焼結して粉末粒子表面を融着させて冷却することにより、多孔質構造を形成した樹脂シート等が挙げられる。 Porous resin sheets that can be used as the water absorbing portion include, for example, those described in JP-B-42-13560 and JP-A-08-283447. A resin sheet having a porous structure formed by a fine fibrous structure obtained by sintering, described in JP-A-2009-235417 (WO Publication 03-014205, USP7758953, USP8110289), emulsion polymerization or pulverization. A resin sheet having a porous structure formed by filling a mold with a solid powder of a thermoplastic resin obtained by the method, heating and sintering to fuse the surfaces of the powder particles, and cooling may be used.

上記した多孔性樹脂シートを形成する樹脂としては、低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子ポリエチレン等の各種ポリエチレンやポリプロピレン、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレンやポリビニリデンジフロライド等のフッ素樹脂、エチレン－酢酸ビニル共重合体、ポリアミド、スチレン－アクリロニトリル共重合体、スチレン－ブタジエン－アクリロニトリル三元共重合体、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等が挙げられる。 Examples of resins for forming the above porous resin sheet include various types of polyethylene such as low-density polyethylene, high-density polyethylene, ultra-high molecular weight polyethylene, polypropylene, polymethyl methacrylate, polystyrene, polytetrafluoroethylene, polyvinylidene difluoride, and the like. Fluororesins, ethylene-vinyl acetate copolymers, polyamides, styrene-acrylonitrile copolymers, styrene-butadiene-acrylonitrile terpolymers, polycarbonates, polyvinyl chloride and the like.

なお、吸水部３２の形態としては、上記のものに限定されるものではない。例えば、図７に示す生体細胞保持部３ａのように、生体細胞保持部３ａの側部に、ベース部露出部３５を有するものであってもよい。この実施例のものでは、生体細胞保持部３ａは、吸水部３２ａの両側部に生体細胞保持部３ａの長手方向に延びる向かい合う２つのベース部露出部３５を有している。 Note that the form of the water absorbing portion 32 is not limited to the above. For example, like the living cell holding portion 3a shown in FIG. 7, the living cell holding portion 3a may have a base exposed portion 35 on the side thereof. In this embodiment, the living cell holding portion 3a has two facing base exposed portions 35 extending in the longitudinal direction of the living cell holding portion 3a on both sides of the water absorbing portion 32a.

また、図８に示す生体細胞保持部３ｂのように、中央部に欠損部３３を有する個別吸水部３２ｂが複数設けられたものであってもよい。この実施例では、個別吸水部３２ｂは、円形状のものとなっており、内部に円形状の欠損部３３を備えている。そして、複数の個別吸水部３２ｂが、ベース部３１の表面に固定されている。また、個別吸水部３２ｂの外側および欠損部３３において、ベース部３１の表面は、露出している。なお、個別吸水部３２ｂの形状は、円形に限定されるものではなく、楕円状のもの、矩形状のもの、多角形状のものであってもよい。 Moreover, like the biological cell holding portion 3b shown in FIG. 8, a plurality of individual water absorbing portions 32b having a cutout portion 33 in the central portion may be provided. In this embodiment, the individual water absorbing portion 32b is circular and has a circular cutout portion 33 inside. A plurality of individual water absorbing portions 32 b are fixed to the surface of the base portion 31 . Further, the surface of the base portion 31 is exposed outside the individual water absorbing portion 32b and at the cutout portion 33. As shown in FIG. The shape of the individual water absorbing portion 32b is not limited to a circular shape, and may be an elliptical shape, a rectangular shape, or a polygonal shape.

また、図９に示す実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部３ｃのように、吸水部３２ｃは、所定の厚さ（高さ）を有するものであってもよい。この場合、吸水部３２ｃの厚さ（高さ）としては、２～７ｍｍ程度が好適であり、特に、２～５ｍｍが好ましい。このように、吸水部３２ｃがある程度の厚さを有する場合、欠損部３３ａにおける吸水部３２ｃの内面とベース部３１の上面により、細胞収納部が形成され、細胞の離出が抑制される。 Moreover, like the living cell holding portion 3c of the living cell cryopreservation device of the embodiment shown in FIG. 9, the water absorbing portion 32c may have a predetermined thickness (height). In this case, the thickness (height) of the water absorbing portion 32c is preferably about 2 to 7 mm, particularly preferably 2 to 5 mm. In this way, when the water absorbing portion 32c has a certain thickness, the inner surface of the water absorbing portion 32c and the upper surface of the base portion 31 at the cutout portion 33a form a cell storage portion, thereby suppressing the release of cells.

筒状収納部材４は、図１０ないし図１２に示すように、生体細胞保持部３を被包可能に本体部２に着脱自在に取り付けられるものであり、一端が封鎖され、かつ耐寒性材料により形成されたものである。特に、この実施例の筒状収納部材４は、筒状本体４１と、その一端部内に収納された封止部材４２とを備える。筒状本体４１の一端部は、収納する封止部材(具体的には、通気性封止部材）４２により通気可能に封止されている。 As shown in FIGS. 10 to 12, the cylindrical housing member 4 is detachably attached to the main body 2 so as to enclose the living cell holding section 3. It is formed. In particular, the tubular housing member 4 of this embodiment comprises a tubular body 41 and a sealing member 42 housed within one end thereof. One end of the cylindrical main body 41 is air-permeably sealed by a sealing member (specifically, an air-permeable sealing member) 42 to accommodate.

さらに、この実施例の筒状収納部材４では、筒状本体４１の先端部には、錘４３が収納されている。錘４３は、封止部材４２よりも先端側に収納されている。錘４３を設けることにより、液体窒素タンクに投入された筒状収納部材４は、その先端側が下方を確実に向くものとなる。また、筒状収納部材４は、生体細胞保持部３に接触することなく被包できる内径および長さを備えている。また、筒状本体４１は、後端（開口部）の外面には、開口部の認識を容易とするための着色部４４を備えている。 Further, in the tubular storage member 4 of this embodiment, a weight 43 is accommodated at the tip of the tubular main body 41 . The weight 43 is housed on the tip side of the sealing member 42 . By providing the weight 43, the tip side of the cylindrical storage member 4 put into the liquid nitrogen tank is surely directed downward. In addition, the cylindrical storage member 4 has an inner diameter and a length that can enclose the living cell holding part 3 without coming into contact with it. In addition, the tubular body 41 has a colored portion 44 on the outer surface of the rear end (opening) for facilitating recognition of the opening.

筒状収納部材４の形成材料としては、例えば、３－フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル（例えば、ＰＥＴ）、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂からなるフィルムあるいはそれらの積層体が挙げられる。特に、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。 Materials for forming the cylindrical storage member 4 include, for example, 3-fluorinated polyethylene, low-density polyethylene, medium-density polyethylene, high-density polyethylene, polycarbonate, nylon, polysulfone, polyester (eg, PET), polystyrene, polyimide, and ultra-high density polyethylene. Examples thereof include films made of synthetic resins such as molecular weight polyethylene and ethylene-vinyl acetate copolymer, and laminates thereof. Particularly preferred are liquid nitrogen resistant materials, in other words, materials that do not embrittle when in contact with liquid nitrogen.

次に、本発明の生体細胞凍結保存具１および生体細胞凍結保存用具１０の使用方法について説明する。
この説明では、生体細胞である卵子を凍結保存する場合を例にとり説明する。
まず、ピペットの先端に卵子を採取し、卵子の細胞内液を平衡液に置換する作業を行い、さらに、細胞外液をガラス化液に置換する作業を行う。そして、顕微鏡下において、本発明の生体細胞凍結保存具１の生体細胞保持部３に設けられた吸水部３２の欠損部３３に卵子を少量のガラス化液とともに配置させ、ベース部材３１の表面に付着させる。卵子が付着した生体細胞凍結保存具１の生体細胞保持部をあらかじめ準備しておいた液体窒素に浸漬し凍結（ガラス化）させる。そして、筒状収納部材４内に、卵子が付着した生体細胞凍結保存具１を挿入し、収納容器（図示せず）内に、生体細胞凍結保存具１を収納した筒状収納部材４を収納させ、続いて、収納容器を液体窒素タンク内に入れ保存する。 Next, a method for using the biological cell cryopreservation tool 1 and the biological cell cryopreservation tool 10 of the present invention will be described.
In this description, the case of cryopreserving an ovum, which is a living cell, will be described as an example.
First, an egg is collected at the tip of a pipette, the intracellular fluid of the egg is replaced with the equilibrium solution, and then the extracellular fluid is replaced with the vitrification fluid. Then, under a microscope, the ovum and a small amount of vitrification liquid are placed in the defective portion 33 of the water absorbing portion 32 provided in the biological cell holding portion 3 of the biological cell cryopreservation device 1 of the present invention, and the ovum is placed on the surface of the base member 31. Attach. The biological cell holding portion of the biological cell cryopreservation device 1 to which the ovum is attached is immersed in liquid nitrogen prepared in advance and frozen (vitrified). Then, the biological cell cryopreservation device 1 to which the ova are attached is inserted into the cylindrical storage member 4, and the cylindrical storage member 4 containing the biological cell cryopreservation device 1 is stored in a storage container (not shown). Then, the storage container is stored in a liquid nitrogen tank.

また、本発明の生体細胞凍結保存具および生体細胞凍結保存用具としては、図２１ないし図２３に示すような生体細胞凍結保存具１ａであってもよい。
この実施例の生体細胞凍結保存具１ａは、耐寒性材料により形成された本体部２と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部３ｄとを備える。そして、生体細胞保持部３ｄは、光透過性を有し、細長いベース部３１と、ベース部の少なくとも一方の表面の両側部に固定された細長い２つの吸水部３２ａ，３２ｂを備える。そして、２つの吸水部３２ａ，３２ｂ間にて露出するベース部３１が、光透過性を有する細胞載置部位３３となっている。Moreover, the biological cell cryopreservation device and the biological cell cryopreservation device of the present invention may be a biological cell cryopreservation device 1a as shown in FIGS.
A biological cell cryopreservation device 1a of this embodiment includes a body portion 2 made of a cold-resistant material, and a biological cell holding portion 3d made of a cold-resistant material. The biological cell holding portion 3d has optical transparency and includes an elongated base portion 31 and two elongated water absorbing portions 32a and 32b fixed to both sides of at least one surface of the base portion. The base portion 31 exposed between the two water absorbing portions 32a and 32b serves as a cell mounting portion 33 having optical transparency.

この実施例の生体細胞凍結保存具１ａの基本構成は、上述した生体細胞凍結保存具１と同じであり、相違点は、吸水部の形態のみである。
光透過性を有するベース部３１は、上述したものと同じである。図２１および図２３に示すように、ベース部３１の一方の表面に吸水部３２ａ，３２ｂが固定されている。なお、吸水部３２ａ，３２ｂは、ベース部３１の表面および裏面に設けてもよい。吸水部３２ａ，３２ｂは、ベース部３１の表面の側部を被覆するように、長手方向に細長く延びるものとなっている。２つの吸水部３２ａ，３２ｂは、向かい合うように設けられている。The basic configuration of the biological cell cryopreservation device 1a of this embodiment is the same as that of the biological cell cryopreservation device 1 described above, and the only difference is the form of the water absorbing portion.
The light transmissive base portion 31 is the same as described above. As shown in FIGS. 21 and 23 , water absorbing portions 32 a and 32 b are fixed to one surface of the base portion 31 . Note that the water absorbing portions 32 a and 32 b may be provided on the front surface and the back surface of the base portion 31 . The water absorbing portions 32 a and 32 b are elongated in the longitudinal direction so as to cover the side portions of the surface of the base portion 31 . The two water absorption portions 32a and 32b are provided so as to face each other.

吸水部３２ａ，３２ｂの幅としては、０．２～１．５ｍｍが好ましく、特に、０．３～１．０ｍｍが好ましい。そして、向かい合う吸水部３２ａ，３２ｂ間において、ベース部３１の表面が露出し、生体細胞載置部位３３となっている。また、吸水部３２ａ，３２ｂの長さとしては、５～７０ｍｍが好ましく、特に、１０～５０ｍｍが好ましい。また、吸水部３２ａ，３２ｂ間の離間距離、言い換えれば、生体細胞載置部位３３の幅は、０．５～１．５ｍｍが好ましい。吸水部３２ａ，３２ｂの構成材料としては、上述した吸水部３２にて説明したものが使用可能である。 The width of the water absorption portions 32a and 32b is preferably 0.2 to 1.5 mm, particularly preferably 0.3 to 1.0 mm. The surface of the base portion 31 is exposed between the water absorbing portions 32a and 32b facing each other to form a biological cell mounting portion 33. As shown in FIG. Moreover, the length of the water absorbing portions 32a and 32b is preferably 5 to 70 mm, particularly preferably 10 to 50 mm. Moreover, the distance between the water absorbing portions 32a and 32b, in other words, the width of the living cell-bearing portion 33 is preferably 0.5 to 1.5 mm. As the constituent material of the water absorbing portions 32a and 32b, the materials described for the water absorbing portion 32 can be used.

この実施例の生体細胞凍結保存具１ａにおいても、図２３に示すように、生体細胞保持部３ｄの先端部には、マーカー３４が設けられている。マーカー３４は、生体細胞保持部３ｄの先端部の一方の表面（具体的には、吸水シートまたはベース部の表面）に、有色を付する（油性インクで着色する）ことにより形成される。
また、この実施例の生体細胞凍結保存具１ａにおいても、上述した筒状収納部材４を用いることができる。生体細胞凍結保存具１ａと筒状収納部材４により、生体細胞凍結保存用具が、構成される。Also in the biological cell cryopreservation device 1a of this embodiment, as shown in FIG. 23, a marker 34 is provided at the tip of the biological cell holding portion 3d. The marker 34 is formed by coloring (coloring with oil-based ink) one surface (specifically, the surface of the water-absorbing sheet or the base portion) of the tip portion of the living cell holding portion 3d.
Further, the above-described cylindrical storage member 4 can be used in the biological cell cryopreservation device 1a of this embodiment as well. The biological cell cryopreservation tool 1a and the cylindrical storage member 4 constitute a biological cell cryopreservation tool.

また、本発明の生体細胞凍結保存具および生体細胞凍結保存用具としては、図２４および図２５に示すような生体細胞凍結保存具１ｂであってもよい。
この実施例の生体細胞凍結保存具１ｂは、耐寒性材料により形成された本体部２と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部３ｅとを備える。そして、生体細胞保持部３ｅは、光透過性を有し、細長いベース部３１と、ベース部３１の少なくとも一方の表面に、ベース部３１を横切るように固定された向かい合う２つの吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄを有し、吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄ間にて露出するベース部３１が、光透過性を有する細胞載置部位３３となっている。Moreover, the biological cell cryopreservation device and the biological cell cryopreservation device of the present invention may be a biological cell cryopreservation device 1b as shown in FIGS. 24 and 25. FIG.
A biological cell cryopreservation device 1b of this embodiment includes a body portion 2 made of a cold-resistant material, and a biological cell holding portion 3e made of a cold-resistant material. The biological cell holding portion 3e has a light-transmissive, elongated base portion 31, and two water absorbing portions 37a and 37b facing each other fixed to at least one surface of the base portion 31 so as to cross the base portion 31. , 37c and 37d, and the base portion 31 exposed between the water absorbing portions 37a, 37b, 37c and 37d serves as a cell mounting portion 33 having optical transparency.

この実施例の生体細胞凍結保存具１ｂの基本構成は、上述した生体細胞凍結保存具１と同じであり、相違点は、吸水部の形態のみである。
光透過性を有するベース部３１は、上述したものと同じである。図２４および図２５に示すように、ベース部３１の一方の表面に吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄが固定されている。なお、吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、ベース部３１の表面および裏面に設けてもよい。
吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、ベース部３１の表面を横切るように、複数設けられている。各吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、ベース部３１の長手方向に隣り合う吸水部が向かい合うように設けられている。隣り合う吸水部間における露出するベース部部分が、生体細胞載置部位３３となっている。The basic configuration of the biological cell cryopreservation device 1b of this embodiment is the same as that of the biological cell cryopreservation device 1 described above, and the only difference is the shape of the water absorbing portion.
The light transmissive base portion 31 is the same as described above. As shown in FIGS. 24 and 25, water absorbing portions 37a, 37b, 37c, and 37d are fixed to one surface of the base portion 31. As shown in FIGS. Note that the water absorbing portions 37a, 37b, 37c, and 37d may be provided on the front surface and the back surface of the base portion 31, respectively.
A plurality of water absorbing portions 37 a , 37 b , 37 c , 37 d are provided across the surface of the base portion 31 . Each of the water absorbing portions 37a, 37b, 37c, and 37d is provided so that adjacent water absorbing portions in the longitudinal direction of the base portion 31 face each other. The exposed base portion portion between the adjacent water absorbing portions serves as the living cell placement portion 33 .

吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、ベース部３１の幅全体に延びるものとなっている。なお、吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、図２６に示す実施例の生体細胞保持部３ｆのように、ベース部３１の幅全体ではなく、ある程度の長さ延びるものであってもよい。この場合、吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄは、図ベース部３１の幅の１／２以上延びるものであることが好ましい。 The water absorbing portions 37 a , 37 b , 37 c , 37 d extend over the entire width of the base portion 31 . Note that the water absorbing portions 37a, 37b, 37c, and 37d may extend not over the entire width of the base portion 31 but over a certain length like the biological cell holding portion 3f of the embodiment shown in FIG. In this case, it is preferable that the water absorption portions 37a, 37b, 37c, and 37d extend by 1/2 or more of the width of the base portion 31. As shown in FIG.

吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄのベース部３１の長手方向長は、０．２～５ｍｍが好ましく、特に、０．５～３ｍｍが好ましい。吸水部の数としては、２～１０程度が好ましく、特に、２～５が好ましい。また、吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄの離間距離、言い換えれば、生体細胞載置部位３３の幅は、０．５～１．５ｍｍが好ましい。吸水部３７ａ，３７ｂ，３７ｃ，３７ｄの構成材料としては、上述した吸水部３２にて説明したものが使用可能である。 The longitudinal length of the base portion 31 of the water absorbing portions 37a, 37b, 37c, 37d is preferably 0.2 to 5 mm, particularly preferably 0.5 to 3 mm. The number of water absorbing portions is preferably about 2 to 10, particularly preferably 2 to 5. Moreover, the distance between the water absorbing portions 37a, 37b, 37c, and 37d, in other words, the width of the living cell-bearing portion 33 is preferably 0.5 to 1.5 mm. As the constituent materials of the water absorbing portions 37a, 37b, 37c, and 37d , the materials described for the water absorbing portion 32 can be used.

上述した実施例の生体細胞凍結保存具においても、図２３、図２５および図２６に示すように、生体細胞保持部３ｄ，３ｅ、３ｆの先端部には、マーカー３４が設けられている。マーカー３４は、生体細胞保持部の先端部の一方の表面（具体的には、吸水シートまたはベース部の表面）に、有色を付する（油性インクで着色する）ことにより形成される。 As shown in FIGS. 23, 25 and 26, the living cell holding parts 3d, 3e, and 3f are also provided with markers 34 in the living cell cryopreservation devices of the above-described embodiments. The marker 34 is formed by coloring one surface (specifically, the surface of the water-absorbing sheet or the base portion) of the tip portion of the living cell holding portion (coloring with oil-based ink).

また、上述した実施例の生体細胞凍結保存具１ａ，１ｂおよび図２６に示した生体細胞保持部３ｆを有する実施例のすべてにおいて、図９に示す実施例の生体細胞凍結保存具の生体細胞保持部３ｃのように、吸水部は、所定の厚さ（高さ）を有するものであってもよい。この場合、吸水部の厚さ（高さ）としては、２～７ｍｍ程度が好適であり、特に、２～５ｍｍが好ましい。
また、上述したの実施例の生体細胞凍結保存具１ａ，１ｂにおいても、上述した筒状収納部材４を用いることにより、生体細胞凍結保存用具を構成することができる。Moreover, in all of the biological cell cryopreservation devices 1a and 1b of the above-described embodiments and the embodiments having the biological cell holding portion 3f shown in FIG. Like the portion 3c, the water absorbing portion may have a predetermined thickness (height). In this case, the thickness (height) of the water absorbing portion is preferably about 2 to 7 mm, particularly preferably 2 to 5 mm.
Also, in the biological cell cryopreservation devices 1a and 1b of the above-described embodiments, the biological cell cryopreservation device can be constructed by using the above-described cylindrical storage member 4. FIG.

また、本発明の生体細胞凍結保存具および生体細胞凍結保存用具としては、図１３ないし図１９に示すような生体細胞凍結保存具５および生体細胞凍結保存用具２０であってもよい。
この実施例の生体細胞凍結保存具５は、耐寒性材料により形成された本体部５１と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部５２とを備える。生体細胞保持部５２は、光透過性を有するベース部５３と、ベース部５３の表面に固定された吸水部５４とを備える。吸水部５４は、吸水部５４により取り囲まれた欠損部６１を備え、欠損部６１において、ベース部５３の表面が露出し、光透過性を有している。Further, the biological cell cryopreservation tool and the biological cell cryopreservation tool of the present invention may be a biological cell cryopreservation tool 5 and a biological cell cryopreservation tool 20 as shown in FIGS.
A biological cell cryopreservation device 5 of this embodiment includes a body portion 51 made of a cold-resistant material, and a biological cell holding portion 52 made of a cold-resistant material. The biological cell holding portion 52 includes a base portion 53 having optical transparency and a water absorbing portion 54 fixed to the surface of the base portion 53 . The water absorbing portion 54 has a cutout portion 61 surrounded by the water absorbing portion 54. At the cutout portion 61, the surface of the base portion 53 is exposed and has optical transparency.

生体細胞保持部５２のベース部５３は、断面が略矩形状であり、本体部５１と接続された基端部５９を備えている。そして、この実施例のものでは、ベース部５３は、細長い幅の狭い帯状（薄板状）のものとなっている。そして、その表面に、吸水部５４が固定されている。ベース部５３の幅は、０．４～１．０ｍｍが好ましく、長さは、５～３０ｍｍが好ましく、全体の厚さは、０．０８～１．０ｍｍが好ましい。また、ベース部５３の肉厚な基端部の長さは、５～３０ｍｍが好ましく、本体部の長さは、２０～１００ｍｍが好ましい。本体部５１は、先端方向に突出する突出部６４を備え、ベース部５３は、突出部６４を収納する凹部６５を備えている。 A base portion 53 of the biological cell holding portion 52 has a substantially rectangular cross section and includes a proximal end portion 59 connected to the main body portion 51 . In this embodiment, the base portion 53 is in the shape of an elongated narrow strip (thin plate). A water absorbing portion 54 is fixed to the surface thereof. The width of the base portion 53 is preferably 0.4 to 1.0 mm, the length is preferably 5 to 30 mm, and the overall thickness is preferably 0.08 to 1.0 mm. Moreover, the length of the thick proximal end portion of the base portion 53 is preferably 5 to 30 mm, and the length of the body portion is preferably 20 to 100 mm. The body portion 51 has a projecting portion 64 projecting in the distal direction, and the base portion 53 has a recessed portion 65 that accommodates the projecting portion 64 .

そして、本発明の生体細胞凍結保存具５においても、図１３、図１４、図１６および図１７に示すように、生体細胞保持部５２は、複数の欠損部（細胞載置部位）６１を備えている。具体的には、生体細胞保持部５２の長手方向に、複数設けられている。具体的には、５つの欠損部（細胞載置部位）６１が設けられている。欠損部（細胞載置部位）６１の数としては、１～７程度が好ましく、特に、２～５が好適である。欠損部の大きさとしては、円形の場合、直径が．０．５～１．５ｍｍ程度が好適である。 13, 14, 16 and 17, the biological cell holding portion 52 of the biological cell cryopreservation device 5 of the present invention also has a plurality of defective portions (cell placement portions) 61. ing. Specifically, a plurality of them are provided in the longitudinal direction of the biological cell holding portion 52 . Specifically, five defective parts (cell placement parts) 61 are provided. The number of defective portions (cell placement sites) 61 is preferably about 1 to 7, particularly preferably 2 to 5. As for the size of the defect, in the case of a circular shape, the diameter is . About 0.5 to 1.5 mm is suitable.

また、欠損部６１は、円状形態であることが好ましい。さらに、吸水部５４は、光難透過性シートであることが好ましい。このようなものとすることにより、透過型顕微鏡を用いた生体細胞の載置作業を行う際に、吸水部５４が難透過性であり、欠損部６１には光が透過するため、細胞を載置するターゲットである欠損部（細胞載置部位）６１が浮かび上がるように見え、ターゲットの認識が極めて容易である。 Moreover, it is preferable that the cutout portion 61 has a circular shape. Furthermore, the water absorbing portion 54 is preferably a light-impermeable sheet . With such a configuration, when a living cell is placed using a transmission microscope, the water absorbing portion 54 is impermeable and the defective portion 61 allows light to pass through, so that the cell can be placed. A defective portion (cell placement site) 61, which is a target to be placed, appears to emerge, and recognition of the target is extremely easy.

また、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、図１４および図１６に示すように、生体細胞保持部５２は、吸水部５４の両側部に生体細胞保持部５２の長手方向に延びる向かい合う２つのベース部露出部（後述する膨出部５７，５８）を有している。なお、吸水部５４は、欠損部６１を除き、ベース部５３の先端部の一方の表面の全体を覆うものであってもよい。さらには、図７に示した生体細胞保持部３ｂのように、中央部に欠損部を有する個別吸水部が複数設けられたものであってもよい。 Moreover, in the biological cell cryopreservation device 5 of this embodiment, as shown in FIGS. 14 and 16, the biological cell holding portions 52 are provided on both sides of the water absorbing portion 54 with two opposite sides extending in the longitudinal direction of the biological cell holding portions 52 . It has two base exposed portions (expanded portions 57 and 58 to be described later). Note that the water absorbing portion 54 may cover the entire surface of one of the tip portions of the base portion 53 except for the cutout portion 61 . Furthermore, a plurality of individual water absorbing portions having a cutout portion in the central portion may be provided as in the biological cell holding portion 3b shown in FIG.

吸水部５４は、その全体もしくは一部が、ベース部５３の表面に固定されている。吸水部５４のベース部５３への固定は、接着剤、両面テープなどの接着性物質により行うことが好ましい。なお、部分的なヒートシールによって、固定してもよい。
吸水部としては、繊維からなるシート、多孔性樹脂シートなどの各種シートが使用できる。吸水部の厚みは１０μｍ～５ｍｍであることが好ましく、より好ましくは２０μｍ～２．５ｍｍである。そして、繊維からなるシートとしては、紙又は不織布が使用できる。吸水部としては、上述したものが好適に使用できる。The water absorbing portion 54 is fixed to the surface of the base portion 53 in whole or in part. It is preferable to fix the water absorbing portion 54 to the base portion 53 with an adhesive substance such as an adhesive or a double-sided tape. In addition, you may fix by a partial heat seal.
Various sheets such as a fiber sheet and a porous resin sheet can be used as the water absorbing portion. The thickness of the water absorbing portion is preferably 10 μm to 5 mm, more preferably 20 μm to 2.5 mm. Paper or non-woven fabric can be used as the sheet made of fibers. As the water absorbing portion, the above-described ones can be used favorably.

さらに、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、図１３、図１４、図１６ないし図１８に示すように、ベース部５３の吸水部５４の固定部の両側部に設けられかつ生体細胞保持部５２の長手方向に延びる２つの側部膨出部５７，５８を有している。このため、生体細胞凍結保存具５は、吸水部固定部の両側部に膨出部を有するため、生体細胞載置時における生体細胞の側部方向への移動を確実に抑制できる。 Furthermore, in the biological cell cryopreservation device 5 of this embodiment, as shown in FIGS. The portion 52 has two lateral bulges 57, 58 extending longitudinally. Therefore, since the biological cell cryopreservation device 5 has the bulging portions on both sides of the water absorbing portion fixing portion, it is possible to reliably suppress the movement of the biological cells in the lateral direction when the biological cells are placed.

さらに、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、図１３ないし図１８（特に、図１５，図１６）に示すように、生体細胞保持部５２は、吸水部固定部より生体細胞保持部５２の先端側に設けられた突出部６３を備えている。突出部６３は、生体細胞保持部５２の先端部より、上面側（吸水部側）に突出するものとなっている。また、突出部６３は、図１７に示すように、先端面は、若干基端側に傾斜する傾斜面となっている。このような突出部６３を形成することにより、もし、生体細胞収納部より生体細胞が離脱して、先端側に移動したとき、生体細胞凍結保存具５、言い換えれば、生体細胞保持部５２からの落下を防止する。特に、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、上述したように、生体細胞保持部５２の両側部に設けられた膨出部５７，５８と協働することにより、生体細胞の落下を防止する。 Furthermore, in the biological cell cryopreservation device 5 of this embodiment, as shown in FIGS. is provided with a protruding portion 63 provided on the tip side thereof. The protruding portion 63 protrudes from the tip portion of the biological cell holding portion 52 toward the upper surface side (water absorbing portion side). Further, as shown in FIG. 17, the protruding portion 63 has a tip end surface that is slightly inclined toward the base end side. By forming such a protruding portion 63, if a living cell detaches from the living cell storage portion and moves to the tip side, the living cell cryopreservation device 5, in other words, from the living cell holding portion 52 Prevent falling. In particular, in the biological cell cryopreservation device 5 of this embodiment, as described above, by cooperating with the bulging portions 57 and 58 provided on both sides of the biological cell holding portion 52, the biological cells are prevented from falling. do.

本体部５１、ベース部５３および吸水部５４は、耐寒性材料により形成されている。特に、本体部５１、ベース部５３および吸水部５４は、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。また、ベース部５３は、透明性を有することが好ましく、また、多少の可撓性を有するものであることが好ましい。本体部５１およびベース部５３の形成材料としては、例えば、３－フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂、また、それら合成樹脂により形成されたフィルムの積層体が好適に使用される。 The body portion 51, the base portion 53, and the water absorbing portion 54 are made of a cold-resistant material. In particular, the body portion 51, the base portion 53, and the water absorption portion 54 are preferably made of liquid nitrogen-resistant material, in other words, made of a material that does not become embrittled even when it comes into contact with liquid nitrogen. Moreover, it is preferable that the base portion 53 has transparency and that it has some flexibility. Materials for forming the body portion 51 and the base portion 53 include, for example, 3-fluorinated polyethylene, low density polyethylene, medium density polyethylene, high density polyethylene, polycarbonate, nylon, polysulfone, polyester, polystyrene, polyimide, ultra high molecular weight polyethylene, Synthetic resins such as ethylene-vinyl acetate copolymers, and laminates of films formed from these synthetic resins are preferably used.

そして、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、図１３ないし図１９に示すように、生体細胞保持部５２は、生体細胞保持部５２の長手方向に延び、かつ、生体細胞保持部５２の先端より突出する熱伝導性体５５，５６を有している。特に、この実施例の生体細胞凍結保存具５では、熱伝導性体５５，５６は、線状熱伝導性体となっており、生体細胞保持部５２の両方の側部に設けられている。さらに、この実施例のものでは、熱伝導性体５５，５６は、吸水部固定部を越えて、ベース部５３の基端側に延び、生体細胞保持部５２の基端もしくはその付近に到達するものとなっている。また、熱伝導性体５５，５６は、先端部５５ａ，５６ａを除き、側部膨出部５７，５８内に埋設されている。言い換えれば、先端部５５ａ，５６ａは、生体細胞保持部５２の先端より突出し、外面が露出した状態となっている。 In the biological cell cryopreservation device 5 of this embodiment, as shown in FIGS. 13 to 19, the biological cell holding section 52 extends in the longitudinal direction of the biological cell holding section 52, and the biological cell holding section 52 It has thermally conductive bodies 55 and 56 protruding from the tip. In particular, in the biological cell cryopreservation device 5 of this embodiment, the thermally conductive bodies 55 and 56 are linear thermally conductive bodies and are provided on both sides of the biological cell holder 52 . Furthermore, in this embodiment, the thermally conductive bodies 55 and 56 extend beyond the water absorbing portion fixing portion toward the proximal end of the base portion 53 and reach the proximal end of the biological cell holding portion 52 or its vicinity. It has become a thing. Also, the thermally conductive bodies 55 and 56 are embedded in the side bulging portions 57 and 58 except for the tip portions 55a and 56a. In other words, the tip portions 55a and 56a protrude from the tip of the biological cell holding portion 52, and the outer surfaces thereof are exposed.

また、この実施例では、熱伝導性体５５，５６は、線状部材もしくは細い棒状部材により形成されている。さらに、熱伝導性体５５，５６の先端部５５ａ，５６ａの形状は、基端側に向かって湾曲する湾曲先端部となっているものであってもよい。この場合、湾曲先端部５５ａ，５６ａは、図１４に示すように、生体細胞凍結保存具５の先端部の前方に突出し、かつ、突出部６３を保護するものであることが好ましい。
熱伝導性体５５，５６は、熱伝導性材料により形成されている。熱伝導性材料としては、銀、銅、アルミニウム、ステンレス鋼などの金属類、窒化アルミニウム、窒化ケイ素、アルミナなどの熱伝導性セラミックスなどが好適に使用できる。Also, in this embodiment, the thermally conductive bodies 55 and 56 are formed of linear members or thin rod-shaped members. Furthermore, the tip portions 55a and 56a of the thermally conductive bodies 55 and 56 may have curved tip portions that curve toward the base end side. In this case, as shown in FIG. 14, the curved distal end portions 55a and 56a preferably protrude forward from the distal end portion of the biological cell cryopreservation device 5 and protect the projecting portion 63. As shown in FIG.
The thermally conductive bodies 55, 56 are made of a thermally conductive material. As the thermally conductive material, metals such as silver, copper, aluminum and stainless steel, and thermally conductive ceramics such as aluminum nitride, silicon nitride and alumina can be suitably used.

図１９に示す実施例の生体細胞凍結保存用具２０は、上述した生体細胞凍結保存具５と、生体細胞凍結保存具５を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材７とを備える。
筒状収納部材７は、図１９に示すように、生体細胞凍結保存具５を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状体である。筒状収納部材７は、内部に生体細胞保持部材収納部７１を有する筒状体７０と、筒状体７０の先端に設けられた熱伝導性部材７２とを備える。また、この実施例では、筒状収納部材７は、先端閉塞部７３と、基端開口部７４と、内部に生体細胞保持部材収納部７１を有する筒状体７０と、筒状体７０の先端部内に収納された熱伝導性部材７２とにより構成されている。The biological cell cryopreservation tool 20 of the embodiment shown in FIG. 19 includes the above-described biological cell cryopreservation tool 5 and a cylindrical storage member which is made of a cold-resistant material and which can accommodate the biological cell cryopreservation tool 5 and whose one end is closed. 7.
As shown in FIG. 19, the cylindrical housing member 7 is a cylindrical body that can contain the biological cell cryopreservation device 5 and is made of a cold-resistant material and closed at one end. The tubular storage member 7 includes a tubular body 70 having a living cell holding member storage portion 71 inside, and a thermally conductive member 72 provided at the tip of the tubular body 70 . In this embodiment, the cylindrical housing member 7 includes a distal end blocking portion 73, a proximal opening portion 74, a cylindrical body 70 having a living cell holding member housing portion 71 therein, and a distal end portion of the cylindrical body 70. It is composed of a thermally conductive member 72 housed in the portion.

熱伝導性部材７２は、筒状体７０の内部に移動不能に収納されており、また、先端閉塞部７３の内面に当接するように収納されている。また、熱伝導性部材７２は、金属製の円柱状のものが用いられている。熱伝導性部材７２の上面は、生体細胞凍結保存具５の熱伝導性体５５，５６の先端部５５ａ，５６ａと接触可能なものとなっている。なお、熱伝導性部材７２は、先端面、先端側側面などが筒状体７０より露出するものであってもよい。 The heat-conducting member 72 is housed immovably inside the cylindrical body 70 and is housed so as to contact the inner surface of the tip closing portion 73 . Also, the thermally conductive member 72 is made of metal and has a columnar shape. The upper surface of the thermally conductive member 72 can come into contact with the tip portions 55a, 56a of the thermally conductive bodies 55, 56 of the biological cell cryopreservation device 5. As shown in FIG. Note that the thermally conductive member 72 may be exposed from the tubular body 70 at its tip surface, tip side side surface, and the like.

また、このタイプの生体細胞凍結保存具においても、図２０に示す生体細胞凍結保存具５ａのように、ベース部５３の上面に設けられる吸水部５４ａは、所定の厚さ（高さ）を有するものであってもよい。この場合、吸水部５４ａの厚さ（高さ）としては、２～７ｍｍ程度が好適であり、特に、２～５ｍｍが好ましい。このように、吸水部５４ａがある程度の厚さを有する場合、欠損部６１における吸水部５４ａの内面とベース部５３の上面により、細胞収納部が形成され、載置される細胞６８の離出が抑制される。 Also in this type of biological cell cryopreservation device, the water absorbing portion 54a provided on the upper surface of the base portion 53 has a predetermined thickness (height) like the biological cell cryopreservation device 5a shown in FIG. can be anything. In this case, the thickness (height) of the water absorbing portion 54a is preferably about 2 to 7 mm, particularly preferably 2 to 5 mm. In this way, when the water absorbing portion 54a has a certain thickness, the inner surface of the water absorbing portion 54a and the upper surface of the base portion 53 in the cutout portion 61 form a cell storage portion, which prevents the cells 68 placed thereon from detaching. Suppressed.

筒状体７０は、耐寒性材料により形成されている。特に、筒状体７０は、液体窒素耐性材料、言い換えれば、液体窒素に接触しても脆化しないものが好ましい。また、筒状体７０は、内部が視認可能な透明もしくは半透明体であることが好ましい。筒状体７０の形成材料としては、例えば、３－フッ化ポリエチレン、低密度ポリエチレン、中密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、ポリカーボネート、ナイロン、ポリスルホン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリイミド、超高分子量ポリエチレン、エチレン－酢酸ビニル共重合体などの合成樹脂、また、それら合成樹脂により形成されたフィルムの積層体が好適に使用される。 The tubular body 70 is made of a cold-resistant material. In particular, the cylindrical body 70 is preferably made of a liquid nitrogen resistant material, in other words, a material that does not become embrittled even when it comes into contact with liquid nitrogen. Moreover, it is preferable that the cylindrical body 70 is a transparent or translucent body whose inside can be visually recognized. Materials for forming the tubular body 70 include, for example, 3-fluorinated polyethylene, low-density polyethylene, medium-density polyethylene, high-density polyethylene, polycarbonate, nylon, polysulfone, polyester, polystyrene, polyimide, ultra-high molecular weight polyethylene, and ethylene-acetic acid. Synthetic resins such as vinyl copolymers and laminates of films formed from these synthetic resins are preferably used.

また、筒状収納部材７の生体細胞保持部材収納部７１の長さは、生体細胞凍結保存具５の全長より、１０～５０ｍｍ長いものであることが好ましい。また、筒状収納部材７（筒状体７０）の全長は、５０～１００ｍｍが好ましく、内径は、２～５ｍｍが好ましい。 Moreover, the length of the biological cell holding member housing portion 71 of the cylindrical housing member 7 is preferably longer than the total length of the biological cell cryopreservation device 5 by 10 to 50 mm. Further, the total length of the cylindrical storage member 7 (cylindrical body 70) is preferably 50 to 100 mm, and the inner diameter is preferably 2 to 5 mm.

次に、本発明の生体細胞凍結保存用具５の使用方法について説明する。
この説明では、生体細胞である卵子を凍結保存する場合を例にとり説明する。
まず、複数の卵子を採取し、卵子の細胞内液を平衡液に置換する作業を行い、さらに、細胞外液をガラス化液に置換する作業を行う。そして、顕微鏡下において、図１８に示すように、生体細胞凍結保存具５の生体細胞保持部５２に設けられた吸水部５４の欠損部６１に卵子６８を少量のガラス化液とともに配置させ、ベース部材５３の表面に付着させる。卵子が付着した生体細胞凍結保存具５を生体細胞保持部５２側より、筒状収納部材７内に挿入し、図１９に示すように、生体細胞凍結保存具５の生体細胞保持部５２の先端より突出する熱伝導性体５５，５６の先端部５５ａ，５６ａが、筒状収納部材７内の熱伝導性部材７２と接触する状態とする。Next, a method for using the biological cell cryopreservation device 5 of the present invention will be described.
In this description, the case of cryopreserving an ovum, which is a living cell, will be described as an example.
First, a plurality of ova are collected, the intracellular fluid of the ova is replaced with the equilibrium solution, and the extracellular fluid is replaced with the vitrification fluid. Then, under a microscope, as shown in FIG. 18, an ovum 68 is placed in the defective portion 61 of the water absorbing portion 54 provided in the biological cell holding portion 52 of the biological cell cryopreservation device 5 together with a small amount of vitrification liquid, and the base is placed. It is attached to the surface of the member 53 . The biological cell cryopreservation device 5 with attached ova is inserted into the cylindrical storage member 7 from the biological cell holding part 52 side, and as shown in FIG. The tip portions 55 a and 56 a of the thermally conductive bodies 55 and 56 that protrude further are brought into contact with the thermally conductive member 72 inside the cylindrical storage member 7 .

そして、生体細胞凍結保存具５を収納した筒状収納部材７を先端側（熱伝導性部材７２側）より、あらかじめ準備しておいた液体窒素に浸漬し凍結（ガラス化）させる。筒状収納部材７の液体窒素との接触により、筒状収納部材７内の熱伝導性部材７２は急激冷却され、その冷却は、熱伝導性部材７２と接触する生体細胞凍結保存具５の生体細胞保持部５２の熱伝導性体５５，５６より温度を急激に奪うものとなり、生体細胞保持部５２に保持されてる卵子も急激に冷却される。収納容器（ケーン）に、ガラス化した卵子を付着保持する生体細胞凍結保存具５を筒状収納部材７ごと収納した後、収納容器を液体窒素タンク内に入れ保存する。 Then, the cylindrical storage member 7 storing the biological cell cryopreservation device 5 is immersed in liquid nitrogen prepared in advance from the tip side ( thermally conductive member 72 side) to freeze (vitrify). The contact of the cylindrical storage member 7 with the liquid nitrogen causes the thermally conductive member 72 in the cylindrical storage member 7 to be rapidly cooled, and the cooling is applied to the living body of the biological cell cryopreservation device 5 that is in contact with the thermally conductive member 72 . The temperature is rapidly taken away from the heat conductive bodies 55 and 56 of the cell holding portion 52, and the ovum held in the living cell holding portion 52 is also rapidly cooled. After storing the biological cell cryopreservation device 5 to which the vitrified ova are adhered and held in a storage container (cane) together with the cylindrical storage member 7, the storage container is stored in a liquid nitrogen tank.

本発明の生体細胞凍結保存具は、以下のものである。
（１） 耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
前記生体細胞保持部は、光透過性を有するベース部と、前記ベース部の表面に固定された吸水部とを備え、前記吸水部は、前記吸水部により取り囲まれた欠損部を備え、前記欠損部において、前記ベース部の前記表面が露出し、光透過性を有している生体細胞凍結保存具。The biological cell cryopreservation device of the present invention is as follows.
(1) A biological cell cryopreservation device comprising a body portion made of a cold-resistant material and a biological cell holding portion made of a cold-resistant material,
The biological cell holding portion includes a base portion having optical transparency and a water absorbing portion fixed to the surface of the base portion, the water absorbing portion includes a defective portion surrounded by the water absorbing portion, and In the section, the biological cell cryopreservation device, wherein the surface of the base section is exposed and has optical transparency.

この生体細胞凍結保存具では、吸水部により取り囲まれた欠損部を備え、欠損部は光透過性を有するため、細胞の載置作業を行う際、欠損部の上面にピペットの先端部を配置したとき、透過型顕微鏡によるピペット先端の確認が容易である。また、過剰なガラス化液が、細胞とともに欠損部に滴下されても、ガラス化液は、欠損部を取り囲む吸水部に吸収されるため、除去操作も不要である。このため、生体細胞の凍結を迅速に行うことができる。 This living cell cryopreservation device has a defective portion surrounded by a water-absorbing portion, and since the defective portion has optical transparency, the tip of a pipette is placed on the upper surface of the defective portion when placing cells. At times, it is easy to confirm the pipette tip with a transmission microscope. Moreover, even if the excess vitrification fluid is dropped onto the defect along with the cells, the vitrification fluid is absorbed by the water absorbing portion surrounding the defect, so that no removal operation is required. Therefore, biological cells can be frozen rapidly.

また、上記の実施態様は、以下のものであってもよい。
（２） 前記欠損部における前記ベース部の表面が、細胞載置部位である上記（１）に記載の生体細胞凍結保存具。
（３） 前記生体細胞凍結保存具は、複数の前記欠損部を備えている上記（１）または（２）に記載の生体細胞凍結保存具。
（４） 前記欠損部は、円状または多角形状である上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。Further, the above embodiments may be as follows.
(2) The biological cell cryopreservation device according to (1) above, wherein the surface of the base portion in the defective portion is a cell mounting portion.
(3) The biological cell cryopreservation device according to (1) or (2) above, wherein the biological cell cryopreservation device has a plurality of the defective portions.
(4) The biological cell cryopreservation device according to any one of (1) to (3) above, wherein the defective portion is circular or polygonal.

また、本発明の生体細胞凍結保存具は、以下のものである。
（５） 耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
前記生体細胞保持部は、光透過性を有し、細長いベース部と、前記ベース部の少なくとも一方の表面の両側部に固定された細長い２つの吸水部を有し、前記２つの吸水部間にて露出する前記ベース部が、光透過性を有する細胞載置部位となっている生体細胞凍結保存具。Moreover, the biological cell cryopreservation tool of the present invention is as follows.
(5) A biological cell cryopreservation device comprising a body portion made of a cold-resistant material and a biological cell holding portion made of a cold-resistant material,
The biological cell holding portion has optical transparency, and has an elongated base portion and two elongated water absorbing portions fixed to both sides of at least one surface of the base portion, between the two water absorbing portions. The biological cell cryopreservation device, wherein the base portion exposed through the rim serves as a light-transmissive cell mounting portion.

また、本発明の生体細胞凍結保存具は、以下のものである。
（６） 耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
前記生体細胞保持部は、光透過性を有し、細長いベース部と、前記ベース部の少なくとも一方の表面に、前記ベース部を横切るように固定された向かい合う２つの吸水部を有し、前記２つの吸水部間にて露出する前記ベース部が、光透過性を有する細胞載置部位となっている生体細胞凍結保存具。Moreover, the biological cell cryopreservation tool of the present invention is as follows.
(6) A biological cell cryopreservation device comprising a body portion made of a cold-resistant material and a biological cell holding portion made of a cold-resistant material,
The biological cell holding portion has optical transparency, and has an elongated base portion and two water absorbing portions facing each other and fixed to at least one surface of the base portion so as to cross the base portion. A biological cell cryopreservation device, wherein the base portion exposed between the two water absorbing portions is a light-transmissive cell mounting portion.

これら生体細胞凍結保存具においても、吸水部に近接する細胞載置部位は、光透過性を有するため、細胞の載置作業を行う際、細胞載置部位の上面にピペットの先端部を配置したとき、透過型顕微鏡によるピペット先端の確認が容易である。また、過剰なガラス化液が、細胞とともに細胞載置部位に滴下されても、ガラス化液は、細胞載置部位に近接する吸水部に吸収されるため、除去操作も不要である。このため、生体細胞の凍結を迅速に行うことができる。 In these biological cell cryopreservation devices, the cell-mounting portion adjacent to the water absorbing portion is also light-transmitting, so that the tip of the pipette is placed on the upper surface of the cell-mounting portion when performing the cell-mounting operation. At times, it is easy to confirm the pipette tip with a transmission microscope. Moreover, even if the excess vitrification liquid is dripped onto the cell-mounting site together with the cells, the vitrification liquid is absorbed by the water absorbing portion adjacent to the cell-mounting site, so that no removal operation is required. Therefore, biological cells can be frozen rapidly.

また、上記の実施態様は、以下のものであってもよい。
（７） 前記ベース部は、無色透明である上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（８） 前記ベース部は、透明性シートである上記（１）ないし（６）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（９） 前記ベース部は、細長い平板状の可撓性シートである上記（１）ないし（８）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（１０） 前記ベース部は、細長い硬質平板部材である上記（１）ないし（７）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。
（１１） 前記吸水部は、光難透過性シートである上記（１）ないし（１０）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。 Further, the above embodiments may be as follows.
(7) The biological cell cryopreservation device according to any one of (1) to (6) above, wherein the base portion is colorless and transparent.
(8) The biological cell cryopreservation device according to any one of (1) to (6) above, wherein the base portion is a transparent sheet.
(9) The biological cell cryopreservation device according to any one of (1) to (8) above, wherein the base portion is an elongated flat flexible sheet.
(10) The biological cell cryopreservation device according to any one of (1) to (7) above, wherein the base portion is an elongated rigid flat plate member.
(11) The biological cell cryopreservation device according to any one of (1) to (10) above, wherein the water absorbing portion is a light-impermeable sheet .

また、本発明の生体細胞凍結保存用具は、以下のものである。
（１２） 上記（１）ないし（１１）のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具と、前記生体細胞凍結保存具を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材とを備える生体細胞凍結保存用具。Moreover, the biological cell cryopreservation tool of the present invention is as follows.
(12) The biological cell cryopreservation device according to any one of (1) to (11) above, and a cylindrical storage member which is capable of containing the biological cell cryopreservation device and which is made of a cold-resistant material and whose one end is closed. A biological cell cryopreservation device comprising:

Claims (10)

耐寒性材料により形成された本体部と、耐寒性材料により形成された生体細胞保持部とを備える生体細胞凍結保存具であって、
前記生体細胞保持部は、光透過性を有するベース部と、前記ベース部の表面に固定された吸水部と、前記吸水部により取り囲まれた欠損部とを備え、
前記吸水部は、光難透過性シートからなり、前記ベース部は、細長い平坦シート状であり、前記欠損部は、光難透過性シートである前記吸水部により取り囲まれた円状または多角形状となっており、さらに、前記欠損部は、前記ベース部の前記表面が露出した光透過性を有する平坦な生体細胞載置部位を形成しており、かつ、透過型顕微鏡を用いた生体細胞の載置作業を行う際に、光難透過性である前記吸水部により取り囲まれ、光が透過する前記生体細胞載置部位が前記生体細胞を載置するターゲットを形成することを特徴とする生体細胞凍結保存具。 A biological cell cryopreservation device comprising a body portion made of a cold-resistant material and a biological cell holding portion made of a cold-resistant material,
The biological cell holding portion includes a base portion having optical transparency, a water absorbing portion fixed to the surface of the base portion, and a defective portion surrounded by the water absorbing portion,
The water-absorbing portion is made of a light-impermeable sheet, the base portion is in the shape of an elongated flat sheet, and the missing portion has a circular or polygonal shape surrounded by the water-absorbing portion, which is the light-impermeable sheet. Further, the defective portion forms a flat living cell placement portion having light transmissivity in which the surface of the base portion is exposed, and the living cell can be examined using a transmission microscope. A biological cell characterized in that the biological cell mounting portion, which is surrounded by the light-impermeable water absorbing portion and through which light is transmitted, forms a target on which the biological cell is mounted when the biological cell is mounted. cryopreservation. 前記吸水部により取り囲まれ、光が透過する前記生体細胞載置部位は、円形であり、直径が．０．５～１．５ｍｍである請求項１に記載の生体細胞凍結保存具。 The living cell placement portion surrounded by the water absorption portion and through which light is transmitted has a circular shape with a diameter of . The biological cell cryopreservation tool according to claim 1, which is 0.5 to 1.5 mm . 前記生体細胞凍結保存具は、複数の前記欠損部を備えている請求項１または２に記載の生体細胞凍結保存具。 The biological cell cryopreservation device according to claim 1 or 2, wherein the biological cell cryopreservation device comprises a plurality of the defect portions. 前記吸水部は、前記欠損部を除き、前記ベース部の先端部の一方の表面の全体を覆うものとなっている請求項１ないし３のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。4. The biological cell cryopreservation device according to any one of claims 1 to 3, wherein the water absorbing portion covers the entire one surface of the tip portion of the base portion except for the defective portion. 前記生体細胞保持部は、中央部に前記欠損部を有する個別吸水部を複数備えており、前記個別吸水部の外側および前記欠損部において、前記ベース部の表面は、露出している請求項１ないし３のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。2. The biological cell holding part has a plurality of individual water absorbing parts having the cutout in the central part, and the surface of the base part is exposed outside the individual water absorbing parts and at the cutout. 4. The biological cell cryopreservation device according to any one of 1 to 3. 前記ベース部は、無色透明である請求項１ないし５のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。 The biological cell cryopreservation device according to any one of claims 1 to 5 , wherein the base portion is colorless and transparent. 前記ベース部は、透明性シートである請求項１ないし５のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。 The biological cell cryopreservation device according to any one of claims 1 to 5 , wherein the base portion is a transparent sheet. 前記ベース部は、細長い平板状の可撓性シートである請求項１ないし７のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。 The biological cell cryopreservation device according to any one of claims 1 to 7 , wherein the base portion is an elongated flat flexible sheet. 前記ベース部は、細長い硬質平板部材である請求項１ないし８のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具。 The biological cell cryopreservation device according to any one of claims 1 to 8 , wherein the base portion is an elongated rigid flat plate member. 請求項１ないし９のいずれかに記載の生体細胞凍結保存具と、前記生体細胞凍結保存具を収納可能かつ耐寒性材料により形成された一端が閉塞した筒状収納部材とを備える生体細胞凍結保存用具。 A biological cell cryopreservation comprising: the biological cell cryopreservation device according to any one of claims 1 to 9 ; and a cylindrical storage member which is capable of containing the biological cell cryopreservation device and which is made of a cold-resistant material and whose one end is closed. tools.
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