JP7097800B2 - Electrode holding member - Google Patents
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Description
本発明は、培養した細胞の電気抵抗を測定するための電極保持部材に関する。 The present invention relates to an electrode holding member for measuring the electrical resistance of cultured cells.
従来、培養した細胞の性質や、培養状態を調べるために細胞の電気抵抗値を計測するための技術が知られている。例えば、上皮細胞抵抗(TEER)計測では、培養液中において細胞培養用の膜の一方側と他方側とに電極を配置して電気抵抗値を計測することにより、膜状に培養された細胞自体の電気抵抗値を計測する。このように細胞の電気抵抗値を計測する技術については、例えば、特許文献1に記載されている。
Conventionally, techniques for measuring the electrical resistance value of cells for investigating the properties of cultured cells and the state of culture have been known. For example, in epithelial cell resistance (TEER) measurement, cells themselves cultured in a membrane form are measured by arranging electrodes on one side and the other side of a cell culture membrane in a culture medium and measuring the electrical resistance value. Measure the electrical resistance value of. A technique for measuring the electrical resistance value of a cell in this way is described in, for example,
特許文献1に記載の細胞培養容器は、蓋部から細胞が培養されるインサート容器の内部まで延びる電極と、インサート容器の下方において細胞培養容器の底面に配置される電極とを有する。このような電極構造では、電極を備えた専用の細胞培養容器を用いる必要がある。
The cell culture container described in
本発明は、このような事情に鑑みなされたものであり、汎用的な細胞培養容器を用いて、培養された細胞の電気抵抗を簡便に計測することができる技術を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a technique capable of easily measuring the electrical resistance of cultured cells using a general-purpose cell culture vessel. ..
上記課題を解決するため、本願の第1発明は、複数の凹部を有するウェルプレートの前記凹部内に電極を配置するための電極保持部材であって、格子状に配置された複数の観察用開口を有し、水平方向に延びる平板状かつ絶縁性の基板と、前記観察用開口の一部または全てのそれぞれの近傍に配置される、複数の電極部と、を有し、前記電極部はそれぞれ、一端を前記基板に固定され、前記基板から下方へ延びる第1電極部および第2電極部を有し、前記第1電極部は、絶縁性の第1柱状部材と、前記第1柱状部材の側面に設けられる第1作用電極と、前記第1柱状部材の側面に設けられる第1参照電極と、を有し、前記第2電極部は、絶縁性の第2柱状部材と、前記第2柱状部材の側面に設けられる第2作用電極と、前記第2柱状部材の側面に設けられる第2参照電極と、を有する。
In order to solve the above problems, the first invention of the present application is an electrode holding member for arranging an electrode in the recess of a well plate having a plurality of recesses, and a plurality of observation openings arranged in a grid pattern. It has a flat plate-like and insulating substrate extending in the horizontal direction, and a plurality of electrode portions arranged in the vicinity of each of a part or all of the observation openings, each of which has a plurality of electrode portions. One end thereof is fixed to the substrate and has a first electrode portion and a second electrode portion extending downward from the substrate . The first electrode portion includes an insulating first columnar member and the first columnar member. It has a first working electrode provided on the side surface and a first reference electrode provided on the side surface of the first columnar member, and the second electrode portion has an insulating second columnar member and the second columnar member. It has a second working electrode provided on the side surface of the member and a second reference electrode provided on the side surface of the second columnar member .
本願の第2発明は、第1発明の電極保持部材であって、前記基板は、少なくとも一部が前記基板の上面にプリントされた複数の導線を有し、前記第1電極部および前記第2電極部はそれぞれ、その上端部が前記基板の上面よりも上方に配置され、前記基板の上面にプリントされた前記導線の上面と、前記第1作用電極、前記第1参照電極、前記第2作用電極、および前記第2参照電極のいずれかとは、略直方体の導電性接続部材を介して電気的に接続される。
The second invention of the present application is the electrode holding member of the first invention, wherein the substrate has a plurality of conductors having at least a part printed on the upper surface of the substrate, the first electrode portion and the second. The upper end of each of the electrode portions is arranged above the upper surface of the substrate, and the upper surface of the conducting wire printed on the upper surface of the substrate, the first working electrode, the first reference electrode, and the second acting. The electrode and any of the second reference electrodes are electrically connected via a substantially rectangular conductive connecting member.
本願の第3発明は、第1発明または第2発明の電極保持部材であって、前記電極部の数は、前記観察用開口の数と同一である。
The third invention of the present application is the electrode holding member of the first invention or the second invention , and the number of the electrode portions is the same as the number of the observation openings.
本願の第4発明は、第1発明または第2発明の電極保持部材であって、前記電極部の数は、前記観察用開口の数よりも少ない。
The fourth invention of the present application is the electrode holding member of the first invention or the second invention , and the number of the electrode portions is smaller than the number of the observation openings.
本願の第1発明~第4発明によれば、汎用的な細胞培養容器を用いて、培養された細胞の電気抵抗を簡便に計測することができる。
According to the first to fourth inventions of the present application, the electrical resistance of the cultured cells can be easily measured by using a general-purpose cell culture vessel.
以下、本発明の実施形態について、図面を参照しつつ説明する。なお、以下の説明において電極保持部材の基板に平行な方向を「水平方向」、水平方向に直交する方向を「上下方向」と称する。しかしながら、細胞培養容器および電極保持部材の使用時の姿勢は、電極保持部材の基板が水平方向とならなくてもよい。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings. In the following description, the direction parallel to the substrate of the electrode holding member is referred to as "horizontal direction", and the direction orthogonal to the horizontal direction is referred to as "vertical direction". However, the posture of the cell culture vessel and the electrode holding member when used does not have to be such that the substrate of the electrode holding member is in the horizontal direction.
<1.細胞培養容器および電極保持部材の構成>
図1は、本発明の一実施形態に係る電極保持部材1とともに用いられる細胞培養容器2の上面図である。図2は、本発明の一実施形態に係る電極保持部材1の上面図である。図2中に、電極保持部材1の使用時における電極保持部材1の各部の位置が破線で示されている。なお、図2中、拡大部を除いて、導電性接続部材15が省略して示されている。図3は、電極保持部材1および細胞培養容器2のA-A断面における断面図である。図4は、電極保持部材1のB-B断面における部分断面図である。なお、図4は、位置関係の把握を容易にするために、各構成要素を誇張して表示しており、その寸法は実際と異なる。
<1. Configuration of cell culture container and electrode holding member>
FIG. 1 is a top view of a
細胞培養容器2は、電極保持部材1の有する電極部10を用いて電気抵抗値を計測する対象である細胞を培養するための容器である。細胞培養容器2は、複数のウェル21を有する、いわゆるウェルプレートである。図1および図3に示すように、ウェル21は、細胞培養容器2の上面から凹む凹部である。本実施形態の細胞培養容器2では、縦2行、横3列の合計6個のウェル21が格子状に配列されている。なお、本発明の電極保持部材とともに用いられる細胞培養容器のウェルの数は、6個に限られず、例えば、12個、24個、96個、384個等であってもよい。
The
細胞培養容器2の各ウェル21の内部には、インサートカップ20が配置される。インサートカップ20は、筒部31と、支持部32と、細胞培養部33とを有する。筒部31は、円錐台状かつ筒状に形成された絶縁性の部位である。
An
支持部32は、筒部31の上端から外方へと延びる。支持部32を細胞培養容器2の上面に載置すると、ウェル21の内部であって、細胞培養部33がウェル21の底面に接触しない位置に、筒部31および細胞培養部33を配置することができる。本実施形態では、筒部31の周方向の3箇所に支持部32が放射状に配置される。しかしながら、支持部32は、筒部31および細胞培養部33を所定の位置に支持できる構成であれば、他の形状であってもよい。例えば、支持部32は、インサートカップ20の周方向の2箇所のみに配置されてもよいし、4箇所以上に配置されてもよい。また、支持部32は、インサートカップ20の周方向の一部から外方へ延びるフランジ状であってもよい。
The
細胞培養部33は、筒部31の下方の開口を覆う膜である。細胞培養部33には、細胞接着性を有する膜が用いられる。なお、細胞培養部33には、微細な貫通孔が多数設けられた板状の部材が用いられてもよい。計測対象である細胞の培養時には、ウェル21の内部に、少なくとも細胞培養部33が浸る位置まで培養液を注入する。
The
電極保持部材1は、細胞培養容器2のウェル21内に電極を配置するための部材である。具体的には、電極保持部材1は、細胞培養容器2に載置して、各ウェル21内のインサートカップ20上で培養された細胞の電気抵抗値を計測を行うための各電極42,43,52,53を保持する。電極42,43,52,53については、後述する。
The
電極保持部材1は、基板11と、基板上に形成された複数の導線12と、複数の電極部10とを有する。
The
基板11は、水平方向に延びる平板状かつ絶縁性の基板である。基板11は、例えば、ガラスエポキシ樹脂により形成される。基板11には、格子状に配置された複数の観察用開口13が設けられる。各観察用開口13は、細胞培養容器2の各ウェル21の位置に合わせて形成されている。
The
各導線12の一端は、電極部10の後述する電極42,43,52,53のいずれかと電気的に接続される電極接続端子121である。各導線12の他端は、外部と電気的に接続可能な外部接続端子122である。導線12のうち、電極接続端子121を含む少なくとも一部は、基板11の上面にプリントされることにより形成される。導線12のその他の部分は、複数層に形成された基板11の内部の層にプリントされたり、基板11の形成時に内部に埋め込まれたりしていてもよい。
One end of each
電極部10はそれぞれ、観察用開口13の近傍に配置される。本実施形態では、全ての観察用開口13ごとに、電極部10が配置されている。しかしながら、一部の観察用開口13のみに対して、電極部10が配置されていてもよい。電極部10は、それぞれ、第1電極部40と、第2電極部50とを有する。
Each of the
第1電極部40は、第1柱状部材41と、第1作用電極42と、第1参照電極43とを有する。第1電極部40は、その一端が基板11に固定される。また、第1電極部40は、基板11から下方へ延びる。
The
第1柱状部材41は、上下方向に延びる角柱状の絶縁性部材である。第1柱状部材41は、例えば、ガラスにより形成される。
The
第1作用電極42は、第1柱状部材41の4つの側面のうちの1つの全体に設けられる。第1参照電極43は、第1柱状部材41の他の側面の全体に設けられる。第1作用電極42と第1参照電極43とは、互いに隣り合わず、間隔を空けて配置される。本実施形態では、第1作用電極42および第1参照電極43はそれぞれ、第1柱状部材41の側面に形成された金属薄膜である。しかしながら、第1作用電極42および第1参照電極43はそれぞれ、第1柱状部材41に金属板を接着したものや、その他の構成であってもよい。
The first working
第2電極部50は、第2柱状部材51と、第2作用電極52と、第2参照電極53とを有する。第2電極部50は、その一端が基板11に固定される。また、第2電極部50は、基板11から下方へ延びる。
The
第2柱状部材51は、上下方向に延びる角柱状の絶縁性部材である。第2柱状部材51は、例えば、ガラスにより形成される。 The second columnar member 51 is a prismatic insulating member extending in the vertical direction. The second columnar member 51 is formed of, for example, glass.
第2作用電極52は、第2柱状部材51の4つの側面のうちの1つの全体に設けられる。第2参照電極53は、第2柱状部材51の他の側面の全体に設けられる。第2作用電極52と第2参照電極53とは、互いに隣り合わず、間隔を空けて配置される。本実施形態では、第2作用電極52および第2参照電極53とはそれぞれ、第2柱状部材51の側面に形成された金属薄膜である。しかしながら、第2作用電極52および第2参照電極53はそれぞれ、第2柱状部材51に金属板を接着したものや、その他の構成であってもよい。
The second working
図2~図4に示すように、基板11には、観察用開口13の周囲に、第1電極部40および第2電極部50が挿入される貫通孔14が設けられている。図3および図4に示すように、第1電極部40および第2電極部50はそれぞれ、その上端部が基板11の上面よりも上方に配置される。
As shown in FIGS. 2 to 4, the
図2に示すように、各貫通孔14に隣接する位置に、2つの導線12の電極接続端子121が配置される。図4に示すように、第1作用電極42および第1参照電極43はそれぞれ、導電性接続部材15を介して導線12の電極接続端子121に電気的に接続される。
As shown in FIG. 2, the
各導電性接続部材15は、略直方体形状である。図2中の拡大部および図4に示すように、導電性接続部材15は、各導線12の電極接続端子121の上に配置される。また、図4に示すように、第1作用電極42の上端部付近が、1つの導電性接続部材15の側面と導電性接着剤16により接着される。また、当該導電性接続部材15の下面と1つの導線12の電極接続端子121の上面とが、導電性接着剤16により接着される。これにより、第1作用電極42と1つの導線12とが、導電性接続部材15および導電性接着剤16を介して電気的に接続される。
Each conductive connecting
同様に、第1参照電極43の上端部付近が、他の1つの導電性接続部材15の側面と導電性接着剤16により接着される。また、当該導電性接続部材15の下面と他の1つの導線12の電極接続端子121の上面とが、導電性接着剤16により接着される。これにより、第1参照電極43と他の1つの導線12とが、導電性接続部材15および導電性接着剤16を介して電気的に接続される。
Similarly, the vicinity of the upper end portion of the
また、このように第1作用電極42および第1参照電極43が導電性接続部材15を介して基板11に接着されることにより、第1電極部40の上端部が基板11に固定される。
Further, the first working
第2作用電極52および第2参照電極53についても、第1作用電極42および第1参照電極43と同様に、導電性接続部材15を介して導線12と接続される。
The second working
電極保持部材1を細胞培養容器2に載置する際には、図1に示すように、電極部10を挿入するウェル21において、インサートカップ20を所定の方向の一方側(図1中では右側)に寄せて配置する。そして、電極保持部材1を細胞培養容器2に載置することによって、電極部10を所望のウェル21内に挿入する。
When the
本実施形態では、電極保持部材1を細胞培養容器2に載置した際に、各観察用開口13が各ウェル21の略中央に配置される。ここで、図2に示すように、第1電極部40は、観察用開口13の一方側(図2中では右側)に配置され、第2電極部50は、観察用開口13の他方側(図2中では左側)に配置される。上記の通り、インサートカップ20は、ウェル21の一方側に偏って配置されるため、第1電極部40は、インサートカップ20の内部に挿入され、第2電極部50は、インサートカップ20の外部に挿入される。
In the present embodiment, when the
図3に示すように、第2電極部50は、第1電極部40よりも下方に突出している。これにより、電極保持部材1を細胞培養容器2に載置した際に、第1電極部40の下端部がインサートカップ20の細胞培養部33よりも上方に配置されるとともに、第2電極部50の下端部が細胞培養部33よりも下方に配置される。
As shown in FIG. 3, the
<2.培養細胞の電気抵抗計測>
続いて、電極保持部材1に保持される電極42,43,52,53を用いた培養細胞の電気抵抗計測の方法について、図3および図5を参照しつつ説明する。図5は、計測ユニット9の電気的な接続を示した概略図である。なお、図5では、電極42,43,52,53が1組のみの場合における計測ユニット9の電気的な接続を示している。なお、複数の電極部10に対して同時に計測を行う場合には、計測ユニット9の構成が異なる。例えば、後述する計測装置90の電源装置91や電圧計92の接続先を、電極部10ごとに切替可能とする。
<2. Measurement of electrical resistance of cultured cells>
Subsequently, a method of measuring the electrical resistance of the cultured cells using the
図5に示すように、計測ユニット9は、上記の電極保持部材1、細胞培養容器2および細胞培養容器2内の培養液と、電極保持部材1と接続する計測装置90とにより構成される。
As shown in FIG. 5, the
計測装置90は、電源装置91と、電圧計92とを有する。電源装置91の2つの出力端子は、導線12を介して第1作用電極42および第2作用電極52に接続される。また、電圧計92の2つの入力端子は、導線12を介して第1参照電極43および第2参照電極53に接続される。
The measuring
培養細胞の電気抵抗計測を行う場合、ウェル21には、第1作用電極42および第1参照電極43の少なくとも先端部が浸る量の培養液を注入する必要がある。なお、培養液中の抵抗値の条件を均一化するためには、ウェル21内を培養液で満たすことが好ましい。
When measuring the electrical resistance of cultured cells, it is necessary to inject into the well 21 an amount of the culture solution in which at least the tips of the first working
図5において、抵抗Rmは、細胞培養部33および細胞培養部33上に培養された細胞(以下、「細胞部」と称する)による電気抵抗である。抵抗Rw1は、第1作用電極42と細胞部との間における培養液の電気抵抗である。抵抗Rw2は、第2作用電極52と細胞部との間における培養液の電気抵抗である。抵抗Rr1は、第1参照電極43と細胞部との間における培養液の電気抵抗である。抵抗Rr2は、第2参照電極53と細胞部との間における培養液の電気抵抗である。
In FIG. 5, the resistance Rm is the electrical resistance of the
各電極42,43,52,53と細胞部との間における各抵抗Rw1,Rr1,Rw2,Rr2と、細胞が培養されていない状態の細胞培養部33の抵抗Rmとの抵抗値はそれぞれ、予めコントロールとして測定しておく。
The resistance values of the resistances Rw1, Rr1, Rw2, Rr2 between the
そして、電源装置91を駆動させて第1作用電極42と第2作用電極52との間に電位をかけ、同時に、電圧計92によって第1参照電極43と第2参照電極53との間の電圧値を計測する。計測した電圧値から、作用電極42,52間の正確な電圧値を推測することにより、作用電極42,52間の電気抵抗値を算出する。さらに、作用電極42,52間の電気抵抗値から細胞部の抵抗Rmを算出する。これにより、細胞培養部33上に培養された細胞の電気的特性を得ることができる。
Then, the
なお、電源装置91を用いて第1作用電極42と第2作用電極52との間に電位をかけると、第1作用電極42および第2作用電極52の電極表面において、培養液の酸化反応および還元反応が起きる。これにより、第1作用電極42および第2作用電極52の電極表面には、電気二重層が形成される。このため、電源装置91による出力電位が、作用電極42,52間の正確な電圧値とはならない。そこで、第1作用電極42および第2作用電極52のそれぞれの近傍に第1参照電極43および第2参照電極53を配置し、参照電極43,53間の電位を計測する。その計測電位を利用して計算することにより、より正確に細胞部の抵抗Rmを計測することができる。
When a potential is applied between the first working
この電極保持部材1では、各ウェル21に対応する観察用開口13を設けている。これにより、細胞培養部33上で培養される細胞の観察を行いやすい。さらに、電極部10の第1電極部40および第2電極部50を観察用開口13の観察用開口13と上下方向に重ならない位置に配置することにより、培養された細胞の電気抵抗の測定と、細胞の観察とを同時に行うことができる。
The
<3.変形例>
以上、本発明の主たる実施形態について説明したが、本発明は、上記の実施形態に限定されるものではない。
<3. Modification example>
Although the main embodiments of the present invention have been described above, the present invention is not limited to the above embodiments.
上記の実施形態では、電極保持部材の有する電極部の数が観察用開口の数と同一であった。すなわち、電極保持部材が、全ての観察用開口のそれぞれに対応する電極部を有していた。しかしながら、本発明の電極保持部材の有する電極部の数は、観察用開口の数よりも少なくてもよい。すなわち、電極保持部材が、複数の観察用開口の一部のみに対応する電極部を有していてもよい。 In the above embodiment, the number of electrode portions included in the electrode holding member is the same as the number of observation openings. That is, the electrode holding member had an electrode portion corresponding to each of all the observation openings. However, the number of electrode portions included in the electrode holding member of the present invention may be smaller than the number of observation openings. That is, the electrode holding member may have an electrode portion corresponding to only a part of a plurality of observation openings.
また、上記の実施形態では、導線部の一例が示されているが、本発明はこれに限られない。導線部は、基板にプリントされたものに限られない。また、導線部の配置は、適宜変更しうる。 Further, in the above embodiment, an example of the conducting wire portion is shown, but the present invention is not limited to this. The conductor portion is not limited to the one printed on the substrate. Moreover, the arrangement of the conducting wire portion can be changed as appropriate.
また、上記の実施形態では、同じ列に並ぶ複数の電極部において、第1電極部と第2電極部とが一直線上に配置されたが、本発明はこれに限られない。例えば、電極保持部材が細胞培養容器に載置された際に、第2電極部は、ウェルの角部に配置されてもよい。 Further, in the above embodiment, the first electrode portion and the second electrode portion are arranged in a straight line in a plurality of electrode portions arranged in the same row, but the present invention is not limited to this. For example, when the electrode holding member is placed on the cell culture vessel, the second electrode portion may be arranged at the corner portion of the well.
また、上記の実施形態では、電極保持部材が載置される細胞培養容器のウェルの形状が上面視で略四角形であったが、本発明はこれに限られない。細胞培養容器のウェルの形状は、上面視で丸形であってもよい。 Further, in the above embodiment, the shape of the well of the cell culture container on which the electrode holding member is placed is substantially quadrangular in top view, but the present invention is not limited to this. The shape of the wells of the cell culture vessel may be round when viewed from above.
また、電極保持部材の細部の構成については、本願の各図と相違していてもよい。また、上記の実施形態や変形例に登場した各要素を、矛盾が生じない範囲で、適宜に組み合わせてもよい。 Further, the detailed configuration of the electrode holding member may be different from each drawing of the present application. Further, the elements appearing in the above-described embodiments and modifications may be appropriately combined as long as there is no contradiction.
1 電極保持部材
2 細胞培養容器
9 計測ユニット
10 電極部
11 基板
12 導線
13 観察用開口
14 貫通孔
15 導電性接続部材
16 導電性接着剤
20 インサートカップ
21 ウェル
31 筒部
32 支持部
33 細胞培養部
40 第1電極部
41 第1柱状部材
42 第1作用電極
43 第1参照電極
50 第2電極部
51 第2柱状部材
52 第2作用電極
53 第2参照電極
1
Claims (4)
格子状に配置された複数の観察用開口を有し、水平方向に延びる平板状かつ絶縁性の基板と、
前記観察用開口の一部または全てのそれぞれの近傍に配置される、複数の電極部と、
を有し、
前記電極部はそれぞれ、
一端を前記基板に固定され、前記基板から下方へ延びる第1電極部および第2電極部
を有し、
前記第1電極部は、
絶縁性の第1柱状部材と、
前記第1柱状部材の側面に設けられる第1作用電極と、
前記第1柱状部材の側面に設けられる第1参照電極と、
を有し、
前記第2電極部は、
絶縁性の第2柱状部材と、
前記第2柱状部材の側面に設けられる第2作用電極と、
前記第2柱状部材の側面に設けられる第2参照電極と、
を有する、電極保持部材。 An electrode holding member for arranging an electrode in the recess of a well plate having a plurality of recesses.
A flat plate-like and insulating substrate that has multiple observation openings arranged in a grid pattern and extends in the horizontal direction.
A plurality of electrode portions arranged in the vicinity of each of a part or all of the observation openings, and
Have,
Each of the electrode portions
One end thereof is fixed to the substrate and has a first electrode portion and a second electrode portion extending downward from the substrate.
The first electrode portion is
Insulating first columnar member and
A first working electrode provided on the side surface of the first columnar member and
A first reference electrode provided on the side surface of the first columnar member and
Have,
The second electrode portion is
Insulating second columnar member and
A second working electrode provided on the side surface of the second columnar member and
A second reference electrode provided on the side surface of the second columnar member,
The electrode holding member having .
前記基板は、 The substrate is
少なくとも一部が前記基板の上面にプリントされた複数の導線 Multiple conductors, at least partially printed on the top surface of the substrate
を有し、Have,
前記第1電極部および前記第2電極部はそれぞれ、その上端部が前記基板の上面よりも上方に配置され、 The upper end of each of the first electrode portion and the second electrode portion is arranged above the upper surface of the substrate.
前記基板の上面にプリントされた前記導線の上面と、前記第1作用電極、前記第1参照電極、前記第2作用電極、および前記第2参照電極のいずれかとは、略直方体の導電性接続部材を介して電気的に接続される、電極保持部材。 The upper surface of the conducting wire printed on the upper surface of the substrate and any one of the first working electrode, the first reference electrode, the second working electrode, and the second reference electrode are substantially rectangular conductive connecting members. An electrode holding member that is electrically connected via.
前記電極部の数は、前記観察用開口の数と同一である、電極保持部材。 The number of the electrode portions is the same as the number of the observation openings, the electrode holding member.
前記電極部の数は、前記観察用開口の数よりも少ない、電極保持部材。 The number of the electrode portions is smaller than the number of the observation openings, the electrode holding member.
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