JP7093489B2 - Treatment for cerebral infarction - Google Patents
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Description
本発明は脳梗塞を治療するための医薬組成物に関する。 The present invention relates to a pharmaceutical composition for treating cerebral infarction.
脳梗塞では、脳血管の詰まり、血流循環の低下などにより、脳組織が酸素欠乏、栄養不足などに陥り、その状態がある程度の時間続いた結果、脳組織が壊死・梗塞が認められる。
脳梗塞によって失われた機能の回復を図るため早期からリハビリの実施が行われているが、虚血性脳梗塞3年後、患者の20%-50%の患者が運動機能障害、言語障害などのハンディキャップを抱えている。
In cerebral infarction, the brain tissue becomes deficient in oxygen, lack of nutrition, etc. due to clogging of cerebral blood vessels, decreased blood flow circulation, etc., and as a result of the state continuing for a certain period of time, necrosis / infarction is observed in the brain tissue.
Rehabilitation is performed from an early stage to recover the function lost due to cerebral infarction, but 20% -50% of patients have motor dysfunction, speech disorder, etc. 3 years after ischemic cerebral infarction. I have a handicap.
脳梗塞の治療方法としては、急性期においては発症後4.5時間内でt-PAによる血栓溶解療法、発症48時間内でヘパリンによる抗凝固療法、血液希釈療法などが存在し梗塞エリアの抑制が図られる。 In the acute phase, thrombolytic therapy with t-PA, anticoagulant therapy with heparin, blood dilution therapy, etc. are available within 4.5 hours after onset, and the infarct area can be suppressed. Be done.
脳梗塞の治療方法として、上記のとおり急性期においては梗塞エリアを抑制するものが知られている一方で、急性期の後のステージである亜急性期又は慢性期における運動機能障害などの症状に対しては、根本的に有効な治療方法はないし、用いられる薬剤も存在しないのが現状である。
本発明は、亜急性期又は慢性期の脳梗塞を処置又は治療に用いるための医薬組成物を提供することを課題とした。
As a treatment method for cerebral infarction, as described above, one that suppresses the infarct area in the acute phase is known, but for symptoms such as motor dysfunction in the subacute phase or the chronic phase, which is the stage after the acute phase. On the other hand, there is no fundamentally effective treatment method, and there is no drug used at present.
It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for treating or treating subacute or chronic cerebral infarction.
上記課題に鑑み本発明者らは、亜急性期又は慢性期の脳梗塞に有効な化合物を探索したところ、ある種の化合物によって亜急性期又は慢性期の脳梗塞の治療を行いえる可能性を見出し、さらに鋭意研究を進めた結果本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、少なくとも以下の発明に関する：
［１］下記の化学構造式で示される化合物（ＳＭ－３４５４３１）及び少なくとも１つの薬学上許容される担体を含む、亜急性期又は慢性期の脳梗塞を治療するための医薬組成物。
［２］脳梗塞の発症後７日目以降に投与される、上記［１］の医薬組成物。
［３］脳梗塞の発症後８日目～１４日目における少なくとも１日及び３週間目及び／又は４週間目にさらに投与される、上記［２］の医薬組成物。
［４］傷害が生じた神経及び軸索を再生する、上記［１］～［３］のいずれかの医薬組成物。
In view of the above problems, the present inventors have searched for a compound effective for subacute or chronic cerebral infarction, and found that a certain compound may be able to treat subacute or chronic cerebral infarction. As a result of the discovery and further diligent research, the present invention was completed.
That is, the present invention relates to at least the following inventions:
[1] A pharmaceutical composition for treating subacute or chronic cerebral infarction, which comprises a compound (SM-345431) represented by the following chemical structural formula and at least one pharmaceutically acceptable carrier.
[2] The pharmaceutical composition according to the above [1], which is administered after the 7th day after the onset of cerebral infarction.
[3] The pharmaceutical composition according to the above [2], which is further administered at least 1 day and 3 weeks and / or 4 weeks after the onset of cerebral infarction.
[4] The pharmaceutical composition according to any one of the above [1] to [3], which regenerates injured nerves and axons.
本発明によれば、亜急性期又は慢性期の脳梗塞を治療するための治療に用いるための治療薬剤が提供される。
より具体的には本発明によれば、発症後７日目以降に投与されても脳梗塞の治療が可能になる。
本発明による医薬組成物のうち脳梗塞の発症後８日目～１４日目における少なくとも１日及び３週間目及び／又は４週間目にさらに投与されるものによれば、脳梗塞の治療をより効果的に行うことができる。
セマフォリンはこれまで約20種類ほど見出されているが、クラス3型と呼ばれるサブファミリーの遺伝子群は神経成長円錐の伸長を抑制する機能などを有し、特に研究が進んでいる。
クラス3型のセマフォリン（Sema3A）は、10 pMという低濃度で、神経細胞を退縮させることが知られ、Sema3Aを阻害する低分子化合物であるSM-345431は、損傷部での神経の再生を促し、例として脊髄損傷の改善が想定されている（特許文献１）。
一方、脳梗塞とSema3Aとの関連では、中大脳動脈閉塞による脳梗塞モデルにおいて、急性期でSema3A のmRNAの発現が脳内で増加していること（非特許文献１）、及びその下流の因子が活性化していることが知られている（非特許文献２）。さらに本モデルでは神経脱落スコア（Neurological Deficit Score、NDS）の悪化が認められるが、Sema3Aを欠損させた場合NDSの改善が認められることが明らかにされている（非特許文献３）。
INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a therapeutic agent for use in the treatment for treating subacute or chronic cerebral infarction is provided.
More specifically, according to the present invention, it is possible to treat cerebral infarction even if it is administered after the 7th day after the onset.
According to the pharmaceutical composition according to the present invention, which is further administered at least 1 day and 3 weeks and / or 4 weeks after the onset of cerebral infarction, the treatment of cerebral infarction is further improved. It can be done effectively.
About 20 types of semaphorins have been found so far, but the gene cluster of the subfamily called
On the other hand, regarding the relationship between cerebral infarction and Sema3A, in the cerebral infarction model due to middle cerebral artery occlusion, the expression of Sema3A mRNA is increased in the brain in the acute phase (Non-Patent Document 1), and factors downstream thereof. Is known to be activated (Non-Patent Document 2). Furthermore, in this model, deterioration of the neurological deficit score (NDS) is observed, but it has been clarified that improvement of NDS is observed when Sema3A is deficient (Non-Patent Document 3).
本発明の医薬組成物の有効成分として用いられる化合物であるＳＭ－３４５４３１について、同化合物がセマフォリン阻害剤であり、セマフォリン阻害剤とはセマフォリンのいずれかが有する活性、例えば、細胞の遊走活性、細胞死誘導活性、細胞の球状化や成長円錐の退縮といった細胞の形態変化、神経突起伸長抑制あるいは促進活性、神経細胞の樹状突起の伸長促進あるいは抑制活性、神経軸索ガイダンス活性などを阻害する物質であることが、特許文献１には記載されている。また、特許文献１記載されている脊髄神経の損傷及び／又は末梢神経の損傷を伴う疾患を含む神経障害疾患及び／又は神経変性疾患の予防若しくは治療剤が治療の対象とする疾患には、脳梗塞などに起因する神経障害や脳梗塞が包含されていることが、同文献には記載されている。
特許文献４には「ラット中大脳動脈閉塞モデルにおける薬理試験例」として、脳神経細胞の障害は、永久中大脳動脈閉塞または中大脳動脈閉塞－再開通によって生じる脳梗塞巣の大きさとして評価できることや、脳梗塞巣に存在する神経線維の数、再生神経線維の数、あるいは健常部より梗塞部へと進入する線維の数についても定量化でき、障害の程度を知る指標となり、これらのパラメーターを指標として抑制効果を有する虚血性脳血管障害治療剤または予防剤の薬理作用を確認できることが開示され、被験物質としてＳＭ－３４５４３１（同文献においては「ＳＰＦ－３０５９－５」と表記されている）が挙げられている。
Regarding SM-345431, which is a compound used as an active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, the compound is a semaphorin inhibitor, and the semaphorin inhibitor is an activity possessed by any one of semaphorins, for example, cell migration. Activity, cell death-inducing activity, cell morphological changes such as cell spheroidization and growth cone retraction, neurite outgrowth suppression or promotion activity, nerve cell dendrite elongation promotion or suppression activity, nerve axon guidance activity, etc. It is described in
In
脳梗塞とSema3Aとの関係について、上記のとおり急性期の脳梗塞の病態においてSema3Aが関与することは知られていた。また、ＳＭ－３４５４３１がセマフォリン阻害剤であることも知られている。 Regarding the relationship between cerebral infarction and Sema3A, it was known that Sema3A is involved in the pathophysiology of cerebral infarction in the acute phase as described above. It is also known that SM-345431 is a semaphorin inhibitor.
しかしながらSema3Aが亜急性期又は慢性期の脳梗塞に関与していることはこれまで知られていないし、亜急性期又は慢性期において、セマフォリン阻害剤により対象の運動機能の改善がなされることについては、これまで示唆さえなされていない。また特許文献１や特許文献４に、脳梗塞についての試験結果等は示されていない。
さらに、脳梗塞の急性期では虚血性障害に起因する神経細胞死がおこる一方で、亜急性期及び慢性期においては神経細胞死が顕著ではない。亜急性期から慢性期において軸索再生をはじめとした虚血性障害後の神経再生が徐々にはじまるが、セマフォリン3Aをはじめとした軸索再生阻害因子やグリア瘢痕等により神経の回復は困難である。
However, it has not been known that Sema3A is involved in subacute or chronic cerebral infarction, and that semaphorin inhibitors improve the motor function of subjects in the subacute or chronic phase. Has not even been suggested so far. Further,
Furthermore, while neuronal cell death due to ischemic injury occurs in the acute phase of cerebral infarction, neuronal cell death is not remarkable in the subacute phase and the chronic phase. From the subacute phase to the chronic phase, nerve regeneration after axonal regeneration such as axonal regeneration gradually begins, but nerve recovery is difficult due to axonal regeneration inhibitory factors such as semaphorin 3A and glial scars. be.
これに対して本発明者らは、Sema3Aが亜急性期又は慢性期の脳梗塞に関与していることを明らかにしたうえで、本発明の医薬組成物が脳梗塞後亜急性期においてセマフォリン3Aを機能阻害することによりRnd1/R-Ras/Akt/pGSK-3βシグナルを介して虚血後軸索再生を促進させる可能性があることを把握し、さらに亜急性期又は慢性期の脳梗塞に生じる生体における神経機能及び運動機能が、本発明の医薬組成物により有意に改善されることを明らかにした。 したがって本発明の医薬組成物は上記各文献に記載されている技術を含む従来技術からは想到しえないものであるし、本発明の医薬組成物が奏する、亜急性期又は慢性期の脳梗塞に有効な治療剤としての効果は従来技術からは予測不能な顕著な効果である。 On the other hand, the present inventors have clarified that Sema3A is involved in subacute or chronic cerebral infarction, and then the pharmaceutical composition of the present invention is semaphorin in the post-cerebral infarction subacute stage. We understand that inhibition of 3A may promote post-ischemic axonal regeneration via Rnd1 / R-Ras / Akt / pGSK-3β signals, and further subacute or chronic cerebral infarction. It was clarified that the neural function and the motor function in the living body generated in the above are significantly improved by the pharmaceutical composition of the present invention. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention cannot be conceived from the prior art including the techniques described in the above documents, and the cerebral infarction in the subacute phase or the chronic phase exhibited by the pharmaceutical composition of the present invention. The effect as an effective therapeutic agent is a remarkable effect unpredictable from the prior art.
本明細書における「脳梗塞の亜急性期又は慢性期」の語のうち、「亜急性期」は、脳梗塞の症状が発生してから約７日目～約２１日目までの時期を意味し、「慢性期」は脳梗塞の症状が発生してから約２８日目以降の時期を意味する。
本明細書における「運動機能の改善」の語は、脳梗塞により生じた何らかの運動機能の障害が低減されることを意味する。
「運動機能の障害」には、限定されないあらゆる可動部位を動かす機能や、可動範囲、動く速度、あるいはバランスが、脳梗塞が発症する前より劣ったり、コントロールできない状態にあることが包含される。上記可動部位には、頭部や手足といった体を構成する部位のほか、口、舌及び咽頭といった小器官も包含される。
本明細書にける「治療」の語は、医薬組成物を対象に適用して疾患により生じた症状の程度を低減するか又は対象を疾患から完治することを意味する。
本明細書にける「処置」の語は、医薬組成物を対象に適用して疾患により生じた症状の程度を低減するか又は対象を疾患から完治することを試みることを意味する。
Of the terms "subacute or chronic phase of cerebral infarction" in the present specification, "subacute phase" means the period from about 7 days to about 21 days after the onset of symptoms of cerebral infarction. However, the "chronic phase" means the period after about 28 days after the onset of cerebral infarction symptoms.
As used herein, the term "improvement of motor function" means that any impaired motor function caused by cerebral infarction is reduced.
"Impairment of motor function" includes the ability to move any, but not limited to, range of motion, speed of motion, or balance that is inferior or uncontrollable compared to before the onset of cerebral infarction. The movable parts include not only parts constituting the body such as the head and limbs, but also organelles such as the mouth, tongue and pharynx.
The term "treatment" herein means applying a pharmaceutical composition to a subject to reduce the degree of symptoms caused by the disease or to cure the subject completely from the disease.
The term "treatment" herein means applying a pharmaceutical composition to a subject to reduce the degree of symptoms caused by the disease or attempt to cure the subject completely from the disease.
本発明の医薬組成物の有効成分として用いられる化合物であるＳＭ－３４５４３１は、下記の化学構造を有する化合物であり、本発明はＳＭ－３４５４３１及び少なくとも１つの薬学上許容される担体を含む、亜急性期又は慢性期の脳梗塞を治療するための医薬組成物である：
ＳＭ－３４５４３１はキサントン化合物とも呼ばれる化合物の一つであり、セマフォリン３Ａの神経伸長活性を阻害する作用を有することが知られている化合物である。
理論に束縛されるものではないが、本発明の医薬組成物はＳＭ－３４５４３１を含むため、血管新生の促進により、傷害が生じた神経や軸索について再生し、及び／又は神経新生を促進することにより、亜急性期又は慢性期の脳梗塞の治療に資するものである可能性がある。
SM-345431 is one of the compounds also called a xanthone compound, and is a compound known to have an action of inhibiting the nerve elongation activity of semaphorin 3A.
Without being bound by theory, the pharmaceutical composition of the present invention contains SM-345431 and thus promotes angiogenesis to regenerate and / or promote neurogenesis of injured nerves and axons. This may contribute to the treatment of subacute or chronic cerebral infarction.
ＳＭ－３４５４３１はペニシリウム・エスピー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）ＳＰＦ－３０５９株の培養、化学的な全合成、又は本培養もしくは全合成によって得られた物を原料に用いた公知の合成方法による化学的な変換によって得ることができる。
培養としては、大阪府内土壌より分離したペニシリウム属に属するカビＳＰＦ－３０５９株［本菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約に基づき、２００１年７月１３日に経済産業省独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（〒３０５－８５６６茨城県つくば市東１－１－１中央第６）に受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ－７６６３として寄託されている。］を培養することにより効果的に得ることができる。具体的には、国際公開第０２／０９７５６号パンフレット（特許文献１）又は国際公開第０３／０６２２４３号パンフレット（特許文献２）に記載された方法に従って、当該化合物を得ることができる。
全合成としては、特開２００８－１３５３０号公報（特許文献３）に記載された方法に従ってＳＭ－３４５４３１を得ることができる。
SM-345431 is a culture of Penicillium sp. SPF-3059 strain, chemical total synthesis, or chemical conversion by a known synthetic method using a product obtained by main culture or total synthesis as a raw material. Can be obtained by.
As a culture, the fungus SPF-3059 strain belonging to the genus Penicillium isolated from the soil in Osaka Prefecture [This strain is based on the Butapest Convention on International Approval of Deposit of Microorganisms in Patent Procedures, Economy, Trade and Industry on July 13, 2001. It has been deposited as a deposit number FERM BP-7663 at the Patent Organism Depositary Center of the Ministry of Economy, Trade and Technology (METI, 305-8566, Ibaraki Prefecture, 1-1-1, Higashi, Central No. 6). ] Can be effectively obtained by culturing. Specifically, the compound can be obtained according to the method described in International Publication No. 02/09756 (Patent Document 1) or International Publication No. 03/062443 (Patent Document 2).
For total synthesis, SM-345431 can be obtained according to the method described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-13530 (Patent Document 3).
投与時期
本発明の医薬組成物の投与時期は、脳梗塞の亜急性期又は慢性期であれば限定されない。
本発明の医薬組成物の投与時期として、脳梗塞の発症後７日目を含む投与時期は好ましく、脳梗塞の発症後７日目～２１日目における少なくとも１日をさらに含む投与時期はより好ましく、脳梗塞の発症後８日目～１４日目における少なくとも１日をさらに含む投与時期はさらにより好ましい。本発明の医薬組成物を脳梗塞の発症後７日目～１３日目まで毎日投与することもさらにより好ましく、発症後およそ３週間後及び／又は４週間後にも投与することは一層より好ましい。
Time of administration The time of administration of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited as long as it is in the subacute stage or the chronic stage of cerebral infarction.
As the administration time of the pharmaceutical composition of the present invention, the administration time including 7 days after the onset of cerebral infarction is preferable, and the administration time including at least 1 day from 7 days to 21 days after the onset of cerebral infarction is more preferable. The administration time including at least one day on the 8th to 14th days after the onset of cerebral infarction is even more preferable. It is even more preferable to administer the pharmaceutical composition of the present invention daily from the 7th to the 13th day after the onset of cerebral infarction, and even more preferably to administer it approximately 3 weeks and / or 4 weeks after the onset.
投与経路・剤形
本発明の医薬組成物はＳＭ－３４５４３１及び少なくとも１つの薬学上許容される担体を含むところ、薬学上許容される担体は限定されない。本発明の組成物は、薬学的に許容される添加剤を担体として用いて、公知の方法で製造することができる。
本発明の医薬組成物に用いられる担体としては、目的に応じて、賦形剤、崩壊剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、等張剤、結合剤、流動化剤、滑沢剤、コーティング剤、溶解剤、溶解補助剤、増粘剤、分散剤、安定化剤、甘味剤、香料等を用いることができる。添加剤として、具体的には、例えば、乳糖、マンニトール、結晶セルロース、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、トウモロコシデンプン、部分α化デンプン、カルメロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、ステアリン酸マグネシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、酸化チタン、タルク等が挙げられる。
Route of Administration / Dosage Form The pharmaceutical composition of the present invention contains SM-345431 and at least one pharmaceutically acceptable carrier, but the pharmaceutically acceptable carrier is not limited. The composition of the present invention can be produced by a known method using a pharmaceutically acceptable additive as a carrier.
The carrier used in the pharmaceutical composition of the present invention includes excipients, disintegrants, diluents, pH buffers, isotonic agents, binders, fluidizers, lubricants, coating agents, etc., depending on the intended purpose. Dissolving agents, dissolving aids, thickeners, dispersants, stabilizers, sweeteners, flavors and the like can be used. Specific examples of the additive include lactose, mannitol, crystalline cellulose, low-substituted hydroxypropyl cellulose, corn starch, partially pregelatinized starch, carmellose calcium, croscarmellose sodium, hydroxypropyl cellulose, hydroxypropylmethyl cellulose, and the like. Examples thereof include polyvinyl alcohol, magnesium stearate, stearyl sodium fumarate, polyethylene glycol, propylene glycol, titanium oxide, talc and the like.
本発明の医薬組成物は、経口的又は非経口的に投与することができ、全身的投与又は局所的投与のいずれも可能であり、より好ましくは非経口的に投与してよい。
本発明の医薬組成物は、経口的には、通常用いられる投与形態、例えば錠剤、丸剤、粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液などの剤型で経口的に投与することができる。
The pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and can be administered systemically or topically, more preferably parenterally.
The pharmaceutical composition of the present invention is orally administered in a commonly used dosage form such as tablets, pills, powders, granules, capsules, syrups, emulsions and suspensions. be able to.
本発明の医薬組成物は、非経口的には、例えば、軟膏剤、注射剤、注射剤、静脈内注射用製剤（点滴剤）、筋注射剤、皮下注射剤、点鼻剤（鼻腔投与用スプレー剤）などの形態の製剤とすることができる。
静脈内注射用製剤（点滴剤）は好ましい。本発明の医薬組成物において注射剤としては、例えば、無菌の溶液または懸濁液、及び乳剤等が挙げられ、より具体的には例えば、水溶液、水－プロピレングリコール溶液等が挙げられる。注射剤は、水を含んでもよい、ポリエチレングリコールまたは／およびプロピレングリコールの溶液の形で製造することもできる。
The pharmaceutical composition of the present invention may be used parenterally, for example, as an ointment, an injection, an injection, an intravenous injection (drip), an intramuscular injection, a subcutaneous injection, or a nasal drop (for nasal administration). It can be a formulation in the form of a spray agent) or the like.
Intravenous injection preparations (drips) are preferred. Examples of the injection in the pharmaceutical composition of the present invention include sterile solutions or suspensions, emulsions and the like, and more specifically, examples thereof include aqueous solutions, water-propylene glycol solutions and the like. Injections can also be made in the form of a solution of polyethylene glycol and / and propylene glycol, which may contain water.
本発明の医薬組成物は、非経口投与においては、有効成分は水、生理食塩水、油、ブドウ糖水溶液などの生理的に許容しうる担体に溶解又は懸濁し、これは補助剤として乳化剤、安定化剤、浸透圧調整用塩又は緩衝剤を必要に応じて含有してもよい。添加物として、グリセリンや塩化ナトリウムなどの等張化剤、リン酸やクエン酸などの緩衝剤、塩酸や水酸化ナトリウムなどのｐＨ調節剤、ヒドロキシプルピルメチルセルロースやポリビニルアルコールなどの増粘剤、塩化ベンゼトニウムなどの保存剤、あるいは可溶化剤を必要に応じて含有してもよい。 In the pharmaceutical composition of the present invention, when administered parenterally, the active ingredient is dissolved or suspended in a physiologically acceptable carrier such as water, physiological saline, oil, or aqueous glucose solution, which is an emulsifier and stable as an auxiliary agent. An agent, an osmotic pressure adjusting salt or a buffer may be contained as required. Additives include tonicity agents such as glycerin and sodium chloride, buffers such as phosphoric acid and citric acid, pH adjusters such as hydrochloric acid and sodium hydroxide, thickeners such as hydroxypulpyrmethylcellulose and polyvinyl alcohol, and chloride. A preservative such as benzethonium or a solubilizer may be contained, if necessary.
本発明の医薬組成物は、液体の製剤の場合には、投与経路を問わず、適宜溶液、乳化液、懸濁液などにすることができる。 In the case of a liquid preparation, the pharmaceutical composition of the present invention can be appropriately made into a solution, an emulsion, a suspension or the like regardless of the route of administration.
投与量
本発明の医薬組成物の投与量及び投与回数は、投与法と患者の年齢、体重、病状等によって異なるが、病床部位に局所的に投与する方法が好ましい。また、１日あたり１回又は２回以上投与することが好ましい。２回以上投与するときは連日あるいは適当な間隔をおいて繰り返し投与することが望ましい。投与回数を減らすために徐放性製剤を用いることもできる。その場合は数日おきの投与が可能になる。
投与量は、成人患者一人１回当たり有効成分の量として数百μｇ～２ｇ、好ましくは５～百ｍｇ、更に好ましくは数十ｍｇ以下を用いることができ、１日１回又は数回にわけて投与することができる。投与回数を減らすために徐放性製剤を用いることができ、オスモティックポンプなどで長期間にわたって少量ずつ投与することもできる。非経口投与では、成人患者一人あたり０．１～１００ｍｇ／日、さらに好ましくは０．３～５０ｍｇ／日の投与量が挙げられ、１日１回又は数回に分けて投与することができる。投与回数を減らすために徐放性製剤を用いることもできる。
これらのいずれの投与方法においても、作用部位においてセマフォリンの活性を充分に阻害する濃度になるような投与経路、投与方法を採用することが好ましい。また、本発明の医薬組成物は、動物薬としての利用も可能である。当該動物の中でも哺乳類が好ましく、ヒトが最も好ましい。
Dosage The dose and frequency of administration of the pharmaceutical composition of the present invention vary depending on the administration method and the age, body weight, medical condition, etc. of the patient, but a method of locally administering to the bed site is preferable. In addition, it is preferable to administer once or twice or more per day. When administering more than once, it is desirable to administer repeatedly every day or at appropriate intervals. Sustained release preparations can also be used to reduce the number of doses. In that case, administration is possible every few days.
The dose may be several hundred μg to 2 g, preferably 5 to 100 mg, more preferably several tens of mg or less as the amount of the active ingredient per adult patient, and may be divided into once or several times a day. Can be administered. Sustained release preparations can be used to reduce the number of doses, and small doses can be administered over a long period of time using an osmotic pump or the like. For parenteral administration, a dose of 0.1 to 100 mg / day, more preferably 0.3 to 50 mg / day per adult patient can be mentioned, and the dose can be administered once or divided into several times a day. Sustained release preparations can also be used to reduce the number of doses.
In any of these administration methods, it is preferable to adopt an administration route and an administration method having a concentration that sufficiently inhibits the activity of semaphorin at the site of action. Further, the pharmaceutical composition of the present invention can also be used as a veterinary drug. Among the animals, mammals are preferable, and humans are the most preferable.
本発明の医薬組成物のその他の態様
本発明の医薬組成物は、脳梗塞の亜急性期又は慢性期における治療を可能にするといった効果を奏する。より具体的には、本発明の医薬組成物は脳梗塞の亜急性期又は慢性期に投与されることにより、脳梗塞により生じた運動機能の障害が回復するか又は回復が促進される。
本発明の医薬組成物のうち、脳梗塞の亜急性期又は慢性期に投与されることにより、脳梗塞により障害を受けた神経機能及び運動機能を改善するものは好ましい。また本発明の医薬組成物のうち、脳梗塞の亜急性期又は慢性期に投与されることにより、脳梗塞により生じた挺舌機能の回復を促進するか及び／又は前肢運動の機能を改善するものは好ましい。
また本発明の医薬組成物のうち、脳梗塞の亜急性期又は慢性期に投与されることにより、対象の死亡率を低下させるものは好ましい。また、本発明の医薬組成物のうち、脳梗塞の亜急性期又は慢性期に投与されることにより、梗塞巣において血管新生を促進するものも好ましい。
さらに本発明の医薬組成物のうち、脳梗塞の亜急性期又は慢性期に投与されることにより、神経新生を促進するものも好ましい。
Other Aspects of the Pharmaceutical Composition of the Present Invention The pharmaceutical composition of the present invention has an effect of enabling treatment in the subacute or chronic phase of cerebral infarction. More specifically, when the pharmaceutical composition of the present invention is administered in the subacute phase or the chronic phase of cerebral infarction, the impaired motor function caused by cerebral infarction is recovered or the recovery is promoted.
Among the pharmaceutical compositions of the present invention, those that improve the neural function and motor function impaired by cerebral infarction by being administered in the subacute phase or chronic phase of cerebral infarction are preferable. Further, among the pharmaceutical compositions of the present invention, when administered in the subacute stage or the chronic stage of cerebral infarction, the recovery of the tongue function caused by the cerebral infarction is promoted and / or the function of forefoot movement is improved. The one is preferable.
Further, among the pharmaceutical compositions of the present invention, those that reduce the mortality rate of a subject by administration in the subacute stage or the chronic stage of cerebral infarction are preferable. Further, among the pharmaceutical compositions of the present invention, those that promote angiogenesis in the infarcted lesion by being administered in the subacute stage or the chronic stage of cerebral infarction are also preferable.
Further, among the pharmaceutical compositions of the present invention, those that promote neurogenesis by administration in the subacute stage or the chronic stage of cerebral infarction are also preferable.
本発明の医薬組成物は、亜急性期又は慢性期の脳梗塞の状態にある対象における軸索の再生に関する試験において、再生を促進する剤として試薬的に用いることもできる。 The pharmaceutical composition of the present invention can also be used as a reagent as an agent for promoting regeneration in a test for axonal regeneration in a subject suffering from subacute or chronic cerebral infarction.
以下において実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの実施例にいかなる意味においても限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the technical scope of the present invention is not limited to these examples in any sense.
実施例1：本発明の医薬組成物による、脳梗塞モデルの挺舌機能回復促進の例
動物は6週齢（入荷時）雄性のWistar系ラットを日本クレアより購入し、1週間の検収検疫後に実験に用いた。セマフォリン阻害剤（SM-345431）を0.1 Mリン酸バッファー（pH7.7）を0.22 μmのフィルターで濾過後、5.0 mg/mlになるように調製し、本発明の医薬組成物とした。
ラットにイソフルラン吸入麻酔を行い、左内頸動脈より脳中大動脈（MCA）起始部まで先端をシリコンコーティングしたナイロン糸を挿入することによりMCAを2時間閉塞した。ラットをイソフルランで再び麻酔し、栓子を引き抜いてMCA支配領域の再開通を行い、術部を縫合しホームケージに戻した。虚血-再開通手術の翌日に神経症状評価及びtongue protrusion test（挺舌機能の評価）を行った。両テストの結果から傷害が不完全と判断されたラットは実験には使用しなかった。手術７日後の薬剤投与開始前に、再度、神経症状評価及びtongue protrusion testを行い、両テストの平均スコアが同程度になるようにPBS群（リン酸バッファーのみを投与した群）とSM群（本発明の医薬組成物を投与した群）に均等に振り分けた。
神経症状評価では下表に示す(1)前肢の屈曲、(2)胴のねじれ、(3)旋回、(4)後肢の配置、(5)自発運動について、0から１点あるいは0点から2点（(5)自発運動のみ）までのスコア付けを行い、獲得合計点数により評価した。
tongue protrusion testではシャーレに接着させた内径6 mmのチューブにピーナツバターを充填し、ラットのホームケージに一晩静置する。翌朝に上端からチューブの壁のピーナッツバターを舐め取った長さ（深さ）を測定する（図１）。脳梗塞手術前に2回の計測を行い、値の大きいものを手術前値とした。手術前値が8 mm未満のラットのデータは採用しなかった。
PBSあるいは本発明の医薬組成物を1日1回5mg/kgを2日間の休薬を挟みながら、術後7～10日目、13～17日目、20～24日目に静脈内投与した。tongue protrusion testは術後7日目、10日目、14日目、21日目、28日目に測定を実施した。各測定日におけるスコアについて、各ラットの術後７日目のスコアからの変化量を求め、該変化量を各群の術後7日目のスコア（平均）で除し、%表示した（図２）。
MCAO（中大脳動脈閉塞）による挺舌機能の障害は手術翌日に最も顕著に現れ、その後徐々に自然回復してきた。投与開始時からのスコアの回復度を比較したところ、術後10日から28日まで本発明の医薬組成物により挺舌機能の回復が“促進”されることが明らかとなった（図２）。
Example 1: Example of promotion of recovery of cerebral infarction model by the pharmaceutical composition of the present invention As an animal, a 6-week-old (at the time of arrival) male Wistar rat was purchased from Claire Japan, and after 1 week of quarantine and quarantine. Used in the experiment. A semaphorin inhibitor (SM-345431) was filtered through a 0.1 M phosphate buffer (pH 7.7) with a 0.22 μm filter and adjusted to 5.0 mg / ml to prepare the pharmaceutical composition of the present invention.
The rats were anesthetized by inhalation of isoflurane, and the MCA was occluded for 2 hours by inserting a nylon thread with a silicon coating at the tip from the left internal carotid artery to the origin of the middle cerebral artery (MCA). Rats were anesthetized again with isoflurane, the embolus was removed to reopen the MCA-dominated area, the surgical site was sutured, and the rat was returned to the home cage. The day after ischemia-reopening surgery, neurological symptom evaluation and tongue protrusion test (evaluation of tongue function) were performed. Rats judged to be incomplete based on the results of both tests were not used in the experiment. Nerve symptom evaluation and tongue protrusion test were performed again 7 days after the operation, and the PBS group (group receiving only phosphate buffer) and SM group (group receiving only phosphate buffer) so that the average scores of both tests were similar. The group to which the pharmaceutical composition of the present invention was administered) was evenly distributed.
In the evaluation of neurological symptoms, 0 to 1 point or 0 to 2 points for (1) forelimb flexion, (2) torso twist, (3) turning, (4) hind limb placement, and (5) spontaneous movement shown in the table below. Scores were given up to the score ((5) Spontaneous exercise only) and evaluated by the total score obtained.
In the tongue protrusion test, a tube with an inner diameter of 6 mm adhered to a petri dish is filled with peanut butter and placed in a rat home cage overnight. The next morning, the length (depth) of licking the peanut butter on the wall of the tube from the top is measured (Fig. 1). Two measurements were taken before cerebral infarction surgery, and the one with the larger value was taken as the preoperative value. Data from rats with preoperative values <8 mm were not included.
PBS or the pharmaceutical composition of the present invention was intravenously administered once daily at 5 mg / kg on the 7th to 10th, 13th to 17th, and 20th to 24th days after the operation, with a 2-day rest period. .. The tongue protrusion test was performed on the 7th, 10th, 14th, 21st, and 28th days after the operation. For the scores on each measurement day, the amount of change from the score on the 7th postoperative day of each rat was calculated, and the amount of change was divided by the score (mean) on the 7th postoperative day of each group and displayed as% (Fig.). 2).
Impairment of tongue function due to MCAO (middle cerebral artery occlusion) was most prominent the day after surgery, and then gradually recovered spontaneously. When the degree of recovery of the score from the start of administration was compared, it was clarified that the recovery of the tongue function was "promoted" by the pharmaceutical composition of the present invention from 10 days to 28 days after the operation (Fig. 2). ..
実施例2：本発明の医薬組成物による、脳梗塞モデルの前肢運動機能改善の例
実施例1記載の方法にて、ラット脳中大動脈閉塞を行い、群分けを行った。PBSあるいは本発明の医薬組成物（SM-345431を5.0 mg/ml含有する）を1日1回5mg/kgを2日間の休薬を挟みながら、術後7～10日目、13～17日目、20～24日目に静脈内投与した。
angle board testでは図のようにラットを頭が下向きになるように傾斜版の上に乗せると、ラットは下に滑り落ちないように四肢を突っ張って耐えようとする。傾斜角度を5度刻みで増やしていき、ラットが滑り落ちない最大の角度（θ）と体重から耐えることのできた斜面方向の力（N）を算出した（図３）。各ラットの術後７日目のθ値からの変化量を各群の術後7日目のθ値（平均）で除し、%表示した。N値についても同様にして算出した。
angle board testは術後7日目、14日目、21日目、28日目に測定を実施した。angle board testのスコアリングでは手術7～14日目に最も障害が大きく、その後、術後28日目まで次第に自然回復が見られた。投与開始時からのスコアの回復度を比較したところ、傾斜角と耐えられた下向きの力のいずれでも、本発明の医薬組成物投与群ではPBS群よりも有意に回復が促進することが認められた（図４）。
Example 2: Example of improvement of forefoot motor function of a cerebral infarction model by the pharmaceutical composition of the present invention Rat cerebral middle cerebral artery occlusion was performed by the method described in Example 1, and grouping was performed. 7 to 10 days and 13 to 17 days after surgery, with PBS or the pharmaceutical composition of the present invention (containing 5.0 mg / ml of SM-345431) once daily at 5 mg / kg with a 2-day washout. It was administered intravenously on the 20th to 24th day of the eye.
In the angle board test, when the rat is placed on the tilted plate with its head facing down as shown in the figure, the rat tries to endure by stretching its limbs so that it does not slip down. The tilt angle was increased in increments of 5 degrees, and the maximum angle (θ) at which the rat did not slip off and the force (N) in the slope direction that the rat could withstand were calculated from the weight (Fig. 3). The amount of change from the θ value on the 7th postoperative day of each rat was divided by the θ value (mean) on the 7th postoperative day of each group and displayed as%. The N value was calculated in the same way.
The angle board test was measured on the 7th, 14th, 21st, and 28th days after the operation. In the scoring of the angle board test, the disorder was the most severe on the 7th to 14th days after the operation, and then spontaneous recovery was observed until the 28th day after the operation. When the degree of recovery of the score from the start of administration was compared, it was found that the recovery was significantly promoted in the pharmaceutical composition-administered group of the present invention as compared with the PBS group in both the tilt angle and the downward force tolerated. (Fig. 4).
実施例3：本発明の医薬組成物による、脳梗塞モデルの死亡率抑制作用の例
実施例1記載の方法のうち栓子を留置したままMCAを永久閉塞した個体を作製し、その他は実施例1記載の方法にて、28日目まで実験を行ったラットについて、投与開始直前(day7)の生存個体数を100%として生存率をプロットした。その結果、傷害15日後(day15)の生存率がVehicle群においては53.3%であったのに対して本発明の医薬組成物投与群においては68.2%となり、本発明の医薬組成物により死亡率が抑制されることが明らかとなった（図５）。
Example 3: Example of mortality-suppressing action of a cerebral infarction model by the pharmaceutical composition of the present invention Among the methods described in Example 1, an individual in which MCA was permanently occluded with an embolus indwelled was prepared, and the others were Examples. For the rats tested up to the 28th day by the method described in 1, the survival rate was plotted with the number of surviving individuals immediately before the start of administration (day 7) as 100%. As a result, the
実施例4：本発明の医薬組成物による、脳梗塞モデルへの血管新生に対する作用の例
実施例1記載の方法にて、ラット脳中大動脈閉塞を行い、群分けを行った。術後7日目よりPBSあるいは本発明の医薬組成物を1日5mg/kg静脈内投与することを途中2日間の休薬（術後12～13日目）を挟んで術後14日目まで6回繰り返した。薬物投与開始から１週間後（脳梗塞手術から２週間後）に灌流固定、断頭して脳を摘出し、bregmaを含む厚さ4 mmの脳切片を切り出した。ホルマリンで一晩固定した後、脱水、透徹し、パラフィンブロックを作製した。8μmの薄切切片スライドを作製し、血管内皮細胞のマーカーであるvon Willebrand Factor(vWF)の抗体で免疫染色を行った（図６）。画像解析システムにて大脳皮質の梗塞巣と線条体の脳梗塞内に含まれる血管の数と各血管の断面積を測定した。血管数と各梗塞巣面積より血管数密度を算出した。
血管数密度は、本発明の医薬組成物投与群のほうがPBS投与群に比べて有意に高かった。これに対し個々の血管の断面積は本発明の医薬組成物投与群のほうが低かった（図７）。これらの結果は線条体でも同様であった。新生血管の断面積は小さいと考えられるので、これらの結果より本発明の医薬組成物は梗塞巣において血管新生を促進することが示唆された。
Example 4: Example of action of the pharmaceutical composition of the present invention on angiogenesis on a cerebral infarction model Rat cerebral middle cerebral artery occlusion was performed by the method described in Example 1 and grouped. From the 7th postoperative day, intravenously administer PBS or the pharmaceutical composition of the present invention at 5 mg / kg daily until the 14th postoperative day with a 2-day rest period (12th to 13th postoperative days). Repeated 6 times. One week after the start of drug administration (two weeks after cerebral infarction surgery), perfusion fixation and decapitation were performed to remove the brain, and a 4 mm-thick brain section containing bregma was cut out. After fixing with formalin overnight, dehydration and permeation were performed to prepare a paraffin block. An 8 μm sliced slide was prepared and immunostained with an antibody of von Willebrand Factor (vWF), which is a marker for vascular endothelial cells (Fig. 6). The number of blood vessels contained in the infarct lesion of the cerebral cortex and the cerebral infarction of the striatum and the cross-sectional area of each blood vessel were measured by an image analysis system. The blood vessel number density was calculated from the number of blood vessels and the area of each infarct lesion.
The blood vessel number density was significantly higher in the pharmaceutical composition-administered group of the present invention than in the PBS-administered group. On the other hand, the cross-sectional area of each blood vessel was lower in the pharmaceutical composition-administered group of the present invention (Fig. 7). These results were similar for the striatum. Since the cross-sectional area of new blood vessels is considered to be small, these results suggest that the pharmaceutical composition of the present invention promotes angiogenesis in infarcted lesions.
実施例5：本発明の医薬組成物による、脳梗塞モデルへの神経新生に対する作用の例
実施例4記載の方法にて、8μmの薄切切片スライドを作製し、神経前駆細胞マーカーDCXに対する抗体で脳組織切片を免疫染色した。本発明の医薬組成物投与群で脳室下帯（SVZ）におけるDCX陽性細胞の増加と梗塞部位に向けたマイグレーションの促進が観察された(図８)。さらに画像解析によりDCX陽性部位の面積を定量した所、SM投与群で増加傾向が認められた。
Example 5: Example of action of the pharmaceutical composition of the present invention on neurogenesis on a cerebral infarction model An 8 μm sliced slice slide was prepared by the method described in Example 4, and an antibody against the neural progenitor cell marker DCX was used. Brain tissue sections were immunostained. In the pharmaceutical composition-administered group of the present invention, an increase in DCX-positive cells in the subventricular zone (SVZ) and promotion of migration toward the infarct site were observed (Fig. 8). Furthermore, when the area of the DCX positive site was quantified by image analysis, an increasing tendency was observed in the SM-administered group.
参考例1：脳梗塞モデルラットのPeri-infarct areaにおけるセマフォリン3Aの推移に関する検討
実験動物として、9週雄性Wistarラットを日本チャールス・リバー株式会社より購入し、検収検疫後に脳梗塞モデル作製に用いた。先端を丸めたシリコンコート4-0ナイロン糸をラット中大脳動脈まで挿入させ、永久的中大脳動脈閉塞（Middle cerebral artery occlusion：MCAO）モデルを作製した。MCAO後3、7、14、28、56日目にラットを屠殺し、PBS100ml、4%パラホルムアルデヒド100mlにて灌流固定して脳を取り出した。取り出した脳は30％スクロースに48～72時間保存した後、クリオスタットにて20μmの脳切片を作成した。梗塞巣の辺縁より300μmをperi-infarct areaと定義し（図9のA）、セマフォリン3A、軸索のマーカーであるphosphorylated neurofilament heavy chain（pNFH）、神経細胞体のマーカーであるMicrotubule-associated protein 2（MAP2）の発現を免疫組織染色にて解析した。
Peri-infarct areaにおいて、セマフォリン3AはpNFHではなくMAP2と共発現し（図9のB）、セマフォリン3AとMAP2との共陽性細胞はMCAO後7日より14日まで上昇し、その後56日目にかけて減少した（図10）。つまり、セマフォリン3Aが脳梗塞後亜急性期の虚血周辺部に著しく発現することが明らかになった。
Reference example 1: Examination of changes in semaphorin 3A in the Peri-infarct area of cerebral infarction model rats A 9-week-old male Wistar rat was purchased from Japan Charles River Co., Ltd. as an experimental animal and used to prepare a cerebral infarction model after acceptance and quarantine. board. A silicon-coated 4-0 nylon thread with a rounded tip was inserted into the rat middle cerebral artery to create a permanent middle cerebral artery occlusion (MCAO) model. Rats were sacrificed on
In the Peri-infarct area, semaphorin 3A co-expressed with MAP2 instead of pNFH (B in Figure 9), and co-positive cells with semaphorin 3A and MAP2 increased from 7 days to 14 days after MCAO, then 56 days. It decreased in the eyes (Fig. 10). In other words, it was clarified that semaphorin 3A is significantly expressed in the peri-ischemic region in the subacute stage after cerebral infarction.
実施例6：ラット初代神経細胞におけるセマフォリン3Aの発現、リコンビナントセマフォリン3A、セマフォリン阻害剤（SM-345431）による軸索再生の検討
妊娠17日Wistarラットの胎児前頭葉皮質神経細胞から初代神経細胞培養を作製し、軸索が十分に発育した培養7日目に3時間の無糖無酸素負荷（Oxygen-glucose deprivation：OGD）を行った。OGD後、リコンビナントセマフォリン3Aを0.1nM、1nM、また、本発明の医薬組成物として、SM-345431をB27とL-glutaine（2.5mmol/L）を添加したニューロベイサル（Neurobasal）培地中に0.1μM、1μM含有する組成物を投与した。
脳梗塞慢性期に相当すると考えられるOGD後96時間目に培養神経細胞を回収し、ウェスタン・ブロットにてpNFH、神経細胞マーカーであるnon-phosphorylated NFH（npNFH）の発現を解析した。
OGD後pNFHの発現は、リコンビナントセマフォリン3A投与により濃度依存的に低下し、本発明の医薬組成物の投与により濃度依存的に増加した（図11）。一方で、npNFHの発現はリコンビナントセマフォリン3Aや本発明の医薬組成物の投与による有意な変化は認められなかった。
これらの結果から、OGD後の培養神経細胞においてセマフォリン3AはpNFH+軸索再生を調節すること、及び本発明の医薬組成物が虚血後の軸索再生を促進させる可能性があることが示された。
Example 6: Expression of semaphorin 3A in rat primary neurons, examination of axonal regeneration by recombinant semaphorin 3A, semaphorin inhibitor (SM-345431) A culture was prepared and subjected to sugar-free and anoxic loading (OGD) for 3 hours on the 7th day of the culture when the axons were fully developed. After OGD, recombinant semaphorin 3A was 0.1 nM, 1 nM, and SM-345431 as the pharmaceutical composition of the present invention was 0.1 in Neurobasal medium supplemented with B27 and L-glutaine (2.5 mmol / L). A composition containing μM and 1 μM was administered.
Cultured nerve cells were collected 96 hours after OGD, which is considered to correspond to the chronic stage of cerebral infarction, and the expression of pNFH and the nerve cell marker non-phosphorylated NFH (npNFH) was analyzed by Western blot.
The expression of pNFH after OGD decreased in a concentration-dependent manner by administration of recombinant semaphorin 3A, and increased in a concentration-dependent manner by administration of the pharmaceutical composition of the present invention (Fig. 11). On the other hand, the expression of npNFH was not significantly changed by administration of recombinant semaphorin 3A or the pharmaceutical composition of the present invention.
These results indicate that semaphorin 3A may regulate pNFH + axon regeneration in cultured neurons after OGD, and that the pharmaceutical composition of the present invention may promote axon regeneration after ischemia. Shown.
実施例7：ラット初代神経細胞におけるRho family GTPase 1（Rnd1）/R-Ras/Akt/Glycogen Synthase Kinase 3beta （pGSK-3β）を介した虚血後軸索再生の検討
同時に、OGD後96時間目の培養神経細胞を回収したサンプルを用いて、セマフォリン3A関連シグナル蛋白の発現をウェスタン・ブロットにて解析した。本発明の医薬組成物の投与によりセマフォリン3AとRnd1の減少、R-Ras、phosphorylated Akt（pAkt）、phosphorylated GSK3-β（pGSK3-β）の増加がみられた（図12のA）。一方で、リコンビナントセマフォリン3A投与ではセマフォリン3AとRnd1の増加、R-Ras、pAkt、pGSK-3β低下が認められ、本発明の医薬組成物の投与とは逆の現象が確認された。セマフォリン3Aは、Rnd1/R-Ras/Akt/pGSK-3βを介してpNFHの発現を調節する。つまり、本発明の医薬組成物のを投与することによりRnd1/R-Ras/Akt/pGSK-3βシグナルを介して虚血後軸索再生が増強されることが確認された。（図12のB）。
Example 7: Examination of post-ischemic axon regeneration mediated by Rho family GTPase 1 (Rnd1) / R-Ras / Akt / Glycogen Synthase Kinase 3beta (pGSK-3β) in rat primary neurons Simultaneously 96 hours after OGD The expression of semaphorin 3A-related signal protein was analyzed by Western blot using the sample collected from the cultured nerve cells of. Administration of the pharmaceutical composition of the present invention resulted in a decrease in semaphorin 3A and Rnd1 and an increase in R-Ras, phosphorylated Akt (pAkt), and phosphorylated GSK3-β (pGSK3-β) (A in FIG. 12). On the other hand, administration of recombinant semaphorin 3A resulted in an increase in semaphorin 3A and Rnd1 and a decrease in R-Ras, pAkt, and pGSK-3β, confirming the opposite phenomenon to the administration of the pharmaceutical composition of the present invention. Semaphorin 3A regulates pNFH expression via Rnd1 / R-Ras / Akt / pGSK-3β. That is, it was confirmed that administration of the pharmaceutical composition of the present invention enhances post-ischemic axon regeneration via the Rnd1 / R-Ras / Akt / pGSK-3β signal. (B in Figure 12).
実施例8：SM-345431投与におけるOGD後軸索進展の検討
培養神経細胞において、OGD後軸索伸展の長さを詳細に解析するためMicrofluidic chamber（図13のA）を用いて、軸索を神経細胞体から分離して培養した。リコンビナントセマフォリン3A（1nM）、SM-345431（1μM）を投与し微速度顕微鏡にて軸索伸展を評価した。Microfluidic chamberを用いた軸索伸長の検討では、本発明の医薬組成物（SM-345431の濃度は1μM）投与は、OGD後非投与、OGD後リコンビナントセマフォリン3A（1nM）投与に比して軸索伸展がみられた（図13のB）。
Example 8: Examination of OGD posterior axon extension in SM-345431 administration In cultured neurons, axons were analyzed using a Microfluidic chamber (A in FIG. 13) to analyze the length of OGD posterior axon extension in detail. It was separated from the nerve cell body and cultured. Recombinant semaphorin 3A (1nM) and SM-345431 (1 μM) were administered, and axon extension was evaluated with a time-lapse microscope. In the study of axon elongation using a microfluidic chamber, administration of the pharmaceutical composition of the present invention (SM-345431 concentration of 1 μM) was more axial than administration of non-administration after OGD and administration of recombinant semaphorin 3A (1nM) after OGD. Axon extension was seen (B in Figure 13).
実施例9：脳梗塞モデルラットのperi-infarct areaにおけるセマフォリン3Aの推移に関する検討－１
参考例1において、peri-infarct areaでのセマフォリン3A陽性神経細胞の発現がMCAO後7～14日目に上昇することが明らかにされた。一方実施例6～8により、脳梗塞後亜急性期において本発明の医薬組成物は、セマフォリン3Aを機能阻害することによりRnd1/R-Ras/Akt/pGSK-3βシグナルを介して虚血後軸索再生を促進させる可能性が示唆された。そこで本発明の医薬組成物による、生体における神経機能及び運動機能への影響を調べる試験を行った。
そこで参考例１において用いられたMCAOモデルと同様に作製したMCAOモデルのラットに、MCAO後7日目にAlzet pumpを用いてperi-infarct areaに本発明の医薬組成物を直接、SM-345431の濃度として0.1mg/ml、1mg/ml、3mg/mlとなる濃度別に14日間投与した。MCAO後7、14、21、28日目にModified neurological severity score （mNSS）（注1）で神経徴候を評価し、Rotarod試験（注2）で運動機能を評価した。mNSSではVehicle群と比較して、3mg/mlのSM-345431投与では 14日目以降で、1mg/mlのSM-345431投与では14日目において神経徴候の改善を認めた（図14のA）。RotarodではVehicle群と比較して、28日後において3mg/mlのSM-345431投与で有意に改善を認めた（図14のB）。
（注1：運動、感覚、バランス及び反応試験を複合した統合的な神経機能評価スコア。正常が0点、最大の神経機能欠損が18点で表される。
注2：運動機能検査の一種であり、回転するロータからラットが落下するまでの時間を記録する。）
Example 9: Examination of transition of semaphorin 3A in peri-infarct area of cerebral infarction model rat-1
In Reference Example 1, it was revealed that the expression of semaphorin 3A-positive neurons in the peri-infarct area was increased 7 to 14 days after MCAO. On the other hand, according to Examples 6 to 8, in the subacute phase after cerebral infarction, the pharmaceutical composition of the present invention functionally inhibits semaphorin 3A after ischemia via the Rnd1 / R-Ras / Akt / pGSK-3β signal. It was suggested that it may promote axonal regeneration. Therefore, a test was conducted to investigate the effect of the pharmaceutical composition of the present invention on nerve function and motor function in a living body.
Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention was directly applied to the peri-infarct area of the rat of the MCAO model prepared in the same manner as the MCAO model used in Reference Example 1 using an Alzet pump on the 7th day after MCAO of SM-345431. It was administered for 14 days according to the concentration of 0.1 mg / ml, 1 mg / ml, and 3 mg / ml. On
(Note 1: An integrated neural function evaluation score that combines motor, sensory, balance, and response tests. Normal is 0 points, and maximum neurological deficiency is 18 points.
Note 2: A type of motor function test that records the time it takes for a rat to fall from a rotating rotor. )
実施例10：脳梗塞モデルラットのperi-infarct areaにおけるセマフォリン3Aの推移に関する検討－２
参考例１において用いられたMCAOモデルと同様に作製したMCAOモデルのラットに、MCAO後７日目～２１日目の１４日間の間、本発明の医薬組成物を投与した。前記ラットをMCAO後28日目に屠殺し、脳サンプル（ラット脳切片）を免疫染色して評価を行った。
ラット脳切片による組織学的評価では、梗塞巣の面積は本発明の医薬組成物の投与（0.1mg/ml、1mg/ml、3mg/mlのSM-345431投与）、Vehicle群の4群間において差異はなかった。一方蛍光免疫染色では、peri-infarct areaにおいてセマフォリン3AとMAP2の共陽性細胞は本発明の医薬組成物投与にて減少し、pGSK-3βとMAP2共陽性細胞は有意に増加した（図15）。またpNFH陽性軸索の発現は本発明の医薬組成物投与で有意に増加した（図16）。
これらの結果は亜急性期又は慢性期の脳梗塞においても、本発明の医薬組成物により軸索再生が促進される可能性を示すものである。
Example 10: Examination of transition of semaphorin 3A in peri-infarct area of cerebral infarction model rat-2
Rats of the MCAO model prepared in the same manner as the MCAO model used in Reference Example 1 were administered with the pharmaceutical composition of the present invention for 14 days from the 7th day to the 21st day after MCAO. The rats were sacrificed 28 days after MCAO, and brain samples (rat brain sections) were immunostained for evaluation.
In histological evaluation using rat brain sections, the area of the infarct lesion was measured between the four groups of the vehicle group, that is, the administration of the pharmaceutical composition of the present invention (administration of SM-345431 of 0.1 mg / ml, 1 mg / ml, 3 mg / ml). There was no difference. On the other hand, in fluorescent immunostaining, co-positive cells of semaphorin 3A and MAP2 decreased by administration of the pharmaceutical composition of the present invention in the peri-infarct area, and pGSK-3β and MAP2 co-positive cells increased significantly (Fig. 15). .. In addition, the expression of pNFH-positive axons was significantly increased by administration of the pharmaceutical composition of the present invention (Fig. 16).
These results indicate that the pharmaceutical composition of the present invention may promote axonal regeneration even in subacute or chronic cerebral infarction.
以上の結果、とくに実施例６～１０に示された結果から、本発明の医薬組成物が、脳梗塞peri-infarct areaにおいて亜急性期に発現上昇するセマフォリン3Aを機能阻害することで、Rnd1/R-Ras/Akt/pGSK-3βシグナルを介して軸索再生並びに機能回復を促進し、この作用は亜急性期又は慢性期の脳梗塞においても発揮することが示された。したがって本発明の医薬組成物は、脳梗塞後の機能回復を目的とした、亜急性期又は慢性期の脳梗塞の治療に資するものであると考えられる。 From the above results, particularly the results shown in Examples 6 to 10, the pharmaceutical composition of the present invention functionally inhibits semaphorin 3A whose expression is increased in the subacute phase in the peri-infarct area of cerebral infarction, thereby causing Rnd1. It promotes axonal regeneration and functional recovery via the / R-Ras / Akt / pGSK-3β signal, and this effect has been shown to be exerted in subacute or chronic cerebral infarction. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention is considered to contribute to the treatment of subacute or chronic cerebral infarction for the purpose of functional recovery after cerebral infarction.
本発明によれば、亜急性期又は慢性期の脳梗塞を治療するための治療薬剤が提供される。したがって本発明は、医薬産業及びそれに関連する産業の発展に寄与するところ大である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a therapeutic agent for treating subacute or chronic cerebral infarction is provided. Therefore, the present invention greatly contributes to the development of the pharmaceutical industry and related industries.
Claims (14)
Priority Applications (1)
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Non-Patent Citations (7)
| Title |
|---|
| Biochemical and Biophysical Research Communications，2008年，367，pp.109-115 |
| Mol. Neurobiol. ，2014年，49，pp.945-956 |
| Mol. Neurobiol.，2015年，52，pp.1093-1105 |
| Nature Medicine，2006年，12(12)，pp.1380-1389 |
| Stroke，42(3)，2011年，pp. e180, Abstract Number: W P68 |
| 先進医薬研究振興財団研究成果報告書 循環医学分野，2018年，Vol.2017，pp.172-174 |
| 神経治療，2009年，26(6)，pp.753-758 |
Also Published As
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