JP7090072B2 - 全身毒性又は肝毒性を引き起こす可能性について候補化合物をスクリーニングするための方法及びシステム - Google Patents

全身毒性又は肝毒性を引き起こす可能性について候補化合物をスクリーニングするための方法及びシステム Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本発明は、2016年9月16日に出願された米国仮特許出願第62/395,503号の優先権を主張し、本明細書にはその全体が参照により組み込まれる。
本発明は、胆汁うっ滞性の肝毒性の可能性について候補化合物又は化学物質をスクリーニングすることに関する。より詳細には、本発明は、全身毒性又は肝毒性を引き起こすことに対する感受性又は引き起こす可能性について候補化合物をスクリーニングするための方法及びシステムに関する。
新しい治療薬、薬物及び医薬化合物の開発において、それらの胆汁うっ滞性の肝毒性の可能性を決定するために新しい化学物質（NCE）をスクリーニングする必要がある。薬物で誘発される胆汁うっ滞性の肝毒性は、胆汁酸の胆汁流障害の結果であり、その結果、肝細胞中に毒性濃度の胆汁酸が蓄積する。薬物誘発性の胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす可能性が高い新しい化学物質（NCE）は、さらなる薬物開発試験において検討から除外される可能性がある。
新しい化学物質（NCE）、化合物又は候補薬物がインビボで胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす可能性を評価するための改良されたインビトロ方法論及びシステムが必要とされている。
上記の必要性は、本発明によって対処される。
以下、本発明のいくつかの実施態様を列挙し、そして多くの場合、これらの実施態様の変形態様や置換態様を列挙する。以下は多数の様々な実施態様の単なる例示である。ここに挙げられた実施態様の１又はそれ以上の代表的な特徴への言及は、同様に例示的である。そのような実施態様は、通常、言及された特徴を伴って又は伴わずに存在することができる。同様に、これらの特徴は、ここに列挙されているか否かにかかわらず、本発明の他の実施態様に適用され得る。過度の繰り返しを避けるために、以下そのような特徴のすべての可能な組み合わせを列挙又は示唆しない。
いくつかの実施態様において、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性について化合物をスクリーニングする方法であって、スクリーニングされるべき化合物を提供する段階、胆汁酸合成、胆汁酸輸送及び／又は胆汁酸調節の能力を有する肝細胞系（HCS）を確立する段階、胆汁酸の毒性プロファイルを決定するために、ある濃度範囲の胆汁酸に該肝細胞系（HCS）を曝露する段階であって、該胆汁酸毒性プロファイルが毒性効力を含む段階、スクリーニングされる化合物の存在下でこの肝細胞系（HCS）をある濃度範囲の胆汁酸に曝露し、胆汁酸の毒性プロファイルを決定する段階であって、該胆汁酸毒性プロファイルが毒性効力を含む段階、及び胆汁酸の毒性効力を比較して、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす該化合物の感受性を決定する段階、を含む方法が提供される。
いくつかの実施態様において、ある化合物のインビボの肝毒性能を予測するためのインビトロシステムであって、(i) 胆汁酸合成、胆汁酸輸送及び／又は胆汁酸調節の能力を有するインビトロで培養された肝細胞系（HCS）、(ii) 該肝細胞系（HCS）内で確立された毒性効力を有する１又はそれ以上の胆汁酸、及び(iii) １又はそれ以上の胆汁酸の存在下で該肝細胞系（HCS）に曝されたときのこの化合物の肝毒性を測定するためのアッセイ、を含むシステムが提供される。
いくつかの実施態様において、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす感受性について化合物をスクリーニングする方法であって、スクリーニングされるべき化合物を提供する段階、胆汁酸合成、胆汁酸輸送及び／又は胆汁酸調節の能力を有する肝細胞系（HCS）を確立する段階、スクリーニングされる化合物の存在下で、ある濃度範囲の胆汁酸に肝細胞系（HCS）を曝露し、スクリーニングされる化合物の存在下の胆汁酸の毒性プロファイルを決定する段階であって、該胆汁酸の毒性プロファイルが該濃度範囲にわたって知られており、該胆汁酸の胆汁酸毒性プロファイルが胆汁酸の毒性効力を含む段階、及び該化合物の存在下及び非存在下における胆汁酸の毒性効力を比較して、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす該化合物の可能性を決定する段階、を含む方法が提供される。
従って、本発明の目的は、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす感受性について化合物をスクリーニングするための方法及びシステムを提供することである。この目的及びその他の目的は、本発明によって全体的に又は部分的に達成される。さらに、本発明の目的、上記の本発明の他の目的及び利点は、以下の記載、図面及び実施例を検討した後に当業者に明らかになるであろう。
本発明は、以下の図を参照することによってよりよく理解することができる。図中の構成要素は必ずしも一定の縮尺ではなく、その代わりに本発明の原理を説明することに重点が置かれている（しばしば概略的に）。これらの図面において、同様の参照番号は異なる図においても対応する部分を示す。添付の図面の図で例証される実施態様を参照することによって、本発明のさらなる理解を得ることができる。例証される実施態様は本発明を実施するためのシステムの単なる例示であるが、本発明の構成及び動作方法の両方は、その更なる目的及び利点と共に、一般的に、図面及びその説明を参照することによってより容易に理解され得る。これらの図面は、添付の又は後に補正される特許請求の範囲に詳細に記載されている本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、単に本発明を明確にし、例示することを意図したものである。
本発明をより完全に理解するために、ここで以下の図面を参照する。
薬物誘発性の胆汁うっ滞性肝毒性を引き起こす可能性がある妥協胆汁酸ホメオスタシス（図１Ｂ）と比較した、インビボでの正常な胆汁酸ホメオスタシス経路（図１Ａ）を示す肝細胞の概略図である。 インビボの正常な胆汁酸の取り込み、合成及び排出を示す肝細胞の概略図である。 新化学物質（NCE）が、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）阻害剤として作用して、胆汁酸ホメオスタシスフィードバック機構を開始させて、代償機構の誘導と胆汁酸の細胞内濃度の低下をもたらす、効果を示す肝細胞の概略図である。 新化学物質（NCE）が、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）阻害剤及びファルネソイドＸ受容体（FXR）アンタゴニストとして作用して、胆汁酸ホメオスタシスフィードバック機構の活性化を防止して、胆汁酸細胞内濃度の増加をもたらして、胆汁酸肝毒性をもたらす、効果を示す肝細胞の概略図である。 新化学物質（NCE）が、複数の胆汁酸排出経路を阻害して、肝細胞毒性をもたらす、効果を示す肝細胞の概略図である。 新化学物質（NCE）が、胆汁酸の取り込みを阻害して、全身性胆汁うっ滞をもたらす肝細胞に提示される胆汁酸の量の減少をもたらす、効果を示す肝細胞の概略図である。 新化学物質（NCE）の存在下における、胆汁酸増加の、ＡＴＰ含有量（図７）及びＬＤＨ漏出（図８）に対する効果を示すグラフである。 ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）中の胆汁酸ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ及びＧＤＣＡの濃度を増加させた場合の、ＡＴＰ（図９）及びＬＤＨ（図１０）に対する効果を示す散布図である。 ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）中の胆汁うっ滞剤の非存在下及び存在下における胆汁酸プール毒性プロファイルに対する、グルコース濃度（図１１：５ｍＭグルコース、図１２：１１ｍＭグルコース）の効果を示すプロットである。 開示されたアッセイ、方法及びシステムの、アンブリセンタンとシタキセンタンとを区別する能力を評価する実現可能性の研究のデータを示すプロットである。 胆汁酸及び胆汁酸プールへの曝露に基づく生存度試験のデータを示すプロットである。 トログリタゾンの存在下における胆汁酸プールの肝毒性に対する遊離脂肪酸の効果の評価データを示すプロットである。 薬物曝露が胆汁酸排出経路を阻害する場合の、胆汁酸毒性に対する肝細胞の感受性を評価する研究のデータを示すヒストグラムである。 トログリタゾンの存在下においてヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）に観察されるｄ８－ＴＣＡの胆汁クリアランス（図２５Ａ）及びｄ８－ＴＣＡの胆汁排出（図２５Ｂ）の阻害の結果を示すドットプロットである。 トログリタゾンへの曝露後のヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）におけるファルネソイドＸ受容体（FXR）拮抗作用を示すヒストグラムである。 ＡＴＰ含有量及びＬＤＨ漏出のヒストグラムであり、ファルネソイドＸ受容体（FXR）拮抗作用を評価するために利用される条件下において細胞生存度を評価する。 感作培養条件下でトログリタゾン、ピオグリタゾン及びロシグリタゾンで処理したヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）がＬＤＨ漏出及びＡＴＰ含有量の減少に及ぼす影響を示すヒストグラムである。
本発明は以下で完全に説明される。そこでは、本発明のすべてではないがいくつかの実施態様が説明される。実際、本発明は、多くの異なる態様で具現化することができるが、本明細書に記載の実施態様に限定されると解釈されるべきではない。そうではなく、これらの実施態様は、本発明が適用される法的要件を満たすように提供されたものである。
本明細書で使用される用語は、特定の実施態様を説明することのみを目的としており、本発明を限定することを意図するものではない。
以下の用語は当業者によく理解されていると考えられるが、以下の定義は本発明の説明を容易にするために示されたものである。
本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、以下で他に定義されない限り、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有することを意図している。本明細書で採用される技術への言及は、当技術分野で一般に理解されている技術を指すことを意図しており、当業者に明らかなそれらの技術の変形又は同等の技術の置換を含む、以下の用語は当業者によく理解されていると考えられるが、以下の定義は本発明の説明を容易にするために示されたものである。
本発明を説明する際に、いくつかの技法及び段階が開示されていることが理解されるであろう。これらの各々は個々の利点を有し、そして各々はまた、他に開示された技術の１つ以上、又は場合によってはすべてと併せて使用されることができる。
従って、以下の説明においては、明確のために、個々の段階のあらゆる可能な組み合わせを不必要な方法で繰り返すことを控えるであろう。にもかかわらず、明細書及び特許請求の範囲は、そのような組み合わせが完全に本発明及び特許請求の範囲内にあることを理解して読まれるべきである。
長年の特許法の慣例に従って、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」という用語は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合、「１つ又は複数」を指す。従って、例えば、「１つの細胞」への言及は複数のそのような細胞を含む、などである。
特記しない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件などを表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されていると理解されるべきである。従って、そうでないと示さない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、近似値であり、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変わり得る。
本明細書で使用される場合、組成物の値又は量、用量、配列同一性（例えば、２又はそれ以上のヌクレオチド又はアミノ酸配列を比較するとき）、質量、重量、温度、時間、体積、濃度、百分率などを指す時、「約」という用語は、明記される値から、ある実施態様において±２０％、ある実施態様において±１０％、ある実施態様において±５％、ある実施態様において±１％、ある実施態様において±０．５％、ある実施態様において±０．１％の変動を含むことを意味するが、これは、そのような変形は開示された方法を実施するため又は開示された組成物を使用するために適切なものであるためである。
「を含む（including）」、「を含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義である「を含む（comprising）」という用語は、包括的又は無制限であり、引用されない追加の要素又は方法ステップを除外しない。「を含む」は、特許請求の言語で使用される専門用語であり、名前を挙げた要素が存在するが、他の要素が追加されてもよく、依然として特許請求の範囲内の構築物又は方法を形成することを意味する。
本明細書で使用される場合、「からなる」という語句は、特許請求の範囲内に明記されないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。「からなる」という語句が、前文の直後ではなく、特許請求の範囲の本文の条項に出現する場合、それは、その条項内に説明される要素のみを限定し、他の要素は特許請求の範囲全体からは除外されない。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という語句は、特許請求の範囲を、明記される材料又はステップ、ならびに主張される主題の基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的な影響を与えないものに限定する。
「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」という用語に関して、これら３つの用語のうちの１つが本明細書で使用される場合、本開示の主張される主題は、その他の２つの用語のいずれかの使用を含むことができる
本明細書で使用される場合、実体を列挙する文脈で使用される時、「及び／又は」という用語は、単独又は組み合わせで存在する実体を指す。従って、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という語句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個々に含むが、また、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの任意ならびに全ての組み合わせ及び部分組み合わせも含む。
本明細書で使用される場合、肝細胞系（HCS）は、胆汁酸合成、胆汁酸輸送及び／又は胆汁酸調節の能力を有する肝細胞系を指す。いくつかの実施態様において、この肝細胞系（HCS）は、ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）を含む肝細胞のサンドイッチ培養物（SCH）などの（但し、これらに限定されない）二次元培養を含むことができる。いくつかの実施態様において、この肝細胞系（HCS）は、三次元培養物（例えば、３Ｄ足場に基づく培養物、回転楕円体培養物などであるが、これらに限定されない）を含むことができる。この肝細胞系（HCS）は、初代肝細胞又は他の関連肝細胞系、例えば、HepaRG、Huh7、共培養系、及び/又は幹細胞由来の肝細胞などを含むことができる。いくつかの実施態様において、肝細胞系（HCS）のインキュベーション培地中などの肝細胞系（HCS）において、１又はそれ以上の遊離脂肪酸及び／又は予め選択されたグルコースの濃度が使用される。
本明細書において、全身毒性又は肝毒性を引き起こすことに対する感受性、又はこれらを引き起こす可能性について候補化合物をスクリーニングするための方法及びシステムが開示される。本明細書中で使用される場合、候補化合物の「能力」、「感受性」、「可能性」、「蓋然性」、「見込み」などを指すために使用される用語は、互換的に使用され、一般に、ある化合物が、本明細書に開示され議論されるように、システム又は肝臓の毒性及びこれに関連する状態に影響を与え、それを引き起こし、又はその原因となる可能性があることを示唆する。
本発明は、いくつかの実施態様において、新化学物質（NCE）、化合物又は候補薬物がインビボで胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす可能性を評価するためのインビトロ方法論及びシステムを提供する。一次胆汁酸は、例えば、Ｃｙｐ７Ａ１を含む１又はそれ以上の肝酵素によって肝細胞中で合成され、次いでタウリンとグリシンの両方に急速に結合し、そしてグルクロン酸化及び硫酸化によってさらに変化することができる。胆汁酸及び結合体は、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）及びＭＲＰ２によって胆汁中に排出され、ＭＲＰ３／４又はＯＳＴα／βによって門脈循環中に排出される。胆汁酸は腸内でさらに代謝され、ASBTによって腸細胞に吸収され、OSTα/βによって腸細胞から門脈に排出される。胆汁酸は、主にNTCPによって門脈循環から取り込まれる。しかし、いくつかの研究では、OATPがある程度の取り込みに関与している可能性があることも示唆されている。胆汁酸は界面活性剤として作用することができ、そして高細胞内濃度（ICC）の胆汁酸は肝毒性であることが示されている。
薬物誘発性の胆汁うっ滞性の肝毒性は、一般に、新化学物質（NCE）による胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）のみの阻害から生じる胆汁酸の胆汁流障害の結果であると考えられている。しかし、ファルネソイドＸ受容体（FXR）によって媒介される肝細胞胆汁酸ホメオスタシス適応応答の障害は、薬物誘発性肝障害において極めて重要な役割を果たす可能性が高い。特定の理論又は作用機序及び／又は現在の教義に縛られることなく、現在、新化学物質（NCE）による胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）の阻害は細胞内胆汁酸濃度の増加をもたらす開始事象にすぎないと考えられている。胆汁酸の細胞内濃度が十分に高い場合、胆汁酸はファルネソイドＸ受容体（FXR）を活性化し、これはＣＹＰ７Ａ１の発現の減少を開始し、その速度は胆汁酸産生における酵素を制限し、その結果、胆汁酸合成は減少し、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）及びOSTα/β発現の両方の誘導をもたらす。新化学物質（NCE）はその経路による輸送を阻害するので、この胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）発現の増加は、最小限の効果しか及ぼさないであろう。しかし、このＯＳＴα／βの誘導は、肝細胞から門脈循環への胆汁酸クリアランスを大幅に増加させ、それによって肝細胞は、胆汁酸の細胞内濃度を減少させ、そして肝毒性の可能性を減少させる。従って、胆汁うっ滞性の肝毒性について提案されたメカニズムは、潜在的な胆汁うっ滞性の肝毒性物質が胆汁酸排出経路（例えば、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）及び／又はＭＲＰ３／４）を阻害し、かつ、１）ファルネソイドＸ受容体（FXR）が細胞内胆汁酸濃度の上昇を感知することの防止（拮抗）、又は２）ＯＳＴα／β（胆汁酸排出代償経路）を介した胆汁酸排出の阻害、又は３）これら両方の組み合わせ、をしなければならない。
インビボの胆汁酸の肝臓排出に対する影響を正確に予測するために、必要でなければ、本明細書で提供されるような統合システムは重要でありうる。いくつかの実施態様において、この統合システムは、合成、輸送（取り込み、側底排出、及び小管排出）、ならびに調節（輸送、代謝及び合成）を含む。ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）モデルは、これらの経路すべてを結合することのできる、特徴のある１つのシステムである。
本発明の方法及びシステムは、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）阻害を測定するためのヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）モデルの使用と、ファルネソイドＸ受容体（FXR）を介した胆汁酸調節とを結合したものである。さらに、胆汁酸の細胞内濃度がファルネソイドＸ受容体（FXR）フィードバック機構の活性化の推進力であることが観察された。この細胞内胆汁酸濃度は、胆汁うっ滞性の肝毒性を予測するためのインビトロ方法論の開発のための一つの因子であるので、胆汁酸の細胞内濃度（ICC）がファルネソイドＸ受容体（FXR）フィードバック機構を活性化するために必要であると決定された。さらに、異なる胆汁酸は、肝毒性について異なる可能性を有することが知られているので、複数の胆汁酸及びそれらの組み合わせ（胆汁酸プール）を、毒性についての標準アッセイを用いて肝毒性反応を誘発する可能性について評価した（例えば、ＡＴＰ、ＬＤＨ、カスパーゼ３／７及びＡＰＯＴＯＸ Ｇｌｏ、但しこれらに限定されない）。そしてデオキシコール酸（DCA）を含む様々な胆汁酸混合物が、最も強力な肝毒性胆汁酸の１つとして同定された。これらのアッセイの使用は、この系における細胞生存度、壊死及びアポトーシスの間の区別を可能にした。
一般に、本発明の方法は、いくつかの実施態様において、胆汁酸の毒性プロファイルを特定するために、ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）をある濃度範囲の胆汁酸（例えば、DCA）又は胆汁酸プールと共に培養する段階を含むことができる（ＡＴＰ及び／又はＬＤＨの測定などにより；図７及び８の点線）。これと並行する研究において、潜在的な胆汁うっ滞性の肝毒性物質の存在下でヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）をある濃度範囲のDCA又は複数の胆汁酸の組み合わせに暴露することができる。３つの可能な結果が観察されうる。
１．新化学物質（NCE）の存在下で胆汁酸（BA）毒性効力に変化なし＝予測された効果なし。
２．新化学物質（NCE）の存在下で胆汁酸（BA）毒性効力が増加＝胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす可能性あり（例えば、胆汁酸（BA）排出阻害剤、ファルネソイドＸ受容体（FXR）アンタゴニスト、若しくはその両方）。又は
３．新化学物質（NCE）の存在下で胆汁酸（BA）毒性効力が低下＝胆汁うっ滞を引き起こし、全身毒性をもたらす可能性がある（例えば、胆汁酸（BA）取り込み阻害剤）。
従って、新化学物質（NCE）は、胆汁酸ホメオスタシスに影響を及ぼさないもの（１）、又は全身性胆汁酸濃度の上昇に関連するかどうかにかかわらず、胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす可能性が高いもの（２）、又は臨床的胆汁うっ滞症の観察の可能性があるもの（３）（全身性胆汁酸濃度は上昇するが、肝胆汁うっ滞の可能性はほとんどない）、又はこれらの組み合わせ、に分類できる。
従って、いくつかの実施態様において、本明細書では、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性について化合物をスクリーニングする方法が提供される。いくつかの実施態様において、この方法は、（ａ）スクリーニングされるべき化合物を提供する段階、
（ｂ）胆汁酸合成、胆汁酸輸送及び／又は胆汁酸調節の能力を有する肝細胞系（ＨＣＳ）を確立する段階、（ｃ）胆汁酸の毒性プロファイルを決定するために、ある濃度範囲の胆汁酸に該肝細胞系（ＨＣＳ）を曝露する段階であって、該胆汁酸毒性プロファイルが毒性効力を含む段階、（ｄ）スクリーニングされる化合物の存在下でこの肝細胞系（ＨＣＳ）をある濃度範囲の胆汁酸に曝露し、胆汁酸の毒性プロファイルを決定する段階であって、該胆汁酸毒性プロファイルが毒性効力を含む段階、及び（ｅ）該胆汁酸の毒性効力を比較して、該化合物が全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性を決定する段階、から成る。
いくつかの態様では、この化合物が全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性を決定する段階は、更に、この化合物の存在下において、この化合物の非存在下と比較して、この胆汁酸の毒性効力に変化がないことを確認する段階、この化合物の存在下において、この化合物の非存在下と比較して、この胆汁酸の毒性効力の増加を確認する段階、又はこの化合物の存在下において、この化合物の非存在下と比較して、この胆汁酸の毒性効力の減少を確認する段階、を含む。胆汁酸の毒性効力に変化を引き起こさない化合物は、全身毒性又は肝毒性を引き起こさないとして特徴付けられる。
しかし、胆汁酸の毒性効力の増加を引き起こす化合物は、胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす可能性を有するとして特徴付けられる。この胆汁うっ滞性の肝毒性は、胆汁酸排出の阻害によって引き起こされうる（この場合、この化合物は胆汁酸排出阻害剤として特徴付けられる）、及び／又はこの胆汁うっ滞性の肝毒性は、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の拮抗作用によって引き起こされる（この場合、この化合物はファルネソイドＸ受容体（FXR）アンタゴニストとして特徴付けられる）、及び／又は両方の組み合わせである。いくつかの態様では、胆汁酸排出の阻害は、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）の阻害を含む。
それでもなお、この胆汁酸の毒性効力に低下を引き起こす化合物は、全身毒性をもたらす胆汁うっ滞を引き起こす可能性を有するとして特徴付けられる。この全身毒性をもたらすことができる胆汁うっ滞は、胆汁酸取り込みの阻害によって引き起こされる。
いくつかの態様では、全身毒性又は肝毒性を引き起こす化合物の可能性を決定する段階は、この化合物を胆汁酸排出阻害剤、ファルネソイドＸ受容体（FXR）アンタゴニスト、胆汁酸取り込み阻害剤、又は上記の非存在として特徴付ける段階を含む。いくつかの実施態様において、この化合物は候補薬物であることができ、この候補薬物は、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性が低いとして、又は全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性が高いとして、特徴付けられる。
いくつかの実施態様において、胆汁酸輸送は、胆汁酸取り込み、側底排泄及び／又は小管排泄を含む。この胆汁酸の濃度範囲は、インビボでの細胞内の空腹時及び／又は食後の濃度を模倣する細胞内濃度を含む。この胆汁酸の濃度範囲は、ファルネソイドＸ受容体（FXR）フィードバック機構を活性化するのに十分な胆汁酸細胞内濃度を含む。
いくつかの態様では、胆汁酸の毒性プロファイルの決定は、細胞毒性アッセイを用いて肝毒性応答を測定することを含むことができる。このような細胞毒性アッセイは、酵素漏出アッセイ、ＡＴＰ、ＡＰＯＴＯＸ Ｇｌｏ及びそれらの組み合わせから成る群から選択されることができるが、これらに限定されない。この酵素漏出アッセイは、ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＬＤＨから成る群から選択されることができる。
いくつかの実施態様において、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性について化合物をスクリーニングする方法は、更に、肝細胞系（HCS）を複数の胆汁酸に曝露して、この複数の胆汁酸についての複数の毒性プロファイルを決定する段階を含み、この胆汁酸毒性プロファイルが複数の毒性効力を含むことができる。この複数の毒性効力は、前記化合物の肝毒性の可能性を予測するために、前記化合物の非存在下及び存在下の肝細胞系（ＨＣＳ）中で測定されることができる。
いくつかの実施態様において、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性について化合物をスクリーニングする方法は、初代肝細胞又はその他の肝細胞系を利用した、二次元培養物又は三次元培養物を含む肝細胞系（HCS）を利用することができる。この二次元培養物は、肝細胞のサンドイッチ培養物（SCH）を含むことができ、このＳＣＨがヒト肝細胞を含む。この三次元培養物は、三次元（３Ｄ）足場に基づく培養物又は回転楕円体培養物を含むことができる。その他の肝細胞系は、ＨｅｐａＲＧ、Ｈｕｈ７、共培養系、幹細胞由来肝細胞、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、この化合物は、ある範囲の濃度にわたって肝細胞系（ＨＣＳ）に曝露されることができる。この胆汁酸又は複数の胆汁酸は、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＧＤＣＡ、ＤＣＡ、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＬＣＡ、ＧＬＣＡ、ＴＬＣＡ、又はそれらの任意の組み合わせである。更に、この肝細胞系（ＨＣＳ）中で、１又はそれ以上の遊離脂肪酸及び／又は予め定めたグルコースの濃度が採用されることができる。
いくつかの実施態様において、ある化合物のインビボの肝毒性能を予測するためのインビトロシステムであって、(i) 胆汁酸合成、胆汁酸輸送及び／又は胆汁酸調節の能力を有するインビトロで培養された肝細胞系（HCS）、(ii) 該肝細胞系（HCS）内で確立された毒性効力を有する１又はそれ以上の胆汁酸、及び(iii) １又はそれ以上の胆汁酸の存在下で該肝細胞系（HCS）に曝されたときのこの化合物の肝毒性を測定するためのアッセイ、を含むシステムが提供される。
いくつかの実施態様において、このインビトロで培養された肝細胞系（HCS）は、胆汁酸合成、輸送、及び胆汁酸ホメオスタシスフィードバック機構を有する統合肝細胞系を含むことができる。このインビトロで培養された肝細胞系（HCS）は、初代肝細胞又はその他の肝細胞系を利用した、二次元培養物又は三次元培養物を含むことができる。このインビトロで培養された肝細胞系（HCS）は、肝細胞のサンドイッチ培養物（ＳＣＨ）を含み、該ＳＣＨがヒト肝細胞を含むことができる。このインビトロで培養された肝細胞系（HCS）は、三次元（３Ｄ）足場に基づく培養物又は回転楕円体培養物を含むことができる。このインビトロで培養された肝細胞系（HCS）は、ＨｅｐａＲＧ、Ｈｕｈ７、共培養系、幹細胞由来肝細胞、及びそれらの組み合わせを含むことができる。
いくつかの実施態様において、この胆汁酸又は複数の胆汁酸は、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＧＤＣＡ、ＤＣＡ、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＬＣＡ、ＧＬＣＡ、ＴＬＣＡ、又はそれらの任意の組み合わせである。
この１又はそれ以上の胆汁酸の確立された毒性効力は、細胞毒性アッセイを用いた肝毒性反応に基づくこの１又はそれ以上の胆汁酸の毒性プロファイルを含むことができる。このような細胞毒性アッセイには、酵素漏洩アッセイ、ＡＴＰ、ＡＰＯＴＯＸ Ｇｌｏ、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。この酵素漏出アッセイは、例えば、ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＬＤＨである。
いくつかの態様において、このようなインビトロシステムを、胆汁酸の毒性効力に変化を引き起こさない化合物を、全身毒性又は肝毒性を引き起こさない可能性が高い化合物として特徴付けるように構成することができる。いくつかの態様において、このようなインビトロシステムを、胆汁酸の毒性効力の増加を引き起こす化合物を、胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす可能性のある化合物として特徴付けるように構成することができる。いくつかの態様において、このようなインビトロシステムを、胆汁酸の毒性効力の低下を引き起こす化合物を、全身毒性をもたらす胆汁うっ滞を引き起こす可能性のある化合物として特徴付けるように構成することができる。
いくつかの実施態様において、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性について化合物をスクリーニングする方法が提供される。いくつかの実施態様において、この方法は、（ａ）スクリーニングされるべき化合物を提供する段階、（ｂ）胆汁酸合成、胆汁酸輸送及び／又は胆汁酸調節の能力を有する肝細胞系（HCS）を確立する段階、（ｃ）スクリーニングされる化合物の存在下で、ある濃度範囲の胆汁酸に肝細胞系（HCS）を曝露し、スクリーニングされる化合物の存在下の胆汁酸の毒性プロファイルを決定する段階であって、該胆汁酸の毒性プロファイルが該濃度範囲にわたって知られており、該胆汁酸の胆汁酸毒性プロファイルが胆汁酸の毒性効力を含む段階、及び（ｄ）該化合物の存在下及び非存在下における胆汁酸の毒性効力を比較して、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす該化合物の感受性を決定する段階、を含む。このような方法において、この化合物は、ある濃度範囲にわたって肝細胞系（HCS）に曝露されることができる。
いくつかの態様では、この胆汁酸は、複数の胆汁酸の組み合わせから成ることができ、この胆汁酸の組み合わせの毒性プロファイルは既知であり、この毒性プロファイルは毒性効力を含む。この複数の胆汁酸の組み合わせは、所定の比率で提供される複数の胆汁酸から成ることができる。この複数の胆汁酸の組み合わせは、インビボの複数の胆汁酸の濃度と比率を模倣するように構成された濃度と比率の複数の胆汁酸から成ることができる。
この全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす化合物の感受性を決定する段階は、いくつかの実施態様において、更に、この化合物の存在下において、この化合物の非存在下と比較して、胆汁酸毒性効力に変化がないことを確認する段階、この化合物の存在下において、この化合物の非存在下と比較して、胆汁酸毒性の増加を確認する段階、又はこの化合物の存在下において、この化合物の非存在下と比較して、胆汁酸毒性の減少を確認する段階を含むことができる。
胆汁酸の毒性効力に変化を引き起こさない化合物を、全身毒性又は肝毒性を引き起こさないとして特徴付けることができる。一方、胆汁酸の毒性効力の増加を引き起こす化合物を、胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす可能性を有するとして特徴付けることができる。この胆汁うっ滞性の肝毒性は、胆汁酸排出の阻害によって引き起こされることができ（この場合、この化合物は胆汁酸排出阻害剤として特徴付けられる）、及び／又はこの胆汁うっ滞性の肝毒性は、ファルネソイドＸ受容体（FXR）の拮抗作用によって引き起こされることができ（この場合、この化合物はファルネソイドＸ受容体（FXR）アンタゴニストとして特徴付けられる）、及び／又は両方の組み合わせである。この胆汁酸排出の阻害は、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）の阻害を含むことができる。
それでもなお、この胆汁酸の毒性効力に低下を引き起こす化合物を、全身毒性をもたらす胆汁うっ滞を引き起こす可能性を有するとして特徴付けることができる。この全身毒性をもたらす胆汁うっ滞は、胆汁酸取り込みの阻害によって引き起こされることができる。
いくつかの態様では、この化合物の全身毒性又は肝毒性を引き起こす可能性を決定する段階は、この化合物を胆汁酸排出阻害剤、ファルネソイドＸ受容体（FXR）アンタゴニスト、胆汁酸取り込み阻害剤、又は上記の非存在として特徴付ける段階を含む。この化合物は候補薬物であってもよく、この候補薬物は、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性が低いとして、又は全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性が高いとして、特徴付けられる。
胆汁酸輸送は、胆汁酸取り込み、側底排泄及び／又は小管排泄を含むことができる。この胆汁酸の濃度範囲は、インビボでの細胞内の空腹時及び／又は食後の濃度を模倣する細胞内濃度を含むことができる。この胆汁酸の濃度範囲は、ファルネソイドＸ受容体（FXR）フィードバック機構を活性化するのに十分な胆汁酸細胞内濃度を含むことができる。いくつかの実施態様において、この胆汁酸又は複数の胆汁酸は、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＧＤＣＡ、ＤＣＡ、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＬＣＡ、ＧＬＣＡ、ＴＬＣＡ、又はそれらの任意の組み合わせであってもよく、但しこれらに限定されない。
いくつかの実施態様において、この胆汁酸の毒性プロファイルの決定は、細胞毒性アッセイを用いて肝毒性応答を測定することを含むことができる。この細胞毒性アッセイは、例えば、酵素漏出アッセイ、ＡＴＰ、ＡＰＯＴＯＸ Ｇｌｏ及びそれらの組み合わせであってもよい。この酵素漏出アッセイは、例えば、ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＬＤＨであってもよい。
このような方法において、この肝細胞系（HCS）は、初代肝細胞又はその他の肝細胞系を利用した、二次元培養物又は三次元培養物を含むことができる。この二次元培養物は、肝細胞のサンドイッチ培養物（SCH）を含み、該ＳＣＨがヒト肝細胞を含むことができる。一方、この三次元培養物は、三次元（３Ｄ）足場に基づく培養物又は回転楕円体培養物を含むことができる。その他の肝細胞系は、ＨｅｐａＲＧ、Ｈｕｈ７、共培養系、幹細胞由来肝細胞、及びそれらの組み合わせを含むことができる。最後に、このような方法において、この肝細胞系（HCS）中で、１又はそれ以上の遊離脂肪酸及び／又は予め定めたグルコースの濃度が採用されてもよい。
以下の実施例は、本発明の様々な実施態様をさらに説明するために含まれる。しかし、当業者は、ここに本開示に照らして、開示された特定の実施態様に多くの変更を加えることができ、それでも本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様の又は類似の結果を得ることができる。
実施例１
胆汁酸ホメオスタシス
本明細書で実証されるように、薬物誘発性の胆汁うっ滞性の肝毒性は、新化学物質（NCE）による胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）の阻害及び肝細胞胆汁酸ホメオスタシス適応反応の障害を介した胆汁酸の胆汁流障害の結果である。薬物誘発性の胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす作用の可能性のあるメカニズムの一つは、胆汁うっ滞性肝毒性物質が胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）を阻害すること（初期傷害）、及び１）ファルネソイドＸ受容体（FXR）が胆汁酸の細胞内濃度の上昇を感知することを妨げること（拮抗作用）、２）全ての胆汁酸排出経路（側底及び小管）を阻害すること、又は３）これらの両方の組み合わせ、から成ることができる。
図１～６は、タイトジャンクション１４及びそれらの間の１又はそれ以上の胆管１６を有する複数の肝細胞１２を含む肝細胞系１０（インビボ又はインビトロ）の概略図である。この細胞系内の成分、酵素及びトランスポーターには以下のものが含まれる：胆汁酸（BA）；アデノシン三リン酸（ATP）；ファルネソイドＸ受容体（FXR）；胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）；多剤耐性関連タンパク質2（MRP2）；多剤耐性関連タンパク質3 MRP3）；多剤耐性関連タンパク質4 （MRP4）；正常な胆汁酸の取り込み（NTCP）；側底排出トランスポーター（OST）；胆汁酸合成酵素（Cyp7A1）。これらはここで議論され定義される。
図１Ａは、インビボでの正常な胆汁酸ホメオスタシス経路を示し、一方図１Ｂは、潜在的に薬物誘発性胆汁うっ滞性の肝毒性をもたらす妥協胆汁酸ホメオスタシスを示す。図１Ｂにおいては、ファルネソイドＸ受容体（FXR）、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）及び／又は側底排出トランスポーター（OST）のうちの１つ以上が遮断又は阻害され、胆汁酸のホメオスタシスと輸送に干渉を引き起こす。
従って、いくつかの実施態様において、本発明のスクリーニングアッセイ、方法及びシステムは、以下の概念の構成要素を含む。
－胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）阻害
－胆汁酸ホメオスタシス（ファルネソイドＸ受容体（FXR））フィードバックメカニズム
－胆汁酸輸送と胆汁酸ホメオスタシスフィードバック機構を維持する統合肝細胞系を利用する必要性を理解すること；ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）システムは上記の最初の2つの項目を満たす。
－ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）系がよりインビボのように振る舞うために追加の胆汁酸を必要とすることの認識（例えば、空腹時及び食後）；システムは、新化学物質（NCE）の存在下及び非存在下における空腹時及び食後のモデル状態に応じて胆汁酸（BA）用量を使用する。
－毒性反応を誘発する生理学的に関連のある胆汁酸又は胆汁酸プール（すなわちＤＣＡ）を同定すること；及び/又は
－胆汁うっ滞を初回のインビボアッセイにおける毒性に関連させること。
実施例２
胆汁酸ホメオスタシスフィードバックメカニズム
図２は、インビボでの正常な胆汁酸(BA)の取り込み（NTCP）、合成（CYP7A1）及び排出（胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP））を示す。
図３は、新化学物質（NCE）が、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）阻害剤として作用し、胆汁酸ホメオスタシスフィードバック機構（例えば、ファルネソイドＸ受容体（FXR）の活性化）を開始し、その結果、代償機構（例えば、側底排出トランスポーターＯＳＴα／β）の誘導及び細胞内胆汁酸濃度の低下をもたらす効果を示す。胆汁酸フィードバックメカニズムを開始すると、胆汁酸肝毒性（別名、胆汁うっ滞性肝毒性）が防止される。
図４は、新化学物質（NCE）が、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）阻害剤及びファルネソイドＸ受容体（FXR）アンタゴニストとして作用し、胆汁酸ホメオスタシスフィードバック機構の活性化を防止し、その結果、胆汁酸細胞内濃度の増加をもたらし、胆汁酸肝毒性（別名、胆汁うっ滞性肝毒性）をもたらす効果を示す。
図５は、新化学物質（NCE）が、複数の胆汁酸排出経路を阻害し、その結果、肝毒性をもたらす効果を示す。胆汁酸フィードバックメカニズムは無傷のままであるが、代償機構（例えば、ＯＳＴα／β側底排出）及び他の胆汁酸排出機構は阻害され、胆汁酸細胞内濃度及び肝毒性（すなわち、胆汁うっ滞性肝毒性）の増加をもたらす。
図６は、新化学物質（NCE）が、胆汁酸の取り込みを阻害し、その結果、肝細胞に提示される胆汁酸の量が減少し、全身性胆汁うっ滞を引き起こす効果を示す。
実施例３
胆汁うっ滞肝毒性スクリーニングアッセイの開発
ここでは、肝細胞の胆汁酸処理能力を妨害する可能性がある新化学物質（NCE）を同定するためのアッセイ、方法及びシステムが提供される。いくつかの実施態様において、このようなアッセイ、方法及びシステムは、毒性アッセイ（例えば、ATP/LDH/カスパーゼ3/7/8）に基づいて、及び／又は通常は肝機能のモニタリングに使用されている臨床測定（AST/ALT）に関連するＬＤＨをモニタリングすることによって、胆汁うっ滞を肝毒性に結び付けるように構成される。いくつかの実施態様において、このようなアッセイ、方法及びシステムは、新化学物質（NCE）を、(i) 胆汁うっ滞性であるもの、(ii) 効果がないもの、又は(iii) 胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こすもの、として分類するように構成される。
可能性のある結果（新化学物質（NCE）の存在下での胆汁酸（BA））は、いくつかの実施態様において、図７及び図８に示すように表すことができる。図７及び図８において、点線、破線及び実線は以下を示す。
－点線：
・新化学物質（NCE）非存在下において、胆汁酸（BA）毒性効力（TC50）を決定するための胆汁酸（BA）用量反応
－システムID正常応答の校正
－広範囲の胆汁酸（BA）濃度で、肝細胞がどのように反応するかを実証
・新化学物質（NCE）の存在下において、胆汁酸（BA）毒性の効力に変化がない＝予測される効果なし
－破線：
・新化学物質（NCE）の存在下において、胆汁酸（BA）毒性効力が増加＝胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす可能性あり
・胆汁酸（BA）排出抑制剤、ファルネソイドＸ受容体（FXR）アンタゴニスト、又はその両方
－実線：
・新化学物質（NCE）の存在下において、胆汁酸（BA）毒性の効力の低下は、胆汁うっ滞を引き起こす可能性があることと同等であり、これは全身毒性を引き起こす可能性がある
・胆汁酸（BA）取り込み阻害剤
24時間にわたってヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）中で、胆汁酸GCA、GCDCA及びGDCAをその濃度を増加させて評価した。ＡＴＰ（図９）及びＬＤＨ（図１０）含有量を測定した。図９及び図１０に示すように、これらの評価の結果は、ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）が２４時間までの曝露において胆汁酸（BA）毒性に対してかなり耐性があることを示す。より具体的には、GCAは細胞毒性ではなく、ATPアッセイにおいてGCDCAはGDCAに匹敵し、LDHアッセイにおいてGDCAはGCDCAよりも大であった。
ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）において、胆汁うっ滞剤（例えば、トログリタゾン及びシタキセンタン）の非存在下及び存在下で、グルコース濃度が胆汁酸プール毒性プロファイルに及ぼす影響（即ち、シフト）を調べるために、グルコース濃度を評価した。前項と同様の方法を利用して、ApoTox-GloTM Triplex Assayで肝毒性を評価した。結果を図１１及び１２に示す。
細胞生存度及び胆汁酸効力関係に対するトログリタゾン効果に対するヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）系の感受性を高めるために、低グルコース条件が必要であった（図１１～１２）。低グルコース条件は、おそらく肝ミトコンドリア機能への依存性を改善し、それがATP産生量の増加とミトコンドリア機能の促進することによって、細胞生存率アッセイのダイナミックレンジを改善した。シタキセンタンの添加は胆汁酸プールの肝毒性を変えなかった。
実施例４
胆汁うっ滞肝毒性スクリーニングアッセイの可能性
開示されたアッセイ、方法及びシステムが、アンブリセンタンとシタキセンタンを区別する能力を評価するための実現可能性試験も実施された。その結果を以下及び図１３に示す。シタキセンタンとアンブリセンタンの特徴を以下に列挙する。
・シタキセンタン（２～２００μＭ）
－胆汁酸（BA）の毒性の潜在的能力の減少
－インビトロアッセイは、強力な／有効な、正常な胆汁酸の取り込み（NTCP）阻害剤を示した。
－インビトロアッセイは、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）効果を示さなかった。
－Ｃｍａｘ（投与後に達成される最大（又はピーク）濃度）＝ ２３．５μＭ
－５ヵ月後の診療所での毒性；肝臓はおそらく主要な毒性部位ではない。３ヶ月で毒性なし
・アンブリセンタン（２～２００μＭ）
－胆汁酸（BA）毒性の効力に変化なし
－Ｃｍａｘ ＝３μＭ
－許容的であり、 毒性なし
－インビトロアッセイは、正常な胆汁酸の取り込み（NTCP）／胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）効果を示さなかった。
個々の胆汁酸及び胆汁酸混合物（胆汁酸プール）がトログリタゾン（100μＭ）及びシタキセンテン（60μＭ）の肝毒性を変化させる可能性を、5mMグルコースの存在下で24時間曝露した後のサンドイッチ培養ヒト肝細胞において評価した。試験化合物の効果を個々の胆汁酸の存在下及び胆汁酸プールの存在下で評価した。それらの効果を胆汁酸処理のみの効果と比較した。 ＤＭＳＯ処理のみを、肝毒性の比較例として使用した。肝毒性を、生存度、細胞毒性及びアポトーシスを評価するApoTox-GloTMTriplex Assayで評価した。
Figure 0007090072000001
胆汁酸混合物を評価した。この胆汁酸混合物は、表１に示すように各胆汁酸の生理学的に適切な比率に維持された４つの異なる胆汁酸から構成される。個々の胆汁酸は、それらがこの混合物中で表す濃度で投与された。
胆汁酸プールの存在下でのみトログリタゾンの左方シフトが観察され、これは細胞生存度を低下させるのに必要な胆汁酸が少ないことを示している（図１４）。個々の胆汁酸への曝露は、細胞生存度に左方シフトをもたらさなかった（図１５～１８）。
これらのデータは、胆汁酸プールが、いくつかの実施態様において、その系が胆汁酸ホメオスタシスに対する化合物の効果を識別することを可能にするために必要な成分であることを示唆する。トログリタゾンは、細胞内の胆汁酸濃度の増加に反応する肝細胞の能力を妨害し、それによって胆汁酸の肝毒性を増加させる。
実施例５
試験化合物の肝毒性に及ぼす遊離脂肪酸の影響
前項と同様の方法論を利用して、２つの遊離脂肪酸比の存在下で（オレイン酸：パルミチン酸＝２：１及び０：３）、胆汁酸プールの肝毒性に対するトログリタゾン（１００μＭ）及びシタキセンテン（６０μＭ）の効果を評価した。遊離脂肪酸無しの処理群を対照として用いた。肝毒性を、生存度、細胞毒性及びアポトーシスを評価するApoTox-GloTM Triplex Assayで評価した。
遊離脂肪酸の非存在下では、トログリタゾンの存在下で胆汁酸の肝毒性が増加した（図１９）。ＴＣ５０（肝細胞に対する毒性が５０％である胆汁酸の濃度）は、対照の４４％へ減少した（１．４８μＭから０．６５μＭへ）（表２）。
Figure 0007090072000002
オレイン酸：パルミチン酸の両方の比率で遊離脂肪酸を添加すると、トログリタゾンの存在下で胆汁酸プールの肝毒性がさらに変化した。図２０を参照されたい。トログリタゾン及びオレイン酸とパルミチン酸（オレイン酸：パルミチン酸比が２：１）の存在下の胆汁酸についてのＴＣ５０は、対照の９．５％へ減少した（１．３２μＭから０．１３μＭへ）（表３）。
Figure 0007090072000003
オレイン酸：パルミチン酸比が０：３の存在下でも同様の効果が観察された（図２１）。トログリタゾン及びオレイン酸とパルミチン酸（オレイン酸：パルミチン酸比が０：３）の存在下での胆汁酸のＴＣ５０は、対照の１７％へ減少した（１．２８μＭから０．２２μＭへ）（表４）。
Figure 0007090072000004
オレイン酸：パルミチン酸のいずれの比率においても、遊離脂肪酸単独の添加は、プールされた胆汁酸の肝毒性プロファイルにほとんど影響を及ぼさなかった。ＤＭＳＯ対照中の胆汁酸のＴＣ５０は、遊離脂肪酸のいずれかの比（オレイン酸：パルミチン酸が２：１又は０：３）を添加した場合、それぞれ対照の８９％及び８６％へしか減少しなかった。以下の表５を参照されたい。
Figure 0007090072000005
トログリタゾンの存在下での胆汁酸の肝毒性に対する遊離脂肪酸のこのような予期しない効果は、遊離脂肪酸の添加が、胆汁酸排出を変化させそして肝毒性を予測する可能性についての試験化合物の評価における因子であり得ることを示唆する。
実施例６
胆汁うっ滞肝毒性スクリーニングアッセイの応用
上述のように、薬物曝露が胆汁酸排出経路（例えば、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）及び／又はＭＲＰ３／４）を阻害し、そして１）ファルネソイドＸ受容体（FXR）が細胞内濃度の上昇した胆汁酸を感知するのを妨げる（拮抗する）、又は２）側底排出トランスポーター（OST）α／βを介した胆汁酸流出を阻害する、又は３）これら両方の、場合、肝細胞は胆汁酸毒性（例えば、胆汁うっ滞性肝毒性）の影響を受けやすくなる。この発見をさらに説明するために、ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）を、低グルコース（約２ｍＭから約１０ｍＭ、又は約５ｍＭ）標準培地又は低グルコース（約２ｍＭから約１０ｍＭ、又は約５ｍＭ）を含む感作培地、又は、いくつかの実施態様において、他の適切なエネルギー源（例えば、ガラクトース）、遊離脂肪酸（約１００μＭから約２ｍＭ、又は約２５０μＭから約１．５ｍＭ、又は約５００μＭから約１ｍＭ、又は約１ｍＭ）、及び胆汁酸プール（約５μＭ～約１ｍＭ、又は約５０μＭ～約５００μＭ、又は約１００μＭ～約２５０μＭ、又は約２５０μＭ）を用いて、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）阻害剤（例えば、シクロスポリンＡ（CsA）；Ansede et al., 2010）、又は胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）阻害剤とファルネソイドＸ受容体（FXR）アンタゴニストの両方の特徴を有する化合物（例えば、トログリタゾン； Marion et al., 2007 and Kaimal et al. 2009）に24時間曝露した。
要約すると、肝細胞をサンドイッチ培養構成で４回確立した。培養４日目に、ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）をシクロスポリンＡ（CsA）（１０μＭ； １３×Ｃｍａｘ）又はトログリタゾン（１００μＭ； １６×Ｃｍａｘ）に２４時間曝露し、標準的な培地又は感作培地で培養した。シクロスポリンＡ（CsA）及びトログリタゾンの濃度は、Dawson et al. 2012に報告されているCmax値に基づく。試験化合物の経口投与後に門脈内で起こり得る集中作用を考慮して、薬物曝露は約8倍から約16倍のCmaxの範囲であった。24時間後、ＬＤＨ漏出及びＡＴＰ含有量を市販のアッセイを利用して評価した。
標準培養条件下では、シクロスポリンＡ（CsA）（１０μＭ；１３ｘＣｍａｘ）又はトログリタゾン（１００μＭ；１６ｘＣｍａｘ）のいずれかで処置した３つのヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）ドナーのいずれにおいても、ＬＤＨ分泌の顕著な増加及びＡＴＰ含有量の有意な減少は観察されなかった（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。しかし、感作培養条件下では、シクロスポリンＡ（CsA）曝露ではなくトログリタゾン曝露は、３つのヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）ドナーにおいて、LDH分泌が対照の490％以上へ増加し（Tukey's; p値<0.05）、ATP含量が対照の0.9％以下へ減少した（Tukey's; p値<0.05）（図２２Ａ及び２２Ｂ）。
感作培地は、遊離脂肪酸、並びに毒性を最小にするが肝細胞胆汁酸ホメオスタシス機構に挑戦する適切な濃度（２５０μＭ）の上記の一次及び二次胆汁酸（ＧＣＤＣＡ、ＧＣＡ、ＤＣＡ及びＧＤＣＡ）の生理学的混合物を含む。感作培地への24時間の曝露後、3つのヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）調製物のうち2つにおいて、LDH分泌は有意に増加しなかった（Tukeyのp値<0.05）（図２３Ａ）。同じドナーでは、感作培地中でＡＴＰ含有量が２４．８％以下減少した（図２３Ｂ）。これらの結果は、感作培地が複数のドナーにわたって許容度が高いことを示した。
標準培養条件下で、胆汁うっ滞性の肝毒性物質であるトログリタゾンの存在下では、肝細胞は毒性を誘発するのに十分な濃度の胆汁酸又は適切な混合物を有さない。これは、トログリタゾンで処理した場合、標準培養条件下において、調べた３つのドナー全てにおいてＬＤＨ及びＡＴＰに対する効果が欠如していることによって実証された（図２４Ａ及び２４Ｂ）。胆汁酸ホメオスタシスメカニズムの機能を完全に評価するためには、肝細胞は胆汁酸の負荷を必要とする。食事後に分泌された胆汁酸の95％以上が回腸から門脈にインビボで再吸収される(Chiang, 2009)。従って、インビボの胆汁酸門脈濃度は、動的であり、それぞれ標準培地及び感作培地に代表される、空腹時と食後状態との間で３倍以上増加することが報告されている(Angelin B et al, 1982)。
シクロスポリンＡ（CsA）療法に関連するヒトの主な毒性は腎毒性と神経毒性であり、肝毒性ではなく、用法に比べて発生率が比較的低い(LiverTox Database, Magnasco et al., 2008)。これとは対照的に、トログリタゾンに関する臨床研究によれば、肝損傷の発生率は1：1000患者程度に高くなる可能性があり、これは明らかにトログリタゾンが肝損傷を引き起こすことを示している(LiverTox Database)。これら２つの強力な胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）阻害剤の間の臨床的肝障害発生率の明確な差は、胆汁酸塩排出タンパク質（BSEP）阻害に加えて、胆汁酸ホメオスタシス機構の干渉（例えば、ファルネソイドＸ受容体（FXR）拮抗作用）のような別のプロセスが含まれることを示唆する。この臨床的肝障害発生率とシクロスポリンＡ（CsA）及びトログリタゾンのインビボアッセイの結果とは完全に一致しており、このことは、胆汁うっ滞性の肝毒性アッセイが、非薬物性肝障害(DILI)剤であるシクロスポリンＡ（CsA）と胆汁うっ滞性薬物性肝障害(DILI)剤であるトログリタゾンとを区別することができることを示唆している。
５０μＭ（８×Ｃｍａｘ）、７５μＭ（１２×Ｃｍａｘ）及び１００μＭ（１６×Ｃｍａｘ）の３つの異なるヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）調製物におけるトログリタゾン（チアゾリジンジオン系化合物）の滴定により、感作培地のみで現れる毒性の用量依存性を確立した（図２４Ａ及び図２４Ｂ）。濃度が５０～７５μＭ（８×～１２×Ｃｍａｘ）のトログリタゾンで処理された３つのドナー全てにおいて、対照の５９０％以上のＬＤＨ漏出及び対照の９５％以上のＡＴＰ含有量の喪失が、観察された（図２４Ｂ）。これらの結果は、肝毒性経路が特異体質ではなく、ドナーで投与量に依存する毒性が保存されていることを実証した。評価された全ての濃度で、標準培地条件下でトログリタゾンに曝露されたヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）において、LDH漏出又はATPの喪失の顕著な増加は観察されなかった。これらの結果は、胆汁うっ滞性物性肝障害(DILI)剤を同定するためには、ヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）が特定の培養条件（例えば、感作培地）を必要とすることを実証した。これらの結果は、肝細胞が大量の胆汁酸を処理することを必要とする条件において（例えば、感作条件）、トログリタゾンが、胆汁酸ホメオスタシスメカニズムを破壊し、胆汁酸又は胆汁鬱滞性肝毒性をもたらすことを示唆した。
この結論は、トログリタゾンの存在下のヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）培養物において観察された、d8-TCAの胆汁クリアランスの阻害（図２５）及びファルネソイドＸ受容体（FXR）拮抗作用（図２６）によってさらに支持された。このモデル胆汁酸（ｄ８－ＴＣＡ）の胆汁クリアランスは、トログリタゾンで処理したヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）において用量依存的に著しく減少した（図２５Ａ）。トログリタゾンに曝露されたヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）において、ｄ８－ＴＣＡの胆汁排泄（例えば、胆汁排泄指数）も用量依存的に顕著に減少した（図２５Ｂ）。これらの結果は、以前の報告(Marion et al., 2007)と一致して、トログリタゾンの存在下で、小管ドメインを横切る胆汁酸排泄が減少したことを示唆する。
トログリタゾン（７５～１００μＭ）曝露はまた、ＣＤＣＡ及びシクロスポリンＡ（CsA）の同時処理後にヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）においてＯＳＴβｍＲＮＡ含有量の相乗的誘導応答を防止した（図２６Ａ及び２６Ｂ）。CDCA、CsA及びDY268（新規で強力なファルネソイドＸ受容体（FXR）アンタゴニスト）の組み合わせで処理したヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）においても同様の効果が観察された(Yu et al., 2014)。これとは別に、ＯＳＴβｍＲＮＡ含有量の減少は、評価された条件下での細胞毒性によって説明され得る。しかし、調べた条件下ではＡＴＰ含量の有意な減少やＬＤＨ漏出の増加は観察されず、ＯＳＴβｍＲＮＡ含量の減少はファルネソイドＸ受容体（FXR）活性化の拮抗作用によるものであることが示唆された（図２７）。
ピオグリタゾン及びロシグリタゾンを含む他のチアゾリジンジオン化合物を使用して、胆汁うっ滞性の肝毒性スクリーニング予測精度の予備的評価を行った。トログリタゾン（チアゾリジンジオン化合物であり、かつ定評のある薬物性肝障害(DILI)剤である）は、臨床的肝障害発生率が1：1000患者であり、肝障害のために市場から除外された(LiverTox Database)。これとは対照的に、ピオグリタゾン及びロシグリタゾンのいずれも、広範な使用にもかかわらず、12件未満の肝損傷症例しか報告されていない(LiverTox Database)。ピオグリタゾン又はロシグリタゾンのいずれについても、大規模臨床試験において、通常の上限3倍以上のALT上昇はプラセボレシピエントと変わらなかった。これは、これらのチアゾリジンジオン化合物のいずれについても肝障害の可能性が低いことを示唆する。トログリタゾン(Cmax: 6.4 μM; Dawson et al. 2012)、ピオグリタゾン(Cmax: 2.9 μM; Dawson et al. 2012)及びロシグリタゾン(Cmax: 1.0 μM; Dawson et al. 2012)のＣｍａｘを含む広範囲の濃度（1、5、10、25、50、100μM）にわたって、3つすべてのチアゾリジンジオン化合物を胆汁うっ滞肝毒性スクリーニングアッセイで評価した。トログリタゾン（１００μＭ）で処理されたヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）において、感作培養条件下でのみ、ＬＤＨ漏出の顕著な増加（対照の８６３％）及びＡＴＰ含量の顕著な喪失（対照の＞ ９９％）が観察され（図２８Ａ及び２８Ｂ）、これは以前の結果と整合した。調べたいずれの培養条件下でも、いずれの濃度のピオグリタゾン又はロシグリタゾンで処理したヒト肝細胞のサンドイッチ培養物（SCHH）においても、ＬＤＨ漏出の顕著な増加又はＡＴＰ含有量の減少は観察されなかった（図２８Ａ及び２８Ｂ）。これらのインビトロの結果は、開示された胆汁うっ滞性の肝毒性スクリーニングアッセイの予測精度を実証したチアゾリジンジオン系化合物の臨床的肝損傷発生率と概ね一致していた。
参考文献
特許、特許出願及び刊行物、科学雑誌記事、ならびにデータベースエントリ（例えば、GENBANK(R)データベースエントリ及びその中で利用可能なすべての注釈）を含む（但し、これらに限定されない）全ての参考文献は、それらが本明細書で使用される方法論、技術、及び／又は組成物を補足し、説明し、背景を提供し、又は教示する限りにおいて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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本発明の様々な詳細は、本発明の範囲から逸脱することなく変更され得ることが理解されるであろう。さらに、上記の説明は例示のみを目的としており、限定することを目的としていない。
１０ 肝細胞系
１２ 肝細胞
１４ タイトジャンクション
１６ 胆管

Claims (12)

  1. 胆汁うっ滞性の肝毒性の可能性について化合物をスクリーニングする方法であって、以下の段階を含み、
    （ａ）スクリーニングされるべき化合物を提供する段階、
    （ｂ）胆汁酸合成、胆汁酸輸送及び／又は胆汁酸調節の能力を有する肝細胞系（ＨＣＳ）を確立する段階、
    （ｃ）ある濃度範囲の胆汁酸に該肝細胞系（ＨＣＳ）を曝露し、胆汁酸の毒性効力を決定する段階、
    （ｄ）スクリーニングされる化合物の存在下でこの肝細胞系（ＨＣＳ）をある濃度範囲の胆汁酸に曝露し、胆汁酸の毒性効力を決定する段階、及び
    （ｅ）段階（ｃ）と段階（ｄ）との間の該胆汁酸の毒性効力を比較して、該化合物が全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性を決定する段階
    段階（ｅ）が、更に、該化合物の存在下において、該化合物の非存在下と比較して、該胆汁酸の毒性効力に変化がないことを確認する段階、該化合物の存在下において、該化合物の非存在下と比較して、該胆汁酸の毒性効力の増加を確認する段階、又は該化合物の存在下において、該化合物の非存在下と比較して、該胆汁酸の毒性効力の低下を確認する段階、を含み、
    該胆汁酸の毒性効力に低下を引き起こす化合物を、全身毒性をもたらす胆汁うっ滞を引き起こす可能性を有する化合物とみなし、該全身毒性をもたらす胆汁うっ滞が、胆汁酸取り込みの阻害によって引き起こされ、
    段階（ｃ）及び段階（ｄ）の該胆汁酸の毒性効力が、酵素漏出、ＡＴＰ、ＡＰＯＴＯＸ Ｇｌｏ及びそれらの組み合わせで評価され、該酵素漏出が、ＡＬＴ、ＡＳＴ及びＬＤＨから成る群から選択される一つで評価される、方法。
  2. 胆汁酸の毒性効力に変化を引き起こさない化合物を、全身毒性又は肝毒性を引き起こさない化合物とみなし、胆汁酸の毒性効力の増加を引き起こす化合物を、胆汁うっ滞性の肝毒性を引き起こす可能性を有する化合物とみなす、請求項１に記載の方法。
  3. 前記胆汁うっ滞性の肝毒性が胆汁酸排出及び／又は胆汁酸塩排出タンパク質（ＢＳＥＰ）の阻害によって引き起こされる、この場合、前記化合物を胆汁酸排出阻害剤とみなし、及び／又は前記胆汁うっ滞性の肝毒性がファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）の拮抗作用によって引き起こされる、この場合、前記化合物をファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アンタゴニストとみなし、及び／又は両方の組み合わせである、請求項２に記載の方法。
  4. 段階（ｅ）が、前記化合物を、胆汁酸排出阻害剤、ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アンタゴニスト、胆汁酸取り込み阻害剤、又は上記の非存在と決定する段階を含む請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記化合物が候補薬物であり、この候補薬物が、全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性が低いとみなし、又は全身毒性及び／又は肝毒性を引き起こす可能性が高いとみなす、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 胆汁酸輸送が、胆汁酸取り込み、側底排泄及び／又は小管排泄を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記段階（ｃ）及び段階（ｄ）の胆汁酸の濃度範囲が、インビボでの細胞内の空腹時及び／又は食後の濃度を模倣する細胞内濃度を含む、及び／又は前記胆汁酸の濃度範囲が、ファルネソイドＸ受容体（FXR）フィードバック機構を活性化するのに十分な胆汁酸細胞内濃度を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 更に、肝細胞系（ＨＣＳ）を複数の胆汁酸に曝露して、この複数の胆汁酸についての複数の毒性効力を決定する段階を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記複数の毒性効力が、前記化合物の肝毒性の可能性を予測するために、前記化合物の非存在下及び存在下の肝細胞系（ＨＣＳ）中で測定される、請求項８に記載の方法。
  10. 前記肝細胞系（ＨＣＳ）が、初代肝細胞又はその他の肝細胞系を利用した、二次元培養物又は三次元培養物を含み、該二次元培養物が肝細胞のサンドイッチ培養物（ＳＣＨ）を含み、該ＳＣＨがヒト肝細胞を含み、該三次元培養物が、三次元（３Ｄ）足場に基づく培養物又は回転楕円体培養物を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記化合物が、ある範囲の濃度にわたって肝細胞系（ＨＣＳ）に曝露される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記胆汁酸又は複数の胆汁酸が、ＧＣＡ、ＧＣＤＣＡ、ＧＤＣＡ、ＤＣＡ、ＣＡ、ＣＤＣＡ、ＴＣＡ、ＴＣＤＣＡ、ＬＣＡ、ＧＬＣＡ、ＴＬＣＡ、又はそれらの任意の組み合わせであり、前記肝細胞系（ＨＣＳ）中で、１又はそれ以上の遊離脂肪酸及び／又は予め定めたグルコースの濃度が採用される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
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