JP7089305B1

JP7089305B1 - 皮膚美白用組成物

Info

Publication number: JP7089305B1
Application number: JP2021069140A
Authority: JP
Inventors: 麻衣子宮▲崎▼; 裕晃飯塚; 敦史山津; 武祚金
Original assignee: Pharma Foods International Co Ltd
Current assignee: Pharma Foods International Co Ltd
Priority date: 2021-04-15
Filing date: 2021-04-15
Publication date: 2022-06-22
Anticipated expiration: 2041-04-15
Also published as: CN117119910A; JP2022163974A; WO2022220269A1

Abstract

【課題】安全性が高く、かつ優れた美白作用を有する美白剤を提供すること。【解決手段】本願発明は、トレハロースを有効成分として含む、皮膚美白用組成物を提供する。また本願発明は、肌の明度を向上させる方法であって、トレハロースを有効成分として含む皮膚美白用組成物を適用する工程を含む、方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は皮膚美白用組成物に関する。具体的には、トレハロースを有効成分として含む皮膚美白用組成物に関する。

紫外線曝露による日焼けのほか、シミ、そばかす、くすみなどの皮膚における色素の沈着は、色素細胞（メラノサイト）のメラニン生成が亢進された後、過剰に生成されたメラニンがターンオーバーの異常などによって生じることが知られている。このような皮膚における色素の沈着は外観から容易に認められるため、多くの人にとって美容上の大きな悩みとなっており、美白剤や美白用化粧料などの需要は近年大きいものとなっている。

このような需要をうけて、近年においては、皮膚における色素の沈着の予防や改善を目的とする美白剤や美白用化粧料として、メラニン産生抑制剤、チロシナーゼ阻害剤、チロシナーゼ遺伝子発現抑制剤、α－ＭＳＨ阻害剤、抗酸化剤などの色素沈着が生じる作用機序に着目した美白剤が開発されている。

しかしながら、このような美白剤における美白効果は、その作用を発揮する濃度では望まない副作用が生じることもあり、安全性が高く、かつ優れた美白作用を有する美白剤の開発が求められている。

本発明者らは、トレハロースに美白作用があることを見出し、このトレハロースを用いることにより、安全性が高く、かつ優れた美白作用を有する皮膚美白用組成物や、この組成物を用いて、肌の明度を向上させる方法を提供する。

したがって、本発明の主要な観点によれば、以下の発明が提供される。
（項目１）
トレハロースを有効成分として含む、皮膚美白用組成物。
（項目２）
トレハロースを少なくとも約０．００１ｗ／ｖ％の濃度で含む、上記項目に記載の組成物。
（項目３）
前記組成物は経口摂取または皮膚に塗布される、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４）
前記トレハロースは約１ｍｇ～約１０ｇ／日の量で経口摂取または皮膚に塗布される、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
メラニン生成を抑制する、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
チロシナーゼ発現を抑制する、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
飲食品、食品添加物、化粧品、医薬部外品、または医薬品である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目Ａ１）
肌の明度を向上させる方法であって、トレハロースを有効成分として含む皮膚美白用組成物を適用する工程を含む、方法。
（項目Ａ２）
前記組成物が、前記トレハロースを少なくとも約０．００１ｗ／ｖ％の濃度で含む、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ３）
前記適用は、前記組成物の経口摂取および肌表面への塗布を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４）
前記肌が、メラニンが沈着している肌の部分を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ５）
前記適用する工程は、前記有効成分を約１ｍｇ～約１０ｇ／日の量で適用するように行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１）
上記項目のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物を皮膚に塗布し、または経口摂取する工程を有する、非治療的な美白方法。
（項目Ｃ１）
トレハロースを有効成分として含む、メラニン生成抑制剤。
（項目Ｃ２）
トレハロースを少なくとも約０．００１ｗ／ｖ％の濃度で含む、上記項目に記載の抑制剤。
（項目Ｃ３）
前記抑制剤は経口摂取または皮膚に塗布される、上記項目のいずれか一項に記載の抑制剤。
（項目Ｃ４）
前記トレハロースは約１ｍｇ～約１０ｇ／日の量で経口摂取または皮膚に塗布される、上記項目のいずれか一項に記載の抑制剤。
（項目Ｃ５）
チロシナーゼ発現を抑制する、上記項目のいずれか一項に記載の抑制剤。
（項目Ｃ６）
上記項目のいずれか一項に記載のメラニン生成抑制剤を含有する、皮膚美白用組成物。
（項目Ｃ７）
飲食品、食品添加物、化粧品、医薬部外品、または医薬品である、上記項目に記載の組成物。

本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。

本発明の組成物により、メラニンの合成を抑制し、肌の明度を高めることができる。また肌に塗布しても経口で摂取しても美白などの美容効果を得ることができるため、化粧品だけではなく、美白効果を備えたサプリメントなどの補助食品としても提供することができ、利用価値が高い。

図１は、本発明の一実施形態において、トレハロース含有物を摂取した場合の肌明度の改善効果を示すグラフである。トレハロース含有物摂取群とプラセボ群について、８週間（１１～１２月）にわたって毎日摂取した場合の肌明度を比較した。図２は、本発明の一実施形態において、Ｂ１６メラノーマ細胞でのチロシナーゼ遺伝子発現の比較結果を示すグラフである。チロシナーゼの産生を刺激するＭＳＨを添加したＭＳＨ群、ＭＳＨを添加していないコントロール群、ＭＳＨとトレハロースを添加したトレハロース群（０．３８％、０．７６％、１％）のそれぞれについて、チロシナーゼ遺伝子発現を比較した。

以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。

本明細書において、「美白」とは、色素沈着の予防および／または改善をいい、より具体的には、シミ、くすみ、そばかす、日焼け、皮膚の炎症や刺激による黒ずみ等のメラニン産生亢進、過剰蓄積、及び沈着異常等により生じる色素沈着症状の、予防および／または改善をいう。

（好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。

本発明の一局面において、トレハロースを有効成分として含む、皮膚美白用組成物が提供される。

トレハロースは２分子のα－グルコースがα－１，１－グリコシド結合してできた非還元性の二糖類であり、多くの動植物や微生物中に天然に含まれている。トレハロースには、α，α型構造（α－Ｄ－グルコピラノシルα－Ｄ－グルコピラノシド）、α，β型構造（ネオトレハロース）、β，β型構造（イソトレハロース）の異性体が存在する。本発明においては、いずれの型を用いてもよく、１種単独でまたは２種以上を適宜組み合わせて用いることができる。トレハロースは様々な機能を有し、例えば、甘味成分等の食品に添加物として広く使用されている。現在はでん粉から工業的に大量生産されており、市販品としても容易に入手可能である。市販品のトレハロースについても、本発明の方法による効果を損なわない範囲において本発明の方法に用いることができる。

食品に使われているトレハロースはジャガイモやトウモロコシのデンプンから製造されることができるが、酵母などの微生物を大量に培養してトレハロースを抽出することもできる。

本発明の皮膚美白用組成物は、特に限定されないが、経皮または経口で摂取する態様とすることができる。

（飲食品）
本発明の一実施形態において、本発明の組成物を経口摂取または経口投与する場合の態様としては、飲食品や食品添加物とすることができ、または医薬部外品や医薬品とすることもできる。

飲食品の態様とする場合、トレハロースの含有量は所望の効果を発揮し得る量であればよく、飲食品の種類や組成物を添加する飲食品の形態に応じて適宜変更することもでき、例えばトレハロースの含有量を組成物全量に対して総量で、好ましくは約０．００１～約１０ｗ／ｖ％、約０．０１～約１０ｗ／ｖ％、約０．１～約１０ｗ／ｖ％、より好ましくは約０．１～約８ｗ／ｖ％、さらに好ましくは約１～約５ｗ／ｖ％とすることができる。一実施形態において、本発明の組成物におけるトレハロースの含有量は、例えば、約０．３８ｗ／ｖ％とすることもできる。

また本発明の一実施形態において、本発明の組成物を飲食品の態様とする場合、その製造に際しては、食品製造において通常使用される成分を任意に配合することができる。任意の成分としては、例えば、タンパク質、炭水化物、脂肪、栄養素、調味料及び香味料等を用いることができる。炭水化物としては、単糖類、例えば、ブドウ糖、果糖など；二糖類、例えば、マルトース、スクロース、オリゴ糖など；及び多糖類、例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖及び、キシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールが挙げられる。香味料としては、天然香味料（タウマチン、ステビア抽出物等）及び合成香味料（サッカリン、アスパルテーム等）を使用することができる。その他に、通常食品に添加される、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味剤、矯臭剤、ｐＨ調整剤、着色剤等の添加物を使用してもよい。

本発明の一実施形態において、飲食品の形態としては、液状、ペースト状、固体、粉末、顆粒等の形態とすることができる。また他の実施形態において、本発明の組成物は、可溶性粉末とすることができ、タブレット、ハードカプセル、ゼリー、ドリンクなどの他の任意の飲食品に含有、添加または混合することもできる。

本発明のトレハロースを有効成分として含む皮膚美白用組成物を含有する飲食品の好ましい摂取量は特に限定されないが、トレハロース量換算で１日当たり約０．００１ｍｇ～約１０ｇとすることが、十分に効果が発揮される観点から好ましく、さらに約０．０１ｍｇ～約１０ｇ、さらに約１ｍｇ～約１０ｇとすることが好ましく、１日当たり約３８ｍｇの量で摂取することもできる。この１日分の量を一度に、または数回に分けて摂取することができる。また、単回摂取する他に、連続的にまたは断続的に数週間～数か月の間摂取することが好ましい。

（皮膚外用剤）
本発明の皮膚美白用組成物を経皮投与や皮膚に塗布する態様としては、化粧品、医薬部外品、及び医薬品等の皮膚外用剤とすることができる。皮膚外用組成物の剤型としては、特に限定されるものではないが、例えば、ローション剤型、乳液やクリーム等の乳化剤型、オイル剤型、ジェル剤型、パック剤型などが挙げられる。

本発明の組成物を皮膚外用剤の態様とする場合は、トレハロースの含有量は所望の効果を発揮し得る量であればよく、化粧品の種類や組成物を混合する皮膚外用剤の形態に応じて適宜変更することもでき、例えばトレハロースの含有量を組成物全量に対して総量で、好ましくは約０．００１～約１０ｗ／ｖ％、より好ましくは約０．０１～約１０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは約０．１～約８ｗ／ｖ％とすることができる。一実施形態において、本発明の組成物におけるトレハロースの含有量は、例えば、約０．３８ｗ／ｖ％とすることもできる。

本発明の組成物は、皮膚外用剤の態様である場合、トレハロース以外に通常の皮膚外用組成物に配合される成分を、本発明の効果を損なわない限りにおいて任意に含有することができる。そのような成分としては、例えば、マカデミアナッツ油、アボガド油、トウモロコシ油、オリーブ油、ナタネ油、ゴマ油、ヒマシ油、サフラワー油、綿実油、ホホバ油、ヤシ油、パーム油、液状ラノリン、硬化ヤシ油、硬化油、モクロウ、硬化ヒマシ油、ミツロウ、キャンデリラロウ、カルナウバロウ、イボタロウ、ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、ホホバロウ等のオイル、ワックス類；流動パラフィン、スクワラン、プリスタン、オゾケライト、パラフィン、セレシン、ワセリン、マイクロクリスタリンワックス等の炭化水素類；オレイン酸、イソステアリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、ウンデシレン酸等の高級脂肪酸類；セチルアルコール、ステアリルアルコール、イソステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、オクチルドデカノール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール等の高級アルコール等；イソオクタン酸セチル、ミリスチン酸イソプロピル、イソステアリン酸ヘキシルデシル、アジピン酸ジイソプロピル、セバチン酸ジ－２－エチルヘキシル、乳酸セチル、リンゴ酸ジイソステアリル、ジ－２－エチルヘキサン酸エチレングリコール、ジカプリン酸ネオペンチルグリコール、ジ－２－ヘプチルウンデカン酸グリセリン、トリ－２－エチルヘキサン酸グリセリン、トリ－２－エチルヘキサン酸トリメチロールプロパン、トリイソステアリン酸トリメチロールプロパン、テトラ－２－エチルヘキサン酸ペンタンエリトリット等の合成エステル油類；ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、ジフェニルポリシロキサン等の鎖状ポリシロキサン；オクタメチルシクロテトラシロキサン、デカメチルシクロペンタシロキサン、ドデカメチルシクロヘキサンシロキサン等の環状ポリシロキサン；アミノ変性ポリシロキサン、ポリエーテル変性ポリシロキサン、アルキル変性ポリシロキサン、フッ素変性ポリシロキサン等の変性ポリシロキサン等のシリコーン油等の油剤類を使用してもよい。

また、本発明の皮膚美白用組成物には、トレハロース以外の美白剤を共に配合することもできる。そのような美白剤としては、例えば、アルキルレゾルシノール、アスコルビン酸またはその誘導体、胎盤抽出物、ユキノシタやハトムギなどの植物抽出物、アルブチン、コウジ酸、グルタチオン、乳酸、システインなどを挙げることができる。

本発明のトレハロースを有効成分として含む皮膚美白用組成物を含有する化粧品や皮膚外用剤の好ましい塗布量は特に限定されないが、トレハロース量換算で１日当たり約０．００１ｍｇ～約１０ｇとすることが、十分に効果が発揮される観点から好ましく、さらに約０．０１ｍｇ～約１０ｇ、さらに約０．１ｍｇ～約１０ｇ、約１ｍｇ～約１０ｇ、約１ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１０ｍｇ～約１００ｍｇとすることが好ましく、１日当たり約３８ｍｇの量で塗布することもできる。この１日分の量を一度に、または数回に分けて塗布することができる。また、単回塗布する他に、連続的にまたは断続的に数週間～数か月の間塗布することが好ましい。

（メラニン生成およびチロシナーゼ遺伝子発現の抑制）
本発明の一実施形態において、本願発明の皮膚美白用組成物は、経口摂取した場合、または皮膚に塗布した場合のいずれにおいても、メラニン生成を抑制することができる。また他の実施形態において、本願発明の皮膚美白用組成物は、経口摂取した場合、または皮膚に塗布した場合のいずれにおいても、チロシナーゼ遺伝子の発現を抑制することができる。

本発明の一局面において、肌の明度を向上させる方法であって、トレハロースを有効成分として含む皮膚美白用組成物を適用する工程を含む、方法が提供される。

本発明の肌の明度を向上させる方法に用いる組成物は、トレハロースの含有量は所望の効果を発揮し得る量であればよく、適用する肌の部位や適用態様に応じて適宜変更することもでき、例えばトレハロースの含有量を組成物全量に対して総量で、好ましくは約０．００１～約１０ｗ／ｖ％、より好ましくは約０．０１～約１０ｗ／ｖ％、さらに好ましくは約０．１～約８ｗ／ｖ％とすることができる。一実施形態において、本発明の組成物におけるトレハロースの含有量は、例えば、約０．３８ｗ／ｖ％とすることもできる。

本発明の肌の明度を向上させる方法において、トレハロースを有効成分として含む皮膚美白用組成物は、経口摂取または肌表面に塗布する態様とすることができる。肌に塗布する態様とする場合、どのような肌にも適用することができるが、メラニンが沈着している肌の部分に適用することで、本発明の皮膚美白用組成物による美白効果をより効率的に得ることができる。

本発明の肌の明度を向上させる方法において、トレハロースを有効成分として含む皮膚美白用組成物の適用量は特に限定されないが、トレハロース量換算で１日当たり約０．００１ｍｇ～約１０ｇとすることが、十分に効果が発揮される観点から好ましく、さらに約０．０１ｍｇ～約１０ｇ、さらに約０．１ｍｇ～約１０ｇ、約１ｍｇ～約１０ｇ、約１ｍｇ～約１０００ｍｇ、約１０ｍｇ～約１００ｍｇとすることが好ましく、１日当たり約３８ｍｇの量で適用することもできる。この１日分の量を一度に、または数回に分けて適用することができる。また、単回適用する他に、連続的にまたは断続的に数週間～数か月の間適用することが好ましい。

本発明の一実施形態において、本発明の肌の明度を向上させる方法によれば、トレハロースを有効成分として含む皮膚美白用組成物を少なくとも約８週間適用した場合に、当該組成物を適用していない肌と比べて、当該組成物を適用した肌の明度は約０．５％、約０．７％、約１％、約１．５％、約１．６％、約１．８％、約２％、約５％、約８％、約１０％、約１５％、約２０％、約３０％、約４０％、約６０％、約８０％、または約１００％向上することができる。

本発明の一局面において、皮膚美白用組成物を皮膚に塗布し、または経口摂取する工程を有する、非治療的な美白方法が提供される。この場合、本発明の美白方法に用いられる皮膚美白用組成物としては、本明細書の他の箇所で説明される皮膚美白用組成物を用いることができる。

また他の局面において、トレハロースを有効成分として含む、メラニン生成抑制剤を提供することができる。この場合、本発明のメラニン生成抑制剤は、他の賦形剤と共に、皮膚美白用組成物とすることができる。このような皮膚美白用組成物は、本明細書の他の箇所で説明される皮膚美白用組成物として用いることができる。

本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

（実施例１：トレハロース含有物摂取による肌明度の改善効果）
トレハロース含有物をヒトに経口摂取した場合の肌明度の改善効果を確認した。試験デザインはダブルブラインド並行群間試験とし、予め肌明度がほぼ等しくなるように２群に分けた被験者について、トレハロース含有物１００ｍｇ（トレハロースとして３８ｍｇ）／日を経口摂取した群（Ｎ＝１２）と、プラセボ（対照）１００ｍｇ／日を経口摂取した群（Ｎ＝１２）とに分けた。それぞれの群において、トレハロース含有物またはプラセボは、１日１回摂取することとし、８週間（１１～１２月）にわたって毎日摂取させた。

肌明度の測定は、Skin color sensor(SCS-1,Moritex Co.)を用いて、０、２、４、６、８週目に、両腕の同箇所の明度を経時的に測定した。

結果を図１に示した。トレハロース含有物摂取群はプラセボ群と比べて、２週間の時点で肌明度の向上傾向が見られはじめ、トレハロース含有物摂取群はプラセボ群に比べて肌明度が８週間で１．６％改善することがわかった。

（実施例２：トレハロース含有物によるチロシナーゼ遺伝子発現抑制効果）
Ｂ１６マウスメラノーマ細胞を用いてトレハロース含有物によるチロシナーゼ遺伝子発現への影響を確認した。

使用試薬としては以下のものを用いた。
・継代用培地：１０％ＦＢＳ，１％Ｐ／Ｓ，Ｄ－ＭＥＭ（低グルコース、富士フィルム０４１－２９７７５）
・サンプル添加用培地（Ｄ－ＭＥＭ／２％ＦＢＳ）：２％ＦＢＳ，１％Ｐ／Ｓ，Ｄ－ＭＥＭ（低グルコース、富士フィルム０４１－２９７７５）
・ＰＢＳ（－）：ボトル（富士フィルム）でも粉末（ダルベッコ）でもどちらでも使用可能
・α－ＭＳＨ：（Ｗａｋｏ，３３８－４０５７１）０．１ｍＭとなるようフィルターしたＤＷで溶解後、５０μＬずつエッペンチューブに分注し、－２５℃で保管。使用時に解凍し、１００ｎＭＭＳＨとなるようＤ－ＭＥＭ／２％ＦＢＳ培地に溶解させた。
・トレハロース含有物：必要な分を量り取り、１０ｍｇ／ｍＬとなるように、１００ｎＭＭＳＨ，Ｄ－ＭＥＭ／２％ＦＢＳを加えて溶解し、フィルター滅菌を行って使用した。
・トレハロース：必要な分を量り取り、１０，７．６，３．８ｍｇ／ｍＬとなるように、１００ｎＭＭＳＨ，Ｄ－ＭＥＭ／２％ＦＢＳをそれぞれ加えて溶解し、フィルター滅菌を行って使用した。
・ＩＳＯＧＥＮＩＩ：ニッポンジーン、３１１－０７３６１
・ＲＮＡ抽出用Distilled Water：ニッポンジーン、３１２－９０１０３
・Ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ：富士フィルム、１６８－２１６７５
・７５％ＥｔＯＨ：ＥｔＯＨ（Ｗａｋｏ、０５７－００４５６）とＲＮＡ抽出用ＤＷを３：１で混ぜて調製した。
・PrimeScript RT reagent kit：タカラバイオ、ＲＲ０３７Ａ
・TB Green Premix Ex Taq II：タカラバイオ、ＲＲ８２０Ａ
・βアクチンプライマー：ＦＡＳＭＡＣ、Ｆ配列：ACTATTGGCAACGAGCGGTT（配列番号１）、Ｒ配列：ATGGATGCCACAGGATTCCA（配列番号２）
各５μＭとなるようＦプライマーとＲプライマーを混合した溶液を作製。
・チロシナーゼプライマー：ＦＡＳＭＡＣ、Ｆ配列：GCCCAGCATCCTTCTTC（配列番号３）、Ｒ配列：TAGTGGTCCCTCAGGTGTCC（配列番号４）
各５μＭとなるようＦプライマーとＲプライマーを混合した溶液を作製。

（細胞培養・サンプル添加）
２４穴プレートに、１．０×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬ、０．５ｍＬ／ｗｅｌｌで播種し、翌日、培地をＤ－ＭＥＭ／２％ＦＢＳに交換した。４～６時間後、Ｄ－ＭＥＭ／２％ＦＢＳ＋α－ＭＳＨ１００ｎＭ（比率としては、Ｄ－ＭＥＭ／２％ＦＢＳ５０ｍＬ＋０．１ｍＭ α－ＭＳＨ５０μＬ）に溶かしたサンプルを０．５ｍＬ／ｗｅｌｌで添加した。ポジティブコントロールとしてはα－ＭＳＨ１００ｎＭ添加Ｄ－ＭＥＭ／２％ＦＢＳを、ネガティブコントロールとしてはＤ－ＭＥＭ／２％ＦＢＳを用いた。これを２４時間培養した。

（ＲＮＡ抽出）
ＰＢＳで一度ｗａｓｈした後、ＩＳＯＧＥＮＩＩを０．４ｍＬ／ｗｅｌｌ加え、エッペンドルフチューブに回収した。ＲＮＡ抽出用のＤＷを０．１６ｍＬ／エッペンドルフチューブ加え、エッペンドルフチューブ立てで挟み、１５秒激しく撹拌した後、５～１０分静置した。その後、遠心を２０℃で１２０×１００ｇで１５分間行った。上清０．５ｍＬ／エッペンドルフチューブを回収し、別のエッペンドルフチューブに加えた。イソプロパノールを０．５ｍＬ／エッペンドルフチューブ加え、転倒混和した後、５～１０分静置した。その後、遠心を２０℃で１２０×１００ｇで１０分間行った。

デカントし、７５％ＥｔＯＨを０．５ｍＬ／エッペンドルフチューブ加えた。その後、遠心を２０℃で８０×１００ｇで５分間行った。さらにデカントし、７５％ＥｔＯＨを０．５ｍＬ／エッペンドルフチューブ加えた（２回目）。その後、遠心を２０℃で８０×１００ｇで５分間行った。またさらにデカントし、さかさまにしたまま約２０分間にわたって風乾させた。ＲＮＡ抽出用のＤＷを３０μＬ／エッペンドルフチューブ加え、ＲＮＡを溶解させて－８０℃で保存した。

（ｃＤＮＡ合成）
ＲＮＡの濃度をプレートリーダーを用いて測定し、２００ｎｇ／μＬとなるように８連チューブにＲＮＡ溶液を加えた。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔの１．ｂｕｆｆｅｒ、２．ＲＴｅｎｚｙｍｅ、３．ｄＴｐｒｉｍｅｒｓ（５０μＭ）、及び４．ｒａｎｄｏｍ６ｍｅｒｓ（１００μＭ）を、１：０．２５：０．２５：０．２５：０．２５（μＬ）／１サンプルとなるよう混和し、ボルテックス後、スピンダウンをして調製した。まとめて調製したのち、１．７５μＬ／ｗｅｌｌで加えた。

ＲＮＡ溶液とＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔのｍｉｘとＤＷでｔｏｔａｌ１０μＬとなるようにＤＷを加え、８連チューブのフタを閉め、ボルテックス、スピンダウンをしたのち、サーマルサイクラーで反応させた（３７℃、１５分→８５℃、１５秒→４℃）。反応後、ＤＷ３０μＬ／ｗｅｌｌ加え、ボルテックス、スピンダウンをした。

（ＰＣＲ）
ＴＢｇｒｅｅｎ、５μＭＦ／Ｒｐｒｉｍｅｒｍｉｘ、ＤＷが５：０．８：０．２／１サンプルとなるよう混和し、ボルテックス後、スピンダウンをして調製した。まとめて調製したのち、６μＬ／ｗｅｌｌでＰＣＲ用９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに加えた。ＤＷを加えたｃＤＮＡ溶液を４μＬ／ｗｅｌｌでＰＣＲ用９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅに加え、圧着フィルムでシーリングしたのち、ボルテックス、スピンダウンをした。

リアルタイムＰＣＲ装置を立ち上げ、測定し、サンプルタイプは全てＵｎｋｎｏｗｎ、サイクルは６０℃で４０サイクルとした。βアクチンのＣｔ－チロシナーゼのＣｔ＝ΔＣｔを計算し、２^（ΔＣｔ）＝ΔΔＣｔ値を算出した。ポジティブコントロールのΔΔＣｔ値の平均をチロシナーゼ遺伝子発現率１００％として、各ΔΔＣｔ値から遺伝子発現率を算出した。

結果を図２に示した。この結果、チロシナーゼの産生を刺激するＭＳＨの存在化でトレハロースを加えるとチロシナーゼ遺伝子発現が抑制されることがわかった（トレハロース１％、０．７６％、０．３８％）。このことから、トレハロースはチロシナーゼ遺伝子の発現を抑制することがわかった。またトレハロースの濃度を上昇させることによりチロシナーゼ遺伝子発現の抑制効果も上昇する傾向が見られたことから、さらにトレハロースの濃度を上昇させることにより、ＭＳＨを添加していないコントロール群と同等のチロシナーゼ遺伝子発現となることも予想できた。

（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

本発明の組成物により、メラニンの合成を抑制し、肌の明度を高めることができる。また肌に塗布しても経口で摂取しても美白などの美容効果を得ることができるため、化粧品やサプリメントの分野において有用である。

配列番号１～４：実施例１で用いたフォワードまたはリバースプライマー

Claims

トレハロースを有効成分として含む、経口摂取用の皮膚美白用組成物。
トレハロースを少なくとも約０．００１ｗ／ｖ％の濃度で含む、請求項１に記載の組成物。
前記トレハロースは約１ｍｇ～約１０ｇ／日の量で経口摂取される、請求項１または２に記載の組成物。
メラニン生成を抑制する、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
チロシナーゼ発現を抑制する、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
飲食品、食品添加物、医薬部外品、または医薬品である、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
肌の明度を向上させる非治療的な方法であって、トレハロースを有効成分として含む皮膚美白用組成物を経口摂取する工程を含む、方法。
前記組成物が、前記トレハロースを少なくとも約０．００１ｗ／ｖ％の濃度で含む、請求項７に記載の方法。
前記肌が、メラニンが沈着している肌の部分を含む、請求項７または８に記載の方法。
前記経口摂取する工程は、前記有効成分を約１ｍｇ～約１０ｇ／日の量で経口摂取するように行われる、請求項７～９のいずれか一項に記載の方法。
請求項１～６のいずれか一項に記載の皮膚美白用組成物を経口摂取する工程を有する、非治療的な美白方法。
トレハロースを有効成分として含む、経口摂取用のメラニン生成抑制剤。
トレハロースを少なくとも約０．００１ｗ／ｖ％の濃度で含む、請求項１２に記載の抑制剤。
前記トレハロースは約１ｍｇ～約１０ｇ／日の量で経口摂取される、請求項１２または１３に記載の抑制剤。
チロシナーゼ発現を抑制する、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の抑制剤。
請求項１２～１５のいずれか一項に記載のメラニン生成抑制剤を含有する、皮膚美白用組成物。
飲食品、食品添加物、医薬部外品、または医薬品である、請求項１６に記載の組成物。