JP7078918B2 - Biochip and bioassay device and bioassay method - Google Patents
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Description
本発明は、バイオチップ及びバイオアッセイ装置並びにバイオアッセイ方法に関し、特に、細胞培養やその後のバイオアッセイに好適に用いることができるバイオチップ及びバイオアッセイ装置並びにバイオアッセイ方法に関する。 The present invention relates to biochips and bioassay devices and bioassay methods, and more particularly to biochips and bioassay devices and bioassay methods that can be suitably used for cell culture and subsequent bioassays.
基礎研究や臨床研究などの現場では、細胞など生体試料を分析する目的で、生体試料を支持体に固定した状態で生体試料と特定の化合物等との反応などを評価する手法が用いられている。例えば、腸管上皮細胞を透過性膜上に単層培養した細胞層を用い、リポ酸などの成分の透過性をin vitroで評価する技術が知られている(例えば、非特許文献1)。 In the field of basic research and clinical research, for the purpose of analyzing biological samples such as cells, a method of evaluating the reaction between a biological sample and a specific compound while the biological sample is fixed to a support is used. .. For example, there is known a technique for evaluating the permeability of a component such as lipoic acid in vitro using a cell layer obtained by culturing an intestinal epithelial cell on a permeable membrane in a single layer (for example, Non-Patent Document 1).
非特許文献1に記載された物質透過性試験装置は、内側容器と外側容器とを備え、内側容器の底部に透過性膜を配置している。そして、小腸上皮モデルであるCaco-2細胞層を透過性膜上に単層となるように培養し、次に、透過性膜の管腔側に透過試料を含む溶液を導入して基底膜側に透過する透過試料の濃度を測定する。
The substance permeability test apparatus described in Non-Patent
また、生体試料を固定したチップとして、臓器チップや組織チップなどの生体機能チップ(organ on a chip)も知られている。生体機能チップは、複雑で動的な細胞周囲の微小環境を作り臓器の機能を再現するデバイスであり、種々の臓器を再現するものが開発されている。生体機能チップは、臓器に対して直接実施することが困難な毒性試験や安全性試験、バイオマーカーの同定などへの活用が期待されている。 Further, as a chip on which a biological sample is fixed, a biological functional chip (organ on a chip) such as an organ chip or a tissue chip is also known. Biological function chips are devices that reproduce the functions of organs by creating complex and dynamic microenvironments around cells, and devices that reproduce various organs have been developed. Biofunctional chips are expected to be used for toxicity tests, safety tests, biomarker identification, etc., which are difficult to perform directly on organs.
従来、臓器チップとして、マイクロ流体と多孔性足場とを備えたポリマーチップが知られている(例えば、特許文献1参照)。図5は、この文献に記載されたポリマーチップを示す模式図である。この図に示すように、従来のポリマーチップ200は、多孔性足場205,210と、上部カバープレート250と、底部カバープレート260とを備えている。多孔性足場205,210と上部カバープレート250との間にマイクロ流体チャンネル230,240が形成され、多孔性足場205,210と底部カバープレート260との間にマイクロ流体チャンネル220が形成されている。
Conventionally, as an organ chip, a polymer chip provided with a microfluidic and a porous scaffold is known (see, for example, Patent Document 1). FIG. 5 is a schematic diagram showing the polymer chips described in this document. As shown in this figure, the
次に、本文献のポリマーチップを使用したアッセイについて説明する。血流を介した薬剤の送達及び薬剤反応に対する肝臓代謝の効果を模擬するために、まず、多孔性足場で肝細胞及び癌細胞を培養する。具体的には、多孔性足場205と多孔性足場210に幹細胞と癌細胞をそれぞれ播種し、細胞付着後に入口230から多孔性足場205の上部表面上に培地を注入する。培地は多孔性足場205の下部表面から多孔性足場205を出てマイクロ流体チャンネル220に流入し、多孔性足場210に流入して上部表面からマイクロ流体チャンネル240に流入する。続いて、上記と同様の流路で薬剤を送達することで、細胞の薬剤に対する反応性などを評価する。
Next, an assay using the polymer chip of this document will be described. To simulate the effect of liver metabolism on drug delivery and drug response via bloodstream, hepatocytes and cancer cells are first cultured on a porous scaffold. Specifically, stem cells and cancer cells are seeded in the
特許文献1に記載された従来のポリマーチップは、マイクロ流体チャンネル240の途中が垂直方向に下がる段差V1となっている。このため、入口230から注入される培地や薬剤などの流体が段差V1の部分で垂直に流下するため流速が急に増加する。このため、流速の増加した流体によって多孔性足場205の表面の細胞が流体によりかく乱され、細胞が多孔質体から剥がれることがあった。
The conventional polymer chip described in
本発明の目的は、支持体の表面の生体試料が支持体から剥がれにくいバイオチップを提供することにある。また、本発明の他の目的は、このようなバイオチップを用いて安定したバイオアッセイが可能なバイオアッセイ装置及びバイオアッセイ方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a biochip in which a biological sample on the surface of a support does not easily come off from the support. Another object of the present invention is to provide a bioassay apparatus and a bioassay method capable of performing a stable bioassay using such a biochip.
本発明は、表面及び内部空間を有する本体と、前記内部空間内に配置され生体試料を支持可能な支持体と、を備え、前記本体は、前記表面の一部に設けられた開口部と、該開口部から前記支持体に向けて連通する流体導入路と、を有し、前記流体導入路は、少なくとも一部において、前記本体の前記表面側から前記支持体側に向かって傾斜したテーパ部を有することを特徴とするバイオチップである。 The present invention comprises a main body having a surface and an internal space, a support arranged in the internal space and capable of supporting a biological sample, and the main body has an opening provided in a part of the surface. It has a fluid introduction path that communicates from the opening toward the support, and the fluid introduction path has, at least in part, a tapered portion inclined from the surface side of the main body toward the support side. It is a biochip characterized by having.
このように、上記の構成は支持体に向かって傾斜したテーパ部を備えるため、流体のかく乱などが生じにくく、流体をスムーズに導入できる。 As described above, since the above configuration includes the tapered portion inclined toward the support, the fluid is less likely to be disturbed and the fluid can be smoothly introduced.
この場合において、前記テーパ部は、前記支持体に対して10~80度の傾斜角度で傾斜することが好ましい。 In this case, it is preferable that the tapered portion is inclined at an inclination angle of 10 to 80 degrees with respect to the support.
このように、テーパ部の傾斜角度が上記の範囲内であると、流体を支持体にスムーズに導入することが可能となる。 As described above, when the inclination angle of the tapered portion is within the above range, the fluid can be smoothly introduced into the support.
また、上記の場合において、前記テーパ部は、前記開口部側に位置し、前記支持体に対して第1の傾斜角度で傾斜する第1のテーパ部と、前記第1のテーパ部よりも前記支持体側に位置し、前記支持体に対して前記第1の傾斜角度よりも小さい第2の傾斜角度で傾斜する第2のテーパ部と、を有することが好適である。 Further, in the above case, the tapered portion is located on the opening side and is inclined at a first inclination angle with respect to the support, and the tapered portion is more than the first tapered portion. It is preferable to have a second tapered portion that is located on the support side and is inclined at a second inclination angle smaller than the first inclination angle with respect to the support.
このように、本構成では、テーパ部が2段階あり、開口部側の第1のテーパ部の傾斜角度が急で、支持体側の第2のテーパ部の傾斜角度がより緩やかとなっている。このため、開口部から垂直に注入された流体は、第1のテーパ部の壁面にあたって流速が抑えられ、次に緩やかな第2のテーパ部を伝って支持体側に移動するため、テーパ部が1つだけの場合と比べて流体を支持体にスムーズに導入することが可能となる。 As described above, in this configuration, the tapered portion has two stages, the inclination angle of the first tapered portion on the opening side is steep, and the inclination angle of the second tapered portion on the support side is gentler. Therefore, the fluid injected vertically from the opening hits the wall surface of the first tapered portion, the flow velocity is suppressed, and then the fluid moves to the support side through the gentle second tapered portion, so that the tapered portion is 1. It is possible to introduce the fluid into the support more smoothly than in the case of only one.
また、上記の場合において、前記開口部は、平面視形状において円形であることが好ましい。 Further, in the above case, the opening is preferably circular in a plan view shape.
このように、開口部が円形なので横断面が円形のピペットチップなどを刺し込んで流体を導入しやすくなる。 In this way, since the opening is circular, it becomes easy to insert a pipette tip or the like having a circular cross section to introduce a fluid.
また、上記の場合において、前記テーパ部は、前記支持体の表面に垂直な方向の断面形状がV字型又はU字型であることが好適である。 Further, in the above case, it is preferable that the tapered portion has a V-shaped or U-shaped cross section in a direction perpendicular to the surface of the support.
このように、テーパ部の断面形状がV字型又はU字型であるため、V字又はU字の傾斜に沿って流体を谷底にスムーズに流すことができる。 As described above, since the cross-sectional shape of the tapered portion is V-shaped or U-shaped, the fluid can be smoothly flowed to the valley bottom along the V-shaped or U-shaped inclination.
また、上記の場合において、前記内部空間内の気体を排気可能な通気口を備えることが好ましい。 Further, in the above case, it is preferable to provide a vent capable of exhausting the gas in the internal space.
このように、通気口を備えることで、流体を導入することによって押し出される内部空間内の気体を排気口から排出することができる。 In this way, by providing the vent, the gas in the internal space extruded by introducing the fluid can be discharged from the exhaust port.
また、上記の場合において、前記支持体は、シート状のメンブレンであり、前記メンブレンは、前記内部空間を第1の内部空間及び第2の内部空間に分割する位置に配置され、前記流体導入路は、前記第1の内部空間に連通することが好適である。 Further, in the above case, the support is a sheet-shaped membrane, and the membrane is arranged at a position that divides the internal space into a first internal space and a second internal space, and the fluid introduction path. Is preferably communicated with the first internal space.
このように構成することで、メンブレンにより第1の内部空間と第2の内部空間に分割されるため、両空間に流体を導入するなどして様々なアッセイを行うことができる。 With this configuration, the membrane divides the space into a first internal space and a second internal space, so that various assays can be performed by introducing a fluid into both spaces.
さらにこの場合において、前記本体は、前記第2の内部空間に連通する第2の流体導入路を備えることが好ましい。 Further, in this case, it is preferable that the main body includes a second fluid introduction path communicating with the second internal space.
このように構成することで、メンブレンの反対側の面に第2の流体を導入して生体試料を透過した物質の濃度測定などを行うことができる。 With this configuration, it is possible to introduce a second fluid onto the opposite surface of the membrane and measure the concentration of the substance that has permeated the biological sample.
上記の場合において、生体機能チップであることが好適である。 In the above case, it is preferable that the chip is a biological function chip.
上記のバイオチップは、生体試料が流体によってかく乱されにくいため、組織チップや臓器チップなどの生体機能チップに特に適している。 The above biochip is particularly suitable for biological functional chips such as tissue chips and organ chips because the biological sample is not easily disturbed by the fluid.
本発明は、上記のいずれかに記載のバイオチップを用いて生体試料を評価するバイオアッセイ装置であって、前記バイオチップの前記流体導入路から細胞を含む培地を導入して前記支持体の少なくとも一方の面上で前記細胞を培養する細胞培養手段と、前記細胞培養手段で培養された前記細胞に対して薬剤を導入して前記細胞と前記薬剤との反応を分析する分析手段と、を備えることを特徴とするバイオアッセイ装置である。 The present invention is a bioassay apparatus for evaluating a biological sample using the biochip according to any one of the above, in which a medium containing cells is introduced from the fluid introduction path of the biochip to at least the support. It is provided with a cell culturing means for culturing the cells on one surface, and an analysis means for introducing a drug into the cells cultivated by the cell culturing means and analyzing the reaction between the cells and the drug. It is a bioassay device characterized by the above.
上記のバイオチップは、生体試料が流体によってかく乱されにくいため、細胞培養のバイオアッセイ装置に好適に用いることができる。 Since the biochip is not easily disturbed by the fluid, the above biochip can be suitably used for a bioassay device for cell culture.
本発明は、上記のいずれかに記載のバイオチップを用いて生体試料を評価するバイオアッセイ方法であって、前記バイオチップの前記流体導入路から細胞を含む培地を導入して前記支持体の少なくとも一方の面上で前記細胞を培養する細胞培養工程と、前記細胞培養工程で培養された前記細胞に対して薬剤を導入して前記細胞と前記薬剤との反応を分析する分析工程と、を備えることを特徴とするバイオアッセイ方法である。 The present invention is a bioassay method for evaluating a biological sample using the biochip according to any one of the above, wherein a medium containing cells is introduced from the fluid introduction path of the biochip to at least the support. It comprises a cell culturing step of culturing the cells on one surface, and an analysis step of introducing a drug into the cells cultivated in the cell culturing step and analyzing the reaction between the cells and the drug. It is a bioassay method characterized by the above.
上記のバイオチップは、生体試料が流体によってかく乱されにくいため、細胞培養やその後のバイオアッセイに好適に用いることができる。 Since the biochip is not easily disturbed by the fluid, the above biochip can be suitably used for cell culture and subsequent bioassay.
本発明によれば、支持体の表面の生体試料が支持体から剥がれにくいバイオチップを提供することが可能となる。また、本発明によれば、このようなバイオチップを用いて安定したバイオアッセイが可能なバイオアッセイ装置及びバイオアッセイ方法を提供することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a biochip in which a biological sample on the surface of the support does not easily come off from the support. Further, according to the present invention, it is possible to provide a bioassay apparatus and a bioassay method capable of performing a stable bioassay using such a biochip.
1.バイオチップ
以下、図面を参照しながら本発明のバイオチップについて説明する。図1は、本発明の第1の実施形態に係るバイオチップ1を示した斜視図である。図2(a)は図1のバイオチップ1の上面図であり、図2(b)は図1のバイオチップ1の下面図である。図3(a)は図2(a)のA1-A2断面図であり、図2(b)は図2(b)のB1-B2断面図である。図4(a)は図2(a)の開口部周辺領域R1を拡大して示した拡大図であり、図4(b)は図4(a)のC1-C2断面図、図4(c)は図4(a)のD1-D2断面図である。
1. 1. Biochip Hereinafter, the biochip of the present invention will be described with reference to the drawings. FIG. 1 is a perspective view showing a
本実施形態は、バイオチップの一例としての生体機能チップ(organ on a chip)のマイクロリアクタを示している。生体機能チップとしては、組織チップ又は臓器チップなどを挙げることができるが、本発明はこれらに限定されない。 This embodiment shows a microreactor of an organ-on-a-chip as an example of a biochip. Examples of the biological function chip include, but are not limited to, a tissue chip or an organ chip.
図1に示すように、本実施形態のバイオチップ1は、上部本体3及び下部本体5と、メンブレン7と、を備えている。上部本体3と下部本体5は、本発明の本体に該当し、メンブレン7は本発明の支持体に該当する。
As shown in FIG. 1, the
本実施形態の上部本体3は、上部基板10と上部カバープレート11とを備えている。図2(a)に示すように、上部基板10は、平面視形状がほぼ長方形状の板状部材で構成されている。また、上部基板10の中央部には、平面視形状が角丸長方形の上部開口10aが形成されている。
The upper
上部基板10の表面には、上部カバープレート11が設けられている。上部カバープレート11は、本発明の表面を構成する部材である。本実施形態の上部カバープレート11は、透明なフィルム状部材で構成されている。図3(a)及び図3(b)に示すように、上部基板10の上部開口10aと上部カバープレート11とメンブレン7の上面7aとで区画された空間が上部内部空間3a(第1の内部空間)となっている。
An
本実施形態の下部本体5は、下部基板20と下部カバープレート21とを備えている。図2(b)に示すように、下部基板20は、平面視形状がほぼ長方形状の板状部材で構成されている。また、下部基板20の中央部には、平面視形状が角丸長方形の下部開口20aが形成されている。下部基板20の形状や寸法は、上部基板10の形状や寸法とほぼ同じである。
The lower
下部基板20の表面には、透明な下部カバープレート21が設けられている。下部カバープレート21の形状や寸法は、上部カバープレート11の形状や寸法とほぼ同じである。図3(a)及び図3(b)に示すように、下部基板20の下部開口20aと下部カバープレート21とメンブレン7の下面7bとで区画された空間が下部内部空間5a(第2の内部空間)となっている。
A transparent
上部基板10と下部基板20は、いずれも任意の材料で構成することができる。これらの基板を構成する材料としては、プラスチック、ガラス、金属、セラミックスなどを挙げることができる。プラスチックとしては、例えば、ポリスチレン(PS)、パーマノックス(PMX)、ポリエチレン(PE)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ポリカーボネート(PC)、フッ素樹脂などを挙げることができる。
Both the
上部カバープレート11と下部カバープレート21は、いずれも任意の材料で構成することができる。これらのカバープレートを構成する材料としては、プラスチック、ガラス、セラミックスなどを挙げることができる。プラスチックとしては、例えば、ポリスチレン(PS)、パーマノックス(PMX)、ポリエチレン(PE)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリカーボネート(PC)、フッ素樹脂などを挙げることができる。
Both the
本実施形態の上部カバープレート11と下部カバープレート21は、いずれも透明な部材で構成されており、メンブレン7などを視認できるようになっている。ただし、上部カバープレート11と下部カバープレート21は、透明なものに限定されず、半透明や不透明であってもよい。上部カバープレート11と下部カバープレート21の厚みは、いずれも通常は10μm~1mmの範囲内であり、50~500μmの範囲内が好ましい。
Both the
本実施形態のメンブレン7は、生体試料を支持可能なシート状の部材である。メンブレン7は、上部本体3と下部本体5の間で、上部本体3、上部カバープレート11、下部本体5及び下部カバープレート21で形成される内部空間を、上部内部空間3aと下部内部空間5aとに分割する位置に配置されている。メンブレン7は、上面7aと下面7bとで構成され、上面7a側に生体試料(不図示)が載置される。
The
メンブレン7は、生体試料を支持できるものであればよく、生体試料の種類やアッセイ目的等に応じて材料を適宜選択して使用することができる。例えば、バイオチップ1が生体機能チップの場合、メンブレン7の材料としては、ポリカーボネート、セルロース、コラーゲンなどを例示することができる。メンブレン7の種類としては多孔質膜、半透膜などを例示することができる。メンブレン7の厚みは、通常0.1~100μmの範囲内であり、1~50μmの範囲内が好ましい。また、メンブレン7が多孔質の場合、その孔径は、通常0.01~100μmの範囲内であり、0.1~50μmの範囲内が好ましい。
The
次に、バイオチップ1を構成する開口や流路について説明する。上部カバープレート11には、その板面を貫通する開口部12が設けられている。図2(a)に示すように、開口部12は、上部内部空間3aで区画される上部基板10の4つの角部のうちの1つの近傍で、かつ上部基板10の上部内部空間3aよりも外側の位置に設けられている。開口部12は、上面視(本実施形態では平面視と同じ)が正円形状となっている。このように、開口部12は、上面視形状が円形であるため、横断面形状が円形の器具、例えば、ピペットチップなどを刺し込んで、培地や薬液などの流体を開口部12内に導入しやすくなっている。
Next, the openings and flow paths constituting the
上部基板10のうち開口部12の下側に位置する領域からは、流体導入路13が形成されている。図3(a)に示すように、流体導入路13は、一端側(入口側)が開口部12に連通し、他端側(出口側)が上部内部空間3aに連通している。流体導入路13は、開口部12から流入した流体を上部内部空間3aに導入するための流路である。
A
本発明の流体導入路13は、少なくとも一部において、開口部12側からメンブレン7側に向かって傾斜したテーパ部(すなわち傾斜する部分)を有する。このため、従来のように途中に垂直の段差を有する流体導入路を備えたバイオチップと比較して、本発明ではメンブレン7上に載置された生体試料などが流体によってかく乱されにくくなり、メンブレン7上で安定した細胞培養やバイオアッセイを行うことができる。
The
ここでいう「少なくとも一部」とは、流体導入路13の一部の領域のみにテーパ部が設けられていてもよく、すべてがテーパ部であってもよいことを意味する。なお、本実施形態では、後述するように第1のテーパ部13aと第2のテーパ部13bの2段階の傾斜となっている。しかし、本発明はこれに限定されず、一つテーパ部(1段階の傾斜)のみ備えていてもよく、3つ以上のテーパ部(3段階以上の傾斜する部分)を備えていてもよい。
The term "at least a part" as used herein means that the tapered portion may be provided only in a part of the region of the
さらに、図3(a)に示すように、本実施形態の流体導入路13は、開口部12側に位置する第1のテーパ部13aと、上部内部空間3a側に位置する第2のテーパ部13bを有している。第1のテーパ部13aは、メンブレン7に対して第1の傾斜角度θ1で傾斜しており、第2のテーパ部13bは、メンブレン7に対して第2の傾斜角度θ2で傾斜している。そして、第2の傾斜角度θ2は、第1の傾斜角度θ1よりも小さく(すなわち、θ1>θ2)なっている。
Further, as shown in FIG. 3A, the
なお、第1の傾斜角度θ1及び第2の傾斜角度θ2は、いずれもメンブレン7に対して10~80度の傾斜角度で傾斜することが好ましい。この範囲の傾斜角度であると、勾配が急すぎず、かつ緩やかすぎないため、流体を安定して上部内部空間3aに導入することができる。
It is preferable that the first inclination angle θ1 and the second inclination angle θ2 are both inclined at an inclination angle of 10 to 80 degrees with respect to the
このように、本実施形態の流体導入路13は、第1のテーパ部13aと第2のテーパ部13bによって2段階に傾斜している。このため、開口部12から流入した流体は、第1のテーパ部13aでまず流速が緩やかになり、その後に第1のテーパ部13aよりも緩やかな傾斜の第2のテーパ部13bで流速がさらに緩やかになって上部内部空間3a内に導入される。このため、テーパ部が1つのみの場合と比較して、本実施形態の流体導入路13は流体の流速を2段階で弱めるため、メンブレン7上に載置された生体試料などが流体によってよりかく乱されにくくなり、より安定した培養やアッセイを行うことができる。
As described above, the
さらに、図4(b)及び図4(c)に示すように、本実施形態では、第1のテーパ部13aは横断面形状がU字型となっており、第2のテーパ部13bは横断面形状がV字型となっている。このように、テーパ部の横断面形状がV字型やU字型であるため、V字又はU字の傾斜に沿って流体を谷底にスムーズに流すことができる。さらに、テーパ部の横断面形状がV字型やU字型であると、傾斜した谷底に沿って流体をスムーズに流すこともできる。また、第1のテーパ部13aの横断面形状がU字型であるため、先端形状が丸いピペットチップなどの先端部を開口部12から流体導入路13に挿入しやすくなっている。
Further, as shown in FIGS. 4 (b) and 4 (c), in the present embodiment, the first
次に、通気口18及び通気路19について説明する。上部カバープレート11の平面視の中心点を基準に、開口部12が設けられた位置とは点対象となる位置には、その板面を貫通する通気口18が設けられている。図2(a)に示すように、通気口18は、上部内部空間3aで区画される上部基板10の4つの角部のうちの開口部12が設けられる角部と対角の近傍で、かつ上部基板10の上部内部空間3aよりも外側の位置に設けられている。通気口18は、上面視が正円形状となっている。
Next, the ventilation holes 18 and the
上部基板10のうち通気口18の下側に位置する領域からは、通気路19が形成されている。図3(a)に示すように、通気路19は、一端側(出口側)が通気口18に連通し、他端側(入口側)が上部内部空間3aに連通している。通気路19は、上部内部空間3aの気体を通気口18から排気するための経路である。また、上部内部空間3a内の流体を通気口18からサンプリングすることも可能となっている。
A
図3(b)に示すように、上部カバープレート11には、その板面を貫通する上部流体入口14と上部流体出口16が設けられている。図2(a)に示すように、上部流体入口14は、上部内部空間3aで区画される上部基板10の4つの辺のうちの開口部12が設けられる側の短辺の近傍で、かつ上部基板10の上部内部空間3aよりも外側の位置に設けられている。上部流体出口16は、上部カバープレート11の平面視の中心点を基準に、上部流体入口14が設けられた位置とは点対象となる位置に設けられている。上部流体入口14と上部流体出口16は、いずれも上面視が正円形状となっている。
As shown in FIG. 3B, the
図3(b)に示すように、上部基板10のうち上部流体入口14と上部流体出口16の下側に位置する領域には、それぞれ上部垂直流入路15と上部垂直流出路17が設けられている。上部垂直流入路15と上部垂直流出路17は、いずれも上部基板10の板面に対して垂直方向に板面を貫通する円形状の穴である。
As shown in FIG. 3B, an upper
上部基板10と下部基板20を重ね合わせたときに、上部流体入口14と上部流体出口16に対応する領域には、それぞれ下部垂直流入路24と下部垂直流出路26が設けられている。下部垂直流入路24の下端側には、下部水平流入路25が設けられている。下部水平流入路25は、下部垂直流入路24に対して垂直方向に延びており、下部内部空間5aに連通している。下部垂直流出路26の下端側には、下部水平流出路27が設けられている。下部水平流出路27は、下部垂直流入路24に対して垂直方向に延びており、下部内部空間5aに連通している。下部水平流入路25と下部水平流出路27は、いずれもメンブレン7に近い位置に設けられており、本実施形態ではメンブレン7からの厚みがメンブレン7から下部カバープレート21までの距離の1/5程度の薄さとなっている。このように、下部水平流入路25と下部水平流出路27がメンブレン7に近い位置に設けられているため、下部内部空間5aの空気を容易に排出できるようになっている。
When the
このような構成を備えることで、上部基板10と下部基板20を重ね合わせたときに、上部流体入口14に導入された流体は、上部垂直流入路15、下部垂直流入路24、下部水平流入路25を通過して下部内部空間5aに導入される。ここで、上部垂直流入路15、下部垂直流入路24、下部水平流入路25は、本発明の第2の流体導入路に該当する。また、下部内部空間5aから流出する流体は、下部水平流出路27、下部垂直流出路26、上部垂直流出路17を通過して上部流体出口16から排出される。このような構成により、下部内部空間5aに流体を導入して排出する流路が形成される。
With such a configuration, when the
本発明のバイオチップは、生体試料を使用した種々の目的に使用することができるが、特に、生体機能チップとしての用途に適している。生体機能チップとして模倣する生体機能としては、肺、心臓、小腸、大腸、肝臓、腎臓、脳、血液脳関門など各種の臓器を挙げることができる。また、本発明で使用される生体試料としては、特に限定されず、種々の生体試料を使用することができる。生体試料としては、細胞や臓器などの生理学的試料のほか、抗体や酵素など生化学的試料などを挙げることができる。 The biochip of the present invention can be used for various purposes using a biological sample, and is particularly suitable for use as a biological functional chip. Examples of the biological function imitated as a biological function chip include various organs such as lung, heart, small intestine, large intestine, liver, kidney, brain, and blood-brain barrier. Further, the biological sample used in the present invention is not particularly limited, and various biological samples can be used. Examples of biological samples include physiological samples such as cells and organs, as well as biochemical samples such as antibodies and enzymes.
特に、バイオチップを生体機能チップとして用いる場合、模倣する生体機能に応じて種々の生体試料を使用する。例えば、小腸を模倣する場合、生体試料としてはヒト結腸癌由来のcaco-2細胞などを挙げることができる。その他、生体試料としてはヒト心筋細胞(hCMs)、ヒト肝がん由来細胞(HepG2)、ヒト乳がん由来細胞(MCF-7)、正常ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)、iPS由来の分化細胞などを例示することができる。 In particular, when a biochip is used as a biological function chip, various biological samples are used depending on the biological function to be imitated. For example, in the case of mimicking the small intestine, examples of the biological sample include caco-2 cells derived from human colon cancer. In addition, as biological samples, human myocardial cells (hCMs), human liver cancer-derived cells (HepG2), human breast cancer-derived cells (MCF-7), normal human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), iPS-derived differentiated cells, etc. are used. It can be exemplified.
2.バイオチップの製造方法
次に、バイオチップの製造方法について説明する。本実施形態のバイオチップ1は、これを構成する部材の形状や材料等に応じて種々の方法で製造することができる。上部基板10の製造方法としては、原料として光硬化性樹脂を使用し、フォトマスクと露光により所望の形状に造形するフォトリソグラフィ法を例示することができる。また、上部基板10の他の製造方法としては、原料として溶融樹脂を使用し、所望の形状の金型に溶融樹脂を注入する射出成型法や押出成型法などを例示することができる。また、三次元プリンタなどを使用して上部基板10を製造してもよい。下部基板20についても同様の方法で製造することができる。
2. 2. Biochip Manufacturing Method Next, a biochip manufacturing method will be described. The
上部カバープレート11や下部カバープレート21の製造方法については、平板状やフィルム状に加工した部材に、パンチングなどで所望の位置に穿孔する方法を例示することができる。また、上部カバープレート11や下部カバープレート21は、フォトリソグラフィ法などの方法で製造することも可能である。
As a method for manufacturing the
上部本体3は、上部基板10と上部カバープレート11とを公知の接着方法で貼合することで製造することができる。下部本体5も同様に、下部基板20と下部カバープレート21とを公知の接着方法で貼合することで製造することができる。次に、上部本体3と下部本体5の間にメンブレン7を挟み込み、上部本体3と下部本体5を公知の接着方法で貼合すれば、バイオチップ1が完成する。
The upper
3.バイオアッセイ装置及びバイオアッセイ方法
次に、バイオアッセイ装置及びバイオアッセイ方法について説明する。本発明のバイオチップは種々のバイオアッセイに用いることができるが、特に、生体機能チップとして好適に使用することができる。以下、本発明のバイオチップを生体機能チップとして用いる場合のバイオアッセイ装置及びバイオアッセイ方法について説明する。具体的には、生体試料として細胞を使用し、メンブレン7上で培養したのち、特定の薬剤を使用して細胞と薬剤との反応を評価するバイオアッセイ装置及びバイオアッセイ方法について説明する。
3. 3. Bioassay device and bioassay method Next, the bioassay device and bioassay method will be described. The biochip of the present invention can be used in various bioassays, and in particular, it can be suitably used as a biofunctional chip. Hereinafter, a bioassay apparatus and a bioassay method when the biochip of the present invention is used as a biofunctional chip will be described. Specifically, a bioassay device and a bioassay method for evaluating a reaction between a cell and a drug using a specific drug after using the cell as a biological sample and culturing on the
まず、メンブレン7の上面7aに細胞を播種する。細胞の播種は、ピペットなどを用いて細胞懸濁液を開口部12から上部内部空間3a内に導入し、メンブレン7の上面7aに付着させる方法などで行うことができる。あるいは、バイオチップ1の組立前に、メンブレン7の上面7aにあらかじめ細胞懸濁液を滴下するなどして播種しておいてもよい。
First, cells are seeded on the
次に、開口部12から培地を注入する。このとき、開口部12の上面視が円形であるため、横断面形状が円形のピペットチップなどを使用すると、チップの先端を開口部12に挿入しやくなるため好ましい。注入された培地は、流体導入路13を通過して上部内部空間3a内に導入されるが、第1のテーパ部13a及び第2のテーパ部13bの2段階のテーパ部で流速が緩められる。このため、メンブレン7の上面7aに播種された細胞が培地によってかく乱されることが少なく、安定的に細胞培養を行うことができる。
Next, the medium is injected through the
特に、小腸上皮細胞といった単層細胞をメンブレン7上で培養する場合は、培地の導入の際にメンブレン7上の細胞が容易にメンブレン7から剥離されるため、培養が困難であった。しかし、本発明では、流体導入路がテーパ部を有するため、培地によって細胞がかく乱されにくく、単層細胞の培養を安定的に行うことができる。
In particular, when monolayer cells such as small intestinal epithelial cells are cultured on the
上部内部空間3a内に培地が導入されると、上部内部空間3a内の空気が通気路19に押し出されて通気口18から排気される。上部内部空間3a内に培地を満たした状態で、所定の温度・湿度・時間で細胞を培養する。上記の工程が本発明の細胞培養工程に該当する。
When the medium is introduced into the upper
本実施形態のバイオチップ1は、細胞培養中又は細胞培養後において、そのままアッセイに用いることができる。例えば、薬液を開口部12から上部内部空間3aに導入する。薬液は、毒性等の評価のための薬剤と培地とを含むものなどを使用することができる。薬液と細胞とが接触すると、その反応物が薬液中に含まれる。薬液の一部を通気口18からサンプリングし、薬液中に含まれる成分を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)などで分析することで、薬剤と細胞との接触による反応物などを詳細に分析することができる。上記の工程が本発明の分析工程に該当する。
The
一方、薬剤の含まれていない培地を上部流体入口14から注入し、上部垂直流入路15、下部垂直流入路24、下部水平流入路25を通じて下部内部空間5aに導入する。下部内部空間5a内を培地が充填すると、メンブレン7を介して培地を細胞とが接触する。上部内部空間3aの薬剤と細胞との反応物のうちメンブレン7を透過できる成分はメンブレン7を透過し、下部内部空間5a内の培地に混じって、下部水平流出路27、下部垂直流出路26、上部垂直流出路17を通じて上部流体出口16から排出される。この排出された薬液中に含まれる成分をHPLCなどで分析することでも、薬剤と細胞との接触による反応物などを分析することができる。なお、本実施形態では細胞の播種をメンブレン7の上面7aのみとしているが、これに限定されず、下面7bに播種することもでき、上面7aと下面7bに播種することもできる。
On the other hand, the medium containing no drug is injected from the
なお、バイオアッセイ装置においては、培地や薬液を収容するリザーバや、培地や薬液の流入・排出などを行うポンプ、流量などを制御するコンピュータなどを備えるようにしてもよい。これらの装置は、本発明の細胞培養手段に該当する。また、細胞と薬剤との反応のアッセイは、HPLCや分光光度計などの分析装置を用いて行う。これらの装置は、本発明の分析手段に該当する。このようにバイオアッセイ装置とすることで、バイオチップを用いたアッセイを全自動又は半自動化することができる。 The bioassay device may be provided with a reservoir for accommodating the medium or the drug solution, a pump for inflowing / discharging the medium or the drug solution, a computer for controlling the flow rate, or the like. These devices correspond to the cell culture means of the present invention. In addition, the assay of the reaction between the cell and the drug is performed using an analyzer such as HPLC or a spectrophotometer. These devices correspond to the analytical means of the present invention. By using the bioassay device in this way, the assay using the biochip can be fully automated or semi-automated.
バイオアッセイで用いる薬剤としては、特に制限はなく、アッセイの目的に応じて種々の薬剤を用いることができる。薬剤としては、例えば、抗がん剤等の薬剤、ホルモン、蛍光物質などを例示することができる。 The drug used in the bioassay is not particularly limited, and various drugs can be used depending on the purpose of the assay. As the drug, for example, a drug such as an anticancer drug, a hormone, a fluorescent substance and the like can be exemplified.
1 バイオチップ、3 上部本体(本体)、3a 上部内部空間、5 下部本体(本体)、5a 下部内部空間、7 メンブレン(支持体)、7a 上面、7b 下面、
10 上部基板、10a 上部開口、11 上部カバープレート(表面)、12 開口部、13 流体導入路、13a 第1のテーパ部、θ1 第1の傾斜角度、13b 第2のテーパ部、θ2 第2の傾斜角度、14 上部流体入口、15 上部垂直流入路(第2の流体導入路)、16 上部流体出口、17 上部垂直流出路、18 通気口、19 通気路、R1 開口部周辺領域、
20 下部基板、20a 下部開口、21 下部カバープレート、24 下部垂直流入路(第2の流体導入路)、25 下部水平流入路(第2の流体導入路)、26 下部垂直流出路、27 下部水平流出路、
200 ポリマーチップ、205 多孔性足場、210 多孔性足場、220 マイクロ流体チャンネル、230 入口、240 マイクロ流体チャンネル、250 上部カバープレート、260 底部カバープレート、V1 段差
1 Biochip, 3 Upper body (main body), 3a Upper internal space, 5 Lower main body (main body), 5a Lower internal space, 7 Membrane (support), 7a upper surface, 7b lower surface,
10 Upper substrate, 10a Upper opening, 11 Upper cover plate (surface), 12 Opening, 13 Fluid introduction path, 13a 1st taper, θ1 1st tilt angle, 13b 2nd taper, θ2 2nd Tilt angle, 14 upper fluid inlet, 15 upper vertical inflow channel (second fluid inlet), 16 upper fluid outlet, 17 upper vertical outflow channel, 18 vents, 19 vents, area around R1 opening,
20 lower substrate, 20a lower opening, 21 lower cover plate, 24 lower vertical inflow passage (second fluid introduction passage), 25 lower horizontal inflow passage (second fluid introduction passage), 26 lower vertical outflow passage, 27 lower horizontal Outflow channel,
200 Polymer Chips, 205 Porous Scaffolds, 210 Porous Scaffolds, 220 Microfluidic Channels, 230 Inlets, 240 Microfluidic Channels, 250 Top Cover Plates, 260 Bottom Cover Plates, V1 Steps
Claims (9)
前記内部空間内に配置され生体試料を支持可能な支持体と、を備え、
前記支持体は、シート状のメンブレンであり、前記メンブレンは、前記内部空間を第1の内部空間及び第2の内部空間に分割する位置に配置され、
前記本体は、
前記表面の一部に設けられた開口部と、該開口部から前記第1の内部空間に連通する第1の流体導入路と、通気口と、前記第1の内部空間と前記通気口とを連通する通気路と、
前記開口部と異なる位置に設けられた流体入口と、該流体入口から前記第2の内部空間に連通する第2の流体導入路と、流体出口と、前記第2の内部空間と前記流体出口とを連通する流出路と、を有し、
前記第1の流体導入路は、少なくとも一部において、前記本体の前記表面側から前記支持体側に向かって傾斜したテーパ部を有し、
前記テーパ部は、前記支持体の前記表面に垂直な方向の断面形状がV字型又はU字型であることを特徴とするバイオチップ。 The main body with surface and internal space,
A support that is placed in the internal space and can support a biological sample is provided.
The support is a sheet-shaped membrane, and the membrane is arranged at a position that divides the internal space into a first internal space and a second internal space.
The main body is
An opening provided in a part of the surface, a first fluid introduction path communicating from the opening to the first internal space, a vent, and the first internal space and the vent. The ventilation channels that communicate with each other,
A fluid inlet provided at a position different from the opening, a second fluid introduction path communicating from the fluid inlet to the second internal space, a fluid outlet, the second internal space, and the fluid outlet. With an outflow channel that communicates with ,
The first fluid introduction path has, at least in part, a tapered portion inclined from the surface side of the main body toward the support side.
The tapered portion is a biochip characterized in that the cross-sectional shape of the support in the direction perpendicular to the surface is V-shaped or U-shaped.
前記第1のテーパ部よりも前記支持体側に位置し、前記支持体に対して前記第1の傾斜角度よりも小さい第2の傾斜角度で傾斜する第2のテーパ部と、を有すること特徴とする請求項1に記載のバイオチップ。 The tapered portion includes a first tapered portion that is located on the opening side and is inclined at a first inclination angle with respect to the support.
It is characterized by having a second tapered portion that is located closer to the support than the first tapered portion and is inclined at a second tilt angle smaller than the first tilt angle with respect to the support. The biochip according to claim 1.
前記バイオチップの前記第1の流体導入路から細胞を含む培地を導入して前記支持体の少なくとも一方の面上で前記細胞を培養する細胞培養手段と、
前記細胞培養手段で培養された前記細胞に対して薬剤を導入して前記細胞と前記薬剤との反応を分析する分析手段と、を備えることを特徴とするバイオアッセイ装置。 A bioassay device for evaluating a biological sample using the biochip according to claim 1.
A cell culture means for introducing a medium containing cells from the first fluid introduction path of the biochip and culturing the cells on at least one surface of the support.
A bioassay apparatus comprising: an analytical means for introducing a drug into the cells cultured by the cell culture means and analyzing the reaction between the cells and the drug.
前記分析手段は、前記第1の内部空間の前記薬剤と前記細胞との反応物のうち前記メンブレンを透過して前記第2の内部空間の前記培地に混じった成分を分析することを特徴とする請求項6に記載のバイオアッセイ装置。 The analytical means is characterized in that, among the reactants of the drug and the cells in the first internal space, the components that have permeated through the membrane and mixed with the medium in the second internal space are analyzed. The bioassay apparatus according to claim 6.
前記バイオチップの前記第1の流体導入路から細胞を含む培地を導入して前記支持体の少なくとも一方の面上で前記細胞を培養する細胞培養工程と、
前記細胞培養工程で培養された前記細胞に対して薬剤を導入して前記細胞と前記薬剤との反応を分析する分析工程と、を備えることを特徴とするバイオアッセイ方法。 A bioassay method for evaluating a biological sample using the biochip according to claim 1.
A cell culture step of introducing a medium containing cells from the first fluid introduction path of the biochip and culturing the cells on at least one surface of the support.
A bioassay method comprising an analysis step of introducing a drug into the cells cultured in the cell culture step and analyzing the reaction between the cells and the drug.
前記分析工程は、前記第1の内部空間の前記薬剤と前記細胞との反応物のうち前記メンブレンを透過して前記第2の内部空間の前記培地に混じった成分を分析することを特徴とする請求項8に記載のバイオアッセイ方法。 The analysis step is characterized in that, among the reactants of the drug and the cells in the first internal space, the components that have permeated through the membrane and mixed with the medium in the second internal space are analyzed. The bioassay method according to claim 8.
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