JP7059712B2 - Plate generation method, plate generation device, and orifice diameter variable program - Google Patents
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Description
本発明は、プレートの生成方法、プレートの生成装置、及びオリフィスの径可変プログラムに関する。 The present invention relates to a plate generation method, a plate generation device, and an orifice diameter variable program.
近年、分析技術の高感度化により、測定対象を分子数単位で測定することが可能となっており、食品、環境検査、及び医療へ、微量核酸を検出する遺伝子検出技術の産業利用が求められている。 In recent years, due to the increased sensitivity of analytical technology, it has become possible to measure the measurement target in units of molecular number, and industrial use of gene detection technology for detecting trace nucleic acids is required for food, environmental inspection, and medical care. ing.
例えば、分子生物学研究分野で多く使用されるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ)は、その技術特性から、理論上１分子の核酸からでも増幅が可能とされている。
これらの微量の遺伝子検出においては、定量解析を行う場合に、標準試料を用いる必要がある。このため、例えば、特定のコピー数のＤＮＡ断片を細胞に導入し、培養した細胞をマイクロマニピュレータやシングルセルソーターで単離することにより、目的のコピー数のＤＮＡ断片を含有する標準試料の製造方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
For example, the polymerase chain reaction (PCR), which is often used in the field of molecular biology research, can theoretically be amplified even from a single molecule of nucleic acid due to its technical characteristics.
In the detection of these trace amounts of genes, it is necessary to use standard samples when performing quantitative analysis. Therefore, for example, by introducing a DNA fragment having a specific copy number into a cell and isolating the cultured cell with a micromanipulator or a single cell sorter, a method for producing a standard sample containing the DNA fragment having a desired copy number can be used. It has been proposed (see, for example, Patent Document 1).
本発明は、細胞数のばらつきが低減されたプレートを生成できるプレートの生成方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for producing a plate capable of producing a plate having a reduced variation in the number of cells.
課題を解決するための手段としての本発明のプレートの生成方法は、細胞懸濁液を、オリフィスを介して液滴として吐出することによりプレートに順次配置させることを含み、オリフィスが、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径をｒ、オリフィスの径をＲとした場合、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たす。 A method for producing a plate of the present invention as a means for solving a problem comprises sequentially arranging a cell suspension on a plate by ejecting the cell suspension as droplets through an orifice, wherein the orifice is the cell suspension. When the volume average particle size of the cells contained in the turbid liquid is r and the diameter of the orifice is R, the following equation, R / r ≧ 5, is satisfied.
本発明によれば、細胞数のばらつきが低減されたプレートを生成できるプレートの生成方法を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a method for producing a plate capable of producing a plate with reduced variation in the number of cells.
（プレートの生成方法及びプレートの生成装置）
本発明のプレートの生成方法は、細胞懸濁液を、オリフィスを介して液滴として吐出することによりプレートに順次配置させることを含み、オリフィスが、細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径をｒ、オリフィスの径をＲとした場合、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たし、更に必要に応じてその他の工程を含む。
なお、換言すると、本発明で生成されるプレートは、細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径をｒ、オリフィスの径をＲとした場合、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすオリフィスを通液させた細胞懸濁液を液滴として吐出し、順次配置させることにより生成されるプレートである。
また、細胞懸濁液を、オリフィスを介して液滴として吐出することによりプレートに順次配置させることを「吐出工程」と称することがある。
(Plate generation method and plate generation device)
The method for producing a plate of the present invention comprises sequentially placing the cell suspension on the plate by ejecting it as droplets through an orifice, in which the orifice is the volume average grain of cells contained in the cell suspension. When the diameter is r and the diameter of the orifice is R, the following equation, R / r ≧ 5, is satisfied, and other steps are included as necessary.
In other words, the plate produced in the present invention satisfies the following equation, R / r ≧ 5, where r is the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension and R is the diameter of the orifice. It is a plate produced by ejecting a cell suspension through which an orifice is passed as droplets and sequentially arranging them.
Further, the process of sequentially arranging the cell suspension on the plate by discharging the cell suspension as a droplet through the orifice may be referred to as a “discharge step”.
本発明のプレートの生成装置は、細胞懸濁液を、オリフィスを介して液滴として吐出することによりプレートに順次配置させる吐出手段を有し、オリフィスが、細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径をｒ、オリフィスの径をＲとした場合、Ｒ／ｒ≧５、を満たし、更に必要に応じてその他の手段を有する。
プレートの生成方法はプレートの生成装置により好適に行うことができ、吐出工程は吐出手段により好適に行うことができ、その他の工程はその他の手段により行うことができる。
したがって、本発明のプレートの生成装置は、本発明のプレートの生成方法を実施する装置として動作する。即ち、本発明のプレートの生成装置は、本発明のプレートの生成方法を実施することと同義であるので、主に本発明のプレートの生成装置の説明を通じて本発明のプレートの生成方法の詳細についても明らかにする。
The plate generator of the present invention has an ejection means for sequentially arranging the cell suspension on the plate by ejecting the cell suspension as droplets through the orifice, and the orifice is the volume of cells contained in the cell suspension. When the average particle size is r and the diameter of the orifice is R, R / r ≧ 5 is satisfied, and if necessary, other means are provided.
The plate generation method can be preferably performed by the plate generation device, the discharge step can be preferably performed by the discharge means, and the other steps can be performed by other means.
Therefore, the plate generating device of the present invention operates as a device for implementing the plate generating device of the present invention. That is, since the plate generating apparatus of the present invention is synonymous with implementing the plate generating apparatus of the present invention, the details of the plate generating apparatus of the present invention will be mainly described through the description of the plate generating apparatus of the present invention. Also reveal.
本発明のプレートの生成装置は、従来の標準試料製造方法でマイクロマニピュレータを用いた場合には、細胞をハンドリングすると紛失しやすいため細胞数のばらつきが大きくなり、生産性も低いという知見に基づくものである。
また、本発明のプレートの生成装置は、従来の標準試料製造方法において、単にシングルセルソーターを用いただけでは、吐出後に細胞が所定の容器に入らない場合があるため、細胞数のばらつきが大きくなるという知見に基づくものである。
本発明のプレートの生成装置は、細胞の体積平均粒径に対してオリフィスの径を十分大きくすることで、吐出時の細胞懸濁液における細胞の密度を均一にし、吐出する液滴に細胞が偏在しにくくする。これにより、本発明のプレートの生成装置は、吐出時に細胞懸濁液の流れがオリフィス内で偏らなくなり、吐出曲がりなどが発生しにくくなるため、吐出した液滴を所定の位置に付着させることができ、細胞数のばらつきが低減されたプレートを生成できる。
The plate generator of the present invention is based on the finding that when a micromanipulator is used in the conventional standard sample manufacturing method, the cells are easily lost when handled, so that the number of cells varies widely and the productivity is low. Is.
Further, in the conventional standard sample manufacturing method, the plate generating apparatus of the present invention may not allow cells to enter a predetermined container after ejection by simply using a single cell sorter, so that the variation in the number of cells becomes large. It is based on the knowledge.
The plate generator of the present invention makes the diameter of the orifice sufficiently large with respect to the volume average particle size of the cells to make the density of the cells in the cell suspension at the time of ejection uniform, and the cells are generated in the droplets to be ejected. Make it difficult to be unevenly distributed. As a result, in the plate generation device of the present invention, the flow of the cell suspension is not biased in the orifice at the time of ejection, and ejection bending is less likely to occur. Therefore, the ejected droplets can be adhered to a predetermined position. It is possible to generate a plate with a reduced variation in the number of cells.
＜吐出手段＞
吐出手段は、細胞懸濁液を、オリフィスを介して液滴として吐出することによりプレートに順次配置させる。
<Discharging means>
The ejection means sequentially arranges the cell suspension on the plate by ejecting it as a droplet through an orifice.
吐出手段としては、細胞懸濁液を液滴として吐出する手段を好適に用いることができる。
細胞懸濁液を液滴として吐出する方式としては、例えば、オンデマンド方式、コンティニュアス方式などが挙げられる。コンティニュアス方式と比較し、オンデマンド方式では必要に応じて吐出ＯＮ／ＯＦＦを制御する必要があるため、単位時間当たりの吐出回数が少なくなることから、プレート生成スピードの点からコンティニュアス方式の方が好ましい。
As the discharging means, a means for discharging the cell suspension as a droplet can be preferably used.
Examples of the method of ejecting the cell suspension as droplets include an on-demand method and a continuous method. Compared to the continuous method, in the on-demand method, it is necessary to control the discharge ON / OFF as needed, so the number of discharges per unit time is reduced, so the continuous method is used in terms of plate generation speed. Is preferable.
コンティニュアス方式では、液滴を加圧してノズルから押し出す際に圧電素子やヒーターによって定期的なゆらぎを与え、それによって微小な液滴を連続的に作り出すことができる。さらに、飛翔中の液滴の吐出方向に電圧を印加することによって制御することにより、プレートに吐出させるか、回収部に回収させるかを選ぶことも可能である。このような方式は、セルソーター又はフローサイトメーターで用いられており、例えば、ソニー株式会社製のセルソーターＳＨ８００を用いることができる。 In the continuous method, when the droplet is pressurized and extruded from the nozzle, a piezoelectric element or a heater gives a periodic fluctuation, whereby minute droplets can be continuously produced. Further, by controlling by applying a voltage in the ejection direction of the flying droplet, it is possible to select whether to eject the droplet to the plate or to collect the droplet by the collecting unit. Such a method is used in a cell sorter or a flow cytometer, and for example, a cell sorter SH800 manufactured by Sony Corporation can be used.
吐出する液滴としては、プレートに細胞懸濁液を吐出する際に、複数の水準を得るようにしてもよい。
複数の水準としては、例えば、プレートに複数の細胞が所定の濃度勾配を有するようにしてもよい。濃度勾配を有することにより、検量線用試薬として好適に使用することができる。
As the droplets to be ejected, a plurality of levels may be obtained when the cell suspension is ejected onto the plate.
As the plurality of levels, for example, a plurality of cells may have a predetermined concentration gradient on the plate. By having a concentration gradient, it can be suitably used as a reagent for a calibration curve.
＜＜細胞懸濁液＞＞
細胞懸濁液は、複数の細胞及び溶媒を含み、更に必要に応じてその他の成分を含む。
ここで、溶媒とは、細胞を分散させるために用いる液体を意味する。
細胞懸濁液における懸濁とは、細胞が溶剤中に分散して存在する状態を意味する。
<< Cell Suspension >>
The cell suspension contains a plurality of cells and a solvent, and further contains other components as needed.
Here, the solvent means a liquid used to disperse cells.
Suspension in a cell suspension means a state in which cells are dispersed and present in a solvent.
－－細胞－－
細胞とは、生物体を形成する構造的及び機能的単位を意味する。
細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞、単細胞生物細胞を問わず、すべての細胞について使用することができる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
--cell--
A cell means a structural and functional unit that forms an organism.
The cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, it can be used for all cells regardless of eukaryotic cells, prokaryotic cells, multicellular biological cells, and single-celled biological cells. .. These may be used alone or in combination of two or more.
真核細胞としては、特に制限はなく、目的応じて適宜選択することができ、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、真菌、藻類、原生動物などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、動物細胞、真菌が好ましい。 The eukaryotic cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include animal cells, insect cells, plant cells, fungi, algae, and protozoa. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, animal cells and fungi are preferable.
接着性細胞としては、組織や器官から直接採取した初代細胞でもよく、組織や器官から直接採取した初代細胞を何代か継代させたものでもよく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、分化した細胞、未分化の細胞などが挙げられる。 The adherent cell may be a primary cell collected directly from a tissue or organ, or may be a passage of a primary cell directly collected from a tissue or organ for several generations, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, differentiated cells, undifferentiated cells and the like can be mentioned.
分化した細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、肝臓の実質細胞である肝細胞；星細胞；クッパー細胞；血管内皮細胞；類道内皮細胞、角膜内皮細胞等の内皮細胞；繊維芽細胞；骨芽細胞；砕骨細胞；歯根膜由来細胞；表皮角化細胞等の表皮細胞；気管上皮細胞；消化管上皮細胞；子宮頸部上皮細胞；角膜上皮細胞等の上皮細胞；乳腺細胞；ペリサイト；平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞；腎細胞；膵ランゲルハンス島細胞；末梢神経細胞、視神経細胞等の神経細胞；軟骨細胞；骨細胞などが挙げられる。 The differentiated cells are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, hepatocytes, which are parenchymal cells of the liver; stellate cells; Kupper cells; vascular endothelial cells; Endophilic cells such as cells; fibroblasts; osteoblasts; osteoblastic cells; root membrane-derived cells; epidermal cells such as epidermal keratinized cells; tracheal epithelial cells; gastrointestinal epithelial cells; cervical epithelial cells; corneal epithelial cells Epithelial cells such as breast cells; pericite; smooth muscle cells, muscle cells such as myocardial cells; renal cells; pancreatic Langerhans islet cells; peripheral nerve cells, nerve cells such as optic nerve cells; cartilage cells; bone cells and the like. ..
未分化の細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、未分化細胞である胚性幹細胞、多分化能を有する間葉系幹細胞等の多能性幹細胞；単分化能を有する血管内皮前駆細胞等の単能性幹細胞；ｉＰＳ細胞などが挙げられる。 The undifferentiated cells are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, pluripotent stem cells such as embryonic stem cells which are undifferentiated cells and pluripotent mesenchymal stem cells; Unipotent stem cells such as vascular endothelial precursor cells having monodifferentiation ability; iPS cells and the like can be mentioned.
真菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、カビ、酵母菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞周期を調節することができ、１倍体を使用することができる点から、酵母菌が好ましい。
細胞周期とは、細胞が増えるとき、細胞分裂が生じ、細胞分裂で生じた細胞（娘細胞）が再び細胞分裂を行う細胞（母細胞）となって新しい娘細胞を生み出す過程を意味する。
The fungus is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include mold and yeast. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, yeast is preferable because it can regulate the cell cycle and can use haploid.
The cell cycle means a process in which cell division occurs when the number of cells increases, and the cells (daughter cells) generated by the cell division become cells (mother cells) that undergo cell division again to produce new daughter cells.
酵母菌としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、細胞周期をＧ１期に制御するフェロモン（性ホルモン）の感受性が増加したＢａｒ－１欠損酵母が好ましい。酵母菌がＢａｒ－１欠損酵母であると、細胞周期が制御できていない酵母菌の存在比率を低くすることができるため、容器内に収容された細胞の特定の核酸の数の増加等を防ぐことができる。 The yeast is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, Bar-1 deficient yeast having increased sensitivity to a pheromone (sex hormone) that controls the cell cycle in the G1 phase is preferable. When the yeast is Bar-1 deficient yeast, the abundance ratio of yeast whose cell cycle cannot be controlled can be reduced, so that an increase in the number of specific nucleic acids in the cells contained in the container can be prevented. be able to.
原核細胞としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、真正細菌、古細菌などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。 The prokaryotic cell is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include eubacteria and archaea. These may be used alone or in combination of two or more.
細胞としては、死細胞が好ましい。死細胞であると、分取後に細胞分裂が起こることを防ぐことができる。
また、細胞としては、光を受光したときに発光可能な細胞であることが好ましい。光を受光したときに発光可能な細胞であると、細胞の数を高精度に制御してプレートに着弾させることができる。
受光とは、光を受けることを意味する。
光学センサとは、人間の目で見ることができる可視光線と、それより波長の長い近赤外線や短波長赤外線、熱赤外線領域までの光のいずれかの光をレンズで集め、対象物である細胞の形状などを画像データとして取得する受動型センサを意味する。
As the cells, dead cells are preferable. Dead cells can prevent cell division from occurring after sorting.
Further, the cell is preferably a cell that can emit light when it receives light. If the cells are capable of emitting light when they receive light, the number of cells can be controlled with high accuracy and landed on the plate.
Receiving means receiving light.
An optical sensor is a cell that collects visible light that can be seen by the human eye and light that has a longer wavelength, such as near-infrared rays, short-wavelength infrared rays, or light up to the thermal infrared region, with a lens. It means a passive sensor that acquires the shape of an image as image data.
－－光を受光したときに発光可能な細胞－－
光を受光したときに発光可能な細胞としては、光を受光したときに発光可能であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、蛍光色素によって染色された細胞、蛍光タンパク質を発現した細胞、蛍光標識抗体により標識された細胞などが挙げられる。
細胞における蛍光色素による染色部位、蛍光タンパク質の発現部位、又は蛍光標識抗体による標識部位としては、特に制限はなく、細胞全体、細胞核、細胞膜などが挙げられる。
--Cells that can emit light when they receive light ---
The cells capable of emitting light when receiving light are not particularly limited as long as they can emit light when receiving light, and can be appropriately selected depending on the intended purpose. However, cells stained with a fluorescent dye, fluorescence Examples include cells expressing a protein, cells labeled with a fluorescently labeled antibody, and the like.
The site stained with a fluorescent dye, the site expressing a fluorescent protein, or the site labeled with a fluorescently labeled antibody in cells is not particularly limited, and examples thereof include whole cells, cell nuclei, and cell membranes.
－－－蛍光色素－－－
蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類、クマリン類、ピレン類、シアニン類などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、フルオレセイン類、アゾ類、ローダミン類が好ましく、エオシン、エバンスブルー、トリパンブルー、ローダミン６Ｇ、ローダミンＢ、ローダミン１２３がより好ましい。
--- Fluorescent dye ---
Examples of the fluorescent dye include fluoresceins, azos, rhodamines, coumarins, pyrenes, cyanines and the like. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, fluoresceins, azos and rhodamines are preferable, and eosin, evance blue, trypan blue, rhodamine 6G, rhodamine B and rhodamine 123 are more preferable.
蛍光色素としては、市販品を用いることができ、市販品としては、例えば、ＥｏｓｉｎＹ（和光純薬工業株式会社製）、エバンスブルー（和光純薬工業株式会社製）、トリパンブルー（和光純薬工業株式会社製）、ローダミン６Ｇ（和光純薬工業株式会社製）、ローダミンＢ（和光純薬工業株式会社製）、ローダミン１２３（和光純薬工業株式会社製）などが挙げられる。 Commercially available products can be used as the fluorescent dye, and examples of the commercially available products include EosinY (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Evans Blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and Tripan Blue (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Examples include Rhodamine 6G (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Rhodamine B (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Rhodamine 123 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and the like.
－－－蛍光タンパク質－－－
蛍光タンパク質としては、例えば、Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒ、ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ－ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ、ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、ＰＳ－ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
--- Fluorescent protein ---
Examples of the fluorescent protein include Sirius, EBFP, ECFP, mTurquoise, TagCFP, AmCyan, mTFP1, MidoriishiCyan, CFP, TurboGFP, AcGFP, TagGFP, Azami-Green, ZsGreen, EGFr , YFP, PhiYFP, PhiYFP-m, TurboYFP, ZsYellow, mBanana, KusabiraOrange, mOrange, TurboRFP, DsRed-Express, DsRed2, TagRFP, DsRed-Monomer, AsRed2, mStrawberry, TurboFP602, mRFP1, JRed, KillerRed, mCherry, mPlum, PS -CFP, Dendra2, Kaede, EosFP, KikumeGR and the like can be mentioned. These may be used alone or in combination of two or more.
－－－蛍光標識抗体－－－
蛍光標識抗体としては、蛍光標識されていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＰＥなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。
--- Fluorescently labeled antibody ---
The fluorescently labeled antibody is not particularly limited as long as it is fluorescently labeled and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include CD4-FITC and CD8-PE. These may be used alone or in combination of two or more.
［光を受光したときに発光可能な細胞懸濁液の作製方法］
５０ｇ／ＬのＹＰＤ培地（例えば、ＹＰＤＭｅｄｉｕｍ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）等で培養した遺伝子組換え酵母を９０ｍＬ分取した三角フラスコに、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（例えば、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製、以下、「ＤＰＢＳ」とも称することがある）を用いて５００μｇ／ｍＬとなるように調製したαファクター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、α１－ＭａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒａｃｅｔａｔｅｓａｌｔ）を９００μＬ添加し、バイオシェイカー（例えば、ＢＲ－２３ＦＨ、タイテック株式会社製）を用いて、振盪速度：２５０ｒｐｍ、温度：２８℃にて２時間インキュベートし、酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して酵母懸濁液を得る。
同調確認済み酵母懸濁液を遠心管（例えば、ビオラモ、ＶＩＯ－５０Ｒ、アズワン株式会社製）に４５ｍＬ移し、遠心分離機（例えば、ＣＦ１６ＲＮ、株式会社日立製作所製）を用いて、回転速度：３，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得る。酵母ペレットにホルマリン（例えば、和光純薬工業株式会社製、０６２－０１６６１）を４ｍＬ添加し、５分間静置後、遠心して上澄み液を除去し、エタノールを１０ｍＬ添加して懸濁させることにより固定化済みの酵母懸濁液を得る。
固定化済み酵母懸濁液を１．５ｍＬ遮光チューブ（例えば、ワトソン株式会社製、１３１－９１５ＢＲ）に５００μＬ移し、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去し、１ｍＭＥＤＴＡ（例えば、ＴＯＣＲＩＳ社製、２００－４４９－４）となるように調製したＤＰＢＳ（１ｍＭＥＤＴＡ）を４００μＬ添加し、ピペッティングでよく懸濁した後、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去することにより酵母ペレットを得る。ペレットに１ｍｇ／ｍＬに調製したエバンスブルー水溶液（例えば、和光純薬工業株式会社製、０５４－０４０６１）を１ｍＬ添加し、ボルテックスを用いて５分間撹拌後、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去し、ＤＰＢＳ（１ｍＭＥＤＴＡ）を添加し、ボルテックスで撹拌することにより染色済み酵母懸濁液を得ることができる。
[Method of preparing a cell suspension that can emit light when it receives light]
In an Erlenmeyer flask in which 90 mL of recombinant yeast cultured in a 50 g / L YPD medium (for example, YPDMedia, manufactured by Clontech) or the like was taken, a dalbecolinic acid buffered saline solution (for example, manufactured by Thermoffiser), hereinafter referred to as “DPBS”. ”) To add 900 μL of α-factor (made by Sigma-Aldrich, α1-Matting Factoratesalt) prepared to 500 μg / mL, and add 900 μL of bio-shaker (for example, BR-23FH, manufactured by Titec Co., Ltd.). ) Is incubated at a shaking rate of 250 rpm and a temperature of 28 ° C. for 2 hours to synchronize yeast with the G0 / G1 phase to obtain a yeast suspension.
Transfer 45 mL of the tuned yeast suspension to a centrifuge tube (eg, Violamo, VIO-50R, manufactured by AS ONE Co., Ltd.) and use a centrifuge (eg, CF16RN, manufactured by Hitachi, Ltd.) to rotate the speed: 3. Centrifuge at 000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant to give yeast pellets. Add 4 mL of formalin (for example, 062-01661 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) to the yeast pellet, let stand for 5 minutes, centrifuge to remove the supernatant, add 10 mL of ethanol and suspend. Obtain a modified yeast suspension.
Transfer 500 μL of the immobilized yeast suspension to a 1.5 mL light-shielding tube (for example, 131-915BR manufactured by Watson Co., Ltd.), centrifuge at a rotation speed of 3,000 rpm for 5 minutes using a centrifuge, and centrifuge the supernatant. Add 400 μL of DPBS (1 mM EDTA) prepared to obtain 1 mM EDTA (for example, 200-449-4 manufactured by TOCRIS), suspend well by pipetting, and then rotate at a rotational speed using a centrifuge. : Centrifuge at 3,000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant to give yeast pellets. Add 1 mL of Evans Blue aqueous solution (for example, 054-04061 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) prepared to 1 mg / mL to the pellet, stir for 5 minutes using a vortex, and then use a centrifuge to rotate the speed: 3. A stained yeast suspension can be obtained by centrifuging at 000 rpm for 5 minutes, removing the supernatant, adding DPBS (1 mM EDTA) and stirring with vortex.
細胞の体積平均粒径としては、遊離状態において、１００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以下がより好ましく、２０μｍ以下が特に好ましい。体積平均粒径が、１００μｍ以下であれば、インクジェット法に好適に用いることができる。 The volume average particle size of the cells is preferably 100 μm or less, more preferably 50 μm or less, and particularly preferably 20 μm or less in the free state. When the volume average particle size is 100 μm or less, it can be suitably used for the inkjet method.
細胞の体積平均粒径としては、例えば、下記の測定方法で測定することができる。
作製した染色済み酵母分散液から１０μＬ取り出してＰＭＭＡ製プラスチックスライドに乗せ、自動セルカウンター（ＣｏｕｎｔｅｓｓＡｕｔｏｍａｔｅｄＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いることにより体積平均粒径を測定することができる。なお、細胞数も同様の測定方法により求めることができる。また、桿菌のような細長い形状の計測方法については、Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｔｙの設定値を標準値の８０から１００に大きくすることで測定することができる。
The volume average particle size of the cells can be measured by, for example, the following measuring method.
The volume average particle size can be measured by taking out 10 μL of the prepared stained yeast dispersion, placing it on a PMMA plastic slide, and using an automatic cell counter (CountessAutomatedCellCounter, manufactured by Invitrogen). The number of cells can also be determined by the same measuring method. Further, the method for measuring an elongated shape such as a bacillus can be measured by increasing the setting value of Circularity from the standard value of 80 to 100.
細胞懸濁液における細胞の濃度としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下が好ましく、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０７個／ｍＬ以下がより好ましい。細胞数が、５×１０４個／ｍＬ以上５×１０８個／ｍＬ以下であると、吐出した液滴中に細胞を確実に含むことができる。細胞数としては、体積平均粒径の測定方法と同様にして、自動セルカウンター（ＣｏｕｎｔｅｓｓＡｕｔｏｍａｔｅｄＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて測定することができる。 The concentration of cells in the cell suspension is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 5 × 10 4 cells / mL or more and 5 × 10 8 cells / mL or less, and 5 × 10 More preferably, 4 pieces / mL or more and 5 × 10 7 pieces / mL or less. When the number of cells is 5 × 10 4 cells / mL or more and 5 × 10 8 cells / mL or less, the cells can be surely contained in the ejected droplets. The number of cells can be measured using an automatic cell counter (CountessAutomatedCellCounter, manufactured by Invitrogen) in the same manner as in the method for measuring the volume average particle size.
細胞の細胞数は、複数であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。 The number of cells is not particularly limited as long as it is a plurality of cells, and can be appropriately selected depending on the intended purpose.
－－－特定の核酸－－－
特定の核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、感染症検査に用いられる塩基配列、自然界には存在しない核酸、動物細胞由来の塩基配列、植物細胞由来の塩基配列などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。また、特定の核酸としては、プラスミドも好適に使用することができる。
特定とは、特に定められていることを意味する。
核酸とは、プリン又はピリミジンから導かれる含窒素塩基、糖、及びリン酸が規則的に結合した高分子の有機化合物を意味する。
--- Specific nucleic acid ---
The specific nucleic acid is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, a base sequence used for an infectious disease test, a nucleic acid that does not exist in nature, a base sequence derived from an animal cell, or a plant cell derived The base sequence of is mentioned. These may be used alone or in combination of two or more. Moreover, as a specific nucleic acid, a plasmid can also be preferably used.
Specific means that it is specifically defined.
Nucleic acid means a high molecular weight organic compound in which a nitrogen-containing base, a sugar, and a phosphoric acid derived from purine or pyrimidine are regularly bound.
特定の核酸としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられる。これらの中でも、ノロウイルスなどの感染症固定領域に由来するＲＮＡに対応するＤＮＡ、自然界に存在しないＤＮＡなどが好適に用いることができる。 The specific nucleic acid is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, and examples thereof include DNA and RNA. Among these, DNA corresponding to RNA derived from an infectious disease fixed region such as norovirus, DNA that does not exist in nature, and the like can be preferably used.
特定の核酸を有する複数の細胞は、使用する細胞由来の特定の核酸であってもよく、遺伝子導入により導入された特定の核酸であってもよい。特定の核酸として、遺伝子導入により導入された特定の核酸、及びプラスミドを使用する場合は、１細胞に１コピーの特定の核酸が導入されていることを確認することが好ましい。１コピーの特定の核酸が導入されていることの確認方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、シーケンサー、ＰＣＲ法、サザンブロット法などを用いて確認することができる。 The plurality of cells having a specific nucleic acid may be a specific nucleic acid derived from the cell to be used, or may be a specific nucleic acid introduced by gene transfer. When a specific nucleic acid introduced by gene transfer and a plasmid are used as the specific nucleic acid, it is preferable to confirm that one copy of the specific nucleic acid is introduced into one cell. The method for confirming that one copy of a specific nucleic acid has been introduced is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, confirmation is performed using a sequencer, PCR method, Southern blotting or the like. be able to.
遺伝子導入の方法としては、特定の核酸配列が狙いの場所に狙いの分子数導入できれば特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、相同組換え、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、Ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｆｌｉｐ－ｉｎ、Ｊｕｍｐ－ｉｎなどが挙げられる。特に、酵母菌の場合は、効率の高さ、及び制御のしやすさの点から、相同組換えが好ましい。 The method for gene transfer is not particularly limited as long as the target number of molecules can be introduced into the target location for a specific nucleic acid sequence, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, homologous recombination, CRISPR / Cas9, TALEN, etc. Examples thereof include Zincfinuclease, Flip-in, Jump-in and the like. In particular, in the case of yeast, homologous recombination is preferable from the viewpoint of high efficiency and ease of control.
［遺伝子組換え酵母の作製方法］
出芽酵母を１コピーの特定ＤＮＡ配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用することができる。具体的には、特定ＤＮＡ配列をノロウイルスの特異的な配列とし、選択マーカーとタンデムに並ぶように作出し、キャリア細胞の例えば、ＢＡＲ１領域を対象に相同組換えによって１コピーの特定ＤＮＡ配列を酵母染色体に導入し、組換え酵母を作製することができる。
出芽酵母としては、例えば、ｗ３０３－１ａ（ＡＴＣＣ４００１４０８、ＡＴＣＣ社製）などが挙げられる。
ノロウイルスの特異的な配列としては、例えば、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、例えば、配列番号１参照）から入手することができる。
選択マーカーとしては、例えば、ウラシル合成酵素（例えば、ＵＲＡ３等）、ヒスチジン合成酵素（例えば、ＨＩＳ３等）、トリプトファン合成酵素（例えば、ＴＲＰ１等）、リジン合成酵素（例えば、ＬＹＳ２等）、メチオニン合成酵素（例えば、ＭＥＴ１７等）、アデニン合成酵素（例えば、ＡＤＥ２等）などが挙げられる。
[Method for producing recombinant yeast]
Saccharomyces cerevisiae can be used in the production of recombinants as a carrier cell of one copy of a specific DNA sequence. Specifically, a specific DNA sequence is set as a specific sequence of norovirus, and it is created so as to line up with a selectable marker in tandem. It can be introduced into a chromosome to produce recombinant yeast.
Examples of the budding yeast include w303-1a (ATCC4001408, manufactured by ATCC) and the like.
As a specific sequence of norovirus, for example, it can be obtained from NCBI (National Center for Biotechnology Information, for example, see SEQ ID NO: 1).
Selective markers include, for example, uracil synthase (eg, URA3, etc.), histidine synthase (eg, HIS3, etc.), tryptophan synthase (eg, TRP1, etc.), lysine synthase (eg, LYS2, etc.), methionine synthase. (For example, MET17 etc.), adenine synthase (for example, ADE2 etc.) and the like can be mentioned.
－－溶媒－－
溶媒としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、水、培養液、分離液、希釈液、緩衝液、有機物溶解液、有機溶媒、高分子ゲル溶液、コロイド分散液、電解質水溶液、無機塩水溶液、金属水溶液、及びこれらの混合液体などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、水、緩衝液が好ましく、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ緩衝液（ＴＥ）がより好ましい。
--solvent--
The solvent is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, water, culture solution, separation solution, diluted solution, buffer solution, organic substance solution, organic solvent, polymer gel solution, colloidal dispersion. Examples thereof include a liquid, an aqueous electrolyte solution, an aqueous inorganic salt solution, an aqueous metal solution, and a mixed liquid thereof. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, water and a buffer solution are preferable, and water, phosphate buffered saline (PBS) and Tris-EDTA buffer solution (TE) are more preferable.
－－添加剤－－
添加剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、界面活性剤、核酸、樹脂などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
--Additive--
The additive is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include a surfactant, a nucleic acid and a resin. These may be used alone or in combination of two or more.
－－－界面活性剤－－－
界面活性剤は、細胞同士の凝集を防止し、連続吐出安定性を向上することができる。
--- Surfactant ---
The surfactant can prevent cell-to-cell aggregation and improve continuous ejection stability.
界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性及び失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。 The surfactant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include an ionic surfactant and a nonionic surfactant. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, nonionic surfactants are preferable from the viewpoint of not denaturing and inactivating proteins, although it depends on the amount added.
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。 Examples of the ionic surfactant include fatty acid sodium, fatty acid potassium, alpha sulfo fatty acid ester sodium, linear alkylbenzene sulfonate sodium, alkyl sulfate ester sodium, alkyl ether sulfate ester sodium, alpha olefin sulfonate sodium and the like. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, sodium fatty acid is preferable, and sodium dodecyl sulfate (SDS) is more preferable.
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（ＴｒｉｔｏｎＸシリーズ、ＩｇｅｐａｌＣＡシリーズ、ＮｏｎｉｄｅｔＰシリーズ、ＮｉｋｋｏｌＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズなど）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
Examples of the nonionic surfactant include alkyl glycosides, alkylpolyoxyethylene ethers (Brij series, etc.), octylphenol ethoxylates (TritonX series, IgepalCA series, NonidetP series, NikkolOP series, etc.), polysorbates (
界面活性剤の含有量としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、細胞懸濁液全量に対して、０．００１質量％以上３０質量％以下が好ましい。含有量が、０．００１質量％以上であると、界面活性剤の添加による効果を得ることができ、３０質量％以下であると、細胞の凝集を抑制することができるため、細胞懸濁液中の核酸の分子数を厳密に制御することができる。 The content of the surfactant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but is preferably 0.001% by mass or more and 30% by mass or less with respect to the total amount of the cell suspension. When the content is 0.001% by mass or more, the effect of adding the surfactant can be obtained, and when it is 30% by mass or less, cell aggregation can be suppressed, so that the cell suspension can be obtained. The number of molecules of nucleic acid in it can be strictly controlled.
－－－核酸－－－
核酸としては、検出対象の核酸の検出に影響しないものであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ＣｏｌＥ１ＤＮＡなどが挙げられる。核酸であると、特定の塩基配列を有する核酸が、プレートの壁面などに付着することを防ぐことができる。
--- Nucleic acid ---
The nucleic acid is not particularly limited as long as it does not affect the detection of the nucleic acid to be detected, and can be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include ColE1 DNA. When it is a nucleic acid, it is possible to prevent a nucleic acid having a specific base sequence from adhering to the wall surface of a plate or the like.
－－－樹脂－－－
樹脂としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ポリエチレンイミドなどが挙げられる。
---resin---
The resin is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include polyethyleneimide.
－－その他の材料－－
その他の材料としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、架橋剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、湿潤剤、分散剤などが挙げられる。
－－Other materials －－
The other materials are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, a cross-linking agent, a pH adjuster, a preservative, an antioxidant, an osmotic pressure adjuster, a wetting agent, a dispersant and the like can be selected. Can be mentioned.
［細胞を分散する方法］
細胞を分散する方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ビーズミル等のメディア方式、超音波ホモジナイザー等の超音波方式、フレンチプレス等の圧力差を利用する方式などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから超音波方式がより好ましい。メディア方式では、解砕能力が強く、細胞膜や細胞壁を破壊する可能性やメディアがコンタミとして混入することがある。
[How to disperse cells]
The method for dispersing cells is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, a media method such as a bead mill, an ultrasonic method such as an ultrasonic homogenizer, or a pressure difference such as a French press is used. The method etc. can be mentioned. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, the ultrasonic method is more preferable because it causes less damage to cells. In the media method, the crushing ability is strong, the cell membrane and the cell wall may be destroyed, and the media may be mixed as contamination.
［細胞のスクリーニング方法］
細胞のスクリーニング方法としては、特に制限がなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、湿式分級、セルソーター、フィルターによるスクリーニングなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、細胞へのダメージが少ないことから、セルソーター、フィルターによるスクリーニングが好ましい。
[Cell screening method]
The cell screening method is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include wet classification, cell sorter, and filter screening. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, screening with a cell sorter or a filter is preferable because the damage to cells is small.
細胞は、細胞の細胞周期を測定することにより、細胞懸濁液に含まれる細胞数から特定の配列を有する核酸の数を推定することが好ましい。
細胞周期を測定するとは、細胞分裂による細胞数を数値化することを意味する。
核酸の数を推定するとは、細胞数から、核酸のコピー数をおしはかることを意味する。
For cells, it is preferable to estimate the number of nucleic acids having a specific sequence from the number of cells contained in the cell suspension by measuring the cell cycle of the cells.
Measuring the cell cycle means quantifying the number of cells due to cell division.
Estimating the number of nucleic acids means measuring the number of copies of nucleic acid from the number of cells.
核酸の数の推定は、確からしさ（確率）を算出するようにしてもよい。確からしさ（確率）を算出することにより、これらの数値に基づき確からしさを分散または標準偏差として表現して出力することが可能である。複数因子の影響を合算する場合には、一般的に用いられる標準偏差の二乗和平方根を用いることが可能である。例えば、因子として吐出した細胞数の正答率、細胞内のＤＮＡ数、吐出された細胞がプレートに付着する付着率などを用いることができる。この中で影響の大きい項目を選択して算出することもできる。
核酸の数を推定するタイミングとしては、例えば、細胞懸濁液の生成時、吐出時の液滴の状態、細胞数の計数時のいずれのタイミングでもよく、各タイミングで推定して合算してもよい。
For the estimation of the number of nucleic acids, the certainty (probability) may be calculated. By calculating the certainty (probability), it is possible to express and output the certainty as a variance or standard deviation based on these numerical values. When summing up the effects of multiple factors, it is possible to use the square root of the sum of squares of the standard deviations that are commonly used. For example, the correct answer rate of the number of discharged cells, the number of intracellular DNA, the adhesion rate at which the discharged cells adhere to the plate, and the like can be used as factors. It is also possible to select and calculate the item that has a large influence.
The timing for estimating the number of nucleic acids may be, for example, any of the timings of cell suspension generation, droplet state at the time of ejection, and cell number counting, and may be estimated and added up at each timing. good.
計数対象が細胞数ではなく特定のＤＮＡ配列が何個入っているかであってもよい。通常は、特定のＤＮＡ配列は細胞１個につき１つの領域が入っているものを選択する、あるいは遺伝子組み換えにより導入するため、特定のＤＮＡ配列の数は細胞数と等しいと考えてよい。ただし、細胞は特定の周期で細胞分裂を起こすために細胞内で核酸の複製が行われる。細胞周期は細胞の種類によって異なるが、細胞懸濁液から所定量の溶液を抜き取り複数細胞の周期を測定することによって、細胞１個中に含まれる特定の核酸数に対する期待値及びその確からしさを算出することが可能である。これは、例えば、核染色した細胞をフローサイトメーターによって観測することによって可能である。 The counting target may not be the number of cells but the number of specific DNA sequences contained. Normally, a specific DNA sequence is selected that contains one region per cell, or is introduced by genetic recombination, so that the number of specific DNA sequences can be considered to be equal to the number of cells. However, nucleic acid replication occurs within the cell in order to cause cell division in a specific cycle. The cell cycle differs depending on the cell type, but by extracting a predetermined amount of solution from the cell suspension and measuring the cycle of multiple cells, the expected value and its certainty for a specific number of nucleic acids contained in one cell can be obtained. It is possible to calculate. This is possible, for example, by observing nuclear-stained cells with a flow cytometer.
＜＜オリフィス＞＞
オリフィスは、吐出手段に設けられており、吐出前の細胞懸濁液が通液する。
オリフィスは、細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径をｒ、オリフィスの径をＲとした場合、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たす。オリフィスが次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たさないと、細胞の体積平均粒径に対してオリフィスの径が小さくなることから、吐出時の細胞懸濁液における細胞の密度が均一にならず、吐出する液滴に細胞が偏在しやすくなる。このため、吐出時に細胞懸濁液の流れがオリフィス内で偏ることにより吐出曲がりなどが発生してしまい、吐出した液滴をプレートの所定の位置に付着できずに、細胞数のばらつきが大きくなる場合がある。
<< Orifice >>
The orifice is provided in the discharge means, and the cell suspension before discharge passes through the liquid.
The orifice satisfies the following equation, R / r ≧ 5, where r is the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension and R is the diameter of the orifice. If the orifice does not satisfy the following equation, R / r ≧ 5, the diameter of the orifice becomes smaller than the volume average particle size of the cells, so that the density of cells in the cell suspension at the time of ejection is not uniform. , Cells tend to be unevenly distributed in the ejected droplets. For this reason, the flow of the cell suspension is biased in the orifice during ejection, which causes ejection bending and the like, and the ejected droplets cannot adhere to a predetermined position on the plate, resulting in a large variation in the number of cells. In some cases.
オリフィスとしては、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たしていれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、次式、Ｒ／ｒ≧７が好ましく、次式、Ｒ／ｒ≧１０がより好ましい。オリフィスが次式、Ｒ／ｒ≧７を満たすと、吐出した液滴をより確実にプレートの所定の位置に付着させることができ、次式、Ｒ／ｒ≧１０を満たすと、吐出した液滴をさらに確実にプレートの所定の位置に付着させることができる。 The orifice is not particularly limited as long as it satisfies the following equation, R / r ≧ 5, and can be appropriately selected depending on the intended purpose. However, the following equation, R / r ≧ 7, is preferable, and the following equation, R. / R ≧ 10 is more preferable. When the orifice satisfies the following equation, R / r ≧ 7, the ejected droplet can be more reliably adhered to a predetermined position on the plate, and when the following equation, R / r ≧ 10, the ejected droplet is satisfied. Can be more reliably adhered to a predetermined position on the plate.
また、Ｒ／ｒの上限値としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、次式、Ｒ／ｒ≦５０、を満たすことが好ましく、次式、Ｒ／ｒ≦３０、を満たすことがより好ましく、次式、Ｒ／ｒ≦２５、を満たすことがさらに好ましい。次式、Ｒ／ｒ≦５０、を満たすと、１つの液滴に複数の細胞が入りにくくなり、プレート上の細胞数のばらつきが小さくなる。 The upper limit of R / r is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. However, it is preferable to satisfy the following equation, R / r ≦ 50, and the following equation, R / r ≦. It is more preferable to satisfy 30, and it is further preferable to satisfy the following equation, R / r ≦ 25. When the following equation, R / r ≦ 50, is satisfied, it becomes difficult for a plurality of cells to enter one droplet, and the variation in the number of cells on the plate becomes small.
＜＜プレート＞＞
プレートの形状及び構造としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、平板状のもの、１穴マイクロチューブ、８連チューブ、９６穴や３８４穴等のウェルプレートなどが挙げられる。ウェルプレートの場合には、同じ個数の細胞を収容するウェルが存在してもよく、異なる個数の細胞を収容するウェルが存在してもよく、また、細胞が収容されていないウェルが存在してもよい。具体的には、核酸の量を定量的に評価するリアルタイムＰＣＲ装置やデジタルＰＣＲ装置の評価に用いるプレートを作成する際には、細胞（又は核酸）が、１個、２個、４個、８個、１６個、３２個、６４個の７水準としたプレートを生成してもよい。このプレートにより、リアルタイムＰＣＲ装置やデジタルＰＣＲ装置の定量性、線形性、評価下限値などを調べることが可能になる。
プレートの材質としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、ウェルプレートの場合には、後の処理のために細胞や核酸の壁面への付着が抑制されているものを用いることが好ましい。
プレートの大きさとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
<< Plate >>
The shape and structure of the plate are not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. For example, a flat plate-shaped one, a 1-hole microtube, an 8-series tube, a well plate having 96 holes or 384 holes, or the like. Can be mentioned. In the case of a well plate, there may be wells containing the same number of cells, wells containing different numbers of cells, and wells containing no cells. May be good. Specifically, when creating a plate used for evaluation of a real-time PCR device or a digital PCR device for quantitatively evaluating the amount of nucleic acid, one, two, four, or eight cells (or nucleic acids) are used. Plates with 7 levels of 16, 16, 32, and 64 may be produced. This plate makes it possible to investigate the quantitativeness, linearity, lower limit of evaluation, etc. of real-time PCR devices and digital PCR devices.
The material of the plate is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the purpose, but in the case of a well plate, the adhesion of cells and nucleic acids to the wall surface is suppressed for the subsequent treatment. It is preferable to use.
The size of the plate is not particularly limited and can be appropriately selected according to the purpose.
プレートとしては、個々に認識することが可能な認識手段が設けられたものを利用することが好ましい。認識手段としては、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、ＲａｄｉｏＦｒｅｑｕｅｎｃｙＩｄｅｎｔｉｆｉｅｒ（以下、「ＲＦＩＤ」とも称することがある）などを用いることが可能である。プレートを大量生産する場合には、無線でも使用可能なＲＦＩＤが好ましい。 As the plate, it is preferable to use a plate provided with a recognition means capable of individually recognizing. As the recognition means, it is possible to use a barcode, a QR code (registered trademark), a RadioFreequencyIdentifier (hereinafter, also referred to as “RFID”) or the like. For mass production of plates, RFID that can be used wirelessly is preferable.
本発明のプレートの生成方法及び本発明のプレートの生成装置により生成されるプレートは、バイオ関連産業、ライフサイエンス産業、及び医療産業等において幅広く用いることができる。生成されるプレートは、例えば、装置や感染症の検量線作成などの標準プレート等に好適に用いることができる。 The plate produced by the plate producing method of the present invention and the plate producing apparatus of the present invention can be widely used in the bio-related industry, the life science industry, the medical industry and the like. The generated plate can be suitably used, for example, as a standard plate for making a calibration curve for an infectious disease or an apparatus.
標準プレートとしては、感染症に対して実施する場合は公定法や通知法などに定められている方法に適用することができる。
公定法としては、ノロウイルスに関する公定法（食安監発第０５１４００４号）などが挙げられる。図１Ａは、ノロウイルスのオープンリーディングフレーム１部分のプライマーとプローブの位置を表す図である。図１Ｂは、ノロウイルスのオープンリーディングフレーム２部分のプライマーとプローブの位置を表す図である。
As a standard plate, when it is carried out for infectious diseases, it can be applied to the methods stipulated in the official law and the notification law.
Examples of the official method include the official method regarding norovirus (Food Safety Supervision No. 0514004). FIG. 1A is a diagram showing the positions of primers and probes in the
ノロウイルスに関する公定法としては、例えば、図１Ａ及び図１Ｂに示された領域の核酸配列を、遺伝子導入技術を利用して細胞内に導入する。このノロウイルスに特異的な核酸配列を有した細胞をウェルに既知数（１０～１０７）分注する。ここで、低コピー数領域（１０～１０３）では、希釈法では精度が低く検量線の値がばらつき検出コピー数の正確性が低下する懸念があるため、精度の高いインクジェットやセルソーターなどを用いて分注することにより精度を高められる点で好ましい。次に、空のウェルに食安監発第０５１４００４号に示されている方法で抽出された検体を分注し、プライマー、酵素、ＴａｑＭａｎプローブ、水を添加し、リアルタイムＰＣＲで反応を行うことによりノロウイルスの有無を確認することができる。ＲＴ－ＰＣＲの場合は、ＴａｑＭａｎプローブ以外の材料を添加し、サーマルサイクラーで反応させ、得られたサンプルを電気泳動することでノロウイルスの有無を確認できる。 As an official method for norovirus, for example, the nucleic acid sequences of the regions shown in FIGS. 1A and 1B are introduced into cells using a gene transfer technique. A known number (10 to 107 ) of cells having a nucleic acid sequence specific to this norovirus is dispensed into the wells. Here, in the low copy number region (10 to 103 ), the accuracy of the dilution method is low and the calibration curve value varies, and there is a concern that the accuracy of the detected copy number may decrease. Therefore, a highly accurate inkjet or cell sorter is used. It is preferable in that the accuracy can be improved by dispensing. Next, the sample extracted by the method shown in Food Safety Inspection No. 0514004 is dispensed into an empty well, a primer, an enzyme, a TaqMan probe, and water are added, and a reaction is carried out by real-time PCR. It is possible to confirm the presence or absence of. In the case of RT-PCR, the presence or absence of norovirus can be confirmed by adding a material other than the TaqMan probe, reacting with a thermal cycler, and electrophoresing the obtained sample.
＜その他の手段＞
その他の手段としては、例えば、細胞数計数手段、核酸抽出手段、画像認識手段、出力手段、記録手段、酵素失活手段などが挙げられる。これらの中でも、細胞数計数手段、核酸抽出手段、及び画像認識手段の少なくともいずれかを有することが好ましい。
<Other means>
Examples of other means include cell number counting means, nucleic acid extraction means, image recognition means, output means, recording means, enzyme inactivation means, and the like. Among these, it is preferable to have at least one of a cell number counting means, a nucleic acid extracting means, and an image recognition means.
＜＜細胞数計数手段＞＞
細胞数計数手段は、液滴の吐出後、かつ液滴のプレートへの配置前に、液滴に含まれる細胞数を計数する。これにより、液滴のプレートの各位置に配置された細胞数を把握することができるため、細胞数のばらつきの程度を確認することができる。
液滴に含まれる細胞数を計数する方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、センサを用いて細胞数を計数する方法が好ましい。具体的には、センサを用いて細胞数を計数する方法としては、光を受光したときに発光可能な細胞とし、細胞計数手段が、光が照射されたときに発せられる細胞からの発光に基づいて細胞数を計数することが好ましい。
<< Cell Counting Means >>
The cell number counting means counts the number of cells contained in the droplet after the droplet is ejected and before the droplet is placed on the plate. As a result, the number of cells arranged at each position of the droplet plate can be grasped, so that the degree of variation in the number of cells can be confirmed.
The method for counting the number of cells contained in the droplet is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, but a method for counting the number of cells using a sensor is preferable. Specifically, as a method of counting the number of cells using a sensor, cells that can emit light when light is received are used, and the cell counting means is based on the light emitted from the cells emitted when the light is irradiated. It is preferable to count the number of cells.
＜＜核酸抽出手段＞＞
核酸抽出手段は、プレート上の細胞から核酸を抽出する。
ここで、抽出とは、細胞膜や細胞壁などを破壊し、核酸をぬき出すことを意味する。すなわち、ばらつきが低減されたプレート上の細胞から核酸抽出手段が核酸を抽出することにより、核酸の数のばらつきが低減されたプレートを生成できる。
<< Nucleic acid extraction means >>
The nucleic acid extraction means extracts nucleic acid from the cells on the plate.
Here, extraction means destroying cell membranes, cell walls, and the like to extract nucleic acids. That is, the nucleic acid extraction means extracts nucleic acid from the cells on the plate with reduced variation, so that a plate with reduced variation in the number of nucleic acids can be produced.
細胞から核酸を抽出する方法としては、９０℃～１００℃で熱処置する方法が知られている。９０℃以下で熱処理するとＤＮＡが抽出されない可能性があり、１００℃以上で熱処理するとＤＮＡが分解される可能性がある。このとき界面活性剤を添加し熱処理することが好ましい。 As a method for extracting nucleic acid from cells, a method of heat treatment at 90 ° C to 100 ° C is known. If the heat treatment is performed at 90 ° C. or lower, the DNA may not be extracted, and if the heat treatment is performed at 100 ° C. or higher, the DNA may be decomposed. At this time, it is preferable to add a surfactant and heat-treat.
界面活性剤としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、添加量にもよるが、タンパク質を変性・失活させない点から、非イオン性界面活性剤が好ましい。 The surfactant is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose. Examples thereof include an ionic surfactant and a nonionic surfactant. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, a nonionic surfactant is preferable because it does not denature or inactivate the protein, although it depends on the amount added.
イオン性界面活性剤としては、例えば、脂肪酸ナトリウム、脂肪酸カリウム、アルファスルホ脂肪酸エステルナトリウム、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、アルキル硫酸エステルナトリウム、アルキルエーテル硫酸エステルナトリウム、アルファオレフィンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、脂肪酸ナトリウムが好ましく、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）がより好ましい。 Examples of the ionic surfactant include fatty acid sodium, fatty acid potassium, alpha sulfo fatty acid ester sodium, linear alkylbenzene sulfonate sodium, alkyl sulfate ester sodium, alkyl ether sulfate ester sodium, alpha olefin sulfonate sodium and the like. These may be used alone or in combination of two or more. Among these, sodium fatty acid is preferable, and sodium dodecyl sulfate (SDS) is more preferable.
非イオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルグリコシド、アルキルポリオキシエチレンエーテル（Ｂｒｉｊシリーズ等）、オクチルフェノールエトキシレート（ＴｏｔｉｔｏｎＸシリーズ、ＩｇｅｐａｌＣＡシリーズ、ＮｏｎｉｄｅｔＰシリーズ、ＮｉｋｋｏｌＯＰシリーズ等）、ポリソルベート類（Ｔｗｅｅｎ２０等のＴｗｅｅｎシリーズなど）、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、アルキルマルトシド、ショ糖脂肪酸エステル、グリコシド脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、脂肪酸モノグリセリドなどが挙げられる。これらは、１種単独で使用してもよいし、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、ポリソルベート類が好ましい。
Examples of non-ionic surfactants include alkyl glycosides, alkyl polyoxyethylene ethers (Brij series, etc.), octylphenol ethoxylates (Totiton X series, IgepalCA series, NonidetP series, Nikkol OP series, etc.), polysorbates (
界面活性剤の含有量としては、ウェル中の細胞懸濁液全量に対して、０．０１質量％以上５．００質量％以下が好ましい。含有量が、０．０１質量％以上であると、ＤＮＡ抽出に対して効果を発揮でき、５．００質量％以下であると、ＰＣＲの際に増幅の阻害を防止することができるため、両方の効果を得られる数値範囲として上記０．０１質量％以上５．００質量％以下が好適である。
細胞壁を保有している細胞に関しては、上記の方法で十分にＤＮＡ抽出されないことがある。その場合、例えば、浸透圧ショック法、凍結融解法、酵素消化法、ＤＮＡ抽出用キットの使用、超音波処理法、フレンチプレス法、ホモジナイザーなどの方式などが挙げられる。これらの中でも、抽出ＤＮＡのロスが少ないことから、酵素消化法が好ましい。
The content of the surfactant is preferably 0.01% by mass or more and 5.00% by mass or less with respect to the total amount of the cell suspension in the well. When the content is 0.01% by mass or more, it can exert an effect on DNA extraction, and when it is 5.00% by mass or less, it is possible to prevent inhibition of amplification during PCR. The above-mentioned 0.01% by mass or more and 5.00% by mass or less is preferable as the numerical range in which the effect of the above can be obtained.
For cells that have a cell wall, DNA may not be sufficiently extracted by the above method. In that case, for example, an osmotic shock method, a freeze-thaw method, an enzyme digestion method, the use of a DNA extraction kit, an ultrasonic treatment method, a French press method, a homogenizer, or the like can be mentioned. Among these, the enzyme digestion method is preferable because the loss of the extracted DNA is small.
＜＜画像認識手段＞＞
画像認識手段は、液滴を吐出した後、吐出した液滴がプレート上の所定の位置に存在することを画像認識により判定する。これにより、吐出曲がりなどで所定の位置に液滴が付着していないことを判定できるため、生成するプレートの品質を向上させることができる。
<< Image recognition means >>
After ejecting the droplet, the image recognition means determines by image recognition that the ejected droplet exists at a predetermined position on the plate. As a result, it can be determined that the droplets are not attached to a predetermined position due to the ejection bending or the like, so that the quality of the generated plate can be improved.
出力手段は、プレートに付着した細胞懸濁液に含まれる細胞数を、センサにより測定された検出結果に基づいて細胞数計数手段が計数した細胞数を記憶部に出力する。なお、出力手段は、計数した細胞数に限らず、推測した細胞数を記憶部に出力してもよい。また、出力は、細胞数計数工程と同時に行ってもよく、細胞数計数工程の後に行ってもよい。 The output means outputs the number of cells contained in the cell suspension attached to the plate to the storage unit, and the number of cells counted by the cell number counting means based on the detection result measured by the sensor. The output means is not limited to the counted number of cells, and the estimated number of cells may be output to the storage unit. Further, the output may be performed at the same time as the cell number counting step, or may be performed after the cell number counting step.
酵素失活手段は、酵素を失活させる。
酵素としては、例えば、ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅ、核酸抽出工程において核酸を抽出するために使用した酵素などが挙げられる。
酵素を失活させる方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、公知の方法を好適に用いることができる。
Enzyme inactivation means inactivate the enzyme.
Examples of the enzyme include DNase, RNase, and the enzyme used for extracting nucleic acid in the nucleic acid extraction step.
The method for inactivating the enzyme is not particularly limited and may be appropriately selected depending on the intended purpose, and a known method can be preferably used.
このように、本発明のプレートの生成方法では、細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径をｒ、オリフィスの径をＲとした場合、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすオリフィスを通過させた細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートに順次配置させる。これにより、オリフィスの径に対して細胞の体積平均粒径が十分小さくなることから、吐出時の細胞懸濁液における細胞の密度が均一になり、吐出する液滴に細胞が偏在しにくくなる。よって、本発明のプレートの生成方法では、吐出時に細胞懸濁液の流れがオリフィス内で偏らなくなることから吐出曲がりなどが発生しにくくなるため、吐出した液滴を所定の位置に付着させることができ、細胞数のばらつきが低減されたプレートを生成できる。 As described above, in the plate generation method of the present invention, when the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension is r and the orifice diameter is R, the following equation, R / r ≧ 5, is satisfied. The cell suspension that has passed through the plate is sequentially arranged on the plate by ejecting it as droplets. As a result, the volume average particle size of the cells is sufficiently smaller than the diameter of the orifice, so that the density of the cells in the cell suspension at the time of ejection becomes uniform, and the cells are less likely to be unevenly distributed in the droplets to be ejected. Therefore, in the plate generation method of the present invention, since the flow of the cell suspension is not biased in the orifice at the time of ejection, ejection bending and the like are less likely to occur, so that the ejected droplets can be adhered to a predetermined position. It is possible to generate a plate with a reduced variation in the number of cells.
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、この実施例に何ら限定されるものではない。
本実施例では、セルソーターを用いたプレートの生成装置の一例を示す。
なお、以下では、プレートの生成装置を単に「生成装置」と称することがある。
また、下記構成部材の数、位置、形状等は本実施の形態に限定されず、本発明を実施する上で好ましい数、位置、形状等にすることができる。
Hereinafter, examples of the present invention will be described, but the present invention is not limited to these examples.
In this embodiment, an example of a plate generation device using a cell sorter is shown.
In the following, the plate generator may be simply referred to as a "generator".
Further, the number, position, shape, etc. of the following constituent members are not limited to the present embodiment, and can be a preferable number, position, shape, etc. for carrying out the present invention.
図２は、セルソーターを用いたプレートの生成装置の一例を示す概略説明図である。
図２に示すように、生成装置１００は、マイクロチップ１と、振動素子２と、光学検出手段３と、対電極４と、プレート５と、グランド接地対電極６と、ステージ７とを有する。
なお、マイクロチップ１と、振動素子２、光学検出手段３、対電極４、及びグランド接地対電極６の組合せを「吐出ヘッド」と称することがある。
FIG. 2 is a schematic explanatory view showing an example of a plate generation device using a cell sorter.
As shown in FIG. 2, the
The combination of the
マイクロチップ１には、分取対象とする細胞を含む液体（サンプル液）が通流される流路１１及びオリフィス１２が形成されている。
マイクロチップ１への流路１１及びオリフィス１２の成形は、ガラス製基板のウェットエッチングやドライエッチングによって、またプラスチック製基板のナノインプリントや射出成型、機械加工によって行うことができる。
マイクロチップ１は、ガラスや各種プラスチックにより形成できる。各種プラスチックとしては、例えば、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などが挙げられる。
マイクロチップ１の材質は、光学検出手段３から照射される測定光に対して透過性を有し、自家蛍光が少なく、波長分散が小さいために光学誤差が少ない材質とすることが好ましい。なお、マイクロチップ１は、流路１１及びオリフィス１２を成形した基板を、同じ材質又は異なる材質の基板で封止して形成してもよい。
The
The
The
The material of the
振動素子２は、マイクロチップ１の一部に当接するように配設されている。振動素子２は、マイクロチップ１を振動させ、サンプル液を液滴化してチップ外の空間に吐出することができる。
The vibrating
光学検出手段３は、流路１１の所定部位に光（測定光）を照射し、流路１１を通流する細胞から発生する光（測定対象光）を検出する。以下、流路１１において光学検出手段３からの測定光が照射される部位を「光照射部」と称することがある。
光学検出手段３は、従来のフローサイトメトリーと同様に構成することができる。具体的には、光学検出手段３は、レーザー光源により発せられたレーザー光を細胞に対し集光・照射するための集光レンズやダイクロイックミラーなどを備える照射系と、レーザー光の照射によって細胞から発生する測定対象光を検出する検出系とを有する。検出系としては、例えば、ＣＣＤやＣＭＯＳ素子等のエリア撮像素子、ＰＭＴ（ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ ｔｕｂｅ、光電子増倍管）などが挙げられる。
なお、図２では、照射系と検出系を別体としているが、これに限ることなく、照射系と検出系は同一の光学経路であってもよい。
The optical detection means 3 irradiates a predetermined portion of the
The optical detection means 3 can be configured in the same manner as the conventional flow cytometry. Specifically, the optical detection means 3 includes an irradiation system including a condenser lens or a dichroic mirror for condensing and irradiating the cells with the laser light emitted by the laser light source, and the cells from the cells by irradiating the laser light. It has a detection system that detects the generated light to be measured. Examples of the detection system include an area image sensor such as a CCD or CMOS element, a PMT (photomultiplier tube), a photomultiplier tube, and the like.
Although the irradiation system and the detection system are separate bodies in FIG. 2, the irradiation system and the detection system may have the same optical path without limitation.
測定対象光は、測定光の照射によって細胞から発生する光であれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、前方散乱光や側方散乱光、レイリー散乱やミー散乱等の散乱光や蛍光などが挙げられる。細胞の光学特性は、測定対象光から変換された電気信号に基づいて検出される。 The light to be measured is not particularly limited as long as it is light generated from cells by irradiation with the measurement light, and can be appropriately selected according to the purpose. For example, forward scattered light, side scattered light, Rayleigh scattering or Mie scattering. Such as scattered light and fluorescence. The optical properties of cells are detected based on the electrical signal converted from the light to be measured.
図３は、ＤＮＡ複製済みの細胞の頻度と、蛍光強度との関係の一例を示すグラフである。
図３に示すように、ヒストグラム上でＤＮＡの複製有無により２つのピークが現れるため、ＤＮＡ複製済みの細胞がどの程度の割合で存在するかを算出することが可能である。この算出結果から１細胞中に含まれる平均的なＤＮＡ数を算出することが可能であり、前述の細胞数計数結果に乗じることにより、核酸の推定数を算出することが可能である。
また、細胞懸濁液を作成する前に細胞周期を制御する処理を行うことが好ましく、前述のような複製が起きる前、又は後の状態に揃えることによって、特定の核酸の数を細胞数からより精度良く算出することが可能になる。
FIG. 3 is a graph showing an example of the relationship between the frequency of DNA-replicated cells and the fluorescence intensity.
As shown in FIG. 3, since two peaks appear on the histogram depending on the presence or absence of DNA replication, it is possible to calculate the proportion of DNA-replicated cells. It is possible to calculate the average number of DNAs contained in one cell from this calculation result, and it is possible to calculate the estimated number of nucleic acids by multiplying the above-mentioned cell number counting result.
In addition, it is preferable to perform a treatment for controlling the cell cycle before preparing the cell suspension, and by adjusting the state before or after replication as described above, the number of specific nucleic acids can be determined from the number of cells. It becomes possible to calculate more accurately.
図２に戻り、光照射部を通過したサンプル液は、振動素子２の振動により、流路１１の一端に設けられたオリフィス１２を介してマイクロチップ１外の空間に液滴Ｄとして吐出される。
Returning to FIG. 2, the sample liquid that has passed through the light irradiation unit is discharged as a droplet D into the space outside the
ここで、オリフィス１２について詳細な説明する。
図４は、図２に示したオリフィス近傍の拡大断面図である。
本実施例では、オリフィスの径Ｒが１００μｍであり、細胞１３の体積平均粒径ｒが４．５μｍであるため、Ｒ／ｒは２２．２となり、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たす。
Here, the
FIG. 4 is an enlarged cross-sectional view of the vicinity of the orifice shown in FIG.
In this embodiment, since the diameter R of the orifice is 100 μm and the volume average particle size r of the
図２に戻り、液滴Ｄには、細胞が含まれ得る。対電極４は、チップ外の空間に吐出された液滴Ｄの移動方向に沿って配設されており、移動する液滴Ｄを挟んで対向するように配置されている。吐出された液滴Ｄには荷電手段によって電荷が付与され、対電極４は液滴Ｄに付与された電荷との電気的な反発力（又は吸引力）によって液滴Ｄの移動方向を制御し、液滴Ｄをプレート５のウェル５１のいずれかに誘導することもできる。
プレート５は、移動可能なステージ７上に固定されている。
ステージ７は、図２中矢印で示すｘ方向及びｙ方向の少なくともいずれかに移動することができる。
Returning to FIG. 2, the droplet D may contain cells. The counter electrode 4 is arranged along the moving direction of the droplet D ejected into the space outside the chip, and is arranged so as to face each other with the moving droplet D interposed therebetween. The ejected droplet D is charged by a charging means, and the counter electrode 4 controls the moving direction of the droplet D by an electric repulsive force (or attractive force) with the electric charge applied to the droplet D. , The droplet D can also be guided to any of the
The
The
図５は、プレートに吐出した液滴を配置する状態の一例を示す説明図である。
図５に示すように、生成装置１００は、マイクロチップ１外の空間に吐出した液滴Ｄをプレート５上の所定の位置であるウェル５１順次配置する。本実施例では、ステージ７を移動させているが、これに限ることなく、吐出ヘッドを移動させてもよいし、液滴Ｄを対電極４により所定の位置に誘導させてもよい。
生成装置１００は、例えば、ＣＰＵ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、メインメモリ等を有する。この場合、生成装置１００の各種機能は、ＲＯＭ等に記録されたプログラムがメインメモリに読み出されてＣＰＵにより実行されることによって実現できる。ただし、生成装置１００の一部又は全部は、ハードウェアのみにより実現されてもよい。又、生成装置１００は、物理的に複数の装置等により構成されてもよい。
FIG. 5 is an explanatory diagram showing an example of a state in which the droplets discharged on the plate are arranged.
As shown in FIG. 5, the
The
［サンプル液（酵母懸濁液）の調製］
（遺伝子組換え酵母）
出芽酵母ｗ３０３－１ａ（ＡＴＣＣ４００１４０８、ＡＴＣＣ社製）を１コピーの特定ＤＮＡ配列のキャリア細胞として組換え体の作製に使用した。特定ＤＮＡ配列は配列番号１とし、選択マーカーとしたＵＲＡ３とタンデムに並ぶように作出し、キャリア細胞のＢＡＲ１領域を対象に相同組換えによって１コピーの特定ＤＮＡ配列を酵母染色体に導入し、遺伝子組換え酵母を作製した。
[Preparation of sample solution (yeast suspension)]
(Genetically modified yeast)
Saccharomyces cerevisiae w303-1a (ATCC4001408, manufactured by ATCC) was used to prepare a recombinant as a carrier cell of one copy of a specific DNA sequence. The specific DNA sequence is designated as SEQ ID NO: 1, and it is created so as to line up with URA3 as a selectable marker in tandem. One copy of the specific DNA sequence is introduced into the yeast chromosome by homologous recombination targeting the BAR1 region of the carrier cell, and the gene set A recombinant yeast was prepared.
（培養、及び細胞周期制御）
５０ｇ／ＬのＹＰＤ培地（ＹＰＤＭｅｄｉｕｍ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）で培養した遺伝子組換え酵母を９０ｍＬ分取した三角フラスコに、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製、以下、「ＤＰＢＳ」とも称することがある）を用いて５００μｇ／ｍＬとなるように調製したαファクター（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製、α１－ＭａｔｉｎｇＦａｃｔｏｒａｃｅｔａｔｅｓａｌｔ）を９００μＬ添加し、バイオシェイカー（ＢＲ－２３ＦＨ、タイテック株式会社製）を用いて、振盪速度：２５０ｒｐｍ、温度：２８℃にて２時間インキュベートし、酵母をＧ０／Ｇ１期に同調して酵母懸濁液を得た。同調細胞の細胞周期の確認は、ＳＹＴＯＸＧｒｅｅｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＳｔａｉｎ（Ｓ７０２０、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社製）を用いて染色し、フローサイトメーター（ＳＨ８００、ソニー株式会社製）を用いたフローサイトメトリーにて、励起波長４８８ｎｍで、Ｇ０／Ｇ１期に同調していることを確認した。Ｇ１期の割合は９７．１％、Ｇ２期の割合は２．９％であった。結果を図６に示す。
(Culture and cell cycle control)
90 mL of recombinant yeast cultured in 50 g / L YPD medium (YPDMedia, manufactured by Clontech) was placed in an Erlenmeyer flask, which may be referred to as "Thermoffiser", hereinafter also referred to as "DPBS". Add 900 μL of α factor (sigma-Aldrich, α1-Mating Factoracetatesalt) prepared to 500 μg / mL using a bioshaker (BR-23FH, manufactured by Titec Co., Ltd.), and shake speed. The yeast was incubated at 250 rpm and a temperature of 28 ° C. for 2 hours to obtain a yeast suspension by synchronizing the yeast with the G0 / G1 phase. To confirm the cell cycle of synchronized cells, stain with SYSTEMXGreenNucleicAcidStain (S7020, manufactured by Thermo Fisher), and perform flow cytometry using a flow cytometer (SH800, manufactured by Sony Corporation) at an excitation wavelength of 488 nm and G0 /. It was confirmed that it was in sync with the G1 phase. The G1 phase ratio was 97.1%, and the G2 phase ratio was 2.9%. The results are shown in FIG.
（固定化）
同調確認済み酵母懸濁液を遠心管（ビオラモ、ＶＩＯ－５０Ｒ、アズワン株式会社製）に４５ｍＬ移し、遠心分離機（ＣＦ１６ＲＮ、株式会社日立製作所製）を用いて、回転速度：３，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去して酵母ペレットを得た。得られた酵母ペレットにホルマリン（和光純薬工業株式会社製、０６２－０１６６１）を４ｍＬ添加し、５分間静置後、遠心して上澄み液を除去し、エタノールを１０ｍＬ添加して懸濁させることにより固定化済みの酵母懸濁液を得た。
(Fixed)
Transfer 45 mL of the tuned yeast suspension to a centrifuge tube (Violamo, VIO-50R, manufactured by AS ONE Co., Ltd.) and use a centrifuge (CF16RN, manufactured by Hitachi, Ltd.) at a rotation speed of 3,000 rpm. Centrifuge for 5 minutes and remove the supernatant to give yeast pellets. To the obtained yeast pellets, add 4 mL of formalin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 062-01661), let stand for 5 minutes, centrifuge to remove the supernatant, and add 10 mL of ethanol to suspend. An immobilized yeast suspension was obtained.
（染色）
固定化済み酵母懸濁液を１．５ｍＬ遮光チューブ（ワトソン株式会社製、１３１－９１５ＢＲ）に５００μＬ移し、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍにて５分間遠心し、上澄み液を除去し、１ｍＭＥＤＴＡ（ＴＯＣＲＩＳ社製、２００－４４９－４）となるように調製したＤＰＢＳ（１ｍＭＥＤＴＡ）を４００μＬ添加し、ピペッティングでよく懸濁した後、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去することにより酵母ペレットを得た。得られたペレットに１ｍｇ／ｍＬに調製したエバンスブルー水溶液（和光純薬工業株式会社製、０５４－０４０６１）を１ｍＬ添加し、ボルテックスを用いて５分間撹拌後、遠心分離機を用いて回転速度：３，０００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄み液を除去し、ＤＰＢＳ（１ｍＭＥＤＴＡ）を添加し、ボルテックスで撹拌することにより染色済み酵母懸濁液を得た。
(staining)
Transfer 500 μL of the immobilized yeast suspension to a 1.5 mL light-shielding tube (131-915BR manufactured by Watson Co., Ltd.) and centrifuge at a rotation speed of 3,000 rpm for 5 minutes using a centrifuge to remove the supernatant. Then, 400 μL of DPBS (1 mM EDTA) prepared to be 1 mM EDTA (manufactured by TOCRIS, 200-449-4) was added, suspended well by pipetting, and then rotated at a rotation speed of 3,000 rpm using a centrifuge. Centrifuge for 5 minutes and remove the supernatant to obtain yeast pellets. To the obtained pellets, add 1 mL of an Evans blue aqueous solution (054-04061 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) prepared at 1 mg / mL, stir for 5 minutes using a vortex, and then use a centrifuge to rotate the speed: Centrifuge at 3,000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant, add DPBS (1 mM EDTA) and stir with vortex to give a stained yeast suspension.
（分散）
染色済みの酵母懸濁液を超音波ホモジナイザー（ＬＵＨ１５０、ヤマト科学株式会社）を用いて、出力を３０％として１０秒間分散処理し、遠心分離機を用いて回転速度を３，０００ｒｐｍとして５分間遠心し、上澄み液を除去し、ＤＰＢＳを１，０００μＬ添加して洗浄した。遠心分離、上澄み液の除去を計２回実施し、最後にＤＰＢＳで懸濁させて酵母懸濁インクを得た。なお、酵母の体積平均粒経をＣｏｕｎｔｅｓｓＡｕｔｏｍａｔｅｄＣｅｌｌＣｏｕｎｔｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いて計測したところ、４．５μｍだった。
(Dispersion)
The stained yeast suspension was dispersed for 10 seconds at an output of 30% using an ultrasonic homogenizer (LUH150, Yamato Kagaku Co., Ltd.), and centrifuged at a rotation speed of 3,000 rpm for 5 minutes using a centrifuge. Then, the supernatant was removed, and 1,000 μL of DPBS was added for washing. Centrifugation and removal of the supernatant were carried out twice in total, and finally the ink was suspended in DPBS to obtain a yeast suspension ink. The volume average grain size of yeast was measured using a CountessAutomatedCellCounter (manufactured by Invitrogen) and found to be 4.5 μm.
（分注及び細胞計測）
プレートとして９６穴平底プレート（ワトソン株式会社製、４８４６－９６－ＦＳ）を用い、セルソーター（ソニー株式会社製、ＳＨ８００Ｚ、ソーティングチップとしてＬＥ－Ｃ３１１０（オリフィスサイズ１００μｍ）を使用）により励起波長４８８ｎｍで細胞が存在する領域を選択して、シングルセルモードにより規定の粒子数を分注した。蛍光顕微鏡（カールツァイス株式会社製、ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒＤ１）にて４８８ｎｍの励起光により蛍光顕微鏡観察を行った。各液滴内に存在する酵母数と狙いの酵母数（１粒子；特定コピー数＝１）の正誤を判定して一致率を求めた。結果を表１に示した。なお、表１の「Ｎｏ．」は、プレート及びウェルの通し番号を示す。結果から、９９．２％の確率で一致していることが分かった。
(Dispensing and cell measurement)
A 96-hole flat bottom plate (Watson Co., Ltd., 4846-96-FS) is used as a plate, and cells are used with a cell sorter (Sony Co., Ltd., SH800Z, LE-C3110 (
（比較例）
実施例１において、以下のようにサンプル液の調製を変えた以外は、実施例１と同様に評価した。
(Comparative example)
In Example 1, the evaluation was carried out in the same manner as in Example 1 except that the preparation of the sample solution was changed as follows.
（培養）
インキュベーター（ＫＭ－ＣＣ１７ＲＵ２、パナソニック株式会社製、３７℃、５体積％ＣＯ２環境）内において、１０質量％ウシ胎児血清（以下、「ＦＢＳ」とも称することがある）及び１質量％抗生物質（Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ Ｍｉｘｅｄ Ｓｔｏｃｋ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（１００ｘ）、ナカライテスク株式会社製）を含むダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、以下、「Ｄ－ＭＥＭ」とも称することがある）を用い、１００ｍｍディッシュ４枚にてＮＨＤＦ（ＣＣ２５０７、Ｌｏｎｚａ社製）を７２時間培養した。
(culture)
In an incubator (KM-CC17RU2, manufactured by Panasonic Corporation, 37 ° C., 5% by volume CO2 environment), 10% by mass of fetal bovine serum (hereinafter, also referred to as "FBS") and 1% by mass of antibiotics (Antibiotic-). NHDF with 4 100 mm dishes using modified Dulbecco Eagle's medium (manufactured by Life Technologies, hereinafter also referred to as "D-MEM") containing Antibiotic Mixed Stock Solution (100x), manufactured by Nakarai Tesk Co., Ltd. (CC2507, manufactured by Lonza) was cultured for 72 hours.
（染色）
冷凍保存された緑色蛍光染料（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を室温（２５℃）まで解凍し、１０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｍＭ）の濃度でジメチルスルホキシド（以下、「ＤＭＳＯ」とも称することがある）へ溶解させ、無血清ダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）と混合し、濃度１０μｍｏｌ／Ｌ（μＭ）の緑色蛍光染料含有無血清培地を調製した。次に、培養したＮＨＤＦのディッシュ４枚に緑色蛍光染料含有無血清培地をディッシュ１枚あたり５ｍＬ添加し、インキュベーター内で３０分間染色した。
その後、アスピレータを用いて、上澄みを除去した。ディッシュにリン酸緩衝生理食塩水（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、以下、「ＰＢＳ（－）」とも称することがある）をディッシュ１枚あたり５ｍＬ加え、アスピレータでＰＢＳ（－）を吸引除去し、表面を洗浄した。ＰＢＳ（－）による洗浄作業を２回繰り返した後、０．０５質量％トリプシン－０．０５質量％ＥＤＴＡ溶液（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）をディッシュ１枚あたり２ｍＬ加え、インキュベーター内にて５分間加温し、ディッシュから細胞を剥離した。位相差顕微鏡（ＣＫＸ４１、オリンパス株式会社製）により細胞の剥離を確認後、１０質量％ＦＢＳ、１質量％抗生物質を含むＤ－ＭＥＭをディッシュ１枚あたり４ｍＬ加え、トリプシンを失活させた。ディッシュ４枚分の細胞懸濁液を５０ｍｌ遠沈管１本に移し、遠心分離（Ｈ－１９ＦＭ、ＫＯＫＵＳＡＮ社製、１．２×１０３ｒｐｍ、５分間、５℃）を行い、アスピレータを用いて上清を除去した。除去後、遠沈管に１０質量％ＦＢＳ及び１質量％抗生物質を含むＤ－ＭＥＭを１ｍＬ添加し、穏やかにピペッティングを行い、細胞を分散させ細胞懸濁液を得た。その細胞懸濁液から１０μＬをエッペンドルフチューブに取り出し、培地を７０μＬ添加後、１０μＬを別のエッペンドルフチューブに取り出し、０．４質量％トリパンブルー染色液１０μＬを加えてピペッティングを行った。
セルソーター（ソニー株式会社製、ＳＨ８００Ｚ、ソーティングチップとしてＬＥ－Ｃ３１１０（オリフィスサイズ １００μｍ）を使用）により励起波長４８８ｎｍで細胞が存在する領域を選択して、前方散乱光で大きい細胞をゲーティング、シングルセルモードによりマイクロチューブに分注し、細胞の体積平均粒経を計測したところ、２１．０μｍだった。比較例では、図４に示すオリフィスの径Ｒが１００μｍであり、細胞の体積平均粒径ｒが２１．０μｍであるため、Ｒ／ｒは４．７６となり、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たさない。
同一条件で９６穴平底プレートに規定の粒子数を分注、顕微鏡観察により細胞数を計測した。各液滴内に存在する細胞数と狙いの細胞数（１粒子；特定コピー数＝１）の正誤を判定して一致率を求めた。結果を表２に示す。一致率はわずか９．４％しかなかった。
(staining)
A cryopreserved green fluorescent dye (Cell Tracker Green, manufactured by Life Technologies) is thawed to room temperature (25 ° C.) and dimethyl sulfoxide at a concentration of 10 mmol / L (mM) (hereinafter, also referred to as “DMSO”). It was dissolved in serum and mixed with a serum-free modified Dalbecco modified eagle medium (manufactured by Life Technologies) to prepare a serum-free medium containing a green fluorescent dye at a concentration of 10 μmol / L (μM). Next, 5 mL of a serum-free medium containing a green fluorescent dye was added to 4 cultured NHDF dishes, and the cells were stained in an incubator for 30 minutes.
Then, the supernatant was removed using an aspirator. Add 5 mL of phosphate buffered saline (manufactured by Life Technologies, hereinafter also referred to as "PBS (-)") to the dish, and remove the PBS (-) by suction with an aspirator to clean the surface. bottom. After repeating the washing operation with PBS (-) twice, add 2 mL of 0.05 mass% trypsin-0.05 mass% EDTA solution (manufactured by life technologies) per dish and heat in the incubator for 5 minutes. And the cells were detached from the dish. After confirming cell detachment with a phase-contrast microscope (CKX41, manufactured by Olympus Corporation), 4 mL of D-MEM containing 10% by mass FBS and 1% by mass of antibiotic was added per dish to inactivate trypsin. Transfer the cell suspension for 4 dishes to one 50 ml centrifuge tube, centrifuge (H-19FM, manufactured by KOKUSAN, 1.2 x 103 rpm, 5 ° C., 5 ° C.), and use an ejector to eject the supernatant. Was removed. After removal, 1 mL of D-MEM containing 10% by mass FBS and 1% by mass antibiotic was added to the centrifuge tube, and gentle pipetting was performed to disperse the cells to obtain a cell suspension. From the cell suspension, 10 μL was taken out into an Eppendorf tube, 70 μL of the medium was added, 10 μL was taken out into another Eppendorf tube, and 10 μL of 0.4 mass% trypan blue staining solution was added for pipetting.
Select a region where cells exist at an excitation wavelength of 488 nm using a cell sorter (SH800Z manufactured by Sony Corporation, using LE-C3110 (
The specified number of particles was dispensed into a 96-well flat bottom plate under the same conditions, and the number of cells was measured by microscopic observation. The correctness of the number of cells existing in each droplet and the target number of cells (1 particle; specific number of copies = 1) was determined, and the matching rate was obtained. The results are shown in Table 2. The concordance rate was only 9.4%.
以上説明したように、本発明のプレートの生成方法では、細胞の体積平均粒径をｒ、オリフィスの径をＲとした場合、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすオリフィスを通過させた細胞懸濁液を液滴として吐出することによりプレートに順次配置させる。
これにより、オリフィスの径に対して細胞の体積平均粒径が十分小さくなることから、吐出時の細胞懸濁液における細胞の密度が均一になり、吐出する液滴に細胞が偏在しにくくなる。よって、本発明のプレートの生成方法では、吐出時に細胞懸濁液の流れがオリフィス内で偏らなくなることから吐出曲がりなどが発生しにくくなるため、吐出した液滴を所定の位置に付着させることができ、細胞数のばらつきが低減されたプレートを生成できる。
As described above, in the plate generation method of the present invention, when the volume average particle size of the cells is r and the diameter of the orifice is R, the cells passed through the orifice satisfying the following equation, R / r ≧ 5. The suspension is sequentially placed on the plate by ejecting it as droplets.
As a result, the volume average particle size of the cells is sufficiently smaller than the diameter of the orifice, so that the density of the cells in the cell suspension at the time of ejection becomes uniform, and the cells are less likely to be unevenly distributed in the droplets to be ejected. Therefore, in the plate generation method of the present invention, since the flow of the cell suspension is not biased in the orifice at the time of ejection, ejection bending and the like are less likely to occur, so that the ejected droplets can be adhered to a predetermined position. It is possible to generate a plate with a reduced variation in the number of cells.
（オリフィスの径可変プログラム）
本発明のオリフィスの径可変プログラムは、本発明のプレートの生成装置に用いられるオリフィスの径可変プログラムである。オリフィスの径可変プログラムは、取得した細胞の体積平均粒径の情報に基づき、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすようにオリフィスの径を可変させる処理をコンピュータに実行させる。
オリフィスの径可変プログラムは、ハードウェア資源としてのコンピュータ等を用いることにより、オリフィスの径可変装置として実現させる。なお、オリフィスの径可変装置を単に「可変装置」と称することがある。また、この可変装置は、生成装置１００の一部であってもよい。
次に、可変装置について説明する。
(Variable orifice diameter program)
The orifice diameter variable program of the present invention is an orifice diameter variable program used in the plate generator of the present invention. The orifice diameter variable program causes a computer to execute a process of varying the diameter of the orifice so as to satisfy the following equation, R / r ≧ 5, based on the acquired information on the volume average particle size of the cells.
The orifice diameter variable program is realized as an orifice diameter variable device by using a computer or the like as a hardware resource. The orifice diameter variable device may be simply referred to as a "variable device". Further, this variable device may be a part of the
Next, the variable device will be described.
図７は、可変装置のハードウェア構成の一例を示すブロック図である。
図７に示すように、可変装置２００は、ＣＰＵ２０１と、主記憶装置２０２と、補助記憶装置２０３と、外部Ｉ／Ｆ２０４と、可変機構２０５とを有し、これらはバス２０６で通信可能に接続されている。
FIG. 7 is a block diagram showing an example of the hardware configuration of the variable device.
As shown in FIG. 7, the
ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）２０１は、プロセッサの一種であり、種々の制御や演算を行う処理装置である。ＣＰＵ２０１は、補助記憶装置２０３などが記憶するＯＳ（Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）やプログラムを実行することにより、種々の機能を実現する。すなわち、ＣＰＵ２０１は、本実施形態では、オリフィスの径可変プログラムを実行することにより、後述する制御部２２０として機能する。
The CPU (Central Processing Unit) 201 is a kind of processor, and is a processing unit that performs various controls and operations. The
主記憶装置２０２は、各種プログラムを記憶し、また各種プログラムを実行するために必要なデータなどを記憶する。
主記憶装置２０２は、ＲＯＭと、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）と、を有する。
ＲＯＭは、ＢＩＯＳ（Ｂａｓｉｃ Ｉｎｐｕｔ／Ｏｕｔｐｕｔ Ｓｙｓｔｅｍ）等の各種プログラムなどを記憶している。
ＲＡＭは、各種プログラムがＣＰＵ２０１により実行される際に展開される作業範囲などとして機能する。ＲＡＭとしては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。ＲＡＭとしては、例えば、ＤＲＡＭ（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）、ＳＲＡＭ（Ｓｔａｔｉｃ Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）などが挙げられる。
The
The
The ROM stores various programs such as BIOS (Basic Input / Output System).
The RAM functions as a work range expanded when various programs are executed by the
補助記憶装置２０３は、本実施例では、ハードディスクドライブ（「ＨＤＤ」と称することがある）である。
なお、補助記憶装置２０３としては、各種情報を記憶できれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、ソリッドステートドライブ、磁気テープなどが挙げられる。また、他の補助記憶装置２０３としては、例えば、ＣＤドライブ、ＤＶＤドライブなどの可搬記憶装置などが挙げられる。これらは、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
The
The
外部Ｉ／Ｆ（Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）２０４は、データ取得装置３００と通信可能に接続されており、データ取得装置３００から細胞の体積平均粒径の情報を受信する。
なお、データ取得装置３００は、セルソーターのオリフィス１２を通過する細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径の情報を取得する装置である。
The external I / F (Interface) 204 is communicably connected to the
The
可変機構２０５は、モータの駆動によりオリフィス１２の径を可変できる可変開口絞機構を有する。
The
図８は、可変装置の機能構成を示すブロック図である。
図８に示すように、可変装置２００は、通信部２１０と、制御部２２０と、記憶部２３０とを有する。
FIG. 8 is a block diagram showing a functional configuration of the variable device.
As shown in FIG. 8, the
通信部２１０は、制御部２２０の指示に基づき、図７に示した外部Ｉ／Ｆ２０４を用いて細胞の体積平均粒径の情報を受信することができる。
The
制御部２２０は、受信した細胞の体積平均粒径の情報を記憶部２３０に記憶させる。制御部２２０は、記憶させた細胞の体積平均粒径の情報に基づき、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすように、可変機構２０５を用いてオリフィスの径を可変させる。
The
記憶部２３０は、制御部２２０の指示に基づき、補助記憶装置２０３に細胞の体積平均粒径の情報を記憶する。また、記憶部２３０は、前回指示されたオリフィスの径、即ち現状のオリフィスの径Ｒを記憶する。
The
次に、本発明のオリフィスの径可変プログラムについて説明する。本発明のオリフィスの径可変プログラムによる処理は、本発明の可変装置２００の制御部２２０を有するコンピュータを用いて実行することができる。
Next, the diameter variable program of the orifice of the present invention will be described. The processing by the diameter variable program of the orifice of the present invention can be performed by using the computer having the
図９は、オリフィスの径を可変させる動作を行う処理の流れを示すフローチャートである。ここでは、オリフィスの径を可変させる動作を行う処理の流れを図９に示すフローチャートの図中Ｓで表すステップにしたがって説明する。 FIG. 9 is a flowchart showing a flow of processing for performing an operation of varying the diameter of the orifice. Here, the flow of the process of performing the operation of varying the diameter of the orifice will be described according to the step represented by S in the flowchart of the flowchart shown in FIG.
ステップＳ１０１では、制御部２２０は、データ取得装置３００から受信した細胞の体積平均粒径の情報を読み込むと、処理をＳ１０２に移行する。
ステップＳ１０２では、制御部２２０は、細胞の体積平均粒径ｒの情報及び現状のオリフィスの径Ｒのデータから、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たしていると判定すると、本処理を終了する。また、制御部２２０は、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たしていないと判定すると、処理をＳ１０３に戻す。
ステップＳ１０３では、制御部２２０は、記憶させた細胞の体積平均粒径の情報に基づき、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすように、可変機構２０５を用いてオリフィスの径を可変させると、本処理を終了する。
In step S101, when the
In step S102, when the
In step S103, the
このように、本発明のオリフィスの径可変プログラムは、取得した細胞の体積平均粒径の情報に基づき、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすようにオリフィスの径を可変させる処理をコンピュータに実行させる。
これにより、本発明のオリフィスの径可変プログラムは、細胞懸濁液における細胞の体積平均粒径の計測結果に応じて自動的にオリフィスの径を十分大きくすることができるため、吐出時の細胞懸濁液における細胞の密度が均一にすることができる。このため、本発明のオリフィスの径可変プログラムは、オリフィスを通液する細胞懸濁液の細胞を偏在させないようにすることができる。
As described above, the orifice diameter variable program of the present invention performs a process of varying the orifice diameter so as to satisfy the following equation, R / r ≧ 5, based on the acquired information on the volume average particle size of the cells. Let it run.
As a result, the orifice diameter variable program of the present invention can automatically increase the diameter of the orifice sufficiently according to the measurement result of the volume average particle size of the cells in the cell suspension, so that the cell suspension at the time of ejection can be sufficiently increased. The density of cells in the turbid solution can be made uniform. Therefore, the variable diameter program of the orifice of the present invention can prevent the cells of the cell suspension passing through the orifice from being unevenly distributed.
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞ 細胞懸濁液を、オリフィスを介して液滴として吐出することによりプレートに順次配置させることを含み、
前記オリフィスが、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径をｒ、前記オリフィスの径をＲとした場合、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすことを特徴とするプレートの生成方法である。
＜２＞ 前記液滴の吐出後、かつ前記液滴の前記プレートへの配置前に、前記液滴に含まれる細胞数を計数することを更に含む前記＜１＞に記載のプレートの生成方法である。
＜３＞ 前記細胞が、光を受光したときに発光可能であり、
光が照射されたときに発せられる前記細胞からの発光に基づき、前記細胞数を計数する前記＜２＞に記載のプレートの生成方法である。
＜４＞ 前記プレート上の前記細胞から核酸を抽出することを更に含む前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載のプレートの生成方法である。
＜５＞ 前記液滴を吐出した後、吐出した前記液滴が前記プレート上の所定の位置に存在することを確認する前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載のプレートの生成方法である。
＜６＞ 細胞懸濁液を、オリフィスを介して液滴として吐出することによりプレートに順次配置させる吐出手段を有し、
前記オリフィスが、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径をｒ、前記オリフィスの径をＲとした場合、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすことを特徴とするプレートの生成装置である。
＜７＞ 前記液滴の吐出後、かつ前記液滴の前記プレートへの配置前に、前記液滴に含まれる細胞数を計数する細胞計数手段を更に有する前記＜６＞に記載のプレートの生成装置である。
＜８＞ 前記細胞が、光を受光したときに発光可能であり、
前記細胞計数手段が、光が照射されたときに発せられる前記細胞からの発光に基づき、前記細胞数を計数する前記＜７＞に記載のプレートの生成装置である。
＜９＞ 前記プレート上の前記細胞から核酸を抽出する核酸抽出手段を更に有する前記＜６＞から＜８＞のいずれかに記載のプレートの生成装置である。
＜１０＞ 前記液滴を吐出した後、吐出した前記液滴が前記プレート上に存在することを確認する画像認識手段を更に有する前記＜６＞から＜９＞のいずれかに記載のプレートの生成装置である。
＜１１＞ 前記＜６＞から＜１０＞に記載のプレートの生成装置に用いられるオリフィスの径可変プログラムであって、
前記細胞懸濁液に含まれる前記細胞の体積平均粒径の情報を取得し、
前記細胞の体積平均粒径の情報に基づき、前記式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすように前記オリフィスの径を可変させる、
処理をコンピュータに実行させることを特徴とするオリフィスの径可変プログラムである。
Examples of aspects of the present invention are as follows.
<1> The cell suspension is sequentially arranged on a plate by ejecting it as a droplet through an orifice.
Generation of a plate characterized in that the orifice satisfies the following equation, R / r ≧ 5, where r is the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension and R is the diameter of the orifice. The method.
<2> The plate generation method according to <1>, further comprising counting the number of cells contained in the droplet after ejection of the droplet and before placement of the droplet on the plate. be.
<3> The cells can emit light when they receive light.
The method for producing a plate according to <2>, wherein the number of cells is counted based on the light emitted from the cells when irradiated with light.
<4> The method for producing a plate according to any one of <1> to <3>, which further comprises extracting nucleic acid from the cells on the plate.
<5> The plate generation method according to any one of <1> to <4>, wherein after the droplets are ejected, it is confirmed that the ejected droplets are present at a predetermined position on the plate. be.
<6> The cell suspension has a discharge means for sequentially arranging the cell suspension on the plate by discharging it as a droplet through an orifice.
Generation of a plate characterized in that the orifice satisfies the following equation, R / r ≧ 5, where r is the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension and R is the diameter of the orifice. It is a device.
<7> The plate according to <6>, further comprising a cell counting means for counting the number of cells contained in the droplet after the droplet is ejected and before the droplet is placed on the plate. It is a device.
<8> The cells can emit light when they receive light.
The plate generating device according to <7>, wherein the cell counting means counts the number of cells based on the light emitted from the cells when irradiated with light.
<9> The plate generating apparatus according to any one of <6> to <8>, further comprising a nucleic acid extraction means for extracting nucleic acid from the cells on the plate.
<10> The production of the plate according to any one of <6> to <9>, further comprising an image recognition means for confirming that the discharged droplets are present on the plate after the droplets are discharged. It is a device.
<11> An orifice diameter variable program used in the plate generator according to the above <6> to <10>.
Information on the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension was obtained.
Based on the information on the volume average particle size of the cells, the diameter of the orifice is changed so as to satisfy the above formula, R / r ≧ 5.
It is a variable diameter program of an orifice characterized by having a computer perform processing.
前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載のプレートの生成方法、前記＜６＞から＜１０＞のいずれかに記載のプレートの生成装置、前記＜１１＞のに記載のオリフィスの径可変プログラムによれば、従来における前記諸問題を解決し、前記本発明の目的を達成することができる。 The plate generation method according to any one of <1> to <5>, the plate generation device according to any one of <6> to <10>, and the variable diameter orifice according to <11>. According to the program, the conventional problems can be solved and the object of the present invention can be achieved.
１ マイクロチップ
２ 振動素子
３ 光学検出手段
４ 対電極
５ プレート
６ グランド接地対電極
７ ステージ
１２ オリフィス
１００ プレートの生成装置
２００ 可変装置
２０５ 可変機構
２２０ 制御部
３００ データ取得装置
Ｄ 液滴
1
Claims (7)
前記細胞懸濁液に含まれる前記細胞の体積平均粒径の情報を取得し、前記細胞の体積平均粒径の情報に基づき、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径をｒ、前記オリフィスの径をＲとした場合、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすように前記オリフィスの径を可変させることを特徴とするプレートの生成方法。 Containing the sequential placement of the cell suspension on the plate by ejecting it as a droplet through an orifice.
Information on the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension is acquired, and based on the information on the volume average particle size of the cells, the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension is r. When the diameter of the orifice is R, the method for producing a plate is characterized in that the diameter of the orifice is changed so as to satisfy the following equation, R / r ≧ 5.
光が照射されたときに発せられる前記細胞からの発光に基づき、前記細胞数を計数する請求項２に記載のプレートの生成方法。 The cells can emit light when they receive light,
The method for producing a plate according to claim 2, wherein the number of cells is counted based on the light emitted from the cells when irradiated with light.
前記細胞懸濁液に含まれる前記細胞の体積平均粒径の情報を取得し、前記細胞の体積平均粒径の情報に基づき、前記細胞懸濁液に含まれる細胞の体積平均粒径をｒ、前記オリフィスの径をＲとした場合、次式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすように前記オリフィスの径を可変させる制御手段とを有することを特徴とするプレートの生成装置。 A discharge means for sequentially arranging the cell suspension on the plate by discharging the cell suspension as a droplet through the orifice.
Information on the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension is acquired, and based on the information on the volume average particle size of the cells, the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension is r. When the diameter of the orifice is R, the plate generating device includes a control means for varying the diameter of the orifice so as to satisfy the following equation, R / r ≧ 5.
前記細胞懸濁液に含まれる前記細胞の体積平均粒径の情報を取得し、
前記細胞の体積平均粒径の情報に基づき、前記式、Ｒ／ｒ≧５、を満たすように前記オリフィスの径を可変させる、
処理をコンピュータに実行させることを特徴とするオリフィスの径可変プログラム。 A variable diameter program for an orifice used in the plate generator according to claim 6.
Information on the volume average particle size of the cells contained in the cell suspension was obtained.
Based on the information on the volume average particle size of the cells, the diameter of the orifice is changed so as to satisfy the above formula, R / r ≧ 5.
A variable diameter program for orifices, characterized by having a computer perform the process.
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