JP7053401B2 - New cyclized product and method for producing new cyclized product - Google Patents
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Description
本開示は新規環化物及び新規環化物の製造方法に関する。 The present disclosure relates to a novel cyclized product and a method for producing a novel cyclized product.
従来、ボトリオコッセンは、バイオ燃料等の様々な用途への利用が研究されている。ボトリオコッセンは、化学合成が困難な天然化合物である。非特許文献１には、ボトリオコッセンの合成に関する遺伝子を酵母に導入することによってボトリオコッセンを合成する方法が開示されている。
Conventionally, botriocossen has been studied for use in various applications such as biofuels. Botriokossen is a natural compound that is difficult to chemically synthesize. Non-Patent
ボトリオコッセンのような化合物を、トラクション機構用のトラクション油として用いることが考えられる。従来のトラクション油よりも、トラクション係数がさらに大きいトラクション油が求められている。本開示は、トラクション係数が大きい新規環化物及びその製造方法を提供することを目的とする。 It is conceivable to use a compound such as botriocossen as a traction oil for the traction mechanism. There is a demand for traction oil having a higher traction coefficient than conventional traction oil. It is an object of the present disclosure to provide a novel cyclized product having a large traction coefficient and a method for producing the same.
本開示の一局面は、化学式（１）により表される新規環化物である。 One aspect of the present disclosure is a novel cyclized product represented by the chemical formula (1).
本開示の別の局面は、化学式（２）により表される新規環化物である。 Another aspect of the present disclosure is a novel cyclized product represented by the chemical formula (2).
本開示の別の局面は、ＳＨＣ酵素を用い、ボトリオコッセンから化学式（１）で表される新規環化物を製造する新規環化物の製造方法である。本開示の別の局面である新規環化物の製造方法によれば、トラクション油として使用した場合、トラクション係数が大きい新規環化物を製造できる。 Another aspect of the present disclosure is a method for producing a novel cyclized product represented by the chemical formula (1) from botriocossen using an SHC enzyme. According to the method for producing a novel cyclized product, which is another aspect of the present disclosure, when used as a traction oil, a novel cyclized product having a large traction coefficient can be produced.
本開示の別の局面は、ＳＨＣ酵素を用い、ボトリオコッセンから化学式（２）で表される新規環化物を製造する新規環化物の製造方法である。本開示の別の局面である新規環化物の製造方法によれば、トラクション油として使用した場合、トラクション係数が大きい新規環化物を製造できる。 Another aspect of the present disclosure is a method for producing a novel cyclized product, which uses an SHC enzyme to produce a new cyclized product represented by the chemical formula (2) from botriocossen. According to the method for producing a novel cyclized product, which is another aspect of the present disclosure, when used as a traction oil, a novel cyclized product having a large traction coefficient can be produced.
本開示の例示的な実施形態について図面を参照しながら説明する。
１．新規環化物
新規環化物として、化学式（１）～（８）により表される新規環化物がある。
An exemplary embodiment of the present disclosure will be described with reference to the drawings.
1. 1. New cyclized products As new cyclized products, there are new cyclized products represented by the chemical formulas (1) to (8).
２．新規環化物の製造方法
化学式（１）～（８）により表される新規環化物は、例えば、ボトリオコッセンを原料とし、ＳＨＣ（スクアレンホペンサイクラーゼ、Squalene hopene cyclase）酵素を用いて製造することができる。
３．新規環化物が奏する効果
化学式（１）～（８）により表される新規環化物は、環状構造を有することにより、トラクション油として使用した場合、トラクション係数が大きくなる。環状構造を有することにより、トラクション係数が大きくなることは、以下の試験結果による裏付けられる。
2. 2. Method for producing new cyclized product The new cyclized product represented by the chemical formulas (1) to (8) can be produced, for example, using botriocossen as a raw material and using an SHC (Squalene hopene cyclase) enzyme. can.
3. 3. Effect of the new cyclized product The new cyclized product represented by the chemical formulas (1) to (8) has a cyclic structure, so that the traction coefficient becomes large when used as a traction oil. The fact that the traction coefficient is increased by having the annular structure is supported by the following test results.
ｎ－デカン、ブチルシクロヘキサン、ｎ－トリデカン、及び片環ノルボルナンについて、トラクション係数を測定した。ｎ－デカンとブチルシクロヘキサンとを対比すると、１分子当たりの炭素数は同じである。ｎ－デカンは環状構造を有さず、ブチルシクロヘキサンは環状構造を有する。 Traction coefficients were measured for n-decane, butylcyclohexane, n-tridecane, and one-ring norbornane. When n-decane and butylcyclohexane are compared, the number of carbon atoms per molecule is the same. n-decane does not have a cyclic structure and butylcyclohexane has a cyclic structure.
ｎ－トリデカンと片環ノルボルナンとを対比すると、１分子当たりの炭素数は同じである。ｎ－トリデカンは環状構造を有さず、片環ノルボルナンは環状構造を有する。トラクション係数の測定条件は以下のとおりとした。 When n-tridecane and one-ring norbornane are compared, the number of carbon atoms per molecule is the same. n-Tridecane does not have a cyclic structure and single-ring norbornane has a cyclic structure. The measurement conditions for the traction coefficient were as follows.
温度：２５℃
周速：０．５ｍ／ｓ
すべり率：１５％
荷重：３０Ｎ
面圧：１．１ＧＰａ
測定結果を図１及び図２に示す。図１に示すように、ブチルシクロヘキサンのトラクション係数は、ｎ－デカンのトラクション係数の３．８倍であった。また、図２に示すように、片環ノルボルナンのトラクション係数は、ｎ－トリデカンのトラクション係数の２．４倍であった。
Temperature: 25 ° C
Peripheral speed: 0.5 m / s
Slip rate: 15%
Load: 30N
Surface pressure: 1.1 GPa
The measurement results are shown in FIGS. 1 and 2. As shown in FIG. 1, the traction coefficient of butylcyclohexane was 3.8 times the traction coefficient of n-decane. Further, as shown in FIG. 2, the traction coefficient of one-ring norbornane was 2.4 times the traction coefficient of n-tridecane.
この実験結果から、環状構造を有する化学式（１）～（８）により表される新規環化物をトラクション油として使用した場合、トラクション係数が大きくなることが確認できた。
４．実施例
（４－１）新規環化物の製造
以下の方法で新規環化物を製造した。
From this experimental result, it was confirmed that the traction coefficient becomes large when the novel cyclized product represented by the chemical formulas (1) to (8) having a cyclic structure is used as the traction oil.
4. Example (4-1) Production of new cyclized product A new cyclized product was produced by the following method.
Ａ．ＳＨＣ発現大腸菌の作成
A.acidocaldarius由来のＳＨＣの塩基配列は、Ochsらによって１９９２年に報告されている。ＳＨＣの塩基配列は、Genbank AB007002に登録されている。A.acidocaldariusからＳＨＣ遺伝子を、ＰＣＲ法を用いた増幅によって単離した。単離したＳＨＣ遺伝子を、発現ベクターpET3aに挿入した。この発現ベクターpET3aを、大腸菌BL21(DE3)へ形質転換することで、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を作成した。
A. Creation of SHC-expressing E. coli
The nucleotide sequence of SHC from A. acidocaldarius was reported by Ochs et al. In 1992. The base sequence of SHC is registered in Genbank AB007002. The SHC gene was isolated from A. acidocaldarius by amplification using the PCR method. The isolated SHC gene was inserted into the expression vector pET3a. By transforming this expression vector pET3a into Escherichia coli BL21 (DE3), SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)) was prepared.
Ｂ．ＳＨＣ発現大腸菌の培養
（ｂ－１）純水を用い、LB培地を調製した。LB培地は、１％のハイポリペプトン(日本製薬製)と、０．５％のイーストエキストラクト(関東科学製)と、０．５％のNaClとを含む。
B. Culture of SHC-expressing Escherichia coli (b-1) LB medium was prepared using pure water. The LB medium contains 1% high polypeptone (manufactured by Nihon Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.5% yeast extract (manufactured by Kanto Kagaku), and 0.5% NaCl.
（ｂ－２）前記（ｂ－１）で調製したLB培地を、１２１℃で２０分間滅菌した。
（ｂ－３）LB培地が十分に冷めてから、クリーンベンチ内で、濃度５０ｍｇ／ｍＬのアンピシリン酸ナトリウム溶液をLB培地に加えた。アンピシリン酸ナトリウム溶液の添加量は、LB培地５００ｍＬにつき、５００μＬとした。以上の工程により調製された培地を、本培養培地とした。
(B-2) The LB medium prepared in (b-1) above was sterilized at 121 ° C. for 20 minutes.
(B-3) After the LB medium had cooled sufficiently, a sodium ampicillate solution having a concentration of 50 mg / mL was added to the LB medium in a clean bench. The amount of the sodium ampicillate solution added was 500 μL per 500 mL of LB medium. The medium prepared by the above steps was used as the main culture medium.
（ｂ－４）濃度５０ｍｇ／ＬのLB+アンピシリン５ｍＬを、クリーンベンチ内で１５ｍＬチューブに入れた。
（ｂ－５）さらに、１５ｍＬチューブに、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))の２０％グリセロースストックを５０μＬ加えた。その後、３７℃の下、１５０ｒｐｍの条件で４時間振盪培養した。振盪培養後の培地を、以下では前培養液とする。
(B-4) 5 mL of LB + ampicillin having a concentration of 50 mg / L was placed in a 15 mL tube in a clean bench.
(B-5) Further, 50 μL of 20% glycerose stock of SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)) was added to a 15 mL tube. Then, the cells were shake-cultured at 37 ° C. and 150 rpm for 4 hours. The medium after shaking culture is referred to as the preculture solution below.
（ｂ－６）前記（ｂ－１）～（ｂ－３）で調製した本培養培地に、前培養液２．５ｍＬを加えた。その後、３０℃の下、２０時間振盪培養した。
Ｃ．酵素液の調製
（ｃ－１）前記（ｂ－６）の後、本培養培地から、遠心により、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を集菌した。遠心の条件は、６０００ｒｐｍ、１０分間、４℃とした。
（ｃ－２）集菌したＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))に、50mM Tris-HCl(pH 7.5)を加え懸濁した。50mM Tris-HCl(pH 7.5)の添加量は、本培養培地５００ｍＬにつき３０ｍＬとした。
(B-6) 2.5 mL of the preculture solution was added to the main culture medium prepared in the above (b-1) to (b-3). Then, the cells were shake-cultured at 30 ° C. for 20 hours.
C. Preparation of enzyme solution (c-1) After the above (b-6), SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)) was collected from the main culture medium by centrifugation. Centrifugal conditions were 6000 rpm, 10 minutes and 4 ° C.
(C-2) 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) was added to the collected SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)) and suspended. The amount of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) added was 30 mL per 500 mL of the main culture medium.
（ｃ－３）前記（ｃ－２）で生じた懸濁液を５０ｍＬチューブに移した。その後、６０００ｒｐｍ、１０分間、４℃の条件で遠心し、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を集菌した。
（ｃ－４）前記（ｃ－２）及び前記（ｃ－３）をもう一度繰り返した。
(C-3) The suspension produced in (c-2) above was transferred to a 50 mL tube. Then, it was centrifuged at 6000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. to collect SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)).
(C-4) The above (c-2) and the above (c-3) were repeated once more.
（ｃ－５）集菌したＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))に、1% TritonX-100(w/v) 50mM Tris-HCl(pH8.0)を加えた。添加量は、本培養培地５００ｍＬにつき５ｍＬとした。
（ｃ－６）前記（ｃ－５）の後、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を、使用するまで－８０℃で保存した。
(C-5) 1% Triton X-100 (w / v) 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) was added to the collected SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)). The amount added was 5 mL per 500 mL of the main culture medium.
(C-6) After the above (c-5), SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)) was stored at −80 ° C. until use.
（ｃ－７）前記（ｃ－６）で保存したＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を、氷水中で融解した。
（ｃ－８）前記（ｃ－７）で融解したＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))に対し、1% TritonX-100(w/v) 50mM Tris-HCl(pH8.0)を加えた。1% TritonX-100(w/v) 50mM Tris-HCl(pH8.0)の添加量は、本培養培地５００ｍＬにつき２０ｍＬとした。前記（ｃ－５）での1% TritonX-100(w/v) 50mM Tris-HCl(pH8.0)の添加量と、この（ｃ－８）での1% TritonX-100(w/v) 50mM Tris-HCl(pH8.0)の添加量との合計は、本培養培地５００ｍＬにつき２５ｍＬとなった。その後、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を含む液を懸濁した。
(C-7) The SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)) stored in (c-6) above was thawed in ice water.
(C-8) Add 1% Triton X-100 (w / v) 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) to SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)) thawed in (c-7) above. rice field. The amount of 1% TritonX-100 (w / v) 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) added was 20 mL per 500 mL of the main culture medium. The amount of 1% TritonX-100 (w / v) 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) added in (c-5) and 1% TritonX-100 (w / v) in this (c-8). The total with the amount of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) added was 25 mL per 500 mL of the main culture medium. Then, a solution containing SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)) was suspended.
（ｃ－９）前記（ｃ－８）で得られた懸濁液を、スターラーで混和し続け、氷上で冷却しながら、超音波破砕機を用いて、ＳＨＣ発現大腸菌pET3a-SHC(BL21(DE3))を破砕した。超音波破砕機の条件は、出力１、５０％であった。超音波破砕機による処理時間は、懸濁液５０ｍＬ当たり６０分間であった。 (C-9) The suspension obtained in (c-8) above was continuously mixed with a stirrer, and while cooling on ice, an SHC-expressing Escherichia coli pET3a-SHC (BL21 (DE3)) was used using an ultrasonic crusher. )) Was crushed. The condition of the ultrasonic crusher was an output of 1,50%. The treatment time with the ultrasonic crusher was 60 minutes per 50 mL of suspension.
（ｃ－１０）前記（ｃ－９）の処理の後、懸濁液を、１２０００ｒｐｍ、２０分間、４℃の条件で遠心し、上清を回収した。回収した上清を酵素液とした。酵素液はＳＨＣ酵素を含む。
（ｃ－１１）使用するまで、酵素液を－８０℃で保存した。
(C-10) After the treatment of (c-9), the suspension was centrifuged at 12000 rpm for 20 minutes at 4 ° C., and the supernatant was collected. The recovered supernatant was used as an enzyme solution. The enzyme solution contains the SHC enzyme.
(C-11) The enzyme solution was stored at −80 ° C. until use.
Ｄ．ボトリオコッセンの可溶化
（ｄ－１）炭素数３０のボトリオコッセンを用意した。ボトリオコッセンは天然物であってもよいし、合成されたものであってもよい。ボトリオコッセンを合成する方法として、例えば、以下の文献に開示されている方法がある。
（文献）Ｔｏｍ Ｄ． Ｎｉｅｈａｕｓら、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｎｉｑｕｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｆｏｒ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｉｎ Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０１１年、第１０８巻、ｐ．１２２６０－１２２６５
この文献に記載の方法では、ボトリオコッセンの合成に関する遺伝子を酵母に導入することによって、ボトリオコッセンを合成する。具体的には、ファルネシル二リン酸を基質としてプレスクアレン二リン酸を合成する酵素をコードするプレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子と、プレスクアレン二リン酸を基質としてボトリオコッセンを合成する酵素をコードするボトリオコッセン合成酵素遺伝子と、を酵母に導入している。
D. Solubilization of botriocossen (d-1) A botriocossen having 30 carbon atoms was prepared. Botriocossen may be a natural product or a synthetic product. As a method for synthesizing botriocossen, for example, there is a method disclosed in the following documents.
(Reference) Tom D. Niehaus et al., "Identification of unique mechanisms for triterpene biosynthesis in Botryococcus braunii", Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 2011, Vol. 108, p. 12260-12265
In the method described in this document, botriocossen is synthesized by introducing a gene related to botriocossen synthesis into yeast. Specifically, it encodes a presqualene diphosphate synthase gene that encodes an enzyme that synthesizes presqualene diphosphate using farnesyl diphosphate as a substrate, and an enzyme that synthesizes botriocossen using presqualene diphosphate as a substrate. The botriocossen synthase gene is introduced into yeast.
プレスクアレン二リン酸合成酵素遺伝子としては、ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ－ｌｉｋｅ １遺伝子を用いている。ボトリオコッセン合成酵素遺伝子としては、ｓｑｕａｌｅｎｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ－ｌｉｋｅ ３遺伝子を用いている。 As the presqualene diphosphate synthase gene, the squalene syncase-like 1 gene is used. As the botriocossen synthase gene, the squalene syncase-like 3 gene is used.
（ｄ－２）０．５ｍｇのボトリオコッセンと、２０ｍｇのTritonX-100とを試験管に入れた。次に、２ｍＬのアセトンを試験管に加えた。
（ｄ－３）試験管にアルミホイルで蓋をし、１０分間超音波処理をした。
(D-2) 0.5 mg of Botriokossen and 20 mg of Triton X-100 were placed in a test tube. Next, 2 mL of acetone was added to the test tube.
(D-3) The test tube was covered with aluminum foil and sonicated for 10 minutes.
（ｄ－４）Ｎ２ガスを用いて試験管中の溶媒を飛ばした。その後、穴を開けたアルミホイルで試験管に蓋をし、３０分間真空乾燥した。その後、再度、Ｎ２ガスを用いて試験管中の溶媒を飛ばした。 (D-4) The solvent in the test tube was blown off using N 2 gas. Then, the test tube was covered with a perforated aluminum foil and vacuum dried for 30 minutes. Then, again, the solvent in the test tube was blown off using N 2 gas.
（ｄ－５）試験管に１ｍＬの蒸留水を加えた。その後、２０分間超音波処理を行った。以上の工程により、ボトリオコッセンが可溶化した。以上の工程により得られた液を、可溶化済み基質液とする。 (D-5) 1 mL of distilled water was added to the test tube. Then, ultrasonic treatment was performed for 20 minutes. By the above steps, botriocossen was solubilized. The liquid obtained by the above steps is used as a solubilized substrate liquid.
Ｅ．酵素反応
（ｅ－１）１ｍＬの可溶化済み基質液と、５ｍＬの酵素液と、２ｍＬのクエン酸バッファーとを混合した。混合により生じた液を反応液とする。クエン酸バッファーの濃度は０．５Ｍである。クエン酸バッファーのｐＨは６．０である。
E. Enzyme reaction (e-1) 1 mL of solubilized substrate solution, 5 mL of enzyme solution and 2 mL of citric acid buffer were mixed. The liquid produced by mixing is used as a reaction liquid. The concentration of citric acid buffer is 0.5 M. The pH of the citric acid buffer is 6.0.
（ｅ－２）反応液において、６０℃の下、７２時間以上、反応を進行させた。反応のとき、振とう恒温器を用い、７０ｒｐｍで反応液を攪拌した。
（ｅ－３）９．６ｍＬの１５％KOH/MeOHを反応液に添加し、よく混合した。１５％KOH/MeOHとは、メタノールに水酸化カリウムを溶解した溶液である。１５％KOH/MeOHにおける水酸化カリウムの濃度は１５質量％である。１５％KOH/MeOHの添加量は、反応液の１．２倍量である。
(E-2) In the reaction solution, the reaction was allowed to proceed at 60 ° C. for 72 hours or more. At the time of the reaction, the reaction solution was stirred at 70 rpm using a shaking incubator.
(E-3) 9.6 mL of 15% KOH / MeOH was added to the reaction mixture and mixed well. 15% KOH / MeOH is a solution of potassium hydroxide in methanol. The concentration of potassium hydroxide in 15% KOH / MeOH is 15% by weight. The amount of 15% KOH / MeOH added is 1.2 times the amount of the reaction solution.
（ｅ－４）前記（ｅ－３）の後、反応液を３０分間以上湯煎した。このとき、反応が停止し、けん化した。
Ｆ．酵素反応物の抽出
（ｆ－１）前記（ｅ－４）で得られた、反応停止した反応液８ｍＬを５０ｍＬチューブに移した。その後、１６ｍＬのヘキサンを５０ｍＬチューブに加えた。ヘキサンの添加量は、反応液の２倍量である。
(E-4) After the above (e-3), the reaction solution was boiled in hot water for 30 minutes or more. At this time, the reaction stopped and saponified.
F. Extraction of enzyme reaction product (f-1) 8 mL of the reaction solution obtained in (e-4) above was transferred to a 50 mL tube. Then 16 mL of hexane was added to the 50 mL tube. The amount of hexane added is twice the amount of the reaction solution.
（ｆ－２）５０ｍＬチューブを１０秒間程度ボルテックスした。その後、５０ｍＬチューブの内容物が２層に分離するまで、５０ｍＬチューブを静置した。なお、２層に分離しにくい場合は、少量のアセトンを５０ｍＬチューブにさらに加える。 (F-2) A 50 mL tube was vortexed for about 10 seconds. Then, the 50 mL tube was allowed to stand until the contents of the 50 mL tube were separated into two layers. If it is difficult to separate into two layers, add a small amount of acetone to the 50 mL tube.
（ｆ－３）５０ｍＬチューブの内容物のうち、分離した上層を、先端が尖っているナスフラスコに回収した。
（ｆ－４）前記（ｆ－１）～前記（ｆ－３）の工程をさらに２回繰り返した。その結果、ナスフラスコに、酵素反応物を含む抽出液が得られた。
(F-3) Of the contents of the 50 mL tube, the separated upper layer was collected in an eggplant flask with a sharp tip.
(F-4) The steps (f-1) to (f-3) were repeated twice more. As a result, an extract containing the enzyme reaction product was obtained in the eggplant flask.
（ｆ－５）抽出液の溶媒をエバポレーターで飛ばした。ナスフラスコには酵素反応物が残った。
（ｆ－６）酵素反応物を、少量のヘキサン／酢酸エチル混合液で希釈した。ヘキサン／酢酸エチル混合液における、ヘキサンと酢酸エチルとの体積比は、１００：２０である。
(F-5) The solvent of the extract was blown off by an evaporator. The enzyme reaction product remained in the eggplant flask.
(F-6) The enzyme reaction product was diluted with a small amount of a hexane / ethyl acetate mixture. The volume ratio of hexane to ethyl acetate in the hexane / ethyl acetate mixture is 100:20.
（ｆ－７）短いパスツールピペットの先端に少量の脱脂綿を詰めた。紙製のウエスをひも状にし、パスツールピペットの外周面に巻きつけた。パスツールピペットのうち、先端を含む一部を試験管に差し込んだ。このとき、パスツールピペットの外周面に巻きつけた紙製のウエスが試験管の開口端に当接し、パスツールピペットは、それ以上試験管内に進入しない。その結果、パスツールピペットは、試験管に引っ掛った状態となった。パスツールピペットの先端と、試験管の底とは離間した状態になった。 (F-7) A small amount of cotton wool was stuffed into the tip of a short Pasteur pipette. A paper waste was stringed and wrapped around the outer surface of the Pasteur pipette. A part of the Pasteur pipette, including the tip, was inserted into the test tube. At this time, a paper waste wrapped around the outer peripheral surface of the Pasteur pipette abuts on the open end of the test tube, and the Pasteur pipette does not enter the test tube any more. As a result, the Pasteur pipette was caught in the test tube. The tip of the Pasteur pipette was separated from the bottom of the test tube.
空気を除いたシリカゲルを、ヘキサン／酢酸エチル混合液で懸濁した懸濁液を、パスツールピペットの半分程度まで詰めた。その結果、シリカゲルカラムが得られた。シリカゲルは、富士シリシア化学製のCHROMATOREX BW-200である。ヘキサン／酢酸エチル混合液における、ヘキサンと酢酸エチルとの体積比は１００：２０である。 A suspension of silica gel without air suspended in a hexane / ethyl acetate mixture was packed to about half of a Pasteur pipette. As a result, a silica gel column was obtained. The silica gel is CHROMATOREX BW-200 manufactured by Fuji Silysia Chemical. The volume ratio of hexane to ethyl acetate in the hexane / ethyl acetate mixture is 100:20.
ヘキサン／酢酸エチル混合液を、パスツールピペットの最上部まで入れ、パスツールピペットの壁面に付着するシリカゲルを落とした。以降、精製が終了するまで、シリカゲルカラムが乾かないようにした。 A hexane / ethyl acetate mixture was poured to the top of the Pasteur pipette to remove silica gel adhering to the wall of the Pasteur pipette. After that, the silica gel column was prevented from drying until the purification was completed.
（ｆ－８）前記（ｆ－６）で得られた希釈液を、シリカゲルカラムにアプライした。このとき、シリカゲルが舞わないように慎重にアプライした。
（ｆ－９）前記（ｆ－６）で得られた希釈液が入っていたナスフラスコにパスツールピペットでひと吸い程度のヘキサン／酢酸エチル混合液を加え、ナスフラスコの内部をよく洗った。その後、洗液をシリカゲルカラムにアプライした。
(F-8) The diluted solution obtained in (f-6) above was applied to a silica gel column. At this time, the silica gel was carefully applied so as not to fly.
(F-9) A hexane / ethyl acetate mixed solution was added to the eggplant flask containing the diluted solution obtained in (f-6) with a pasteur pipette, and the inside of the eggplant flask was thoroughly washed. Then, the washing liquid was applied to the silica gel column.
（ｆ－１０）前記（ｆ－９）の工程をさらに２回行った。
（ｆ－１１）アプライした液の液面がシリカゲル層の上端まで下降する直前に、ヘキサン／酢酸エチル混合液をシリカゲルカラムにアプライした。このとき、ヘキサン／酢酸エチル混合液の液面がパスツールピペットの最上部に達するようにした。
(F-10) The step of (f-9) was performed twice more.
(F-11) Immediately before the liquid level of the applied liquid descended to the upper end of the silica gel layer, the hexane / ethyl acetate mixed liquid was applied to the silica gel column. At this time, the liquid level of the hexane / ethyl acetate mixture reached the top of the Pasteur pipette.
（ｆ－１２）前記（ｆ－１１）の工程をさらに２回繰り返し、酵素反応物を含む溶液をシリカゲルカラムから溶出させた。
（４－２）新規環化物の分析方法
前記（ｆ－１２）で得られた、酵素反応物を含む溶液から溶媒を除去した。その結果、約６０ｍｇの油状成分を得た。
(F-12) The above step (f-11) was repeated twice, and the solution containing the enzyme reaction product was eluted from the silica gel column.
(4-2) Analytical method for novel cyclized product The solvent was removed from the solution containing the enzyme reaction product obtained in (f-12) above. As a result, about 60 mg of an oily component was obtained.
次に、６０ｍｇの油状成分を、１０ｍＬのMeOH/IPA混合溶液で希釈した。MeOH/IPA混合溶液において、メタノールとイソプロピルアルコールとの体積比は１：１である。
次に、希釈した油状成分をＨＰＬＣに注入し、分離操作を行った。ＨＰＬＣの条件は以下のとおりである。
Next, 60 mg of the oil component was diluted with 10 mL of the MeOH / IPA mixture. In the MeOH / IPA mixed solution, the volume ratio of methanol to isopropyl alcohol is 1: 1.
Next, the diluted oily component was injected into HPLC and a separation operation was performed. The HPLC conditions are as follows.
カラム:YMC-Actus ProC18 RS ２５０ｍｍ×３０ｍｍ
移動相:メタノールとイソプロピルアルコールとを体積比で８２：１８の比率で含む混合溶液
流速:１５ｍＬ／ｍｉｎ
検出:ＵＶ(検出波長:２１０ｎｍ）
次に、分離した成分を、ＧＣ／ＭＳにより同定した。使用した装置は、ガスクロマトグラフ‐飛行時間型質量分析JMS-T200GCAccuTOFGCxである。測定条件は以下のとおりである。
Column: YMC-Actus ProC18 RS 250mm x 30mm
Mobile phase: Mixed solution containing methanol and isopropyl alcohol in a volume ratio of 82:18 Flow rate: 15 mL / min
Detection: UV (detection wavelength: 210 nm)
The separated components were then identified by GC / MS. The device used was a gas chromatograph-time-of-flight mass spectrometry JMS-T200GC AccuTOFGCx. The measurement conditions are as follows.
サンプルの条件：ヘキサン溶液
ＧＣの条件
・GCカラム:DB-5MS UI, 15m x 0.25mm, 0.1μm
・オーブン温度:120℃→ 40℃/min → 300℃(15min)
・注入口:250℃,Split 1:5（EI）、Splitless（FI）
・He流量:1.1mL/min (Constant flow)
EI 条件
・イオン化法:EI+
・イオン化電圧/電流:70eV/ 300μA
・イオン源温度:250℃
MS条件
・質量範囲:m/z35-800
・スペクトル記録間隔:0.4sec
FI 条件
・イオン化法:FI+
・カソード電圧:-10kV
・エミッタ焼き出し:30mA/30msec
また、分離した成分を、ＮＭＲにより分析した。使用した測定装置は、Bruker DPX400である。測定溶媒は重ベンゼンである。
Sample conditions: Hexane solution GC conditions-GC column: DB-5MS UI, 15m x 0.25mm, 0.1μm
・ Oven temperature: 120 ℃ → 40 ℃ / min → 300 ℃ (15min)
・ Injection port: 250 ℃, Split 1: 5 (EI), Splitless (FI)
・ He flow rate: 1.1mL / min (Constant flow)
EI conditions ・ Ionization method: EI +
・ Ionization voltage / current: 70eV / 300μA
・ Ion source temperature: 250 ℃
MS condition ・ Mass range: m / z 35-800
・ Spectrum recording interval: 0.4sec
FI condition ・ Ionization method: FI +
・ Cathode voltage: -10kV
・ Emitter burnout: 30mA / 30msec
In addition, the separated components were analyzed by NMR. The measuring device used was a Bruker DPX400. The measurement solvent is heavy benzene.
（４－３）新規環化物の分析結果
分離した成分の一つのＮＭＲの結果を図３に示す。この成分は、化学式（１）により表される新規環化物である。図３には、化学式（１）により表される新規環化物を構成する各原子のピークを示す。
(4-3) Analysis result of novel cyclized product FIG. 3 shows the result of NMR of one of the separated components. This component is a novel cyclized product represented by the chemical formula (1). FIG. 3 shows the peaks of each atom constituting the novel cyclized product represented by the chemical formula (1).
また、分離した別の成分のＧＣ／ＭＳの結果を図４に示し、ＮＭＲの結果を図５に示す。この成分は、化学式（２）により表される成分である。図５には、化学式（５）により表される新規環化物を構成する各原子のピークを示す。 Further, the result of GC / MS of another separated component is shown in FIG. 4, and the result of NMR is shown in FIG. This component is a component represented by the chemical formula (2). FIG. 5 shows the peaks of each atom constituting the novel cyclized product represented by the chemical formula (5).
また、酵素反応物には、化学式（３）～（８）で表される新規環化物も含まれると推測される。
５．他の実施形態
以上、本開示の実施形態について説明したが、本開示は上述の実施形態に限定されることなく、種々変形して実施することができる。
In addition, it is presumed that the enzyme reaction product also contains novel cyclized products represented by the chemical formulas (3) to (8).
5. Other Embodiments Although the embodiments of the present disclosure have been described above, the present disclosure is not limited to the above-described embodiments, and can be variously modified and implemented.
（１）化学式（１）～（８）により表される新規環化物は、トラクション油以外の用途に用いてもよい。他の用途として、例えば、飼料添加物、食品添加物等が挙げられる。
（２）上記実施形態における１つの構成要素が有する複数の機能を、複数の構成要素によって実現したり、１つの構成要素が有する１つの機能を、複数の構成要素によって実現したりしてもよい。また、複数の構成要素が有する複数の機能を、１つの構成要素によって実現したり、複数の構成要素によって実現される１つの機能を、１つの構成要素によって実現したりしてもよい。また、上記実施形態の構成の一部を省略してもよい。また、上記実施形態の構成の少なくとも一部を、他の上記実施形態の構成に対して付加又は置換してもよい。なお、特許請求の範囲に記載した文言から特定される技術思想に含まれるあらゆる態様が本開示の実施形態である。
(1) The novel cyclized products represented by the chemical formulas (1) to (8) may be used for applications other than traction oil. Other uses include, for example, feed additives, food additives and the like.
(2) A plurality of functions possessed by one component in the above embodiment may be realized by a plurality of components, or one function possessed by one component may be realized by a plurality of components. .. Further, a plurality of functions possessed by the plurality of components may be realized by one component, or one function realized by the plurality of components may be realized by one component. Further, a part of the configuration of the above embodiment may be omitted. Further, at least a part of the configuration of the above embodiment may be added or replaced with the configuration of the other above embodiment. It should be noted that all aspects included in the technical idea specified from the wording described in the claims are embodiments of the present disclosure.
（３）上述した新規環化物の他、当該新規環化物を成分とする組成物、当該新規環化物を含むトラクション油等、種々の形態で本開示を実現することもできる。 (3) In addition to the above-mentioned novel cyclized product, the present disclosure can be realized in various forms such as a composition containing the new cyclized product as a component, a traction oil containing the new cyclized product, and the like.
Claims (4)
A method for producing a novel cyclized product, which comprises using an SHC enzyme to produce a novel cyclized product represented by the chemical formula (2) from botriocossen.
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