JP7051175B1 - Evaluation methods - Google Patents
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Abstract
【課題】試験対象素材の評価方法及び評価用培地を提供すること。【解決手段】本発明は１種以上の腸内細菌を含むヒト便検体と、試験対象素材と、前記腸内細菌により代謝され、有害物質を生成する代謝基質物質と、を培地中で培養する培養ステップと、培養後の培養液に含まれる代謝物をメタボローム解析する解析ステップとを含むことを特徴とする、試験対象素材の評価方法に関する。また、腸内細菌の培養が可能な培地と、前記腸内細菌により代謝され、有害物質を生成する代謝基質物質とを含むことを特徴とする、試験対象素材の作用を評価するための評価用培地に関する。【選択図】図１PROBLEM TO BE SOLVED: To provide an evaluation method and an evaluation medium for a material to be tested. SOLUTION: In the present invention, a human stool sample containing one or more kinds of intestinal bacteria, a material to be tested, and a metabolite substrate substance metabolized by the intestinal bacteria to produce a harmful substance are cultured in a medium. The present invention relates to a method for evaluating a material to be tested, which comprises a culture step and an analysis step for metabolite analysis of metabolites contained in the culture solution after culture. Further, for evaluation for evaluating the action of the material to be tested, which comprises a medium capable of culturing intestinal bacteria and a metabolic substrate substance that is metabolized by the intestinal bacteria and produces harmful substances. Regarding the medium. [Selection diagram] Fig. 1
Description
特許法第３０条第２項適用 刊行物 ２０１９年１１月０２日（０２．１１．２０１９）第２４回日本食物繊維学会学術集会講演要旨集 一般社団法人日本食物繊維学会事務局Application of Article 30,
特許法第３０条第２項適用 刊行物 ２０１９年０９月０６日（０６．０９．２０１９）２０１９年Ｋｅｙｓｔｏｎｅ ｓｙｍ予稿集 登録者へメールで配布Patent Law Article 30
本発明は、試験対象素材の腸内環境に対する作用を評価する方法、及びそのための培地に関する。 The present invention relates to a method for evaluating the effect of a material under test on the intestinal environment, and a medium for that purpose.
ヒトの腸管内では多種多様な細菌が存在し、これらは腸内細菌叢と呼ばれる。腸内細菌叢の構成は食習慣や年齢などによって個々人により異なり、健康に対して様々な作用を及ぼすことが知られている。また、食品や医薬品の健康に対する効果は、腸内細菌叢の変化や、それにともなう腸内細菌の代謝物の増減に大きく関係している場合があることが報告されている。 There are a wide variety of bacteria in the human intestine, which are called the intestinal flora. It is known that the composition of the intestinal flora varies from person to person depending on eating habits and age, and has various effects on health. It has also been reported that the health effects of foods and pharmaceuticals may be significantly related to changes in the intestinal bacterial flora and the accompanying increase or decrease in the metabolites of the intestinal bacteria.
一般に、食品等の機能性成分の機能性・安全性の評価は、ラットやマウス等の実験動物への当該成分の経口投与試験やヒトに対する介入試験にて行われている。しかしながら、実験動物を用いた経口投与試験で得られた結果は、ヒトの腸内環境を反映しているとはいえない場合があった。また、ヒトに対する介入試験では、ヒトを対象とした試験なので手続面の困難性・煩雑性等により、費用が高額になる場合が多いことや、研究期間が長期化すること等が問題点として挙げられる。したがって、ヒトの介入試験を実施する前に、食品や医薬品などの試験対象素材の腸内環境に及ぼす作用を簡便にスクリーニングする手法が望まれている。さらに、経口摂取した場合には胃や小腸で消化・吸収されるような食品や物質等であっても、大腸に到達した場合には腸内環境に有益な効果をもたらす可能性もあるが、動物試験やヒトに対する介入試験で経口摂取した場合には、大腸崩壊性カプセルなどを用いなければそのような仮説を検証することはできない。したがって、上記スクリーニングは、様々な食品や物質を直接大腸に送達した場合の事象を評価できるとなおよいため、試験管内で大腸を模倣したような環境で行われることが望ましい。 In general, the evaluation of the functionality and safety of functional ingredients such as foods is carried out by oral administration tests of the ingredients to experimental animals such as rats and mice and intervention tests in humans. However, the results obtained in the oral administration test using experimental animals may not reflect the human intestinal environment in some cases. In addition, since the intervention test for humans is a test for humans, the cost is often high due to the difficulty and complexity of the procedure, and the research period is prolonged. Be done. Therefore, there is a demand for a method for simply screening the effects of test materials such as foods and pharmaceuticals on the intestinal environment before conducting human intervention tests. Furthermore, even foods and substances that are digested and absorbed in the stomach and small intestine when taken orally may have a beneficial effect on the intestinal environment when they reach the large intestine. When ingested orally in animal studies or intervention studies in humans, such a hypothesis cannot be tested without the use of large intestine disintegrating capsules. Therefore, since it is better to be able to evaluate the events when various foods and substances are delivered directly to the large intestine, it is desirable that the screening be performed in an environment that imitates the large intestine in vitro.
特許文献１には、実際の腸内細菌叢に類似した微生物多様性を維持する腸管模倣培養装置が提案されている。特許文献１では、腸管模倣培養装置に腸管上皮を模倣した構造物を組み込むことにより、微生物の多様性を増すことができることが開示されている。
特許文献１に記載の技術は、腸管模倣培養装置が記載されているが、試験対象素材の作用を効率的に評価できることは記載されていない。そこで本発明は、食品や医薬品候補化合物などの試験対象素材の腸内環境に対する影響を効率的に評価することが可能な評価方法を提供することを一つの目的とする。本発明は、腸内細菌により代謝される代謝基質物質を添加した培地中で便と試験対象素材とを培養し、メタボローム解析を実施することにより、試験対象素材の腸内環境に対する影響を評価することができる。
Although the technique described in
本発明によれば、１種以上の腸内細菌を含む便検体と、試験対象素材と、前記腸内細菌により代謝される代謝基質物質と、を培地中で培養する培養ステップと、培養後の培養液に含まれる代謝物をメタボローム解析する解析ステップとを含むことを特徴とする、試験対象素材の評価方法が得られる。 According to the present invention, a culture step of culturing a stool sample containing one or more types of intestinal bacteria, a material to be tested, and a metabolite that is metabolized by the intestinal bacteria in a medium, and after culturing. A method for evaluating a material to be tested can be obtained, which comprises an analysis step for metabolite analysis of metabolites contained in a culture medium.
本発明によれば、試験対象素材の腸内環境に対する作用を効率的に評価することができる。 According to the present invention, the effect of the test material on the intestinal environment can be efficiently evaluated.
本発明の実施形態の内容を列記して説明する。本発明は、以下のような構成を備える。
［項目１］
１種以上の腸内細菌を含む便検体と、
試験対象素材と、
前記腸内細菌により代謝される代謝基質物質と、を培地中で培養する培養ステップと、
培養後の培養液に含まれる代謝物を解析する解析ステップとを含むことを特徴とする、試験対象素材の評価方法。
［項目２］
前記代謝基質物質は、前記腸内細菌により代謝され、健康状態に悪影響を及ぼすことを特徴とする、項目１に記載の評価方法。
［項目３］
前記代謝基質物質は、少なくとも胆汁酸を含む、項目１に記載の評価方法。
［項目４］
前記代謝基質物質は、少なくともコリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、ヒスチジン、フェニルアラニンから選ばれる少なくとも１つを含む、項目１に記載の評価方法。
［項目５］
前記代謝基質物質は、コリン、カルニチンから選ばれる少なくとも１つと、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸から選ばれる少なくとも１つを少なくとも含む、項目２に記載の評価方法。
［項目６］
前記代謝基質物質は、少なくともコリン、カルニチン、グリココール酸、及びタウロコール酸を含む、項目３に記載の評価方法。
［項目７］
腸内細菌叢の類似度の指標に基づいて、複数の前記便検体の組合せを選択する便検体選択ステップをさらに備える、項目１～６のいずれかに記載の評価方法。
［項目８］
前記便検体選択ステップは、異なるエンテロタイプの前記便検体が含まれるように前記ヒト便検体の組合わせを選択する、項目７に記載の評価方法。
［項目９］
前記便検体選択ステップは、全てのペアのWeighted UniFrac distanceがいずれも０．３以上になるように前記便検体の組合わせを選択する、項目７に記載の評価方法。
［項目１０］
前記便検体選択ステップは、異なるエンテロタイプに属する便検体のペアのWeighted UniFrac distanceがいずれも０．４以上になるように前記便検体の組合わせを選択する、項目７に記載の評価方法。
［項目１１］
前記培地には、炭素源材料が添加されていないことを特徴とする、項目１～１０のいずれかに記載の評価方法。
［項目１２］
腸内細菌の培養が可能な培地と、前記腸内細菌により代謝される代謝基質物質とを含むことを特徴とする、試験対象素材の作用を評価するための評価用培地。The contents of the embodiments of the present invention will be described in a list. The present invention has the following configurations.
[Item 1]
A stool sample containing one or more intestinal bacteria and
The material to be tested and
A culture step of culturing a metabolic substrate substance metabolized by the intestinal bacteria in a medium, and
A method for evaluating a material to be tested, which comprises an analysis step for analyzing metabolites contained in a culture solution after culturing.
[Item 2]
The evaluation method according to
[Item 3]
The evaluation method according to
[Item 4]
The evaluation method according to
[Item 5]
The evaluation method according to
[Item 6]
[Item 7]
The evaluation method according to any one of
[Item 8]
The evaluation method according to
[Item 9]
The evaluation method according to
[Item 10]
The evaluation method according to
[Item 11]
The evaluation method according to any one of
[Item 12]
An evaluation medium for evaluating the action of a material to be tested, which comprises a medium capable of culturing intestinal bacteria and a metabolic substrate substance metabolized by the intestinal bacteria.
図１に、本実施の形態における評価方法の概要を示す。本評価方法では、嫌気培養システムを用い、便懸濁液と試験対象素材とを混合した便-試験対象素材混合液を培養し、無添加での培養と比較して細菌叢・代謝物質のプロファイルがどのように変動したか解析を行う。 FIG. 1 shows an outline of the evaluation method in the present embodiment. In this evaluation method, a stool-test material mixture in which a stool suspension and a test target material are mixed is cultured using an anaerobic culture system, and the profile of the bacterial flora and metabolites is compared with the culture without additives. Analyze how the fluctuations occurred.
本実施の形態において試験対象素材とは、動物の腸内環境に作用する可能性のある素材であれば特に制限はなく、食品、食品由来の生理活性物質、食品添加物、飲料、微生物（細菌、真菌等。死菌体や菌体由来の抽出物も含む）、医薬品、医薬品に準ずる化合物、及びこれらの混合物であってよい。 In the present embodiment, the test target material is not particularly limited as long as it is a material that may act on the intestinal environment of the animal, and is food, a bioactive substance derived from food, a food additive, a beverage, and a microorganism (bacteria). , Fungi, etc., including dead cells and extracts derived from the cells), pharmaceuticals, compounds equivalent to pharmaceuticals, and mixtures thereof.
本実施形態における培地には、代謝基質物質の少なくとも一つを含む。代謝基質物質とは、ヒトの腸内細菌により代謝されうる基質物質である。特に、ヒトの腸内細菌により代謝されることによって腸内環境や健康に有害な物質を生成するなど、健康状態に悪影響を及ぼす代謝基質物質を使用することができる。これらの代謝基質物質として、コリン、カルニチン、ヒトが分泌する抱合胆汁酸（グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸）、ヒスチジン、フェニルアラニン等を使用することができる。 The medium in this embodiment contains at least one of the metabolic substrate substances. A metabolic substrate substance is a substrate substance that can be metabolized by human intestinal bacteria. In particular, it is possible to use a metabolic substrate substance that adversely affects the health condition, such as producing a substance harmful to the intestinal environment and health by being metabolized by human intestinal bacteria. As these metabolic substrate substances, choline, carnitine, conjugated bile acid (glycolic acid, taurocholic acid, glycokenodeoxycholic acid, taurokenodeoxycholic acid), histidine, phenylalanine and the like secreted by humans can be used.
なお、コリンやカルニチンは、腸内細菌により代謝されるとトリメチルアミンとなるが、トリメチルアミンは、門脈を介して肝臓に運ばれ、肝酵素フラビン・モノオキシゲナーゼ3（FMO3）により酸化されトリメチルアミンＮオキシド（TMAO）となり血液中を循環する。血液中を循環するTMAOは、動脈硬化進展にかかわるマクロファージの泡沫化を促進することが知られている。また、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸などの胆汁酸は、腸内細菌によりデオキシコール酸やリトコール酸などの二次胆汁酸へと変換される。二次胆汁酸には、大腸がん促進作用や細胞障害作用が報告されている。ヒスチジンは、腸内細菌により代謝され、イミダゾールプロピオン酸となる。イミダゾールプロピオン酸はインスリンシグナル伝達を阻害することで耐糖能の悪化につながることが報告されている。フェニルアラニンも腸内細菌により代謝されフェニル酢酸となり、門脈を介して肝臓に運ばれ、肝臓のアミノ基転移酵素によりフェニルアセチルグルタミンやフェニルアセチルグリシンとなる。これらは血液中を循環し、血小板に作用することで血栓症や動脈硬化、心不全を引き起こすことが報告されている。 Choline and carnitine become trimethylamine when metabolized by intestinal bacteria, but trimethylamine is carried to the liver via the portal vein and oxidized by the liver enzyme flavin monooxygenase 3 (FMO3) to trimethylamine N oxide (trimethylamine N oxide). It becomes TMAO) and circulates in the blood. TMAO circulating in the blood is known to promote foaming of macrophages involved in the development of arteriosclerosis. In addition, bile acids such as glycocholic acid, taurocholic acid, glycokenodeoxycholic acid, and taurokenodeoxycholic acid are converted into secondary bile acids such as deoxycholic acid and lithocolic acid by intestinal bacteria. Secondary bile acids have been reported to have colorectal cancer promoting effects and cytotoxic effects. Histidine is metabolized by gut bacteria to imidazole propionic acid. It has been reported that imidazole propionic acid inhibits insulin signaling, leading to impaired glucose tolerance. Phenylalanine is also metabolized by intestinal bacteria to phenylacetic acid, which is transported to the liver via the portal vein and becomes phenylacetylglutamine and phenylacetylglycine by the liver's transaminase. It has been reported that these circulate in the blood and act on platelets to cause thrombosis, arteriosclerosis, and heart failure.
本実施の形態において、代謝基質物質として特にコリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、ヒスチジン、フェニルアラニンから選ばれる少なくとも１つを含んでいることが好ましい。また、コリン、カルニチンの少なくともいずれか、及び、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸から選ばれる少なくともいずれか、の少なくとも２種を含むことがより好ましく、コリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸を含むことが特に好ましい。 In the present embodiment, it is preferable that the metabolic substrate substance contains at least one selected from choline, carnitine, glycocholic acid, taurocholic acid, glycokenodeoxycholic acid, taurokenodeoxycholic acid, histidine, and phenylalanine. Further, it is more preferable to contain at least one of choline and carnitine, and at least two kinds selected from glycocholic acid, taurocholic acid, glycokenodeoxycholic acid and taurocholic acid, and more preferably, choline, carnitine and glycocol. It is particularly preferable to contain an acid and taurocholic acid.
また、代謝基質物質として、腸内細菌により代謝されることによって腸内環境や健康に良い効果をもたらす物質を生成する代謝基質物質を使用することもできる。例えば、食物繊維やオリゴ糖等を使用することもできる。 Further, as the metabolic substrate substance, a metabolic substrate substance that produces a substance that has a positive effect on the intestinal environment and health by being metabolized by the intestinal bacteria can also be used. For example, dietary fiber, oligosaccharides and the like can also be used.
培地は、腸内細菌が増殖可能な培地であれば特に制限はない。例えば、ＹＣＦＡ培地やＧＡＭ培地、ＢＢＬ培地、ＳＯＣ培地、ＬＢ培地などの培地を使用可能であり、これらの既知の培地を改変した培地、混合した培地を使用することができる。また、特定の腸内細菌に対する影響や、特定の腸内細菌による代謝基質物質の代謝を評価するために、選択培地を用いることや、培地に抗生物質等を混合し、一部の腸内細菌のみが増殖できる状況で試験を行うこともできる。本実施の形態において、培地に炭素源材料を添加しないことが好ましい。炭素源材料として特にグルコースを添加しないこととすることが好ましい。ここで「炭素源材料」とは、酵母抽出物などの炭素源を含む混合物とは区別する意図で、通常炭素源を培地に含ませることを主目的として使用する材料を指し、代表的にはグルコース、フルクトース、ガラクトース、マルトースなどの糖源材料である。炭素源材料を添加しないことによって、試験対象素材による腸内細菌叢の増減に対する影響を確認しやすくすることができる。 The medium is not particularly limited as long as it is a medium in which intestinal bacteria can grow. For example, a medium such as YCFA medium, GAM medium, BBL medium, SOC medium, or LB medium can be used, and a modified medium or a mixed medium of these known media can be used. In addition, in order to evaluate the effect on specific intestinal bacteria and the metabolism of metabolic substrate substances by specific intestinal bacteria, a selective medium may be used, or antibiotics may be mixed with the medium to evaluate some intestinal bacteria. The test can also be performed in situations where only can grow. In this embodiment, it is preferable not to add the carbon source material to the medium. It is preferable not to add glucose as a carbon source material. Here, "carbon source material" refers to a material that is usually used mainly for the purpose of including a carbon source in a medium with the intention of distinguishing it from a mixture containing a carbon source such as yeast extract, and is typically used. It is a sugar source material such as glucose, fructose, galactose, and maltose. By not adding the carbon source material, it is possible to easily confirm the effect of the material under test on the increase or decrease of the intestinal bacterial flora.
便検体は、ヒトの便であってもよいし、ヒト以外の動物の便検体であってもよい。また、便検体は新鮮便であってもよいし、採便後に冷凍保存した冷凍便であってもよい。便の濃度は、試験対象素材を添加する前の便懸濁液の段階で０．０１% (w/v)～５０% (w/v)とすることができる。便が多すぎると便中の腸内細菌以外の成分（ヒト細胞や食物残渣等）による影響が生じることや、細菌数過多により培地中の栄養源が速やかに枯渇して培養が不十分になることで適切な培養が実施できない点で好ましくなく、また少なすぎると試験対象素材の添加効果を検証できない。また、便検体の代わりに、１以上の特定の腸内細菌を用いてもよい。 The stool sample may be a human stool or a stool sample of a non-human animal. Further, the stool sample may be fresh stool or frozen stool that has been frozen and stored after stool collection. The stool concentration can be 0.01% (w / v) -50% (w / v) at the stage of the stool suspension prior to the addition of the material under test. If there are too many stools, the effects of components other than intestinal bacteria (human cells, food residues, etc.) in the stool will occur, and if the number of bacteria is excessive, the nutrient sources in the medium will be rapidly depleted and the culture will be insufficient. Therefore, it is not preferable in that proper culture cannot be carried out, and if the amount is too small, the effect of adding the test material cannot be verified. Further, one or more specific intestinal bacteria may be used instead of the stool sample.
本実施の形態において、複数の個体から採取した便検体をそれぞれ用いることが好ましい。腸内細菌叢の構成は個体によって異なることから、単一の便サンプルを用いた試験では、当該試験の結果が実際の介入試験における１症例の模倣に過ぎず、試験対象素材の腸内細菌叢に対する影響を十分に評価することができるとは言えない。したがって、多様な便サンプルを用いることが重要であると考えられる。特に、腸内細菌叢の類似性の低い便検体を複数用いて試験を行うことによって、腸内細菌叢の違いによる試験対象素材の作用の違いを検証することができる。本実施の形態の評価方法においては、腸内細菌叢の類似性の指標に基づいて、使用する便検体の組み合わせを選定するステップを備えることができる。腸内細菌叢の類似性の指標としては例えば、腸内細菌叢エンテロタイプの考え方を採用することができる。腸内細菌叢エンテロタイプは、一般的にBacteroidesエンテロタイプ・Prevotellaエンテロタイプ・Ruminococcusエンテロタイプに分類される。一例として、異なるエンテロタイプに分類される便検体を２以上使用することが好ましく、これらの３つのエンテロタイプに属する便検体をそれぞれ１つ以上使用することがより好ましい。日本人の腸内環境における試験対象素材の作用を評価する場合の好適例として、Bacteroidesエンテロタイプ・Prevotellaエンテロタイプ・Ruminococcusエンテロタイプの3タイプが日本人における割合（3:2:1）となるように試験を実施することができる。当該割合で試験を実施することで、試験対象素材を広く日本人に適用した場合の効果を知ることができる。 In this embodiment, it is preferable to use stool samples collected from a plurality of individuals. Since the composition of the intestinal flora varies from individual to individual, in a test using a single stool sample, the result of the test is only a copy of one case in the actual intervention test, and the intestinal flora of the test material is the intestinal flora. It cannot be said that the effect on the disease can be fully evaluated. Therefore, it is important to use a variety of stool samples. In particular, by conducting a test using a plurality of stool samples having low similarity in the intestinal bacterial flora, it is possible to verify the difference in the action of the test target material due to the difference in the intestinal bacterial flora. The evaluation method of the present embodiment can include a step of selecting a combination of stool samples to be used based on an index of similarity of the intestinal flora. As an index of the similarity of the intestinal bacterial flora, for example, the idea of the enterobacterial flora enterotype can be adopted. The enterobacterial flora enterotype is generally classified into Bacteroides enterotype, Prevotella enterotype, and Ruminococcus enterotype. As an example, it is preferable to use two or more stool samples classified into different enterotypes, and it is more preferable to use one or more stool samples belonging to each of these three enterotypes. As a suitable example for evaluating the action of the test material in the Japanese intestinal environment, the ratio of Bacteroides enterotype, Prevotella enterotype, and Ruminococcus enterotype should be the ratio in Japanese (3: 2: 1). The test can be carried out. By conducting the test at this ratio, it is possible to know the effect when the test target material is widely applied to Japanese people.
また、腸内細菌叢プロファイルの違いを距離として計算した値であるUniFrac distanceの値を指標とすることもできる。例えば、細菌の種類および各細菌の存在比を考慮したWeighted UniFrac distanceの最小値が一定以上である便検体の組み合わせを使用することができる。例えば、過去に臨床試験で得た日本人の便検体から無作為に６人分を選び、それらのWeighted UniFrac distanceの最小値を選択する工程を１００回行い、それらの平均値を算出したところ、０．３であった。したがって、使用する便検体について、全てのペアのWeighted UniFrac distanceがいずれも０．３以上の便検体の組み合わせを使用すると好適であり、０．３５以上の便検体の組み合わせを使用するとより好適である。また、使用する便検体のうち、異なるエンテロタイプに属する便検体のペアのWeighted UniFrac distanceの最小値が一定以上である便検体の組み合わせを使用することもできる。この場合は、異なるエンテロタイプに属する便検体のWeighted UniFrac distanceの最小値が０．４０以上である便検体の組み合わせを使用すると好適であり、０．４２以上である便検体の組み合わせを使用するとさらに好適である。 In addition, the value of UniFrac distance, which is a value calculated by using the difference in the intestinal flora profile as the distance, can be used as an index. For example, a combination of stool samples having a minimum weighted UniFrac distance of a certain value or more in consideration of the type of bacteria and the abundance ratio of each bacterium can be used. For example, 6 people were randomly selected from Japanese stool samples obtained in clinical trials in the past, and the process of selecting the minimum value of their Weighted UniFrac distance was performed 100 times, and the average value was calculated. It was 0.3. Therefore, it is preferable to use a combination of stool samples having a Weighted UniFrac distance of 0.3 or more for all pairs of stool samples to be used, and it is more preferable to use a combination of stool samples having a weighted UniFrac distance of 0.35 or more. .. Further, among the stool samples to be used, a combination of stool samples in which the minimum value of the Weighted UniFrac distance of the pair of stool samples belonging to different enterotypes is equal to or more than a certain value can also be used. In this case, it is preferable to use a combination of stool samples having a minimum Weighted UniFrac distance of 0.40 or more for stool samples belonging to different enterotypes, and further using a combination of stool samples having a weighted UniFrac distance of 0.42 or more. Suitable.
本試験の方法について説明する。まず、試験対象素材を水等の溶媒で溶かし、あらかじめ嫌気チャンバー内で気相を置換しておいたチューブなどに、所定の孔径のフィルターを通して移す。溶解しきらない素材は、所定の孔径のフィルターを通した溶媒で懸濁することができる。溶媒は、ｐＨを４．0～５．５に調整して使用することができる。試験対象素材の終濃度（培地添加後）は、０．０１% (w/v)～５．０% (w/v)程度とすることができる。０．０１% (w/v)未満であると素材の効果を測定することが困難であり、５．０％(w/v)より大きいと腸内細菌の適切な増殖を妨げる恐れがある。特に０．１～０．５% (w/v)とすることが好適である。 The method of this test will be described. First, the material to be tested is dissolved in a solvent such as water, and the material is transferred to a tube or the like whose gas phase has been replaced in advance in an anaerobic chamber through a filter having a predetermined pore size. The insoluble material can be suspended in a solvent that has passed through a filter having a predetermined pore size. The solvent can be used by adjusting the pH to 4.0 to 5.5. The final concentration of the test material (after adding the medium) can be about 0.01% (w / v) to 5.0% (w / v). If it is less than 0.01% (w / v), it is difficult to measure the effect of the material, and if it is more than 5.0% (w / v), it may hinder the proper growth of intestinal bacteria. In particular, it is preferably 0.1 to 0.5% (w / v).
次に、代謝基質物質を水などの溶媒に溶かし、適切な濃度になるように液体培地に添加して代謝基質物質混合液入り培地を調整する。各代謝基質物質の代謝基質物質混合液入り培地中の終濃度は、０．１μＭ～１００００μＭとすることができる。１００００μＭより多いと腸内細菌の生育を阻害するおそれがあり好ましくない。また、０．１μＭ未満であると培養後の代謝物の正確な分析が困難となる。特に、１μＭ以上、３μＭ以上、５μＭ以上、８μＭ以上、１０μＭ以上であると好適である。また、１０００μＭ以下、５００μＭ以下、１５０μＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下であると好適である。 Next, the metabolic substrate substance is dissolved in a solvent such as water and added to a liquid medium so as to have an appropriate concentration to prepare a medium containing a mixed solution of the metabolic substrate substance. The final concentration of each metabolic substrate substance in the medium containing the metabolic substrate substance mixed solution can be 0.1 μM to 10000 μM. If it is more than 10,000 μM, it may inhibit the growth of intestinal bacteria, which is not preferable. Further, if it is less than 0.1 μM, accurate analysis of metabolites after culturing becomes difficult. In particular, it is preferably 1 μM or more, 3 μM or more, 5 μM or more, 8 μM or more, and 10 μM or more. Further, it is preferably 1000 μM or less, 500 μM or less, 150 μM or less, 100 μM or less, and 50 μM or less.
嫌気チャンバー内で、あらかじめ気相を置換しておいたエッペンドルフチューブに規定量の便検体を量り取る。便検体は、上記で調整した代謝基質物質混合液入り培地で懸濁する。または、水や生理食塩水などで懸濁してもよい。当該便の懸濁液を代謝基質物質混合液入り培地に添加して攪拌し、便ジュースを作成する。 In the anaerobic chamber, weigh a specified amount of stool sample into an Eppendorf tube whose gas phase has been replaced in advance. The stool sample is suspended in the medium containing the metabolic substrate mixture prepared above. Alternatively, it may be suspended in water or physiological saline. The suspension of the stool is added to a medium containing a mixture of metabolic substrate substances and stirred to prepare stool juice.
最後に、上記で調製した試験対象素材と便ジュースとを所定量ずつ混合し、嫌気条件下で３７℃にて所定時間培養する。培養は、腸内細菌の対数増殖期中に終了することが好ましく、非連続培養の場合は例えば１２時間～２４時間とする。特に、培養時間を１６時間～２０時間とすることが好ましい。培養時間が長すぎると、腸内細菌の増殖が定常期に到達してしまい、試験対象素材による影響を正確に評価することができない場合がある。 Finally, the test target material prepared above and the stool juice are mixed in predetermined amounts and cultured at 37 ° C. for a predetermined time under anaerobic conditions. The culture is preferably terminated during the logarithmic growth phase of the gut microbiota, for example 12 to 24 hours in the case of discontinuous culture. In particular, the culture time is preferably 16 to 20 hours. If the culture time is too long, the growth of intestinal bacteria may reach a steady state, and it may not be possible to accurately evaluate the effect of the material under test.
本実施形態における培養は、非連続培養、連続培養のいずれにも適用することができる。非連続培養の場合は、例えば９６ウェルプレートを使用することができ、培養液の使用量が削減でき、設備も手軽である。 The culture in this embodiment can be applied to both discontinuous culture and continuous culture. In the case of discontinuous culture, for example, a 96-well plate can be used, the amount of culture medium used can be reduced, and the equipment is simple.
また、試験対象素材投入後の（培養開始時の）培地のｐＨは、５．０～９．０となるように調整することが好ましい。ｐＨが当該範囲外であると、腸内細菌の培養に悪影響が出る場合がある。試験対象素材のｐＨによって、必要に応じて素材投入前の培地のｐＨを調整する。酸性の素材を使用する場合、素材投入前の培地はｐＨ７．０～８．０程度に調整することができる。 Further, it is preferable to adjust the pH of the medium (at the start of culturing) after the test material is added so as to be 5.0 to 9.0. If the pH is outside the range, the culture of intestinal bacteria may be adversely affected. If necessary, adjust the pH of the medium before adding the material according to the pH of the material to be tested. When an acidic material is used, the pH of the medium before the material is added can be adjusted to about 7.0 to 8.0.
（実施例１）
まず、培養時間を最適化する目的で、以下の実験を行った。
Ａ．試験対象素材の調整
ドラフト内で所定の試験対象素材を９０ｍｇ量り取った。実施例１において、試験対象素材としてグルコースを用いた。なお、ネガティブコントロールとしてグルコースを添加しないものを作成した。嫌気チャンバー内で、量り取った試験対象素材をｐＨ４．５のPureWater １ｍＬで溶かした。あらかじめ嫌気チャンバー内で気相を置換しておいたチューブに、０．２２μｍのフィルターを通して移した。(Example 1)
First, the following experiments were conducted for the purpose of optimizing the culture time.
A. Adjustment of test target material 90 mg of the predetermined test target material was weighed in the draft. In Example 1, glucose was used as the test target material. As a negative control, a substance to which glucose was not added was prepared. In the anaerobic chamber, the weighed test material was dissolved in 1 mL of Pure Water at pH 4.5. It was transferred through a 0.22 μm filter to a tube in which the gas phase had been replaced in advance in the anaerobic chamber.
B．培地の調整
ＹＣＦＡ培地の組成は以下のとおりである。（per liter）
trypticase (2.5 g), peptone (2.5 g), yeast extract(5 g), K2HPO4 (0.9 g), KH2PO4 (0.9 g), NaCl (1.8 g), NH4SO4 (1.8 g), CaCl2 2H2O (0.24 g), MgSO4 7H2O (0.375 g), potassiumacetate (1 g), sodium propionate (0.5 g), sodium n-butyrate (0.3g), valeric acid (0.1 g), isobutyrate (0.1 g), isovaleric acid (0.1g), 2-methyl butyrate (0.1 g), NH4Fe(III)-citrate (0.01 g), MnCl2(0.006 g), CoCl2 (0.002 g), NiCl2 (0.0004 g), (NH4)6(Mo7O24) 4H2O(0.0004 g), CuSO4 (0.00015 g), AlK(SO4)2 (0.0003 g), Na2B4O7(0.0003 g), ZnSO4 (0.002 g), Na2SeO3 (0.0003 g), pyridoxalphosphate (0.002 g), p-amino benzoate (0.0005 g), biotin (0.0002g), phenylpropionate (0.002 g), l-arginine (0.002 g), Panvitan(0.1 g), cysteine hydrochloride(1 g), resazurin (7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-one 10-oxide) (0.005 g), and vitamin K(0.001g).B. Medium preparation The composition of the YCFA medium is as follows. (Per liter)
trypticase (2.5 g), peptone (2.5 g), yeast extract (5 g), K 2 HPO 4 (0.9 g), KH 2 PO 4 (0.9 g), NaCl (1.8 g), NH 4 SO 4 (1.8 g) ), CaCl 2 2H 2 O (0.24 g), DDL 4 7H 2 O (0.375 g), potassiumacetate (1 g), sodium propionate (0.5 g), sodium n-butyrate (0.3 g), valeric acid (0.1 g) , isobutyrate (0.1 g), isovaleric acid (0.1 g), 2-methyl butyrate (0.1 g), NH 4 Fe (III) -citrate (0.01 g), MnCl 2 (0.006 g), CoCl 2 (0.002 g), NiCl 2 (0.0004 g), (NH 4 ) 6 (Mo 7 O 24 ) 4H 2 O (0.0004 g), CuSO 4 (0.00015 g), AlK (SO 4 ) 2 (0.0003 g), Na 2 B 4 O 7 (0.0003 g), ZnSO 4 (0.002 g), Na 2 SeO 3 (0.0003 g), pyridoxalphosphate (0.002 g), p-amino benzoate (0.0005 g), biotin (0.0002 g), phenylpropionate (0.002 g), l- arginine (0.002 g), Panvitan (0.1 g), cysteine hydrochloride (1 g), resazurin (7-hydroxy-3H-phenoxazin-3-one 10-oxide) (0.005 g), and vitamin K (0.001 g).
C．便ジュースの調整
嫌気チャンバー内で、あらかじめ気相を置換しておいたエッペンドルフチューブに便を１２ｍｇ量り取った。Bで調整したYCFA培地を５００μL入れ、ホモジナイズし、さらにYCFA培地を加えて便ジュースを作成した。便ジュースにおける便濃度は０．１% (w/v)となった。なお、実施例１では、異なる６人の健康な男女より採取した便（００１、１０１、００５、１０４、１０６、１０７）を使用した。C. Preparation of stool juice In an anaerobic chamber, 12 mg of stool was weighed into an Eppendorf tube whose gas phase had been replaced in advance. 500 μL of YCFA medium prepared in B was added, homogenized, and YCFA medium was further added to prepare stool juice. The stool concentration in stool juice was 0.1% (w / v). In Example 1, stools (001, 101, 005, 104, 106, 107) collected from 6 different healthy men and women were used.
D．培養
Ａで調整した試験対象素材１０μＬを９６wellプレートの各wellに添加した。
Cで調整した便ジュースを２９０μＬずつwellに添加した。
試験対象素材の終濃度は０．３% (w/v)となった。
嫌気チャンバー内の３７℃インキュベーターで培養した。D. 10 μL of the test material prepared in Culture A was added to each well of the 96 well plate.
290 μL of C-adjusted stool juice was added to the well.
The final concentration of the test material was 0.3% (w / v).
The cells were cultured in a 37 ° C. incubator in an anaerobic chamber.
本実施例１においては、培養時間をそれぞれ１６時間、２４時間、４０時間とし、濁度測定（ＯＤ600）を実施した。結果を図２（ａ）に示す。便検体ごとに６本の棒グラフが示されており、左から無添加（ネガティブコントロール）１６時間、無添加２４時間、無添加４０時間、グルコース（素材あり）１６時間、グルコース２４時間、グルコース４０時間、のＯＤ値を示している。当該結果から、いくつかのサンプルにおいて４０時間培養した場合のＯＤ値が、２４時間培養した場合のＯＤ値よりも小さいことが分かった。In Example 1, the culture time was 16 hours, 24 hours, and 40 hours, respectively, and the turbidity measurement (OD 600 ) was carried out. The results are shown in FIG. 2 (a). Six bar graphs are shown for each stool sample, from left to right: additive-free (negative control) 16 hours, additive-free 24 hours, additive-free 40 hours, glucose (with material) 16 hours,
次に、上記便検体のうち、００５、１０６について、培養時間を０時間、１６時間、３６時間、４８時間として上記と同様に培養を行い、ＯＤ値を測定した。結果を図２（ｂ）に示す。便検体ごとに３本の棒グラフが示されており（培養時間０時間の場合のＯＤ値はいずれも０であったため表示されていない）、左からＮ．Ｔ．（ネガティブコントロール）１６時間、Ｎ．Ｔ．３６時間、Ｎ．Ｔ．４８時間、グルコース（素材あり）１６時間、グルコース３６時間、グルコース４８時間、のＯＤ値を示している。当該結果から、３６時間培養した場合のＯＤ値が、１６時間培養した場合のＯＤ値よりも小さいことが分かった。 Next, among the above stool samples, 005 and 106 were cultured in the same manner as above with the culture times set to 0 hours, 16 hours, 36 hours, and 48 hours, and the OD value was measured. The results are shown in FIG. 2 (b). Three bar graphs are shown for each stool sample (the OD value was 0 when the culture time was 0 hours, so they are not displayed). T. (Negative control) 16 hours, N. T. 36 hours, N.M. T. The OD values of 48 hours, glucose (with material) 16 hours, glucose 36 hours, and glucose 48 hours are shown. From the results, it was found that the OD value after culturing for 36 hours was smaller than the OD value after culturing for 16 hours.
以上図２（ａ）、（ｂ）の結果から、本試験系において、培養２４時間までは、腸内細菌が対数増殖しており、培養３６時間を超えると対数増殖期を超えてしまう可能性が示された。したがって、培養時間を２４時間以下、若しくは２０時間以下、特に１６時間以下とすることによって、多くの腸内細菌が対数増殖期にある状態での試験が可能となるといえる。対数増殖期で培養を終了することによって、幅広い腸内細菌が活動状態にあるタイミングでの腸内細菌叢や代謝物の評価が可能となり、より実際のヒトの腸内環境を反映することができる。 From the results of FIGS. 2 (a) and 2 (b) above, in this test system, intestinal bacteria grow logarithmically up to 24 hours of culture, and if the culture exceeds 36 hours, the logarithmic growth phase may be exceeded. It has been shown. Therefore, it can be said that by setting the culture time to 24 hours or less, or 20 hours or less, particularly 16 hours or less, it is possible to carry out the test in a state where many intestinal bacteria are in the logarithmic growth phase. By terminating the culture in the logarithmic growth phase, it is possible to evaluate the intestinal flora and metabolites at the timing when a wide range of intestinal bacteria are active, and it is possible to more reflect the actual human intestinal environment. ..
（実施例２）
本実施例においては、代謝基質物質を添加し、その濃度範囲を検討する目的で、以下の実験を行った。本実施例においては、試験対象素材（グルコース）を添加しない点（すべて無添加）と、培地に代謝基質物質を添加し、代謝基質物質混合液入り培地を用いる点以外は、上記実施例１と同様に培養液を準備し、１６時間培養を行った。また、便検体としては、上記実施例１で用いた便検体のうち、１０４、１０６、１０７の便検体を用いた。(Example 2)
In this example, the following experiment was carried out for the purpose of adding a metabolic substrate substance and examining its concentration range. In this example, the same as in Example 1 above, except that the material to be tested (glucose) is not added (all are not added) and the medium containing the metabolic substrate substance is added to the medium and the medium containing the mixed solution of the metabolic substrate substance is used. Similarly, a culture medium was prepared and cultured for 16 hours. As the stool sample, 104, 106, and 107 stool samples were used from the stool samples used in Example 1 above.
E．代謝基質物質混合液の調整
代謝基質物質として、コリン、カルニチン、グリココール酸（Glycocholic acid; GCA）、タウロコール酸（Taurocholic acid; TCA）を用いた。各代謝基質物質について、３００ｍＭの水溶液を作成した。コリンとして塩化コリン（ナカライ）、カルニチンとしてＬ-Carnitine（東京化成工業）、グリココール酸としてSodium Glycocholate Hydrate（東京化成工業）、タウロコール酸としてTaurocholic acid sodium salt hydrate（ＳＩＧＭＡ）を使用した。作成した３００ｍＭのコリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸をそれぞれ１４μLずつエッペンドルフチューブに取り、１，３４４μLのPureWaterを入れ、３mMの代謝基質物質混合液 １．４ mLを作製した。
あらかじめチューブ内の空間を嫌気チャンバー内の気相に置換しておいた３０ｍLチューブに、１１．６mLのYCFA培地を分注し、３ｍＭの代謝基質物質混合液を４００μLずつ培地に添加した。各代謝基質物質の代謝基質物質混合液入り培地における終濃度はそれぞれ１００μＭとなった。E. Preparation of Metabolic Substrate Mixture As the metabolic substrate, choline, carnitine, glycocholic acid (GCA), and taurocholic acid (TCA) were used. A 300 mM aqueous solution was prepared for each metabolic substrate substance. Choline chloride (Nakarai) was used as choline, L-Carnitine (Tokyo Kasei Kogyo) was used as carnitine, Sodium Glycocholate Hydrate (Tokyo Kasei Kogyo) was used as glycocholic acid, and Taurocholic acid sodium salt hydrate (SIGMA) was used as taurocholic acid. The prepared 300 mM choline, carnitine, glycocholic acid, and taurocholic acid were taken in 14 μL each in an Eppendorf tube, 1,344 μL of Pure Water was added, and 1.4 mL of a 3 mM metabolic substrate mixture was prepared.
11.6 mL of YCFA medium was dispensed into a 30 mL tube in which the space inside the tube was replaced with the gas phase in the anaerobic chamber, and 400 μL of a 3 mM metabolic substrate mixture was added to the medium. The final concentration of each metabolic substrate substance in the medium containing the metabolic substrate substance mixture was 100 μM.
なお、本実施例においては、各代謝基質物質（コリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸）それぞれの終濃度が１μＭ、１０μＭ、１００μＭとなるように、前記Eで作成した３ｍＭの代謝基質物質混合液をYCFA培地で希釈し、代謝基質物質の濃度を変更した培養液を作成した。また、代謝基質物質が０μＭ（添加しない）培養液も用いた。 In this example, the 3 mM metabolic substrate substance mixture prepared in E above so that the final concentrations of each metabolic substrate substance (choline, carnitine, glycocholic acid, taurocholic acid) are 1 μM, 10 μM, and 100 μM. The solution was diluted with YCFA medium to prepare a culture solution in which the concentration of the metabolic substrate substance was changed. In addition, a culture solution containing 0 μM (not added) of the metabolic substrate substance was also used.
実施例１と同様に、便ジュースを作成する際に、代謝基質物質混合液入り培地を用いた。ただし、代謝基質物質が０μＭの培養液は、YCFA培地を用いて便ジュースを作成した。 Similar to Example 1, when preparing stool juice, a medium containing a mixed solution of metabolic substrate substances was used. However, for the culture solution having a metabolic substrate substance of 0 μM, stool juice was prepared using YCFA medium.
各培養液について１６時間培養後の各培養液のＯＤ値を測定した。結果を図３に示す。図３から、いずれのサンプルも培養後のＯＤ値が０．５以上に上昇していることから、代謝基質物質を添加したことによる腸内細菌の増殖への影響はほとんどないことがわかった。 For each culture solution, the OD value of each culture solution after culturing for 16 hours was measured. The results are shown in FIG. From FIG. 3, since the OD value after culturing increased to 0.5 or more in all the samples, it was found that the addition of the metabolic substrate substance had almost no effect on the growth of intestinal bacteria.
また、各サンプルの培養後の腸内細菌叢の属組成を図４に示す。図４（ａ）が便検体１０４、図４（ｂ）が便検体１０６、図４（ｃ）が便検体１０７の結果であり、それぞれ上からＭｉｘ０（代謝基質物質０μＭ）、Ｍｉｘ１（代謝基質物質１μＭ）、Ｍｉｘ１０（代謝基質物質１０μＭ）、Ｍｉｘ１００（代謝基質物質１００μＭ）を３サンプルずつ培養した結果を示している。図４（ｄ）は、図４（ａ）～（ｃ）の凡例を示している。また、図５（ａ）、（ｂ）は、各サンプル間の距離情報のマトリックスを２次元に落とした主座標分析の結果である。図５から、代謝基質物質を０～１００μＭに変化させた場合においても、便検体ごとに同じクラスターを形成することがわかる。図４、５の結果から、代謝基質物質を０～１００μＭ添加した場合でも、もともとの個人ごとの腸内細菌叢の特徴を超越するような変化は起こらないことが示された。
In addition, the genus composition of the intestinal flora after culturing each sample is shown in FIG. FIG. 4 (a) shows the results of the
（実施例３）
次に、ＹＣＦＡ培地以外の培地の有用性について確認するために以下の実験を行った。
試験対象素材（グルコース）を添加しない点（すべて無添加）と、培地の組成を以下のとおり変更した以外は、上記実施例１と同様に培養液を準備し、１６時間培養を行った。なお、実施例２と同様に、代謝基質物質混合液入り培地を用い、各代謝基質物質の終濃度はそれぞれ１００μＭとした。また、便検体としては、上記実施例１で用いた便検体と同じ６者（００１、１０１、１０２、１０４、１０６、１０７）の便を用いた。(Example 3)
Next, the following experiment was performed to confirm the usefulness of the medium other than the YCFA medium.
A culture solution was prepared and cultured for 16 hours in the same manner as in Example 1 above, except that the material to be tested (glucose) was not added (all were not added) and the composition of the medium was changed as follows. As in Example 2, a medium containing a mixed solution of metabolic substrate substances was used, and the final concentration of each metabolic substrate substance was set to 100 μM. As the stool sample, the same stools of 6 persons (001, 101, 102, 104, 106, 107) as the stool sample used in Example 1 were used.
各サンプルの培地組成は以下のとおりである。
サンプル名「non」：ＹＣＦＡ培地１００％
サンプル名「０．３ＧＡＭ」：ＹＣＦＡ培地９９．７％＋ＧＡＭ培地０．３％
サンプル名「３ＧＡＭ」：ＹＣＦＡ培地９７％＋ＧＡＭ培地３％
サンプル名「１０ＧＡＭ」：ＹＣＦＡ培地９０％＋ＧＡＭ培地１０％
サンプル名「３０ＧＡＭ」：ＹＣＦＡ培地７０％＋ＧＡＭ培地３０％
サンプル名「ＧＡＭ」：ＧＡＭ培地１００％
なお、ＹＣＦＡ培地は、実施例１と同様の組成である。ＧＡＭ培地の組成は以下のとおりである。59.0g（1L分）中：ペプトン10.0g、ダイズペプトン3.0g、プロテオーゼペプトン10.0g、消化血清末13.5g、酵母エキス5.0g、肉エキス2.2g、肝臓エキス1.2g、ブドウ糖3.0g、リン酸二水素カリウム2.5g、塩化ナトリウム3.0g、溶性デンプン5.0g、L-システイン塩酸塩0.3g、チオグリコール酸ナトリウム0.3gThe medium composition of each sample is as follows.
Sample name "non": 100% YCFA medium
Sample name "0.3GAM": YCFA medium 99.7% + GAM medium 0.3%
Sample name "3GAM": YCFA medium 97% + GAM medium 3%
Sample name "10GAM": YCFA medium 90% + GAM medium 10%
Sample name "30GAM": YCFA medium 70% + GAM medium 30%
Sample name "GAM": 100% GAM medium
The YCFA medium has the same composition as that of Example 1. The composition of the GAM medium is as follows. In 59.0g (1L): Peptone 10.0g, Sodium Peptone 3.0g, Proteose Peptone 10.0g, Digested serum powder 13.5g, Yeast extract 5.0g, Meat extract 2.2g, Liver extract 1.2g, Glucose 3.0g, Phosphoric acid Potassium dihydrogen 2.5g, sodium chloride 3.0g, soluble starch 5.0g, L-cysteine hydrochloride 0.3g, sodium thioglycolate 0.3g
各培養液について１６時間培養後の各培養液のＯＤ値を測定した。結果を図６に示す。図６から、いずれのサンプルも培養後のＯＤ値が０．５付近まで上昇していることから、ＹＣＦＡ培地、ＧＡＭ培地、及びこれらの混合培地のいずれを用いても腸内細菌の増殖への影響はほとんどないことがわかった。 For each culture solution, the OD value of each culture solution after culturing for 16 hours was measured. The results are shown in FIG. From FIG. 6, since the OD value after culturing of each sample increased to around 0.5, any of the YCFA medium, the GAM medium, and a mixed medium thereof was used for the growth of intestinal bacteria. It turned out to have little effect.
（実施例４）
次に、便検体の保存条件を検証するために以下の実験を行った。
試験対象素材（ファイバリクサ：Ｆｉｂ）を添加した点と、使用する便検体の状態を以下のとおりとした以外は、上記実施例３（ＹＣＦＡ培地１００％）と同様に培養液を準備し、１６時間培養を行った。また、ネガティブコントロールとして、試験対象素材を添加しない無添加（Ｎｏｎ）サンプルを作成した。また、便検体としては、上記実施例１で用いた便検体のうち、３者（１０４、１０６、１０７）の便を用いた。
・０ｈ－ＲＴ：便を採便後すぐに試験に使用
・７ｄ－ｆｒｏｚｅｎ：便を冷凍庫（－８０℃）で７日間静置してから使用
・７ｄ－ＲＴ：便を常温で７日間静置してから使用(Example 4)
Next, the following experiment was conducted to verify the storage conditions of the stool sample.
A culture solution was prepared in the same manner as in Example 3 (YCFA medium 100%) above for 16 hours, except that the material to be tested (fiber lixa: Fib) was added and the condition of the stool sample to be used was as follows. Culturing was performed. In addition, as a negative control, an additive-free (Non) sample to which the test target material was not added was prepared. As the stool sample, the stools of three persons (104, 106, 107) among the stool samples used in Example 1 above were used.
・ 0h-RT: Use the stool for the test immediately after collecting the stool ・ 7d-frozen: Use the stool after leaving it in the freezer (-80 ℃) for 7 days ・ 7d-RT: Let the stool stand at room temperature for 7 days And then use
培養後の腸内細菌叢の属組成を図７に示す。左から、０ｈ－ＲＴ、７ｄ－ｆｒｏｚｅｎ、７ｄ－ＲＴの便を使用したサンプルの結果を３反復ずつ表示し、冷凍又は常温で７日間静置してから試験した場合に、便を採便後すぐに試験に使用（０ｈ－ＲＴ）した場合と比較して、腸内細菌の属組成がどのように変化するかを示している。また、図８は、７ｄ－ｆｒｏｚｅｎ（７ｄ－ｆｒｄ）、７ｄ－ＲＴの腸内細菌の属組成が０ｈ－ＲＴのものとどのくらい類似しているかをスピアマン距離（1からスピアマン相関係数を引いたもの）で示したグラフである。したがって、スピアマン距離が0である場合に、０ｈ－ＲＴの細菌叢組成と全く同じであることを示し、棒グラフの高さが低いほど０ｈ－ＲＴと似ている、ということを意味する。３反復の平均値を棒グラフの高さで、また標準偏差をひげのながさで示した。図８（ａ）は、試験対象素材を添加しない無添加（Ｎｏｎ）サンプルの結果であり、図８（ｂ）は、ファイバリクサを添加したサンプルの結果である。以上の結果から、７ｄ－ｆｒｏｚｅｎの細菌叢組成は、７ｄ－ＲＴのものと比べて、０ｈ－ＲＴの細菌叢組成に近いことが分かった。図７、８の結果から、冷凍保存した便も、便を採便後すぐに試験に使用した場合と細菌叢組成において大きな違いは見られなかったため、本発明の試験に使用可能であるといえる。 The genus composition of the intestinal flora after culturing is shown in FIG. From the left, the results of samples using 0h-RT, 7d-frozen, and 7d-RT stools are displayed three times each, and when the test is performed after freezing or allowing to stand at room temperature for 7 days, after stool collection. It shows how the genus composition of gut microbiota changes as compared to the case of immediate use in the test (0h-RT). In addition, FIG. 8 shows how similar the genus composition of the intestinal bacteria of 7d-frozen (7d-frd) and 7d-RT to that of 0h-RT is the Spearman distance (1 minus the Spearman correlation coefficient). It is a graph shown in (things). Therefore, when the Spearman distance is 0, it means that it is exactly the same as the bacterial flora composition of 0h-RT, and the lower the height of the bar graph, the more similar it is to 0h-RT. The mean value of the three iterations is shown by the height of the bar graph, and the standard deviation is shown by the length of the whiskers. FIG. 8 (a) is the result of the additive-free (Non) sample to which the material to be tested is not added, and FIG. 8 (b) is the result of the sample to which the fiber lixa was added. From the above results, it was found that the bacterial plexus composition of 7d-frozen was closer to that of 0h-RT than that of 7d-RT. From the results shown in FIGS. 7 and 8, it can be said that the frozen-preserved stool can also be used in the test of the present invention because no significant difference was observed in the bacterial flora composition from the case where the stool was used for the test immediately after the stool was collected. ..
（実施例５）
実施例５では、試験対象素材として４種類の食物繊維を用いて、複数の試験対象素材を並列に比較可能か否か評価を行った。試験対象素材として食物繊維を用いる点と、使用する便検体の状態を以下のとおりとした以外は、上記実施例３（ＹＣＦＡ培地１００％）と同様に培養液を準備し、１６時間培養を行った。(Example 5)
In Example 5, four types of dietary fiber were used as the test target material, and it was evaluated whether or not a plurality of test target materials could be compared in parallel. A culture solution was prepared and cultured for 16 hours in the same manner as in Example 3 (YCFA medium 100%) above, except that dietary fiber was used as the test target material and the condition of the stool sample to be used was as follows. rice field.
本実施例における試験対象素材は以下のとおりとした。なお、ポジティブコントロールとしてグルコース、比較対象として何も溶解していない酸素除去済み超純水を添加した無添加サンプルを解析した。
・チコリ由来イヌリン：Ｃｈｉ（直鎖イヌリン）
・アガベ由来イヌリン：Ａｇａ（分岐鎖イヌリン）
・合成イヌリン：Ｓｙｎ（合成イヌリン）
・難消化性デキストリン：ｄｅｘThe test target materials in this example are as follows. In addition, glucose was added as a positive control, and an additive-free sample to which oxygen-removed ultrapure water in which nothing was dissolved was added was analyzed as a comparison target.
・ Chicory-derived inulin: Chi (linear inulin)
・ Agave-derived inulin: Aga (branched chain inulin)
-Synthetic inulin: Syn (synthetic inulin)
・ Indigestible dextrin: dex
本実施例で用いた便検体について以下説明する。本実施例においては、6名の健康な男女より採取した便を使用して便懸濁液を調製した（００１、１０１、１０２、１０４、１０６、１０７）。本試験では異なる腸内環境を想定して試験化合物の影響を検証するため、過去の調査より予め腸内細菌叢が判明している被験者の中から比較的細菌叢プロファイルの異なる6名の便を供試した。腸内細菌叢エンテロタイプ(Arumugam, M. et al. 2011)においては、Bacteroidesエンテロタイプ・Prevotellaエンテロタイプ・Ruminococcusエンテロタイプの3タイプが日本人におけるおおよその割合（3:2:1）となるように試験を実施した。 The stool sample used in this example will be described below. In this example, stool suspensions were prepared using stools collected from 6 healthy men and women (001, 101, 102, 104, 106, 107). In this study, in order to verify the effects of the test compounds assuming different intestinal environments, 6 stools with relatively different bacterial plexus profiles were selected from the subjects whose intestinal plexus was known in advance from past surveys. I tried it. In the intestinal flora enterotype (Arumugam, M. et al. 2011), the three types of Bacteroides enterotype, Prevotella enterotype, and Ruminococcus enterotype are approximately the ratio (3: 2: 1) in Japanese. The test was carried out in.
本試験で使用した便検体の細菌叢とエンテロタイプを図９に示す。図９（ａ）は、未培養の便検体における細菌叢の属組成である。全体像における合計組成比が多い20属を色分けし、その他の属を「Others」とした。「Unassigned」は、リファレンスとして使用したSILVAデータベースに登録されている16Sリファレンス配列のうち、属名および科名が登録されていないリファレンス配列を示す。図９（ｂ）は、各便検体のエンテロタイプ分類である。白抜きのプロットが本試験で使用した便検体を表している。００１、１０１はRuminococcusエンテロタイプ、１０２、１０６、１０７はBacteroidesエンテロタイプ、１０４はPrevotellaエンテロタイプである。また、これらの便検体の全てのペアのWeighted UniFrac distanceのうち、最小の値は０．４であった。また、これらの便検体のうち、異なるエンテロタイプに属する便検体間のWeighted UniFrac distanceの最小値は、０．４４６であった。 The bacterial flora and enterotype of the stool sample used in this test are shown in FIG. FIG. 9 (a) shows the genus composition of the bacterial flora in an uncultured stool sample. The 20 genera with the highest total composition ratio in the overall picture were color-coded, and the other genera were designated as "Others". "Unassigned" indicates a reference sequence in which the genus name and family name are not registered among the 16S reference sequences registered in the SILVA database used as a reference. FIG. 9B is an enterotype classification of each stool sample. The white plot shows the stool sample used in this study. 001 and 101 are Ruminococcus enterotypes, 102, 106 and 107 are Bacteroides enterotypes, and 104 are Prevotella enterotypes. In addition, the minimum value among the Weighted UniFrac distances of all pairs of these stool samples was 0.4. Among these stool samples, the minimum value of Weighted UniFrac distance between stool samples belonging to different enterotypes was 0.446.
培養後、ピペッティングし、培養液をスクリューチューブに抜き取った。培養液を遠心分離し、上清をエッペンドルフチューブに移し入れた。ペレットが残ったチューブには、０．１ｍｍジルコニア／シリカビーズを入れた。 After culturing, pipetting was performed and the culture broth was withdrawn into a screw tube. The culture was centrifuged and the supernatant was transferred to an Eppendorf tube. 0.1 mm zirconia / silica beads were placed in the tube in which the pellets remained.
・マイクロバイオーム解析
実施例５における細菌系統組成を明らかにするため、未培養便および培養後の便-試験化合物混合液に対する16S rRNA遺伝子配列を用いたメタゲノム解析を行った。メタゲノム解析はMurakamiら（2015）の方法に従った。まず便および便-試験化合物混合液の遠心ペレットから抽出したDNAを鋳型として、16S rRNA遺伝子のV1-V2領域のDNA断片をPCRにて増幅し、続いてPCR産物の配列をIllumina MiSeqを用いたペアエンド法により解析した。これらの塩基配列をbowtie2により16S rRNA遺伝子のデータベースに対してマッピングした。16S rRNA遺伝子のデータベースには、silva（https://www.arb-silva.de）が提供するSILVA SSU Refを99%の閾値でクラスタリングして得られたOTUを用いた（以下、SILVAデータベースと記載）。上記マッピングにより、各塩基配列はSILVAデータベース内で最も類似しているOTUに帰属され、各OTUに帰属した（マップされた）塩基配列数を数えることで、腸内細菌叢の細菌系統組成を定量化した。-Microbiota analysis In order to clarify the bacterial lineage composition in Example 5, metagenomic analysis was performed using 16S rRNA gene sequences for uncultured stool and post-cultured stool-test compound mixture. Metagenomic analysis followed the method of Murakami et al. (2015). First, using the DNA extracted from the centrifugal pellet of the stool and stool-test compound mixture as a template, the DNA fragment of the V1-V2 region of the 16S rRNA gene was amplified by PCR, and then the sequence of the PCR product was sequenced using Illumina MiSeq. It was analyzed by the pair-end method. These sequences were mapped to the 16S rRNA gene database by bowtie2. For the 16S rRNA gene database, OTU obtained by clustering SILVA SSU Ref provided by silva (https://www.arb-silva.de) with a threshold of 99% was used (hereinafter referred to as SILVA database). description). By the above mapping, each base sequence is assigned to the most similar OTU in the SILVA database, and the bacterial lineage composition of the intestinal flora is quantified by counting the number of (mapped) base sequences assigned to each OTU. It became.
算出された各腸内細菌属の存在量をもとに、無添加と比較した特定の試験対象素材を添加した際の存在量の対数変化倍率（log fold change, logFC）を算出した。Wilcoxonの符号順位検定（対応ありノンパラメトリック二群検定）において、複数種類の細菌属で有意な変動（P < 0.05）が検出された。特定の試験対象素材による各便懸濁液における代表的な細菌属の変動プロファイルの変化を図１０に示した。図１０中の数値は各便懸濁液における特定試験対象素材/無添加時の存在比であり、色が濃いほど特定試験対象素材添加時の当該細菌属の存在量が増加したことを示している。Lachnoclostridium属及びBacteroides属では全ての試験対象素材で、Dorea属ではdex以外の試験対象素材で有意な増加が認められた。一方、Alistipesではdexのみで有意な増加が認められた。このように、本試験系は複数の試験対象素材が腸内環境に及ぼす影響を一度に並列に評価することが可能である。また、図１０の結果より、便検体によって細菌属の変動プロファイルが異なることが分かる。例えばチコリ由来イヌリン（Ｃｈｉ）を添加した場合に、Bacteroides属は、便検体１０７では減少傾向にある一方、便検体１０４では顕著な増加傾向にあった。このように、本試験系は異なる腸内環境に対する試験対象素材の影響を一度に並列に評価することが可能である。
Based on the calculated abundance of each gut microbiota, the log fold change (logFC) of the abundance when a specific test target material was added compared with no addition was calculated. Wilcoxon signed rank test (paired nonparametric two-group test) detected significant variation (P <0.05) in multiple bacterial genera. The changes in the variation profile of a representative bacterial genus in each stool suspension with a particular test material are shown in FIG. The numerical values in FIG. 10 are the abundance ratio of the specific test target material / no addition in each stool suspension, and indicate that the darker the color, the higher the abundance of the bacterial genus when the specific test target material was added. There is. A significant increase was observed in all test materials in the genus Lachnoclostridium and Bacteroides, and in the genus Dorea in test materials other than dex. On the other hand, in Alistipes, a significant increase was observed only with dex. In this way, this test system can evaluate the effects of multiple test materials on the intestinal environment in parallel at once. In addition, from the results of FIG. 10, it can be seen that the variation profile of the genus Bacteria differs depending on the stool sample. For example, when chicory-derived inulin (Chi) was added, the genus Bacteroides tended to decrease in the
・メタボローム解析
試験対象素材添加による腸内細菌叢由来の代謝反応への影響を評価するため、便-試験化合物混合液の上清に含まれる代謝物質のうち、有機酸・短鎖脂肪酸、胆汁酸について定量評価を実施した。まず、培養液を遠心分離して得られた上清をフィルターユニット付きチューブでろ過し、有機酸・短鎖脂肪酸測定用と胆汁酸測定用に分けた。有機酸・短鎖脂肪酸測定用の試料溶液は有機溶媒を用いた液液抽出ののち誘導体化処理を施し、溶出時間補正用の内部標準物質を添加した。胆汁酸測定用の試料溶液は有機溶媒を用いた液液抽出ののち、内部標準物質を添加した。代謝物質はLC-TOF/MSを用いて測定し、検出されたピークのカラム保持時間、質量電荷比（m/z）、ピーク面積を取得した。これらの情報を標準試料の測定結果と照合することで各ピークが対応する代謝物質を同定した。これらのピークは、検体ごとに内部標準物質との面積比が一定になるように補正し、サンプル間で相対定量が可能な値（相対面積比、relative area）に変換した。代謝物質のうち有機酸・短鎖脂肪酸分析では14化合物、胆汁酸分析では14化合物を濃度既知の標準試料を用いて作成した検量線と比較することにより、絶対定量を行った。・ Metabolite analysis In order to evaluate the effect of the addition of the test material on the metabolic reaction derived from the intestinal flora, among the metabolites contained in the supernatant of the stool-test compound mixture, organic acids, short-chain fatty acids, and bile acids Was quantitatively evaluated. First, the supernatant obtained by centrifuging the culture solution was filtered through a tube equipped with a filter unit, and separated into those for measuring organic acids and short-chain fatty acids and those for measuring bile acids. The sample solution for measuring organic acids and short-chain fatty acids was subjected to liquid-liquid extraction using an organic solvent and then derivatized, and an internal standard substance for elution time correction was added. The sample solution for bile acid measurement was liquid-liquid extracted with an organic solvent, and then an internal standard substance was added. The metabolites were measured using LC-TOF / MS, and the column retention time, mass-to-charge ratio (m / z), and peak area of the detected peaks were obtained. By collating this information with the measurement results of the standard sample, the metabolites corresponding to each peak were identified. These peaks were corrected so that the area ratio with the internal standard substance was constant for each sample, and converted into a value that allows relative quantification between the samples (relative area ratio, relative area). Absolute quantification was performed by comparing 14 compounds in the organic acid / short-chain fatty acid analysis and 14 compounds in the bile acid analysis with the calibration curve prepared using a standard sample having a known concentration.
算出された各代謝物質の濃度（便-試験化合物混合液の上清における濃度（nM））をもとに、無添加と比較した特定の試験対象素材を添加した際の濃度の対数変化倍率（logFC）を算出した。なお、Wilcoxonの符号順位検定（対応ありノンパラメトリック二群検定）において、複数の代謝物質で有意な変動（P < 0.05）が検出された。特定の試験対象素材添加による各便懸濁液における代表的な代謝物質の変動プロファイルをヒートマップで図示した（図１１）。図１1中の数値は各便懸濁液における特定試験対象素材添加時/無添加時の濃度比であり、色が濃いほど特定試験対象素材添加時の当該代謝物質の濃度が増加したことを示している。酢酸は全ての試験対象素材で有意な増加が認められ、酪酸、プロピオン酸は多くの試験対象素材で増加した。また、図１１の結果より、便検体によって代謝物質の変動プロファイルが異なることが分かる。例えば便検体１０７における酪酸（Ｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ）の変動は、チコリイヌリンを添加した場合にのみ増加し、その他の食物繊維では増加しなかった。また、試験対象素材に注目すると、チコリ由来イヌリンは全ての便検体で酪酸が増加したが、アガベ由来イヌリンや合成イヌリンは酪酸が増加しない便検体も存在した。このように、代謝物質においても、細菌叢と同様に、複数の試験対象素材が腸内環境に及ぼす影響及び異なる腸内環境に対する試験対象素材の影響を一度に並列に評価することが可能である。
Based on the calculated concentration of each metabolite (concentration in the supernatant of the stool-test compound mixture (nM)), the logarithmic change ratio of the concentration when a specific test target material is added compared to no addition ( logFC) was calculated. In Wilcoxon signed rank test (paired nonparametric two-group test), significant fluctuations (P <0.05) were detected in multiple metabolites. The variation profile of typical metabolites in each stool suspension due to the addition of specific test material is illustrated by heat map (Fig. 11). The numerical values in Fig. 11 are the concentration ratios of each stool suspension with and without the addition of the specific test target material, and the darker the color, the higher the concentration of the metabolite when the specific test target material was added. ing. Acetic acid was significantly increased in all test materials, butyric acid and propionic acid were increased in many test materials. In addition, from the results of FIG. 11, it can be seen that the fluctuation profile of the metabolite differs depending on the stool sample. For example, the variation in butyric acid in
次に、各試験対象素材添加時に見られた細菌存在量と代謝物質濃度の変動の相関解析を行った。本解析ではイヌリン添加時に増加が期待されていた短鎖脂肪酸（酢酸、プロピオン酸、酪酸）の濃度の変動と相関性のあった細菌属を検出した。各代謝物質の濃度と細菌属の存在量でピアソン相関係数およびスピアマン相関係数を算出し、いずれかの相関係数が0.6以上（正の相関）の組み合わせを図１２に示した。酪酸は、Lachnoclostridium属と正の相関が、プロピオン酸はBacteroides属、Prevotella_9と正の相関が、酪酸はLachnoclostridium属と正の相関がみられた。 Next, the correlation analysis between the abundance of bacteria and the fluctuation of the concentration of metabolites observed when the material to be tested was added was analyzed. In this analysis, we detected a bacterial genus that was associated with fluctuations in the concentration of short-chain fatty acids (acetic acid, propionic acid, butyric acid) that were expected to increase when inulin was added. The Pearson correlation coefficient and the Spearman correlation coefficient were calculated based on the concentration of each metabolite and the abundance of bacteria, and the combination of any of the correlation coefficients of 0.6 or more (positive correlation) is shown in FIG. Butyric acid was positively correlated with the genus Lachnoclostridium, propionic acid was positively correlated with the genus Bacteroides and Prevotella_9, and butyric acid was positively correlated with the genus Lachnoclostridium.
Lachnoclostridium属は短鎖脂肪酸を産生するClostiridium spp.を含むことが報告されている属であることから、酢酸濃度と正の相関が見られる細菌属としては妥当であると考えられる（Yutin, N. & Galperin, MY. 2013）。 Since the genus Lachnoclostridium is a genus that has been reported to contain Clostiridium spp., Which produces short-chain fatty acids, it is considered to be appropriate as a bacterial genus that has a positive correlation with acetic acid concentration (Yutin, N. & Galperin, MY. 2013).
Bacteroides属はコハク酸代謝経路を介したプロピオン酸産生の代表的な細菌属として知られており、コハク酸・プロピオン酸を産生する種が複数報告されている（Louis, P. et al. 2014）。また、Prevotella_9はプロピオン酸、コハク酸を産生する細菌属として報告されている（Louis, P. et al. 2014; Koh, A. et al. 2016）。 The genus Bacteroides is known as a representative bacterial genus of propionic acid production via the succinic acid metabolic pathway, and several species producing succinic acid / propionic acid have been reported (Louis, P. et al. 2014). .. Prevotella_9 has also been reported as a bacterial genus that produces propionic acid and succinic acid (Louis, P. et al. 2014; Koh, A. et al. 2016).
酪酸では酢酸の濃度と相関性が高かった細菌属が検出された。Lachnoclostridium属には酪酸産生に関与する細菌種も報告されている（Yutin, N. & Galperin, MY. 2013）。 In butyric acid, a bacterial genus that was highly correlated with the concentration of acetic acid was detected. Bacterial species involved in butyric acid production have also been reported in the genus Lachnoclostridium (Yutin, N. & Galperin, MY. 2013).
本試験では多くの便検体で複数のイヌリン・食物繊維添加時に酪酸産生が増加傾向にあることが観察されたが、便懸濁液１０７においては、チコリイヌリン（Ｃｈｉ）のみで酪酸が増加していた（図１１）。このことから、便検体１０７においては、他の便懸濁液とは異なる細菌属が酪酸産生に関与することが示唆された。
In this study, it was observed that butyric acid production tended to increase when multiple inulin and dietary fiber were added in many stool samples, but in
本実施例の結果から、イヌリン添加による短鎖脂肪酸の統計的に有意な増加が認められ、特に酢酸・酪酸においてはチコリイヌリン、プロピオン酸においてはアガベイヌリンでより顕著な効果が検出された。加えて、それぞれの産生に関与することが報告されている細菌属において高い相関性が示されたことから、上記試験対象素材の添加により腸内細菌叢に由来する当該短鎖脂肪酸の産生が亢進する可能性が示唆された。また、類似の複数の試験対象素材を並列に比較評価可能であることが示された。 From the results of this example, a statistically significant increase in short-chain fatty acids was observed by the addition of inulin, and a more remarkable effect was detected with chicory inulin in acetic acid / butyric acid and agabeinulin in propionic acid. In addition, since a high correlation was shown in the bacterial genera reported to be involved in the production of each, the addition of the above-mentioned test material enhances the production of the short-chain fatty acid derived from the intestinal flora. It was suggested that there is a possibility of doing so. It was also shown that multiple similar test target materials can be compared and evaluated in parallel.
（実施例６）
実施例６においては、試験対象素材としてフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）を使用した。なお、ポジティブコントロールとしてグルコース（Ｇｌｕ）、比較対象として何も溶解していない酸素除去済み超純水を添加した無添加サンプルを解析した。また、便検体として、００１、１０１、１０２、１０４、１０７、１１０を使用した。これらの便検体の全てのペアのWeighted UniFrac distanceのうち、最小の値は０．３であった。また、これらの便検体のうち、異なるエンテロタイプに属する便検体間のWeighted UniFrac distanceの最小値は、０．４２２であった。試験対象素材として上記を用いた以外は、実施例３（ＹＣＦＡ培地１００％）と同様にして、培養を行った。培養後、ピペッティングし、培養液をスクリューチューブに抜き取った。培養液を遠心分離し、上清をエッペンドルフチューブに移し入れた。ペレットが残ったチューブには、０．１ｍｍジルコニア／シリカビーズを入れた。(Example 6)
In Example 6, fructooligosaccharide (FOS) was used as the test target material. In addition, an additive-free sample to which glucose (Glu) was added as a positive control and oxygen-depleted ultrapure water in which nothing was dissolved was added as a comparison target was analyzed. Moreover, 001, 101, 102, 104, 107, 110 were used as the stool sample. Of the Weighted UniFrac distances of all pairs of these stool specimens, the smallest value was 0.3. In addition, among these stool samples, the minimum value of Weighted UniFrac distance between stool samples belonging to different enterotypes was 0.422. Culturing was carried out in the same manner as in Example 3 (YCFA medium 100%) except that the above was used as the test target material. After culturing, pipetting was performed and the culture broth was withdrawn into a screw tube. The culture was centrifuged and the supernatant was transferred to an Eppendorf tube. 0.1 mm zirconia / silica beads were placed in the tube in which the pellets remained.
実施例５と同様にマイクロバイオーム解析を実施し、腸内細菌叢の細菌系統組成を定量化した。算出された各腸内細菌属の存在量をもとに、各サンプルの腸内細菌叢の属組成を算出した（図１３）。フラクトオリゴ糖を添加したサンプルでは、無添加の場合と比較してBifidobacterium属が増加していた。図１４は、無添加サンプルと比較したグルコース、フラクトオリゴ糖を添加した際のBifidobacterium属の変動プロファイルをヒートマップで示した。図１４中の数値は、各便懸濁液における特定試験対象素材添加時/無添加時の存在比であり、色が濃いほど特定試験対象素材添加時の当該細菌属の存在量が増加したことを示している。図１４から、Bifidobacterium属細菌は、フラクトオリゴ糖添加により、便検体１０４で特に顕著な増加が認められた。また、全ての便検体において、フラクトオリゴ糖添加時は、グルコース添加時よりBifidobacterium属細菌が増加することが明らかになった。
Microbiome analysis was performed in the same manner as in Example 5 to quantify the bacterial phylogenetic composition of the intestinal flora. Based on the calculated abundance of each gut microbiota, the genus composition of the gut microbiota of each sample was calculated (FIG. 13). In the sample to which fructooligosaccharide was added, the genus Bifidobacterium was increased as compared with the case where no fructooligosaccharide was added. FIG. 14 shows a heat map showing the variation profile of the genus Bifidobacterium when glucose and fructooligosaccharide were added as compared with the non-added sample. The numerical values in FIG. 14 are the abundance ratios of each stool suspension with and without the addition of the specific test target material, and the darker the color, the higher the abundance of the bacterial genus when the specific test target material was added. Is shown. From FIG. 14, the Bifidobacterium genus bacteria showed a particularly remarkable increase in the
また、実施例５と同様にメタボローム解析を実施した。算出された各代謝物質の濃度（便-試験化合物混合液の上清における濃度（nM））を図１５、図１６を示す。その結果、フラクトオリゴ糖を添加したサンプルでは、無添加の場合と比較して酢酸の増加及びデオキシコール酸（ＤＣＡ）の減少が見られた。図１７は、無添加サンプルと比較したグルコース、フラクトオリゴ糖を添加した際の酢酸（Ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）、デオキシコール酸（Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）の変動プロファイルをヒートマップで示した。図１７中の数値は各便懸濁液における特定試験対象素材添加時/無添加時の濃度比を示しており、色が濃いほど特定試験対象素材添加時の当該代謝物質の濃度が増加したことを示している。図１７から、全ての便検体において、フラクトオリゴ糖添加時は、酢酸が、グルコース添加時と同等以上に増加することが明らかになった。また、便検体００１、１１０では、デオキシコール酸の顕著な減少が認められた。
In addition, a metabolome analysis was performed in the same manner as in Example 5. The calculated concentrations of each metabolite (concentration in the supernatant of the stool-test compound mixture (nM)) are shown in FIGS. 15 and 16. As a result, in the sample to which fructooligosaccharide was added, an increase in acetic acid and a decrease in deoxycholic acid (DCA) were observed as compared with the case without addition. FIG. 17 shows a heat map showing the fluctuation profiles of acetic acid and deoxycholic acid when glucose and fructooligosaccharide were added as compared with the non-added sample. The numerical values in FIG. 17 show the concentration ratio of each stool suspension with and without the addition of the specific test target material, and the darker the color, the higher the concentration of the metabolite when the specific test target material was added. Is shown. From FIG. 17, it was clarified that acetic acid increased to the same level or higher when fructooligosaccharide was added in all stool samples. In addition, in
以上より、フラクトオリゴ糖は、Bifidobacterium属の増加および酢酸の増加を促す作用があることが示された。フラクトオリゴ糖を添加したサンプルでは、Bifidobacterium属が増加し、Bifidobacterium属の増加と相関してBifidobacterium属が産生すると報告されている酢酸も増加した可能性が考えられる。 From the above, it was shown that fructooligosaccharide has an action of promoting an increase in the genus Bifidobacterium and an increase in acetic acid. In the sample to which fructooligosaccharide was added, the genus Bifidobacterium increased, and it is possible that the acetic acid reported to be produced by the genus Bifidobacterium also increased in correlation with the increase in the genus Bifidobacterium.
（実施例７）
実施例７においては、試験対象素材としてフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）を使用し、比較対象として何も溶解していない酸素除去済み超純水を添加した無添加サンプルを解析した。また、便検体として１０１、１０２、１０４、１０７、１１０、１１５を使用した。代謝基質物質として、コリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸を用い、代謝基質物質の終濃度がそれぞれ１００μＭの組（ｏｌｄ４）、代謝基質物質として、コリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸を用い、培養液における代謝基質物質の終濃度がそれぞれ１０μＭの組（４ｍｉｘ）、代謝基質物質としてコリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸を用い、培養液における代謝基質物質の終濃度がそれぞれ１０μＭの組（５ｍｉｘ）、及び代謝基質物質を添加しない組（ｎｏｎ）を用意した。その他の条件は実施例３（ＹＣＦＡ培地１００％）と同様にして１６時間培養した。(Example 7)
In Example 7, fructooligosaccharide (FOS) was used as a test target material, and an additive-free sample to which oxygen-removed ultrapure water in which nothing was dissolved was added was analyzed as a comparison target. Moreover, 101, 102, 104, 107, 110, 115 were used as the stool sample. Choline, carnitine, glycocholic acid, and taurocholic acid are used as the metabolic substrate substances, and a set (old4) having a final concentration of 100 μM each of the metabolic substrate substances is used, and choline, carnitine, glycocholic acid, and taurocholic acid are used as the metabolic substrate substances. , The final concentration of the metabolic substrate substance in the culture solution is 10 μM (4 mix), and choline, carnitine, glycocholic acid, taurocholic acid, and glycokenodeoxycholic acid are used as the metabolic substrate substances, and the final concentration of the metabolic substrate substance in the culture solution is A set of 10 μM (5 mix) and a set without addition of a metabolic substrate substance (non) were prepared, respectively. Other conditions were the same as in Example 3 (YCFA medium 100%), and the cells were cultured for 16 hours.
培養後、実施例５と同様にメタボローム解析を実施し、リトコール酸（ＬＣＡ）及びウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）の濃度（便－試験化合物混合液の上清における濃度（ｎＭ））を算出した（図１８）。図中、棒グラフは左から、試験対象素材無添加でかつ代謝基質物質を添加しない組（ｎｏｎ-ｎｏｎ）、代謝基質物質組成がｏｌｄ４の組（ｎｏｎ-ｏｌｄ４）、代謝基質物質組成が４ｍｉｘの組（ｎｏｎ-４）、代謝基質物質組成が５ｍｉｘの組（ｎｏｎ-５）、試験対象素材としてＦＯＳを用いかつ代謝基質物質を添加しない組（ＦＯＳ-ｎｏｎ）、代謝基質物質組成がｏｌｄ４の組（ＦＯＳ-ｏｌｄ４）、代謝基質物質組成が４ｍｉｘの組（ＦＯＳ-４）、代謝基質物質組成が５ｍｉｘの組（ＦＯＳ-５）の結果を表している。結果、代謝物質としてコリン、カルニチン、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸を用いた組（５ｍｉｘ）では、その他の組（ｎｏｎ、ｏｌｄ４、４ｍｉｘ）と比較して有意にＬＣＡ、ＵＤＣＡの濃度が高かった。このことから、代謝基質物質として添加したグリコケノデオキシコール酸が培養系において代謝され、ＬＣＡ及びＵＤＣＡが生成されたことが示唆された。また、ＬＣＡ、ＵＤＣＡの検出濃度は便検体によって異なり、例えば便検体１０１では他の便検体と比較してＬＣＡの検出濃度が高く、便検体１０２、１１５では、他の便検体と比較してＵＤＣＡの検出濃度が高かった。このことから、本実験系によればグリコケノデオキシコール酸の代謝反応における個人差を検証可能であることが示された。また、ＬＣＡ、ＵＤＣＡの検出濃度は試験対象物質（ＦＯＳ）の有無によっても異なり、ＬＣＡはＦＯＳを添加することで検出濃度が有意に増加した。ＵＤＣＡは、ＦＯＳを添加した場合の効果が便検体によって異なる傾向がみられ、例えば１０１ではＦＯＳを添加することによってＵＤＣＡの検出濃度が減少し、１０２では反対に増加した。また、ＬＣＡ、ＵＤＣＡは、培養開始時点での基質の濃度が１０μＭであっても十分に評価可能であることが示された。以上より、代謝基質物質としてグリコケノデオキシコール酸を添加することによって、その代謝物であるＬＣＡ及びＵＤＣＡが検出可能となり、腸内環境におけるグリコケノデオキシコール酸の代謝状況を検証することができることが示された。
After culturing, metabolome analysis was carried out in the same manner as in Example 5, and the concentrations of lithocholic acid (LCA) and ursodeoxycholic acid (UDCA) (concentration (nM) in the supernatant of the stool-test compound mixture) were calculated (. FIG. 18). In the figure, from the left, the bar graph shows a set with no added test material and no metabolic substrate material added (non-non), a set with a metabolic substrate material composition of old4 (non-old4), and a set with a metabolic substrate material composition of 4 mix. (Non-4), a set with a metabolic substrate composition of 5 mix (non-5), a set with FOS as the test material and no addition of a metabolic substrate substance (FOS-non), a set with a metabolic substrate composition of old4 (non-4). FOS-old4), the set of metabolic substrate material composition of 4 mix (FOS-4), and the set of metabolic substrate material composition of 5 mix (FOS-5) are shown. As a result, in the group (5 mix) using choline, carnitine, glycocholic acid, taurocholic acid, and glycokenodeoxycholic acid as metabolites, the concentrations of LCA and UDCA were significantly higher than those in the other groups (non, old4, 4mix). it was high. This suggests that glycochenodeoxycholic acid added as a metabolic substrate substance was metabolized in the culture system to produce LCA and UDCA. Further, the detected concentrations of LCA and UDCA differ depending on the stool sample. For example, the
以上より、本発明の試験方法によれば、代謝基質物質を添加した培地中で試験対象素材を培養するという簡便な試験系で、試験対象素材が腸内細菌の代謝、すなわち腸内環境に及ぼす影響を評価することが可能である。特に、代謝基質物質として、腸内細菌により代謝されることによって宿主の健康状態に悪影響を及ぼす代謝基質物質を添加した場合は、当該代謝基質物質の代謝物の増減を解析することによって、試験対象素材の健康上の効果を評価することができる。また、本発明の試験方法に依れば、腸内細菌叢の類似性に基づいて複数の便検体を選択するステップを設けることにより、腸内細菌叢の違いによる効果の現れ方の違いを効率的に評価する試験設計が可能である。 Based on the above, according to the test method of the present invention, in a simple test system in which the test target material is cultured in a medium containing a metabolic substrate substance, the test target material affects the metabolism of intestinal bacteria, that is, the intestinal environment. It is possible to assess the impact. In particular, when a metabolic substrate substance that adversely affects the health condition of the host by being metabolized by intestinal bacteria is added as the metabolic substrate substance, the test subject is analyzed by analyzing the increase or decrease of the metabolite of the metabolic substrate substance. The health effects of the material can be evaluated. Further, according to the test method of the present invention, by providing a step of selecting a plurality of stool samples based on the similarity of the intestinal bacterial flora, the difference in the appearance of the effect due to the difference in the intestinal bacterial flora is efficiently shown. It is possible to design a test for evaluation.
本発明は、試験対象素材の腸内環境への作用をインビトロで簡便に評価することができる。本発明による評価方法は、産業上の多くの分野（食品、医薬品および医療等）で広く実施することができ、極めて有用である。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can easily evaluate the effect of the test material on the intestinal environment in vitro. The evaluation method according to the present invention can be widely practiced in many industrial fields (food, pharmaceuticals, medical treatment, etc.) and is extremely useful.
Claims (10)
試験対象素材と、
前記腸内細菌により代謝される代謝基質物質と、を培地中で培養する培養ステップと、
培養後の培養液に含まれる代謝物を解析する解析ステップと、
腸内細菌叢の類似度の指標に基づいて、複数の前記便検体の組合せを選択する便検体選択ステップを備えることを特徴とする、試験対象素材の評価方法。 A stool sample containing one or more intestinal bacteria and
The material to be tested and
A culture step of culturing a metabolic substrate substance metabolized by the intestinal bacteria in a medium, and
Analysis steps to analyze metabolites contained in the culture medium after culturing , and
A method for evaluating a material to be tested, which comprises a stool sample selection step for selecting a combination of a plurality of the stool samples based on an index of similarity of the intestinal bacterial flora .
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