JP7049569B2 - Screening method for peptides that bind to target molecules in a pH-dependent manner - Google Patents

Screening method for peptides that bind to target molecules in a pH-dependent manner Download PDF

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本発明は、あるpHでは標的分子に結合し、あるpHでは標的分子に結合しない分子を選択するスクリーニング方法等に関する。 The present invention relates to a screening method for selecting a molecule that binds to a target molecule at a certain pH and does not bind to the target molecule at a certain pH.

neonatal Fc receptor（FcRn）は、胎児から母体へと胎盤を通過して抗体を輸送する機能をもつ受容体として発見された。また、最近、大人では抗体の血中濃度の恒常性に寄与することが示唆された。これらの機能はいずれも、IgGとFcRnがpH依存的に結合することに起因する。このpH依存性は極めてドラスティックなもので、pH6では解離定数が数nMの結合をもつにもかかわらず、pH7.4ではほぼ結合しない。血中のタンパク質やペプチドは、ピノサイトーシスによりエンドソームへと取り込まれリソソームで分解されるため、血中半減期は短い（図５Ａ）。しかし、抗体はエンドソームでpHが酸性に変化することで、そこに発現しているFcRnと結合することができる。FcRnと結合した抗体は、エキソサイトーシスの経路にのることができるので、最終的に、再び細胞外に提示され、pHが7.4に戻ることでFcRnと解離し、血中へと戻ってゆく（図５Ｂ）。このためIgGの血中半減期は4週間と非常に長い。変異を導入してpH依存性を失わせたIgGでは、血中半減期が減少することが知られており、また、pH依存性をもたせたままpH6における親和性をさらに強めることで、半減期が延長された例も報告されている。 The neonatal Fc receptor (FcRn) was discovered as a receptor that has the function of transporting antibodies from the fetus to the mother through the placenta. Recently, it has been suggested that it contributes to the homeostasis of antibody blood levels in adults. All of these functions are due to pH-dependent binding of IgG and FcRn. This pH dependence is extremely drastic, and although the dissociation constant has a bond of several nM at pH 6, it hardly binds at pH 7.4. Since proteins and peptides in blood are taken up by endosomes by pinocytosis and degraded by lysosomes, they have a short half-life in blood (Fig. 5A). However, the antibody can bind to the FcRn expressed there by changing the pH to acidic in the endosome. Antibodies bound to FcRn can enter the pathway of exocytosis, so that they are finally presented extracellularly, dissociate from FcRn when the pH returns to 7.4, and return to the blood. (Fig. 5B). Therefore, the half-life of IgG in blood is as long as 4 weeks. It is known that IgG in which a mutation is introduced to eliminate pH dependence has a reduced half-life in blood, and the half-life is further strengthened by further strengthening the affinity at pH 6 while maintaining pH dependence. Has also been reported to be extended.

pH依存的な反応の多くは、ヒスチジン（His）残基のプロトネーションと脱プロトネーションによって起きていると考えられている。これは、生体内のpH変化が5～7.4程度であり、20種類のアミノ酸の中でHisの側鎖のみ、pKaが6であるためである。実際に、抗体のCDRにHisを導入することで作製した、抗原からpH依存的に乖離する抗体が報告されている（例えば特許文献１）。この抗体は、pH7.4の血液中においては抗原と強く結合して機能を阻害するが、エンドソームに取り込まれるとpH6.0のエンドソーム内において抗原を解離し、リサイクル、すなわち血液中に再度放出される。その結果、血液中において新たな抗原と何度も結合できることが示唆された。
Hisを多く含む分子を作製すれば、pH依存性を獲得しやすいことが予想されるが、そうすると配列自体の多様性が大きく制限されるので、pH依存的結合分子の創出の可能性も制限される。また、HisのみによるpH依存性では、pHの変化による親和性の変化が十分ではない場合もある。 Many pH-dependent reactions are thought to be caused by protonation and deprotonation of histidine (His) residues. This is because the pH change in the living body is about 5 to 7.4, and among the 20 kinds of amino acids, only the side chain of His has pKa of 6. In fact, an antibody that is pH-dependently dissociated from an antigen produced by introducing His into the CDR of the antibody has been reported (for example, Patent Document 1). This antibody binds strongly to the antigen in blood at pH 7.4 and inhibits its function, but when taken up by endosomes, it dissociates the antigen in endosomes at pH 6.0 and is recycled, that is, released again into blood. To. As a result, it was suggested that it can bind to new antigens in blood many times.
It is expected that if a molecule containing a large amount of His is produced, it will be easy to acquire pH dependence, but this will greatly limit the diversity of the sequence itself, and thus the possibility of creating a pH-dependent binding molecule will also be limited. To. In addition, the pH dependence of His alone may not be sufficient for the change in affinity due to changes in pH.

特開２０１２－２１００４号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2012-21004

例えば、FcRnとpH6前後では強く結合し、pH7.4前後では結合しないペプチドを得て、かかるペプチドと医薬品を結合させれば、同医薬品を抗体と同様の経路でリサイクルさせて血中半減期を延長できる可能性がある。
また、例えばがん細胞周辺は他の場所に比較して酸性度が高いなど、生体内にはpHが異なる領域が存在するため、pH依存的に標的分子に結合できるペプチドを得ることができれば、かかるペプチドを用いて特定領域をターゲティングすることができる。
そこで、本発明は、標的分子にpH依存的に結合する分子、及び、かかる分子を選択するためのスクリーニング方法等を提供することを目的とする。 For example, if a peptide that binds strongly to FcRn at around pH 6 and does not bind at around pH 7.4 is obtained and the peptide is bound to a drug, the drug can be recycled by the same route as an antibody to achieve a half-life in blood. It may be possible to extend it.
In addition, since there are regions with different pH in the living body, such as the acidity around cancer cells being higher than in other places, if a peptide that can bind to the target molecule can be obtained in a pH-dependent manner, Specific regions can be targeted using such peptides.
Therefore, an object of the present invention is to provide a molecule that binds to a target molecule in a pH-dependent manner, a screening method for selecting such a molecule, and the like.

本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、pHのわずかな変化でも側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を有するペプチドを含むライブラリーを作製し、当該ライブラリーと標的分子とを第1のpH条件下で結合させ、第2のpH条件下で標的分子からペプチドを解離させることにより、第1のpHでは標的分子に結合し、第2のpHでは標的分子に結合しない、pH依存的に結合する性質をもったペプチドが得られることを見出した。
さらに、そのスクリーニング方法で得られたペプチドは、わずかなpHの違いで標的分子との結合についての解離定数が数十倍変化することを確認し、本発明を確認するに至った。
即ち、本発明は、
〔１〕標的分子に対して、第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しないペプチドを選択するスクリーニング方法であって、
核酸ライブラリーであって、各核酸が、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドをコードする核酸ライブラリーを合成する工程と、
前記核酸ライブラリーを用いて、前記ペプチドを発現させ、ペプチドライブラリーを製造する工程と、
前記ペプチドライブラリーと前記標的分子を前記第1のpH条件下で接触させてインキュベートし、該標的分子に結合するペプチドを選択する工程と、
前記標的分子に結合したペプチドから、前記第2のpH条件では該標的分子と結合しないものを選択する工程と、を含む方法；
〔２〕標的分子に対して、第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しないペプチドを選択するスクリーニング方法であって、
pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドと、これをコードする核酸とが結合したペプチド－核酸複合体ライブラリーを合成する工程と、
前記ペプチド－核酸複合体ライブラリーと前記標的分子とを前記第1のpH条件下で接触させてインキュベートし、該標的分子に結合するペプチド－核酸複合体を選択する工程(a)と、
前記選択されたペプチド－核酸複合体の核酸を含む核酸ライブラリーを得て、ペプチド－核酸複合体ライブラリーを製造する工程(b)と、
前記工程(a)及び(b)を1回以上行う工程と、
再度工程(a)を行い、前記標的分子に結合したペプチド－核酸複合体を前記第2のpH条件で溶出して、溶出されたペプチドを同定する工程と、を含む方法；
〔３〕前記pH依存的に側鎖のチャージが変化するアミノ酸は、側鎖にpH6～8でプロトン化状態が変化する官能基を含む、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法；
〔４〕前記pH依存的に側鎖のチャージが変化するアミノ酸は、以下から選択される、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法：
3位、又は3位および5位に、NO2、Cl、Br、I、SO2R（Rは、OH、NH2、又はArを表す。）
、COR（Rは、OH、NH2、Ar、CF3、又はC6F5を表す。）、CN、CF3、若しくはC6Fを有するチロシン又はそのN-置換体；
Nωに、NO2、SO2R（Rは、OH、NH2、又はArを表す。）、COR（Rは、OH、NH2、Ar、CF3、又はC6F5を表す）、CN、CF3、若しくはC6F5を有するアルギニン又はそのN-置換体；
2位、3位、若しくは4位にアミノ基を有するフェニルアラニン又はそのN-置換体；及び 2-ピリジルアラニン、3-ピリジルアラニン、若しくは4-ピリジルアラニン又はそれらのN-置換体；
〔５〕前記pH依存的に側鎖のチャージが変化するアミノ酸は、以下に示す群から選択される、上記〔１〕又は〔２〕に記載の方法：

Figure 0007049569000001
〔６〕前記ペプチドは、環状ペプチドである、上記〔１〕から〔５〕のいずれか１項に記載の方法；
〔７〕がん細胞で発現しているタンパク質に特異的に結合するペプチドを選択するスクリーニング方法であって、
上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法において、前記標的分子を癌細胞で発現しているタンパク質とし、第1のpHを弱酸性、第2のpHを弱塩基性とする、方法；
〔８〕ピノサイトーシス後リサイクルされるペプチドを選択するスクリーニング方法であって、
上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法において、前記標的分子をneonatal Fc receptor（FcRn）とし、第1のpHを弱酸性、第2のpHを弱塩基性とする、方法；
〔９〕前記標的分子が抗原またはサイトカイン受容体である、上記〔１〕から〔６〕のいずれか１項に記載の方法；
〔１０〕以下のアミノ酸配列を含むペプチド、または、以下のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列を含み、FcRnに結合するペプチド：
F[Nty]LYN[Nna]GDPL[Nty]L、
QSV[Nty]PDHWS[Pal]、
F[Nty]W[Nty]IWPKNY、
VS[Nty]T[Pal][Nty]WYWD、
[Pal]NFGPLWSKLS[Nna]、及び
LKS[Nty]LSWVYKS
〔式中、Ntyは、3-ニトロ-L-チロシンを表し、Nnaは、Nωニトロ-L-アルギニンを表し、Palは、3-ピリジル-L-アラニンを表す。〕
〔１１〕以下のアミノ酸配列を含むペプチド、または、以下のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列を含み、FcRnに結合するペプチド：
[AcD-Nty]F[Nty]LYN[Nna]GDPL[Nty]LC、
[AcD-Nty]QSV[Nty]PDHWS[Pal]C、
[AcD-Nty]F[Nty]W[Nty]IWPKNYC、
[AcD-Nty]VS[Nty]T[Pal][Nty]WYWDC、
[AcD-Nty][Pal]NFGPLWSKLS[Nna]C、及び
[AcD-Nty]LKS[Nty]LSWVYKSC
〔式中、AcD-Ntyは、N-アセチル-3-ニトロ-D-チロシンを表し、Ntyは、3-ニトロ-L-チロシンを表し、Nnaは、Nωニトロ-L-アルギニンを表し、Palは、3-ピリジル-L-アラニンを表す。各ペプチドは、AcD-Ntyのアセチル基とシステイン残基がチオエーテル結合して環状化していてもよい。〕
〔１２〕上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載の方法で選択されたペプチド、又は〔１０〕若しくは〔１１〕に記載のペプチドと、医薬との複合体；
；及び
〔１３〕上記〔１〕から〔９〕のいずれか１項に記載のスクリーニング方法を行うためのキット、
に関する。 As a result of repeated studies to solve the above problems, the present inventors have prepared a library containing a peptide having a special amino acid whose side chain charge changes even with a slight change in pH, and the library and the target. By binding the molecule under the first pH condition and dissociating the peptide from the target molecule under the second pH condition, it binds to the target molecule at the first pH and to the target molecule at the second pH. It has been found that a peptide having a pH-dependent binding property can be obtained.
Furthermore, it was confirmed that the peptide obtained by the screening method changed the dissociation constant for binding to the target molecule several tens of times with a slight difference in pH, which confirmed the present invention.
That is, the present invention
[1] A screening method for selecting a peptide that binds to a target molecule at a first pH and does not bind at a second pH.
A process of synthesizing a nucleic acid library in which each nucleic acid encodes a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH.
A step of expressing the peptide using the nucleic acid library to produce a peptide library, and
A step of contacting and incubating the peptide library and the target molecule under the first pH condition to select a peptide to be bound to the target molecule.
A method comprising a step of selecting a peptide bound to the target molecule that does not bind to the target molecule under the second pH condition;
[2] A screening method for selecting a peptide that binds to a target molecule at a first pH and does not bind at a second pH.
A step of synthesizing a peptide-nucleic acid complex library in which a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH and a nucleic acid encoding the peptide are bound to each other.
The step (a) of contacting and incubating the peptide-nucleic acid complex library and the target molecule under the first pH condition to select a peptide-nucleic acid complex to be bound to the target molecule.
The step (b) of obtaining a nucleic acid library containing the nucleic acid of the selected peptide-nucleic acid complex and producing the peptide-nucleic acid complex library, and
The step of performing the steps (a) and (b) one or more times, and
A method comprising the step (a) of performing the step (a) again, eluting the peptide-nucleic acid complex bound to the target molecule under the second pH condition, and identifying the eluted peptide;
[3] The method according to [1] or [2] above, wherein the amino acid whose side chain charge changes depending on the pH contains a functional group whose side chain changes its protonation state at pH 6-8;
[4] The method according to [1] or [2] above, wherein the amino acid whose side chain charge changes depending on the pH is selected from the following.
NO 2 , Cl, Br, I, SO 2 R (R stands for OH, NH 2 , or Ar) in 3rd, or 3rd and 5th place.
, COR (R stands for OH, NH 2 , Ar, CF 3 , or C 6 F 5 ), CN, CF 3 , or tyrosine with C 6 F or its N-substituent;
For Nω, NO 2 , SO 2 R (R stands for OH, NH 2 , or Ar), COR (R stands for OH, NH 2 , Ar, CF 3 , or C 6 F 5 ), CN , CF 3 , or arginine with C 6 F 5 or its N-substituent;
Phenylalanine having an amino group at the 2-position, 3-position, or 4-position or its N-substituted product; and 2-pyridylalanine, 3-pyridylalanine, or 4-pyridylalanine or an N-substituted product thereof;
[5] The method according to [1] or [2] above, wherein the amino acid whose side chain charge changes depending on the pH is selected from the group shown below.
Figure 0007049569000001
 [6] The method according to any one of [1] to [5] above, wherein the peptide is a cyclic peptide;
[7] A screening method for selecting a peptide that specifically binds to a protein expressed in cancer cells.
In the method according to any one of [1] to [6] above, the target molecule is a protein expressed in cancer cells, the first pH is weakly acidic, and the second pH is weakly basic. how to;
[8] A screening method for selecting peptides to be recycled after pinocytosis.
In the method according to any one of [1] to [6] above, the target molecule is a neonatal Fc receptor (FcRn), the first pH is weakly acidic, and the second pH is weakly basic. Method;
[9] The method according to any one of [1] to [6] above, wherein the target molecule is an antigen or a cytokine receptor;
[10] A peptide containing the following amino acid sequence, or a peptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted or deleted in the following amino acid sequence and binds to FcRn:
F [Nty] LYN [Nna] GDPL [Nty] L,
QSV [Nty] PDHWS [Pal],
F [Nty] W [Nty] IWPKNY,
VS [Nty] T [Pal] [Nty] WYWD,
[Pal] NFGPLWSKLS [Nna], and
LKS [Nty] LSWVYKS
[In the formula, Nty represents 3-nitro-L-tyrosine, Nna represents Nωnitro-L-arginine, and Pal represents 3-pyridyl-L-alanine. ]
[11] A peptide containing the following amino acid sequence, or a peptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted or deleted in the following amino acid sequence and binds to FcRn:
[ Ac D-Nty] F [Nty] LYN [Nna] GDPL [Nty] LC,
[ Ac D-Nty] QSV [Nty] PDHWS [Pal] C,
[ Ac D-Nty] F [Nty] W [Nty] IWPKNYC,
[ Ac D-Nty] VS [Nty] T [Pal] [Nty] WYWDC,
[ Ac D-Nty] [Pal] NFGPLWSKLS [Nna] C, and
[ Ac D-Nty] LKS [Nty] LSWVYKSC
[In the formula, Ac D-Nty represents N-acetyl-3-nitro-D-tyrosine, Nty represents 3-nitro-L-tyrosine, Nna represents Nωnitro-L-arginine, and Pal. Represents 3-pyridyl-L-alanine. Each peptide may be cyclized by thioether-bonding the acetyl group of Ac D-Nty and the cysteine residue. ]
[12] A peptide selected by the method according to any one of [1] to [9] above, or a complex of a peptide according to [10] or [11] and a drug;
; And [13] A kit for performing the screening method according to any one of the above [1] to [9].
Regarding.

本発明のスクリーニング方法によれば、所望の標的分子に対して、わずかなpHの違いで反応の解離定数が大きく変化するペプチドを同定することができる。
例えば、標的分子をFcRnとすれば、得られたペプチドや当該ペプチドを含むコンジュゲートは、ピノサイトーシスによって細胞に取り込まれてもエキソサイトーシスによって再度血中に放出される可能性が高く、これにより血中半減期を延長することが可能である。
また、得られたペプチドや当該ペプチドを含むコンジュゲートを、生体内において周囲と異なるpHを示す組織や臓器等に特異的に送達させることも可能である。 According to the screening method of the present invention, it is possible to identify a peptide in which the dissociation constant of the reaction changes significantly with respect to a desired target molecule with a slight difference in pH.
For example, if the target molecule is FcRn, the obtained peptide and the conjugate containing the peptide are likely to be released into the blood again by exocytosis even if they are taken up by cells by pinocytosis. It is possible to prolong the half-life in blood.
It is also possible to specifically deliver the obtained peptide or a conjugate containing the peptide to a tissue or organ having a pH different from that of the surroundings in the living body.

図１は、実施例で行ったmRNAディスプレイを説明する概念図である。FIG. 1 is a conceptual diagram illustrating the mRNA display performed in the examples. 図２は、実施例で用いた改変された遺伝暗号表である。FIG. 2 is a modified genetic code table used in the examples. 図３は、mRNAディスプレイでFcRn結合ペプチドをスクリーニングした結果を示す。FIG. 3 shows the results of screening FcRn-binding peptides on an mRNA display. 図４は、図３に示すスクリーニングの結果、もっとも出現頻度が高かった8D-01のクローンのpH6.0及びpH7.4での結合能をmRNAディスプレイで評価した結果を示す。FIG. 4 shows the results of evaluating the binding ability of the clone of 8D-01, which had the highest frequency of appearance, at pH 6.0 and pH 7.4 on the mRNA display as a result of the screening shown in FIG. 図５Ａは、血中タンパク質やペプチドが、ピノサイトーシスによりエンドソームへ取り込まれてリソソームで分解されることを示す概念図である。FIG. 5A is a conceptual diagram showing that blood proteins and peptides are taken up by endosomes by pinocytosis and degraded by lysosomes. 図５Ｂは、抗体がエンドソーム内でFcRnに結合し、エキソサイトーシスの経路にのって再び細胞外に提示され、血中に戻ることを示す概念図である。FIG. 5B is a conceptual diagram showing that the antibody binds to FcRn in the endosome, is presented extracellularly again by the pathway of exocytosis, and returns to the blood.

本発明に係るスクリーニング方法の第1の態様は、標的分子に対して、第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しないペプチドを選択する方法であって、
核酸ライブラリーであって、各核酸が、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドをコードする核酸ライブラリーを合成する工程と、
前記核酸ライブラリーを用いて、前記ペプチドを発現させ、ペプチドライブラリーを製造する工程と、
前記ペプチドライブラリーと前記標的分子を前記第1のpH条件下で接触させてインキュベートし、該標的分子に結合するペプチドを選択する工程と、
前記標的分子に結合したペプチドを前記第2のpH条件で溶出し、溶出されたペプチドを同定する工程と、を含む。 The first aspect of the screening method according to the present invention is a method of selecting a peptide that binds to a target molecule at a first pH and does not bind at a second pH.
A process of synthesizing a nucleic acid library in which each nucleic acid encodes a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH.
A step of expressing the peptide using the nucleic acid library to produce a peptide library, and
A step of contacting and incubating the peptide library and the target molecule under the first pH condition to select a peptide to be bound to the target molecule.
It comprises a step of eluting the peptide bound to the target molecule under the second pH condition and identifying the eluted peptide.

本明細書において、標的分子は特に限定されないが、例えばタンパク質やペプチドとすることができる。標的分子の例としては、FcRn、各種抗原、各種受容体、これらの断片などが挙げられる。 In the present specification, the target molecule is not particularly limited, but may be, for example, a protein or a peptide. Examples of target molecules include FcRn, various antigens, various receptors, fragments thereof and the like.

本明細書において「ライブラリー」は、全部または一部にランダムな配列を有する核酸またはペプチドを2以上含む集合体を意味する。 As used herein, "library" means an aggregate containing two or more nucleic acids or peptides having random sequences in whole or in part.

本明細書において、「核酸」はDNA、RNA、DNAとRNAのキメラを含み、PNA（ペプチド核酸）、LNA（Locked核酸）など人工塩基を含んでいてもよい。また、本明細書において「発現」は、DNAの配列に従ってRNAポリメラーゼがmRNAを産生する転写と、mRNAの配列に従ってペプチド又はタンパク質が合成される翻訳のいずれをも含む用語として用いられ、当業者は文脈からその意味を判断することができる。 In the present specification, the "nucleic acid" includes DNA, RNA, a chimera of DNA and RNA, and may contain an artificial base such as PNA (peptide nucleic acid) and LNA (Locked nucleic acid). Also, as used herein, "expression" is used as a term that includes both transcription in which RNA polymerase produces mRNA according to the sequence of DNA and translation in which a peptide or protein is synthesized according to the sequence of mRNA. The meaning can be judged from the context.

本明細書において、第1のpHと第2のpHは、互いに異なる以上どのようなpHであってもよく、第1のpHが第2のpHより高くてもよいし、第1のpHが第2のpHより低くてもよい。当業者は、目的に応じて第1のpHと第2のpHを選択し、本発明に係るスクリーニング方法を行うことができる。
例えば、標的分子をFcRnとする場合、第1のpHをエンドソーム内と同じ約5.5～6とし、第2のpHを血漿中と同じ約7.4としてもよい。また、癌細胞周辺で特異的に標的分子に結合するペプチドを同定する場合には、第1のpHを弱酸性（例えば、pH6.3～6.8）、第2のpHを弱アルカリ性（例えば、pH7.2～7.5）とするとよい。
そのほか、第1のpHを約4.0～6.5、第2のpHを約6.7～10.0とする組合せ、第1のpHを約6.7～10.0、第2のpHを約4.0～6.5とする組合せ、第1のpHを約5.5～6.5、第2のpHを約7.0～8.0とする組合せ、第1のpHを約7.0～8.0、第2のpHを約5.5～6.5とする組合せなどを用いることもできる。 In the present specification, the first pH and the second pH may be any pH as long as they are different from each other, the first pH may be higher than the second pH, and the first pH may be higher. It may be lower than the second pH. Those skilled in the art can select the first pH and the second pH according to the purpose and carry out the screening method according to the present invention.
For example, when the target molecule is FcRn, the first pH may be about 5.5 to 6, which is the same as in endosomes, and the second pH may be about 7.4, which is the same as in plasma. In addition, when identifying a peptide that specifically binds to a target molecule around cancer cells, the first pH is weakly acidic (for example, pH 6.3 to 6.8) and the second pH is weakly alkaline (for example, pH 7). .2 to 7.5) is recommended.
In addition, a combination with a first pH of about 4.0 to 6.5 and a second pH of about 6.7 to 10.0, a combination with a first pH of about 6.7 to 10.0 and a second pH of about 4.0 to 6.5, the first A combination having a pH of about 5.5 to 6.5 and a second pH of about 7.0 to 8.0, a combination having a first pH of about 7.0 to 8.0 and a second pH of about 5.5 to 6.5 can also be used.

本明細書において、「第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しない」という場合、「結合する」と「結合しない」は相対的な状態を意味し、その系の中のすべての分子が結合している、又は結合していない状態のみを指すものではない。例えば、第1のpHでは標的分子と結合しているペプチドが優勢であり、第2のpHでは標的分子と結合していないペプチドが優勢である場合や、第2のpHに比較して、第1のpHでは標的分子との結合についての解離定数が圧倒的に小さい場合なども、「第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しない」と表現される状態に該当する。 In the present specification, when "binding at the first pH and not binding at the second pH", "binding" and "not binding" mean relative states, and all in the system. It does not mean only the state where molecules are bound or not bound. For example, at the first pH, the peptide bound to the target molecule is predominant, and at the second pH, the peptide not bound to the target molecule is predominant, or compared to the second pH. Even when the dissociation constant for binding to a target molecule is overwhelmingly small at a pH of 1, it corresponds to the state expressed as "binding at the first pH and not at the second pH".

本発明に係るスクリーニング方法の第1の態様では、まず、各核酸が、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドをコードする核酸ライブラリーを合成する工程を行う。 In the first aspect of the screening method according to the present invention, first, each nucleic acid is subjected to a step of synthesizing a nucleic acid library encoding a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH. ..

本明細書において「アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、天然アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体、誘導体を含む。本明細書においてアミノ酸は、天然タンパク性L-アミノ酸；D-アミノ酸；アミノ酸変異体及び誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β-アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク性アミノ酸；N-置換アミノ酸；及びアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられる。非天然アミノ酸の例として、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニンなど）、D-アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（β-ヒドロキシ-ヒスチジン、ホモヒスチジン、α-フルオロメチル-ヒスチジン及びα-メチル-ヒスチジンなど)、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）及び側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。
本明細書においてアミノ酸は、慣用される1文字表記又は3文字表記で表される。1文字表記又は3文字表記で表されたアミノ酸は、それぞれその変異体、誘導体を含む場合もある。
また、本明細書においては、非蛋白質性アミノ酸、非天然アミノ酸、人工アミノ酸をまとめて「特殊アミノ酸」という。 As used herein, "amino acid" is used in the broadest sense and includes artificial amino acid variants and derivatives in addition to natural amino acids. As used herein, amino acids are natural proteinaceous L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; natural non-proteinaceous amino acids such as norleucine, β-alanine and ornithine; N-substituted amino acids. ; And chemically synthesized compounds having properties known in the art, which are the characteristics of amino acids, and the like. Examples of unnatural amino acids are α-methyl amino acids (such as α-methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (such as β-hydroxy-histidine, homohistidine, α-fluoromethyl-histidine and α-methyl-histidine). Included are amino acids with excess methylene in the side chains (“homo” amino acids) and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chains are replaced with sulfonic acid groups (such as cysteine acid).
Amino acids are represented herein by the commonly used one-letter or three-letter notation. Amino acids represented by one-letter or three-letter notation may include their variants and derivatives, respectively.
Further, in the present specification, non-protein amino acids, unnatural amino acids, and artificial amino acids are collectively referred to as "special amino acids".

本明細書において、「pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸」は、その最も広い意味で用いられ、側鎖がわずかなpHの変化に応じてプロトン化、脱プロトン化、アニオン化、脱アニオン化するものをいう。例えば側鎖にアミノ基や窒素原子を有し、pHの低下によってプロトン化され、pHの上昇よって脱プロトン化されるアミノ酸や、側鎖のヒドロキシ基がpHの上昇によってアニオン化され、pHの低下によって脱アニオン化されるアミノ酸などが挙げられる。「pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸」としては、側鎖のpKaが4～10程度のもの（好ましくはpKaが5～9程度のもの）や、pKbが6～7.4付近のものを用いることもできる。pHが7近傍、すなわちpH6～8程度で、プロトン化状態が変化する官能基を側鎖に有するアミノ酸（N-置換アミノ酸を含む）を用いてもよい。
かかるアミノ酸の非限定的な例としては、
3位、又は3位および5位に、NO2、Cl、Br、I、SO2R（Rは、OH、NH2、Ar等を表す。）、COR（Rは、OH、NH2、Ar、CF3、C6F5等を表す。）、CN、CF3、C6F等を有するチロシン又はそのN-置換体；
Nωに、NO2、SO2R（Rは、OH、NH2、Ar等を表す。）、COR（Rは、OH、NH2、Ar、CF3、C6F5等を表す）、CN、CF3、C6F5等を有するアルギニン又はそのN-置換体；
2位、3位、又は4位にアミノ基を有するフェニルアラニン又はそのN-置換体；及び
2-ピリジルアラニン、3-ピリジルアラニン、若しくは4-ピリジルアラニン、又はそれら
のN-置換体等が挙げられる。 In the present specification, "special amino acid whose side chain charge changes depending on pH" is used in the broadest sense, and the side chain is protonated, deprotonated, or anionized in response to a slight change in pH. , Deprotonating. For example, an amino acid that has an amino group or nitrogen atom in the side chain and is protonated by a decrease in pH and deprotonated by an increase in pH, or a hydroxy group in the side chain is anionized by an increase in pH and the pH decreases. Examples include amino acids that are deprotonated by. "Special amino acids whose side chain charge changes depending on pH" include those with a side chain pKa of about 4 to 10 (preferably those with a pKa of about 5 to 9) and those with a pKb of about 6 to 7.4. You can also use things. Amino acids (including N-substituted amino acids) having a functional group whose protonation state changes at a pH of around 7, that is, about pH 6 to 8, may be used.
A non-limiting example of such an amino acid is
NO 2 , Cl, Br, I, SO 2 R (R stands for OH, NH 2 , Ar, etc.), COR (R stands for OH, NH 2 , Ar, etc.) in the 3rd, or 3rd and 5th places. , CF 3 , C 6 F 5 , etc.), CN, CF 3 , Tyrosine with C 6 F, etc. or its N-substituent;
Nω includes NO 2 , SO 2 R (R stands for OH, NH 2 , Ar, etc.), COR (R stands for OH, NH 2 , Ar, CF 3 , C 6 F 5 , etc.), CN , CF 3 , C 6 F 5 etc. arginine or its N-substituent;
Phenylalanine having an amino group at the 2-position, 3-position, or 4-position or its N-substituted product; and
Examples thereof include 2-pyridylalanine, 3-pyridylalanine, 4-pyridylalanine, and N-substitutes thereof.

このようなアミノ酸としては、例えば、以下のものが挙げられる。

Figure 0007049569000002
化合物（I）：N-クロロアセチル-3-ニトロ-D-チロシン（ClAcD-Nty）
化合物（II）：3-ニトロ-L-チロシン（Nty）
化合物（III）：Nωニトロ-L-アルギニン（Nna）
化合物（IV）：3-ピリジル-L-アラニン（Pal）
化合物（V）：4-アミノ-L-フェニルアラニン（Aph）
これらのアミノ酸では、それぞれ丸で囲んだヒドロキシ基、アミノ基、窒素原子が、アニオン化またはプロトン化される結果、わずかなpHの変化で側鎖のチャージが変化する。 Examples of such amino acids include the following.
Figure 0007049569000002
 Compound (I): N-Chloroacetyl-3-nitro-D-tyrosine ( ClAc D-Nty)
Compound (II): 3-Nitro-L-Tyrosine (Nty)
Compound (III): Nωnitro-L-arginine (Nna)
Compound (IV): 3-Pyridyl-L-alanine (Pal)
Compound (V): 4-Amino-L-Phenylalanine (Aph)
In these amino acids, the hydroxy, amino, and nitrogen atoms circled, respectively, are anionized or protonated, resulting in a change in side chain charge with a slight change in pH.

pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドをコードする核酸は、「遺伝暗号のリプログラミング」によって当該特殊アミノ酸をコードするコドンを割り振り、かかるコドンを少なくとも1つ含む核酸を作ることによって得ることができる。
以下、遺伝暗号のリプログラミングについて説明する。 Nucleic acids encoding peptides containing at least one special amino acid whose side chain charge changes in a pH-dependent manner are assigned codons encoding the special amino acid by "reprogramming the genetic code" and contain at least one such codon. It can be obtained by making nucleic acids.
The reprogramming of the genetic code will be described below.

生体の翻訳では、mRNAの3つの塩基の並び（トリプレット）が一つのコドンとなって一つのアミノ酸を指定しており、その並びに対応するペプチドが合成される。このとき、コドンとアミノ酸との対応付けは、以下の2段階で行われる。(i) tRNAの末端にアミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase：ARS）が対応するアミノ酸を連結する。(ii) tRNAのアンチコドンが対応するmRNAのコドンと対合することにより、mRNAの情報に沿ってtRNA上のアミノ酸が重合されペプチドが合成される。
こうしたコドンとアンチコドンとの対応関係は、ほとんど普遍的に決定されており、64種類のコドンそれぞれに、20種類のアミノ酸のいずれか一つが割り当てられている。普遍遺伝暗号表を以下に示す。

Figure 0007049569000003
In the translation of living organisms, a sequence of three bases (triplet) of mRNA serves as one codon to specify one amino acid, and the corresponding peptide is synthesized. At this time, the association between the codon and the amino acid is performed in the following two steps. (i) Aminoacyl-tRNA synthetase (ARS) ligates the corresponding amino acid to the end of tRNA. (ii) By pairing the anticodon of tRNA with the codon of the corresponding mRNA, the amino acids on the tRNA are polymerized according to the information of the mRNA and the peptide is synthesized.
The correspondence between these codons and anticodons is almost universally determined, and each of the 64 types of codons is assigned one of 20 types of amino acids. The universal genetic code table is shown below.
Figure 0007049569000003

ここで、任意のtRNAに通常とは異なる任意のアミノ酸を結合させ、これを無細胞翻訳系等による発現系に用いれば、遺伝暗号をリプログラミングすることができる。
すなわち、遺伝暗号のリプログラミングとは、任意のtRNAに所望のアミノ酸を結合させたアミノアシル化tRNAを用いることによって、コドンが上表に示したものとは異なるアミノ酸を指定できるようにすることを意味する。
遺伝暗号のリプログラミングを行って、無細胞翻訳系で発現させる場合、無細胞翻訳系の構成因子は目的に合わせて自由に選択することができる。例えば、翻訳系から特定のアミノ酸を除去すると、当該アミノ酸に対応するコドンが空きコドンになる。そこで、その空きコドンに相補的なアンチコドンを有するtRNAに所望のアミノ酸を連結し、これを加えて翻訳を行えば、当該アミノ酸がそのコドンでコードされることになり、除去したアミノ酸の代わりに当該所望のアミノ酸が導入されたペプチドが翻訳される。 Here, if an arbitrary amino acid different from the usual amino acid is bound to an arbitrary tRNA and this is used for an expression system by a cell-free translation system or the like, the genetic code can be reprogrammed.
That is, reprogramming the genetic code means that by using an aminoacylated tRNA in which a desired amino acid is bound to an arbitrary tRNA, it is possible to specify an amino acid whose codon is different from that shown in the above table. do.
When the genetic code is reprogrammed and expressed in a cell-free translation system, the components of the cell-free translation system can be freely selected according to the purpose. For example, when a specific amino acid is removed from the translation system, the codon corresponding to the amino acid becomes an empty codon. Therefore, if a desired amino acid is ligated to a tRNA having an anticodon complementary to the free codon and then translated, the amino acid is encoded by the codon, and the amino acid is replaced with the removed amino acid. The peptide into which the desired amino acid has been introduced is translated.

任意のtRNAに任意のアミノ酸を結合させる方法としては、例えば、人工アミノアシル化RNA触媒「フレキシザイム（flexizyme）」を利用することができる。
フレキシザイムは、任意のtRNAに任意のアミノ酸またはヒドロキシ酸を連結（アシル化）することのできる人工RNA触媒（アシルtRNA合成酵素様活性を持つRNA触媒）である。例えば、以下の文献に記載されたものが公知である：H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), "A Versatile tRNA Aminoacylation Catalyst Based on RNA"Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662； H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), "Using a solid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the genetic code" Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084； H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga
(2006) "The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides" Nature Methods 3, 357-359；N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) "A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water-friendly leaving group" Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894；及びWO2007/066627「多目的化アシル化触媒とその用途」）。
フレキシザイムは、原型のフレキシザイム（Fx）、及び、これから改変されたジニトロベンジルフレキシザイム（dFx）、エンハンスドフレキシザイム（eFx）、アミノフレキシザイム（aFx）等の呼称でも知られる。
フレキシザイムによれば、例えば、上述したpH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸をtRNAに連結することができる。 As a method for binding an arbitrary amino acid to an arbitrary tRNA, for example, an artificial aminoacyl-acylated RNA catalyst "flexizyme" can be used.
Flexizyme is an artificial RNA catalyst (RNA catalyst having acyl tRNA synthase-like activity) capable of linking (acylating) any amino acid or hydroxy acid to any tRNA. For example, those described in the following documents are known: H. Murakami, H. Saito, and H. Suga, (2003), "A Versatile tRNA Aminoacylation Catalyst Based on RNA" Chemistry & Biology, Vol. 10, 655-662; H. Murakami, D. Kourouklis, and H. Suga, (2003), "Using a solid-phase ribozyme aminoacylation system to reprogram the genetic code" Chemistry & Biology, Vol. 10, 1077-1084; H. Murakami, A. Ohta, H. Ashigai, H. Suga
(2006) "The flexizyme system: a highly flexible tRNA aminoacylation tool for the synthesis of nonnatural peptides" Nature Methods 3, 357-359; N. Niwa, Y. Yamagishi, H. Murakami, H. Suga (2009) "A flexizyme that selectively charges amino acids activated by a water-friendly leaving group "Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 19, 3892-3894; and WO 2007/066627" Multipurpose Acylation Catalysts and Their Applications ").
The flexizyme is also known as a prototype flexizyme (Fx), and a modification of the dinitrobenzyl flexizyme (dFx), an enhanced flexizyme (eFx), an amino flexizyme (aFx), and the like.
According to flexizyme, for example, the above-mentioned special amino acid whose side chain charge changes depending on pH can be linked to tRNA.

任意のtRNAに任意のアミノ酸を連結する方法としては、化学的アミノアシル化や変異タンパク質酵素を用いる方法も挙げられる。 Examples of the method for linking an arbitrary amino acid to an arbitrary tRNA include a method using chemical aminoacylation and a mutant protein enzyme.

より具体的には、例えば、系からメチオニンを除くと、AUGが空きコドンとなる。そこで、AUGを少なくとも1つランダムな位置に含むDNAを合成し、これを転写してmRNAを得る。一方で、コドンAUGに対応するアンチコドンを有するtRNAにClAcD-Ntyを連結し、これを用いて当該mRNAを翻訳すれば、ランダムな位置に少なくとも1つのClAcD-Ntyを含むペプチドを得ることができる。 More specifically, for example, when methionine is removed from the system, AUG becomes an empty codon. Therefore, DNA containing at least one AUG at a random position is synthesized and transcribed to obtain mRNA. On the other hand, if ClAc D-Nty is ligated to a tRNA having an anticodon corresponding to the codon AUG and the mRNA is translated using this, a peptide containing at least one ClAc D-Nty at a random position can be obtained. can.

したがって、各核酸が、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドをコードする核酸ライブラリーを合成するためには、核酸がDNAである場合、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸をコードするコドンをアサインし、かかるコドンをランダムに少なくとも1つ含むDNAを合成すればよく、核酸がRNAの場合には、これを転写すればよい。DNAの合成と転写は公知の方法にしたがって行うことができる。 Therefore, in order to synthesize a nucleic acid library in which each nucleic acid encodes a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes in a pH-dependent manner, when the nucleic acid is DNA, the side chain charge changes in a pH-dependent manner. A codon encoding a special amino acid whose strand charge changes may be assigned, and a DNA containing at least one such codon may be synthesized at random. If the nucleic acid is RNA, this may be transcribed. DNA synthesis and transcription can be performed according to known methods.

本発明に係るスクリーニング方法の第1の態様では、続いて、核酸ライブラリーを発現させる。発現系としては、無細胞翻訳系が好ましく用いられる。 In the first aspect of the screening method according to the present invention, a nucleic acid library is subsequently expressed. As the expression system, a cell-free translation system is preferably used.

本明細書において「無細胞翻訳系」は、例えば、リボソームタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素（ARS）、リボソームRNA、アミノ酸、エネルギーソース（GTP、ATPなど）、tRNA、アミノ酸、翻訳開始因子（IF）伸長因子（EF）、終結因子（RF）、およびリボソーム再生因子（RRF）、ならびに翻訳に必要なその他の因子を含む。発現効率を高くするために大腸菌抽出液や小麦胚芽抽出液を用いてもよい。他に、ウサギ赤血球抽出液や昆虫細胞抽出液を用いてもよい。例えば、大腸菌のリボソームを用いる系として次の文献に記載された技術が公知である：H. F. Kung, B. Redfield, B. V. Treadwell, B. Eskin, C. Spears and H. Weissbach (1977) "DNA-directed in vitro synthesis of beta-galactosidase. Studies with purified factors" The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894 ; M. C. Gonza, C. Cunningham and R. M. Green (1985) "Isolation and point of action of a factor from Escherichia coli required to reconstruct translation" Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America Vol. 82, No. 6, 1648-1652 ; M. Y. Pavlov and M. Ehrenberg (1996) "Rate of translation of natural mRNAs in an optimized in vitro system" Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16 ; Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa and T. Ueda (2001) "Cell-free translation reconstituted with purified components"Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755；H. Ohashi, Y. Shimizu, B. W. Ying, and T. Ueda (2007) "Efficient protein selection based on ribosome display system with purified components" Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276。 As used herein, the term "cell-free translation system" refers to, for example, ribosomal proteins, aminoacyl tRNA synthases (ARS), ribosomal RNAs, amino acids, energy sources (GTP, ATP, etc.), tRNAs, amino acids, translation initiation factor (IF) elongation. Includes Factor (EF), Initiation Factor (RF), and Ribosome Regeneration Factor (RRF), as well as other factors required for translation. Escherichia coli extract or wheat germ extract may be used to increase the expression efficiency. Alternatively, a rabbit red blood cell extract or an insect cell extract may be used. For example, the techniques described in the following literature are known as systems using E. coli ribosomes: H. F. Kung, B. Redfield, B. V. Treadwell, B. Eskin, C. Spears and H. Weissbach (1977) "DNA-directed. in vitro synthesis of beta-galactosidase. Studies with purified factors "The Journal of Biological Chemistry Vol. 252, No. 19, 6889-6894; factor from Escherichia coli required to reconstruct translation "Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America Vol. 82, No. 6, 1648-1652; M.Y. Pavlov and M. Ehrenberg (1996)" Rate of translation of natural mRNAs in an optimized in vitro system "Archives of Biochemistry and Biophysics Vol. 328, No. 1, 9-16; Y. Shimizu, A. Inoue, Y. Tomari, T. Suzuki, T. Yokogawa, K. Nishikawa and T. Ueda (2001) "Cell-free translation reconstituted with purified components" Nature Biotechnology Vol. 19, No. 8, 751-755; H. Ohashi, Y. Shimizu, B. W. Ying, and T. Ueda (2007) "Efficient protein selection" based on ri bosome display system with purified components "Biochemical and Biophysical Research Communications Vol. 352, No. 1, 270-276.

このとき、翻訳系には、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を、これをコードするコドンと相補的なアンチコドンを有するtRNAに連結させたものを加えれば、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドライブラリーを得ることができる。 At this time, if a special amino acid whose side chain charge changes depending on pH is added to the translation system by linking it to a tRNA having an anticodon complementary to the codon encoding this, the side chain charge is changed in a pH-dependent manner. A peptide library containing at least one special amino acid with varying chain charge can be obtained.

本明細書において、「ペプチド」とは、2以上のアミノ酸がペプチド結合で結合したものをいい、アミノ酸の数は特に限定されないが、例えば、3アミノ酸から50アミノ酸の間、5アミノ酸から30アミノ酸の間等とすることができる。
また、ペプチドライブラリーの各ペプチドに含まれるpH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸の数も特に限定されないが、例えば、2以上、3以上、5以上とすることができる。例えば、ペプチド全体のアミノ酸数の10％以上、20％以上、30％以上としてもよい。 As used herein, the term "peptide" refers to a peptide bond of two or more amino acids, and the number of amino acids is not particularly limited, but is, for example, between 3 and 50 amino acids and 5 to 30 amino acids. It can be an interval.
Further, the number of special amino acids contained in each peptide of the peptide library whose side chain charge changes depending on the pH is not particularly limited, but may be, for example, 2 or more, 3 or more, or 5 or more. For example, the number of amino acids in the whole peptide may be 10% or more, 20% or more, and 30% or more.

本明細書において、ペプチドは環状ペプチドも含む。「環状ペプチド」とは、ペプチド中の2つのアミノ酸が結合し、その全部または一部が環状になっているものをいう。
ペプチドは環状化すると、プロテアーゼ耐性が向上したり、剛直性が増して膜透過性や標的タンパク質との親和性が向上したりする、と考えられている。例えば、ペプチドが2個以上のシステイン残基を含むよう設計すれば、翻訳された後、ジスルフィド結合により環状構造を形成できる。また、Gotoらの方法（Y. Goto, et al. ACS Chem. Biol. 3 120-129 (2008)）の従い、遺伝暗号のリプログラミング技術により、N末端にクロロアセチル基を有するペプチドを合成し、ペプチド中にシステイン残基を配置しておくことによっても環状化できる。これにより、翻訳後に自発的にメルカプト基がクロロアセチル基に求核攻撃し、ペプチドがチオエーテル結合により環状化する。遺伝暗号のリプログラミング技術により、結合して環状を形成するその他のアミノ酸の組合せをペプチド内に配置して環状化してもよい。 As used herein, peptides also include cyclic peptides. "Cyclic peptide" means a peptide in which two amino acids are bound and all or part of them are cyclic.
It is believed that when a peptide is cyclized, protease resistance is improved, rigidity is increased, and membrane permeability and affinity with a target protein are improved. For example, if a peptide is designed to contain two or more cysteine residues, it can be translated and then formed into a cyclic structure by disulfide bonds. In addition, according to the method of Goto et al. (Y. Goto, et al. ACS Chem. Biol. 3 120-129 (2008)), a peptide having a chloroacetyl group at the N-terminal was synthesized by the reprogramming technique of the genetic code. , It can also be cyclized by placing a cysteine residue in the peptide. As a result, the mercapto group spontaneously nucleophilically attacks the chloroacetyl group after translation, and the peptide is cyclized by a thioether bond. Other combinations of amino acids that bind to form a ring may be placed within the peptide to be circularized by genetic code reprogramming techniques.

本発明に係るスクリーニング方法の第1の態様では、次に、ペプチドライブラリーと標的分子を、第1のpH条件下で接触させてインキュベートし、標的分子に結合するペプチドを選択する工程と、標的分子に結合したペプチドから、第2のpH条件では標的分子と結合しないものを選択する工程とを行う。
これらの工程におけるpH以外の条件は、標的分子にあわせて当業者が適宜決定することができる。標的分子に結合するペプチドを選択する工程と、結合しないペプチドを選択する工程は、pH以外の条件は同一とすることも好ましい。 In the first aspect of the screening method according to the present invention, the peptide library and the target molecule are then contacted and incubated under the first pH condition to select a peptide to be bound to the target molecule, and the target. From the peptides bound to the molecule, a step of selecting a peptide that does not bind to the target molecule under the second pH condition is performed.
Conditions other than pH in these steps can be appropriately determined by those skilled in the art according to the target molecule. It is also preferable that the step of selecting the peptide that binds to the target molecule and the step of selecting the peptide that does not bind to the target molecule have the same conditions other than pH.

標的分子に結合するペプチドを選択する工程は、当業者が公知の方法にしたがって適宜行うことができるが、例えば、標的分子を固相担体に固定して、ペプチドライブラリーと接触させた後、標的分子に結合しているペプチドごと固相担体を回収したり、固相担体表面を適切な緩衝液で洗浄し、標的分子に結合しているペプチドのみを固相担体表面に捕捉することによって行うことができる。
この場合、標的分子に結合しないペプチドを選択する工程は、固相担体表面を第2のpH条件下で溶出し、第2のpH条件にすることによって、標的分子からはずれたものを同定することにより行うことができる。 The step of selecting a peptide to be bound to the target molecule can be appropriately performed according to a method known to those skilled in the art. For example, the target molecule is immobilized on a solid phase carrier, contacted with a peptide library, and then targeted. This can be done by recovering the solid-phase carrier together with the peptide bound to the molecule, or by washing the surface of the solid-phase carrier with an appropriate buffer and capturing only the peptide bound to the target molecule on the surface of the solid-phase carrier. Can be done.
In this case, the step of selecting a peptide that does not bind to the target molecule is to identify those deviated from the target molecule by eluting the surface of the solid phase carrier under the second pH condition and setting the second pH condition. Can be done by.

本明細書において、「固相担体」は、標的分子を固定できる担体であれば特に限定されず、ガラス製、金属性、樹脂製等のマイクロタイタープレート、基板、ビーズ、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレン、PVDFメンブレン等が挙げられ、標的分子は、これらの固相担体に公知の方法に従って固定することができる。
溶出工程、及び溶出されたペプチドの同定等は、当業者が公知の方法に従って行うことができる。 In the present specification, the "solid phase carrier" is not particularly limited as long as it is a carrier capable of immobilizing a target molecule, and is a microtiter plate made of glass, metal, resin, etc., a substrate, beads, a nitrocellulose membrane, a nylon membrane. , PVDF membrane and the like, and the target molecule can be immobilized on these solid phase carriers according to a known method.
The elution step, identification of the eluted peptide, and the like can be performed according to a method known to those skilled in the art.

また、標的分子に結合するペプチドと結合しないペプチドを選択する工程は、第1のpHと第2のpHにおける、標的分子とペプチドの結合の強さを定量することによって行うこともできる。
標的分子とペプチドの結合の強さの定量は、タンパク質間相互作用を解析するあらゆる方法を用いて行うことができるが、例えば、結合の解離定数を求めてもよい。解離定数は、表面プラズモン共鳴を利用したBiacore（GE healthcare）やFACSにより求めることができる。
標的分子に結合するペプチドと結合しないペプチドを、例えば、標的分子との結合の解離定数が、2倍以上、10倍以上、20倍以上、または40倍以上異なるものとすることができる。 The step of selecting a peptide that binds to a peptide that binds to a target molecule and a peptide that does not bind to the target molecule can also be performed by quantifying the strength of the binding between the target molecule and the peptide at the first pH and the second pH.
The strength of the bond between the target molecule and the peptide can be quantified using any method for analyzing protein-protein interactions, and for example, the dissociation constant of the bond may be determined. The dissociation constant can be obtained by Biacore (GE healthcare) or FACS using surface plasmon resonance.
Peptides that bind to and do not bind to the target molecule can be, for example, different in dissociation constants of binding to the target molecule by 2 times or more, 10 times or more, 20 times or more, or 40 times or more.

次に、本発明に係るスクリーニング方法の第2の態様について説明する。第2の態様は、無細胞翻訳系等を利用した各種のディスプレイ技術を用いるものであり、
pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドと、これをコードする核酸とが結合したペプチド－核酸複合体ライブラリーを合成する工程と、
前記ペプチド－核酸複合体ライブラリーと前記標的分子とを前記第1のpH条件下で接触させてインキュベートし、該標的分子に結合するペプチド－核酸複合体を選択する工程(a)と、
前記選択されたペプチド－核酸複合体の核酸を含む核酸ライブラリーを得て、ペプチド－核酸複合体ライブラリーを製造する工程(b)と、
前記工程(a)及び(b)を1回以上行う工程と、
再度工程(a)を行い、前記標的分子に結合したペプチド－核酸複合体を前記第2のpH条件で溶出して、溶出されたペプチドを同定する工程と、を含む。
第1の態様と同じ用語は同義で用いられるので、説明を省略する。 Next, a second aspect of the screening method according to the present invention will be described. The second aspect uses various display technologies using a cell-free translation system or the like.
A step of synthesizing a peptide-nucleic acid complex library in which a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH and a nucleic acid encoding the peptide are bound to each other.
The step (a) of contacting and incubating the peptide-nucleic acid complex library and the target molecule under the first pH condition to select a peptide-nucleic acid complex to be bound to the target molecule.
The step (b) of obtaining a nucleic acid library containing the nucleic acid of the selected peptide-nucleic acid complex and producing the peptide-nucleic acid complex library, and
The step of performing the steps (a) and (b) one or more times, and
The step (a) is performed again, and the peptide-nucleic acid complex bound to the target molecule is eluted under the second pH condition to identify the eluted peptide.
Since the same terms as in the first aspect are used interchangeably, the description thereof will be omitted.

第2の態様では、まず、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドと、これをコードする核酸とが結合したペプチド－核酸複合体ライブラリーを合成する。pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドをコードする核酸ライブラリーを合成する工程を、第1の態様に準じた方法で行う。 In the second aspect, first, a peptide-nucleic acid complex library in which a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH and a nucleic acid encoding the peptide is bound is synthesized. The step of synthesizing a nucleic acid library encoding a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH is carried out by a method according to the first aspect.

続いて、かかる核酸とペプチドとが結合したペプチド－核酸複合体ライブラリーを、各種のディスプレイ法に応じた方法で製造する。ここで、ディスプレイ法とは、無細胞翻訳系やファージ等を用いて、DNA又はmRNA（遺伝子型）と、ペプチド（表現型）とを関連付ける技術をいい、例えば、mRNAディスプレイ（Nemoto, N. et al, （1997）FEBS Lett., 414, 405-408; Roberts, R.W. & Szostak, J.W. （1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302）、リボソームディスプレイ（Mattheakis, L. C. et al., （1994）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9022-9026; Hanes, J. and Plueckthun, A. （1997）Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942）、DNAディスプレイ、RAPIDディスプレイ（国際公開WO2011/049157）、ファージディスプレイ（Science. 1985 Jun 14;228(4705):1315-7.）、bacterial display（Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Nov 15;90(22):10444-8.）、Mammalian cell display（Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 23;105(38):14336-41.）、Yeast display（Nat Biotechnol. 1997 Jun;15(6):553-7.）等が挙げられるがこれらに限定されない。ペプチド－核酸複合体ライブラリーにおいて、核酸とペプチドとは、直接結合していてもよいし、リンカーや他の分子（例えばリボソームなど）を介して結合していてもよく、当業者は、各ディスプレイ法に応じて、適宜結合方法を選択することができる。 Subsequently, a peptide-nucleic acid complex library in which the nucleic acid and the peptide are bound is produced by a method corresponding to various display methods. Here, the display method refers to a technique for associating DNA or mRNA (genotype) with a peptide (phenotype) using a cell-free translation system, phage, or the like, for example, mRNA display (Nemoto, N. et. al, (1997) FEBS Lett., 414, 405-408; Roberts, R.W. & Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 12297-12302), Ribosome Display (Mattheakis, L.C. et al ., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9022-9026; Hanes, J. and Plueckthun, A. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 4937-4942), DNA display, RAPID display (International release WO 2011/049157), phage display (Science. 1985 Jun 14; 228 (4705): 1315-7.), Bacterial display (Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Nov 15; 90 (22) ): 10444-8.), Mammalian cell display (Proc Natl Acad Sci U S A. 2008 Sep 23; 105 (38): 14336-41.), Yeast display (Nat Biotechnol. 1997 Jun; 15 (6): 553- 7.), etc., but are not limited to these. In the peptide-nucleic acid complex library, the nucleic acid and the peptide may be directly bound to each other, or may be bound to each other via a linker or another molecule (for example, ribosome), and those skilled in the art will appreciate each display. Depending on the method, the binding method can be appropriately selected.

ディスプレイ法として、mRNAディスプレイを用いる場合、上記方法でmRNAライブラリーを得た後、各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する。mRNAの3'末端へのピューロマイシンの結合は公知の方法に従って行うことができる。mRNAとピューロマイシンとがスペーサーを介して結合してもよい。
次に、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記ペプチドを発現させることにより、ペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造することができる。3'末端にピューロマイシンが結合したmRNAを鋳型として無細胞翻訳反応を行うと、ピューロマイシンがリボソームのPサイトにあるペプチド鎖と結合し、ペプチド－mRNA複合体が形成されるのである。 When an mRNA display is used as the display method, an mRNA library is obtained by the above method, and then puromycin is bound to the 3'end of each mRNA to produce a puromycin-bound mRNA library. Binding of puromycin to the 3'end of mRNA can be performed according to known methods. mRNA and puromycin may be bound via a spacer.
Next, the peptide-mRNA complex library can be produced by expressing the peptide by a cell-free translation system using a puromycin-bound mRNA library. When cell-free translation reaction is performed using mRNA with puromycin bound at the 3'end as a template, puromycin binds to the peptide chain at the P site of the ribosome to form a peptide-mRNA complex.

ディスプレイ法として、リボソームディスプレイを用いる場合、上記方法でmRNAライブラリーを製造する際、各mRNAが終止コドンを欠くよう構成する。mRNA上に終止コドンがあれば、終止コドンに結合する解離因子群の触媒作用によって翻訳されたペプチドとリボソームが解離するが、終止コドンがないと、リボソームとmRNAとの解離が生じない結果、mRNA－リボソーム－ペプチド複合体が生じる。 When a ribosome display is used as the display method, each mRNA is configured to lack a stop codon when the mRNA library is produced by the above method. If there is a stop codon on the mRNA, the translated peptide and ribosome will be dissociated by the catalytic action of the dissociation factors that bind to the stop codon, but if there is no stop codon, the dissociation between the ribosome and mRNA will not occur, resulting in mRNA. A-ribosome-peptide complex is formed.

ディスプレイ法として、DNAとペプチドとの複合体を利用するDNAディスプレイを用いてもよい。DNAディスプレイとしては、例えば、STABLE法（Doi, N. and Yanagawa, H.（1999）FEBS Lett., 457, 227-230）が挙げられる。この方法では、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドと、ストレプトアビジンとの融合タンパク質をコードするDNAライブラリーを製造し、各DNAをビオチンラベルして、W/Oエマルジョンにより形成したコンパートメント内で発現させる。これにより、ストレプトアビジンとビオチンが結合し、DNAと発現したペプチドとの複合体を得ることができる。D
NAディスプレイとしては、ほかに、CIS display（Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 Mar 2;101(9):2806-10）やCovalent Antibody Display（Nucleic Acids Res. 2005; 33(1): e10.）、SNAP Display(Methods Mol Biol. 2012;805:101-11.)等を用いることもできる。
当業者は、各ディスプレイ法に応じて、DNAとペプチドとの複合体を得ることができる。 As a display method, a DNA display using a complex of DNA and a peptide may be used. Examples of the DNA display include the STABLE method (Doi, N. and Yanagawa, H. (1999) FEBS Lett., 457, 227-230). In this method, a DNA library encoding a fusion protein of streptavidin and a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH is prepared, and each DNA is biotin-labeled and W. Expressed within the compartment formed by the / O emulsion. As a result, streptavidin and biotin bind to each other, and a complex of DNA and the expressed peptide can be obtained. D
Other NA displays include CIS display (Proc Natl Acad Sci US A. 2004 Mar 2; 101 (9): 2806-10) and Covalent Antibody Display (Nucleic Acids Res. 2005; 33 (1): e10.). , SNAP Display (Methods Mol Biol. 2012; 805: 101-11.), Etc. can also be used.
Those skilled in the art can obtain a complex of DNA and peptide depending on each display method.

ディスプレイ法としては、RAPIDディスプレイを用いてもよい。RAPIDディスプレイは、ペプチドをコードするmRNAの3'末端の塩基とハイブリダイズする一本鎖領域を一端に有し、もう一端にペプチド転移反応によって翻訳産物に結合可能な基を含むペプチドアクセプター領域を有するリンカーであって、該ペプチドアクセプター領域が、塩基配列ACCAからなるオリゴRNAにアミノ酸がエステル結合した構造からなるリンカーを用いる方法である。
この場合、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドをコードするDNAライブラリーを製造する際、ペプチドのコード領域の下流に、上記リンカーの一本鎖領域に相補的な領域を設ける。そして、かかるDNAライブラリーとを、リンカーの存在下、無細胞系で転写、翻訳すると、mRNAの3'末端にリンカーの一本鎖領域がハイブリダイズし、リンカーの他端のアミノ酸が翻訳産物のC末端アミノ酸に結合し、mRNA－リンカー－ペプチド複合体が形成される。 As a display method, a RAPID display may be used. The RAPID display has a single-stranded region at one end that hybridizes to the 3'end base of the mRNA encoding the peptide, and a peptide acceptor region at the other end that contains a group that can bind to the translation product by a peptide transfer reaction. It is a method using a linker having a structure in which an amino acid is ester-bonded to an oligo RNA having a peptide acceptor region having a base sequence ACCA.
In this case, when producing a DNA library encoding a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH, it complements the single-stranded region of the linker downstream of the peptide coding region. Area is provided. Then, when the DNA library is transcribed and translated in a cell-free system in the presence of a linker, the single-stranded region of the linker hybridizes to the 3'terminal of the mRNA, and the amino acid at the other end of the linker is the translation product. It binds to the C-terminal amino acid to form an mRNA-linker-peptide complex.

その他、当業者は、遺伝子型と表現型を関連付けるあらゆるディスプレイ法を応用して、核酸とペプチドとが結合したペプチド－核酸複合体ライブラリーを製造することができる。 In addition, those skilled in the art can apply any display method for associating genotype and phenotype to produce a peptide-nucleic acid complex library in which nucleic acids are bound to each other.

こうして得られたペプチド－核酸複合体ライブラリーは、標的分子と第1のpH条件下で接触させてインキュベートし、標的分子に結合するペプチド－核酸複合体を選択する。この工程を工程(a)とする。当該工程は、当業者であれば公知の種々の方法に従って行うことができるが、例えば、標的分子を固相担体に固定しておき、これとペプチド－核酸複合体ライブラリーとを接触させてインキュベートした後、複合体ごと固相担体を回収する方法や、固相担体表面を洗浄等して、標的分子に結合している複合体のみを分離する方法によって行うことができる。
あるいは、標的分子にビオチンを結合しておき、ビオチン化標的分子とペプチド－核酸複合体ライブラリーを液相で接触させた後、ストレプトアビジン磁器ビーズを加えてビオチンとストレプトアビジンを結合させ、磁器ビーズを磁石で回収することによって行ってもよい。 The peptide-nucleic acid complex library thus obtained is contacted and incubated with the target molecule under the first pH condition, and the peptide-nucleic acid complex that binds to the target molecule is selected. This step is referred to as step (a). The step can be carried out according to various methods known to those skilled in the art, for example, the target molecule is immobilized on a solid phase carrier, and the target molecule is brought into contact with the peptide-nucleic acid complex library for incubation. After that, the solid phase carrier can be recovered together with the complex, or the surface of the solid phase carrier can be washed to separate only the complex bound to the target molecule.
Alternatively, biotin is bound to the target molecule, the biotinylated target molecule and the peptide-nucleic acid complex library are brought into contact with each other in a liquid phase, and then streptavidin porcelain beads are added to bind biotin and streptavidin to the porcelain beads. May be done by collecting with a magnet.

工程(a)の後、選択されたペプチド－核酸複合体の核酸を含む核酸ライブラリーを得て、ペプチド－核酸複合体ライブラリーを製造する工程(b)を行う。
核酸ライブラリーから、ペプチド－核酸複合体ライブラリーを製造する方法は、上述のとおり、各ディスプレイ法に応じて、当業者が適宜核酸を修飾し、必要なリンカーを調製して、無細胞翻訳系等で翻訳することにより行うことができる。
例えば、mRNAディスプレイの場合、まず、各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させ、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造する工程を行う。より具体的には、選択されたペプチド－mRNA複合体群のmRNAを逆転写することによってcDNA群を得、このcDNA群を転写することによって再びmRNAライブラリーが得られる。そこで、各mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させて、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを製造することができる。このピューロマイシン結合mRNAライブラリーを、無細胞系で翻訳することにより、ペプチド－mRNA複合体ライブラリーを得ることができる。 After the step (a), a nucleic acid library containing the nucleic acid of the selected peptide-nucleic acid complex is obtained, and the step (b) of producing the peptide-nucleic acid complex library is performed.
As described above, a method for producing a peptide-nucleic acid complex library from a nucleic acid library is a cell-free translation system in which a person skilled in the art appropriately modifies the nucleic acid according to each display method, prepares a necessary linker, and prepares a necessary linker. It can be done by translating with.
For example, in the case of mRNA display, first, puromycin is bound to the 3'end of each mRNA, and a step of producing a puromycin-bound mRNA library is performed. More specifically, the cDNA group is obtained by reverse transcription of the mRNA of the selected peptide-mRNA complex group, and the mRNA library is obtained again by transcribing this cDNA group. Therefore, puromycin-bound mRNA library can be produced by binding puromycin to the 3'end of each mRNA. By translating this puromycin-bound mRNA library in a cell-free system, a peptide-mRNA complex library can be obtained.

工程(a)及び(b)のセットを1回以上繰り返し行って、標的分子に結合するペプチドが十分に濃縮された後、再度工程(a)を行い、第2のpH条件で、標的分子に結合したペプチド－核酸複合体を溶出する。工程(a)及び(b)のセットを行う回数は特に限定されず、標的分子に結合するペプチドが十分に濃縮されるまで行う。例えば、3回、5回、7回等とすることができる。 The set of steps (a) and (b) is repeated one or more times to sufficiently concentrate the peptide that binds to the target molecule, and then step (a) is repeated to obtain the target molecule under the second pH condition. Elute the bound peptide-nucleic acid complex. The number of times the steps (a) and (b) are set is not particularly limited, and the steps (a) and (b) are performed until the peptide bound to the target molecule is sufficiently concentrated. For example, it can be 3 times, 5 times, 7 times, and the like.

具体的には、例えば、標的分子をビーズに固定した場合、工程(a)において当該ビーズを回収することによって、標的分子に結合したペプチド－mRNA複合体を選択する。そして、今度は第2のpH条件の緩衝液でビーズからペプチド－mRNA複合体を溶出する。
かかるペプチドを同定することにより、標的分子に対して、第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しないペプチドを選択することができる。 Specifically, for example, when the target molecule is fixed to the beads, the peptide-mRNA complex bound to the target molecule is selected by recovering the beads in the step (a). Then, this time, the peptide-mRNA complex is eluted from the beads with a buffer solution under the second pH condition.
By identifying such peptides, it is possible to select peptides that bind to the target molecule at the first pH and not at the second pH.

上記ディスプレイ法としてmRNAディスプレイを用いる場合、mRNAの3'末端にピューロマイシンを結合させる際、特開2002－291491号公報の方法に従って、mRNAの3'末端に、当該mRNAの3'末端の一部に相補的なDNA断片を連結し、当該DNA断片の3'末端にピューロマイシンを結合させてもよい。
この場合、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを用いて、無細胞翻訳系により前記ペプチドを発現させ、ペプチド－mRNA複合体ライブラリーを製造する工程の後、逆転写酵素を用いて、上記DNA断片を伸長するようにmRNAの一本鎖部分に相補的なDNAを合成してもよい。これにより、ペプチド－mRNA複合体ライブラリーのmRNAがDNAとのハイブリッドを形成し、より安定的に工程(a)を行うことができる。 When the mRNA display is used as the display method, when puromycin is bound to the 3'end of the mRNA, a part of the 3'end of the mRNA is attached to the 3'end of the mRNA according to the method of JP-A-2002-291491. A DNA fragment complementary to the DNA fragment may be ligated to bind puromycin to the 3'end of the DNA fragment.
In this case, the peptide is expressed by a cell-free translation system using a puromycin-bound mRNA library, and after the step of producing a peptide-mRNA complex library, the DNA fragment is extended using reverse transcriptase. As such, DNA complementary to the single-stranded portion of mRNA may be synthesized. As a result, the mRNA of the peptide-mRNA complex library forms a hybrid with DNA, and the step (a) can be performed more stably.

この場合、工程(b)は、選択されたペプチド－mRNA複合体から、PCRによって二本鎖DNAを得て、これを転写してRNAを得て、このmRNAの3'末端に、当該mRNAの3'末端の一部に相補的なDNA断片をライゲーションし、ピューロマイシンを結合させて、ピューロマイシン結合mRNAライブラリーを得る。 In this case, in step (b), double-stranded DNA is obtained from the selected peptide-mRNA complex by PCR, and this is transcribed to obtain RNA, and the 3'end of this mRNA is attached to the mRNA. A DNA fragment complementary to a part of the 3'end is ligated and puromycin is bound to obtain a puromycin-bound mRNA library.

上述したスクリーニング方法で得られたペプチドは、第1のpHでは標的分子と結合し、第2のpHでは標的分子と結合しないという性質に基づき、様々な用途に用いられる。
例えば、標的分子ががん細胞にも正常細胞にも発現しているタンパク質である場合、第1のpHを弱酸性（例えば、pH6.3～6.8）、第2のpHを弱塩基（例えば、pH7.2～7.5）として得られたペプチドは、酸性度の高いがん細胞の周辺でのみ標的分子に結合することができ、正常細胞周辺では結合しない。したがって、かかるペプチドを抗がん剤に結合させておけば、抗がん剤をがん細胞周辺に選択的に送達させることが可能である。 The peptide obtained by the screening method described above is used for various purposes due to the property that it binds to the target molecule at the first pH and does not bind to the target molecule at the second pH.
For example, if the target molecule is a protein that is expressed in both cancer and normal cells, the first pH is weakly acidic (eg, pH 6.3-6.8) and the second pH is weakly base (eg, pH 6.3-6.8). The peptide obtained as pH 7.2-7.5) can bind to the target molecule only around highly acidic cancer cells, not around normal cells. Therefore, if such a peptide is bound to an anticancer drug, the anticancer drug can be selectively delivered to the periphery of cancer cells.

また、標的分子をFcRnとし、第1のpHを約5.5～6、第2のpHを約7.4として得られたペプチドは、ピノサイトーシスによって酸性度の高いエンドソームに取り込まれると、FcRnに結合することができる。そうするとリソソームで分解されることなく、エキソサイトーシスされ、pHが約7.4の血液中でFcRnと解離する。したがって、かかるペプチドをタンパク質医薬などの医薬に結合させておけば、当該医薬はピノサイトーシスされても分解されることなく再び血中に放出されリサイクルされるので、結果として血中半減期が延長され得る。 The peptide obtained with the target molecule as FcRn and the first pH of about 5.5 to 6 and the second pH of about 7.4 binds to FcRn when taken up by highly acidic endosomes by pinocytosis. be able to. It is then exocytosed without being degraded by lysosomes and dissociates from FcRn in blood at a pH of about 7.4. Therefore, if such a peptide is bound to a drug such as a protein drug, the drug is released into the blood again without being decomposed even if it is pinocytosis and is recycled, resulting in an extension of the blood half-life. Can be done.

また、FcRnは、気道の上皮細胞にも発現していることが知られ、このFcRnとのpH依存的な相互作用を介してタンパク質性医薬品を経肺投与したことが報告されている（例えば、Bitonti, A.J. & Dumont, J.A. Advanced Drug Delivery Reviews 58, 1106 - 1118 (2006).; Liebert, M.A. et al. Journal of Aerosol Medicine 18, 294-303 (2005).; Vllasaliu, D. et al. Journal of Controlled Release 1-9 (2011).doi:10.1016/j.jconrel.2011.12.009）。したがって、標的分子をFcRnとして得られたペプチドを、タンパク質医薬などの医薬品に結合させておけば、当該医薬を経肺投与することが可能である。 FcRn is also known to be expressed in epithelial cells of the respiratory tract, and it has been reported that a proteinaceous drug was administered transpulmonaryly through a pH-dependent interaction with this FcRn (for example). Bitonti, A.J. & Dumont, J.A. Advanced Drug Delivery Reviews 58, 1106 --1118 (2006) .; Liebert, M.A. et al. Journal of Aerosol Medicine 18, 294-303 (2005) .; Vllasaliu, D. et al. Journal of Controlled Release 1-9 (2011) .doi: 10.1016 / j.jconrel.2011.12.009). Therefore, if the peptide obtained with the target molecule as FcRn is bound to a drug such as a protein drug, the drug can be administered transpulmonaryly.

また、抗体の主要な代謝経路には、膜型抗原依存的なものもある。この場合、抗体は、膜型抗原に結合した状態でエンドサイトーシスされ、膜型抗原と一緒にリソソームで分解される。同様に、サイトカインにもサイトカイン受容体に結合し、受容体ごと分解を受ける代謝経路がある（例えば、Igawa, T. et al. Nature Biotechnology 28, 1203-1207 (2010).; Chaparro-riggers, J. et al. Journal of Biological Chemistry 1-15 (2012).doi:10.1074/jbc.M111.319764; Sarkar, C.A. et al. Nature Biotechnology 20, (2002).; 特開2012-21004号公報; 特表2010-536384号公報;特表2004-508044号公報）。
したがって、本願発明の方法で、膜型抗原やサイトカイン受容体を標的分子として、pH依存的に膜型抗原やサイトカイン受容体と解離できるペプチドを得ることができれば、分解を回避できる可能性がある。 In addition, some of the major metabolic pathways of antibodies are membrane-type antigen-dependent. In this case, the antibody is endocytosed in a state of being bound to the membrane-type antigen and is degraded by lysosomes together with the membrane-type antigen. Similarly, cytokines also have metabolic pathways that bind to cytokine receptors and undergo degradation of each receptor (eg, Igawa, T. et al. Nature Biotechnology 28, 1203-1207 (2010) .; Chaparro-riggers, J. . et al. Journal of Biological Chemistry 1-15 (2012) .doi: 10.1074 / jbc.M111.319764; Sarkar, CA et al. Nature Biotechnology 20, (2002) .; 2010-536384 Gazette; Special Table 2004-508044 Gazette).
Therefore, if a peptide capable of dissociating from a membrane-type antigen or cytokine receptor in a pH-dependent manner can be obtained by using the method of the present invention as a target molecule, degradation may be avoided.

ペプチドに結合される医薬は特に限定されず、低分子化合物、高分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド等であることができる。ペプチドと医薬の複合体は公知の方法に従って製造される。医薬がペプチドやタンパク質の場合は、融合タンパク質として発現させてもよく、医薬とペプチドとがリンカーを介して結合していてもよい。また、かかる複合体は適宜製剤化してから投与してもよい。 The drug bound to the peptide is not particularly limited, and may be a small molecule compound, a high molecular compound, a nucleic acid, a protein, a peptide, or the like. Peptide-pharmaceutical complexes are prepared according to known methods. When the drug is a peptide or protein, it may be expressed as a fusion protein, or the drug and the peptide may be bound via a linker. In addition, the complex may be appropriately formulated before administration.

また、本発明は、本発明に係るpH依存的にFcRnに結合する、以下のアミノ酸配列を含むペプチド、または、以下のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失したアミノ酸配列を含むペプチドも包含する。
F[Nty]LYN[Nna]GDPL[Nty]L、
QSV[Nty]PDHWS[Pal]、
F[Nty]W[Nty]IWPKNY、
VS[Nty]T[Pal][Nty]WYWD、
[Pal]NFGPLWSKLS[Nna]、及び
LKS[Nty]LSWVYKS
〔式中、Ntyは、3-ニトロ-L-チロシンを表し、Nnaは、Nωニトロ-L-アルギニンを表し、Palは、3-ピリジル-L-アラニンを表す。〕 Further, the present invention is a peptide containing the following amino acid sequence that binds to FcRn in a pH-dependent manner according to the present invention, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are added, substituted or deleted in the following amino acid sequence. Also includes peptides containing.
F [Nty] LYN [Nna] GDPL [Nty] L,
QSV [Nty] PDHWS [Pal],
F [Nty] W [Nty] IWPKNY,
VS [Nty] T [Pal] [Nty] WYWD,
[Pal] NFGPLWSKLS [Nna], and
LKS [Nty] LSWVYKS
[In the formula, Nty represents 3-nitro-L-tyrosine, Nna represents Nωnitro-L-arginine, and Pal represents 3-pyridyl-L-alanine. ]

また、これらのペプチドは、N末端に[AcD-Nty]を、C末端にCを有する以下の構成であってもよい。
[AcD-Nty]F[Nty]LYN[Nna]GDPL[Nty]LC、
[AcD-Nty]QSV[Nty]PDHWS[Pal]C、
[AcD-Nty]F[Nty]W[Nty]IWPKNYC、
[AcD-Nty]VS[Nty]T[Pal][Nty]WYWDC、
[AcD-Nty][Pal]NFGPLWSKLS[Nna]C、及び
[AcD-Nty]LKS[Nty]LSWVYKSC
〔式中、AcD-Ntyは、N-アセチル-3-ニトロ-D-チロシンを表し、Ntyは、3-ニトロ-L-チロシンを表し、Nnaは、Nωニトロ-L-アルギニンを表し、Palは、3-ピリジル-L-アラニンを表す。各ペプチドは、AcD-Ntyのアセチル基とシステイン残基がチオエーテル結合して環状化していてもよい。〕 Further, these peptides may have the following constitutions having [ Ac D-Nty] at the N-terminal and C at the C-terminal.
[ Ac D-Nty] F [Nty] LYN [Nna] GDPL [Nty] LC,
[ Ac D-Nty] QSV [Nty] PDHWS [Pal] C,
[ Ac D-Nty] F [Nty] W [Nty] IWPKNYC,
[ Ac D-Nty] VS [Nty] T [Pal] [Nty] WYWDC,
[ Ac D-Nty] [Pal] NFGPLWSKLS [Nna] C, and
[ Ac D-Nty] LKS [Nty] LSWVYKSC
[In the formula, Ac D-Nty represents N-acetyl-3-nitro-D-tyrosine, Nty represents 3-nitro-L-tyrosine, Nna represents Nωnitro-L-arginine, and Pal. Represents 3-pyridyl-L-alanine. Each peptide may be cyclized by thioether-bonding the acetyl group of Ac D-Nty and the cysteine residue. ]

本明細書において、「1又は数個のアミノ酸が付加、置換又は欠失する」という場合、得られたペプチドがFcRnに結合する限り、その個数及び場所は問わない。1個から5個、例えば、2個、3個、又は4個のアミノ酸が付加、置換、又は欠失してもよく、付加、置換又は欠失する位置は、N末端又はC末端でもよく、末端以外であってもよい。2個以上の付加、置換又は欠失を含む場合、連続していても連続していなくてもよい。
また上記ペプチドのC末端は、OH、NH2、エステル等であってもよく、PEG、アルキル鎖、ピペリジン等が結合していてもよい。
本発明のポリペプチドには、ポリペプチドの塩も含まれる。ポリペプチドの塩としては、生理学的に許容される塩基や酸との塩が用いられ、例えば、無機酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等）の付加塩、有機酸（p-トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、p-ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等）の付加塩、無機塩基（水酸化アンモニウム又はアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等）、アミノ酸の付加塩等が挙げられる。
また、本発明のポリペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、リン酸化、メチル化、アセチル化、アデニリル化、ADPリボシル化、糖鎖付加などの修飾が加えられたものであってもよい。他のペプチドやタンパク質と融合させたものであってもよい。 In the present specification, when "one or several amino acids are added, substituted or deleted", the number and location thereof do not matter as long as the obtained peptide binds to FcRn. One to five, for example, two, three, or four amino acids may be added, substituted, or deleted, and the position of addition, substitution or deletion may be N-terminal or C-terminal. It may be other than the terminal. It may or may not be contiguous if it contains more than one addition, substitution or deletion.
Further, the C-terminal of the peptide may be OH, NH 2 , ester or the like, or PEG, an alkyl chain, piperidine or the like may be bonded.
The polypeptide of the present invention also includes salts of the polypeptide. As the salt of the polypeptide, a salt with a physiologically acceptable base or acid is used, and for example, an addition salt of an inorganic acid (hydrochloride, hydrobromic acid, hydroiodide, sulfuric acid, phosphoric acid, etc.), Addition salts of organic acids (p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, oxalic acid, p-bromophenylsulfonic acid, carboxylic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid, acetic acid, etc.), inorganic bases (ammonium hydroxide or alkali) Alternatively, alkaline earth metal hydroxides, carbonates, bicarbonates, etc.), added salts of amino acids, etc. may be mentioned.
Further, the polypeptide of the present invention is modified with phosphorylation, methylation, acetylation, adenylylation, ADP ribosylation, glycosylation and the like as long as it solves the problem of the present invention. May be. It may be fused with another peptide or protein.

上記pH依存的にFcRnに結合するペプチドの具体例としては、以下に示す8D-01～8D-06や2G01Dが挙げられる。

Figure 0007049569000004
Figure 0007049569000005
 Specific examples of the pH-dependent peptide that binds to FcRn include 8D-01 to 8D-06 and 2G01D shown below.
Figure 0007049569000004
Figure 0007049569000005

2G01Dは、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を5つ含む16アミノ酸からなる環状ペプチドである。
後述する実施例で示されるとおり、この環状ペプチドとFcRnとの結合に関する解離定数は、pH7.4とpH6.0では70倍近く異なった。 2G01D is a cyclic peptide consisting of 16 amino acids containing 5 special amino acids whose side chain charge changes depending on pH.
As shown in the examples described below, the dissociation constants for the binding of this cyclic peptide to FcRn differed nearly 70-fold between pH 7.4 and pH 6.0.

本発明は、本発明に係るスクリーニング方法を行うためのキットも提供する。かかるキットの内容は特に限定されないが、pH調整剤やpH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を含む各種試薬、各種ライブラリー、緩衝液等を含み得る。その他の必要な器具や取扱説明書等を備えていてもよい。 The present invention also provides a kit for performing the screening method according to the present invention. The contents of such a kit are not particularly limited, but may include a pH adjuster, various reagents containing a special amino acid whose side chain charge changes depending on pH, various libraries, a buffer solution, and the like. Other necessary equipment, instruction manuals, etc. may be provided.

本明細書において引用されるすべての特許文献及び非特許文献の開示は、全体として本明細書に参照により組み込まれる。 Disclosures of all patented and non-patented documents cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

以下、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明は何らこれに限定されるものではない。当業者は、本発明の意義を逸脱することなく様々な態様に本発明を変更することができ、かかる変更も本発明の範囲に含まれる。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on examples, but the present invention is not limited thereto. Those skilled in the art can modify the invention in various embodiments without departing from the meaning of the invention, and such modifications are also included in the scope of the invention.

〔NNK mRNAライブラリーの製造〕
まず、下記の配列を有する二本鎖DNAを調製した（以下では、Forward鎖のみを5'→3'の順で記載する。）
TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATATACAT(ATG)(NNK)1(NNK)2・・・(NNK)n(TGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(TAG)GACGGGGGGCGGAAA
（ORF領域は一つのコドンを一つの( )で括った。NはA、T、G、Cのいずれか一つを、KはT、Gのいずれか一つを、それぞれ表す。nは、4－12の9種類である。 [Manufacturing of NNK mRNA library]
First, a double-stranded DNA having the following sequence was prepared (hereinafter, only the Forward strand is described in the order of 5'→ 3').
TAATACGACTCACTATAGGGTTAACTTTAAGAAGGAGATACAT (ATG) (NNK) 1 (NNK) 2・ ・ ・ (NNK) n (TGC) (GGC) (AGC) (GGC) (AGC) (GGC) (AGC) (TAG) GACGGGGGGCGGAAA
(The ORF region encloses one codon in one (). N represents any one of A, T, G, and C, and K represents any one of T and G. N is. There are 9 types of 4-12.

続いてこれをT7 RNAポリメラーゼを用いて転写し、下記の配列で表されるmRNAを得た。
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAU(AUG)(NNK)1(NNK)2・・・(NNK)n(UGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(GGC)(AGC)(UAG)GACGGGGGGCGGAAA
（NはA、U、G、Cのいずれか一つを、KはU、Gのいずれか一つを、それぞれ表す。） Subsequently, this was transcribed using T7 RNA polymerase to obtain mRNA represented by the following sequence.
GGGUUAACUUUAAGAAGGAGAUAUACAU (AUG) (NNK) 1 (NNK) 2・ ・ ・ (NNK) n (UGC) (GGC) (AGC) (GGC) (AGC) (GGC) (AGC) (UAG) GACGGGGGGCGGAAA
(N represents any one of A, U, G, and C, and K represents any one of U and G.)

〔RNAディスプレイ〕
以下の「ピューロマイシンリンカーとの連結」から「回収したペプチドの配列情報の増幅」までのサイクルを繰り返すことで、ランダムなペプチドライブラリーからFcRnに結合するペプチドを選択した。図１にRNAディスプレイの概念図を示す。 [RNA display]
Peptides that bind to FcRn were selected from a random peptide library by repeating the cycle from "linkage with puromycin linker" to "amplification of sequence information of recovered peptides". FIG. 1 shows a conceptual diagram of an RNA display.

［1］ ピューロマイシンリンカーとの連結
下記の配列で表されるピューロマイシンリンカーを上記のmRNAライブラリーとアニールさせ、T4 RNA ligase で連結した（SPC18はCとOの総数が18であるPEGを表す。Puはピューロマイシンを表す）。
pdCTCCCGCCCCCCGTCC(SPC18)5CC(Pu) [1] Concatenation with puromycin linker The puromycin linker represented by the following sequence was annealed with the above mRNA library and ligated with T4 RNA ligase (SPC18 represents PEG in which the total number of C and O is 18). . Pu stands for puromycin).
pdCTCCCGCCCCCCGTCC (SPC18) 5 CC (Pu)

［2］ 翻訳
リンカーと連結されたmRNAを、図２に示される改変された遺伝暗号表の下で翻訳した。本実施例の場合には、通常の２０種類のアミノ酸からメチオニン、アルギニンが除去された翻訳系を構築し、代わりに、
(i) tRNAfMet CAUにα-N-クロロアセチル-3-ニトロ-D-チロシン(ClAc-D-Nty)を連結したもの、
(ii) tRNAAsnE2 CAUに3-ニトロ-L-チロシン(Nty)を連結したもの、
(iii) tRNAAsnE2 CUAにω-N-ニトロ-L-アルギニン(Nna)を連結したもの、
(iv) tRNAAsnE2 ACGに3-ピリジル-L-アラニン(Pal)を連結したもの、及び
(v) tRNAAsnE2 CCGに4-アミノ-L-フェニルアラニン(Aph)を連結したもの
の５つを、フレキシザイムを用いて調製・添加して翻訳を行った。
翻訳によって、ランダム配列中に(i)から(v)の非タンパク質性アミノ酸を含み、チオエーテル結合で環状化したペプチドライブラリーが合成され、ペプチドのC末端にPuが結合することで、mRNAとペプチドが連結される。 [2] Translation The mRNA ligated with the linker was translated under the modified genetic code table shown in FIG. In the case of this example, a translation system was constructed in which methionine and arginine were removed from the usual 20 kinds of amino acids, and instead,
(i) tRNA fMet CAU ligated with α-N-chloroacetyl-3-nitro-D-tyrosine (ClAc-D-Nty),
(ii) TRNA AsnE2 CAU ligated with 3-nitro-L-tyrosine (Nty),
(iii) tRNA AsnE2 CUA ligated with ω-N-nitro-L-arginine (Nna),
(iv) tRNA AsnE2 ACG ligated with 3-pyridyl-L-alanine (Pal), and
(v) Five of tRNA AsnE2 CCG ligated with 4-amino-L-phenylalanine (Aph) were prepared and added using flexizyme for translation.
Translation synthesizes a peptide library containing non-protein amino acids (i) to (v) in a random sequence and cyclized with a thioether bond, and Pu binds to the C-terminus of the peptide to bind mRNA to the peptide. Are concatenated.

［3］FcRnに結合するペプチドの取得
NHS－ビオチンを用いて化学的にビオチン化したヒト可溶型FcRnに、調製した特殊環状ペプチドライブラリーを混合し、pH 6.0のMESバッファー中で、4℃で30分間撹拌した。さらにストレプトアビジン磁気ビーズを加えて4℃で5分間撹拌した。磁石を利用して上澄みを除去し、残った磁性粒子をpH 6.0のMESバッファーで洗浄した。
ビーズにPCR用の溶液を加えて95°Cで５分間加熱し、ペプチドをビーズからはがして上澄みを回収した。 [3] Acquisition of peptide that binds to FcRn
The prepared special cyclic peptide library was mixed with human soluble FcRn chemically biotinylated with NHS-biotin, and stirred at 4 ° C. for 30 minutes in MES buffer at pH 6.0. Further, streptavidin magnetic beads were added, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 5 minutes. The supernatant was removed using a magnet and the remaining magnetic particles were washed with pH 6.0 MES buffer.
A solution for PCR was added to the beads and heated at 95 ° C. for 5 minutes, and the peptide was peeled off from the beads to recover the supernatant.

［4］ 回収したペプチドの配列情報の増幅
FcRnに結合して回収されてきたペプチド－mRNAを、逆転写してcDNAとし、PCRによって増幅した。得られたDNAを転写してmRNAとした。なお、ラウンド2以降では、RNAアプタマーが選択されてくることを防ぐため、mRNAとペプチドの連結直後に逆転写を実施した。 [4] Amplification of sequence information of recovered peptides
The peptide-mRNA that had been recovered by binding to FcRn was reverse transcribed into cDNA, which was amplified by PCR. The obtained DNA was transcribed into mRNA. In Round 2 and subsequent rounds, reverse transcription was performed immediately after the ligation of mRNA and peptide to prevent RNA aptamers from being selected.

［5］ 選択されたペプチド配列の同定
上記の一連の操作を繰り返し、FcRnに特異的に結合する配列の濃縮を行った。 [5] Identification of the selected peptide sequence The above series of operations was repeated to concentrate the sequence that specifically binds to FcRn.

〔セレクションの結果〕
セレクションの結果を図３に示す。
mRNAディスプレイによるFcRn結合ペプチドの取得を行った結果、ラウンド6でFcRn依存的にcDNA回収率の増加が確認できた。そこで、再度ラウンド6を実施し、pH 6.0のMESバッファーで洗浄後のビーズに、pH 7.4のMESバッファーを加え、室温で20分間撹拌後、上澄みを回収した。継続して、ラウンド７も同様の溶出を行ったところ、cDNA回収率の増加が再度確認できた。 [Result of selection]
The results of the selection are shown in FIG.
As a result of obtaining the FcRn-binding peptide by mRNA display, it was confirmed that the cDNA recovery rate increased in a FcRn-dependent manner in Round 6. Therefore, Round 6 was carried out again, MES buffer of pH 7.4 was added to the beads washed with MES buffer of pH 6.0, and the mixture was stirred at room temperature for 20 minutes, and the supernatant was recovered. When the same elution was continuously performed in Round 7, the increase in the cDNA recovery rate was confirmed again.

〔選択されたペプチド配列の同定〕
ラウンド７の後、PCRにより増幅されたDNAを用いてTAクローニングを行い、得られたペプチドの配列を同定した。結果を下表に示す。

Figure 0007049569000006
[Identification of selected peptide sequences]
After round 7, TA cloning was performed using the DNA amplified by PCR, and the sequence of the obtained peptide was identified. The results are shown in the table below.
Figure 0007049569000006

〔選択されたペプチドのFcRnに対するpH依存的結合評価評価〕
選択されたペプチドの配列のうち、もっとも出現頻度が高かった8D-01を用い、クローンでの結合能評価を前述のmRNAディスプレイを用いて評価した。FcRnとペプチド-mRNAの相互作用時には、pH 6.0もしくはpH 7.4のMESバッファーを用いた。ペプチド-mRNAの溶出は、ビーズにPCR用の溶液を加えて95°Cで５分間加熱し、ペプチドをビーズからはがして上澄みを回収した。
結果を図４に示す。pH 6.0のバッファーでFcRnと相互作用した場合、pH 7.4のバッファーと比べ、cDNAの回収率が圧倒的に高く、バッファーのpH依存的にcDNAの回収率が変化した。 [Evaluation of pH-dependent binding of selected peptides to FcRn]
Among the sequences of the selected peptides, 8D-01, which had the highest frequency of appearance, was used, and the binding ability in clones was evaluated using the above-mentioned mRNA display. A pH 6.0 or pH 7.4 MES buffer was used during the FcRn-peptide-mRNA interaction. To elute the peptide-mRNA, a solution for PCR was added to the beads and heated at 95 ° C. for 5 minutes, and the peptide was peeled off from the beads to recover the supernatant.
The results are shown in FIG. When interacting with FcRn in a pH 6.0 buffer, the cDNA recovery rate was overwhelmingly higher than that in the pH 7.4 buffer, and the cDNA recovery rate changed depending on the pH of the buffer.

〔固相合成されたペプチドのFcRnに対するpH依存的結合評価〕
ペプチド単独でも、pH依存的にFcRnと相互作用するかを確かめるため、8D-01のC末端側のSGSGSを持たず、C末端がアミド化されたペプチド2G01Dを固相上で合成し、Biacore T100 (GEヘルスケア社)を用いて、その解離定数Kd結合定数を測定した。FcRnはアミンカップリング法でセンサーチップに固定した。2G01Dを以下に示す。

Figure 0007049569000007
また、pH 6.0もしくは7.4のリン酸バッファーにアナライトとして固相合成されたペプチド2G01Dを加え、解離定数を測定した。
結果を下表に示す。解離定数は、pH 6.0では4.3 nM、pH 7.4では290 nMとなり、pH依存的に約70倍、解離定数が変化した。
Figure 0007049569000008
 [Evaluation of pH-dependent binding of solid-phase synthesized peptides to FcRn]
In order to confirm whether the peptide alone interacts with FcRn in a pH-dependent manner, the peptide 2G01D, which does not have SGSGS on the C-terminal side of 8D-01 and has the C-terminal amidated, was synthesized on the solid phase and Biacore T100. The dissociation constant Kd binding constant was measured using (GE Healthcare). FcRn was fixed to the sensor chip by the amine coupling method. 2G01D is shown below.
Figure 0007049569000007
 In addition, peptide 2G01D synthesized in solid phase as an analyze was added to a phosphate buffer having a pH of 6.0 or 7.4, and the dissociation constant was measured.
The results are shown in the table below. The dissociation constant was 4.3 nM at pH 6.0 and 290 nM at pH 7.4, and the dissociation constant changed about 70 times in a pH-dependent manner.
Figure 0007049569000008

Claims (14)

標的分子に対して、第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しないペプチドを選択するスクリーニング方法であって、該ペプチドは、ペプチドを構成するアミノ酸の数が3から50であり、
核酸ライブラリーであって、各核酸が、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドをコードするランダムな配列を有する核酸ライブラリーを合成する工程と、
前記核酸ライブラリーを用いて、前記ペプチドを発現させ、ランダムな配列を有するペプチドライブラリーを製造する工程と、
前記ペプチドライブラリーと前記標的分子を前記第1のpH条件下で接触させてインキュベートし、該標的分子に結合するペプチドを選択する工程と、
前記標的分子に結合したペプチドから、前記第2のpH条件では該標的分子と結合しないものを選択する工程と、を含む方法。 A screening method for selecting a peptide that binds to a target molecule at a first pH and not at a second pH, wherein the peptide has 3 to 50 amino acids constituting the peptide.
A process of synthesizing a nucleic acid library in which each nucleic acid has a random sequence encoding a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH.
A step of expressing the peptide using the nucleic acid library to produce a peptide library having a random sequence, and
A step of contacting and incubating the peptide library and the target molecule under the first pH condition to select a peptide to be bound to the target molecule.
A method comprising a step of selecting a peptide bound to the target molecule that does not bind to the target molecule under the second pH condition. 標的分子に対して、第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しないペプチドを選択するスクリーニング方法であって、該ペプチドは、ペプチドを構成するアミノ酸の数が3から50であり、
pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドと、これをコードする核酸とが結合したランダムな配列を有するペプチド－核酸複合体ライブラリーを合成する工程と、
前記ペプチド－核酸複合体ライブラリーと前記標的分子とを前記第1のpH条件下で接触させてインキュベートし、該標的分子に結合するペプチド－核酸複合体を選択する工程(a)と、
前記選択されたペプチド－核酸複合体の核酸を含む核酸ライブラリーを得て、ペプチド－核酸複合体ライブラリーを製造する工程(b)と、
前記工程(a)及び(b)を1回以上行う工程と、
再度工程(a)を行い、前記標的分子に結合したペプチド－核酸複合体を前記第2のpH条件で溶出して、溶出されたペプチドを同定する工程と、を含む方法。 A screening method for selecting a peptide that binds to a target molecule at a first pH and not at a second pH, wherein the peptide has 3 to 50 amino acids constituting the peptide.
A step of synthesizing a peptide-nucleic acid complex library having a random sequence in which a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH and a nucleic acid encoding the peptide are bound to each other.
The step (a) of contacting and incubating the peptide-nucleic acid complex library and the target molecule under the first pH condition to select a peptide-nucleic acid complex to be bound to the target molecule.
The step (b) of obtaining a nucleic acid library containing the nucleic acid of the selected peptide-nucleic acid complex and producing the peptide-nucleic acid complex library, and
The step of performing the steps (a) and (b) one or more times, and
A method comprising the step (a) of performing the step (a) again, eluting the peptide-nucleic acid complex bound to the target molecule under the second pH condition, and identifying the eluted peptide. 標的分子に対して、第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しないペプチドを製造する方法であって、該ペプチドは、ペプチドを構成するアミノ酸の数が3から50であり、
核酸ライブラリーであって、各核酸が、pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドをコードするランダムな配列を有する核酸ライブラリーを合成する工程と、
前記核酸ライブラリーを用いて、前記ペプチドを発現させ、ランダムな配列を有するペプチドライブラリーを製造する工程と、
前記ペプチドライブラリーと前記標的分子を前記第1のpH条件下で接触させてインキュベートし、該標的分子に結合するペプチドを選択する工程と、
前記標的分子に結合したペプチドから、前記第2のpH条件では該標的分子と結合しないものを選択する工程と、を含む方法。 A method for producing a peptide that binds to a target molecule at a first pH and not at a second pH, wherein the peptide has 3 to 50 amino acids constituting the peptide.
A process of synthesizing a nucleic acid library in which each nucleic acid has a random sequence encoding a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH.
A step of expressing the peptide using the nucleic acid library to produce a peptide library having a random sequence, and
A step of contacting and incubating the peptide library and the target molecule under the first pH condition to select a peptide to be bound to the target molecule.
A method comprising a step of selecting a peptide bound to the target molecule that does not bind to the target molecule under the second pH condition. 標的分子に対して、第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しないペプチドを製造する方法であって、該ペプチドは、ペプチドを構成するアミノ酸の数が3から50であり、
pH依存的に側鎖のチャージが変化する特殊アミノ酸を少なくとも1つ含むペプチドと、これをコードする核酸とが結合したランダムな配列を有するペプチド－核酸複合体ライブラリーを合成する工程と、
前記ペプチド－核酸複合体ライブラリーと前記標的分子とを前記第1のpH条件下で接触させてインキュベートし、該標的分子に結合するペプチド－核酸複合体を選択する工程(a)と、
前記選択されたペプチド－核酸複合体の核酸を含む核酸ライブラリーを得て、ペプチド－核酸複合体ライブラリーを製造する工程(b)と、
前記工程(a)及び(b)を1回以上行う工程と、
再度工程(a)を行い、前記標的分子に結合したペプチド－核酸複合体を前記第2のpH条件で溶出して、溶出されたペプチドを同定する工程と、を含む方法。 A method for producing a peptide that binds to a target molecule at a first pH and not at a second pH, wherein the peptide has 3 to 50 amino acids constituting the peptide.
A step of synthesizing a peptide-nucleic acid complex library having a random sequence in which a peptide containing at least one special amino acid whose side chain charge changes depending on pH and a nucleic acid encoding the peptide are bound to each other.
The step (a) of contacting and incubating the peptide-nucleic acid complex library and the target molecule under the first pH condition to select a peptide-nucleic acid complex to be bound to the target molecule.
The step (b) of obtaining a nucleic acid library containing the nucleic acid of the selected peptide-nucleic acid complex and producing the peptide-nucleic acid complex library, and
The step of performing the steps (a) and (b) one or more times, and
A method comprising the step (a) of performing the step (a) again, eluting the peptide-nucleic acid complex bound to the target molecule under the second pH condition, and identifying the eluted peptide. 前記pH依存的に側鎖のチャージが変化するアミノ酸は、側鎖にpH6～8でプロトン化状態が変化する官能基を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the amino acid whose side chain charge changes depending on the pH contains a functional group whose side chain changes its protonation state at pH 6-8. 前記pH依存的に側鎖のチャージが変化するアミノ酸は、以下から選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法：
3位、又は3位および5位に、NO2、Cl、Br、I、SO2R（Rは、OH、NH2、又はArを表す。）、COR（Rは、OH、NH2、Ar、CF3、又はC6F5を表す。）、CN、CF3、若しくはC6F5を有するチロシン又はそのN-置換体；
Nωに、NO2、SO2R（Rは、OH、NH2、又はArを表す。）、COR（Rは、OH、NH2、Ar、CF3、又はC6F5を表す）、CN、CF3、若しくはC6F5を有するアルギニン又はそのN-置換体；
2位、3位、若しくは4位にアミノ基を有するフェニルアラニン又はそのN-置換体；及び
2-ピリジルアラニン、3-ピリジルアラニン、若しくは4-ピリジルアラニン又はそれらのN-置換体。 The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the amino acid whose side chain charge changes depending on the pH is selected from the following.
NO 2 , Cl, Br, I, SO 2 R (R stands for OH, NH 2 , or Ar), COR (R stands for OH, NH 2 , Ar) in 3rd, or 3rd and 5th place. , CF 3 , or C 6 F 5 ), CN, CF 3 , or tyrosine with C 6 F 5 or its N-substituent;
For Nω, NO 2 , SO 2 R (R stands for OH, NH 2 , or Ar), COR (R stands for OH, NH 2 , Ar, CF 3 , or C 6 F 5 ), CN , CF 3 , or arginine with C 6 F 5 or its N-substituent;
Phenylalanine having an amino group at the 2-position, 3-position, or 4-position or its N-substituted product; and
2-Pyridylalanine, 3-Pyridylalanine, or 4-Pyridylalanine or N-substitutes thereof. 前記pH依存的に側鎖のチャージが変化するアミノ酸は、以下に示す群から選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法：
Figure 0007049569000009
 The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the amino acid whose side chain charge changes depending on pH is selected from the group shown below.
Figure 0007049569000009
 前記ペプチドは、環状ペプチドである、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 7, wherein the peptide is a cyclic peptide. 前記標的分子に対して、第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しないペプチドが、がん細胞で発現しているタンパク質に特異的に結合するペプチドであって、
前記標的分子を癌細胞で発現しているタンパク質とし、第1のpHを弱酸性、第2のpHを弱塩基性とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。 A peptide that binds to the target molecule at a first pH and not at a second pH is a peptide that specifically binds to a protein expressed in cancer cells.
The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the target molecule is a protein expressed in cancer cells, the first pH is weakly acidic, and the second pH is weakly basic. 前記標的分子に対して、第1のpHでは結合し、第2のpHでは結合しないペプチドが、ピノサイトーシス後リサイクルされるペプチドであって、
前記標的分子をneonatal Fc receptor（FcRn）とし、第1のpHを弱酸性、第2のpHを弱塩基性とする、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。 A peptide that binds to the target molecule at a first pH and does not bind at a second pH is a peptide that is recycled after pinocytosis.
The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the target molecule is a neonatal Fc receptor (FcRn), the first pH is weakly acidic, and the second pH is weakly basic. 前記標的分子が抗原またはサイトカイン受容体である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 8, wherein the target molecule is an antigen or a cytokine receptor. 以下のいずれかのアミノ酸配列を含むペプチド：
[AcD-Nty]F[Nty]LYN[Nna]GDPL[Nty]LC、
[AcD-Nty]QSV[Nty]PDHWS[Pal]C、
[AcD-Nty]F[Nty]W[Nty]IWPKNYC、
[AcD-Nty]VS[Nty]T[Pal][Nty]WYWDC、
[AcD-Nty][Pal]NFGPLWSKLS[Nna]C、及び
[AcD-Nty]LKS[Nty]LSWVYKSC
〔式中、AcD-Ntyは、N-アセチル-3-ニトロ-D-チロシンを表し、Ntyは、3-ニトロ-L-チロシンを表し、Nnaは、Nωニトロ-L-アルギニンを表し、Palは、3-ピリジル-L-アラニンを表す。各ペプチドは、AcD-Ntyのアセチル基とシステイン残基がチオエーテル結合して環状化している。〕 Peptides containing any of the following amino acid sequences:
[AcD-Nty] F [Nty] LYN [Nna] GDPL [Nty] LC,
[AcD-Nty] QSV [Nty] PDHWS [Pal] C,
[AcD-Nty] F [Nty] W [Nty] IWPKNYC,
[AcD-Nty] VS [Nty] T [Pal] [Nty] WYWDC,
[AcD-Nty] [Pal] NFGPLWSKLS [Nna] C, and
[AcD-Nty] LKS [Nty] LSWVYKSC
[In the formula, AcD-Nty stands for N-acetyl-3-nitro-D-tyrosine, Nty stands for 3-nitro-L-tyrosine, Nna stands for Nωnitro-L-arginine, and Pal stands for Pal. , 3-Represents pyridyl-L-alanine. Each peptide is cyclized by thioether-bonding the acetyl group of AcD-Nty and the cysteine residue. ] 以下のいずれかのアミノ酸配列において1個のアミノ酸が置換したアミノ酸配列を含み、弱酸性のpHにおいてFcRnに結合し、弱塩基性のpHにおいてFcRnに結合しないペプチド：
[AcD-Nty]F[Nty]LYN[Nna]GDPL[Nty]LC、
[AcD-Nty]QSV[Nty]PDHWS[Pal]C、
[AcD-Nty]F[Nty]W[Nty]IWPKNYC、
[AcD-Nty]VS[Nty]T[Pal][Nty]WYWDC、
[AcD-Nty][Pal]NFGPLWSKLS[Nna]C、及び
[AcD-Nty]LKS[Nty]LSWVYKSC
〔式中、AcD-Ntyは、N-アセチル-3-ニトロ-D-チロシンを表し、Ntyは、3-ニトロ-L-チロシンを表し、Nnaは、Nωニトロ-L-アルギニンを表し、Palは、3-ピリジル-L-アラニンを表す。各ペプチドは、AcD-Ntyのアセチル基とシステイン残基がチオエーテル結合して環状化している。〕 A peptide containing an amino acid sequence in which one amino acid is substituted in any of the following amino acid sequences, which binds to FcRn at a weakly acidic pH and does not bind to FcRn at a weakly basic pH :
[AcD-Nty] F [Nty] LYN [Nna] GDPL [Nty] LC,
[AcD-Nty] QSV [Nty] PDHWS [Pal] C,
[AcD-Nty] F [Nty] W [Nty] IWPKNYC,
[AcD-Nty] VS [Nty] T [Pal] [Nty] WYWDC,
[AcD-Nty] [Pal] NFGPLWSKLS [Nna] C, and
[AcD-Nty] LKS [Nty] LSWVYKSC
[In the formula, AcD-Nty stands for N-acetyl-3-nitro-D-tyrosine, Nty stands for 3-nitro-L-tyrosine, Nna stands for Nωnitro-L-arginine, and Pal stands for Pal. , 3-Represents pyridyl-L-alanine. Each peptide is cyclized by thioether-bonding the acetyl group of AcD-Nty and the cysteine residue. ] 請求項１２又は１３に記載のペプチドと、医薬との複合体。 A complex of the peptide according to claim 12 or 13 and a pharmaceutical product.
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