JP7043412B2

JP7043412B2 - 疾患の不均一性を特徴づけるための転移性疾患における、循環腫瘍細胞（ｃｔｃ）の単一細胞ゲノムプロファイリング

Info

Publication number: JP7043412B2
Application number: JP2018543010A
Authority: JP
Inventors: ディッタモアライアン; マルリヌッチデナ
Original assignee: エピックサイエンシス，インコーポレイテッド
Priority date: 2015-11-03
Filing date: 2016-11-01
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2036-11-01
Also published as: US20180321247A1; CA3004150A1; AU2016348401A1; EA201891085A1; CN115341033A; US20210405055A1; WO2017079139A1; EP3371327A4; CN108603233A; JP2018534595A; EP3371327A1; AU2023200364A1; IL259093A

Description

本件出願は、2015年11月3日に出願された米国仮出願第62/250,422号の利益を主張するものであり、この仮出願の全内容は、引用により本明細書中に組み込まれている。

本発明は一般に、癌診断の分野、及びより具体的には、疾患の不均一性を特徴づけるための循環腫瘍細胞（CTC）の単一細胞ゲノムプロファイリングについての方法に関する。

（背景）
連続的な癌治療の後、癌細胞の複数の亜集団が生じ、これらはそれぞれ薬物への抵抗性又は感受性を付与し得る異なる遺伝的異常を備える。組織生検ではこれらの亜集団を検出することができないが、血液の液体生検は、これらの重要な腫瘍細胞を同定し、患者の腫瘍がどのように経時的に発展してきたかを特徴づける一助とすることができる。単一細胞ゲノムプロファイリングは、癌の発展及び多様性を研究し、並びに腫瘍の発達における希少細胞の役割を理解するための、強力な新たなツールである。クローンの多様性は、浸潤、転移、及び治療への抵抗性の発展において重要な役割を果たすように運命づけられる。

前立腺癌は、米国（US）において最もよく診断される固形臓器悪性腫瘍であり、依然として米国人男性の間の癌による死亡の2番目の原因となっている。2014年だけでも、前立腺癌の予測される発生数は233,000症例であり、男性29,480名が死亡に至るとされ、このことは転移性前立腺癌治療をまさに未だ満たされていない医療ニーズとしている（Siegelらの文献、2014. CA Cancer J Clin. 2014;64(1):9-29）。欧州の疫学的研究は、2012年の、新規症例416700例の推定発生数に匹敵するデータを示し、これは男性における癌診断の22.8％を占めている。合計で92200例のPCと特定される死亡が予想され、これは男性の最も可能性のある死因となる3種の癌の一つであり、死亡率は9.5％である。

化学的又は外科的去勢を使用する前立腺癌のホルモン療法の成功は証明されているものの、大部分の患者はやがて転移性の疾患段階へと進行することとなり、さらなるホルモン処置に対する抵抗性を示す。これを、転移性去勢抵抗性前立腺癌（mCRPC）と呼ぶ。しかしながら、この呼称にもかかわらず、去勢レベルのアンドロゲンに直面した場合さえも、アンドロゲン受容体（AR）仲介性シグナル伝達及び遺伝子発現が、mCRPCにおいて持続され得ることの証拠が存在する。このことは部分的に、アンドロゲン合成に関与する酵素の上方調節、ARの過剰発現、又は様々なステロイド性リガンドの無差別的認識を有する変異型ARの出現に起因し得る。アンドロゲン受容体（AR）遺伝子の増幅は、mCRPCの20～30％に認められ、ホルモン除去療法の結果として発達し、治療の失敗の最も重要な原因となることが提唱されている。mCRPCを有する患者の治療は、依然として重大な臨床的課題である。研究によりさらに、PI3K-AKT-mTOR及びアンドロゲン受容体（AR）シグナル伝達軸の間の直接的関係が明らかにされ、その結果ホルモン抵抗性の発達の間のこれらの経路間の動的相互作用が明らかにされた。PTENはヒト前立腺癌において最もよく欠失され/変異が入る腫瘍サプレッサー遺伝子の1つである。脂質ホスファターゼ及びPI3K/AKT/mTOR経路の負の調節因子として、PTENは生存、成長、増殖、代謝、遊走、及び細胞構造を含む、いくつかの細胞過程を制御する。PTENの喪失を、前立腺癌の診断的及び予後的バイオマーカーとして使用し、並びに出現するPI3K/AKT/mTOR阻害剤への患者の反応を予測することができる。

2004年よりも前、mCRPCを有する男性の生存を向上することが証明された治療は存在しなかった。ミトキサントロンと、プレドニゾン又はヒドロコルチゾンによる患者の治療は、疼痛を軽減し、かつ生活の質を向上することのみを目的としていたが、全生存期間（OS）の観点からの利点は存在しなかった。2004年に、2つの主要な第3相臨床試験、TAX 327及びSWOG（米国南西部癌臨床試験グループ（Southwest Oncology Group））9916の結果により、mCRPCを有する患者の第一化学療法選択肢として、Taxotere（登録商標）（ドセタキセル）が確立された。アンドロゲン受容体（AR）標的化療法、化学療法、併用療法、及び免疫療法と共に行う追加のホルモン治療がmCRPCについて研究されており、近年の結果により、この難治療性患者群における追加の選択肢が提供された。過去5年間のみでも、転移性去勢抵抗性前立腺癌（mCRPC）患者の治療のために試験されかつ承認された新規薬剤が飛躍的に増加したことにより、これらの薬剤の最適な順番又は組合わせに関する問題点が生じてきている。最良の順番を決定するアプローチについて、臨床医を直接補助するいくつかの指針が存在し、かつそれらのほとんどは、症状の有無、パフォーマンスステータス、並びに疾患の負担を評価し、これらの薬剤に関する最良の順番を決定することを補助する（Mohlerらの文献、2014, J Natl Compr Canc Netw. 2013;11(12):1471-1479；Cooksonらの文献、2013, J Urol. 2013;190(2):429-438）。現在、承認されている治療は、Taxotere（登録商標）（ドセタキセル）及びJevtana（登録商標）（カバジタキセル）などのタキサンクラスの細胞傷害性薬剤、並びにZytiga（登録商標）（アンドロゲン生産を遮断する、アルビテロン（arbiterone））又はXtandi（登録商標）（アンドロゲン受容体（AR）阻害剤である、エンザルタミド）などの抗アンドロゲンホルモン療法薬からなる。

臨床医にとっての課題は、患者に最大の恩恵を提供するためのこれらの療法を施す最良の順番を決定することである。しかし療法の失敗は、各薬剤からの交差抵抗性を考慮した、患者間の治療に対する不均一な反応を基づく重大な課題であり続けている（Mezynskiらの文献、Ann Oncol. 2012;23(11):2943-2947；Noonanらの文献、Ann Oncol. 2013;24(7):1802-1807；Pezaroらの文献、Eur Urol. 2014, 66( 3): 459-465）。加えて患者は、全生存期間の向上を提供することが証明されている各薬物から実質的恩恵を得るための治療域を外れることがある。従って、標的化療法から恩恵を受ける可能性が最大である標的集団を同定するより良い方法は、重要な目標であり続けている。

循環腫瘍細胞(CTC)は、癌診断において著しい利点を示し、それらの非侵襲的測定によりさらにより魅力的なものとなっている（Cristofanilliらの文献、N Engl J Med, 2004, 351:781-91）。原発性腫瘍部位又はその転移部位のいずれかから放出されたCTCは、その腫瘍の生物学に関する重要な情報を保持している。歴史的に、血流中のCTCの極めて低いレベルは、それらの未知の表現型と一緒に、それらの検出を著しく妨げ、かつそれらの臨床的有用性を制限している。CTCの情報を利用するために、それらの検出、単離、及び特徴づけに関する様々な技術が近年出現している。CTCは治療中にリアルタイムで癌の増悪を評価する非侵襲的な手段を提供し、さらに、治療に反応して生じる表現型上の、生理的な、及び遺伝的変化をモニタリングすることにより、直接の治療を補助する潜在性を有する。大部分の進行した前立腺癌患者において、原発性腫瘍が摘出され、CTCは転移から放出される細胞からなると期待され、「液体生検」を提供する。CTCは従来CD45^-、かつ形態的に識別可能なEpCAM/サイトケラチン陽性（CK⁺）細胞として定義されているが、近年の証拠から、EpCAM/サイトケラチン陰性（CK^-）の細胞、又は従来型CTCよりもサイズの小さい細胞を含む、CTCの候補となる他の集団が存在することが示唆されている。CTC集団の不均一性に関するこれらの知見より、富化を伴わないCTCのプラットフォームが、重要なCTC亜集団を取りこぼす傾向のある、CTCをサイズ、密度、又はEpCAM陽性に基づいて単離するポジティブ選択技術よりも好ましいことが示唆される。

CRPCはこの進行した形態のPrCaに罹患した患者及びこれらの患者を管理する臨床医の両方にとって深刻な問題を提示する。臨床医は適切な個別治療を導く努力において総合的診断の提供及び疾患増悪を引き起こす機構の評価に直面することが多い。適切な治療及び予後マーカーを同定することにより、標的化療法の潜在的な臨床上の利益は増し、臨床医がより十分にCRPCを管理することが可能となり、患者の生活の質が向上し、臨床転帰が強化される。細胞表現形と組合わせてサブクローン性CNV駆動因子の変化の頻度及び個別のCTCにおけるゲノム不安定性を理解して不均一な疾患のより正確な観察を可能とし、治療への反応を予測し、かつ抵抗性の新規機構を特定することの必要性が存在する。本発明は、この必要性に対処し、関係する利点を提供する。

（発明の概要）
本発明は、癌患者において疾患の不均一性を検出する方法であって、(a) 該患者から取得した血液試料中の有核細胞の、免疫蛍光染色及び形態的特性評価を含む直接的分析を実施して、循環腫瘍細胞（CTC）を同定し、かつ計数すること；(b) 該試料から該CTCを単離すること；(c) ゲノムパラメータを個別に特徴づけて、該CTCの各々に対するゲノムプロファイルを作成すること；及び(c) 該プロファイルに基づいて該癌患者における疾患の不均一性を決定すること、を含む、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、該癌は、前立腺癌である。いくつかの実施態様において、該前立腺癌は、ホルモン不応性である。

いくつかの実施態様において、有核細胞の該免疫蛍光染色は、汎サイトケラチン、表面抗原分類（CD）45、ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含む。

いくつかの実施態様において、該ゲノムパラメータは、コピー数多型（CNV）特徴を含む。いくつかの実施態様において、該CNV特徴は、遺伝子の増幅又は欠失を含む。いくつかの実施態様において、該遺伝子の増幅は、AR遺伝子の増幅を含む。いくつかの実施態様において、該欠失は、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ遺伝子（PTEN）の喪失を含む。いくつかの実施態様において、該CNV特徴は、アンドロゲン非依存的細胞成長と関連する遺伝子を含む。

いくつかの実施態様において、該ゲノムパラメータは、ゲノム不安定性を含む。いくつかの実施態様において、該ゲノム不安定性は、大規模トランジション（LST）を測定することによって特徴づけられる。いくつかの実施態様において、該ゲノム不安定性は、ゲノム変化率（PGA）を測定することによって特徴づけられる。

本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかとなるだろう。

（図面の簡単な説明）
図1Aは、標準的なEpic CTC分析工程の説明を示す。マルチパラメータデジタル病理アルゴリズムを使用して画像を分析し、CTC候補を検出してタンパク質バイオマーカーの発現レベルを定量化する。CTCの分類をウェブベースの報告に表示して、熟練した技術者によって確認する。図1Bは、CTC回収の説明及びゲノムプロファイリングのワークフローを示す。個別の細胞を単離し、全ゲノム増幅及びNGSライブラリ調製に付す。配列決定をIllumina NextSeq 500上で実施する。

図2は、実施されたバイオインフォマティクス分析の図を提供する。生のFASTQファイルを品質について評価し、フィルタリングする。リードをhg 38参照ゲノム（UCSC）とアラインし、PCR重複を除去し、MAPQスコア30によってフィルタリングする。フィルタリング後の＞250Kのリードを有する試料をコピー数変化について分析する。フィルタリングしたアラインメイントファイルをEpicコピー数パイプライン（Epic’s Copy Number Pipelines）によってさらに分析する。一方のパイプラインは1 Mbp域を使用するゲノム不安定性を評価するためのものとし、もう一方のパイプラインは遺伝子特異的コピー数測定のためのものとした。¹ LST：少なくとも10 Mbの隣接領域間の染色体切断のn。² PGA：コピー数変化を有する患者のゲノムのパーセンテージ（増幅又は欠失）。

図3A～3Cは、一細胞中のコピー数多型（CNV）を示す。各々LNCaP、PC3、及びVCaPからの一細胞を単離し、かつ全ゲノム配列決定法によってコピー数多型について分析した。増幅及び欠失は、レプリケート間で再現的に観察することができる。各細胞株の代表的な画像も示す。細胞をCKカクテル、AR、CD45、及びDAPIで染色する。各細胞株からの5つのレプリケートをここに示し、再現性を実証する。各細胞株からの既知のゲノム変化を図3Dに記載する。プロットをCircos: Krzywinski, M.らの文献、「Circos：比較ゲノミクスのための美感に関する情報（Circos: an Information Aesthetic for Comparative Genomics.）」（Genome Res (2009) 19:1639-1645）により作成した。

図4A～4Dは、CNV（図4A及び4B）及びゲノム不安定性測定（図4C及び4D）を示す。図4Aは、3つの代表的な細胞株及び健常ドナーの白血球（WBC）対照におけるARのlog2ゲノムコピー数の比較を示す。VCaPはARの増幅を有し、一方LNCaP及びPC3は2コピーのARを維持する。図4Bは、3つの代表的な細胞株及び健常ドナーのWBC対照におけるPTENのlog2ゲノムコピー数の比較を示す。PC3のホモ接合PTENの喪失を確認し、顕著なz-スコアを有するLNCaPヘテロ接合PTENの喪失を多くの細胞中で観察した。図4Cは3つの代表的な細胞株及び健常ドナーWBC対照の間の切断点（LST）の数の比較を示す。LNCaP（wt p53及びヘテロ接合PTENの喪失）及びWBC対照と比較して、より多くの数の切断点がPC3（ゼロPTEN、p53変異体）及びVCaP（p53変異体）中に検出された。図4Dは、3つの代表的な細胞株及び健常ドナーのWBC対照におけるゲノム変化率の比較を示す。PC3は最も高い変化率を示し、おそらくPTEN及びp53の両方の喪失に起因する遺伝的不安定性及び倍数性が明らかとなった。

（詳細な説明）
本件開示は、統合一細胞全ゲノムCNV分析が、複数のレプリケート間で再現的なコピー数プロファイルを提供し、ARの増幅及びPTENの喪失を含む既知の局所CNV事象の存在を確認するという発見に部分的に基づいている。本件開示はさらに、全ゲノムコピー数分析を使用して、LST及びPGAを測定することによりゲノム不安定性を再現的に特徴づけることができるという発見に部分的に基づいている。本明細書に開示されるような、野生型（LNCaP）と比較してp53変異体細胞株（PC3及びVCaP）において検出されるのは最も高いゲノム不安定性である。サブクローン性CNV駆動因子の変化の頻度及び個別のCTCにおけるゲノム不安定性を細胞表現形と組合わせて理解することにより、不均一な疾患のより正確な観察、潜在的な治療反応が可能となり、かつ新規抵抗性の機構を特定することができる。

腫瘍内不均一性の増加は、治療に対する内因の抵抗性及び不良な予後と相互に関連付けられる。CTCは不均一な疾患及び転移性患者における活動的転移性腫瘍集団を反映することが示されている。本明細書に記載の富化を伴わないCTC分析プラットフォームは、一細胞解像度及び不均一なCTC集団の正確なゲノムプロファイリングを可能にすることによって本発明の方法を可能にする。腫瘍内の不均一性を特性評価するために、循環腫瘍細胞（CTC）の一細胞全ゲノムコピー数分析を、富化を伴わないCTC分析プラットフォームを使用して実施した。PI3K阻害剤又はAR標的化療法についての治療感度のマーカー、例えばPTENの欠失又はアンドロゲン受容体（AR）の増幅はそれぞれ、患者試料を模倣するために血液中に添加される個別の前立腺癌細胞において検出された。局所性の利用可能な変化の検出に加え、ゲノム不安定性を大規模トランジション（LST）及びゲノム変化率（PGA）を測定することによって特徴づけた。

本発明では、癌患者における疾患の不均一性を検出する方法であって、(a) 該患者から取得した血液試料中の有核細胞の、免疫蛍光染色及び形態的特性評価を含む直接的分析を実施して、循環腫瘍細胞（CTC）を同定し、かつ計数すること；(b) 該試料から該CTCを単離すること；(c) ゲノムパラメータを個別に特徴づけて、該CTCの各々に対するゲノムプロファイルを作成すること；及び(c) 該プロファイルに基づいて該癌患者における疾患の不均一性を決定すること、を含む、前記方法を提供する。いくつかの実施態様において、該癌は、前立腺癌である。いくつかの実施態様において、該前立腺癌は、ホルモン不応性である。

いくつかの実施態様において、有核細胞の免疫蛍光染色は、汎サイトケラチン、表面抗原分類（CD）45、ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）、及びアンドロゲン受容体（AR）を含む。

いくつかの実施態様において、該プロファイルに基づいて癌患者における疾患の不均一性を決定することは、疾患の新規機構を特定する。

いくつかの実施態様において、該プロファイルに基づいて癌患者における疾患の不均一性を決定することは、治療に対する肯定的な反応を予測する。

いくつかの実施態様において、該プロファイルに基づいて癌患者における疾患の不均一性を決定することは、治療に対する抵抗性を予測する。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、及び「該（the）」は、そうでないことが文脈によって明らかに指示されない限り、複数の指示物を含むことに留意しなくてはならない。従って、例えば、「バイオマーカー（a biomarker）」に対する言及は、2以上のバイオマーカーの混合物などを含む。

用語「約」は、特に所与の量を参照して、プラスマイナス5％の偏差を包含することを意味する。

添付の特許請求の範囲を含む本件出願において使用される、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、及び「該（the）」は、そうでないことが文脈によって明らかに指示されない限り、複数の指示物を含み、「少なくとも1つの（at least one）」及び「1以上の（one or more）」と互換的に使用される。

本明細書で使用される用語「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「含む（includes）」、「含んでいる（including）」、「含む（contains）」、「含んでいる（containing）」、及びこれらの任意の変形は、非排他的な包含を含むことを意図するものであり、その結果要素又は要素のリストを含み（comprises）、含み（includes）、又は含む（contains）プロセス、方法、プロダクトバイプロセス、又は物質の組成が、これらの要素のみを含むのではなく、明示的に列記されていないか、又はそのようなプロセス、方法、プロダクトバイプロセス、又は物質の組成に固有の他の要素を含み得る。

本明細書で使用される、液体生検試料の文脈で使用される用語「提供する（providing）」は、試料を取得することの任意の、かつ全ての手段を包含することを意味している。この用語は、請求される方法の実践の文脈において、試料の存在をもたらす全ての直接的及び間接的手段を包含する。

本明細書で使用される用語「患者」は、好ましくはヒトを指すが、他の哺乳動物も包含する。本明細書で使用される用語「生物」、「個体」、「対象」、又は「患者」は、同義語として互換的に使用されることに留意されたい。

本明細書に記載の組成物及び方法において使用される用語「癌」は、典型的に細胞成長の混乱を特徴とする哺乳動物における生理状態を指すか、又は記載する。一実施態様において、癌は、上皮癌である。一実施態様において、癌は、前立腺癌である。本明細書に記載の方法及び組成物の様々な実施態様において、癌は、非限定的に、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、脳癌、食道癌、胃癌、膀胱癌、膵癌、子宮頸癌、頭頸部癌、卵巣癌、黒色腫、及び多剤抵抗性癌、又はそれらの亜型及び病期を含み得る。さらに代替の実施態様において、癌は、「初期」癌である。さらに別の実施態様において、癌は、「後期」癌である。本明細書で使用される用語「腫瘍」は、悪性であれ良性であれ、全ての腫瘍性細胞成長及び細胞増殖、並びに全ての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。癌は、リンパ増殖性癌、例えば、前駆Bリンパ芽球性白血病/リンパ芽球性リンパ腫、濾胞起源のB細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫前駆T細胞リンパ芽球性白血病/リンパ芽球性リンパ腫、未成熟T細胞の新生物、末梢性成熟T細胞の新生物、T細胞前リンパ球性白血病、末梢性T細胞リンパ腫、不特定未分化大細胞リンパ腫、成人性T細胞白血病/リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、前駆Tリンパ芽球性白血病/リンパ芽球性リンパ腫、T細胞前リンパ球性白血病、血管免疫芽細胞性リンパ腫、又は結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫であり得る。

本明細書で使用される用語「循環腫瘍細胞」又は「CTC」は、生体試料中に存在し、かつ癌と関係する任意の希少細胞を包含することを意味している。CTCは単一細胞として、又はCTCのクラスター中に存在し得るものであり、患者の循環中に非常に低濃度に認められる固形腫瘍から放出される上皮細胞である場合が多い。

本明細書で使用される「従来型CTC」は、サイトケラチン陽性、CD45陰性であり、DAPI核を含み、かつ形態的に周囲の白血球から識別可能な単一CTCを指す。

本明細書で使用される「従来型でないCTC」は、少なくとも1つの特性において、従来型CTCと異なるCTCを指す。

その最も広い意味で、生体試料は、CTCを含む任意の試料とすることができる。試料は、血液などの体液；細胞調製品の可溶性画分、又は細胞がそこで成長した培地のアリコート；細胞から単離若しくは抽出された染色体、細胞小器官、又は膜；溶液中の若しくは基板に結合された、ゲノムDNA、RNA、又はcDNA；1個の細胞；ひとつの組織；組織プリント；フィンガープリント；複数の細胞；皮膚などを含むことができる。対象から得られた生体試料は、細胞を含む任意の試料とすることができ、かつCTCがその中で検出され得る任意の物質を包含している。試料は、例えば、全血、血漿、唾液又は他の体液若しくは細胞を含む組織とすることができる。

特定の実施態様において、生体試料は、血液試料である。本明細書記載のように、試料は、全血、より好ましくは末梢血又は末梢血の細胞画分とすることができる。当業者に理解されるように、血液試料は、血液の任意の画分又は成分を、非限定的に、T細胞、単球、好中球、赤血球、血小板、並びにエキソソーム及びエキソソーム様小胞のような微小胞を含むことができる。本件開示のこの文脈において、血液試料中に含まれる血液細胞は、任意の有核細胞を包含し、かつ全血の成分に限定されない。従って血液細胞は、例えば、白血球（WBC）、並びにCTCを含む希少細胞の両方を含む。

本件開示の試料は、当技術分野において周知の方法（例えば、FACS、免疫組織化学）により識別可能な複数の細胞集団及び細胞亜集団を、各々含むことができる。例えば、血液試料は、赤血球（例えば、4～5百万個/μl）又は血小板（150,000～400,000細胞/μl）のような無核細胞の集団、及びWBC（例えば、4,500～10,000細胞/μl）、CEC又はCTC（循環腫瘍細胞；例えば、2～800細胞/μl）のような有核細胞の集団を含むことができる。WBCは、例えば好中球（2,500～8,000細胞/μl）、リンパ球（1,000～4,000細胞/μl）、単球（100～700細胞/μl）、好酸球（50～500細胞/μl）、好塩基球（25～100細胞/μl）などのような細胞亜集団を含んでよい。本件開示の試料は、富化を伴わない試料であり、すなわちこれらは、有核細胞の特定の集団又は亜集団のいずれかについて富化されていない。例えば、富化を伴わない血液試料は、CTC、WBC、B細胞、T細胞、NK細胞、単球などについて富化されていない。

いくつかの実施態様において、該試料は健常対象又は例えば年齢、人種、家族及び病歴を含む当技術分野で公知の臨床上確立された基準に基づいて癌又は既存の癌の転移のリスクが高いと考えられる対象から取得した血液試料である。いくつかの実施態様において、該血液試料は、組織又は液体生検及び/又は外科手術又は治療的背景に基づいて癌と診断された対象からのものである。いくつかの実施態様において、該血液試料は癌の臨床徴候を示し、かつ/又は当技術分野で周知されており、又は特定の癌についての既知のリスク因子のいずれかを示す対象から取得される。いくつかの実施態様において、該癌は、膀胱癌、例えば、尿路上皮膀胱癌である。

CTCデータ作成の文脈において本明細書において使用される用語「直接分析」とは、CTCが、検出前にCTCについて試料を富化した後とは対照的に、試料中に全ての周囲の有核細胞が存在する文脈において検出されることを意味する。いくつかの実施態様において、本方法は、CTC及び少なくとも200個の周囲の白血球（WBC）の両方を含んだ視野を提供する顕微鏡検査を含む。

本件開示の基本的態様は、CTCの検出に関する開示された方法の無類の堅牢性である。CTCに関する本明細書に開示された希少事象の検出は、周囲の非希少事象の文脈における希少事象の同定を包含している集団の、直接分析、すなわち富化を伴わない分析を基にしている。開示された方法に従う希少事象の同定は、周囲の事象を非希少事象として本質的に同定する。周囲の非希少事象を考慮し、かつ非希少事象に関する平均、例えば非希少事象の平均細胞サイズを決定することは、ノイズを除去することによるその検出方法の較正を可能にする。直接分析を基にせず、代わりに、本質的に歪められた構成上での希少事象の比較で富化された集団を比較する方法では達成できない結果が、本開示の方法の堅牢性である。本明細書に開示された直接分析方法の堅牢性は、本明細書記載のCTC亜型を含むCTCの特徴決定を可能にし、他のCTC検出方法により達成することができない表現型及び不均一性を同定することが可能であり、かつ請求項記載の方法の構成においてバイオマーカーの分析が可能である。

いくつかの実施態様において、本明細書に開示する方法は、さらに個別の患者のリスク因子及び画像化データを包含し、該画像データは、例えば非限定的に、X線コンピュータ断層撮影（CT）、超音波、陽電子放射断層撮影（PET）、電気インピーダンス断層撮影、及び磁気共鳴（MRI）による、任意の形態の公知かつ当技術分野で使用される画像化モダリティーを含む。当業者であれば、様々な技術分野で知られた基準に基づいて、画像化モダリティーを選択することができることを理解する。本明細書に記載の本発明の方法は、1枚以上の画像化データを包含することができる。本明細書で開示する方法において、1以上の個別のリスク因子を年齢、人種、家族歴からなる群から選択することができる。当業者であれば、様々な技術分野で知られた基準に基づいて、追加の個別のリスク因子を選択することができることを理解する。本明細書に記載の本発明の方法は、1以上の個別のリスク因子を包含することができる。従って、バイオマーカーは画像化データ、個別のリスク因子、及びCTCデータを含むことができる。本明細書に記載のバイオマーカーはまた、これらに限定はされないが、ヌクレオチド、核酸、ヌクレオシド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、代謝産物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ホルモン、抗体、生体高分子の代理物としての機能を果たす関心対象の領域、及びそれらの組合わせ（例えば、糖タンパク質、リボヌクレオタンパク質、リポタンパク質）、並びに生体分子の一部又は断片を含む生体分子を含み得る。

CTCデータは、形態的、遺伝的、後成的特徴、及び免疫蛍光特徴を含み得る。当業者に理解されるように、バイオマーカーは、生体分子、又は生体分子の断片、癌と、個別に又は他の測定可能な特徴と組合わせて相互に関連付けられ得る変化及び/若しくは検出を含むことができる。CTCは、一細胞又はCTCクラスター内に存在することができるが、これらは固形腫瘍から放出されかつ対象の循環中に非常に低い濃度で存在する上皮細胞であることが多い。従って血液試料中のCTCの検出は、希少事象検出と称され得る。CTCは、血液細胞集団中に1：1,000未満の存在量を、例えば、1：5,000、1：10,000、1：30,000、1：50,000、1：100,000、1：300,000、1：500,000、又は1：1,000,000未満の存在量を有する。いくつかの実施態様において、CTCは、該細胞集団中に1：50,000～1：100,000の存在量を有する。

本件開示の試料は、例えば固形組織生検又は液体生検を含む任意の手段により取得されてもよい（例えば、Marrinucci D.らの文献、2012, Phys. Biol. 9 016003参照）。簡潔に説明すると、特定の実施態様において、このプロセスは、7.5 mL血液試料中の赤血球の溶解及び除去、その各々が全血のおよそ0.5 mLの相当量を収容する専用の顕微鏡スライド上の残存する有核細胞の堆積を包含することができる。血液試料は、血液細胞又はそれらの成分を含むことが分かっている任意の給源、例えば静脈、動脈、末梢、組織、臍帯などから抽出されてよい。これらの試料は、周知かつ慣習的な臨床方法（例えば、全血を採取しかつ処理する手順）を用いて、処理されてよい。いくつかの実施態様において、血液試料は、EDTA又はStreck Cell-Free DNA（商標）を含み得る含抗凝固剤採血管（BCT）へ採取される。他の実施態様において、血液試料は、CellSave（登録商標）チューブ（Veridex社）へ採取される。血液試料は、さらなる処理の前に、最大12時間、24時間、36時間、48時間、又は60時間さらに貯蔵されてよい。

いくつかの実施態様において、本開示の方法は、血液試料の白血球(WBC)数を取得する初期工程を含む。いくつかの実施態様において、WBC数は、HemoCue(登録商標)WBC装置(Hemocue社、エンゲルホルム、スウェーデン)を使用することにより得てよい。いくつかの実施態様において、WBC数は、スライド1枚当たりに有核細胞の一貫した負荷量を播くのに必要とされる血液の量を決定し、かつ血液容量当たりに相当するCTCを逆算するために、使用される。

いくつかの実施態様において、本件開示の方法は、血液試料中の赤血球を溶解する初期工程を含む。いくつかの実施態様において、赤血球は、例えば、塩化アンモニウム溶液を血液試料へ添加することにより、溶解される。ある実施態様において、血液試料は、赤血球溶解後、遠心分離に供され、かつ有核細胞は、例えばPBS溶液中に再浮遊される。

いくつかの実施態様において、試料、例えば血液試料由来の有核細胞は、平面基板上に単層として堆積される。この平面基板は、例えば、任意の蛍光的に透明な物質、細胞付着を促す任意の物質、細胞デブリの容易な除去を促す任意の物質、厚さ＜100 μmを有する任意の物質など任意の材料であってよい。いくつかの実施態様において、この材料は、フィルムである。いくつかの実施態様において、この材料は、スライドグラスである。ある実施態様において、本方法は、スライドグラス上の単層として血液試料由来の有核細胞を堆積する初期工程を包含している。スライドグラスは、生存細胞の最大保持が可能であるように、コーティングされ得る（例えば、Marrinucci D.らの文献、2012, Phys. Biol. 9 016003参照）。いくつかの実施態様において、約50万、100万、150万、200万、250万、300万、350万、400万、450万、又は500万個の有核細胞が、スライドグラス上に堆積される。いくつかの実施態様において、この開示の方法は、スライドグラス上に約300万個の細胞を堆積することを含む。追加の実施態様において、この開示の方法は、スライドグラス上に約200万～約300万個の細胞を堆積することを含む。いくつかの実施態様において、スライドグラス及び固定された細胞試料は、本開示の方法が完了された後のさらなる処理又は実験に利用され得る。

いくつかの実施態様において、本件開示の方法は、富化を伴わない血液試料中の有核細胞を同定する初期工程を含む。いくつかの実施態様において、有核細胞は、蛍光染色により同定される。ある実施態様において、蛍光染色は、核酸特異的染色を含む。ある実施態様において、蛍光染色は、ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）である。いくつかの実施態様において、有核細胞の免疫蛍光染色は、汎サイトケラチン（CK）、表面抗原分類（CD）45、及びDAPIを含む。本明細書にさらに記載されたいくつかの実施態様において、CTCは、周囲の有核細胞からの識別可能な免疫蛍光染色を含む。いくつかの実施態様において、CTCの識別可能な免疫蛍光染色は、DAPI（+）、CK（+）及びCD45（-）を含む。いくつかの実施態様において、CTCの同定は、汎サイトケラチン蛍光染色の強度を、周囲の有核細胞と比較することをさらに含む。いくつかの実施態様において、CTCデータは、血液試料中の有核細胞の免疫蛍光染色を検出するために、走査型蛍光顕微鏡検査により作成される（Marrinucci D.らの文献、2012, Phys. Biol. 9 016003）。

特定の実施態様において、全ての有核細胞は、保持され、かつ専ら上皮細胞中に認められる中間径フィラメントであるサイトケラチン(CK)を標的化するモノクローナル抗体、白血球共通抗原CD45を標的化する汎白血球に特異的な抗体、及び核染色DAPIにより、免疫蛍光的に染色される。有核血液細胞は、複数の蛍光チャンネルにおいて画像化され、核輪郭及び細胞質分布の細かい細胞学的詳細を保持する高品質かつ高解像度のデジタル画像を作成することができる。周囲のWBCは、CD45を標的化する汎白血球特異的抗体により同定することができるが、CTCは、DAPI(+)、CK(+)及びCD45(-)として同定することができる。本明細書記載の方法において、該CTCは、周囲の有核細胞から識別可能な免疫蛍光染色を含む。

さらなる実施態様において、該CTCデータは、高解像度CTC(HD-CTC)としても公知である従来型CTCを含む。従来型CTCは、CK陽性、CD45陰性であり、これは識別可能であるアポトーシス変化及び破壊された外見を伴わない無傷なDAPI陽性の核を含み、かつ周囲の白血球（WBC）から形態学的に識別される。DAPI（+）、CK（+）及びCD45（-）強度は、先に説明されたような、HD-CTC計数時に、測定可能な特徴として分類され得る。Nievaらの文献、Phys Biol, 9:016004 （2012）。本明細書に開示された方法により利用される富化を伴わない直接分析は、高い感度及び高い特異性を生じると同時に、高解像度細胞形態学的技法を加えて不均一であることがわかっているCTC集団の詳細な形態的特性評価を可能にする。

CTCは、DAPI（+）、CK（+）及びCD45（-）細胞を含むものとして同定することができるが、本発明の方法は、当業者がCTCデータを作成し並びに/又はCTC及びCTCクラスターを同定するために選択するいずれか他のバイオマーカーにより実践することができる。当業者は、その変化及び/又は検出を、CTCと相互に関連付けることができる形態的特徴、生体分子、又は生体分子の断片を選択する方式を知っている。分子バイオマーカーは、ヌクレオチド、核酸、ヌクレオシド、アミノ酸、糖、脂肪酸、ステロイド、代謝産物、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、ホルモン、抗体、生体高分子の代理物としての機能を果たす関心対象の領域及びそれらの組合わせ（例えば、糖タンパク質、リボヌクレオタンパク質、リポタンパク質）を含む生体分子を含むが、これらに限定されるものではない。この用語はまた、生体分子の一部又は断片、例えばタンパク質のペプチド断片又はポリペプチドも包含している。

当業者は、走査型蛍光顕微鏡検査を含む顕微鏡検査ベースのアプローチ（例えば、Marrinucci D.らの文献、2012, Phys. Biol. 9 016003参照）、配列決定アプローチ、MS/MS、LC-MS/MS、多重反応モニタリング（MRM）又はSRM、及びプロダクト-イオンモニタリング（PIM）のような質量分析アプローチを含み、並びにまた、免疫蛍光、免疫組織化学、ウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、免疫沈降、放射免疫アッセイ、ドットブロッティング、及びFACSなどの免疫アッセイのような抗体ベースの方法を含む、数多くの方法を使用し、CTCデータを作成することができることを認識するであろう。免疫アッセイ技術及びプロトコルは一般に、当業者に公知である（Price及びNewmanの文献、「免疫アッセイの原理と実践（Principles and Practice of Immunoassay）」、第2版、Grove’s Dictionaries、1997；及び、Goslingの文献、「免疫アッセイ：実践法（Immunoassays: A Practical Approach）」、Oxford University Press、2000）。競合及び非競合免疫アッセイを含む様々な免疫アッセイ技術を、使用することができる（Selfらの文献、Curr. Opin. Biotechnol., 7:60-65 （1996）、同じくJohn R. Crowtherの文献、「ELISA指針（The ELISA Guidebook）」、第1版、Humana Press、2000、ISBN 0896037282、及びChard T編集の「放射免疫アッセイ及び関連技術への入門（An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques）」、Elsevier Science、1995、ISBN 0444821198も参照されたい）。

当技術分野で公知であり、かつ各論的には（specifically）記載されていない標準的分子生物学技術は、一般にSambrookらの文献、「分子クローニング：実験室マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989)、及びAusubelらの文献、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)、及びPerbal, Aの文献、「分子クローニングの実践的手引き（Practical Guide to Molecular Cloning）」, John Wiley & Sons, New York (1988)、及びWatsonらの文献、「組換えDNA（Recombinant DNA）」, Scientific American Books, New York、及びBirrenら（編）「ゲノム分析：実験室マニュアルシリーズ（Genome Analysis: A Laboratory Manual Series）」, Vols. 1-4 Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)にあるように従う。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は一般的に、「PCRプロトコル：方法及び応用の手引き（PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)）」にある通りに実施することができる。特定の試料のDNAコピー数プロファイルを決定することができる任意の方法を、本発明のバイオマーカーを同定するのに十分な解像度を提供する、本発明による分子プロファイリングに使用することができる。当業者は、本発明の1以上のバイオマーカーのコピー数を特定するのに十分な解像度の全ゲノムコピー数変化を評価するために、いくつかの異なるプラットフォームを使用することを認識し、かつ使用することができる。

インサイチュハイブリダイゼーションアッセイは周知されており、一般にAngererらの文献、Methods Enzymol. 152:649-660 (1987)に記載されている。インサイチュハイブリダイゼーションアッセイにおいて、細胞、例えば生検由来の細胞を固体支持体、典型的にはスライドグラスに固定する。DNAをプロービングする場合、細胞を熱またはアルカリで変性させる。続いて細胞を中程度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させて、標識された特異的プローブをアニーリングさせる。好ましくはプローブを、放射性同位体又は蛍光レポーターで標識する。FISH（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）では蛍光プローブが高度の配列類似性を示す配列部分にのみ結合する蛍光プローブを使用する。

FISHは細胞中の特定のポリヌクレオチド配列を検出し、かつ局在を明らかにするために使用される細胞遺伝学的技術である。例えば、FISHは染色体上のDNA配列を検出するために使用することができる。FISHはまた、組織試料内の特定のRNA、例えばmRNAを検出し、かつその局在を明らかにするために使用することができる。FISHでは、蛍光プローブが高度の配列類似性を示す特定のヌクレオチド配列と結合する蛍光プローブを使用する。蛍光顕微鏡検査を使用して、蛍光プローブが結合しているかどうか、及びどこに結合しているかを突き止めることができる。特定のヌクレオチド配列、例えば転座、融合、切断、重複、及び他の染色体異常の検出に加え、FISHは細胞及び組織内の特定の遺伝子のコピー数及び/又は遺伝子発現の空間的-時間的パターンを規定する助けとなり得る。

核酸配列決定技術は遺伝子発現の分析に好適な方法である。これらの方法の基礎となる原理は、試料中でcDNA配列が検出される回数が、その配列に対応するRNAの相対発現と直接関係することである。これらの方法は時に用語デジタル遺伝子発現（DGE）によって参照され、得られるデータの離散的数的特性を反映する。この原理が適用される初期の方法は、遺伝子発現連鎖解析（SAGE）及び大規模並列シグネチャー配列決定法（MPSS）であった。例えば、S. Brennerらの文献、Nature Biotechnology 18(6):630-634 (2000)を参照されたい。より最近、「次世代」配列決定技術の出現により、DGEはより簡単に、よりハイスループットに、かつより手ごろなものとなった。結果として、より多くの実験室でDGEを利用し、以前に可能であったよりも多くの個別の患者試料におけるより多くの遺伝子の発現をスクリーニングすることができる。例えば、J. Marioniの文献、Genome Research 18(9):1509-1517 (2008); R. Morinの文献、Genome Research 18(4):610-621 (2008); A. Mortazaviの文献、Nature Methods 5(7):621-628 (2008); N. Cloonanの文献、Nature Methods 5(7):613-619 (2008)を参照されたい。

当業者であれば、例えば抗体、アプタマー、融合タンパク質、例えばタンパク質受容体若しくはタンパク質リガンド成分を含む融合タンパク質、又はバイオマーカー特異的低分子結合剤を含む当技術分野で公知の任意のクラスのマーカー特異的結合試薬を使用して、バイオマーカーの存在又は不存在を検出することができることをさらに認識するであろう。いくつかの実施態様において、CK又はCD45の存在又は不存在を、抗体により決定する。当業者であれば、バイオマーカーの存在又は不存在を、バイオマーカーの染色体座位での染色体コピー数変化を評価することによって測定することができることをさらに認識するであろう。ゲノムバイオマーカーは、例えば、比較ゲノムハイブリダイゼーション（CGH）などの任意の技術、又は癌細胞などの細胞株の一塩基多型アレイ（遺伝子型判定マイクロアレイ）によって同定することができる。バイオインフォマティクスアプローチは、qPCR又はインサイチュハイブリダイゼーションのような技術を使用するさらなる分析に加え、増幅及び欠失の適切なコピー数閾値を使用して、細胞株群を識別し、バイオマーカーを示す染色体異常の領域を同定することができる。染色体DNAのコピー数変化の検出のための核酸アッセイ方法には：(i) インタクトな組織又は細胞試料に対するインサイチュハイブリダイゼーションアッセイ、(ii) 組織試料から抽出した染色体DNAに対するマイクロアレイハイブリダイゼーションアッセイ、及び(iii) ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、又は組織試料から抽出された染色体DNAに対する他の増幅アッセイがある。これらのいずれかのフォーマットにおける核酸の合成アナログ、例えばペプチド核酸、を使用するアッセイも使用することができる。

バイオマーカーは検出可能に標識された核酸ベースのプローブ、例えばデオキシリボ核酸（DNA）プローブ又はタンパク質核酸（PNA）プローブ、又は特異的に設計された染色体標的にハイブリダイズするように設計され/選択された非標識プライマーを使用したハイブリダイゼーションアッセイにより検出することができる。非標識プライマーは増幅アッセイにおいて、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって使用され、ここではプライマー結合後、ポリメラーゼはその後の検出のための標的核酸配列を増幅する。PCRにおいて使用される検出プローブ又は他の増幅アッセイは、好ましくは蛍光であり、さらにより好ましくは、検出プローブは「リアルタイムPCR」において有用である。蛍光標識はまた、インサイチュハイブリダイゼーションにおける使用に好ましいが、ハイブリダイゼーション技術に一般的に使用される他の検出可能な標識、例えば酵素的、発色性、及び同位体標識も使用することができる。有用なプローブ標識技術は、参照により本明細書に組み込まれている「分子細胞遺伝学：プロトコル及び応用（Molecular Cytogenetics: Protocols and Applications）」、Y.-S. Fan, Ed., Chap. 2、「ゲノム標的のための標識蛍光インサイチュハイブリダイゼーションプローブ（Labeling Fluorescence In Situ Hybridization Probes for Genomic Targets）」、L. Morrisonらの文献、p. 21-40, Humana Press,.COPYRGT. 2002に記載されている。マイクロアレイ分析によるゲノムバイオマーカーの検出において、これらのプローブ標識技術を適用して、患者試料からの染色体DNA抽出物を標識し、これをその後マイクロアレイにハイブリダイズさせる。

他の実施態様において、バイオマーカータンパク質は免疫学的手段又は他のタンパク質アッセイにより検出することができる。本発明において有用なバイオマーカーレベルを測定するためのタンパク質アッセイ法は、(i) 発現するバイオマーカーとの標識抗体又はタンパク質の結合を伴う免疫アッセイ法、(ii) 発現するバイオマーカーを決定するための質量分析法、及び(iii) 発現するバイオマーカーに対する「プロテインチップ」アッセイに基づくプロテオミクスを含み得る。有用な免疫アッセイ法には、当技術分野で公知の任意のフォーマット、例えば、これらに限定はされないが、ELISAフォーマット、サンドイッチフォーマット、競合阻害フォーマット（フォワード又はリバース競合阻害アッセイの両方を含む）、又は蛍光分極フォーマットを使用して実施する溶液相アッセイ、及び免疫組織化学（「IHC」と呼ぶ）などの固相アッセイの両方がある。

本開示の抗体は、バイオマーカーと特異的に結合する。この抗体は、当技術分野において公知のいずれか好適な方法を用いて調製することができる。例えば、Coliganの文献、「免疫学最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）」（1991）；Harlow及びLaneの文献、「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」（1988）；Godingの文献、「モノクローナル抗体：原理と実践（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice）」（第2版 1986）を参照されたい。この抗体は、天然に又は全体的若しくは部分的に合成により調製されるか否かにかかわらず、任意の免疫グロブリン又はそれらの誘導体とすることができる。特異的結合能を維持しているそれらの誘導体もまた全て、この用語に含まれる。この抗体は、免疫グロブリン結合ドメインと相同であるか又は大部分相同である結合ドメインを有し、かつ天然の給源から誘導されるか、又は部分的若しくは全体的に合成により調製することができる。この抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体とすることができる。いくつかの実施態様において、抗体は、単鎖抗体である。当業者は、抗体は、例えば、ヒト化、部分的ヒト化、キメラ、キメラヒト化などを含む様々な形態のいずれかで提供され得ることを認識するであろう。この抗体は、Fab、Fab’、F(ab’)2、scFv、Fv、dsFv、ダイアボディ、及びFd断片を含むが、これらに限定されるものではない抗体断片とすることができる。この抗体は、任意の手段により調製することができる。例えば、この抗体は、インタクトな抗体の断片化により、酵素的に若しくは化学的に調製することができるか、及び/又はこれは、部分的抗体配列をコードしている遺伝子から組み換えにより調製することができる。この抗体は、単鎖抗体断片を含むことができる。あるいは又は加えて、この抗体は、例えば、ジスルフィド結合により一緒に連結されている複数の鎖、並びにそのような分子から得られた任意の機能性断片を含むことができ、ここでそのような断片は、親抗体分子の特異的結合特性を保持している。完全分子の機能性成分としてのそれらのより小さいサイズのために、抗体断片は、ある種の免疫化学技術における使用及び実験適用について、インタクトな抗体に勝る利点をもたらすことができる。

検出可能な標識は、本発明の方法においてCTCデータを作成する場合に、バイオマーカーの直接又は間接検出のために、本明細書記載の方法において使用することができる。多種多様な検出可能な標識を使用することができ、標識の選択は、必要な感度、抗体とのコンジュゲーションの容易さ、安定性の必要要件、並びに利用可能な計測手段及び廃棄設備に応じて決まる。当業者は、本発明の方法におけるバイオマーカーのアッセイ検出を基に、好適な検出可能な標識の選択について、熟知している。好適な検出可能な標識は、蛍光色素（例えば、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Oregon Green（商標）、ローダミン、テキサスレッド、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（tetrarhodimine isothiocynate）（TRITC）、Cy3、Cy5、Alexa Fluor（登録商標）647、Alexa Fluor（登録商標）555、Alexa Fluor（登録商標）488）、蛍光マーカー（例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、フィコエリトリンなど）、酵素（例えば、ルシフェラーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、ナノ粒子、ビオチン、ジゴキシゲニン、金属などを含むが、これらに限定されるものではない。

質量分析ベースの分析について、同位体試薬による示差的タグ付け、例えば同位体-コードされた親和性タグ（ICAT）又はアイソバリック（isobaric）タグ付け試薬を使用するより最近の変法iTRAQ（Applied Biosystems社、フォスターシティ、カリフォルニア）、それに続く多方向液体クロマトグラフィー（LC）及びタンデム質量分析（MS/MS）の分析は、本開示の方法を実践する上でのさらなる方法論を提供することができる。

化学発光性抗体を使用する化学発光アッセイは、タンパク質の感度のよい非放射性検出のために使用することができる。蛍光色素で標識された抗体もまた、好適であることができる。蛍光色素の例は、非限定的に、DAPI、フルオレセイン、Hoechst 33258、R-フィコシアニン、B-フィコエリトリン、R-フィコエリトリン、ローダミン、テキサスレッド、及びリサミンを含む。間接的標識は、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼ(AP)、β-ガラクトシダーゼ、ウレアーゼなどのような、当技術分野において周知である様々な酵素を含む。セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼのための好適な基質を使用する検出システムは、当技術分野において周知である。

直接又は間接標識からのシグナルは、例えば、蛍光顕微鏡又は走査型蛍光顕微鏡のような顕微鏡を用いて、分析することができる。あるいは、発色基質からの色を検出するための分光光度計；¹²⁵Iの検出のためのガンマカウンターのような、放射線を検出するための放射線カウンター；又は、特定の波長の光の存在下で蛍光を検出するための蛍光光度計を、使用することができる。望ましいならば、本開示の方法を実践するために使用されるアッセイを、自動化するか、又はロボット制御により実行することができ、かつ複数の試料からのシグナルを、同時に検出することができる。

いくつかの実施態様において、これらのバイオマーカーは、免疫蛍光マーカーである。いくつかの実施態様において、免疫蛍光マーカーは、上皮細胞に特異的なマーカーを含む。いくつかの実施態様において、免疫蛍光マーカーは、白血球（WBC）に特異的なマーカーを含む。いくつかの実施態様において、1以上の免疫蛍光マーカーは、CD45及びCKを含む。

いくつかの実施態様において、CTC又はWBCのような有核細胞における免疫蛍光マーカーの存在又は不存在は、識別可能な免疫蛍光染色パターンを生じる。CTC及びWBCに関する免疫蛍光染色パターンは、上皮マーカー又はWBCマーカーが各細胞において検出されることを基に異なってよい。いくつかの実施態様において、1以上の免疫蛍光マーカーの存在又は不存在の決定は、例えば、WBCを識別可能に同定する、CD45の免疫蛍光染色を使用し、CTCの識別可能な免疫蛍光染色を、WBCの識別可能な免疫蛍光染色と比較することを含む。WBCの様々な亜集団に結合する他の検出可能なマーカー又は検出可能なマーカーの組合わせが存在する。これらは、CD45の免疫蛍光染色との組合わせにおいて、又はこれの代わりとして含む、様々な組合わせで使用してもよい。

いくつかの実施態様において、CTCは、周囲の有核細胞と比べて、識別可能な形態的特徴を含む。いくつかの実施態様において、この形態的特徴は、核サイズ、核形状、細胞サイズ、細胞形状、及び/又は核対細胞質の比を含む。いくつかの実施態様において、この方法は、核の詳細、核輪郭、核小体の存在又は不存在、細胞質の質、細胞質の量、免疫蛍光染色パターンの強度により、有核細胞を分析することをさらに含む。当業者は、本件開示の形態的特徴は、決定されかつCTCの検出と相互に関連付けられ得る細胞の任意の特徴、特性、特質、又は態様を含み得ることを理解している。

CTCデータは、当技術分野において公知の顕微鏡的方法のいずれかにより作成することができる。いくつかの実施態様において、この方法は、走査型蛍光顕微鏡検査により実施される。ある実施態様において、この顕微鏡的方法は、CTC及びそれらの周囲のWBCの高解像度の画像を提供する(例えば、Marrinucci D.らの文献、2012, Phys. Biol. 9 016003を参照されたい)。いくつかの実施態様において、富化を伴わない血液試料のような試料由来の有核細胞の単層でコーティングされたスライドを、走査型蛍光顕微鏡により走査し、かつ免疫蛍光マーカー及び核染色からの蛍光強度を記録し、各免疫蛍光マーカーの存在又は不存在の決定、並びに有核細胞の形態の評価が可能である。いくつかの実施態様において、顕微鏡的データの収集及び分析は、自動化された方式で実施される。

いくつかの実施態様において、CTCデータは、1以上のバイオマーカー、例えばCK及びCD45を検出することを含む。バイオマーカーは、使用される各検出法のバックグラウンドノイズを上回り検出可能である(例えば、バックグラウンドよりも、2倍、3倍、5倍、又は10倍高い；例えば、バックグラウンドを2σ又は3σ超える)場合に、細胞内に「存在する」と考えられる。いくつかの実施態様において、バイオマーカーは、使用される検出法のバックグラウンドノイズを上回って検出可能でない(例えば、バックグラウンドシグナルよりも、＜1.5倍又は＜2.0倍高い；例えば、バックグラウンドを＜1.5σ又は＜2.0σ超える)場合に、「不存在」と考えられる。

いくつかの実施態様において、有核細胞内の免疫蛍光マーカーの存在又は不存在は、視野内のWBC上の全ての免疫蛍光マーカーが予め設定された蛍光レベルに達するように、蛍光走査プロセス時の暴露時間を選択することにより決定される。これらの条件下で、CTC特異的免疫蛍光マーカーは、例えWBC上に存在しないとしても、固定された高さを持つバックグラウンドシグナルとしてWBCにおいて視認される。さらに、CTC上に存在しないWBC特異的免疫蛍光マーカーは、固定された高さを持つバックグラウンドシグナルとしてCTCにおいて視認される。各マーカーに関するその蛍光シグナルが、固定されたバックグラウンドシグナルよりも、有意に高い(例えば、バックグラウンドよりも、2倍、3倍、5倍、又は10倍高い；例えば、バックグラウンドを2σ又は3σ超える)場合に、細胞は、免疫蛍光マーカーについて陽性であると考えられる(すなわち、このマーカーは存在すると考えられる)。例えば、有核細胞は、CD45に関するその蛍光シグナルがバックグラウンドシグナルよりも有意に高い場合に、CD45陽性(CD45⁺)と考えられる。各マーカーに関する細胞の蛍光シグナルが、バックグラウンドシグナルを有意に上回らない(例えば、バックグラウンドシグナルよりも、＜1.5倍又は＜2.0倍高い；例えば、バックグラウンドを＜1.5σ又は＜2.0σ超える)場合に、細胞は、免疫蛍光マーカーについて陰性であると考えられる(すなわち、このマーカーは存在しないと考えられる)。

典型的には、各顕微鏡視野は、CTC及びWBCの両方を含む。ある実施態様において、顕微鏡視野は、少なくとも1、5、10、20、50、又は100個のCTCを示す。ある実施態様において、顕微鏡視野は、CTCよりも少なくとも10、25、50、100、250、500、又は1,000倍多いWBCを示す。ある実施態様において、顕微鏡視野は、少なくとも10、50、100、150、200、250、500、1,000又はそれよりも多いWBCにより取り囲まれた1以上のCTC又はCTCクラスターを含む。

本明細書記載の方法のいくつかの実施態様において、CTCデータの作成は、血液試料中に存在するCTCの計数を含む。いくつかの実施態様において、本明細書記載の方法は、少なくとも1.0 CTC/mL血液、1.5 CTC/mL血液、2.0 CTC/mL血液、2.5 CTC/mL血液、3.0 CTC/mL血液、3.5 CTC/mL血液、4.0 CTC/mL血液、4.5 CTC/mL血液、5.0 CTC/mL血液、5.5 CTC/mL血液、6.0 CTC/mL血液、6.5 CTC/mL血液、7.0 CTC/mL血液、7.5 CTC/mL血液、8.0 CTC/mL血液、8.5 CTC/mL血液、9.0 CTC/mL血液、9.5 CTC/mL血液、10 CTC/mL血液、又はそれよりも多いものの検出を包含している。

本明細書記載の方法のいくつかの実施態様において、CTCデータの作成は、非従来型CTCを含む、CTCの識別可能な亜型を検出することを含む。いくつかの実施態様において、本明細書記載の方法は、少なくとも0.1 CTCクラスター/mL血液、0.2 CTCクラスター/mL血液、0.3 CTCクラスター/mL血液、0.4 CTCクラスター/mL血液、0.5 CTCクラスター/mL血液、0.6 CTCクラスター/mL血液、0.7 CTCクラスター/mL血液、0.8 CTCクラスター/mL血液、0.9 CTCクラスター/mL血液、1 CTCクラスター/mL血液、2 CTCクラスター/mL血液、3 CTCクラスター/mL血液、4 CTCクラスター/mL血液、5 CTCクラスター/mL血液、6 CTCクラスター/mL血液、7 CTCクラスター/mL血液、8 CTCクラスター/mL血液、9 CTCクラスター/mL血液、10クラスター/mL又はそれよりも多いものの検出を包含している。特定の実施態様において、本明細書記載の方法は、少なくとも1 CTCクラスター/mL血液の検出を包含している。

いくつかの実施態様において、その開示された方法は、予測的モデルの使用を包含する。さらなる実施態様において、その開示された方法は、測定可能な特徴を参照特徴と比較することを包含する。当業者であれば認識できるように、そのような比較が参照特徴との直接比較、又は参照特徴を予測的モデルに組み込んだ間接的比較とすることができる。さらなる実施態様において、測定可能対象（a measurable）の分析は、線形判別分析モデル、サポートベクター機械分類アルゴリズム、再帰的特徴量削減モデル、マイクロアレイモデルの予測解析、ロジスティック回帰モデル、CARTアルゴリズム、フレックスツリーアルゴリズム、LARTアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、MARTアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、ペナルティー回帰法、又はそれらの組合わせの1以上を包含する。特定の実施態様において、該解析は、ロジスティック回帰を含む。追加の実施態様において、決定は、リスクスコアとして表される。

解析的分類プロセスでは、様々な統計解析法のいずれか1つを使用して、定量的データを操作し、かつ試料の分類を提供することができる。有用な方法の例には、線形判別分析、再帰的特徴量削減、マイクロアレイの予測解析、ロジスティック回帰、CARTアルゴリズム、フレックスツリーアルゴリズム、LARTアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、MARTアルゴリズム、機械学習アルゴリズム、及び当業者に公知の他の方法がある。

試料が所与のクラスに属する確率を決定するための閾値を設定する予測的モデリング法によって、分類を行うことができる。確率は好ましくは少なくとも50％、又は少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なくとも90％、又はそれより高い。また、取得したデータセット及び参照データセットの間の比較によって統計的有意差がもたらされるかどうか決定することにより、分類を行うことができる。もしそうであるならば、データセットを取得した試料は、参照データセットクラスに属さないと分類する。反対に、そのような比較によって参照データセットとの統計的有意差がない場合、データセットを取得した試料を参照データセットクラスに属するものとして分類する。

モデルの予測能力は、特定の値、又は値の範囲の質測定基準、例えばAUROC（ROC曲線下面積）又は精度を提供するその能力に従って評価することができる。曲線下面積基準は、完全なデータ範囲にわたって分類主体（classifier）の精度を比較するのに有用である。AUCのより大きい分類主体は、未知標本（unknowns）を関心対象の2つの群間で正確に分類する能力がより高い。ROC解析を使用して、様々な臨床状況下で最適な閾値を選択し、特異度と感度の間に存在する固有のバランスをとることができる。いくつかの実施態様において、所望の質閾値は、少なくとも約0.7、少なくとも約0.75、少なくとも約0.8、少なくとも約0.85、少なくとも約0.9、少なくとも約0.95、又はそれより高い精度で試料を分類する予測的モデルである。代替の基準として、所望の質閾値は、少なくとも約0.7、少なくとも約0.75、少なくとも約0.8、少なくとも約0.85、少なくとも約0.9、又はそれより高いAUCで試料を分類する予測的モデルを指すことができる。

当技術分野で公知であるように、予測的モデルの相対感度及び特異度を調節して、特異度測定基準又は感度測定基準のいずれかを優位にすることができ、ここでこの2つの測定基準は逆相関関係を有する。上記モデルにおける限界値は、実施される検査の特定の要求に応じて、選択した感度又は特異度のレベルを提供するように調節することができる。感度及び特異度の一方又は両方は、少なくとも約0.7、少なくとも約0.75、少なくとも約0.8、少なくとも約0.85、少なくとも約0.9、又はそれよりも高くすることができる。

生データは、通常3連又は複数の3連で、最初に各測定可能な特徴又はバイオマーカーの値を測定することにより、解析することができる。該データは操作することができ、例えば、生データを標準曲線を使用して変換することができ、3連の測定値の平均を、各患者に対する平均及び標準偏差の計算に使用する。これらの値は、モデルにおいて使用する前に変換、例えば対数変換、Box-Cox変換（Box及びCoxの文献、Royal Stat. Soc., Series B, 26:211-246(1964)）することができる。そして該データを、状態に従って試料を分類する予測的モデルに入力する。結果として得られる情報を、患者又は医療提供者に伝達することができる。いくつかの実施態様において、該方法は、＞60％、＞70％、＞80％、＞90％、又はそれより高い特異度を有する。

当業者であれば理解するように、解析的分類プロセスは、様々な統計解析法のうちのいずれか1つを使用して、定量的データを操作し、試料の分類を提供することができる。有用な方法の例には、非限定的に、線形判別分析、再帰的特徴量削減、マイクロアレイの予測解析、ロジスティック回帰、CARTアルゴリズム、フレックスツリーアルゴリズム、LARTアルゴリズム、ランダムフォレストアルゴリズム、MARTアルゴリズム、及び機械学習アルゴリズムがある。

別の実施態様において、本開示は、少なくとも1つの試料中に発現するバイオマーカーとの結合に特異的な少なくとも1つの標識プローブ、タンパク質、又は抗体を含む容器を含む、バイオマーカーレベルの測定用キットを提供する。また、これらのキットはアッセイ用の他の関連する試薬を含む容器を含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、キットは、バイオマーカーと結合させるための標識モノクローナル抗体又は核酸プローブを含む容器、及び少なくとも1つの較正組成物を含む。キットは、検出可能な標識を検出するために必要な構成要素（例えば、酵素又は基質）をさらに含むことができる。また、キットはアッセイし、検査試料と比較することができる対照試料又は一連の対照試料を含むことができる。キットの各構成要素は個別の容器内に封入することができ、様々な容器の全てを、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための説明書とともに、一つの包装中に入れることができる。

先の記載から、本明細書に記載の発明に変更及び修正を加えて、様々な使用及び条件に採用することができることが明らかであろう。また、そのような実施態様は以下の特許請求の範囲の範囲内である。

本明細書中のあらゆる変数の定義における要素の表の列挙には、列記された要素のあらゆる単一の要素又は組合わせ（又はサブコンビネーション）としてのその変数の定義を含む。本明細書における実施態様の列挙には、あらゆる単一の実施態様又は、あらゆる他の実施態様との組合わせ、又はそれらの一部としての実施態様を含む。

本明細書中に言及された全ての特許及び刊行物は、各々の独立した特許及び刊行物が具体的かつ個別的に参照により組み込まれていることが示されているかのように、同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。

以下の実施例を、限定としてではなく、例示として提供する。

（実施例1）
CTCの試料の評価を、Epic Sciencesプラットフォームを使用して過去に報告した通りに実施した。Marrinucciらの文献、Phys Biol 9:016003, 2012。Epic CTC収集及び検出プロセスは、以下の流れである：(1) 血液を溶解させ、血液試料由来の有核細胞をスライド上に載せる；(2) スライドを-80℃の生物貯蔵容器中で保存する；(3) スライドをCK、CD45、DAPI、及びARで染色する；(4) スライドをスキャンする；(5) マルチパラメータデジタル病理アルゴリズムを実行する、及び(6) ソフトウェア及びヒト解読者によるCTCの確認並びにバイオマーカーの発現の定量化である。続くCTCの回収及びゲノムプロファイリングワークフローの間、個別の細胞を単離し、全ゲノム増幅、及びNGSライブラリ調製に付した。配列決定をIllumina NextSeq 500により実施した。

血液試料は、溶血、遠心分離、再懸濁及びスライド上への播種を経た後、-80℃で保存する。分析の前に、スライドを解凍し、免疫蛍光により標識（汎サイトケラチン、CD45、DAPI）し、かつ自動蛍光透視法により画像化し、その後人力で病理学者として熟練した技術者（MSL）によって確認した。Marrinucciらの文献、Phys Biol 9:016003, 2012。DAPI（+）、CK（+）、及びCD45（-）の強度を先に記載した通りCTC計数の間に、特徴として類別した。

より具体的には、末梢血液試料を、無細胞DNA BCT（Streck社、オマハ、NE、USA）中に収集し、直ちにEpic Sciences社（サンディエゴ、CA、USA）へ外界温度で輸送した。受け取ったらすぐに、赤血球を溶解し、かつ有核細胞を先に説明されたようにガラス製顕微鏡スライド上に分配し（Marrinucciらの文献、Hum Pathol, 38(3): 514-519 (2007)；Marrinucciらの文献、Arch Pathol Lab Med, 133(9): 1468-1471 (2009)；Mikolajczykらの文献、J Oncol, 2011: 252361. (2011)；Marrinucciらの文献、Phys Biol, 9(1): 016003 (2012)；Wernerらの文献、J Circ Biomark, 4: 3 (2015)）、かつ染色まで、-80℃で保存した。スライド1枚当たりに播いた血液のミリリットル相当量を、試料の白血球数、及び使用したRBC溶解後の細胞懸濁液の容量を基に計算した。循環腫瘍細胞を、説明されたように免疫蛍光により同定した（Marrinucciらの文献、2007, 前掲；Marrinucciらの文献、2009, 前掲；Mikolajczykらの文献、2011, 前掲；Marrinucciらの文献、2012, 前掲；Wernerらの文献、2015, 前掲）。その後のCTC回収及びゲノムプロファイリングワークフローの間に、個別の細胞を単離し、全ゲノム増幅、及びNGSライブラリ調製に付した。配列決定をIllumina NextSeq 500により実施した。

図1～4及び対応する図面の簡単な説明には、さらなる実験の詳細を記載する。

本明細書中に言及された全ての特許及び刊行物は、各々の独立した特許及び刊行物が具体的かつ個別的に参照により組み込まれていることが示されているかのように、同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
本件出願は、以下の構成の発明を提供する。
（構成１）
癌患者における疾患の不均一性を検出する方法であって、
(a) 該患者から取得した血液試料中の有核細胞の、免疫蛍光染色及び形態的特性評価を含む直接的分析を実施して、循環腫瘍細胞（CTC）を同定し、かつ計数すること；
(b) 該試料から該CTCを単離すること；
(c) ゲノムパラメータを個別に特徴づけて、該CTCの各々に対するゲノムプロファイルを作成すること；及び
(c) 該プロファイルに基づいて該癌患者における疾患の不均一性を決定すること、を含む、前記方法。
（構成２）
前記癌が、前立腺癌である、構成1記載の方法。
（構成３）
前記前立腺癌が、ホルモン不応性である、構成2記載の方法。
（構成４）
前記有核細胞の免疫蛍光染色が、汎サイトケラチン、表面抗原分類（CD）45、及びジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含む、構成1～3のいずれか1項記載の方法。
（構成５）
前記ゲノムパラメータが、コピー数多型（CNV）特徴を含む、構成1～4のいずれか1項記載の方法。
（構成６）
前記コピー数多型（CNV）特徴が、遺伝子の増幅又は欠失を含む、構成5記載の方法。
（構成７）
前記CNV特徴が、アンドロゲン非依存的細胞成長と関連する遺伝子を含む、構成6記載の方法。
（構成８）
前記欠失が、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ遺伝子（PTEN）の喪失を含む、構成6記載の方法。
（構成９）
前記遺伝子の増幅が、AR遺伝子の増幅を含む、構成6記載の方法。
（構成１０）
前記ゲノムパラメータが、ゲノム不安定性を含む、構成1～4のいずれか1項記載の方法。
（構成１１）
前記ゲノム不安定性が、大規模トランジション（LST）を測定することによって特徴づけられる、構成10記載の方法。
（構成１２）
前記ゲノム不安定性がゲノム変化率（PGA）を測定することによって特徴づけられる、構成10記載の方法。

Claims

癌患者における疾患の不均一性を検出する方法であって、
(a) 該患者から取得した血液試料中の有核細胞の、免疫蛍光染色及び形態的特性評価を含む直接的分析を実施して、循環腫瘍細胞（CTC）を同定し、かつ計数すること；
(b) 該試料から該CTCを単離すること；
(c) ゲノムパラメータを個別に特徴づけて、該CTCの各々に対するゲノムプロファイルを作成すること；及び
(d) 該プロファイルに基づいて該癌患者における疾患の不均一性を決定すること、を含み
該ゲノムパラメータが、大規模トランジション（LST）及びゲノム変化率（PGA）を測定することによって特徴づけられるゲノム不安定性を含み、
LSTは、少なくとも10 Mbの隣接領域間の染色体切断のnであり、PGAは、コピー数変化を有する患者のゲノムのパーセンテージ（増幅又は欠失）である、前記方法。
前記癌が、前立腺癌である、請求項1記載の方法。
前記前立腺癌が、ホルモン不応性である、請求項2記載の方法。
前記有核細胞の免疫蛍光染色が、汎サイトケラチン、表面抗原分類（CD）45、及びジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含む、請求項1～3のいずれか1項記載の方法。
前記ゲノムパラメータが、コピー数多型（CNV）特徴をさらに含む、請求項1～4のいずれか1項記載の方法。
前記コピー数多型（CNV）特徴が、遺伝子の増幅又は欠失を含む、請求項5記載の方法。
前記CNV特徴が、アンドロゲン非依存的細胞成長と関連する遺伝子を含む、請求項6記載の方法。
前記欠失が、ホスファターゼ・テンシン・ホモログ遺伝子（PTEN）の喪失を含む、請求項6記載の方法。
前記遺伝子の増幅が、AR遺伝子の増幅を含む、請求項6記載の方法。