JP7042619B2 - 無細胞の生体分子ブレッドボード並びに関連する方法およびアレンジメント - Google Patents

無細胞の生体分子ブレッドボード並びに関連する方法およびアレンジメント Download PDF

Info

Publication number
JP7042619B2
JP7042619B2 JP2017542427A JP2017542427A JP7042619B2 JP 7042619 B2 JP7042619 B2 JP 7042619B2 JP 2017542427 A JP2017542427 A JP 2017542427A JP 2017542427 A JP2017542427 A JP 2017542427A JP 7042619 B2 JP7042619 B2 JP 7042619B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
circuit
cell
genetic
molecular
free
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017542427A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2018512044A5 (ja
JP2018512044A (ja
Inventor
ゼット サン ザカリー
エム マーレー リチャード
シンハル ヴィプル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
California Institute of Technology CalTech
Original Assignee
California Institute of Technology CalTech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by California Institute of Technology CalTech filed Critical California Institute of Technology CalTech
Publication of JP2018512044A publication Critical patent/JP2018512044A/ja
Publication of JP2018512044A5 publication Critical patent/JP2018512044A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7042619B2 publication Critical patent/JP7042619B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B5/00—ICT specially adapted for modelling or simulations in systems biology, e.g. gene-regulatory networks, protein interaction networks or metabolic networks
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1075—Isolating an individual clone by screening libraries by coupling phenotype to genotype, not provided for in other groups of this subclass
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1089—Design, preparation, screening or analysis of libraries using computer algorithms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6897—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids involving reporter genes operably linked to promoters
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B35/00—ICT specially adapted for in silico combinatorial libraries of nucleic acids, proteins or peptides
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C20/00—Chemoinformatics, i.e. ICT specially adapted for the handling of physicochemical or structural data of chemical particles, elements, compounds or mixtures
    • G16C20/60—In silico combinatorial chemistry

Description

関連出願の相互参照
本出願は、それぞれその全体において参照により本明細書に組み込まれる、「In Vitro Biomolecular Breadboard Rapid and Predictive Prototyping of In Vivo Synthetic Dynamic Circuits」と題される、2015年2月17日に出願された、整理番号CIT-7105の米国仮出願第62/117,319号、および「In Vitro Method for Rapidly Exploring Generic Pathways that Produce Biological Products」と題される、2015年4月7日に出願された、整理番号CIT-7154の米国仮出願第62/143,878号に対し、優先権を主張する。
政府の認可のステートメント
本発明は、DARPAにより付与された認可番号HR0011-12-C-0065に基づいて政府の援助とともになされた。政府は、本発明における所定の権利を有する。
本開示は、無細胞の生体分子ブレッドボード並びに関連する方法およびアレンジメントに関する。特に、本開示は、目標環境において、合成動的回路を、設計、構築、実行、デバッグ、および／または試験するために構成される、無細胞生体分子ブレッドボード、並びに、関連する方法およびアレンジメントに関する。
合成生物学は、生物的制御の基礎をなす根本的な法則を解読するための有用なアプローチとして出現した。近年の努力により、多くのシステムおよびアプローチが産み出され、また、どのように生物学的機能を操作し、合成経路を効率的に最適化するのかについての実質的な識見も得られている。
努力や進展があるにも関わらず、そのような操作を行うための現在のアプローチは面倒であり、コストがかかり、困難である場合が多い。存在する生物学的システムを再プログラミングし、新たな生物学的システムを構成し、生物学、エンジニアリング、グリーンケミストリー、農業、および医療を含む、様々な分野における将来の斬新な用途のために、遺伝子回路を試験するために必要とされる設計－構築－試験のサイクルを加速させるためのエンジニアリング主導のアプローチおよびシステムを開発する課題がまだ残っている。
本明細書で提供されるのは、目標環境で動作する生物学的遺伝子回路を、設計、構築、実行、デバッグ、および／または試験するためにいくつかの実施形態において使用可能な方法およびアレンジメント、並びに、それに応じて構成された無細胞生体分子ブレッドボードである。
本開示における遺伝子回路は、相互に作用する成分の完全接続ネットワークを形成するために、回路設計にしたがって、生化学的反応により１つから別の１つに接続される分子成分の集合である。遺伝子回路において、少なくとも１つの分子成分は、遺伝子回路が回路設計にしたがって動作するときに検出できる、レポート可能なエレメントである。
第１の態様によれば、無細胞システムに、目標環境で動作する遺伝子回路を構築する方法が記載される。方法は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットを提供し、各セットは、遺伝子回路の分子成分を提供する無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物において反応可能である。
方法は、さらに、目標環境の条件下で、無細胞混合物中に、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の前記各セットの組み合わせを試験することを含み、無細胞混合物は、無細胞システムの化学物質成分を含み、試験は、目標環境の条件下で、遺伝子回路の分子成分を提供するために、無細胞混合物において反応可能なポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の前記各セットの選択された組み合わせを提供する。
また、方法は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の前記各セットの選択された組み合わせを、無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物と接触させ、目標環境の条件下で再試験し、選択された組み合わせは、目標環境で動作する遺伝子回路のレポート可能な分子成分を、無細胞混合物で提供することが可能なポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の前記各セットのさらに選択された組み合わせを提供することを含む。
第２の態様によれば、無細胞システムにおいて、目標環境で動作する遺伝子回路を構築する方法が記載される。方法は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットを提供し、各セットは無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物で反応することが可能であり、遺伝子回路の分子成分を提供することを含む。
方法は、目標環境の条件下で、別々の無細胞混合物において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の各セットを試験することをさらに含み、各無細胞混合物は無細胞システムの化学物質成分を含み、試験は、無細胞混合物において反応可能な各セットのための選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物を提供し、目標環境の条件下で、遺伝子回路の分子成分の１つを提供することを含む。
また、方法は、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の各セットの組み合わせを、目標環境の条件下で、無細胞混合物と折接触させることを含み、無細胞混合物は無細胞システムの化学物質成分を含み、接触は、目標環境の条件下で動作する遺伝子回路のレポート可能な分子成分を、無細胞混合物中に提供することが可能なポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の前記各セットの選択された組み合わせを提供する。
第３の態様によれば、無細胞システムにおいて、目標環境で動作する遺伝子回路を構築する方法が記載される。方法は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットを提供することを含み、各セットは、遺伝子回路の分子成分を提供するために、無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物において反応することができる。
また、方法は、別々の無細胞混合物において、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の各セットを試験することを含み、各無細胞混合物は、無細胞システムの化学物質成分を含み、各セットの試験は、目標環境の条件下で遺伝子回路の分子成分を提供するために、無細胞混合物において反応することが可能な選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物を、各セットにいついて提供することを、目標環境の条件下で行う。
方法は、さらに、別々の無細胞混合物において、目標環境の条件下で、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の各セットの組み合わせを試験することを含み、それぞれは、無細胞システムの化学物質成分を含み、試験は、目標環境の条件下で、遺伝子回路の分子成分を提供するために無細胞混合物において反応することが可能な、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の各セットの選択した組み合わせをもたらす。
また、方法は、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の各セットの選択された組み合わせを、無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物と接触させ、目標環境で動作する遺伝子回路のレポート可能な分子成分を目標システムの条件下で、無細胞混合物中に提供することが可能な、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の各セットのさらに選択された組み合わせを提供するために、選択された組み合わせを再試験することを含む。
第４の態様によれば、目標環境で動作する遺伝子回路を無細胞システムに構築する方法が記載される。方法は、本明細書に記載される遺伝子回路を提供し、各分子成分を試験し、目標環境の条件下で、分子成分を提供する無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物中で反応することが可能なポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットを、各試験された分子成分について選択することを含む。
方法は、さらに、遺伝子回路および／またはこれらの組み合わせの分子成分を試験し、目標環境の条件下で、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／もしくは代謝生成物またはこれらの組み合わせのセットを選択することを含み、各セットは分子成分を提供する無細胞システム中で反応することが可能である。
方法は、また、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／もしくは代謝生成物またはこれらの組み合わせのセットをさらに選択することにより遺伝子回路を構築することを含み、さらに選択されたセットは、遺伝子回路のレポート可能な分子成分を提供するために、無細胞混合物中で反応することが可能である。
第５の態様によれば、目標環境で動作する遺伝子回路を無細胞システム中でデバッグする方法が記載される。方法は、遺伝子回路を提供し、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットにより提供される分子成分を選択するために、目標環境下で、無細胞システム中で遺伝子回路の１以上の分子成分を試験することを含み、各セットは、遺伝子回路の１つの分子成分を提供するために、無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物中で反応することが可能である。方法は、さらに、１以上の分子成分を試験して変化させた遺伝子回路をもたらすことにより、選択された分子成分で、遺伝子回路の１以上の分子成分を置き換えることにより、遺伝子回路のバリエーションを提供し、目標環境で動作する遺伝子回路を無細胞システム中でデバッグするために、変化させた遺伝子回路で１以上の分子成分の試験および回路のバリエーションの提供を任意に繰り返すことを含む。
第６の態様によれば、目標環境で動作する遺伝子回路を、無細胞システム中に、構築および／またはデバッグするアレンジメント（配置、装置）が記載され、アレンジメントは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットを含み、各セットは遺伝子回路の分子成分を提供する無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物中で反応することが可能であり、単一の無細胞混合物を含む場合に、本開示の遺伝子回路を構築および／またはデバッグするための方法にしたがって遺伝子回路のレポート分子成分を提供することが可能である。
第７の態様によれば、目標環境で動作する遺伝子回路のバリエーションを無細胞システム中で試験する方法が記載される。方法は、遺伝子回路を提供し、分子成分の試験、分子成分の組み合わせの試験、および／または遺伝子回路の試験の後に、無細胞システム中で提供された分子成分におけるバリエーションを検出することにより、目標環境の条件下で、無細胞システムにおける遺伝子回路の変化を試験することを含み、各試験は、無細胞システムにおける変化を有し／有さずに行われる。方法では、遺伝子回路の分子成分が、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットにより無細胞システム中に提供され、各セットは、遺伝子回路の１つの分子成分を提供するために、無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物中で反応することが可能である。
第８の態様によれば、目標環境で動作する遺伝子回路の無細胞システム中での変化を試験するアレンジメントが記載され、アレンジメントは、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチおよび／または代謝生成物のセットの組み合わせを含み、各セットの各組み合わせは、単一の無細胞混合物中に含まれる場合に、方法に従って構築されたおよび／またはデバッグされた遺伝子回路のレポート可能な分子成分を提供することを可能にし、アレンジメントは、遺伝子回路のバリエーション、特に、遺伝子回路の少なくとも１つの分子成分におけるバリエーションを実施することが可能な少なくとも１つの試薬を含む。
第９の態様によれば、目標環境で動作する遺伝子回路を無細胞システム中で試験する方法が記載される。方法は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットにより提供される１以上の分子成分を選択するために、遺伝子回路を提供し、目標環境の条件下で、無細胞システム中で、遺伝子回路またはその一部を試験することを含み、各セットは、遺伝子回路の１つの分子成分を提供するために、無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物中で反応することが可能である。方法は、さらに、試験により選択された１以上の分子成分を試験することによりおよび／または遺伝子回路に添加することにより選択された１以上の分子成分で、遺伝子回路の１以上の分子成分を置き換えることにより、遺伝子回路のバリエーションを提供することを含む。方法は、また、目標環境で動作する変化させた遺伝子回路を無細胞システム中に提供するために、１以上の分子成分の試験を繰り返し、遺伝子回路のバリエーションを提供することを含む。
第１０の態様によれば、目標環境で動作する遺伝子回路の無細胞システムでの変化を試験するアレンジメントが記載され、アレンジメントは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットの組み合わせを含み、各セットは、遺伝子回路の分子成分を提供する無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物中での反応が可能であり、組み合わせは、単一の無細胞混合物中に含まれる場合に、本開示の遺伝子回路を構築および／またはデバッグするための方法にしたがって構築された遺伝子回路のレポート可能な分子成分を提供することが可能である。システムは、さらに、本開示にしたがう遺伝子回路のバリエーションを試験するための方法において、同時に、組み合わせて、または連続しての使用のために、追加の分子成分を提供する、少なくとも１つのセットのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物を含む。
第１１の態様によれば、無細胞の生体分子ブレッドボードは、本明細書に記載される方法にしたがい、目標環境で動作する１以上の遺伝子回路または回路の一部を、無細胞システム中で試験するために、プロトコル、アレンジメント、反応混合物、コンピュータを用いてシステム、インビトロでシステム、および／またはインビボシステムの組み合わせを含むことが記載される。
本明細書に記載される無細胞の生体分子ブレッドボード、および関連する方法、およびアレンジメントは、いくつかの実施形態において、目標環境で動く遺伝子回路を付与する関連する発現に対する、分子成分および／または分子の能率的な付加、変更、除去により、目標環境で動作する遺伝学的にコードされた回路の迅速なおよび／または費用効果の高い構築を可能にする。
本明細書に記載される無細胞の生体分子ブレッドボードおよび関連する方法およびアレンジメントは、いくつかの実施形態において、目標環境で作用する場合に、遺伝子回路で動作する分子成分の同定に基づき、目標環境で動作する遺伝子回路を迅速におよび能率的にデバッグすることを可能にする。
本明細書に記載される無細胞の生体分子ブレッドボードおよび関連する方法およびアレンジメントは、いくつかの実施形態において、目標環境で動作する遺伝子回路、関連する分子成分および／またはこれらの組み合わせの変化を、無細胞システム中で、迅速に、能率的に、および／または費用効果を高く試験することを可能にする。
本明細書に記載される無細胞の生体分子ブレッドボードおよび関連する方法およびアレンジメントは、いくつかの実施形態において、インビボまたはインビトロの生物学的環境における、天然のおよび操作された遺伝子回路を迅速におよび正確に特徴づけるための能率的かつ効果的なツールである。
本明細書に記載される無細胞の生体分子ブレッドボードおよび関連する方法およびアレンジメントは、いくつかの実施形態において、追加の試験の実行、特徴づけ、および／または細胞宿主または他の目標環境での操作のために、細胞宿主または他の目標環境にその後移される、遺伝子回路の無細胞システムにおける、迅速な設計、構築、実行、特徴づけ、および／またはエンジニアリングを可能にする。
本明細書に記載される無細胞の生体分子ブレッドボードおよび関連する方法およびアレンジメントは、遺伝子回路を設計、構築、試験、および／またはデバッグすることが所望される、種々のアプリケーションと関連して使用することができる。例えば、本明細書に記載される無細胞の生体分子ブレッドボードおよび関連する方法およびアレンジメントは、インビトロで広範囲、定量的、および迅速なネットワークの特徴づけを行うために、生物システムエンジニアリングおよび成分の特徴づけで使用することができる。追加の例示的なアプリケーションは、基礎生物学研究、応用生物学、バイオエンジニアリング、バイオエネルギー、医学研究、医療診断、治療学、バイオ燃料、農業、環境モニタリング、および治療、分子の検出、生物兵器防衛を含むいくつかの分野、並びに本開示から当業者により読み取れる識別可能な追加の分野での無細胞の生体分子ブレッドボードおよび関連する方法およびアレンジメントの使用を含む。
本開示の１以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の記載で明らかである。他の特徴、目的、および利点は、図面および明細書から、並びにクレームから明らかである。
添付の図面は、詳細な説明および実施例とともに、本明細書に組み込まれ、かつその一部を構成し、本開示の１以上の実施形態を示し、本開示の原理および実施を説明する。
図１は、例示的なベーシックブレッドボードプロセスの概略図を提供する。図１のＡは、１，４ブタンジオールを産生するための生体分子の「事象検出」および経路を含む、設計・実行された回路のタイプを示す。図１のＢは、ブレッドボード主成分がＴＸ－ＴＬ抽出システムであることを示す。また、詳細なモデリングツールボックスが回路および経路のシミュレーションおよび分析のために使用可能である。図１のＣ～Ｄは、液滴に基づくミクロ流体システムおよび連続的なフローリアクター（EPFLとともに開発）の使用を示す。回路は、大腸菌に形質転換され得る（図１のＥ）。 図２は、ＴＸ－ＴＬ無細胞システムを用いた転写および翻訳プロセスを示す。 図３の（ａ）は、遺伝学的トグルスイッチ遺伝子回路レイアウトを示す。ＴｅｔＲはＰＬｔｅｔＯ－１を抑制するが、ＴｅｔＲ’の働きは、インデューサーａＴｃにより阻害され、ＬａｃＩはＰｔｒｃ－２の働きを抑制するが、ＬａｃＩの働きは、インデューサーＩＰＴＧにより阻害される。図３の（ｂ）は、抑制遺伝子回路レイアウトを示す。ＴｅｔＲはλcIの発現を抑制し、同様にＬａｃＩ発現を抑制する。最後に、ＬａｃＩはＴｅｔＲの発現を抑制し、抑制サイクルが完成する。 図４は、８つのタイプのフィードフォワードループ（ＦＦＬ）を示す。転写調節因子Ｘは、転写調節因子Ｙを調節し、両方が共にＺを調節する。普通の矢印は、２つのノード間の相互作用が活性化していることを示す。頭の部分がフラットな矢印は、２つのノード間の相互作用が抑制されていることを示す。 図５Ａは、例示的な非干渉性フィードフォワードループを示す。Ａ、Ｂ、Ｃとラベルされたボックスは、遺伝学的分子成分であり、それぞれが翻訳または転写ユニットを表す。 図５Ｂは、図５のＡの非干渉性フィードフォワードループから生じたパルス状の波形を示す。 図６は、例示的な生体分子回路のプロトタイピングおよびデバッグの基本的な「ワークフロー」を描く概略図を示す。全体のワークフローは、「設計、構築、試験」（ＤＢＴサイクル）として言及され、それは、モデル、無細胞発現システム、インビボ回路の組み合わせを用いるＤＢＴサイクルを実行する方法を含む。 図７は、フローチャートとして示される、例示的な生体分子回路のプロトタイピングおよびデバッグの基本的な「ワークフロー」を描く概略図を示す。インビトロおよびインビボでの実験の結果は、モデルにより予測された結果と比較される。これらのステップは、エレメントがマッチしない場合には、繰り返される。 図８は、インビボで採取された一実施形態において、ＯＤにより正規化されたレポータータンパク質ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡにより示される、ＧＦＰシグナルの時間発展をプロットする。各プロットされた種は、プラスミド３６０およびｐＬａｓ変異体レポータープラスミドの組み合わせである。 図９のＡは、例示的なオープンループバージョンの例示的なフィードフォワードループを示し、２つのノード、ｐＬａｃＯ１－ＵＴＲ１－ｌａｓＲおよびｐＬａｓ－変異体－ＵＴＲ１－ｄｅＧＦＰを含む。各ｌａｓＲプロモーター変異体は、３ＯＣ１２ＨＳＬを変更することによるＴＸ－ＴＬで試験される。各プロットで示されるのは、独立した３つの実験の平均である。図９のＢからＦは、各ｐＬａｓ変異体のｐＬａｓ変異体（５つのプロモーター：Ｐ＿ｏｒｉｇ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４）についての時間の関数として、各パネルのｄｅＧＦＰ量を示す。 図９Ｂでは、文献からのこれまでのレポーターである、ｐＲｓａＬ（Ｐ０、またはＰ＿ｏｒｉｇ）が試験された。 図９Ｃでは、－１０領域（Ｐ１）で変異を有するｐＬａｓＩが試験される。 図９Ｄでは、ｐＬａｓＩ野生型（Ｐ２）が試験された。 図９Ｅでは、ｐＬａｓＢ野生型（Ｐ３）が試験された。 図９Ｆでは、拡張された領域を有するｐＲｓａＬ（Ｐ４）が試験された。 図９Ｇは、関連するプロモーターの特徴についての最も適合される値を示す。データは、３ＯＣ１２ＨＳＬを変化されるために、ＴＸ－ＴＬｐｅｒプロモーター時間＝３００分でのエンドポイントの値から得て、各実験は、新たに調製されたＤＮＡ源で３回行われる。 図９Ｈは、一実施形態における各ｐＬａｓ変異体についての３ＯＣ１２ＨＳＬ濃度の関数として、ｄｅＧＦＰ量をプロットする。本実施形態で試験される回路は、変化したｄｅＧＦＰを産生するｌａｓＲ－活性化プロモーターとともに、１ｎＭｐＬａｃ－ｌａｓＲプラスミドおよび１ｎＭプラスミドで構成される。３つの独立した実験からｔ＝３００分からのエンドポイントが図９Ｈに示される。 図９Ｉは、各プロモーターについての最小のシグナルに対して最大のシグナルを比較し、各プロモーターについてのフォールドチェンジダイナミックレンジを決定する。 図１０は、インビトロ（左）およびインビボ（右）についてのヒートマップを示す。インビトロのセクションについては、各横列はｐＬａｓ変異体(つまりプロモーター）に対応し、各縦列は異なる抽出（Ａ～Ｋ）に対応する。ｔ＝１８０分でのプロモーターＶｍａｘの値は、ことなる抽出にわたって使用される。抽出は、図９、１２、１４、１５、１６、３８、３９、４１、４３、４４、５４について使用される主要な抽出である。抽出ＡおよびＤは、ＥｘｐｒｅｓｓＩＱの種であり、Ｂ～ＣおよびＥ～Ｉは、ＢＬ２１Ｒｏｓｅｔｔａ２であり、ＪはＭＧＺ１種であり、およびＫはＪＳ００６種である。インビボのセクションについては、データの一次導関数、例えば、ｄＧＦＰ／ｄＯＤは、図８から取られ、それぞれの最大値はヒートマップ上にプロットされる。濃いグレーは相対的な発現が１であり、白は相対的な発現が０である。 図１１Ａは、３つの遺伝学的分子成分を有する例示的な非干渉性フィードフォワードループのモチーフ（ＩＦＦＬ）を示す。 図１１Ｂは、一実施形態における、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬレベルで採取された、２５６種の全てについての導入後の経時の正規化されたＧＦＰシグナルを示す。 図１１Ｃは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬレベルで採取された、２５６種の全てについての導入後の経時のＧＦＰシグナルを示す。 図１１Ｄは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬレベルで採取された、２５６種の全てについての導入後の経時のＯＤシグナルを示す。 図１１Ｅは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬで、ＵＴＲ１ ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ（横列）およびＵＴＲ１ ＴｅｔＲ（縦列）の場合についてトレースされたサンプルデータを示す。 図１１Ｆは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬで、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ（横列）およびＢ００３４ ＴｅｔＲ（縦列）の場合についてトレースされたサンプルデータを示す。 図１１Ｇは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬで、ＢＣＤ２４ ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ（横列）およびＵＴＲ１ ＴｅｔＲ（縦列）の場合についてトレースされたサンプルデータを示す。 図１２のＡおよびＢは、インビトロおよびインビボでの例示的なフィードフォワードループの例示的な翻訳の変化を示し、リプレッサー成分およびレポーター成分は、ＲＢＳにより変化する。インビトロでは、ｌａｓＲ、ＴｅｔＲ、およびｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡは、２：１：８の割合で発現される。インビトロでは、それらはｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１＊、およびｃｏｌＥ１プラスミドの上に置かれ、２：１：８の割合でみられる。点線は、［１］で開発された予測バイシストロニックアレンジメントを用いてＲＢＳのアウトラインを描く。 インビボについてのデータは、ピークパルス（またはオープンループについて１６時間後のエンドポイントの発現）としてとられ、インビトロについてのデータは、６時間後のエンドポイントの発現として取られた。 図１２Ｃは、インビトロ（左）およびインビボ（右）からのＴｅｔＲ発現（Ｂ００３４）の１つの縦列を示す。各縦列は、ＲＢＳ配列を変化させた１６のｄｅＧＦＰ変異体を含む。 図１２Ｄは、インビトロ（上）およびインビボ（下）からのｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ（ＵＴＲ１）の１つの横列を示す。各横列は、ＲＢＳ配列を変化させた１６のＴｅｔＲ変異体を含む。 図１３は、２つの種からのインビボでの相対的なコピー数を定量するための定量的ＰＣＲを示す。 図１４Ａは、１つのインビトロでの実施形態における、ａＴｃ１０ｕＭレベルで採取された、２５６種の全てについての導入後の経時の正規化されたＧＦＰシグナルを示す。各サブパネルは、異なる種を表し、Ｙ軸は相対的な蛍光ユニット（ｒｆｕ）、Ｘ軸は分での時間を示す。ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡプラスミドに対応するＲＢＳは、各横列の左側に示され、ＴｅｔＲプラスミドに対応するＲＢＳは、各縦列の上に示される。 図１４Ｂは、１０ｕＭのａＴｃで、ＵＴＲ１ ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡおよびＵＴＲ１ ＴｅｔＲの場合についてのサンプルデータのトレースを示す。 図１５は、一実施形態において、インビトロでの（左）およびインビボ（右）でのａＴｃの変化を示す。インビトロのプロットは、ａＴｃ量（Ｘ軸）の関数として、ｄｅＧＦＰの発現（Ｙ軸）を示す。インビボのプロットは、ａＴｃ量を変化させた１６ｘ１６ＧＦＰ格子データを示す（左から右に：１０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および０ｎｇ／ｍＬ）。濃いグレーはパルスなし、明るいグレーはパルスを示す。 図１６は、一実施形態におけるインビトロ（左下）およびインビボ（右）でのｌａｓＲ変化の効果を示す。左は、ｌａｓＲ ＤＮＡ濃度（Ｘ軸）を変化させた場合のエンドポイントのｄｅＧＦＰ発現（Ｙ軸）を示し、図面におけるインサートは、異なる量のｌａｓＲ ＤＮＡ濃度についての時間（Ｙ軸）とｄｅＧＦＰシグナル（Ｘ軸）を示す。右側は、ｌａｓＲを発現する高発現のＲＢＳの１つ（ＢＣＤ２、左）と、ｌａｓＲを発現する中程度に発現するＲＢＳの１つ（ＢＣＤ２０、右）と、ｌａｓＲを発現する低発現のＲＢＳの１つ（ＢＣＤ２２、下）との３セットの種からのインビボの結果を示す。図の一部となっている種の各グラフでは、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡを発現するプラスミドについてのＲＢＳが横列で配置され、ＴｅｔＲを発現するプラスミドについてのＲＢＳが縦列で配置され、各グラフは時間（Ｘ軸）およびＧＦＰ／ＯＤ（ｒｆｕ）（Ｙ軸）を示す。 図１７Ａは、プラスミド３６０（ＰｌａｃＯ１＿ＢＣＤ２２＿ｌａｓＲ＿Ｔ５００）（配列番号１）についての配列表を示す。 図１７Ｂは、利用プロモーター「ＰＯｒｉｇ＿ｔｅｔＯ１」のプラスミド４２８（ＰＲｓａＬ－ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）（配列番号２）についての配列表を示す。 図１７Ｃは、利用プロモーター「Ｐ１＿ｔｅｔＯ１」のプラスミド３４７（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿－１０－ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）（配列番号３）についての配列表を示す。 図１７Ｄは、利用プロモーター「Ｐ２＿ｔｅｔＯ１」のプラスミド４２９（ＰＬａｓＩ－ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）（配列番号４）についての配列表を示す。 図１７Ｅは、利用プロモーター「Ｐ３＿ｔｅｔＯ１」のプラスミド４３０（ＰＬａｓＢ－ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）（配列番号５）についての配列表を示す。 図１７Ｆは、利用プロモーター「Ｐ４＿ｔｅｔＯ１」のプラスミド４３１（ＰＲａｓＬ ｌｏｎｇ（ｌａｓ）－ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）（配列番号６）についての配列表を示す。 図１８Ａは、利用プロモーター「Ｐｏｒｉｇ」のプラスミド１６５ （ＰＲｓａＬ＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）（配列番号７）についての配列表を示す。 図１８Ｂは、利用プロモーター「Ｐ１」のプラスミド１９６（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿－１０＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）（配列番号８）についての配列表を示す。 図１８Ｃは、利用プロモーター「Ｐ２」のプラスミド１９７（ＰＬａｓＩ－＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）（配列番号９）についての配列表を示す。 図１８Ｄは、利用プロモーター「Ｐ３」のプラスミド１９８（ＰＬａｓＢ－＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）（配列番号１０）についての配列表を示す。 図１８Ｅは、利用プロモーター「Ｐ４」のプラスミド１９９（ＰＲａｓＬ ｌｏｎｇ（ｌａｓ）－＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）（配列番号１１）についての配列表を示す。 図１８Ｆは、プラスミド１６３（ｐＬａｃＯ１－ＵＴＲ１－ｌａｓＲ）（ 配列番号１２）についての配列表を示す。 図１９Ａは、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡをコードする遺伝子（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿－１０＿ｔｅｔＯ１（Ｐ１＿ｔｅｔＯ１）－（ｂｌａｎｋ）－ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ－Ｂ１００２）（配列番号１３）を運ぶ、プラスミドの共有骨格配列の配列表を示す。 図１９Ｂは、図１９Ａおよび図１９Ｂで示されるプラスミド骨格配列に装入される１６の変異体ＲＢＳ配列（配列番号１４～２９）の一覧である。 図１９Ｃは、ＴｅｔＲ（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿－１０（Ｐ１）－（ｂｌａｎｋ）－ＴｅｔＲ－Ｔ５００）（配列番号３０）を運ぶ、プラスミドの共有骨格配列の配列表を示す。 図２０Ａは、プラスミド３７３：Ｐｌａｃ＿ＢＣＤ２＿ｌａｓＲ＿Ｔ５００（配列番号３１）についての配列表を示す。 図２０Ｂは、プラスミド３７４：Ｐｌａｃ＿ＢＣＤ２２＿ｌａｓＲ＿Ｔ５００（配列番号３２）についての配列表を示す。 図２１Ａは、実施例３３～４０で使用される直鎖ＤＮＡ構成物を表に要約する。 図２１Ｂは、実施例３３～４０で使用されるプラスミドを表に要約する。 図２１Ｃは、実施例３３～４０で使用されるプラスミドを表に要約する。 図２１Ｄは、実施例３３～４０で使用される種を表に要約する。 図２１Ｅは、実施例３３～４０で使用されるＤＮＡ濃度の一覧である。 図２１Ｆは、実施例３３～４０で使用されるＤＮＡ濃度の一覧である。 図２２は、無細胞リプレッシレーターの特徴づけを説明する。図２２のＡは、ＣＩリプレッサーの結合部位の１つに位置するＣＩプロモーター(ＯＲ２＊)での点変異を有する変更されたバージョンおよびオリジナルのリプレッシレーターを特徴づける無細胞システムの実施形態を示す。図２２のＢは、希釈時間を異ならせて、リプレッシレーターおよびＯＲ２＊バージョンの３つのプロモーターからの発現を示す。図２２のＣは、希釈時間の関数として、リプレッシレーターのオシレーション期間を示す。ＯＲ２＊バージョンでは、オリジナルのリプレッシレーターネットワークと比較して、狭い範囲の希釈時間で持続したオシレーションが維持される。図２２のＤは、異なる初期ＴｅｔＲおよびＣＩリプレッサー濃度から開始するリプレッシレーターオシレーションの位相ポートレートを示す。 図２３は、ネガティブフィードバック回路の特徴づけおよび無細胞プロトタイピングを説明する。図２３のＡは、リプレッシレーターリプレッサー‐プロモーターのペア（上）およびＴｅｔＲ相同体（下）の伝達関数を示す。ＴｅｔＲリプレッサーは、２つの異なるプロモーター：リプレッシレーターで使用されるプロモーター（上のパネル）およびＪ２３１１９－ＴｅｔＲプロモータ［２］（下のパネル）に対して試験される。ラインはヒル機能適合である。図２３のＢは、プラスミドＤＮＡで構成された新規な３－ノードリングオシレータ（３ｎ１）のオシレーションを示す。図２３のＣは、直鎖ＤＮＡ上の２つのバージョンの第２のノードリングオシレータ（３ｎ２）が、オシレータ機能でのＣｌｐＸＰ分解の効果を実験するために使用されたことを示す。１つのバージョンは、全てのリプレッサー遺伝子でｓｓｒＡがタグされたものであり、他のバージョンは、リプレッサーで分解タグが運ばれなかった。中程度の強さの分解タグを有する同じレポーターが両方のバージョンで使用された。図２３のＤは、直鎖ＤＮＡ上の４－ノードサイクリックネガティブフィードバックネットワーク初期条件に依存する２つの安定した定常の状態を有することを示す。ＩＰＴＧは、ｐＰｈｌＦがオンであり、ｐＴｅｔＲがオフである状態へとネットワークを切り替えた。ａＴｃの初期パルスは、安定した定常の状態とは逆の状態をもたらした。図２３のＥは、直鎖ＤＮＡで構成される２つの新規な５－ノードリングオシレータ（５ｎ１、５ｎ２）を示す。図２３のＦは、シミュレーションにより予測され、実験データに示されるように、５－ノードリングオシレータが３－ノードリングオシレータよりも長い期間振動することを示す。 図２４は、例示的な無細胞フレームワークを用いる５－ノードネガティブフィードバックオシレータのエンジニアリングの例示的な実施形態を示す。コンピュータを用いて意図された挙動を示す新規なネットワーク構造は、インビトロで特徴づけられた部分を用いて直鎖ＤＮＡでまずは組み立てられる。直鎖ＤＮＡで試験する初期回路は、i）数時間で直鎖ＤＮＡを合成することができ、ii)複数の回路変異体の迅速な試験を可能にし、iii）それらの相対的濃度を変化させることにより、ネットワーク成分の発現強度を容易に調整することができるため有利である。機能回路は、所望の挙動を維持するパラメータの範囲を特定するために、仮説を実験的に試験するために、さらにその後特徴づけられる。インビボでの実行が意図される場合、インビボでの実行前に、クローンプラスミドのインビトロでの正しい機能が評価される。 図２５Ａは、一実施形態における、希釈時間および合成率に関して、３－ノードリプレッシレーターネットワークについてのオシレーションパラメータの状態を示す。転写（ＴＸ）および翻訳（ＴＬ）率は、３－ノードリプレッシレーターネットワークについての異なる希釈時間でオシレーションを維持する。 図２５Ｂは、希釈時間に関し、３－ノードリプレッシレーターネットワークについてのオシレーションの存在および期間を示す。 図２５Ｃは、希釈時間およびリプレッサー結合親和性に関する３－ノードリプレッシレーターネットワークについてのオシレーションパラメータ状態を示す。 図２６Ａは、一実施形態における、リプレッサーの伝達関数の測定を示す。プロモーターのペアは、無細胞フレームワークを用いて測定される。示されるのは、例としてＬａｃＩ‐pＬａｃＩ(r)を用いる分析および実験結果である。伝達関数は、総Ｃｅｒｕｌｅａｎ濃度に対して、最も高いリプレッサー濃度から最も低いリプレッサー濃度まで（グレーにシェーディングされたエリア）のＣｉｔｒｉｎｅ合成率をプロットすることにより得られ、ナノリアクターアレンジメントでセットされた異なる希釈時間については同じであった。 図２６Ｂは、一実施形態におけるインビトロおよびインビボでの相対的なプロモーター強度の比較を示す。相対的プロモーター強度（Ｖｍａｘ）の比較をインビトロおよびインビボで測定した。ｐＣＩ（ｒ）、ｐＴｅｔＲ（ｒ）、およびｐＬａｃＩ（ｒ）は［３］由来であり、ｐＴｅｔＲは［２］由来であり、ｐＬａｃＩは［４］由来である。エラーバーは、３つの複製の標準偏差を示す。 図２６Ｃは、一実施形態における、インビトロおよびインビボでの抑制のために必要とされる最大半量のリプレッサー濃度の比較を示す。ＫＭ値とともに本研究においてインビトロで測定されたＫＭ値の比較がＳｔａｎｔｏｎらの［２］によりインビボで測定された。ＫＭ値は、ＴｅｔＲのＫＭに対して正規化された。 図２７のＡ～Ｆは、一実施形態における、細胞での新規な３－ノードおよび５－ノードリングオシレータを示す。図２７のＡは、大腸菌（マザーマシン）で動いている３－ノードリングオシレータの時系列のトレースを示す。強いｐＰｈｌＦ ｓｆＧＦＰ－ｓｓｒＡレポーターおよびオシレーションの「オン」および「オフ」からの代表的な画像を用いて、インビボで３６時間、３ｎ１および３ｎ２のシングルトラップのトレースを観察した。スケールバーは５μｍである。図２７のＢは、大腸菌（マザーマシン）において動く５－ノードリングオシレータの時系列のトレースを示す。弱ｐＰｈｌＦ ｓｆＧＦＰ－ｓｓｒＡ レポーターを用いてインビボで７２時間、５ｎ１および５ｎ２のシングルトラップのトレースを観察した。図２７のＣは、インビボで、母集団が広いオシレーションパルスを示す（ＣｅｌｌＡＳＩＣ）。１６０分ごとの強３ｎ１のｐＰｈｌＦ ｓｆＧＦＰ－ｓｓｒＡ レポーターの時系列の顕微鏡写真であり、挿入図は、初期のミクロコロニーの個々の細胞を示す。スケールバーは１０μｍおよび５μｍ（挿入図）。図２７のＤは、インビボでの期間と分裂時間との関係を示す。左は、インビボでの強いｐＰｈｌＦ ｓｆＧＦＰ－ｓｓｒＡレポーター下での３ｎ１である。インビトロでのデータは比較のために示される。ＣｅｌｌＡＳＩＣの実験からの期間および分裂時間に対応するインビボデータでの各ポイントは、異なる媒体タイプおよび流量下で動く。右は、弱いｐＰｈｌＦ ｓｆＧＦＰ－ｓｓｒＡレポーター下での５ｎ２である。インビボの期間は、マザーマシン実験での２９℃および２１℃の増殖温度で測定された。ボックスは、メジアンで内側４分位の範囲を示す。図２７Ｅは、ＣｌｐＸＰ分解について競うことによる、オシレーション期間でのレポーター濃度の影響を示す。左は、一定量のＣｌｐＸＰで、レポーター濃度がリプレッサー分解、つまりオシレーション期間に影響を及ぼす。マザーマシンでランした３ｎ１および５ｎ２の両方について、弱いおよび強いｐＰｈｌＦ ｓｆＧＦＰ－ｓｓｒＡレポーターが観察される期間のヒストグラム。点線はメジアンを示す。 図２８Ａは、一実施形態における、インビボでの３－ノードおよび５－ノードオシレータの強いオシレーションを示す。３－ノード(上)および５－ノードネットワーク(下)は、インビボで、ネットワークサイズに応じた期間で振動する。示されるのは、点線で示されるメジアンと観察される期間の長さの分布である。３－ノードおよび５－ノードネットワークの両方が、３－ノードネットワークについての全ての増殖細胞のオシレーションおよび５－ノードネットワークについての９５％以上の増殖細胞のオシレーションを伴う強いオシレーションを示した（トレースあたり少なくとも２つの別個のオシレーションピークで定義される）。３－ノードネットワークはともに、ｐＰｈｌＦ ｓｆＧＦＰ－ｓｓｒＡレポーターを用いて分析され、２つの５－ノードネットワークは、弱いｐＰｈｌＦ ｓｆＧＦＰ－ｓｓｒＡレポーターを用いて分析された。 図２８Ｂは、一実施形態における、インビボでの、母集団レベルの３ｎ２オシレータを示す。３ｎ２オシレータは、ＣｅｌｌＡＳＩＣミクロ流体アレンジメントにおいて、強いｐＰｈｌＦ ｓｆＧＦＰ－ｓｓｒＡレポーターのもとで、３ｎ２が動かされる。スケールバーは１０μｍである。 図２８Ｃは、一実施形態における、インビボでの３ｎ２オシレータの母集団レベルのオシレーションおよび３カラーのオシレーションを示す。３ｎ２は、同時に３つのレポーターを観察する位相同調性を示す。レポーターは、強いｐＰｈｌＦ Ｃｉｔｒｉｎｅ－ｓｓｒＡ、ｐＴｅｔＲ ｍＣｈｅｒｒｙ－ｓｓｒＡ、およびｐＳｒｐＲ Ｃｅｒｕｌｅａｎ－ｓｓｒＡである。示されるのは、１つのオシレーションサイクルである。スケールバーは１０μｍである。 図２８Ｄは、オリジナルのリプレッシレーターを示し、ＯＲ２＊変異リプレッシレーターは母集団レベルのオシレーションを示さない。オリジナルのリプレッシレーターとＯＲ２＊変異リプレッシレーターとは、位相同調性を示さない。これらはＭ９最少培地で、ｐＴｅｔＲ（ｒ）－ｅＧＦＰ（ＡＳＶ）下で動く。オシレーションは、ＬＢでは維持されない。スケールバーは１０μｍである。 図２９のａ）およびｂ）は、一実施形態における、遺伝子回路の迅速なプロトタイピング手順の概要を説明する。図２９のａ）は、回路の従来の試験を示し、パーツは単一のプラスミドまたは相補的なプラスミドのセットでクローニングされ、インビボで試験され、構成へとサイクルで戻る。図２９のｂ）は、迅速なプロトタイピング手順を示し、回路は直鎖ＤＮＡ上の構成間でサイクルされ、ＴＸ－ＴＬで試験する。最終的な回路のプロトタイプが完成すると、プラスミドＤＮＡ構成およびインビボでの回路の実行の１つのサイクルのみが生じる。 図３０のａ）～ｄ）は、一実施形態における、直鎖ＤＮＡを保護することにおけるｇａｍＳの活性を示す。図３０のａ）は、プラスミドＤＮＡ、ｇａｍＳ保護のない直鎖ＤＮＡ、ｇａｍＳ保護のある直鎖ＤＮＡについてのｄｅＧＦＰの時系列の蛍光の比較を示す。使用されるプラスミドＤＮＡはｐＢＥＳＴ－ＯＲ２－ＯＲ１－Ｐｒ－ＵＴＲ１－ｄｅＧＦＰ－Ｔ５００であり、直鎖ＤＮＡは立体保護の末端がない８１０ｂｐのＰＣＲ産物であり、それぞれは１６ｎＭで供給される。図３０のｂ）は、天然のまま抽出したタンパクの前もってのインキュベーションを行わず、ｇａｍＳの作用濃度を異ならせるために、シグナルに対してプロットされた２ｎＭの直鎖ＤＮＡの８時間後のエンドポイントＧＦＰ発現を示す。図３０のｃ）は、ＤＮＡ濃度を増加させて、ｇａｍＳタンパクありまたはなしでプラスミドおよび直鎖ＤＮＡからのエンドポイントｄｅＧＦＰ発現を示す。プラスミドＤＮＡの０．９８の相関性は０ｎＭ～４ｎＭの値のみについてであり、直鎖ＤＮＡの０．９９の相関性は０ｎＭ～１６ｎＭについてである。図３０のｄ）は、テンプレートの末端で非コードＤＮＡの異なる量を用いる２ｎＭの直鎖ＤＮＡの保護を示す。 図３１のａ）～ｃ）は、一実施形態における、迅速な組み立て概念の方法およびＰＣＲにより作成したもの対迅速に作成した直鎖ＤＮＡを比較する結果を説明する。図３１のａ）は、迅速な組み立ての概要およびプロトタイピング手順を示し、ＤＮＡパーツはプラスミドを作成するゴールデンジーンアッセンブリ（ＧＧＡ）を用いて組み立て、ＴＸ－ＴＬに適する高濃度で直鎖ＤＮＡを作成するために、その後、ＰＣＲテンプレートとして直接使用される。同時に、組み立て産物が、クローンプラスミドのより多くのコピーを産生するために、インビボで増殖させることもできる。図３１のｂ）は、５つのスタンダードなピースである６６ｂｐ、１０３ｂｐ、１１０ｂｐ、７０７ｂｐ、および２３７６ｂｐから組み立てられた遺伝子のアガロースゲルからの結果を示す。示されるのは、５０ｎｇのそれぞれの開始フラグメント（６６ｂｐを除く）、エキソヌクレアーゼ消化前後の組み立て後のフラグメント（「ｅｘｏ」）、およびクローン後のＰＣＲ産物（「ｐｏｓ」）と比較される迅速な組み立てＰＣＲ産物（「ＲＡＰ」）である。矢印は、８９２ｂｐと予測されるサイズを示す。図３１のｃ）は、０．５ｍＭのＩＰＴＧインデューサーありまたはなしで、４ｎＭの迅速な組み立てまたはクローン後産物の機能的な試験を示す。実験は、２ｎＭのＰｌ－ｔｅｔＯ１－ＬａｃＩ直鎖ＤＮＡの存在下で行った。直鎖ＤＮＡは、ｇａｍＳおよび３１ｂｐの立体保護で保護される。エラーバーは、３つの独立した実験からの１標準偏差を示す。 図３２のａ）は、一実施形態における、標準的なピースから組み立てられた、４つのピースのネガティブフィードバック遺伝子を示す。図３２のｂ）は、アイソサーマルアッセンブリ（「ＲＡＰ－ｉｓｏ」）により作成された迅速な組み立て産物、ゴールデンジーンアッセンブリ（「ＲＡＰ－ＧＧＡ」）により作成される迅速な組み立て産物、およびクローン後のＰＣＲ産物（「ｐｏｓ」）のアガロースゲル電気泳動による比較を示す。矢印は、期待されるバンドを示す。直鎖ＤＮＡは、ｇａｍＳで、および２５０ｂｐの立体保護で保護される。図３２のｃ）は、１０μＭのａＴｃありまたはなしでクローン後のＰＣＲ産物と比較される６ｎＭの迅速な組み立て産物の機能的な試験を示す。 図３３のａ）～ｂ）は、一実施形態における、迅速な組み立て方法についての具体的なピースを示す。図３３のａ）は、プロモーター、５’ＵＴＲ、コード配列、ターミネーター（転写終結コドン）、およびこれまでに使用されたｐＢＥＳＴ骨格に基づくベクターに特異的なライゲーション末端を有する５つのピースの標準を示す。図３３のｂ）は、各部位でのライゲーションについての配列の図を示す。 図３４のａ）は、一実施形態における、４つのピースの遺伝学的スイッチを示す。図３４のｂ）は、重複プライマーを用いて、４つの直鎖のピースを形成するために、クローン後のＰＣＲ産物（「ｐｏｓ」）に対する、迅速な組み立て産物（「ＲＡＰ」）の比較を示す。図３４のｃ）は、「オン」または「オフ」の状態の遺伝学的スイッチのためのクローン後のＰＣＲ産物対ＲＡＰ産物の機能的なアッセイを示す。２ｎＭのレポーターおよび１ｎＭのリプレッサーが試験され、「＋ＩＰＴＧ」は０．５ｍＭのＩＰＴＧ、０μＭのａＴｃの状態を示し、「－ＩＰＴＧ」は０ｍＭのＩＰＴＧ、１０μＭのａＴｃの状態を示す。直鎖ＤＮＡは、ｇａｍＳおよび３１ｂｐの立体保護で保護される。エラーバーは、３つの独立した実験からの１標準偏差を示す。 図３５は、一実施形態における、テンプレートの濃度および重複プライマーの機能としての迅速な組み立て産物の純度を示す。標準的な５ピースの組み立てのために、迅速な組み立て産物（「ＲＡＰ」）は、５０μＬのＰＣＲ反応における１μＬ、２μＬ、または５μＬのいずれかを増幅した。また、クローン後のＰＣＲ産物(「ｐｏｓ」)が産生される。非重複プライマーは結合部位を指し、結合部位は、ベクターとプロモーターおよびベクターとターミネーター間の組み立て接合部と交差せず、重複プライマーがこの接合部と交差する。白い実線の矢印はテンプレートＤＮＡ、グレーの矢印は重複プライマーにより除去される非特異的な産物、点線の白い矢印は、重複プライマーにより保持される非特異的な産物である。赤い矢印は、サイズから、セルフライゲーションしたベクターであることが推定される。 図３６Ａ～Ｄは、一実施形態における、非干渉性フィードフォワードループにおけるパルスを生成するプロセスを示す。図３６Ａは、パルスが生成され始め、上のノードが、中間のノードおよび下のノード（下のノードはレポーターである）を活性化するためのタンパクを発現している。 図３６Ｂでは、下のノードは完全に発現し、時間の経過によりシグナルに反映される。同時に、中間のノードもまた発現を開始するが、中間のノードの産物（この場合ＴｅｔＲ）はフリーａＴｃに結合される。 図３６Ｃでは、フリーａＴｃが低下し、中間のノードの産物が、下のノードプロモーターを抑制するために、下のノードに作用し始める。 図３６Ｄでは、下のノードが完全に抑制され、レポーターの分解（レポーターが－ｓｓｒＡタグされている場合）および／または細胞もしくは無細胞システムの希釈からのシグナルが低下する。 図３７は、プロモーターＰｏｒｉｇおよびＰ１‐Ｐ４（配列番号３３～３７ ）についての配列表を示す。 図３８のＡは、ｌａｓＲタンパクが除かれている非干渉性フィードフォワードループのオープンループを示す。図３８のＢは、ｌａｓＲあり（ダークグレイ）およびなし（白）である場合の各プロモーター変異体（Ｐ＿ｏｒｉおよびＰ１‐Ｐ４）について検出されたｄｅＧＦＰシグナルを示す。 図３９のＡは、野生型と比較される、ｔｅｔＯオペレーター部位、変異体１、および変異体２の２つの配置の合理的な設計を示す（配列番号３８～４０）。図３９Ｂは、抑制を試験するために使用される回路の概略図を示し、ａＴｃがＴｅｔＲ産生構成物の存在で変化する。図３９のＣは、野生型およびａＴｃを変化させた２つの変異体について、ｔ＝300分で検出されたエンドポイント蛍光を示す。図３９のＤは、Ｘ軸の時間と、野生型プロモーター対２つの操作されたプロモーターの産生率（Ｙ軸）を示す一次導関数を示す。 図４０Ａは、プラスミド２１２の配列表（配列番号４１）を示す。 図４０Ｂは、プラスミド２１３の配列表（配列番号４２）を示す。 図４１は、図４３および図４４に示される結果を有する、インビトロでの各感受性分析試験について使用される成分およびそれらの濃度を示す。 図４２は、プラスミド２２０の配列表（配列番号４３）を示す。 図４３は、図４１での実験セットアップに対応する各プロットを有する、非干渉性フィードフォワードループのインビトロでおよびインシリコ感受性分析の結果を示す。図４３のＡでは、Ｉ－ＦＦＬについて、５つの各パラメータが個々に変更され、一方、他のパラメータは、１ｕＭの３ＯＣ１２ＨＳＬ、１０ｕＭのａＴｃ、１ｎＭのｐＬａｃ－ｌａｓＲ、０．１ｎＭのｐＬａｓ－ＴｅｔＲ、および１ｎＭｐＬａｓ－ｔｅｔＯ－ｄｅＧＦＰで一定に維持される。全ての反応は、残りのＬａｃＩを除くために１ｍＭのＩＰＴＧを含み、新たなＤＮＡ源を用いて３重で行う。図４３のＢでは、ｐＬａｓ－ｔｅｔＯ－ｄｅＧＦＰプラスミドが変更され、ｔ＝３００分でアウトプットｄｅＧＦＰが測定される。実験データはブラックおよびブルーである。インレットは時系列のデータを示す。図４３のＣでは、３ＯＣ１２を変化させ、アウトプットｄｅＧＦＰをｔ＝３００分で測定した。図４３のＤでは、ｐＬａｃ－ｌａｓＲプラスミドを変化させ、アウトプットｄｅＧＦＰをｔ＝３００分で測定した。図４３のＥでは、ａＴｃを変化させ、抑制までの時間を示す。抑制までの時間は、産生率が最大半量に到達する時間として測定される。図４３のＦでは、ｐＬａｓ－ＴｅｔＲプラスミドを変化させる。ＴｅｔＲの直接的な効果を調査するために、本実験に対してａＴｃは添加しなかった。 図４４は、図４３から得られるインビトロの結果の上に、生体分子ブレッドボード（点線）のインシリコ部分から得られるモデリングデータ重ねたものを示す。 図４５は、最初に特徴づける部分により回路の挙動を予測するためのインシリコモデリングの実行を示すフロー図を提供する。 図４６は、一実施形態における、インシリコモデリングのために使用されるツールボックスのインプットおよびアウトプットのセットを提供する。 図４７は、一実施形態における、インシリコツールボックスにおけるＧＦＰレポーター部分およびＴｅｔＲ－ｐＴｅｔ－ａＴｃからの回路を構築ために使用されるコマンドのセットを提供する。 図４８は、インシリコモデリングツールボックスにおけるｔｘｔｌプロットコマンドのアウトプットを示す。図４８のＡは、シミュレーションにおける時間の関数として、タンパク濃度についての曲線を提供する。図４８のＢは、時間の関数として、シミュレーションでのＲＮＡ（Ｙ軸）の濃度をプロットする。図４８Ｃは、それらの最初（最大）の値に対して正規化された、ＡＧＴＰ（ＡＴＰとＧＴＰの濃度の合計）、ＣＵＴＰ（ＣＴＰとＵＴＰの濃度の合計）、アミノ酸、リボソーム、およびＲＮＡＰの量をプロットする。 図４９は、インシリコモデリングツールボックスにおけるユーザレベル機能間の情報の流れを図示するフロー図を提供し、ユーザが見ることができる機能間の依存性を示す。 図５０は、インシリコモデルに適合させるためのインビトロでのデータを提供するために行われる特徴づけの実験を提供する。実験１は、ｐＴｅｔ－ＧＦＰの量を変化させて（４ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．１２５ｎＭ、０ｎＭ）、ｐＴｅｔプロモーターの制御下でのＧＦＰの恒常的な発現である。実験２は、ｐＬａｃ－ＧＦＰのＤＮＡを変化させ（２ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、０．２５ｎＭ、０．１２５ｎＭ、０．０６２５ｎＭ、０ｎＭ）、ｐＬａｃプロモーターの制御下でのＧＦＰの恒常的な発現である。実験３は、ｐＬａｃ－ＴｅｔＲ遺伝子の量を変化させることにより（２ｎＭ、０．２ｎＭ、０．０２ｎＭ、０．００２ｎＭ、０．０００２ｎＭ、０．００００２ｎＭ、０ｎＭ）、産生されるＴｅｔＲの量を変化させることによるｐＴｅｔ－ＧＦＰ遺伝子（１ｎＭで）の発現の抑制である。実験４は、システムに対して、変化させた量のａＴｃを添加することによる（１０ｕＭ、１ｕＭ、０．１ｕＭ、０．０１ｕＭ、０．００１ｕＭ、０．０００１ｕＭ、０．００００１ｕＭ）、抑制されたｐＴｅｔ－ＧＦＰ遺伝子の導入（deprepression：抑制解除）である。ここで、ｐＬａｃ－ＴｅｔＲのＤＮＡは０．１ｎＭであり、ｐＴｅｔ－ＧＦＰのＤＮＡは１ｎＭである。実験５は、活性化したｐＬａｓ－ＧＦＰ発現の導入である。ｐＬａｃ－ｌａｓＲおよびｐＬａｓ－ＧＦＰのＤＮＡは１ｎＭであり、インデューサー３ＯＣ１２ＨＳＬを変化させる（１０ｕＭ、１ｕＭ、０．１ｕＭ、０．０１ｕＭ、０．００１ｕＭ、０．０００１ｕＭ、０．００００１ｕＭ）。 図５０に示される各実験についての種および生化学反応の生成についてのコンピュータを用いるツールボックスコードを提供する。また、各実験からのデータから予測されるパラメータのリストを提供する。パラメータ予測の手順は、図５２および５３に詳細が記載される。図５１Ａは実験１に対応し、ｐＴｅｔ恒常的な発現強度はｐＴｅｔプロモーター下でＧＦＰ発現を測定することにより観察される。ｐＴｅｔプロモーター（ＴＸＴＬ＿ＰＴＥＴ＿ＲＮＡＰｂｏｕｎｄ＿Ｆ ａｎｄ ＴＸＴＬ＿ＰＴＥＴ＿ＲＮＡＰｂｏｕｎｄ＿Ｒ）を含むＤＮＡに、（シグマ７０ファクターボンド）ＲＮＡポリメラーゼの結合と関連するパラメータが予測される。特徴づけ工程の残りについて固定するいくつかのコアパラメータもまた決定される。 図５０に示される各実験についての種および生化学反応の生成についてのコンピュータを用いるツールボックスコードを提供する。また、各実験からのデータから予測されるパラメータのリストを提供する。図５１Ｂは、実験２と関連するコード、反応、種を示し、ｐＬａｃの制御下でＧＦＰの恒常的な発現である。予測されるパラメータは、実験１がそのまま固定されたことに起因する特徴づけにおいて決定されるコアパラメータによる、ｐＬａｃのＤＮＡに結合するシグマ７０ボンドＲＮＡポリメラーゼについてのフォワードおよびリバース反応である。 図５０に示される各実験についての種および生化学反応の生成についてのコンピュータを用いるツールボックスコードを提供する。また、各実験からのデータから予測されるパラメータのリストを提供する。図５１Ｃは、ｐＴｅｔ－ＴｅｔＲ－ａＴｃ抑制－導入システムについて作成されたモデルを示す。予測されるパラメータは、ＴｅｔＲ二量体化のフォワードおよびバックワード率、ＴｅｔＲ抑制強度を特徴づけるｐＴｅｔ隔離（ＴｅｔＲ二量体による）結合および非結合割合（実験３）、ａＴｃ－ＴｅｔＲ二量体の結合非結合割合（実験４）であった。また、本図面は、これまでの２つの実験／特徴づけ（図５１Ａおよび５１Ｂ）由来である本シミュレーションについて固定されたパラメータの値を示す。 図５０に示される各実験についての種および生化学反応の生成についてのコンピュータを用いるツールボックスコードを提供する。また、各実験からのデータから予測されるパラメータのリストを提供する。図５１Ｄは、ｐＬａｓ－ｌａｓＲ－３ＯＣ１２ＨＳＬ活性化システムについて作成されたモデルを示し、実験５からのデータと合わせて使用される。ここで、非活性化（ＴＸＴＬ＿ＰＬＡＳ＿ＲＮＡＰｂｏｕｎｄ＿Ｆ／Ｒ）および活性化（ＴＸＴＬ＿ＰＬＡＳ＿ＴＦＲＮＡＰｂｏｕｎｄ＿Ｆ／Ｒ）プロモーター部分に結合する（シグマ７０ボンド）ＲＮＡポリメラーゼ、プロモーター部位（ＴＸＴＬ＿ＰＬＡＳ＿ＴＦＢＩＮＤ＿Ｆ／Ｒ）に結合する転写因子、アクチベータータンパクに結合するインデューサー（ＴＸＴＬ＿ＩＮＤＵＣＥＲ＿ＬＵＸＲ＿ＡＨＬ＿Ｆ／Ｒ）についてのパラメータが、実験５からのデータに対するモデル挙動を適合させることにより決定される。 図５２は、一実施形態における、パラメータ予測手順の全体を示すフローチャートを提供する。 図５３は、一実施形態における、パーツの特徴付け手順を示すフローチャートである。 図５４は、図５１Ａ～Ｄにおけるモデルに対し、図５０における実験１～５からの実験データを適合させるためのパラメータを予測することによるパーツの特徴づけの手順の結果を示す。各図のＹ軸はその実験についてのＧＦＰのエンドポイント濃度であり、一方Ｘ軸は変化させた種の濃度である。プロットには３つのラインがあり、実験データからの平均および標準偏差が、エラーバーとともに明るい実線で示される。点線は、図５２に記載されるパラメータ予測の前処理のステージ後のシミュレーション結果である。暗い実線は、図５２に記載される完全なパラメータ予測の結果である。左上：実験１によりｐＴｅｔ－ＧＦＰのＤＮＡを変化させている。右上：実験２によりｐＬａｃ－ＧＦＰＤＮＡを変化させている。中央の左：実験３によりＴｅｔＲのＤＮＡを変化させている。中央の右：実験４によりａＴｃを変化させている。下：実験５により３ＯＣ１２ＨＳＬを変化させている。 図５５は、パーツが特徴づけられた後に、コンピュータを用いて完全なIFFLを生成するために使用されるツールボックスを提供し、予測されたパラメータ値は、パーツのコンフィグレーションファイルをアップデートするために使用されている。 図５６のＡおよびＢは、蛍光タグ－ｓｓｒＡｄｅＧＦＰ（図５６のＡ）および非－ｓｓｒＡタグｄｅＧＦＰ（図５６のＢ）についての、時間の経過によるｄｅＧＦＰ分解をプロットする。 図５７は、もともとは［５］由来であり、酵素ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、およびｖｉｏＥを用いてヴィオラセイン（violacein）へとトリプトファンを代謝するための代謝経路を示す。文字「Ｘ」は未知の中間体を表す。 図５８は、もとは［５］に示される研究由来であり、ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、およびｖｉｏＥを発現するための直鎖ＤＮＡのピースを作り上げることが可能な成分を説明する。Ｊ２３１５１は恒常的なプロモーターであり、ＢＣＤ５はＲＢＳであり、Ｔ１４は［６］由来のターミネーターである。 図５９は、［５］由来であり、経路で所定の遺伝子を排除して得られる、異なる色の代謝生成物を説明する。具体的には、完全な経路な暗い紫色の反応物を作成し、一方、ＶｉｏＥ、ＶｉｏＣ、およびＶｉｏＤの排除は無色の反応物を作成し、ＶｉｏＣおよびＶｉｏＤの排除はピンクの反応物を作成し、ＶｉｏＣの排除はオレンジ色の反応物を作成し、ＶｉｏＤの排除は明るい紫色の反応を作成する。 図６０は、［５］由来であり、完全な経路（左）対ＴＸ－ＴＬ欠如ＶｉｏＣ（右）を用いたＴＸ－ＴＬの結果のナノドロップ２０００での読み取りを説明する。これは異なる波長での測定吸光度であり、垂直な線は、ヴィオラセイン（左）およびデオキシビオラセイン（右）についての公表されたピークを示す。 図６１は、［５］由来であり、完全な経路を含むＴＸ－ＴＬでのＬＣ－ＭＳによる、ヴィオラセイン（図６１のａ））、デオキシビオラセイン（図６１のｂ））、プロデオキシビオラセイン（図６１のｃ））の検出を説明する。 図６２は、［５］由来であり、ヴィオラセイン検出量に対して正規化された、図６１におけるヴィオラセイン、デオキシビオラセイン、およびプロデオキシビオラセインのピーク検出を説明する。 図６３は、［５］由来であり、後に示されるスタンダード（第１カラム）完全な経路（第２カラムおよび第３カラム）またはｖｉｏＢのみ反応（第４カラム）のいずれかからのｖｉｏＡ、ｖｉｏＥ、およびｖｉｏＢの図６３のａ）におけるウェスタンブロットを説明する。ウェスタンブロットにおける各タンパクの定量は、図６３のｂ）に示され、各カラムにおける左手のバー（ダークグレイ）はモデル予測量であり、各カラムにおける右手のバー（ライトグレイ）はウェスタンブロット定量である。 図６４は、［５］由来であり、標準コントロールのヴィオラセイン、６．５ｎＭで含まれるｖｉｏＣおよびｖｉｏＤを除いて４ｎＭで全ての成分を有するＴＸ－ＴＬ反応物、４ｎＭでの全ての成分を有するＴＸ－ＴＬ反応物の薄層クロマトグラフィーを説明する。 図６５は、［５］由来であり、ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、およびｖｉｏＥについてコードする異なる量の直鎖ＤＮＡで異なる反応物の５７２ｎｍの吸光度により測定される天然のままのヴィオラセインの産生物を説明する。 図６６は、［５］由来であり、ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ、およびｖｉｏＥをコードする直鎖ＤＮＡの異なる量での異なる反応のＬＣ‐ＭＳにより測定されるヴィオラセイン、デオキシビオラセイン、およびプロデオキシビオラセインの産生を説明する。「Ｍ」、「ＳＴＤ」、「ＣＨＤＨ」、「ＥＬ」、「ＢＨＣＨＤＨＥＬ」、および「ＢＨＣＨＥＬ」のそれぞれについての棒グラフ（上）では、左の棒はヴィオラセインを測定しており、中央のバーはデオキシビオラセインを測定しており、右側のバーはプロデオキシビオラセインを測定している。
本明細書で提供されるのは、いくつかの実施形態において、目標環境で動作する生物学的遺伝子回路およびこれにより構成される無細胞の生体分子ブレッドボードを設計、構築、実行、デバッグ、および／または試験するために使用される方法およびアレンジメントである。
本明細書で使用される用語「生体分子ブレッドボード」は、制御されたセッティングにおいて遺伝子回路の１以上の特徴の試験を可能にするように構成されたシステムを指す。「無細胞の生体分子ブレッドボード」は、無細胞システムにおける遺伝子回路の１以上の遺伝子回路の特徴の試験を可能にするように構成された生体分子ブレッドボードである。
本開示における無細胞の生体分子ブレッドボードは、典型的には、試験により遺伝子回路を設計、構築、デバッグ、および特徴づけるために使用され得るプロトコル、アレンジメント、反応混合物、インシリコ・システム、インビトロ・システム、および／またはインビボシステムの組み合わせを含む。
参照が図面に対してなされる。図１は、遺伝子回路の実験、モデリング、最適化および設計間の迅速な繰り返しを可能にするアレンジメントおよび環境の組み合わせを使用する、インビトロでの試験環境で行われる一連の工程により、無細胞ブレッドボードプロセスの基本的な要素の概略図を提供する。具体的には、図１のパネルＡは、細胞および他の生体分子シャーシに形質転換されおよび実行される生体回路を示し、最上の回路のエレメントは、レポートする１，４ブタンジオールを産生するための代謝経路の分子成分であり、２つのケミカルインプット（部分的に隠れている）で論理演算を行う遺伝学的成分のセットである。図１のパネルＢは、回路および経路の分析およびシミュレーションを行なう詳細なモデリングツールボックスとともにまたは単体で、関連する１，４ブタンジオール産生経路の反応を行うおよび／または遺伝子回路を実行するＴＸ－ＴＬ抽出システムを示す。図１のパネルＣ～Ｄは、図１のパネルＢのＴＸ－ＴＬ抽出に加えて使用される連続的なフロー反応器（EPFLとともに開発された）および市販の液滴に基づくミクロ流体システムを説明する。遺伝子回路は大腸菌に形質転換される（図１Ｅ）。
本開示に従う無細胞の生体分子ブレッドボードでは、ブレッドボード成分は、目標環境で動作する遺伝子回路の無細胞システムで試験することが可能なように構成される。
本明細書で使用される、用語「遺伝学的回路」、「生物学的回路」、または「回路」は、回路設計にしたがって、生化学的反応により１つから別の１つへと接続された分子成分の収集物を示す（本明細書ではノードと記載する）。具体的には、遺伝子回路において、分子成分の収集物は、１以上のインプットに反応して特定のアウトプットを提供することができるように、生化学的反応により１つから別の１つへと接続される。
本明細書で遺伝子回路と関連して使用される用語「分子成分」または「ノード」は、細胞環境に含まれる化学物質を示す。したがって、例示的な分子成分は、細胞環境で見出される、リボ核酸またはデオキシリボ核酸のようなポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリサッカライド、脂質、アミノ酸、ペプチド、糖、および／または他の小分子もしくは大分子および／またはポリマーを含む。
本開示における遺伝子回路では、遺伝子回路のパーツを形成する分子成分は、遺伝学的分子成分または細胞分子成分としてもよい。
本明細書で使用される、用語「遺伝学的分子成分」は、遺伝子、遺伝子から転写されるＲＮＡもしくはその一部、および、任意で、転写されたＲＮＡから翻訳されるタンパクから形成される分子ユニットを示す。本明細書に記載される遺伝子回路では、遺伝学的分子成分を回路の別の分子成分に接続する生化学的反応は、分子成分を形成する、遺伝子、転写ＲＮＡおよび／またはポリペプチドのいずれか１つを含むこととしてもよい。
遺伝学的分子成分に含まれる遺伝子は、ＲＮＡを提供するために転写されるポリヌクレオチドであり、典型的には、コード領域、並びに、インビトロでまたはインビボでのいずれかで、有機体内の遺伝子の転写または翻訳の増加または翻訳を可能にする核酸分子のセグメントである１以上の調節配列領域を含む。具体的には、本明細書で記載される遺伝子のコード領域は、転写および翻訳されたときにポリペプチドを、ＲＮＡが最終産物である場合（例えば、ＹＵＮＲモチーフ［７］を翻訳的に活性化するＲＮＡを活性化するためにポリヌクレオチドがコードする場合）には、翻訳されないことを意味する機能的なＲＮＡ配列のみを産生する１以上のタンパクコード領域を含むこととしてもよい。本明細書に記載される遺伝子の調節領域は、プロモーター、転写因子結合部位、オペレーター、アクチベーター結合部位、リプレッサー結合部位、エンハンサー、タンパク－タンパク結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、サイレンサー、インスレーター、および当業者により認識される発生および／または外部の刺激に反応して遺伝子発現を変化させる、追加の調節領域を含む。
ＲＮＡの遺伝学的分子成分は、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）のような遺伝子から転写されるあらゆるＲＮＡ、細胞で調節因子として作用することが可能なリボ核酸、および短干渉リボ核酸を含む。遺伝学的分子成分に含まれるｍＲＮＡは、タンパク並びに調節領域、例えばリボソーム結合部位ドメイン（「ＲＢＳ」）をコードする領域を含み、それは、翻訳の開始のためのメッセージを正確に位置するように細胞のリボソームマシナリーが結合する、ｍＲＮＡ分子の上流の（５’）部分のセグメントである。ＲＢＳはｍＲＮＡの翻訳が開始される精度および効率を制御する。ｍＲＮＡは、コードされる追加の制御エレメント、例えば、リボレギュレーター配列またはヘアピンを形成する他の配列を有することとしてもよく、これにより、シャイン・ダルガノ配列へのアクセスを得るために、ＲＮＡを活性化するような、外部ソースを必要とするシャイン・ダルガノ配列へのリボソームのアクセスをブロックする。遺伝学的分子成分を含むことができる調節の役割をもたらす他のＲＮＡは、リボスイッチ、アプタマー（例えば、マラカイトグリーン、スピナッチ（Ｓｐｉｎａｃｈ））、アプタザイム（ａｐｔａｚｙｍｅ）、ガイドＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、および当業者に知られる［８］にレビューされる他のＲＮＡを含む。
分子成分に含まれるタンパクは、機能を活性化する、阻害する、結合する、変換する、またはレポートするタンパクであることとしてもよい。機能を活性化しまたは阻害するタンパクは、典型的には、ＤＮＡ上でコードされるオペレーター部位に作用するが、他の分子成分にも作用することとしてもよい。結合機能を有するタンパクは、典型的には他のタンパクに作用するが、他の分子成分にも作用することとしてもよい。変換機能を有するタンパクは、典型的には小分子に作用し、化学的または酵素的反応を行うことにより、１つの小分子から別の小分子へと変換する。変換機能を有するタンパクは、また、他の分子成分に作用することとしてもよい。レポート機能を有するタンパクは、通常使用される検出方法（例えば、吸光度、蛍光）により容易に検出可能な性能を有し、またはそうでなければ、第２のアッセイ（例えば、その後アッセイされる代謝物のレベルの調整）による容易な検出を生じさせる別の分子成分での反応を生じさせる。タンパクの機能を活性化する、阻害する、結合する、変換する、またはレポートすることは、典型的には、回路の遺伝学的成分間の相互作用を形成する。遺伝学的分子成分に含まれる例示的なタンパクは、単量体のタンパクおよび多量体のタンパク、三次構造または四次構造を有するタンパク、リンカーを有するタンパク、非天然アミノ酸を有するタンパク、異なる結合ドメインを有するタンパク、および当業者に知られる他のタンパクを含む。具体的に例示的なタンパクは、ＴｅｔＲ、ＬａｃＩ、ＬａｍｂｄａＣＩ、ＰｈｌＦ、ＳｒｐＲ、ＱａｃＩ、ＢｅｔＲ、ＬｍｒＡ、ＡｍｅＲ、ＬｉｔＲ、ｍｅｔ、ＡｒａＣ、ＬａｓＲ、ＬｕｘＲ、ＩｐｇＣ、ＭｘｉＥ、Ｇａｌ４、ＧＣＮ４、ＧＲ、ＳＰ１、ＣＲＥＢ、および当業者に知られる他のものを含む。
用語「細胞分子成分」は、遺伝子によりコードされない分子成分を示し、または遺伝子により転写および／または翻訳されるものの、対応する遺伝子なしに回路に含まれる分子成分を示す。例示的な細胞成分は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ポリサッカライド、小分子、および細胞環境に存在し、当業者により同一視することのできる追加の化学物質を含む。ポリサッカライド、小分子、および追加の化学物質は、例えば、ＮＡＤ、ＦＡＤ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ビタミンＢ１、Ｂ１２、クエン酸、グルコース、ピルビン酸、３－ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、アミノ酸ｓ、ＰＥＧ－８０００、ＦｉＣｏｌｌ４００、スペルミジン、ＤＴＴ、ｂ－メルカプトエタノール、マルトース、マルトデキストリン、フルクトース、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、酢酸、ａＴｃ、ＩＰＴＧ、３ＯＣ１２ＨＳＬ、３ＯＣ６ＨＳＬ、バニリン、マラカイトグリーン、スピナッチ、コハク酸、トリプトファンを含む。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ調節因子（小活性化ＲＮＡ、小干渉ＲＮＡ）または、ＤＮＡ結合酵素（例えば、エキソヌクレアーゼ）を飽和させる、または、システム（例えば、［９］で説明される）に存在するアクチベーターもしくはリプレッサー酵素を捕捉するためのオペレーター部位を含む、「ジャンク」デコイＤＮＡを含む。ポリペプチドは、回路における遺伝学的成分（例えば、図２２のＤのＬａｃＩまたはＴｅｔＲ）により産生されないが、遺伝子回路に存在するもの、または、図３０および実施例４３のｇａｍＳ、または図５６のｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡのような回路の分子成分に影響を及ぼすために添加するものを含むこととしてもよい。
本明細書に記載される遺伝子回路のいくつかの実施形態では、１以上の分子成分は、（分子クローニング）のような遺伝子組み換えおよび／または化学合成により複数のソースから分子または関連する部分を合体させ、単一のソースでは見出されない分子成分を作成することにより提供される、組み換え分子成分である。
本明細書に記載される無細胞分子ブレッドボードの実施形態では、遺伝子回路は、少なくとも１つの遺伝学的分子成分、または回路設計にしたがって１つから別の１つに接続される、少なくとも２つの遺伝学的分子成分、および可能であれば、相互に作用する成分の完全接続ネットワークを形成するために、反応を活性化し、阻害し、結合し、または変換することにより、１以上の細胞分子成分を含む。
本明細書で使用される、遺伝子回路の分子成分に関連する、用語「活性化する」は、細胞環境における分子成分の存在の増加をもたらす分子成分をともなう反応を指す。例えば、遺伝学的分子成分の活性化は、遺伝子、ＲＮＡ、および／またはタンパクの遺伝学的分子成分（例えば、分子成分の遺伝子の発現の増加および／またはＲＮＡの翻訳の増加による）の存在の増加をもたらす遺伝子、ＲＮＡおよび／またはタンパクの遺伝学的分子成分をともなう１以上の反応を示す。細胞分子成分の活性化は、細胞環境における細胞分子成分（例えば、ポリサッカライドまたは代謝産物）の産生の増加をもたらす１以上の反応を示す。アクチベーターは、また、［１０］で説明されるｍｘｉＥおよびｉｐｃＧのように、活性化するために複合体へと結合すべきであるタンパクの組み合わせにより形成されるものを含むこととしてもよい。
回路の別の分子成分により遺伝子回路の分子成分の活性化が、分子成分の直接的または間接的な反応により行われることとしてもよい。遺伝学的分子成分の直接的な活性化の例は、回路において、代替的なシグマ因子プロモーター（回路の他の分子成分）により制御される遺伝子の発現を駆動する代替的なシグマ因子（回路の分子成分）の産生、またはリボレギュレーター制御ＲＮＡ（回路の分子成分）の発現を増加させる小リボ核酸（回路の分子成分）の産生を含む。この具体的な例は、［１１］に説明されるシグマ２８またはシグマ５４の活性を含む。遺伝学的分子成分間接的な活性化の例は、図１２に示されるように、活性化タンパク（例えば、ｌａｓＲ）（回路の分子成分）の産生を含み、小分子（例えば、３ＯＣ１２ＨＳＬ）と並列にする場合に（可能であれば、回路の追加の分子成分）、実施例３７および３８におけるように、２つのカスケードの抑制が事実上活性化を生じるように、標的遺伝子の発現を増加させる中簡体タンパクを調節するタンパクの産生、または遺伝子の発現の増加を生じさせる。
本明細書で使用される、遺伝子回路の分子成分に関連する、用語「阻害する」は、遺伝子回路の分子成分をともない、細胞環境の分子成分の存在の低下をもたらすことを指す。例えば、遺伝学的分子成分の阻害は、（例えば、分子成分の遺伝子の発現の減少、および／またはＲＮＡの翻訳の低下による）遺伝子、ＲＮＡおよび／またはタンパクの存在の低下をもたらす、遺伝学的分子成分の遺伝子、ＲＮＡおよび／またはタンパクをともなう１以上の反応を示す。細胞分子成分の阻害は、細胞環境における細胞分子成分（たとえば、ポリサッカライドまたは代謝産物）の産生の減少、または変換、隔離、または分解の増加をもたらす１以上の反応を示す。細胞分子成分の阻害の例は、図５２に示されるように、ＶｉｏＡによるトリプトファンのような酵素を介する代謝産物の変換を含み、遺伝学的成分ＶｉｏＡは、トリプトファンをＩＰＡに変換し、したがってトリプトファンの存在を減少させる。
阻害は、遺伝子回路の分子成分を回路の別の分子成分と直接的に反応させることにより、または遺伝子回路の分子成分と回路の別の分子成分との反応産物の非直接的な反応により、遺伝子回路で行うことができる。遺伝子回路の遺伝学的分子成分の直接的な阻害の例は、実施例１６にて説明されるＴｅｔＲプロモーターにより制御される遺伝子により制御される、遺伝子の発現を低減するタンパク（例えば、ＴｅｔＲ）を抑制する反応を含む。
他の例は、図２３Ａまたは実施例３８における、ＣＩ、ＣＩ ＯＲ２＊、ＴｅｔＲ、ＬａｃＩ、ＢｅｔＩ、ＰｈｌＦ、ＳｒｐＲ、ＱａｃＲの抑制を含む。遺伝学的分子成分の非直接的な阻害の例は、代替的なシグマ因子（例えば、シグマ２８）の反応を含み、リソースの競合または捕捉により、主要なシグマ因子（例えば、シグマ７０）により制御された遺伝子の産生を低減する。
遺伝子回路の分子成分に関連する、本明細書で使用される、用語「結合する」は、２以上の分子成分を維持するための結合、リンク、力、結び目により、回路の２以上の分子成分を接続しまたは合体させることを指し、直接的または間接的な結合を包含し、例えば、第１の分子成分は第２の分子成分と直接的に結合し、または１以上の中間分子が第１の分子成分と第２の分子成分、回路の別の分子成分との間に配置される。例示的な結合は、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス相互作用、および当業者により同一視することのできる他の結合を含む。いくつかの実施形態では、タンパクのスキャホールド結合エレメントに直接結合するポリペプチドスキャホールドの産生のように、結合が直接であることとしてもよい。他の実施形態では、１つのスキャホールド上の多数のタンパクエレメントの共存のように、結合が間接的であることとしてもよい。いくつかの例において、分子成分と別の分子成分との結合は、分子成分を捕捉することをもたらし、したがって、分子成分の一種の阻害を提供する。いくつかの例において、分子成分と別の分子成分との結合は、タンパク間のアロステリックな相互作用の場合のように、分子成分の機能の活性を変化させ、これにより、一種の結合成分の活性化または阻害を提供する。
遺伝子回路の分子成分に関連する、本明細書で使用される、用語「変換する」は、分子成分を別の分子成分に直接的または間接的に変換することを指す。この一例は、タンパクＡにより化学物質Ｘの化学物質Ｙへの変換であり、その後さらにタンパクＢにより化学物質Ｚへと変換される。このことは、実施例５２および図５７に示されるように、第３の分子成分を変換し得るｖｉｏＢとともに、ｖｉｏＡ（遺伝学的成分）を有するトリプトファンのＩＰＡ（分子成分）への変換により例示される。
遺伝子回路の実施形態では、分子成分は、分子成分がインプットされ別の分子成分がアウトプットされる回路設計にしたがって、１つからもう１つへと接続される。具体的には、遺伝子回路は、典型的には、別の分子成分を活性化する、阻害する、結合する、および／もしくは変換する１以上のインプットまたはスタート分子、別の分子成分により活性化される、阻害される、結合されるおよび／もしくは変換される１以上のアウトプットまたはエンド分子成分、および別の分子成分をそれぞれ阻害する、結合する、および／もしくは変換する、並びに別の分子成分により活性化される、阻害される、結合されるおよび／もしくは変換される中間の分子成分を有する。
本明細書に記載される実施形態では、分子成分は、典型的には、モチーフと呼ばれる成分間の相互作用の定義されたパターンで、回路設計にしたがって接続される。モチーフは典型的には、インプットおよびアウトプットを有し、組み換え遺伝学的成分よりも１つレベルの高い情報処理機能を実行する。
回路設計にしたがって遺伝子回路における収集分子成分を接続するために使用される例示的なモチーフは、実施例６～８および実施例１０～１１に示されるフィードフォワードループ（アウトプットはパルスである）［１２］、実施例３３～４０［３］に示されるオシレータ（アウトプットはオシレータアウトプットである）［３］、抑制カスケード（アウトプットは［１３］回路の分子成分の発現の抑制である）、実施例４７および図３および図３４に示されるスイッチ（アウトプットは、１つのインプットへの反応に対する回路の１るの分子成分、または、別のインプットへの反応における回路の別の分子成分である［１４］）、またはカスケード（回路はアウトプットシグナルに対してインプットシグナルを送る）［１１］、および本開示を読んだ当業者により同一視される他の回路設計を含む。
モチーフは、分子成分間の相互作用のパターンが維持される遺伝子回路のクラスを識別できるが、特定の遺伝学的および分子エレメントを変化させることとしてもよい。例えば、図２２Ａに示され、実施例３７により詳細が記載される、別のタンパクの発現を相互に抑制する３つのエレメントオシレータは、モチーフを定義し、異なる特定のタンパクが、相互の抑制のパターンが維持される限り、３つの遺伝的コード成分のいずれかを実行するために使用されることとしてもよい。同様に、図４および図５Ａに記載され、実施例６～８および実施例１０～１１に例示される干渉性フィードフォワードループのモチーフが、早く活性化する軸とよりゆっくり抑制する軸のパターンが維持される限り、異なるリプレッサーおよびアクチベーターピースで実行されることとしてもよい。
本明細書に記載される遺伝子回路では、分子成分は、遺伝子回路内で１以上のモチーフにおいて接続されることとしてもよい。例えば、３－エレメントまたは５－エレメント抑制回路では、組み換え遺伝学的成分のペア（例えば、ｐＬａｃ－ＴｅｔＲ、ｐＴｅｔ－ｌａｍｂｄａＣＩ）由来の転写抑制のモチーフが、実施例３８および図２６Ａ～Ｃに例示されるように、最終的な遺伝子回路をともに形成するためにリンクされることとしてもよい。いくつかの実施形態では、分子成分は、高次の複合体で所望の機能性を達成するために、１以上のモチーフに接続されることとしてもよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子回路は、互いに、相互に抑制する２つのリプレッサーを含む遺伝学的トグルスイッチであることとしてもよい。例えば、図３（ａ）は、互いに相互に抑制する２つのリプレッサーＴｅｔＲおよびＬａｃＩを有する遺伝学的トグルスイッチを示す。回路は、化学的インデューサー、イソプロピル－ｂ－Ｄ－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）およびアンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を用いて「高い」と「低い」状態間で反転することとしてもよい。例えば、ＴｅｔＲを阻害するためにａＴｃがシステムに添加されると、ＬａｃＩが高度に発現し、レポーターはオフになる。逆に、ＬａｃＩを阻害するために、ＩＰＴＧが添加されると、ＴｅｔＲとレポーターが高度に発現する。このことは、実施例４７にさらに例示される。
いくつかの実施形態では、遺伝子回路は、機能（つまり、オシレータアウトプット）を実行するために奇数の複数のリプレッサーを含むリプレッシレーターであることとしてもよい。例えば、図３（ｂ）は、互いに順次抑制する３つのりプレッサーを有するリプレッシレーターを示す。第１のリプレッサータンパク(ＴｅｔＲ)は、タンパク産生物（ｌｃＩ）が第３のリプレッサー遺伝子（ＬａｃＩ）を次に阻害する第２のリプレッサー遺伝子を阻害する。さらに、第３のリプレッサータンパク（ＬａｃＩ）は、第１のリプレッサー遺伝子を阻害し、長いカスケードを有するネガティブフィードバックを完了する。別の実施形態では、リプレッシレーターは、５つのリプレッサー、７つのリプレッサー、２ｎ＋１のリプレッサーを含み、完全体は０より大きい。このことは、実施例の３３～４０にさらに例示される。
いくつかの実施形態では、遺伝子回路は、フィードフォワードループであることとしてもよく、またはフィードフォワードループを含むこととしてもよい。フィードフォワードループ（「ＦＦＬ」）は、２つのインプット組み換え遺伝学的成分（つまり、２つのインプット転写調節因子）および１つのアウトプットレポーティングエレメントで構成される３つの遺伝子モチーフからなるタイプの遺伝子回路である。３つのノードにおける３つの相互作用のそれぞれは、活性化または抑制され得る。合計で８つのタイプのＦＦＬがあり、４つは干渉性であり、残りの４つは非干渉性［１２］である。図４は、フィードフォワードループ（ＦＦＬ）の８つのタイプを示す。転写調節因子Ｘは、転写調節因子Ｙを調節し、両方が共同でＺを調節する。通常の矢印は、２つのノード間の相互作用が活性化していることを示す。Ｔ形状の頭部の矢印は、２つの組み換え遺伝学的成分間の相互作用が抑制されていることを示す。干渉性ＦＦＬでは、転写因子ＸからアウトプットＺまでの直接の経路のサインが、転写因子Ｙによる間接的な経路の全サインと同じである。非干渉性ＦＦＬは、２つの経路につての反対のサインを有する。フィードフォワードループ回路では、ＸおよびＹのインプットは、ロジカルな「アンド」または「オア」のいずれかを用いて組み合わされ、従って、それぞれのケースで異なる動態特性を付与する。干渉性フィードフォワードループは、２つのインプットＸおよびＹ間での論理的な機能に応じて活性化または不活性化のいずれかの遅れの作成を可能にする。アウトプットのロジカルゲートが「アンド」機能である場合、遅れは活性化で現れ、一方、アウトプットゲートが「オア」機能である場合、遅れは不活性化で現れる。
非干渉性フィードフォワードループ（ＩＦＦＬ）では、２つのインプットは２つの異なるロジカルレベルを有し、１つの分子（例えば、分子Ｘ）はアクチベーターであり、一方、他の分子はアウトプットの発現を制御するプロモーターのリプレッサーである。このように、インプットシグナルがオンである場合、分子Ｘの発現は、ＹおよびＺの発現を制御するプロモーターの両方の活性化を開始し、転写を開始し、ＹおよびＺ分子が増加する。それにもかかわらず、Ｙの濃度がその抑制閾値に達すると、抑制を開始し、Ｚ分子の濃度はその安定した状態に減少する。
例示的な非干渉性フィードフォワードループは、図５Ａに示される。ボックスで示されるＡ、Ｂ、およびＣは分子成分であり、それぞれが翻訳または転写ユニットである。例えば、Ａは転写および翻訳を介してタンパクを作成する。ＩＦＦＬは図５Ａに示される。ＡはＢとＣの両方を活性化し、一方ＢはＣを抑制する。ブール論理は、Ａが存在してＢが存在しない場合にＣのみが発現されることを示す。適切な条件下で、図５ＡのＩＦＦＬは、図５Ｂに示されるパルス形状の波形を産生することが予測され、タンパクの希釈および／または分解の存在下で、時間の関数としてタンパクＣの濃度をアウトプットする。タンパクＣは、通常、緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）のようなレポーターであり、その濃度は、蛍光の励起および発光を測定することにより定量することができる。このループのロジックは、転写および翻訳イベントの両方が生じるまでに時間を要し、よってシステムへのコードが遅れるという事実によるものである。具体的には、タンパクＡが産生されると、タンパクＢとＣの両方の産生を活性化する。したがって、まず、タンパクＣの濃度が増加する。しかしながら、タンパクＢの濃度が閾値に達すると、タンパクＣの産生率がその全体的な希釈／分解率を下回り、その濃度が低下して、図５Ｂに示されるパルス形状の曲線を描くように、遺伝子Ｃに対して有意に十分な抑制を働かせる。
図５Ａおよび５Ｂの図示において、パルスを生成することを意味するＩＦＦＬのアウトプットは、レポートエレメントＣの産生由来であり、この場合において、蛍光タンパクである。しかしながら、回路をデバッグするプロセス中に、回路の中間体（例えば、ＡおよびＢ）は、例えば、ウェスタンブロット（実施例５６に示される）、タンパクゲル（実施例５６に示される）、液体／ガスクロマトグラフィー－マススペクトロメトリー（実施例５５に示される）、および当業者により同一視することのできる他の技術のような、代替的な方法により検出されることとしてもよく、または、ＡおよびＢと同じプロモーターを用いてレポートエレメントの追加により検出することとしてもよく（図２８Ｂ～Ｄに示されるように、レポーターエレメントは遺伝子回路におけるものと共通のプロモーターを用いる。）、または、レポート可能なエレメントで、溶融タンパクとなるＡおよびＢのコード配列を変更することにより検出することとしてもよく（［１５］にみられるように）または他の方法で検出されることとしてもよい。
図１１Ａおよび実施例のセクションに示される１つの具体的な遺伝子回路では、ノードＡはｐＬａｃ－ＵＴＲ１－ｌａｓＲプラスミドにより提供され、ノードＢはｐＬａｓ－ＵＴＲ１－ＴｅｔＲプラスミドにより提供され、ノードＣはｐｌａｓｔｅｔＯ－ＵＴＲ１－ｄｅＧＦＰプラスミドにより提供される。
いくつかの遺伝子回路では、遺伝子回路に含まれる１以上のモチーフが、酵素により触媒される化学反応の配列である代謝経路を形成することが可能であり、１つの酵素の産生物が、次のための基質として作用する。いくつかの場合には、遺伝子回路は、回路設計に従って、代謝経路であり、または含む。代謝経路の例は、とりわけ、実施例４９～５９により詳細が記載される、ヴィオラセイン産生経路（チロシンをヴィオラセインに変換する）を含み［１６］、アルテミシン酸（artemicinic acid）、１，４ＢＤＯ産生経路（コハク酸を１，４ＢＤＯに変換する）［１７］、またはアルテミシン酸経路（アセチルＣｏＡをアモルファジエン（amorphadiene）に変換する）［１８］である。代謝経路は、本開示の遺伝子回路に単独で、または本開示を読んだ当業者により理解される他のモチーフと組み合わせて含まれることとしてもよい。
いくつかの実施形態では、遺伝子回路の回路設計は、代謝経路を含み、回路のインプットは、経路の化学的反応の配列により変換されるための基質であることとしてもよく、回路のアウトプットは、経路の化学反応の配列の産生物であることとしてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子回路は代謝経路を含み、代謝経路にともなう化合物は、回路の分子成分であり得、例えば、実施形態において、分子成分は、代謝経路の基質もしくは代謝生成物、および／またはミネラル、ビタミン、並びに機能するために代謝経路の酵素により必要とされる他のコファクターを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子回路は代謝経路を含み、経路の分子成分はポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または他の単一のもしくは複合体分子で構成され、典型的にはインビトロでまたはインビボシステムで存在し得る化学種からなることとしてもよい。ポリペプチドをともなう代謝経路の例は、遺伝子ｖｍｌ１およびｖｌｍ２を用いるアミノ酸からポリペプチドバリノマイシンを作成するバリノマイシン経路を含む［１９］。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子回路の１以上の分子成分は、「転写調節因子」または「転写因子」であり得る。
本明細書で使用される、用語「転写調節因子」または「転写因子」は、プロモーターまたはエンハンサー配列のようなＤＮＡエレメントを調節するときに作用することにより機能し得るあらゆるタイプの因子を指す。転写調節因子は、転写抑制因子（「リプレッサー」ともいう）および転写活性化因子（「アクチベーター」ともいう）に広く分類することができる。転写抑制因子は、遺伝子の転写を抑制するためにＤＮＡエレメントを調節するときに作用し、これにより、遺伝子の発現レベルを低減する。転写活性化因子は、遺伝子の転写を促進するためにＤＮＡエレメントを調節するときに作用し、これにより、遺伝子の発現レベルを増加させる。転写抑制因子および転写活性化因子の両方が、本明細書に記載される遺伝子回路における１以上の成分として使用され得る。
特に、転写調節因子は、エンハンサーまたはプロモーター配列の特定の配列と結合することができる、典型的には少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメインを有する。いくつかの転写因子は、転写開始部位の近くでＤＮＡプロモーター配列と結合し、転写開始複合体を形成することを補助する。他の転写因子は、エンハンサー配列のような他の調節配列に対して結合し、関連する遺伝子の転写を刺激または抑制することとしてもよい。結合部位のエンジニアリングの例は、実施例１６にみられる。
他の調節メカニズムは細胞内に存在し、設計され、構築され、実行され、試験され、またはデバッグされる遺伝子回路の一部となることとしてもよい。追加の調節メカニズムを調節する例は、タンパクに対する共有結合性の変更を含み、共有結合性の変更において、分子変更は、そのコンフォメーションを変化させ、基質または他の生体分子機能の阻害、活性化、隔離、作用に関係するタンパクの活性；分子成分がタンパクに結合して、活性の変化をもたらすそのコンフォメーション（形状）を変更する、タンパクに対するアロステリックな変更；タンパクへと翻訳されるｍＲＮＡの性能に影響を及ぼすｍＲＮＡへの化学的な変更および／またはコンフォメーション（confirmation）；または標準教科書［２０］に記載されおよび／または当業者により理解される他の類似の細胞調節メカニズムに影響を及ぼすタンパクに対して作成される。
具体的な転写抑制因子の例は、ＴｅｔＲ、ＬａｃＩ、ＬａｍｂｄａＣＩ、ＰｈｌＦ、ＳｒｐＲ、ＱａｃＩ、ＢｅｔＲ、ＬｍｒＡ、ＡｍｅＲ、ＬｉｔＲ、ｍｅｔ、および当業者により同一視することのできるもの、並びに、原核生物（prokarayotic）および真核生物（eukarayotic）システムの両方で機能する既知の抑制因子相同体を含む。転写活性化因子の例は、ＡｒａＣ、ＬａｓＲ、ＬｕｘＲ、ＩｐｇＣ、ＭｘｉＥ、Ｇａｌ４、ＧＣＮ４、ＧＲ、ＳＰ１、ＣＲＥＢ等、並びに原核生物および真核生物システムの両方で機能する既知の活性化因子の相同体を含む。
遺伝子の発現に影響を及ぼすおよび遺伝学的成分の遺伝子を調節するために使用される他の因子の例は、ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳシステム、ｓｉＲＮＡ、リボレギュレーター、転写ＲＮＡベースのアクチベーターおよびリプレッサー［８］、および天然のシステムから合成的に得られる他のシステムのようなリボ核酸に基づくものを含む。これらの因子は、転写または翻訳アクチベーターまたはリプレッサーであることとしてもよい。
挙げられている調節メカニズムの例は、ＴｅｔＲのような転写リプレッサー、実施例１～１８におけるｌａｓＲのようなアクチベーター、ｓｒｐＲおよびｐｈｌＦのようなＴｅｔＲの相同体の使用、並びに実施例３３～４０におけるｌａｍｂｄａＣＩおよびＬａｃＩのような異なる転写リプレッサーの使用を含む。
本明細書に記載される無細胞の生体分子ブレッドボードの遺伝子回路では、回路の少なくとも１つの分子成分は、遺伝子回路が回路設計にしたがって作用するときに、無細胞システムでおよび／または目標環境で検出できるレポート可能な分子成分である。
本明細書で使用される、用語「レポート可能な分子成分」は、１以上のシステムおよび／または環境で検出が可能な分子成分を示す。本明細書で使用される、用語「検出する」または「検出」は、サンプル、反応混合物、分子複合体、および基質を含むがこれらに限定されない、限られた位置のスペースにおけるターゲットの実存、存在、または事実の測定を示す。本明細書で使用される、用語「検出する」または「検出」は、相互に作用する、具体的には他の化合物と結合する性能、別の化合物を活性化する性能、および本開示を読んだ当業者により同一視することのできる追加の特性を含むがこれらに限定されない、ターゲットの化学および／または生物学的特性の測定を含むこととしてもよい。検出は、量的または質的であることとしてもよい。検出は、ターゲットまたはシグナルの量または割合を測定するために設計されたあらゆる分析を含むが、これらにに制限されない、ターゲットまたはシグナルの量的または量の測定（定量ともいう）を指し、これに関連し、またはこれをともなう場合、「定量的」である。検出は、定量化されない別のターゲットまたはシグナルに対する相対的存在量に関連するターゲットまたはシグナルの種類の質の同定を指し、これに関連し、またはこれをともなう場合、「定性的」である。
本開示による遺伝子回路のいくつかの実施形態では、レポート可能な分子成分は、ラベルを含むまたはラベルとリンクされることとしてもよく、用語のラベルは、放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光色素、発色団、酵素、酵素基質、酵素コファクター、酵素阻害剤、色素、金属イオン、ナノパーティクル、金属のゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはハプテン）等を含むがこれらに限定されない、ラべリングシグナルの放出を可能にする化合物を指す。用語「フルオロフォア」は、（蛍光レポーターＣｉｔｒｉｎｅ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｓｆＧＦＰ、および実施例３３～３９におけるｍＣｈｅｒｒｙ、または実施例４０～４８におけるｄｅＧＦＰについてみられる）検出画像で蛍光を示すことが可能な物質またはその一部を指す。結果として、本明細書で使用される、ワード「ラべリングシグナル」は、放射活性、蛍光、化学発光、酵素的な反応の結果における化合物の産生（着色化合物の産生とともに、図５９に、より一般的には実施例４９～５９に具体的にみられるように）等を含むがこれらに限定されない、ラベルの検出を可能にするラベルから放射されたシグナルを指す。
典型的には、回路設計にしたがって遺伝子回路が作用する場合に検出可能な少なくとも１つの分子成分は、回路設計にしたがって回路のアウトプットを提供する成分を含む。これは、例えば、実施例４９～５９におけるヴィオラセインについてのまたは実施例３３～３９におけるオシレータでレポートする蛍光レポーターについての場合である。したがって、本開示の遺伝子回路では、遺伝子回路が回路設計に従って作用する場合に、無細胞システムにおいておよび／または目標環境において検出可能な回路の分子成分のレポート可能なを検出することにより検出されることとしてもよい。
本明細書に記載される無細胞の生体分子ブレッドボードでは、無細胞システムにおよび／または目標環境において、回路の動作を試験しまたは検出する前に、選択された分子成分および／または関連する組み合わせを提供するための目標環境の条件下で、無細胞システムにおいて遺伝子回路の分子成分および／または関連する組み合わせの試験を可能にする方法およびアレンジメントが提供される。したがって、本明細書に記載される方法およびアレンジメントは、いくつかの実施形態において、目標環境の条件下で提供され、かつ適合性のある無細胞システム分子成分および関連する組み合わせを選択することにより、無細胞システムおよび／または目標環境における遺伝子回路の試験を低減させることを可能にする。
本明細書で使用される、用語「無細胞システム」は、反応物質が細胞環境の外側に含まれる混合物において、細胞環境で生じる反応を行うことが可能となる反応物質の組み合わせを指す。細胞環境で生じる例示的な反応は、タンパク合成、転写、翻訳、ＤＮＡ複製および／または当業者により同一視することのできる細胞環境で生じる追加の生物学的反応を含む。無細胞システムを形成する組み合わせは、高分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）の産生のためのテンプレート、支持体単量体（例えば、アミノ酸、ヌクレオチド）、コファクター、酵素、および細胞環境の一部である追加の化合物を含むこととしてもよい。無細胞システムは、当然に、複製が可能な細胞全体を含まないが、その成分は、典型的には細胞由来である。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、無細胞システムは、無細胞システムを形成する反応物質の無細胞混合物により形成されるインビトロ・システムであることとしてもよく、細胞質の組み合わせおよび／またはタンパク合成、転写、翻訳、ＤＮＡ複製、および／または当業者により同一視することのできる細胞環境で生じる追加の生物学的反応についての反応物質を含む細胞由来の核の成分を含むこととしてもよい。
いくつかの実施形態では、無細胞システムは、細胞環境において関連する反応に関する規則とともに提供される、反応物質のインシリコ・コンビネーションとしてもよい。インシリコ・システムでは、細胞成分の組み合わせは、典型的には、対応する物理的混合で生じる生化学的反応を仮想的に実行するプログラムでシミュレーションが行われる。この例は、とりわけ、ＭＡＴＬＡＢのＳｉｍＢｉｏｌｏｇｙテキストブック、その実行の１つに加えてSystems Biology Markup Language［２１］を含む。インシリコシステム利用MATLAB SimBiologyは実施例１９～３０にも例示されている。
いくつかの実施形態では、本開示の無細胞システムの方法およびアレンジメントは、本開示を読んだ当業者により理解されるように、無細胞混合物のインビトロ・コンビネーション、および反応物質のインシリコ・コンビネーションにより形成されることとしてもよい。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、無細胞システムは、転写および翻訳システム（本明細書では、「ＴＸ－ＴＬ」とも記載する）、具体的には、大腸菌由来のＴＸ－ＴＬシステム［２２］であることとしてもよい。ＴＸ－ＴＬシステムは、デオキシリボース核酸（ＤＮＡ）の転写およびメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）のタンパクへの翻訳について必要とされる試薬を含む。ＤＮＡ複製のような操作はあるかもしれないが、ＴＸ－ＴＬシステムを実行するためには必要はない。
他の実施形態では、無細胞システムは、粗大腸菌Ｓ３０抽出物のような粗細胞抽出物［２３］、ＰＵＲＥシステム［２４］十分に定義された成分からの反応物質、市販のシステムからの反応物質（例えば、Promega S30）、または小麦胚芽［２５］またはウサギ網状赤血球［２６］のような細胞抽出物の反応物質により形成されることとしてもよい。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において、遺伝子回路の分子成分および／または関連する組み合わせは、目標環境の条件下で無細胞システムにおいて試験され、目標環境下で動作する遺伝子回路を識別するために作用される。具体的には、本明細書に記載される方法およびアレンジメントの実施形態において、回路を形成する分子成分は、無細胞システムにおいて、目標環境で動かない組み換え遺伝学的成分および／または対応する回路をもたらす分子成分を排除するために、はじめは別個にその後組み合わせた目標環境の条件下で試験される。
本明細書で使用される用語「目標環境」は、まわりの成分の集合体および遺伝子回路が作用される関連する条件を示し、インビボ環境およびインビトロ環境を含む。
インビボ環境は、単一のまたは複数の細胞有機体またはこのような有機体の組み合わせを含むこととしてもよく、遺伝学的コート回路は、トランスフォーメーションまたは当業者に知られる同等の手段により導入されることとしてもよい。実施例のインビボ目標環境は細胞であり、例えば、有機体のそれは遺伝子回路がプロトタイプであった（例えば、大腸菌の無細胞システムに基づく場合、そのときの目標環境は大腸菌細胞であり、小麦胚芽の無細胞システムに基づく場合、そのときの目標環境は小麦胚芽または細胞株である。）。しかしながら、ある実施形態では、目標環境は、プロトタイプであった有機体に対してはあいまいである（例えば、大腸菌の無細胞システムに基づく場合、目標環境は小麦胚芽である。）。インビボの目標環境は、単一の細胞、細胞の収穫物、細胞株、または有機体である。インビボの目標環境は、それ自身を再生できる。
インビトロでの環境は、転写および翻訳を行うことができる成分を含む非生存の環境を含む。インビトロでの環境は、ＴＸ－ＴＬのような無細胞システム、並びに凍結乾燥または転写もしくは翻訳が生じ得る条件を作成する化学物質（水を含む）の添加で転写および翻訳を行うために、インビトロでの環境の性能を維持するプロセスにより得られるこのようなシステムの変異体により提供されることとしてもよい。インビトロでの目標環境は、回路の操作において利用される分子成分の再生なく、これらに制限されることなく、例えば、１ｐＬ～１０ｕＬ、１０ｕＬ～１ｍＬ、１ｍＬ、２Ｌ、または２Ｌ～２０００Ｌのような量の範囲のｂａＴｃｈ‐モードフォーマットのようなインビトロでの混合物である。インビトロでの混合物は、また、凍結乾燥したフォーマット、部分的に補充されたフォーマット（例えば、ＡＴＰ、アミノ酸、コファクター、および他の分子成分を含むエネルギーリザーバー内の透析カセット）、または安定した状態のフォーマット（例えば、エネルギーリザーバーをポンプし、［２７］に記載されているように、細胞の分割をエミュレートするための所与の時間を試薬に使用してポンプで吸い出す）であることとしてもよい。このインビトロでの目標環境は、細胞で産生される毒性のまたはそうでなければ経済的でない化学物質のような材料を産生するために、または、遺伝子回路から指示されるタスクを実行するために使用されることとしてもよい。インビトロでの目標環境は、それ自身を再生することはできない。
目標環境は、典型的には、細胞環境でみられる化合物を含み、また、いくつかの実施形態では、回路の操作で必要とされる細胞および／または遺伝学的分子成分を含む。
いくつかの実施形態では、成分の試験は、インビトロで タンパク合成、転写、ＤＮＡ複製、および／または、当業者により同一視することのできる細胞環境で生じる追加の生物学的反応についての反応物質を含む細胞由来の細胞質および／または核の成分の混合物のような無細胞混合物で行うこととしてもよい。いくつかの実施形態では、試験は、インシリコ無細胞システムで行われることとしてもよい。
本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、無細胞システムは、ＴＸ－ＴＬシステムから組成反応物質により形成されることとしてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、ＴＸ－ＴＬ反応混合物は以下のステップにしたがって調製されることとしてもよい。まず、粗細胞抽出物、アミノ酸溶液、およびエナジーソリューションが準備される。次に、ＴＸ－ＴＬシステムを作成するための、粗細胞抽出物、アミノ酸溶液、およびエナジーソリューションを含む、３つの成分が調製される。アミノ酸溶液およびエナジーソリューションは、その後、ＴＸ－ＴＬバッファを作成するために組み合わされる。次のステップは、発現の最大レベルでＴＸ－ＴＬ反応を産生するために、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）濃度およびＭｇ２＋、Ｋ＋の最大濃度を測定するために、粗細胞抽出物をキャリブレーションする。第３に、キャリブレーション結果が、ＴＸ－ＴＬバッファーのチューブ、粗細胞抽出物のチューブ、およびＤＮＡのチューブを含む３つのチューブシステムを作成するために使用される。最後のステップは、図２に示される、調製されたＴＸ－ＴＬ試薬を用いてＴＸ－ＴＬ反応を実行するためである。本明細書に記載される、ＴＸ－ＴＬシステムは、典型的な無細胞アプリケーション並びに合成生物学回路を説明するために使用されることとしてもよい。どのようにＴＸ－ＴＬシステムを調製するのかについての詳細な方法は、Sunおよび協力者［１５］による以前の文献に見出すことができ、本文献は、その全体を本明細書に参照により援用する。
いくつかの実施形態では、分子成分またはこれらの組み合わせの試験は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットを提供することにより行うこととしてもよく、各セットは、無細胞混合物中で反応して遺伝子回路の分子成分を提供することができる。これらの実施形態では、提供されたセットは、目標環境の条件下で回路の各分子成分を提供することができる１以上のセットを別個に選択する無細胞システムで反応させることとしてもよい。ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の選択されたセットは、目標環境の条件下で分子成分を提供することができるセットを選択するために無細胞システムで組み合わせて試験されることとしてもよい。
いくつかの実施形態では、提供されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットは、回路の遺伝学的分子成分のための転写および翻訳ユニットを形成するポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物を含む。これらの実施形態では、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットは、遺伝学的分子成分の遺伝子、並びに、無細胞混合物において遺伝学的分子成分を提供する遺伝子の関連する転写および可能性のある翻訳に必要とされる分子成分を含む。
いくつかの実施形態では、提供されるポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットは、単独で、または、他の遺伝子回路の分子成分と細胞分子成分を結合する反応を、活性化し、阻害し、結合し、および／または変換するために必要な可能性のある化合物と組み合わせて回路の細胞分子成分を含む。
本明細書で使用される、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドを含む２以上の単量体からなる有機ポリマーを示す。用語「ヌクレオチド」は、プリン塩基もしくはピリミジン塩基およびリン酸基に結合したリボースもしくはデオキシリボース糖からなり、核酸の基本構造ユニットである任意のいくつかの化合物を指す。用語「ヌクレオチド」は、核酸で特にみられ、デオキシリボースまたはリボースと組み合わされる、プリン塩基もしくはピリミジン塩基からなる化合物（例えば、グアノシンまたはアデノシン）を指す。
本明細書で使用される、用語「ポリペプチド」または「タンパク」は、２以上のアミノ酸単量体および／またはその類似体で構成される、有機の直鎖の、環状の、分枝状のポリマーを指す。用語「ポリペプチド」は、全長のタンパクおよびペプチド並びに類似体およびそのフラグメントを含むあらゆる長さのアミノ酸ポリマーを含む。本明細書で使用される、用語「アミノ酸」、「アミノ酸モノマー」、または「アミノ酸残基」は、２０個の天然由来のアミノ酸、非天然アミノ酸、および人工のアミノ酸のいずれかを指し、ＤおよびＬ光学異性体を含む。特に、非天然アミノ酸は、天然由来のアミノ酸のＤ－光学異性体（それらは酵素分解を受けにくいため有用なリガンド構成要素を含む）を含む。用語「人工のアミノ酸」は、標準的なアミノ酸結合化学を用いて容易に連結可能な分子を示すが、天然由来のアミノ酸に似ていない分子構造を有する。用語「アミノ酸類似体」は、１以上の個々の原子が置き換えられたアミノ酸を指し、異なる原子、アイソトープを有し、または、異なる官能基を有するが、類似体が由来するオリジナルのアミノ酸と一致する。タンパクは、当業者により理解される、二次、三次、および可能であれば四次構造を有することとしてもよい。
本明細書で使用される、用語「代謝生成物」は、インビトロでまたはインビボで生じる酵素－触媒反応の産生物を指す。概して、代謝生成物は有限の半減期を有し、それらは細胞中に蓄積されない。多くの代謝生成物は、代謝のペースを制御する調節因子である。本明細書に記載される、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットで提供される代謝生成物は、細胞環境で存在する小分子（例えば、ＮＡＤ、ＦＡＤ、ＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰ、ＴＴＰ、ＡＭＰ、ＧＭＰ、ＡＤＰ、ＧＤＰ、ビタミンＢ１、Ｂ１２、クエン酸、グルコース、ピルビン酸、３－ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸）、アミノ酸、並びに細胞環境で存在するが無細胞システムの機能を維持しない、例えば、密集剤（例えば、ＰＥＧ－８０００、ＦｉＣｏｌｌ４００、およびスペルミジン）、還元剤（例えば、ＤＴＴおよびｂ－メルカプトエタノール）、外部の非－天然の糖源（マルトース、マルトデキストリン、フルクトース等）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、および酢酸）を含む。インデューサー（例えば、ａＴｃ、ＩＰＴＧ、３ＯＣ１２ＨＳＬ、３ＯＣ６ＨＳＬ、およびバニリン）、基質（例えば、マラカイトグリーン、およびスピナッチ)のような、細胞環境に存在しない、機能するために遺伝子回路にとって重要である小分子、または経路の中間体もしくはインプットを形成するアイテム（例えば、１，４ＢＤＯへの変換のためのコハク酸または遺伝子回路もしくは代謝経路による代謝中間体、ヴィオラセインへの変換のためのトリプトファンまたは実施例４９～５９に例示される代謝中間体）を含む。
無細胞システムがインビトロでの混合物である実施形態では、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物は、当業者により同一視することのできる方法にしたがって物理的に提供される。例えば、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡのde novo合成、天然有機体からのＤＮＡのクローニング、または種々のＤＮＡアセンブリ技術、例えば、ギブソン、ゴールデンゲート、および当業者により同一視することのできる追加の方法を提供することとしてもよい。具体的な方法は、実施例４６および図３３でみることができる。
無細胞システムがインシリコ混合物である場合には、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の活性は、リソースの制限を考慮してコンピュータを用いてモデルでコードされることとしてもよく、その後、実施例２１のように、実行ラインで動かすこととしてもよい。
いくつかの実施形態では、セットのポリヌクレオチドは、プロモーター、転写因子結合部位、オペレーター、アクチベーター結合部位，リプレッサー結合部位、エンハンサー、タンパク－タンパク結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、および当業者に知られる他の制御エレメントのような調節領域を含む。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットで提供されるポリペプチドは、産生において所定の遺伝子学的分子成分をともなうポリペプチドを含み、シャペロンタンパク、シグマ因子、コファクター、翻訳エレメント、スキャホールド、共活性化タンパク、スプリットタンパク、および当業者に知られる他の関連するエレメントのような分子成分をコードするポリヌクレオチドの翻訳にともなう調整因子を含むこととしてもよい。
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、（例えば、コード領域および１以上の調節領域）分離されたピースへと遺伝子またはＲＮＡをブレイクダウンすることにより提供され、その後、実施例４６および図３３に説明されるセットの態様で、ピースを再コンバインすることとしてもよい。例えば、試験される遺伝子学的分子成分を形成するための遺伝子の物理的なＤＮＡを提供するために、物理的なＤＮＡはサブユニット（プロモーター、ＵＴＲ、コード配列、ターミネーター）にブレイクダウンされることとしてもよく、その後、試験可能な、発現可能な遺伝子学的成分（直鎖ＤＮＡ上に）へと迅速に組み立てることとしてもよい。迅速な（８時間）組み立ておよび試験サイクルに関し、実施例４０～４８に記載されるプロセスを実行することとしてもよい。
いくつかの実施形態では、無細胞システムはインビトロでの混合物であり、ポリヌクレオチドは、ゴールデンゲートアッセンブリ、アイソサーマルアッセンブリ、および他の当業者に知られる方法、既に組み立てられたプラスミドのＰＣＲオフ、もしくは既に組み立てられたプラスミドの直接的な使用を含む、試験される遺伝子の遺伝学的分子成分を形成するポリヌクレオチドまたは他のポリヌクレオチドを提供する、または、とりわけ、ＤＮＡ合成により部分的にもしくは全体で物理的なピースを提供するための多くの許容されるプロセスにより提供されることとしてもよい。
特に、これらの実施形態のいくつかにおいて、ＤＮＡは、「やや飽和した」範囲における典型的な濃度で最終混合物に物理的に添加されることとしてもよく、この範囲は０ｎＭからｎＭの量で定義され、ＤＮＡのタブリングは発現されたｍＲＮＡおよびタンパクのその後の増加をもたらさない。この量は、物理的ＤＮＡを作り上げるサブ成分の転写および翻訳強度に応じてプラスミドからプラスミドへと変化するが、実施例２～５９に説明されるように、典型的には６４ｎＭ以下であり、通常、約０ｎＭから１６ｎＭであり、回路試験について付与されるＤＮＡ濃度である。他の実施形態では、提供されるＤＮＡは、飽和させたフェーズの状態または重量をセットした状態（ｎｇまたはμｇで）であることとしてもよい。
無細胞システムでのＤＮＡ、他のポリヌクレオチド、並びにポリペプチドおよび／または代謝生成物を提供する追加の技術およびプロトコルは、本開示を読んだ当業者により同一視することのできるものである。
本明細書に記載される実施形態では、ポリヌクレオチドポリペプチドおよび／または代謝産物のセットは、目標環境の条件下で、無細胞システムおよび／または無細胞反応混合物でまずは試験される。
目標環境の「条件」は、最終的な目標環境に最も似ている環境を指す。例えば、大腸菌種ＪＭ１０９のインビボ目標環境に対応する無細胞混合物では、無細胞混合物は、それ自体、原核生物または真核生物から、好ましくはバクテリアから、より好ましくはグラム陰性細菌から、よりさらに好ましくはあらゆる大腸菌種から、もっとさらにより好ましくはＪＭ１０９から産生されることとしてもよい。同様に、［２８］についてのモバイルペーパーアレンジメントの最終的なインビトロでの目標環境で作用することを意味する遺伝子回路に関し、代謝生成物の再生をしない無細胞混合物がより好ましく、代謝生成物を再生する無細胞混合物はあまり好ましくない。
いくつかの実施形態では、目標環境の条件は、目標環境の調節配列とマッチする分子成分の転写および／または翻訳に影響を及ぼす調節配列または調節因子により提供されることとしてもよい。例えば、真核生物におけるタンパク合成は原核生物とは異なる。ｍＲＮＡの５’末端は、リボソームにより認識される変更された化学構造を有し、その後、リボゾームは、ｍＲＮＡに結合し、最初のＡＵＧコドンをみつけるまでそれに沿って移動する。塩基の特徴的なパターン（「コザック配列」と呼ばれる）はそのコドンの周りでみられ、シャイン・ダルガノ配列を暗示する態様で正確にｍＲＮＡを配置するにあたってアシストするが、リボソームＲＮＡと塩基対を形成しない。したがって、真核生物システムで動作する回路の一部を形成する原核生物で発現されるタンパクにより形成される分子成分において、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝産物のセットにおける調節配列の変更は、回路が動かされる真核生物環境で、原核生物のタンパク成分を試験するために提供される。
いくつかの実施形態では、目標環境の条件は、異なる効率を有するリボソームと結合する異なるＲＢＳにより提供されることとしてもよい。大腸菌において、例えば、TTTAGAGAAAGAGGAGAAATACTAG（配列番号４４）の配列を有するのは、高いリボソーム結合部位（ＲＢＳ）配列であり、それは、この配列に直接続くあらゆる遺伝子（直接３’－この配列まで）がより高い割合で翻訳されることを意味する。したがって、オリジナルの発現レベルで、オリジナルの環境で発現されるタンパクにより形成される分子成分では、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝産物のセットで作用される回路の一部を形成することは、回路が動かされる別の環境でタンパク成分を試験するために提供されることとしてもよい。例えば、実施例６～１１では、１６の異なるＲＢＳユニットが、フィードフォワードループ回路におけるＴｅｔＲおよびｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡの発現の内容物で試験され、これらのＲＢＳのそれぞれは、ＴｅｔＲおよびｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡタンパクの異なる発現レベルをもたらし、したがって、実施例１１および図１２Ａにみられるようにインビトロでのまたはインビトロでの回路の異なる挙動をもたらす。よって、所望される遺伝子回路の最終的な機能的挙動を（フィードフォワードループにおける、特定の期間のパルス）調整するために、強ＲＢＳ、中ＲＢＳ、弱ＲＢＳ、またはその変化は、翻訳効率に影響を及ぼすために選択することができる。結合効率を変化させるＲＢＳの例は、実施例のセクションにおいて使用されるＢＣＤおよびＭＣＤを含む。通常使用されるＲＢＳ配列の１つのファミリーは、http://partsregistry.org.からのB0030のATTAAAGAGGAGAAA（配列番号４５）またはB0034のAAAGAGGAGAAA（配列番号４６）のような、合成モノシストロニック設計（ＭＣＤ）を含む。他のＭＣＤは、B0031、B0032、およびB0033を含む。これらのＲＢＳ配列は、強、中、および弱のＲＢＳ配列に分けることができ、各エレメントの最終的な翻訳の強度は広く予測できるが、広範囲な実験を行うことなく前測定することはできない。ＲＢＳ配列の追加のファミリーは、とりわけ、BCD2のGGGCCCAAGTTCACTTAAAAAGGAGATCAACAATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAACATCTTAATCATGCTAAGGAGGTTTTCT（配列番号２２）、またはBCD22のGGGCCCAAGTTCACTTAAAAAGGAGATCAACAATGAAAGCAATTTTCGTACTGAAACATCTTAATCATGCGGTGGAGGGTTTCT（配列番号１９）のような合成バイシストロニック設計（ＢＣＤ）を含む。［１］で開発されたこれらのＢＣＤユニットは、１対１の相関性ではないにもかかわらず、ｍＲＮＡからの二次構造の制約を除くことにより、各エレメントの最終的な翻訳強度のより大きな予測性を提供することができる。
ポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットが単独でおよび／または組み合わせて試験される方法およびアレンジメントの実施形態では、試験は、目標環境で作用される回路を構築および／またはデバッグするように、無細胞システムで試験されることとしてもよい。
本明細書で使用される、用語「構築」は、分子成分を組み立てて遺伝子回路を提供するプロセスを示す。本明細書で使用される、用語「デバッグ」は、回路設計にしたがって作用しない遺伝子回路をもたらす遺伝子回路におけるエラーを特定するおよび／または取り除くことを示す。デバッグすることは、図６（ステップ４）に示され、実施例３３～４０に例示されるような、非機能的であるものを除外し、機能的であるものを特定し、その後、完全な回路の機能的なモチーフまたはサブセクションを組み合わせる、機能性についての完全な回路のモチーフまたはサブセクションを試験することを含むこととしてもよい。また、デバッグすることは、そのサブ成分（プロモーター、ＲＢＳ、コード配列、ターミネーター）へと遺伝学的成分をブレイクダウンすること、および実施例２～５および実施例１２におけるプロモーター変化ライブラリまたは実施例６～１１におけるリボソーム結合部位変化ライブラリで例示されるような、その後に機能的ユニットへと低減して試験することができる、大きなライブラリを生成するこれらに成分の１以上を変化させることを含むこととしてもよい。また、デバッグすることは、実施例４５のような予期されるアウトプットについての異なる組み立てメカニズムを試験することを含むこととしてもよい。また、デバッグすることは、アプリケーションおよび具体的には実施例４９～５９における代謝のエンジニアリングにより概して例示される、遺伝学的分子成分または細胞分子成分の濃度を添加し、除去し、修正することによる最終産物または中間体の産生を最適化することにより、代謝経路の可能な設計スペースを探索することを含むこととしてもよい。また、デバッグすることは、無細胞混合物におけるおよびインビボ目標環境における濃度がプラスミドコピー数（実施例９）または回路（実施例１７、１８、３１、３２）で重要な変数を示す一般的な感受性分析によりマッチされるように、産生される遺伝学的成分の濃度を決定することを含むこととしてもよい。また、デバッグすることは、実施例１９～３０で測定される、回路の重要な特性の同定または非機能的な設計の除去において援助するためのインシリコブレッドボードの使用を含むこととしてもよい。
いくつかの実施形態では、構築および／またはデバッグされる遺伝子回路が実行されることとしてもよい。いくつかの実施形態では、構築および／またはデバッグされる遺伝子回路は、機能を提供するために、反応を活性化する／阻害する、結合する、および／または変換することにより接続される分子成分を提供することにより、エックスノボ（ex novo）で設計されることとしてもよい。これらの実施形態では、遺伝子回路を設計することは、機能を生じるように分子成分が接続された回路設計を提供することにより実行される。設計することは、したがって、機能を提供するための分子成分を接続するモチーフを識別し、機能を分離することをともなう。例えば、実施例１６および図３９におけるｔｅｔＯ１反応性プロモーターをエンジニアリングする実施例において、所望の機能は、ＴｅｔＲに対する反応において、ｐＬａｓ活性化プロモーターの抑制である。この機能にしたがって、プロモーターユニットは、異なるｔｅｔＯ１オペレーター部位を含むように操作され、ｌａｓＲにより活性化されるプロモーターの性能を維持しながら、ＴｅｔＲの存在下においてプロモーターからの産生をどのオペレーター部位が停止するのかを測定するために試験される。別の例として、グルコースからブタノールへの経路において、人工の経路は、[２９]に記載されるように、細胞に天然に存在しない機能（例えば、大腸菌でのブタノールの産生）を提供するように設計される構成物であることとしてもよい。
いくつかの実施形態では、前から存在する遺伝子回路を改変することにより遺伝子回路の提供が実行されることとしてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、構造において（例えば、実施例３３～４０に例示されるようなオシレータアウトプットを付与することが知られるリングオシレータ構造）、または実際の成分において（実施例４９～５９に例示されるようなヴィオラセイン経路）、前から存在するものが提供されることとしてもよい。前から存在する部分は、微生物のセッティングにおいて生じるような天然のもの、あるいは、コンピュータのアッセイから独自に開発されるような合成のもののような異なる部分により置き換えられることとしてもよい。例えば、ＴｅｔＲのようなタンパクに関し、（国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）Entrez Geneを採掘することによる）異なる微生物の有機体から、または、定向進化アッセイ、および選択もしくはスクリーンから、ＴｅｔＲの異なる天然の相同体を産生することができ、あるいは遺伝子の配列を人工的に変更することから、異なる合成バージョンのＴｅｔＲを産生することができる。ＴｅｔＲ（例えば、ＳｒｐＲ、ＰｈｌＦ）の異なる相同体を用いることにより、リングオシレータの存在する構造が利用されるが、異なるピースが、前から存在するものへと変異体を構築ために実行される。
本明細書に記載される遺伝子回路を構築および／またはデバッグするための方法のいくつかの実施形態では、回路の組み換え遺伝学的成分を形成する分子成分は、目標環境で動かない組み換え遺伝学的成分および／または対応する回路をもたらす分子成分を排除するために、無細胞システムにおいておよび／または無細胞反応混合物において、はじめは別個にそしてその後組み合わせて目標環境の条件下で試験される。
いくつかの実施形態では、目標環境の条件は、他の環境で存在しない、種々のメチル化パターン、リン酸化パターン、または修飾パターンを有するポリヌクレオチドにより提供されることとしてもよく、例えば、「ＧＡＴＣ」上の大腸菌メチル化パターンはＤＮＡ制限を生じさせ、タイプＩおよびタイプＩＩ制限エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡテンプレートをあるインビボ環境で使用されることを制限する。これらの条件は、無細胞システムに制限エンドヌクレアーゼを添加することによりエミュレートされることとしてもよく、または、異なるＤＮＡピースを利用することおよび／またはＤＮＡでシステムを飽和させることおよび／またはそうでなければメチル化もしくは修飾制限パターンを無効にすることにより克服されることとしてもよい。
いくつかの実施形態では、１以上のセットのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物、遺伝子回路の１つの分子を提供することが可能なそれぞれは、回路の分子成分を提供するために、無細胞混合物において反応することが可能なポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の１以上のセットのそれぞれを選択するために、目標環境の条件下で、無細胞システムおよび／または無細胞反応混合物においてまずは試験される。実施例１２および図９Ａ～Ｆは、目標環境において（この場合、レポーターエレメントにおける使用のためのプロモーター）動作する回路の分子成分を選択するために、１セットの異なるポリヌクレオチドに変化させたプロモーターを試験する実施例である。回路の分子成分を提供するポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットの試験の別の実施例は、実施例１６であり、そこでは、異なるポリヌクレオチドが変更されたオペレーター部位は、遺伝学的分子成分リプレッサーユニットのための分子成分を選択するために試験される。
いくつかの実施形態では、遺伝子回路の１つの分子成分を提供することがぞれぞれ可能な、２以上のセットのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の組み合わせは、無細胞システムの化学物質成分をそれぞれ含む、いくつかのまたは別々の無細胞混合物中で、目標環境の条件下で、試験されることとしてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、組み合わせの試験は、目標環境の条件下で、遺伝子回路の少なくとも２つの分子成分で提供するために、それぞれ無細胞混合物で反応することができる、２以上のセットの選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の選択した組み合わせをもたらす。活性化成分（実施例１２参照）を別個に試験することにより実行される図１１Ａの例示的なモチーフバイモチーフ、成分の抑制（実施例１６参照）、２つの選択された遺伝学的分の検出、およびインビボ（図１１Ｅおよび実施例８参照）にみられる機能的なＦＥＬを作成するための２つの選択された分子成分を組み合わせることに関連する参照がなされる。
本開示の方法および関連するアレンジメントのいくつかの実施形態では、組み合わせを形成するために遺伝子回路の１つの分子成分をそれぞれ提供することが可能な、２以上のセットのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物は、無細胞システムおよび／または無細胞反応混合物中で、目標環境の条件下で遺伝子回路の１つの分子成分をそれぞれ提供することが可能である、１以上のセットの選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物を含む。
本明細書に記載される遺伝子回路を構築および／またはデバッグする遺伝子回路を構築ための方法および関連するアレンジメントの実施形態において、１以上のセットの選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物および／または２以上のセットのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の選択された組み合わせは、無細胞システムの化学物質成分を含む無細胞混合物接触（コンタクト）され、目標環境で作用される遺伝子回路のレポート可能な分子成分を無細胞混合物中で提供することが可能な選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物の各セットの組み合わせを選択することをもたらす再試験をすることとしてもよく、実施例は、実施例４９～５９からのヴィオラセイン経路においてみられる。レポート可能な分子成分ヴィオラセイン（vioalcein）を検出するために、実施例５４における経路の完全な再構成（reconstition）からの測定では、具体的には、レポート可能な分子成分の中間体は、重要なことに、中間体（例えば実施例５８参照）を検出するために、変化させた酵素濃度による再試験をもたらす。
いくつかの実施形態では、回路および／またはその組み合わせの分子成分を試験することは、分子成分および／またはその組み合わせ、特定のセットのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物よりもむしろ本開示を読んだ当業者により理解される関連するセットのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物を選択するために行われることとしてもよい。例えば、実施例１６におけるＦＦＬモチーフを抑制エレメントの分子成分を試験することにおいて、ＬａｃＩのような類似の機能を果たす他の抑制エレメントが無細胞システムで同様に試験されることが理解される。別の例として、実施例１２および図１８Ａ～１８Ｅにおける５つのプロモーターのプロモーター強度を試験することにより、同じプロモーターであるが実施例８および１０並びに図１７Ｂ～１７Ｆで使用されるような操作されるｔｅｔＯ1オペレーターを有するものが、関連するプロモーターを再試験する必要性なく、同様の挙動を示すことが、当業者により理解される。
遺伝子回路をデバッグする方法および関連するアレンジメントの実施形態では、遺伝子回路のバリエーションは、１以上の分子成分またはその組み合わせを試験することにより選択された分子成分またはその組み合わせで、遺伝子回路の１以上の分子成分を置き換えることにより提供されることとしてもよい。
これらの実施形態のいくつかでは、遺伝子回路の変化は、機能的回路（本明細書では機能的成分とも記載する）を提供する１以上の分子成分を選択するために行われる。これらの実施形態のいくつかでは、提供することは、実験の結果が所望の結果であることを測定するために、回路の１以上のレポート可能なエレメント、具体的には、回路設計にしたがって回路が作用する場合に検出できるレポート可能なエレメントを検出することにより実行されることとしてもよい。例えば、遺伝子回路のアウトプットがパルスであることが実施例１６において知られる場合には、機能的成分の試験は、プロモーターがＴｅｔＲおよびａＴｃに対して反応するように作成されているかどうかを測定することであり、ＴｅｔＲに対して（例えば、ＴｅｔＲに反応してシグナルが減少しない）またはａＴｃに対して（例えば、ａＴｃがＴｅｔＲの存在下で提供される場合に、シグナルが減少しない）非反応性であるあらゆるプロモーターユニットは、本開示の目的に関し、非機能的である。本試験の別の変異体は、タンパク（例えば、ＴｅｔＲまたはａＴｃ）に対して反応性であることが知られるプロモーターを有するものであることとしてもよいが、むしろ回路のアウトプットが抑制の増加であり、試験される機能的成分はＴｅｔＲタンパクであり、ＴｅｔＲタンパクの変異体が提供され、伝達関数を産生するために試験される。このことは、オシレータに組み込むためのＴｅｔＲ変異体の場合において、図２３Ａ、図２６Ａ、図２６Ｂ、および実施例３８に説明される。いくつかの実施形態では、機能的成分は分子成分、遺伝学的成分、またはそのサブ成分である。典型的には、機能的成分は、異なる変異体、濃度、およびその同一性を測定する他のパラメータ間で変化する。
回路をデバッグするためのいくつかの実施形態では、回路は試験のためにサブ回路（部分回路、分岐回路）またはモチーフへと分けられることとしてもよく、サブ回路またはモチーフの試験の結果は、回路をデバッグするためにともに組み合わされることとしてもよい。これらの実施形態の実施例は図２３Ａにアウトラインが記載され、各個々のレポーター‐リプレッサーのペアが各ペアの伝達関数特性を測定するために試験され（この場合、レポーターはオシレータ回路の最後のレポーターではないが、単にリプレッサー機能を測定するためのレポーターである）、この情報を使用して、完全な回路が、その後、サブ回路またはモチーフから構成される。
遺伝子回路をデバッグするための実施形態では、また、方法は、目標環境で作用される遺伝子回路を無細胞システムにおいてデバッグするために、回路のバリエーションの提供、および／または、１以上の分子成分および／またはその組み合わせの試験を繰り返すことを含む。例は実施例４９～５９の代謝のエンジニアリングでみられ、具体的には、ヴィオラセインの産生をデバッグするために、経路メンバーの異なるコード配列を試験し、多数のレポート可能なエレメントを測定することを繰り返すことが実施例５８で行われる。本実施形態の別の実施例は、実施例１１におけるＦＥＬであり、ＲＢＳの多数の変異体が、パルス状のアウトプットを測定するために、回路のレポート可能な抑制エレメントについて提供され、繰り返しおよび比較が実施例８によりインビボ目標環境でなされ、トップエレメントにおけるさらなる回路の繰り返しが、実施例３２によりインビボと比較してインビトロでなされる。
遺伝子回路を構築および／またはデバッグする方法のいくつかの実施形態では、２以上のセットのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物は、単一の無細胞システムで組み合わされ、試験され、ともに特徴づけられることとしてもよい。例えば、回路がサブ回路、サブセット、またはモチーフに分けられる場合、それぞれが別個に試験され、作用することが理解され、別個のサブ回路は、その後、最終的な回路産生物を組み立てるためにともに組み合わされることとしてもよい。実施例３３～３７におけるこの実施例は、３－ノードオシレータにおいて、３つのリプレッサー－プロモーターのペアののサブセットが独立して試験され、その後、ともに試験するために単一の無細胞システムで組み合わされる。回路の最終的な目標環境がインビボである場合、化学量論的な量のセットのようなパラメータがインビボと同じバランスでバランスされ、例えば、１０ユニットの分子成分を有する１ｎＭのセット１のＤＮＡと１０ユニットの別の分子成分を有する４ｎＭのセット２のＤＮＡを使用する場合、インビボで、セット１を低複製プラスミドに配置し、セット２をコピー数が化学量論的に４×である中程度の複製プラスミドに配置することが予測され、実施例９で説明されるように、分子成分の濃度を１：１にマッチさせる。
本明細書に記載される回路を構築および／またはデバッグする方法のいくつかの実施形態では、分子成分および／または関連するポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物のセットの試験が、無細胞システムで並列に行われることとしてもよい。これらの実施形態のいくつかでは、並列試験は、回路の多数の変異体、およびサブ回路またはモチーフの多数の変異体の平行な試験を可能にし、したがって、他のアプローチと比較して遺伝子回路を試験するおよびデバッグする効率の増加をもたらす。特にこれらの実施形態のいくつかでは、実験は非常に高いスループットのフォーマット（例えば、３８４ウェルのプレート、液滴）で行われることとしてもよく、および／またはＤＮＡのインプットのタイプ（例えば、多数の直鎖またはプラスミドＤＮＡがいったん１つの無細胞混合中で試験され、一方、細胞目標環境中で、細胞の増殖および機能を有する適合性のあるものに限定されない）またはレポーターの利用（例えば、各無細胞混合物は、回路のアウトプットを提供する同じレポート可能な分子成分を有することができるが、異なるサブ回路、回路、変異体、またはモチーフを試験する）で制限を有しない。いくつかの実施形態では、レポート可能な分子成分は、回路設計にしたがって、遺伝子回路のアウトプットを提供する１つの分子成分である（例えば、最終的なアウトプットエレメントとして産生される蛍光タンパク）。他の実施形態では、多数のレポート可能な分子成分は、遺伝子回路に含まれ、回路設計に従う回路の動作に関連する（例えば、遺伝子回路のコースのあいだに産生される多数の蛍光タンパクまたは回路における機能的タンパクに結合される蛍光タンパク）。いくつかの実施形態では、レポート可能な分子成分は、組み換え遺伝学的成分により直接的または間接的に産生される化学物質、小分子、または代謝産物であることとしてもよい（例えば、ＮＡＤＰＨアッセイ由来の吸光度、１つの化学物質から他への化学的変換、組み換え遺伝学的エレメントの活性からもたらされるｐＨの変化）。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの試験、少なくとも１つの検出および／または本開示の設計する、構築する、実行する、デバッグする、および／または試験するための少なくとも１つの方法の提供は、複数の反応を同時に生じさせることにより、試験、検出、および／または提供の実行を示す、「並列で」行われることとしてもよい。したがって、例えば、並列試験および／または検出は、試験時間を低減させるために、同時に行われる複数の反応により実行される試験および／または検出を示す。例えば、並列試験は、コンピュータを用いてまたは無細胞混合物での２以上の反応により行われることとしてもよく、それぞれは、同じもしくは異なる分子成分、その組み合わせ、シグナルおよび／または分子成分の機能的特性、その組み合わせ、および／または回路を検出、提供、および／または選択するための異なる分子成分および／または分子成分の組み合わせを試験する。
レポート可能な分子成分の検出は、蛍光、吸光度、質量分析、フローサイトメトリー比色、目視、UV、ガスクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、プロテインゲル、ウェスタンブロット、薄層クロマトグラフィー、放射能などのインビトロ法のような当業者によって同一視することのできる種々の方法によって行うことができる。特に、標識シグナルは、当業者に理解されるように、これらの技術を用いて定量的または定性的に検出することができる。例えば、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質は、４８５の励起範囲および５１５の発光範囲で検出することができ、ｍＲＦＰは、５８０の励起範囲および６１０の発光範囲で検出することができる。他の蛍光タンパク質には、ｓｆＧＦＰ、ｄｅＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＣＦＰ、ｅＹＦＰ、ｅＣＦＰ、ｍＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍｍＣｈｅｒｒｙが含まれる。他の検出可能なレポート（報告）は検出するために励起を必要としない。例えば、図５９および実施例５４では、各代謝中間体は、必要な励起なしに検出可能な色を有し、これは基本的なスペトロフルオロメーターで読み取ることができる。他の検出可能なシグナルには、遺伝学的成分に結合し、次いで活性（例えば、隔離、ＦＲＥＴ、消化）に際して放出され得るｄｓＲｅｄ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ、フルオレシンなどの色素が含まれる。
例えば、実施例３３～３９では、レポート可能な分子成分は蛍光タンパク質ｄｅＧＦＰであり、実施例４０～４８ではＣｉｔｒｉｎｅ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ｓｆＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙである。しかしながら、ｔｅｔＲ、ｌａｃＩなどのような各非蛍光タンパク質は、そのタンパク質がその存在を検出できる条件下（例えば、ウェスタンブロット、または抗体染色）でランされるタンパクである場合に、レポート可能なエレメントとしても作用することができる。レポート可能なエレメントは、実施例５５～５７の場合のような小分子であってもよく、ヴィオラセインの加工されたバージョンであるデオキシビオラセイン、ヴィオラセイン、およびプロビオラセインの産生は、ＧＣ／ＬＣ－ＭＳまたは薄層クロマトグラフィーを使用して検出される。いくつかの実施形態では、ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢおよびその他の当業者によって同一視することのできるタンパクを含む遺伝学的分子構成物は、タンパクを読み取ることができるシステム上で実行される場合、レポート可能なエレメントでもあり得る。
インシリコ測定では、回路の遺伝学的および分子成分の濃度に対応するモデルの変数の値を直接測定し、遺伝子回路の作動を測定する目的で、その測定値を保存、プロットまたは分析することが可能である。
いくつかの実施形態では、遺伝的回路が回路設計に従って動作する場合、少なくとも１つのレポート可能な分子成分が無細胞システムおよび標的環境において検出可能である。
いくつかの実施形態では、本開示の全体的な方法の文脈におけるレポート成分の検出は、無細胞環境での遺伝子回路の操作をある期間にわたって可能にし、その時点で検出方法が適用されるインビトロまたはインシリコ（コンピュータを用いる）の反応のサンプルに適用する。遺伝的回路は無細胞システムでの操作を継続することができ、さらなるデータポイントを収集することができ、またはインビトロシステムのための試薬を廃棄することにより、またはインシリコシステムのためのシミュレーションプログラムを終了することにより、回路の操作を終了させることができる。
いくつかの実施形態では、方法およびアレンジメントは、本明細書に記載される回路をデバッグする方法および回路を構築する方法の工程を組み合わせる開示の遺伝子回路を構築およびデバッグすることを提供する。
例示的な実施形態では、方法は、以下の工程を含む。
（１）回路の最終的な機能を強調する回路設計を提供することにより、回路を設計する。この設計工程は、完全な回路ベースでなされることとしてもよく（例えば、所望の機能性を達成するためにピースの全てを概説する）、または、サブ回路ベースでなされることとしてもよい（例えば、試験に対して個々にサブモジュールを設計し、その後、サブモジュールを構築する）。図２４に示す例では、オシレータアウトプットが望ましい場合、そのような機能性は、奇数番号の抑制遺伝子および／または細胞分子成分の構造によって達成することができる。
次いで、サブモジュールは、試験されるリプレッサー対（ＴｅｔＲ、ＰｈｌＦ、ＬａｃＩ、ＣＩ、ＳｒｐＲなど）として設計することができる。いくつかの実施形態では、このステップの実行は、サブモジュールの選択および組み立てを助けるためのモチーフおよび／またはサブ回路のモデリングを含むことができる。
（２）当業者によって同一視することのできるアプローチに従って、これらの分子成分のサブセットを試験し、提供するために遺伝学的分子成分または細胞成分を物理的に作製することによって、回路またはサブ回路を構築する。例えば、回路の１つまたは複数の遺伝学的成分を提供する際に、遺伝子構成要素が既存のプラスミドまたは他のベクター上に既に存在する場合、そのようなプラスミドまたはベクターを直接使用することができる（例えば、図２２、リプレッシレーターを直接試験した場合）。そうでなければ、好ましくは実施例４５～４６に記載の方法、迅速線状ＤＮＡアセンブリを用いて遺伝学的成分のサブコンポーネント（プロモーター、コード配列、ＵＴＲ、ターミネーターなど）を作製し、一緒に組み立てることができる。
（３）回路またはサブ回路を試験する。構築されたＤＮＡまたは他の核酸のピースおよび／または遺伝子成分のタンパク、並びに少なくとも１つのレポート可能な分子成分を含む回路の細胞分子成分は、無細胞システム内で実行される。例えば、回路の分子成分は、［１５］に概要が記載される方法に沿って、チューブ、３８４ウェルプレート、定常状態システム、または他のシステムでは、遺伝学的および／または細胞分子成分並びに関連するポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝産物のセットを提供することにより、ＴＸ‐ＴＬシステムで実行することができる。図２３のＢに概略が記載される例示的な実施形態においては、ｐＰｈｌＦ‐ＳｒｐＲ、ｐＳｒｐＲ‐ＢｅｔＩ、ｐＢｅｔＩ‐ＰｈｌＦおよびｐＰｈｌＦ‐ＣｉｒｔｉｎｅレポータープラスミドをコードするプラスミドＤＮＡは、試験される実際のＤＮＡであり、例示的な実施形態は、図２３のＣで説明され。３つの個々の直鎖ＤＮＡは、それぞれが、ｐＴｅｔＲ‐ＰｈｌＦ、ｐＰｈｌＦ‐ＳｒｐＲ、およびｐＳｒｐＲ‐ＴｅｔＲ並びにｐＴｅｔＲ‐Ｃｅｒｕｌｅａｎプラスミドをコードすることが、実際に試験されたＤＮＡである。図９に説明される例示的な実施形態では、物理的なＤＮＡは、分子成分３ＯＣ１２ＨＳＬ（変化量で）およびＩＰＴＧと関連して使用され、プラスミドｐＬａｃ‐ｌａｓＲおよびレポータープラスミドｐＬａｓ‐ｄｅＧＦＰの時間の経緯による曲線を生成する。
（４）回路またはサブ回路をデバッグする。この工程は、回路またはサブ回路が期待されるように実行されない場合に行うことができ、非機能的部分と機能的部分のスイッチングを伴い、あるいは、そうでなければ、回路の機能的な変異体が検出されるまで回路の構造の変化を伴う。例えば、図２３Ｄに説明される例示的な実施形態では、奇数のリプレッサーがオシレーションアウトプットを作成するために必要とされるものがこれまでに知られているものでない場合には、（４）ナンバーのリプレッサーですら試験するが、結果はオシレーションアウトプットに対するスイッチ様挙動を示す。この特定された制限に基づいて、試験のための奇数を有するように、回路が再設計される。
回路の分子成分の試験の追加の組み合わせ、および／またはその組み合わせ、および／または関連するセットのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／または代謝生成物、本明細書に記載される遺伝子回路を構築および／またはデバッグする方法による遺伝子回路の変異体の提供は、本開示を読んだ当業者により同一視することができる。
例えば、上記の方法に従う生体分子回路のプロトタイピング（試作）およびデバッグの基本的なワークフローを表すフローチャートを示すさらなる例示的なアプローチが図７に示されている。このワークフローは、モデル、無細胞発現システムおよび生体内回路、ならびに設計、構築、試験および再設計の工程の組み合わせを含む各サイクルの「設計、構築、試験」（ＤＢＴ）サイクルとも呼ばれる。図７に示すフローチャートは、遺伝的回路の試験および変異体の例示的な統合を表し、本開示の方法がどのように実施され得るかの例示的説明を提供することを実証する。
図７の図では、ステップ１において、いくつかの可能な形態のうちの１つで回路を表現するモデルが提供される。（ａ）ノードおよびエッジからなるグラフ表示であって、ノードが分子および／遺伝学的成分を示し、エッジはパーツ間の相互作用の阻害、活性化、結合、または変換を表し、（ｂ）回路の動作を記述した一連の数式、または（ｃ）シミュレーションデータまたは回路の予測されるアウトプットの他の表示を得るために使用することができる計算モデル（コンピュータアルゴリズム）。モデルのすべての用途は、回路が外因性入力および細胞内に存在する他の成分（分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）とどのように相互作用するかを含む、回路の所望の操作の説明を熟練した設計者に提供する。モデルのすべての用途は、回路が外因性入力および細胞内に存在する他の成分（分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）とどのように相互作用するかを含む、回路の所望の操作の説明を熟練した設計者に提供する。モデルのすべての用途は、回路が外因性入力および細胞内に存在する他の成分（分子、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質）とどのように相互作用するかを含む、回路の所望の操作の説明を熟練した設計者に提供する。モデルを使用して、熟練したエンジニアは、所望の機能を実現する回路を設計することができる。ステップ１の出力は、お互いに、そして機能を実行するためにセル内で利用可能な分子と相互作用するノードのセットからなる概念的な設計とすることができる。これらの部分に加えて、回路は、成分が相互作用する細胞または細胞の環境中に存在する追加の分子種をさらに含むことができる。
図７の例示的な概略図に示される方法のステップ２では、個々のノードが構築される。ＤＮＡのde novo合成、天然生物由来のＤＮＡの従来のクローニング、または様々なＤＮＡアセンブリ技術（Ｇｉｂｓｏｎ、Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅなど）を使用して個々のノードを構築する（組み込む）には、多くの方法がある。回路の迅速な組み立てに使用できる一連の「コネクタ」とともに、コンポーネントのライブラリ（プロモーター、RBS、コーディングシーケンス、ターミネータ）を構築するために特定の方法が使用される。
図７の例示的な概略図に示された方法のステップ３では、個々の部品がいったん構築されると、回路または経路に一緒に組み立てられたときにそれらがどのように機能するかを理解することが特徴付けられる。これらの部品の特徴付けは、回路内で使用されるノードの単一のノードまたはより大きなサブセットのいずれかが無細胞発現システムに導入される無細胞アッセイを実行することによって行われる。図７の例示的な方法に従ってパーツを特徴付けることができる。
ステップ３．１において、そのパーツを表す１つ以上の直鎖またはプラスミドＤＮＡ断片を、容器中の無細胞抽出物およびエネルギー緩衝液（試験管、マイクロタイタープレート上のウェルなど）と組み合わせる。直鎖ＤＮＡを使用することにより、迅速なプロトタイピングが可能になる。
ステップ３．２では、追加の化学薬品を容器に加えて、パーツが特徴づけられる異なる条件を確立することができる。例えば、誘導因子（インデューサ）は、リプレッサータンパクの機能を特徴付けるために異なる濃度で添加されてもよい。
ステップ３．３では、容器をある温度に加熱し、所定の時間インキュベートする。
ステップ３．４では、光学アッセイ（吸光度または蛍光）、化学アッセイ（質量スペック）または他の分析技術を用いて測定を行う。
ステップ３．５では、前の２つのステップが特定のレートで一定の時間反復される。
個々のノード上の測定結果が図７の例示的な図のステップ１の数学的モデルと一致しない場合、ステップ３からのデータは数学的モデルを改善するために使用され、ステップ１はこれらの改良されたモデルを用いて繰り返される。
図７の例示的な概略図に示された方法のステップ４では、個々のノードが特徴づけられると、それらを組み合わせて設計回路またはサブ回路（すなわちモチーフ）を形成することができる。ステップ４の組み合わせは、以下のサブステップによって行うことができる。
ステップ４．１では、各部分の特定濃度を抽出物および緩衝液を含む容器中で混合する。さまざまな濃度の異なる部分を使用して、試験される変異体のコレクションを作製することができる。
ステップ４．２～４．５は、前述のステップ３．２～３．５と同様である。
オプションのステップ４ａでは、回路をコンピュータを用いてテストすることができる。ステップ３の特徴づけられたパーツをインプットとして使用し、設計回路またはサブ回路を形成するためにパーツの異なる配合をコンピュータを用いてシミュレートするインシリコアプローチを使用することができる。これは、インビトロで得られる知見を反映するために最も正確に行われる。インシリコツールボックスは、インビボで回路の予測機能に関するデータを提供することもできる。
図７の模範図に示す方法のステップ５では、ステップ４からのデータを用いて、回路の性能が、データを分析し、一緒に組み合わされてステップ１で設計された機能を実行するときに、どのパーツを組み合わせ、どれくらいの相対的濃度とするのかを決定することにより特徴づけられる。
図７の例示的な方法のステップ５の終了時に、単一のＤＢＴサイクルが完了する。この段階で、回路が設計どおりに動作しない場合は、ステップ５および前の手順のデータを使用して回路を再設計し、ワークフローの前の手順に戻る。
図７の例示的な方法のステップ６では、ブレッドボードに設計された機能を提供するためにノードの特定の組み合わせが決定されると、ノードは、複数のノードが細胞と適合性のあるＤＮＡ断片上で結合されるように結合される。典型的には、回路は、適合性のある複製起点を有する１，２または３つのプラスミド上に集約される（例えば、細胞内で共存することができる）。この形態では、無細胞システム（ステップ６ａ）および細胞を用いたインビボでの（ステップ６ｂ）の両方を用いてインビトロで回路を試験することができる。例えば、以下のステップを使用して、目標環境（標的環境）の条件下で操作性を試験することができる回路のプラスミド形態を作製することができる。第１に、特定のノードは、インビボでマッチするためにインビトロで最も効果的であると決定された化学量論比となるように設計される。低発現が必要なものは低コピー数プラスミドに入れ、高発現を必要とするものは高コピー数プラスミドに入れる。プロモーターまたはリボソーム結合部位（ＲＢＳ）は、強度が変化し得る。次に、最終プラスミドが検証のために細胞に形質転換されるように、ノードを操作する。
目標環境の条件下での操作性のインビトロ検証（ステップ６ａ）は、以下のステップを実行することによって、図７に概略的に例示される例示的な方法で実行することができる。第１に、複数のノードを含むプラスミドまたは他のＤＮＡ配列の特定の濃度を、抽出物および緩衝液を含む容器中で混合する。２つ以上のＤＮＡ断片を使用する場合、異なるプラスミドの異なる濃度を用いて、試験される変異体の集合体を作製することができる。以下のステップは、前述のステップ３．２～３．５と同様である。
図７に概略的に示された例示的な方法のステップ６ａからのアウトプットは、無細胞環境において所望の条件下で回路の性能を測定するデータのセットである。これらのデータは、回路の所望の動作（図７のステップ１の設計およびモデルによって表される）と比較される。結果が同じ場合、回路はインビトロ環境で動作可能である。このステップのアウトプットがモデルと一致しない場合、ステップ６ａおよび前のステップのデータを使用して回路を再設計し、ワークフローの前のステップに戻る。ＤＢＴサイクルのいくつかの実施形態では、ワークフローは、この時点で、図７に概略的に例示されている例示的な方法のステップ１またはステップ５のいずれかに戻ることができる。
図７に示した例示的な方法における目標環境の条件下での操作性のインビボでの検証は、以下のステップを実行することによって実施することができる。第１に、細胞は、それらの外部環境から細胞の細胞質にＤＮＡを輸送できるように、化学的、電気的または熱処理される。第２に、１つまたは複数のプラスミド上にインスタンス化された回路を実現するＤＮＡを含むプラスミドが、処理された細胞の環境に導入される。第３に、細胞のいくつかの画分に１つまたは複数のプラスミドを細胞質に取り込ませる環境刺激（例えば、温度）の導入によって、プラスミドを細胞に形質転換する。第４に、所望の回路要素を含む細胞のみが分裂成長するように、増殖培地および抗生物質を含む容器に細胞を移す。以下のステップは、前述のステップ３.３～３.５と同様である。
図７に示す例示的な方法のステップ６ｂからのアウトプットは、セル内の所望の条件下で回路の性能を測定するデータのセットである。これらのデータは、図７の方法の所望の動作（ステップ１の設計およびモデルによって表される）と比較される。結果が同じ場合、回路はインビボ環境で動作可能である。このステップの出力がモデルと一致しない場合、ステップ６ｂおよび前のステップのデータを使用して回路を再設計し、ワークフローの前のステップに戻る。ＤＢＴサイクルのいくつかの実施形態では、ワークフローはこの時点でステップ１またはステップ５のいずれかに戻ることができる。
図７に概略的に示されているこの多段階プロセスの最後に、単一の実行（インプリメンテーション）反復が完了する。インビボ設定で回路が所望どおりに動作しない場合は、ステップ６および前のステップのデータを使用して回路を再設計し、ワークフローの前のステップに戻る。
いくつかの実施形態において、試験および提供する遺伝子変異体および関連するステップのうちの１つまたは複数は、コンピュータを用いて無細胞システムで実施することができる。特に、遺伝子回路を設計し、デバッグする方法の一部として、インシリコでステップを実行することができる。これらの実施形態のいくつかでは、遺伝子回路の変異体を試験しおよび／または提供することは、所望の回路設計を成分に分解することを含むインシリコ無細胞法の任意の集積化により実施することができ、インビトロで測定された対応する動的挙動にモデルのコンピュータシミュレーションの動的挙動を適合させることによって、各成分のインシリコモデルまたは成分の組み合わせを特徴付ける、回路設計の各成分についてのインビトロ無細胞生体分子ブレッドボードに存在する反応に対応する生化学的反応を含む計算モデルを作成し、適切なコンピュータアルゴリズムを用いた実験データからのパラメータの推定、このように特徴づけられたパーツのインシリコライブラリへの追加、様々な実験条件に対応するライブラリから引き出された成分の組成による完全回路のシミュレーション、回路の動的挙動のインシリコ予測をもたらす。次いでこの方法は、この挙動を同等のインビトロ実験データと比較し、これらの比較を使用してインビトロでの実施の操作をデバッグし、データおよび比較に基づいて遺伝的回路の成分を修正することを含む。
本開示の方法におけるインシリコ無細胞システムの使用を図４５に示し、以下の６つの工程を含む。
図４５の例示的な図に示される方法のステップ１は、回路をパーツに分解することを含む。このステップは、パーツの柔軟な定義によって、複数の方法で実行できる。パーツのために選択された定義は、パーツを異なる回路に構成することができ、パーツをインビトロシステムで機能させることによって各パーツの動作を特徴づけることができるように実行することができる。したがって、例えば、この文脈において、単離されたｔｅｔＲリプレッサータンパク質は、ｐＴｅｔプロモーターおよびレポータータンパク質とは独立した機能を有さないので、パーツの有用な定義を提供しない。ＩＦＦＬ回路（例えば図１１Ａ）が分解される５つのパーツが図５０に示されており、ここでは部分は、我々が行った特徴付け実験の文脈において定義されている。
図４５の例示的な図に示された方法のステップ２は、特徴づけられる各パーツのためのシミュレーション可能な微分方程式モデルを生成している。これらのモデルからの唯一の要件は、それらが各遺伝子または細胞の分子成分ごとに分離され、より大きな回路に構成可能であり、より大きな回路モデルもまたシミュレート可能であるということである。ＯＤＥモデルは、無細胞システムに存在する生化学的方程式に適用される質量作用化学反応速度論から導かれるように選択することができる。これらのモデルの生成は、この目的のために作成されたインシリコツールボックスを使用して実装できる（実施例２１～２６）。このツールボックスは、各パーツ、各パーツのモデルを特徴付けることができる（下記のステップ３および実施例２７～２８を参照）、実験条件の様々な変化の下でシミュレートできるより大きな回路に構成可能な個々のモデルを作成することを可能にする（実施例２９～３０）。
図４５の例示的な図に示される方法のステップ３は、各パーツの特徴付けであり、その後のライブラリーへの組み込みである。この特徴付けは、インシリコとインビトロの両方で実験条件の変化にパーツを適用し、インシリコ（モデル）の挙動をパーツのインビトロ挙動に適合させることを含む。フィッティング自体はパラメータ推定アルゴリズムを使用して実行され、全体的な手順は図５２に概説される。図７の文脈において、図５２は図７のステップ１から４を実施する。特に、モデルにはすでに初期パラメータが含まれており、これを使用してパーツと回路の初期シミュレーションを作成し（ステップ１）、これを使用して実験データ（ステップ３の下の菱形）と予備的な比較を作成し、図５２に示すように、反復プロシージャが図７のステップ３とステップ１との間の反復ループによって実施される。図４５に概略的に示されている方法のパラメータ推定の具体的な実行の１つは、図４５に概略的に示される方法のステップ２で作成されたモデルと組み合わされた組み込みパラメータ推定機能のＭＡＴＬＡＢ ＳｉｍＢｉｏｌｏｇｙを使用して実行することができる。いくつかの実施形態では、一部のパーツのパラメータを推定することによって、他のパーツに関する情報が必要であるという事実から生じるパラメータ推定手順に依存することがある。例えば、ｔｅｔＲ抑制強度パラメータが、ｐＬｅｔ－ｄｅＲＦＰを抑制する回路ｐＬａｃ－ｔｅｔＲを用いて特徴付けられる場合、ｐＬａｃおよびｐＴｅｔの構成的発現強度の知識が必要である。これらの依存関係は、特定の順序で特徴付けを実行することになる。このような順序の例が図５３に示される。パーツの特徴付け後、特徴付けされたパーツは、実施例２８に記載されているように、デジタルライブラリに記憶され、回路に合成するために必要なときに引き出される。この例では、これは、パーツを含む成分（コンポーネント）（例えば、プロモーター、リボソーム結合部位およびタンパク）のコードおよびパラメータファイルが格納され得るツールボックス内のフォルダに対応する。
図４５の例示的な図に概略的に示される方法のステップ４は、ＤＮＡまたは誘導物質分子濃度の変動などの様々な実験的摂動の下で、ステップ３からの成分およびパーツの完全回路への組み立ておよびシミュレーションである。これは、図７のステップ４ａに相当する。本実施例では、このステップはツールボックスによって実施することができ、図５５および実施例２９によって与えられる。
図４５の例示的な図面に概略的に示されるステップ５の方法は、様々な実験的摂動（例えば、ＤＮＡおよびインデューサー濃度変動）下での全回路挙動のシミュレーションを、インビトロでの対応する実験と比較することを含む。図４３と図４４は、この例の文脈において、このステップを示す。
図４５の例示的な図に概略的に示される方法のステップ６は、予測されるインシリコ挙動がインビトロ挙動と一致しない場合にシステムのデバッグを含む。これは実施例３０において詳述されている。定義したパーツや実験はより細かく分けて行う必要があるかもしれない。例えば、ＲＮＡをアプタマーでタグ付けすることにより、ＲＮＡの測定を可能にし、転写および翻訳のためのパラメータの特徴付けを別々に、おそらくより確実に可能にすることができる。もう一つの例は、レポーターを制御する制御プロモーターを含む混合物に、精製したレプレッサータンパクを添加することによって、抑制からレプレッサータンパクの産生を分離することである。これらのステップはすべて設計者側で大きな労力を要するが、エラーの原因を特定してより信頼性の高い回路の特徴づけを導く可能性がある。
試験、提供および／または検出のうちのいくつかがインシリコで実施されるステップまたはサブステップで実施され得る本開示の方法のさらなる実施が実施例に提供され、さらなる実施態様は、本開示を読んだ当業者により明らかにすることができる。
いくつかの実施形態では、、本明細書に記載の方法およびアレンジメントを用いて、目標環境で操作される遺伝子回路の無細胞システムの変化を試験することができる。いくつかの実施形態では、回路の特性評価または回路の機能を理解する目的で試験を実施することができる。いくつかの実施形態では、試験は、テキスト化合物の効果および／または回路の環境条件の変更を識別するために実行することができる。
これらの実施形態のいくつかでは、方法は、遺伝的回路の１つ以上の分子成分を、試験によって選択された１つ以上の分子成分で置換することによって、および／または遺伝的回路に、試験によって選択された１つ以上の分子成分を添加することにより、遺伝子回路のバリエーションを提供することを含むこととしてもよい。例えば、回路のバリエーションを提供することは、異なるタンパク変異体、タンパク変異体を説明するために、回路の分子成分を形成するかまたは含む１つのポリヌクレオチドを変化させることによって行うことができる。これらの実施形態のいくつかにおいて、１つのポリヌクレオチドの変異体は、実施例４９～５９に適用されるバイオインフォマティクスまたはコンビナトリアルライブラリーから同定され、次いで、別個の無細胞混合物中の遺伝子回路に関して個別に試験され得る。次いで、回路の所望の機能に基づく所望の変種を選択することができる。
遺伝子回路のバリエーションを試験する方法のいくつかの実施形態では、変異体は、遺伝学的分子成分（例えば、遺伝子またはＲＮＡ）のパーツを別々の断片（例えば、コード領域および１つまたは複数の調節領域）に分解することによって提供することができ、実施例４５～４８に示すように、設定した方法でピースを再結合し、ピースの異なる組み合わせによってそれぞれ形成された複数の変異体を提供する。例えば、試験される物理的ＤＮＡの複数の変異体を生成することを可能にするためには、物理学的ＤＮＡをサブユニット（プロモーター、ＵＴＲ、コード配列、ターミネーター）に分解することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子回路のバリエーション、遺伝子回路の変異体を試験する方法は、例えば、転写単位（例えば、プロモーター）または翻訳単位（例えば、ＲＢＳ）を例えば変化させることにより、行われるタンパク産生レベルを調節することにより提供され、また、方法は、反応において提供される遺伝学的成分の濃度を物理的に変化させることによってタンパク産生を変化させることも含む。これは、転写単位または翻訳単位の変化をエミュレートする役目を果たすが、他の点ではインビボ目標環境では不可能であるが、インビボ設定では可能であるタンパク質濃度の迅速な調整を可能にする。例えば、感受性分析を示す図４３および４４並びに実施例１７および１８において、ｔｅｔＲ産生、ｄｅＧＦＰ産生またはｌａｓＲ産生プラスミドＤＮＡのＲＢＳまたはプロモーターを修飾する代わりに、プラスミドＤＮＡ自体が変化し、レポートエレメントにおいて得られる反応が測定される。これにより、ｔｅｔＲ、ｄｅＧＦＰ、またはｌａｓＲの効果を試験するために新たな遺伝学的成分を構築する必要がないため、大幅な時間を節約することができる。結果をインビボの目標環境に変換する場合、対応する弱い、中程度のまたは強いＲＢＳをそれぞれ低、中、または高ＤＮＡ濃度の代わりに入れることができる。これは、インビトロ実験がｌａｓＲプラスミドＤＮＡを変化させることによって行われた図１６および実施例３２において実証されているが、インビボでの等価物は、ＢＣＤを弱ＢＣＤ２２から中ＢＣＤ２０から強ＢＣＤ２に変化させることによるものである。変換は、成分が置かれるプラスミドコピー数を変えることによっても生じさせることができる。これは図４３および図４４に示されており、実施例１７および１８はｔｅｔＲ、ｄｅＧＦＰまたはｌａｓＲのＤＮＡ濃度を変化させる実験から得られたものであり、この回路はｔｅｔＲに対して非常に感受性があるがｄｅＧＦＰに対してはリニアであり、したがって、インビボで翻訳する場合、ｔｅｔＲ産生プラスミドを低コピーｐＳＣ１０１に入れ、一方ｄｅＧＦＰを実施例１０および１１の高コピーｃｏｌＥ１に入れる。当業者は、ＤＮＡエレメントの濃度を増加させることによって導入される（またはエレメントを改変する）図２２Ａ～Ｃに見られるように、オペレーター部位の不一致の可能性があることを認識し、それに応じてインビトロまたはコンピュータを用いて回路予測を調整することにより、または追加のオペレーター部位を加えることにより、このミスマッチを補うことができる。
遺伝子回路のバリエーションを試験する方法のいくつかの実施形態では、遺伝子回路の変異体は、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝生成物のセットの１つまたは複数のパラメータまたは特性を修正することにより提供され得、レポータータンパクの転写活性および／または翻訳活性の得られた変化をモニタリングする。特に、改変することができるポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝物のセットの１つまたは複数のパラメータまたは特性には、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝生成物の濃度、調節およびレポート分子成分を構成するポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの配列、システムの温度、緩衝液条件、およびレポータータンパクの発現レベルに影響を及ぼす可能性がある他の因子を含む。これらの実施形態のいくつかでは、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝生成物の組み合わせた２つ以上のセットの１つまたは複数のパラメータまたは特性を変えることができ、レポーターの転写レベルまたは翻訳レベルの発現の得られる変化を監視および検出することができる。
遺伝的回路のバリエーションを試験する方法の実施形態では、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝生成物の濃度、および、レポータータンパク質の発現レベルに影響を及ぼすことができる調節およびレポート分子成分並びに他の因子を構成するポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの配列を含むポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝生成物のセットの１つまたは複数のパラメータまたは特性を改変することができる。
遺伝子回路のバリエーションを試験する方法のいくつかの実施形態では、遺伝子回路の変異体を提供することは、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝生成物の単一のセットの試験および特徴付けによって実施され得、インデューサーおよび酵素のような無細胞システム結合分子へと添加することをともない、レポータータンパク質の転写活性および／または翻訳活性の得られた変化をモニターする。小分子は、遺伝的構成要素を一定に保つという文脈で回路の機能を変えるために頻繁に使用される。例えば、実施例３１では、ａＴｃ濃度を変化させることによってｔｅｔＲ抑制の活性が調整され、したがってレポートエレメントの強度およびパルス持続時間がシフトするが、実施例１４の３ＯＣ１２濃度を変化させると、ｌａｓＲ活性化の活性が調整され、レポートエレメント強度も変化する。小分子は、ユーザによって提供されないが系に先立つ内因性タンパク質に作用することもできる。例えば、図９Ａ～Ｆ（インビトロ）および図１１Ａ～Ｇ（インビボ）において、ＬａｃＩ遺伝子の機能的コピーを保持する株から作製された無細胞混合物である。この例では、内因性のＬａｃＩは遺伝子回路の性能に影響を及ぼす可能性がある。従って、ｐＬａｃＯ１を有するユーザ提供の遺伝的構成要素が抑制されないように、ＩＰＴＧを提供して内因性のＬａｃＩを捕捉することができる。ＩＰＴＧの添加は、例えば、目標環境がｌａｃＩノックアウト株であるが、使用される無細胞混合物がｌａｃＩを有する場合に提供することができる。ＩＰＴＧは最終目標環境のより良いエミュレーションを可能にする。
遺伝子回路のバリエーションを試験する方法のいくつかの実施形態では、遺伝子回路の変異体を提供することは、インビトロでの発現に影響を及ぼす分子成分またはパラメータを改変することによって実施することができ、大腸菌Ｓ３０無細胞混合物における内因性エキソヌクレアーゼによる直鎖ＤＮＡカセットの分解から保護するために、実施例４２～４３に示されるｇａｍＳのような精製されたタンパクを含む。内因性エキソヌクレアーゼをブロックすることにより、ｇａｍＳを加えることで、プラスミドＤＮＡ遺伝子成分とは対照的に、直鎖ＤＮＡ遺伝子成分に遺伝的回路をコードすることができ、インビトロでのプロトタイピングにかかる時間を節約する。図２２Ｄでは、遺伝的回路に直接影響を及ぼす精製タンパク質を添加することもできる。この場合、インビトロでオシレーション（振動）を維持するオシレータ（振動子）の性能を試験するために、精製されたタンパク質量の遺伝子成分ｌａｍｂｄａＣＩ、ｔｅｔＲおよびｌａｃＩを反応に添加して人工的に１軸で反応を開始させ、回路の得られる反応が観察される。これらの成分は、別々に精製され、実施例４２のＴＸ－ＴＬに適合する緩衝液中に保存するか、または別個のＴＸ－ＴＬ反応で予め作製してから新しい反応に添加することができる。図５６のようなｓｓｒＡタグ付きタンパク質の分解を促進するために、ＣｌｐＸなどのさらなるタンパク質を反応に添加することができる。これは、系中の利用可能なタンパク質量を減少させる効果を有し、無細胞混合物の希釈を有さない系においてタンパク質濃度を減少させる唯一の実質的な方法である。
遺伝子回路のバリエーションを試験する方法のいくつかの実施形態では、インビトロ発現に影響を及ぼすことができるＤＮＡおよびＲＮＡなどのポリヌクレオチドを混合物に添加することによって、遺伝子回路の変異体を提供することができる。例えば、反応の途中で、タンパクがインビボ産生タイミングをエミュレートするために特定の順序で時間調節される場合、さらなるタンパク質をコードするＤＮＡを添加することができる。さらに、遺伝子成分を活性化または抑制することができる精製ＲＮＡを添加することができる。
遺伝子回路の変異体を試験する方法のために示された遺伝子回路のバリエーションを提供する様々な実施形態は、当業者に理解されるように、遺伝子回路を構築および／またはデバッグする方法においても使用され得る。
ある実施形態では、遺伝子回路のバリエーションを試験する方法のうち、変化させた回路の操作性は、本明細書に記載の遺伝的回路を構築および／またはデバッグするために、方法において実施される試験と同様の方法で、回路が回路設計に従って動作するときに検出可能なレポート可能な分子成分を検出することによって試験することができる。
いくつかの実施形態では、レポート可能な分子成分の検出は、回路の他の分子成分によって制御され、転写レベルでモニターされるレポート可能な分子成分の発現を試験することによって行うことができる。特に、遺伝子発現の転写レベルは、異なる強度を有する調節配列（異なる強度を有するプロモーターなど）によって制御することができ、遺伝子回路の変異体またはその一部が提供される方法において、提供は、これらの調節配列、および／または転写制御因子の発現レベル、並びに、転写調節因子とレポータータンパク質をコードする遺伝子の調節配列との間の相互作用を改変することによって行うことができる。例えば、実施例５の手順を参照すると、タンパクの転写産物がｐＬａｓプロモーターの５つの変異体によって制御され、これらの変異体は異なる量のタンパク質が産生され、インビボでのプロモーター当たりのタンパク質の量にほぼ対応する、ＴＸ－ＴＬにおけるプロモーター当たりのタンパク質の量がもたらされる。したがって、プロモーターユニットを変化させることができ、インビトロ、インビボおよびインシリコでのタンパク産生の対応する相違を予測することができる。本開示では、先験的に、特定の転写強度を有するプロモーターを設計することは当業者には困難であるが、実験的に割り当てられたインビトロ混合物またはインビボの目標環境および強度でプロモーターを試験することができることに留意されたい。
いくつかの実施形態では、レポート可能な分子成分の検出は、翻訳レベルで回路の他の分子成分によって制御されるレポート可能な成分の発現の検出によって行うことができる。特に、タンパク発現の翻訳レベルは、様々なＲＢＳ結合効率を有するＲＢＳ配列を用いることによって制御することができる。したがって、遺伝子回路の変異体またはその一部が提供される方法において、提供は、ＲＢＳを改変することによって翻訳レベルでタンパク発現を改変することによって行うことができる。翻訳レベルでタンパク質を制御することができる追加の例示的な分子成分には、リボレギュレーター［７］などの小ＲＮＡ法、またはアンチセンスＲＮＡ［３０］のような天然の方法、または小分子干渉［３１］、および当業者により同一視することのできる追加の成分を含む。
遺伝子回路のバリエーションを試験する方法の実施形態では、この方法はまた、１つ以上の分子成分の試験を反復すること、および無細胞システムにおいて、目標環境で作用される変化させた遺伝子回路を提供するための遺伝子回路のバリエーションを提供することを含む。
本明細書に記載される遺伝子回路を設計、構築、実行、デバッグおよび／または試験する方法のいくつかの実施形態では、目標環境は２つ以上の目標環境を含み、回路の変異体および／または検出を提供する試験は、当業者には理解されるように、２つ以上の目標環境の異なる目標環境が含まれる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子回路を設計、構築、実行および／または試験する方法を用いて、遺伝子回路の無細胞プロトタイピングを行うことができる。「無細胞プロトタイピング」という用語は、目標環境で操作することができる遺伝子回路を作製するために必要な無細胞生体分子ブレッドボードを使用して、設計、構築、試験およびデバッグ操作を実施するために必要な技術の組み合わせを示す。特に、本開示の意味における例示的な無細胞生体分子ブレッドボードは、モデル、無細胞発現システムおよびインビボ生物学的環境の組み合わせを含む「設計、構築、試験」（ＤＢＴ）サイクルを実施するために必要な成分を含む。
本明細書中に記載される実施形態において、分子成分、それらの組み合わせ、および／またはポリヌクレオチドポリペプチドおよび／または代謝産物の関連するセットは、無細胞混合物または他のデバイス、ツール、プロトコールおよび組成物と共に、無細胞システムにおいて構築および／またはデバッグするための１つ以上のアレンジメント、目標環境で作用される遺伝子回路、および／または目標環境において作用する遺伝子回路のバリエーションを試験するための１つ以上のアレンジメントにおいて、提供されることとしてもよい。
いくつかの実施形態では、アレンジメント（配置、装置）は、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝産物の各セット、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝産物の各セットの組み合わせを含むことができ、本開示の遺伝子回路を構築および／またはデバッグするための方法にしたがって、遺伝子回路の１つのノードを形成するレポート分子成分を、単一の無細胞混合物中に含む場合に提供することができる。
いくつかの実施形態では、このアレンジメントは、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝生成物の各セットの組み合わせを含み得、各セットの組み合わせは、単一の無細胞混合物に含まれる場合に、本開示の方法に従って構築されるおよび／またはデバッグされる遺伝子回路のレポート可能な分子成分を提供することができ、少なくとも１つの試薬が遺伝子回路の変化、特に遺伝子回路の分子成分の少なくとも１つのバリエーションを実行することができる。
いくつかの実施形態では、アレンジメントは、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝生成物の各セットの組み合わせを含み、選択されたポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝生成物の各セットの組み合わせは、本開示の遺伝子回路を構築および／またはデバッグするための方法に従って構築された遺伝子回路を形成するレポート可能な分子成分を、単一の無細胞混合物中に含む場合に提供することができる。このアレンジメントは、本開示による遺伝子回路の変異を試験する方法における同時、組み合わせまたは逐次使用のためのさらなる分子成分を提供する、ポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／または代謝生成物の少なくとも１つののセットをさらに含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるアレンジメントは、インビトロで無細胞生体分子ブレッドボードに存在する反応に対応する生化学反応を含む計算モデル、インビトロで収集される実験データにモデルを適合させることによりパラメータを予測するためのアルゴリズムおよびインストラクションのセット、全回路へとコンピュータを用いて特徴づけられたパーツを構成するためのアルゴリズムおよびインストラクションのセット、を生成し、その後、これらの実験データのもとで予測を得るために種々の実験的な摂動のもとで回路のシミュレーションを行い、インビトロでの実験データに対するインシリコ予測をプロットするためのインストラクションをセットする、１以上のインシリコツールボックスを含むことができる。
いくつかの実施形態では、アレンジメントは、カスタマイズされたキットが回路（例えば、第三者から提供される）をプロトタイプ化するための遺伝子および分子成分のカスタマイズされたキットであることとしてもよく、キットは遺伝子回路をプロトタイピング（プロトタイプ化）を行うのに必要な遺伝学的成分またはサブコンポーネントを構成し、生体分子ブレッドボードおよびその関連方法を利用している。このアレンジメントは、（１）回路を動作させるために必要なすべての遺伝学的成分、および（２）成分に対する相同体、（３）個々のサブパートおよび相同体、および（４）当業者が必要とする一連の「標準的なパーツ」、例えば、プロモーター（例えば、恒常的プロモーター、誘導性プロモーター、および抑制性プロモーター）、リボソーム結合部位（例えば、ＢＣＤ、ＲＢＳ、ＭＣＤ、ＲＢＳ）、コード配列および／またはＲＮＡ調節配列（例えば、転写活性化因子、転写抑制因子、翻訳活性化因子、翻訳阻害因子、蛍光レポーターおよび吸光度レポーター）、並びにターミネーター（例えば、Ｔ５００、Ｂ１００２、合成ターミネーター、および天然ターミネーター）を含む、生体分子ブレッドボードを用いてプロトタイプ化される回路に基づいた、遺伝学的成分の十分に定義されたサブセットを有する。このアレンジメントはまた、生体分子ブレッドボードを使用してプロトタイプ化される回路に基づいた分子成分の定義されたサブセットを有することができ、これは回路に既に存在する全ての小分子インデューサと、当業者に十分に知られる標準的なセットをプラスする（例えば、ａＴｃ、ＩＰＴＧ、３ＯＣ６ＨＳＬ、３ＯＣ１２ＨＳＬ、アラビノース、Ｃ４ＨＳＬ）。キットは、本明細書に記載の方法の試験、提供および接触および／または構築を行うのに必要な他の遺伝子および分子成分をユーザが補うことができる。
いくつかの実施形態では、このアレンジメントは、個々の部分およびそれらの反応ならびに反応が知られている遺伝子のパーツを含み、インビトロ混合物に加えて、反応をモデル化して仮想的に実行することができるインシリコ混合物を含むことができる。このインシリコ混合物には、第三者が要求する成分が予め充填されているため、第三者がインシリコ混合物を利用してそれらの遺伝的回路を設計し、インビトロでの混合物の知見を検証することができる。
いくつかの実施形態では、このアレンジメントは、目標環境をターゲットとする複数のインビトロ混合物を含み得る。それらの実施形態のいくつかにおいて、複数のインビトロ混合物は、異なる生物（例えば、大腸菌、他の原核生物および真核生物）、同じ生物に由来するが異なる株の複数のインビトロ混合物（例えば、大腸菌ＭＧ１６５５、大腸菌ＢＬ２１、大腸菌ＢＬ２１ＤＥ３、大腸菌ＭＧ１６５５Ｚ１、および大腸菌ＫＬ７４０）、同じ生物および同じ株由来の複数のインビトロ混合物であるが、異なる目標環境（例えば、高ｐＨ、放射性標識されたアミノ酸または代謝生成物の存在、および非天然アミノ酸の存在）で最適化されている、または当業者によって同一視することのできる他のインビトロ混合物を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、インビトロ混合物は、バッチモード反応、連続的定常状態反応、凍結乾燥反応、液滴マイクロ流体反応、透析カセット反応および当業者によって同一視することのできる他の最終使用環境のような、異なる最終使用環境で提供されることとしてもよい。
このアレンジメントの例は、本明細書に記載の方法に従って、実施例６～１１のフィードフォワードループを構築、実装、デバッグまたは試験するために使用できるものである。この例によれば、キットは、
－回路を生成するＤＮＡの各特定のピース（断片）、例えば、ｐＣａｓ－ｌａｓＲ、ｐＬａｓ－ｔｅｔＲ、ｐＬａｓ－ｔｅｔＯ－ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ、ｐＣｒａ－ａｒａＣ、ｐＡｒａＣ－ｌａｃＩ、ｐＡｒａＣ－ｌａｃＯ－ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ、ｐＬａｓ－ｌａｃＩ、ｐＬａｓ－ｌａｃＯ－ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ、ｐＡｒａＣ－ｔｅｔＲ、ｐＡｒａＣ－ｔｅｔＯ１－ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ、および当業者によって同一視することのできる他のもの；
－実施例４５～４８の方法によって組み立てることができる別個の部品として提供される制御要素、例えば、ｐＣｏｎｓｔ、ｐＬａｓ、ｐＡｒａＣ、ｐＬａｓ－ｔｅｔＯ、ｐＬａｓ－ｌａｃＯ、ｐＡｒａＣ－ｔｅｔＯ、ｐＡｒａＣ－ｌａｃＯ、ｐＴｅｔ、ｐＬａｃ；ＵＣＤ１、ＢＣＤ２、ＢＣＤ７、ＢＣＤ１１、ＢＣＤ１３、ＢＣＤ１２、ＢＣＤ１４、ＢＣＤ２０、ＢＣＤ１６、ＢＣＤ２４、ＢＣＤ２２、Ｂ００３０、Ｂ００３１、Ｂ００３２、Ｂ００３４；ｌａｓＲ、ａｒａＣ、ＴｅｔＲ、ＬａｃＩ、ｄｅＧＦＰ、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ、ｍＲＦＰ、ｍＲＦＰ－ｓｓｒＡ、ｌａｓＲ－ｓｓｒＡ、ａｒａＣ－ｓｓｒＡ、ＴｅｔＲ－ｓｓｒＡ、ＬａｃＩ－ｓｓｒＡ；Ｔ５００、Ｂ１００２、当業者によって同一視することのできる他のもの；および
本明細書に記載の1つまたは複数の方法によるｌａｓＲまたはａｒａＣアクチベーターおよびｔｅｔＲまたはｌａｃＩリプレッサーに基づく、大腸菌における制御メカニズムとしての構築パルスジェネレーターのためのインストラクションを典型的に有する標準的なパーツを含む。
本明細書に記載の方法に従って実施例６～１１のフィードフォワードループを構築、実施、デバッグまたは試験するために使用することができるキットの例示において、キットは、ａＴｃ、ＩＰＴＧ、アラビノースなどの分子成分および標準的な分子成分も含むことができる。インシリコ混合物には、各遺伝学的成分の活性のダイナミックスが予めロードされていてもよい。インビトロ混合物は、典型的には目標環境に依存して含まれる。例えば、遺伝子回路が大腸菌で作用される場合、大腸菌から作製された標準的なＴＸ－ＴＬを、単独で、またはその株の変異体とともに（例えば、ｌａｃＩノックアウトおよび／またはＴ７発現株）を含むこととしてもよい。目標環境がインビボである場合、キットの成分は、バッチモード反応または継続的な定常状態システムでの使用のために提供されることとしてもよい。
インビトロ混合物が異なる最終使用環境で提供され得るこのアレンジメントの別の例は、実施例４９～５９のアレンジメント代謝経路の例を構築、実施、デバッグまたは試験するために使用され得るキットである。この例によれば、キットは、
－回路を生成するＤＮＡの各特定のピース、例えば、ｐＣｏｎｓｔ－ｖｉｏＡ、ｐＣｏｎｓｔ－ｖｉｏＢ、ｐＣｏｎｓｔ－ｖｉｏＥ、ｐＣｏｎｓｔ－ｖｉｏＣ、ｐＣｏｎｓｔ－ｖｉｏＤ、および当業者によって同一視することのできる他のもの、
－実施例４５～４８の方法によって容易に組み立てることができる別個の部品として提供される制御エレメント、例えば、ｐＣｏｎｓｔ（例えば、ｐＪ３１５１、ｐＴ７、ｐＴ４、ｐＯＲ２１Ｐｒ）、ＵＣＤ１、ＢＣＤ２、ＢＣＤ７、ＢＣＤ１１、ＢＣＤ１３、ＢＣＤ１２、ＢＣＤ１４、ＢＣＤ２０、ＢＣＤ１６、ＢＣＤ２４、ＢＣＤ２２、Ｂ００３０、Ｂ００３１、Ｂ００３２、Ｂ００３４；ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＥ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤ；Ｔ５００、Ｂ１００２；
－本明細書に記載される１つ以上の方法に従って、代謝経路を構築するためのインストラクションを有する典型的な標準的なパーツ、（例えば、エンドヴィオラセイン生成物の産生を最適化することを目的とする）を含む。
実施例４９～５９のヴィオラセイン代謝経路の例を構築、実施、デバッグ、または試験するために使用され得る例示的なキットにおいて、キットは、回路の分子成分、この場合には、トリプトファン、ＩＰＡ、ＣＰＡ、プロデオキシビオラセイン、デオキシビオラセイン、プロビオラセイン、ヴィオラセイン、並びに標準分子成分のような経路中間体を含むことができる。インシリコ混合物には、各遺伝学的成分の活性のダイナミックスが予めロードされていてもよい。含まれるインビトロ混合物は典型的には目標環境に依存する。例えば、遺伝子回路が大腸菌で操作されることを意図している場合、大腸菌から作製された標準ＴＸ－ＴＬを単独で、または株の変異体とともに（例えば、ｌａｃＩノックアウト、Ｔ７発現株、小分子産生のために最適化された株）、またはＴＸ－ＴＬの条件で（例えば、より塩基性または酸性、または高ＯＤでの産生のために最適化される）含まれることとしてもよい。目標環境が、スケールアップのためのインビボ目標環境である場合、キットの成分は、バッチモード反応または継続的な定常状態システムの使用のために提供されることとしてもよい。目標環境がインビトロ目標環境である場合、キットの成分は、最大の生産を達成するために酸素をポンプで注入して、大きなバイオリアクターを利用する無細胞システムでの使用のために提供することができる。
本開示の更なる効果及び特徴は、実験的な部分のみを参照して説明することにより、以下の詳細な開示から、より明らかになるであろう。
実施例
本明細書に記載の試験およびデバッグのための生体分子ブレッドボードおよび関連する方法およびシステムを、以下の実施例でさらに説明するが、これらは例示として提供され、限定することを意図したものではない。
特に、以下の実施例は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのセットを調製するための例示的な方法およびプロトコル、ポリヌクレオチドおよびポリペプチドのこれらのセットの試験および特徴付け、遺伝子回路の構築、および遺伝的回路の試験およびデバッグを説明する。当業者は、本開示の実施形態による追加の遺伝子回路および生体分子ブレッドボードならびに関連する方法およびシステムに、本セクションで詳細に記載された特徴を適応させるための適用性および必要な改変を理解するであろう。
インビボ系統の調製および試験：インビボでのアッセイのために、プラスミドをコンピテント細胞株に化学的に形質転換した（ｃｏｌＥ１／ｃａｒｂＲ、ｐＳＣ１０１／ｋａｎＲ、ｐ１５Ａ／ｓｐｅｃＲ）［３２－３４］などの適合性のあるベクター上にクローニングする。
この細胞株は、例えば、ｍｉｎｉＦ／ｃｍＲ（ＥｘｐｒｅｓｓＩＱ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）上のｌａｃＩＱを担持するＢＬ－２１由来発現株、またはインビトロ目標環境のために繁殖可能な別の株であり得る。典型的な単一株アッセイのために、使用前に抗生物質耐性寒天プレート上で細胞を選択する。典型的なマルチパネルアッセイでは、ＳＯＣ培地（Ｓｉｇｍａ）中で２９℃で２時間後に細胞を回収し、種に対する抗生物質（例えば、ｃｍＲ、ｋａｎＲ、ｃａｒｂＲ、およびｓｐｅｃＲ、１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、１００μｇ／ｍＬカルベニシリン、および１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンに対して耐性である場合）を含む、１．２５％希釈に希釈したＭＯＰＳ－ＥＺリッチ（Ｔｅｋｎｏｖａ）０．４％グリセロール選択培地で増殖させ、－８０℃で保存した。典型的なインビボアッセイを行うために、細胞を同じ選択的ＭＯＰＳ培地中で２９℃でステーショナリーな段階まで増殖させる。次いで、以前に使用された半抗生物質濃度を有する９６ウェルＭａｔｒｉＰｌａｔｅｓ（Ｂｒｏｏｋｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において、細胞を１ウェルあたり５００μＬに１％希釈する。３つの（Ｂｉｏｔｅｋ Ｈ１／ＭＦ）のような複数のプレートリーダーが使用される場合、これらは蛍光強度および吸光度について較正される。リニア連続振とうモード下で、レポート成分（例えば、ｄｅＧＦＰ、４８５ｎｍ／５１５ｎｍのゲイン６１および１００）およびＯＤ６００ｎｍについて、６分ごとにプレートを測定した。ＯＤ０．１～０．２において、細胞は、適切な誘導物質（インデューサー）（例えば、ａＴｃ、ＩＰＴＧ、および／または３ＯＣ１２ＨＳＬ）で誘導され、その後、ステーショナリーな段階までさらに１６時間測定される。
細胞抽出物の調製：ＴＸ－ＴＬの調製および実行は、インビボ目標環境に適合する株であれば（例えば、ＥｘｐｒｅｓｓＩＱ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）に対して）使用される株を改変して、以前に記載されたプロトコール［１５］にしたがう。しかし、目標環境が異なる場合は、できる限り近い結果を得るために、［１５］のプロトコルを使用して同じ目標環境をＴＸ－ＴＬに作成する必要がある。これが可能でない場合、または利便性が低い場合は、別の目標環境からの結果を代わりに利用することもできる。しかし、生体分子ブレッドボードと目標環境との間の相関関係は、より低い可能性がある。これは、ある条件で抽出物（例えば、「ｅＺＳ８」）をもたららし、この場合、９．９ｍｇ／ｍＬのタンパク質、９．５ｍＭのＭｇ－グルタメート、９５ｍＭのＫ－グルタメート、０．３３ｍＭのＤＴＴ、１．５ｍＭの各アミノ酸（ロイシンを除く）、１．２５ｍＭロイシン、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭＡＴＰおよびＧＴＰ、０．９ｍＭのＣＴＰおよびＵＴＰ、０．２ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．２６ｍＭのＣｏＡ、０．３３ｍＭのＮＡＤ、０．７５ｍＭのｃＡＭＰ、０．０６８ｍＭフォリン酸、１ｍＭスペルミジン、３０ｍＭの３－ＰＧＡ、２％ＰＥＧ－８０００である。異なるＴＸ－ＴＬ調製物について、最適な発現条件を得るために異なる条件が使用される。シグナルを最適化するために、Ｍｇ－グルタメートおよびＫ－グルタメートは一般に最適化される。抽出物間のバラツキを防ぐには、１つの抽出のみを使用する必要がある。
無細胞実施：反応は、典型的には、２９℃で３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）中の１０－２０μＬで行われ、レポート成分（例えば、ｄｅＧＦＰである場合、Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ１／ＭＦプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ）では、４８５ｎｍ／５１５ｎｍのゲイン６１；Ｖｅｎｕｓの場合５０５ｎｍ／５３５ｎｍ、ゲイン６１；ｍＲＦＰの場合５８０ｎｍ／６１０ｎｍ、ゲイン１００）で読み取る。無細胞反応の準備および実行に関する完全な説明は、［１５］に記載されている。しかし、無細胞反応は、連続定常システム［２７］や長期希釈システム［３５］や大型容器［３６］などさまざまなモードで実行することもできる。
プラスミド調製：標準的な分子生物学的手順［２８－３０］を用いてＤＮＡをクローニングし、ＪＭ１０９ ｒｅｃＡＩｌａｃＩＱ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）株などの適合性株で増殖させて精製する。増殖のための株は、プラスミドの性質に依存して選択されるべきであることに留意されたい。例えば、ｐＬａｃＯ１プロモーター［４］プラスミドは、ｌａｃＩリプレッサー株として増殖されるべきであるが、ｐＬａｍｂｄａＣＩ［３７］プロモーターは、ｌａｍｂｄａＣＩリプレッサー株（例えば、ＫＬ７４０）で増殖されるべきであり、一方、非発現プラスミドまたは低発現プラスミドは、典型的なＪＭ１０９、ＢＬ２１、ＤＨ５アルファまたは他のクローニング株において増殖され得る。ＤＮＡは、純粋に合成的に、または天然源からの単離から作製することもできる。産生されたプラスミドは、インビトロ混合物および目標環境（例えば、メチル化パターン、エンドヌクレアーゼ切断部位など）に適合することが重要である。小規模な精製は、ミニプレップ（PureYield、Promega）が行われた後に、脱塩（QiaQuick、Qiagen）のためのＰＣＲ精製によって行われる。最小限の塩の存在は、無細胞混合物中のプラスミドの効率的な発現にとって重要である。大規模な精製は、ミディプレップまたはマキシプレップ（NucleoBond Xtra MidiまたはNucleoBond Xtra Maxi、Macherey-Nagel）によって行われる。すべてのプラスミドをステーショナリー段階で株から単離し、使用前に配列決定した。
プラスミドコピー数を決定するための定量的ＰＣＲ：インビボでのものと同じ相対比でプラスミドの濃度を適合させるために、インビボ目標環境において同じプラスミドに対する定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を実施することが好ましい方法である。活性インビボアッセイからの高発現株および低発現株に対応する２つの試料を、選択成長培地（例えば、抗生物質濃度の半分を有するＭＯＰＳ）で、２９℃にてＯＤ０．９で単離する。グリセロールを最終使用濃度の２５％まで添加し、サンプルを使用するまで－８０℃で保存した。サンプルは、２００ｎＭのプライマーを用いた５０μＬのｑＰＣＲ反応で１：５００希釈で直接使用される。サンプルをPower Sybr Green PCR（Life Technologies）で実行し、ＭＸ３００５（Stratagene）で、９５℃で１０分、その後、９５℃で１５秒間、６℃で１分間の４０サイクルにて測定される。使用されるプライマーは、OligoAnalyzer Software（Integrated DNA Technologies）によって選択され、プラスミドにおける定常領域（例えば、これらの抵抗マーカーを有する３‐プラスミドシステムを使用する場合、ｐＳＣ１０１、ｐ１５Ａ、およびｃｏｌＥ１プラスミドのそれぞれのｋａｎＲ、ｓｐｅｃＲ、およびｃａｒｂＲ領域における）を増幅する。各サンプルは、サンプル中で３回、そして３個のサンプルにわたって繰り返される。データは、ｋａｎＲ遺伝子のような定常領域に対して比較Ｃｔ法を用いて分析される。同等の効率を検証するための標準曲線は、各プライマーセットに対して１：１０希釈の鋳型を用いて作成される。
タンパク質の精製：タンパクを精製してＴＸ－ＴＬに添加し、またはスタンダードとして使用する必要があるかもしれない。蛍光タンパク質のｅＧＦＰ、ｍＲＦＰおよびＶｅｎｕｓおよび変異体ｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ、ｍＲＦＰ－ｓｓｒＡ、およびＶｅｎｕｓ－ｓｓｒＡについて、コード配列を、標準技術を用いてＮ末端Ｈｉｓ６タグを含むＴ７－ｌａｃＯ誘導性ベクターにクローニングし、ＢＬ２１－ＤＥ３株（ニューイングランドバイオラボ）中で増殖させた。タンパク質は、［３８］と同様のプロトコールに従って精製されるが、ＬＢブロスの代わりにＴＢブロス中で増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧ（最終濃度）で誘導し、蛍光タンパクに相当する２５ｋＤａ～３５ｋＤａのバンドを選択した。蛍光タンパク質をSupradex 20 10/300カラムでさらに処理して、純粋な活性化割合を選択し、５０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、２％ＤＭＳＯからなる貯蔵緩衝液中で－８０℃で瞬間凍結した。この貯蔵緩衝液は、典型的なグリセロールベースの貯蔵緩衝液がタンパク質発現を有意に減少させるので、タンパク質がＴＸ－ＴＬにおいて機能するために重要であることに留意されたい。［３８］本実施例における最終濃度は、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ、１６４．８ｕＭ；ｄｅＧＦＰ、１８４．８μＭ；ｍＲＦＰ－ｓｓｒＡ、１８５．６ｕＭ；ｍＲＦＰ、１７０．６ｕＭ；Ｖｅｎｕｓ－ｓｓｒＡ、８７．９ｕＭ；Ｖｅｎｕｓ、１４７．５ｕＭである。
典型的な精製方法が活性タンパクを維持するのに有効でない場合、いくつかのタンパク質はより特殊化した精製方法を必要とすることがある。例えば、ＣｌｐＸについては、一般的なＮｉ－ＮＴＡ精製技術を用いてＮ末端ヒスタグで野生型を精製すると活性の低下がもたらされるため、モノマーのＮ末端欠失変異体Ｆｌａｇ－ｃｌｐＸｄｅｌｔａＮＬｉｎｋｅｄＨｅｘａｍｅｒ－Ｈｉｓ６が使用された（Ａｄｄｇｅｎｅ＃２２１４３）［３９］。[４０］にリストされたＮｉ－ＮＴＡ精製手順、続いてSupradex 20 10/300および２５０ｋＤａを超える純粋な活性比率についての機能性試験を使用した。活性化した割合を、蛍光タンパク質に用いたのと同じ緩衝液中で急速凍結した。ＣｌｐＸの最終濃度は１．９５μＭであった。
ＰＣＲからの直鎖ＤＮＡ調製：ＰＣＲ産物を生成するために、このプロセスを以下に記載する。ＰＣＲ産物をPfu Phusion Polymerase（New England Biolabs）を用いて増幅し、ＤｐｎＩ消化した。プラスミドをPureYieldカラム（Promega）を用いてミニプレップするか、NucleoBond Xtra Midiカラム（Macherey-Nagel）を使用してミディプレップする。すべてのプラスミドはステーショナリー段階で処理される。無細胞反応で使用する前に、プラスミドおよびＰＣＲ産物の両方を、ＴＸ－ＴＬに有害な過剰の塩を除去したＱｉａＱｕｉｃｋカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて追加のＰＣＲ精製工程を行い、溶出し、１０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ溶液で保存し、短期保存の場合はｐＨ８．５で４℃、長期保存の場合は－２０℃とする。
直鎖ＤＮＡ試験のための直鎖ＤＮＡの迅速なインビトロアセンブリ：直鎖ＤＮＡ断片をPfu Phusion Polymerase（New England Biolabs）を用いて増幅し、ＤｐｎＩを３７℃で５分間消化し（New England Biolabs）、アガロースゲル電気泳動で確認し、前述の手順をもちいてＰＣＲ精製する。次に、アイソサーマルアセンブリまたはゴールデンゲートアセンブリのいずれかを用いて、断片をインビトロで組み立てる。アイソサーマルアセンブリーについては、Gibson Assembly Master Mix（New England Biolabs）を１：３のモル比のベクター：インサートを用いて製造者の指示に従って使用し、５０℃で１時間反応させた。［４１］ゴールデンゲートアセンブリについては、等モル量のベクターおよびインサート、１．５μＬの１０×ＮＥＢ Ｔ４緩衝液（New England Biolabs）、１．５μＬの１０×ＢＳＡ（New England Biolabs）、1μLのBsaI（New England Biolabs）、および１μＬのＴ４リガーゼを２００万単位／ｍＬ（New England Biolabs）[42]からなる15μＬの反応液をセットアップした。反応は、２分／３７℃、３分／２０℃、１サイクル５分／５０℃、５分／８０℃の１０サイクルでサーモサイクラーで行った。ゴールデンゲートアセンブリについては、QuikChange Lightning Multi Site-Directed Mutagenesis Kit（Agilent）を使用して、内部ＢｓａＩ切断部位を有する構築物を静かに突然変異させた。
無細胞システムでの試験のための直鎖ＤＮＡカセットの増幅：インビトロ直鎖ＤＮＡアセンブリプロトコルに従う。オーバーラッププライマーは、最終プライマーのＴｍが６０℃を超えるが、各接合側の結合Ｔｍが４０℃未満となるように、ベクター：プロモーターおよびベクター：ターミネーター接合部上で結合するように設計される。次いで、得られた組み立て（アッセンブリ）産物１μＬを５０μＬのＰＣＲ反応液で３５サイクルＰＣＲ増幅し、アガロースゲル電気泳動により確認する。得られたバンドが８０％以上の純度であれば、前述の手順を用いてＤＮＡをＰＣＲ精製し、ＴＸ－ＴＬで直接使用する。同時に、２μＬの組み立て産物を、標準的な化学的コンピテントまたは電気的コンピテント手順を用いて細胞に形質転換した。細胞を増殖させ、ミニプレップし、配列決定する。得られたプラスミドからのＰＣＲ産物を陽性対照として使用する。
ＴＸ－ＴＬ産生代謝生成物のＬＣ－ＭＳ分析：ＴＸ－ＴＬ反応物をペレット化し、洗浄し、代謝産物がどこにあるかに応じて、上清またはペレットから単離することができる。沈殿させた生成物は、７０％エタノールまたはメタノール中に再溶解することができる。サンプルを１．７μｍの逆相カラムに注入し、典型的な流速０．５ｍｌ／分および０～９０％の勾配で、１％ＡＣＮまたはアセトニトリル中の１０ｎＭギ酸アンモニウムなどの緩衝液を流す。
実施例１：フィードフォワードループ機能：３ノード回路の構造が一例として使用され、一緒に実行されるときフィードフォワードモチーフの構造である。非干渉性フィードフォワードループモチーフが、合成回路として選択され、ｌａｓＲ応答性活性化成分およびｔｅｔＲ応答性抑制成分で試験される。この回路はパルスを生成する。
フィードフォワードループモチーフは、あらかじめ定義されたモチーフであり、一緒に組み合わされると、その最後のノードでパルス状の応答を生成する［１２］。これは、１段階活性化枝と２段階抑制枝の組み合わせである。このモチーフの応答がパルスを生成すると予想される。
図３６Ａは、シグナルの最上位ノードから中間ノードおよび最下位ノードへの活性化を示す。これは、トップノードをオンにし、中間ノードおよびボトムノードに向かって「シグナル」を流すと考えることができる。抽象化されていない最上位のノードは、３ＯＣ１２ＨＳＬと並行して中間ノードを活性化し、下位ノードがタンパク質を産生し始める、ｌａｓＲタンパク質の産生である。これは、細胞または無細胞システムの状況において生じ得る。
図３６Ｂでは、この時点で中間ノードが起動され、シグナルを生成する。特に、中間のノードはｔｅｔＲタンパク質を作製し、下のノードはｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡを作製している。ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡは、産生されると、蛍光タンパク質フォールディング手順を経て、時間の経過とともに蛍光シグナルとして視覚化することができる。ここに示すのは、下位ノードからの生産の結果として上昇するシグナルである。
図３６Ｃにおいて、中間ノードから生成されたｔｅｔＲは、最下位ノードのｔｅｔＯ１ボックスに結合することができる。ｔｅｔＲが最下位ノードのｔｅｔＯ１ボックスに結合すると、転写が中断され、最下位ノードは発現を停止する。しかしながら、ｔｅｔＲはαＴｃにも結合することができ、これはタンパク質を捕捉（隔離）すると考えることができる。これが起こると、ｔｅｔＲは不活性化される。しかし、中間ノードがオンでａＴｃが補充されていないため、ｔｅｔＲは常に生成されており、したがって、ある時点でａＴｃが使い果たされることになる。これが起こると、遊離ｔｅｔＲは下のノードに結合し、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ産生は終了する。右側に示すのは、遊離ｔｅｔＲが下位ノードからの発現を結合して停止させるため、シグナルが上昇傾向を一時停止する。
図３６Ｄでは、第３のノードからｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡの産生を停止するために、第２のノードからの十分な遊離ｔｅｔＲが存在する。この時点で、生産は終了したが、これまでに作成されたｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡが存在する。バッチモードの無細胞システム（例えば、溶液の補充なしで１つのチューブで生じる）におけるこのタンパク質は、現在のＣｌｐＸＰ［４３］によって分解され得る。細胞システムでは、タンパク質は、現在のＣｌｐＸＰによって分解され、細胞分裂により希釈される。その結果、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡシグナルの量は経時的に減少する。
実施例２：転写強度を探索するためのオープンループのインビボ実験セットアップ：株の調製および試験。
プラスミドを構築して、図９Ａに示すフィードフォワードループのオープンループバージョンを発現させた。プラスミド３６０（ＰｌａｃＯ１＿ＢＣＤ２２＿ｌａｓＲ＿Ｔ５００）は、図９Ａに示される開ループの最上位ノード（上のノード）を有するプラスミドである。プラスミド３６０は、ｐ１５Ａスペクチノマイシン耐性プラスミド上にある。様々なｌａｓＲプロモーターユニットおよび操作されたｔｅｔＯ１ボックス（「＿ｔｅｔＯ１」で示される）をそれぞれ有する５つの追加のプラスミド（すなわち、ｐｌａｓＲ変異体：ＰＯｒｉｇ＿ｔｅｔＯ１、Ｐ１＿ｔｅｔＯ１、Ｐ２＿ｔｅｔＯ１、Ｐ３＿ｔｅｔＯ１およびＰ４＿ｔｅｔＯ１）を構築した。これらの５つのプラスミドは、図９Ａに示す開ループの底部ノード（下のノード）を保持する。
プラスミドは、当業者に知られる従来のクローニング技術によって調製された。この実施例では、ゴールデンゲートクローニング、その後の形質転換、コロニーピッキング、ミニプレップ、その後のクローニングを確認するためのシークエンシングを用いてプラスミドを調製した。このプラスミドは、他の組み立て技術およびＤＮＡ合成方法を含む任意の他の受け入れられた方法によって代替的に作製することができる。
各ノードはプラスミド上にコードされているので、これらのノードは、インビトロ混合物および目標環境において互いに適合するように異なるバックボーン（主鎖、骨格）によって運ばれる。目標環境がインビボである場合、当業者に理解されるように、プラスミドの複製起点を認識しなければならない。この実施例では、プラスミド３６０はｐ１５Ａプラスミド上に担持され、そしてｐｌａｓＲ転写変異体はｃｏｌＥ１プラスミド上に担持される。ｐ１５ＡプラスミドおよびｃｏｌＥ１プラスミド以外のプラスミドも、ｐＳＣ１０１、ｐＢＢＲ１、細菌人工染色体などの所望のコピー数に応じて選択することができる。複製のプラスミド起点の決定は、コード配列が発現されるのに望ましいコピー数に基づく。ｃｏｌＥ１のようなより高いコピー数は、発現がより高いコーディング配列に対して選択されるべきであり、より低いコピー数は、より低く発現されるコーディング配列についてのｐＳＣ１０１のように選択されるべきである。別の要因は温度感受性である。例えば、ｃｏｌＥ１プラスミドは３７℃より２９℃でより低いコピー数を有するが、ｐＳＣ１０１およびｐ１５Ａプラスミドは温度に対して安定した発現を有する。これが貴重な形質であるかどうかに応じて、温度感受性プラスミドを選択することができる。
さらに、各プラスミドは異なる抗生物質カセットを有する必要があり、最終的な株を選択することができる。この場合、プラスミド３６０はｓｐｅｃＲ遺伝子を含み、ｐｌａｓＲ転写変異体はａｍｐＲを含む。アンピシリン、スペクチノマイシン、ゼオシン、カナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトミオマイシンなどの他の適合性のある抗生物質カセットもまた、当業者によって同定されるように使用され得る。
詳細なプロトコルは次のとおりである。インビボアッセイのために、プラスミドを２～３個の適合性ベクター（ｃｏｌＥ１／ｃａｒｂＲ、ｐＳＣ１０１／ｋａｎＲ、ｐ１５Ａ／ｓｐｅｃＲ）にクローニングし、２９℃で増殖させたＢＬ－２１ Ｒｏｓｅｔｔａ２株に形質転換した。Ｂｌ－２１Ｒｏｓｅｔｔａ２株はクロラムフェニコール耐性を有する。１０μｇ／ｍＬクロラムフェニコール、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンおよび１００μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含むＭＯＰＳ－ＥＺリッチ（Ｔｅｋｎｏｖａ）０．４％グリセロール選択培地中で１．２５％希釈で増殖させる前に、ＳＯＣ培地（Ｓｉｇｍａ）中、２９℃で２時間回復させ、－８０℃で保存した。インビボアッセイを実施するために、細胞を同じ選択的ＭＯＰＳ培地中で２９℃にてステーショナリー段階まで増殖させた。次いで、これまでに使用された半抗生物質濃度を有する９６ウェルMatriPlates（Brooks Life Sciences）において、細胞を１ウェル当たり５００μＬに１％希釈した。プレートリーダーを使用し、蛍光強度および吸光度について較正した。プレートは、線形連続振とうモードで、ｄｅＧＦＰ、４８５ｎｍ／５１５ｎｍゲイン６１および１００、ＯＤ（最適密度）、６００ｎｍで６分ごとに測定した。ＯＤ０．１～０．２において、細胞をＩＰＴＧおよび３ＯＣ１２ＨＳＬで誘導し、次いでステーショナリーの段階までさらに１６時間測定した。
培地は、グリセロールを含む透明培地であるように選択されることに留意されたい。グリセロールは、誘導前にｐＬａｃＯ１プロモーターが完全に抑制されていることを保証するように機能する。培地は、可視化を補助するために透明であることとする。この実施例では、ＩＰＴＧは、上のノードのプラスミド、すなわち３６０プラスミド上の任意のｌａｃ抑制を除去するのに役立つ。３ＯＣ１２ＨＳＬは、３６０プラスミドの発現からｌａｓＲを活性化するのに役立つ。
図１７Ａは、プラスミド３６０（ＰｌａｃＯ１＿ＢＣＤ２２＿ｌａｓＲ＿Ｔ５００）の配列リストを示す。図１７Ｂは、プロモーター「ＰＯｒｉｇ＿ｔｅｔＯ１」を利用するプラスミド４２８（ＰＲｓａＬ－ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）の配列表を示す。図１７Ｃは、プロモーター「Ｐ１＿ｔｅｔＯ１」を利用するプラスミド３４７（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿－１０－ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）の配列表を示す。図１７Ｄは、プロモーター「Ｐ２＿ｔｅｔＯ１」を利用するプラスミド４２９（ＰＬａｓＩ－ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）の配列表を示す。図１７Ｅは、プロモーター「Ｐ３＿ｔｅｔＯ１」を利用するプラスミド４３０（ＰＬａｓＢ－ｔｅｔＯ１＿ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）の配列表を示す。図１７Ｆは、プロモーター「Ｐ４＿ｔｅｔＯ１」を利用したプラスミド４３１（ＰＲａｓＬ ｌｏｎｇ（ｌａｓ）－ｔｅ１ＢＣＤ２＿ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ＿Ｂ１００２）の配列リストを示す。
図８は、レポータータンパク質ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡをＯＤで正規化したことにより提示されるＧＦＰシグナルを示す。図８において、Ｙ軸は任意の所与の時間におけるＯＤシグナルに対するＧＦＰシグナルであり、Ｘ軸は時間（分）である。プロットされた各株は、プラスミド３６０とｐＬａｓ変異体レポータープラスミドとの組み合わせであることに留意されたい。
図８のデータの一次導関数の生の値、すなわちｄＧＦＰ／ｄＯＤが取られ、それぞれの最大値が、最大の表現単位が１の値、すなわちダークグレー；０の値を有する最低発現ユニット、すなわち白色を付与されるようにスケーリングされたヒートマップ上にプロットされる（図１０のインビボのセクションを参照のこと）。スケーリングされたヒートマップは、図１０の左側のインビトロで生成されたデータと後で比較することができる。
実施例３：転写強度を調べるためのインビトロ無細胞調製：プラスミド調製
この実施例では、図９Ａに示したのと同じ２ノード回路を、調製した無細胞システムで試験する。各反応混合物は、１ｎＭの濃度でプラスミド「１６３」を含有する。このプラスミドは、図９Ａに示すように、上のノードを有するｐＬａｃＯ１－ＵＴＲ１－ｌａｓＲとして示される。また、各反応混合物は、実施例２に記載される「ｐＬａｓ変異体」プラスミド（すなわち、Ｐ＿ｏｒｉｇ、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４）を含む。ｐＬａｓ変異体プラスミドの濃度は２ｎＭである。このプラスミドは、図９Ａに示されるように、下のノードを有するｐＬａｓ－変異体－ＵＴＲ１－ｄｅＧＦＰとして示される。各反応混合物はまた、１ｍＭの濃度のＩＰＴＧを含み、抽出物に固有の回路から残留ｌａｃＩを除去する。次いで、これらの反応のそれぞれを、１０μＭから０．１ｎＭまでの３ＯＣ１２の１：１０希釈液およびネガティブコントロールで処理する。言い換えると、５ｘ７＋１反応があり、「５」は５つの異なるｐＬａｓ変異体を示し、「７」は７つの異なる３ＯＣ１２希釈を示し、「＋１」はＤＮＡを全く含まない、バックグラウンドを差し引くための陰性対照である。
図１８Ａは、「Ｐｏｒｉｇ」として示されるプラスミド１６５（ＰＲｓａＬ＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）の配列リストを示す。図１８Ｂは、プロモーター「Ｐ１」を利用するプラスミド１９６（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿１０＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）の配列表を示す。図１８Ｃは、プロモーター「Ｐ２」を利用するプラスミド１９７（ＰＬａｓＩ－＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）の配列表を示す。図１８Ｄは、プロモーター「Ｐ３」を利用するプラスミド１９８（ＰＬａｓＢ－＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）の配列表を示す。図１８Ｅは、プロモーター「Ｐ４」を利用するプラスミド１９９（ＰＲａｓＬ ｌｏｎｇ（ｌａｓ）－＿ＵＴＲ１＿ｄｅＧＦＰ＿Ｔ５００）の配列表を示す。図１８Ｆは、プラスミド１６３（ｐＬａｃＯ１－ＵＴＲ１－ｌａｓＲ）の配列表を示す。
実施例４：転写強度を調べるためのインビトロ無細胞調製：データの特徴づけ
上記実施例の結果を図９Ｂ～図９Ｆに示し、ここでシグナルは各３ＯＣ１２ＨＳＬトレースについて時間の関数としてプロットした。図９Ｇは、各実験が、新たに調製されたＤＮＡ源で３回実施された場合の、３ＯＣ１２ＨＳＬを変化させた場合のｔ＝３００分におけるプロモーター当たりのＴＸ－ＴＬ中のエンドポイント値から得られたデータを有する表を示す。
次いで、図９Ｂ～Ｆの各プロットからのｔ＝３００におけるエンド値を、図９Ｈをプロットするために収集することができる。図９Ｈは、各ｐＬａｓ変異体の３ＯＣ１２ＨＳＬ濃度の関数としてのｄｅＧＦＰ量をプロットしたものである。実験を３回繰り返して、エラーバーを得た。
図１０の「インビトロ（異なる抽出物）」セクションに示されるカラーチャートを構築するために、ｔ＝１８０分におけるプロモーターＶｍａｘ値または各ｐＬａｓ変異体の最高発現値を決定し、次いで３回のランの平均を、最も弱い部分には白の色が割り当てられ、最も強い部分には灰色の色が割り当てられる。
実施例５：転写強度をメトリックとして使用したインビボとインビトロ間のデータ比較
図１０において、インビトロ切片中の各カラムは、［１５］に記載される方法にしたがって調製され、最適化された異なる抽出調製物を表す。この実験では、抽出物Ａを使用する。抽出物ＡおよびＤはＥｘｐｒｅｓｓＩＱ株、Ｂ～ＣおよびＥ～ＩはＢＬ２１ Ｒｏｓｅｔｔａ２株、ＪはＭＧＺ１株、ＫはＪＳ００６株である。次いでインビトロからのデータを、実施例２に記載され、図１０の「インビボ」セクションに示されたインビボで得られたデータと比較する。
ヒートマップに基づいて、強いアイテムと弱いアイテムからの発現に明確なパターンがあることがわかる。言い換えれば、プロモーターＰ３は試験されたインビボの場合の結果と一致して、１１のインビトロ抽出物全体で最も弱いが、プロモーターＰ１は１１のインビトロ抽出物中で最も強い。Ｐ２は、無細胞システムおよび細胞システムの両方において中強度のプロモーターであり、Ｐ＿ｏｒｉｇおよびＰ４は、両方のシステムにおいて弱いプロモーターである。
この実施例の結果は、回路の文脈におけるプロモーターなどの転写エレメントがインビトロで改変され、インビトロでの転写強度の予測を提供し得ることを示す。予測は定量的レベルではないが、それは２つの環境の質的有意性があること、例えば、回路に関してインビトロで弱いプロモーターはインビボでも弱く、逆もまた同様であることを示す。
プロモーターはまた、互いに対して比較することができる。インビトロでのプロモーター強度の順序はＰ１／Ｐ２／Ｐ＿Ｏｒｉｇ／Ｐ４／Ｐ３であり、インビボでのプロモーター強度の順序はＰ１／Ｐ２／Ｐ４／Ｐ＿ｏｒｉｇ／Ｐ３である。比較は定性的であり定量的ではないことを考えると、インビトロでプロモーターセットを使用することを正当化する十分なサポートを提供し、インビボセット全体を行う必要なしに対応するインビボ結果を確実に予測する。あるいは、インビトロおよびインビボ環境の両方を収集し、限られたサブセット上の相関を見ることによって、インビボで試験することなく、異なる転写プロモーターを使用することによって拡大することができる。
実施例６：翻訳強度を探索する非干渉性フィードフォワードループのインビボ実験セットアップ：プラスミド調製
この実施例では、図１１Ａに示される非干渉性フィードフォワードループモチーフ（ＩＦＦＬ）を、ｌａｓＲ反応性活性化成分およびｔｅｔＲ反応性抑制成分で試験するための合成回路として選択した。図１１Ａに示されるＩＦＦＬは、３つのノード、すなわち、１つの上のノード、中間のノードおよび下のノードを含む。
各ノードは、（１）ｐＣｏｎｓｔ：転写を開始し得る恒常的なプロモーター（２）リボソーム結合部位、（３）コード配列、および（４）ターミネーターで構成される、直鎖のプラスミド形態におけるＤＮＡの断片を表す。
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを標的とするシグマ因子であるシグマ７０因子と理想的に結合し、転写を開始する。これは、ｐＴｅｔ、ｐＬａｃ［４］、ｐＯＲ２－ＯＲ１－Ｐｒ［３３］、ｐＴａｃなどを含む、広範囲のプロモーターファミリーであることとしてもよい。また、他の変異体では、恒常的なプロモーターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ｐＴ７と結合することとしてもよい。
図１１Ａに示される上のノードにおいて、ｐＣｏｎｓｔはｐＬａｃＯ１である。ＲＢＳはＵＴＲ１である。コード配列はＬａｓＲである。ターミネーターはＴ５００である。ＤＮＡはプラスミド上に構成されている。
中間のノードにおいて、プロモーターはｌａｓＲ応答性プロモーターである。この特異的プロモーターは、もともとシュードモナス・エルギノーサ（Psuedomonas aeruginosa）ＰＡＯ１由来の転写調節因子ｌａｓＲに反応する。Ｎ－３－オキソドデカノイルホモセリンラクトン（３ＯＣ１２－ＨＳＬ）によって補助されるｌａｓＲタンパク質は、ｌａｓＲ応答性プロモーターに結合してｓｉｇｍａ７０因子を補充し、ＲＮＡ転写を開始することができる。中間のノードのＲＢＳはＵＴＲ１であり、コード配列はｔｅｔＲリプレッサータンパクをコードする。
下のノードでは、プロモーターはｔｅｔＯ１プログラムされた演算子要素を有するｌａｓ応答性プロモーターである。ｔｅｔＯ１エレメントをｌａｓ応答性プロモーターにプログラムするためには、配列「ＴＣＣＣＴＡＴＣＡＧＴＧＡＴＡＧＡＧＡ」（配列番号４７）を有するｔｅｔＯ１ ＤＮＡオペレーター片を含める必要がある。［４］下のノードのＲＢＳはＵＴＲ１であり、コード配列はｄｅＧＦＰをコードする。ｄｅＧＦＰは、一般的なプレートリーダー中の吸光度４８５エミッタンス５１５で視覚化することができる。
プラスミド３６０（Ｐｌａｃ＿ＢＣＤ２０＿ｌａｓＲ＿Ｔ５００）は、回路の上のノードに対応し、前述のようにすべての回路間で共有される。プラスミド３６０の配列は図１７Ａに示されている。ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡをコードする遺伝子を有するプラスミドは、回路の下のノードに対応し、様々なＲＢＳ（リボソーム結合部位）配列および同じ共有骨格配列を有する１６の変異体を有する。ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ濃度は、当業者に理解されるように、ＲＢＳ調整によって調節することができる。つまり、異なる結合効率を有するＲＢＳ配列を使用した。強力なＲＢＳはｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡの高発現をもたらし、弱いＲＢＳは低発現をもたらす。
図１９Ａは、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡコード遺伝子（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿－１０＿ｔｅｔＯ１（Ｐ１＿ｔｅｔＯ１）－（ブランク）－ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ－Ｂ１００２）を有するプラスミドの共有骨格配列の配列表を示す。
図１９Ｂは、図１９Ａに示されるプラスミド骨格配列に挿入される１６の変異体ＲＢＳ配列を列挙する。ＵＴＲ１（ラムダファージ由来の強力なＵＴＲ）、１０個のバイシストロニックデバイス（ＢＣＤ）、および５個の一般的に使用されるモノシストロニックＲＢＳ（ＭＣＤ）を試験した（Ｂ００３０－Ｂ００３４）。ＢＣＤは、ＭＣＤとは対照的に、二次構造にかかわらず予測結果を提供することが以前から知られていた。ＭＣＤ発現は予測が困難であるが、ＴＸ－ＴＬとインビボでのデータマッチングを検証するために使用することもできるという仮説が立てられた。
ＴｅｔＲプラスミドは、ｔｅｔＲを産生する中間のノードに対応する。上記のｄｅＧＦＰプラスミドと同様に、この中間プラスミドは、様々なＲＢＳ配列を有する１６の変異体も有する。各プラスミドは、同一の共有骨格配列および骨格配列の後に挿入された変異型ＲＢＳ配列を含む。図１９Ｃは、ｔｅｔＲを有するプラスミド（ＰＬａｓＩ＿１ＳＮＰ＿－１０（Ｐ１）－（ｂｌａｎｋ）－ｔｅｔＲ－Ｔ５００）の共有骨格配列の配列表を示す。プラスミド骨格配列に挿入される同じ１６の変異型ＲＢＳ配列を図１６Ｂに示す。
したがって、合計３３のプラスミドが、以前に記載された標準的な分子生物学技術を用いて構築された。
実施例７：翻訳強度を探索する非干渉性フィードフォワードループのインビボ実験セットアップ：株の構成物
合計で２５６株が作製された。各株はプラスミド３６０を含む。さらに、株はまた、（１）プラスミドを産生する中間ノードｔｅｔＲおよび（２）より低いノードｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ産生プラスミドを有する。従って、合計の組み合わせは、１×１６×１６＝２５６株である。すべての株を生産するために、ｌａｃＩを過剰発現するＥｘｐｒｅｓｓＩＱ株をプラスミド３６０で形質転換し、スペクチノマイシン抗生物質に対して選択した。次いで、この株を標準的な技術を用いて化学的にコンピテントにし、中央ノード１個と下のノードプラスミド１個を同時にダブル形質転換した。細胞は、１０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍＬのカナマイシン、１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン、１００μｇ／ｍＬのスペクチノマイシンを含むＭＯＰＳ－ＥＺリッチ（Ｔｅｋｎｏｖａ）０．４％グリセロール選択培地中で１．２５％希釈で増殖させる前に、ＳＯＣ培地（Ｓｉｇｍａ）中で２９℃で２時間回復させ、－８０℃で保存した。
実施例８：翻訳強度を探索する非干渉性フィードフォワードループのインビボ実験セットアップ：インビボアッセイ
インビボアッセイを実施するために、細胞を同じ選択的ＭＯＰＳ培地中で２９℃でステーショナリー段階まで増殖させた。次いで、これまでに使用された半抗生物質濃度を有する９６ウェルマルチプレート（Brooks Life Sciences）において、細胞を１ウェル当たり５００μＬに１％に希釈した。３つのプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ Ｈ１／ＭＦ）を使用し、蛍光強度および吸光度について較正した。プレートを６分間毎にｄｅＧＦＰで、４８５ｎｍ／５１５ｎｍのゲイン６１および１００、およびＯＤ６００ｎｍを線形連続振とうモードで測定した。ＯＤ０．１～０．２において、細胞を可変ａＴｃ、１μＭＩＰＴＧ、および１μＭ３ＯＣ１２ＨＳＬで誘導し、次いで、ステーショナリー段階までさらに１６時間測定した。３ＯＣ１２ＨＳＬおよびＩＰＴＧの量は、過剰発現に関連した毒性を導入することなく、実施例１のオープンループのケースの誘導のために測定した。
用いたａＴｃ量は、１０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬおよび０ｎｇ／ｍＬであった。各ａＴｃ量について、完全な１６×１６グリッドをインビボで行った。生データのサンプルセットを図１１Ｂに示す。
このサンプルセットは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬレベルで収集した２５６株すべての誘導後の経時的な、ＯＤシグナル（すなわち、ＧＦＰ／ＯＤ）上のＧＦＰシグナルを表す。各サブパネルは異なる歪みを表し、Ｙ軸はＯＤに対するＧＦＰの相対蛍光単位（ｒｆｕ）として、Ｘ軸は時間（分）として表している。
各行（図１１Ｂの左側）に示される「ＵＴＲ１」「ＢＣＤ２」「ＢＣＤ７」のような表記は、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡプラスミドのリボソーム結合部位である。各カラム（図１１Ｂの上部）について示されたのと同じ表記は、ｔｅｔＲプラスミドのリボソーム結合部位である。
図１１Ｃは、ＯＤのみを有するＧＦＰシグナルを示す。図１１Ｄは、ＧＦＰシグナルを含まないＯＤシグナルのみを示す。図１１Ｄでは、全ての曲線が類似の形状であり、全ての歪みが同様の適合度を有し、同じ速度で成長していることを示していることに留意されたい。これは、データのコントロールとして使用すすることができる。
図１１Ｅ～Ｇは、検出されたＧＦＰ／ＯＤシグナルがどのようにヒートマップ値に変換されるかを示す。図１１Ｅは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬで、ＵＴＲ１ ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ（行）およびＵＴＲ１ ｔｅｔＲ（列）の場合のＧＦＰ／ＯＤのサンプルデータトレースを示す。Ｙ軸は相対蛍光単位（ｒｆｕ）であり、Ｘ軸は時間（分）である。トレースはシグナルの増加を示し、その後にピーク（三角でマークされる）とそれに続くシグナルの減少を示す。シグナルのピークの数値は、データをヒートマップで表現できる形式に変換する目的で採用される。
図１１Ｆは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬで、ＵＴＲ１ ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ（行）およびＢ００３４ ｔｅｔＲ（列）の場合のＧＦＰ／ＯＤのサンプルデータトレースを示す。Ｙ軸は相対蛍光単位（ｒｆｕ）であり、Ｘ軸は時間（分）である。この場合、トレースはダウンしないことに留意する。したがって、最大シグナル（三角形としてマークされている）の数値は、ヒートマップによって表現できる形式にデータを変換する目的で採用される。
図１１Ｇは、ａＴｃ１０００ｎｇ／ｍＬで、ＢＣＤ２４ ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ（行）およびＵＴＲ１ ｔｅｔＲ（列）の場合のＧＦＰ／ＯＤのサンプルデータトレースを示す。この場合、トレースはシグナルの負の制御レベルにあり、実際のデータは存在しないことに留意する。したがって、ヒートマップで表現できる形式にデータを変換する目的で、最大シグナルの数値が取られる（ゼロ点の三角形）。しかしながら、この数値は検出の端より低い。
ヒートマップ値に変換された２５６個のパネルの各パネルで、色は０から１０００の再スケーリングされた上にプロットされる。得られた値は、図１２Ｂに示す１６×１６アレイにプロットされる。行にはｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡのＲＢＳ変異体があり、列にはｔｅｔＲのＲＢＳ変異体がある。左のパネルは１０００ｎｇ／ｍＬのＴｃに対応し、中央は１００ｎｇ／ｍＬのＴｃに対応し、下は１０ｎｇ／ｍＬのＴｃに対応する。
実施例９：翻訳強度を探索する非干渉性フィードフォワードループのインビトロでの無細胞調製：プラスミドコピー数を決定するための定量的ＰＣＲ
実施例７に記載のインビボ実験のセットアップと同様に、インビボ研究のための同じプラスミドをすなわち、３３個のプラスミドの合計（１つは上のノードｌａｓＲ、１６は中間ノードｔｅｔＲ、１６は下のノードｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ、図１１Ａ参照）がインビトロで使用された。
インビボと同じ相対比でプラスミドの濃度を一致させるために、これまでに生成された２つのインビボ株に対して定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を行った。
ｑＰＣＲは、プラスミドの抗生物質カセット領域に結合するプライマーを用いて予め形成された。特に、以下のプライマーを使用した。
Figure 0007042619000001
ｑＰＣＲは２つの系統について実施した。プラスミド３６０、ＢＣＤ２ ｔｅｔＲおよびＢＣＤ２ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ（配列ＩＤ：３６０／３４４／３４７に対応）を含む全回路を有するものと、プラスミド３６０、ＢＣＤ２２ ｔｅｔＲ及びＢＣＤ２２ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ（配列ＩＤ：３６０／３４６／３４９）を含む全回路を有するもの。これらの２つの株は、発現に関して２５６パネル地図の反対側の角にあり、したがって、それらが整列していれば、パネル全体のコピー数を代表すると仮定された。
１：１０、１：１００および１：１０００のテンプレート希釈液を使用し、各実験の３回の反復を行い、したがって図１３に示す９つのデータ点を生成した。図１３Ａおよび１３Ｂは、それぞれ２つの異なる株についてのＣｔグラフを示し、図１３Ｃおよび１３Ｄは、それぞれ異なる２つの株についての相対プラスミド量を示す。
それぞれの結果の比を１単位のｐＳＣ１０１に対して正規化して、１コピーのｐＳＣ１０１（ｋａｎＲプラスミド、ｔｅｔＲを発現する）：２コピーのｐ１５Ａ（ｃｍＲプラスミド、ｌａｓＲを発現する）：８コピーのｃｏｌＥ１（ａｍｐＲプラスミド、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡを発現する）の相対比を得た。この相対比１：２：８を、インビトロ実験に使用する。具体的には、Ｃｔ値に基づいて、各プラスミドの相対量を計算し、次いで比メトリック数（対照標準を用いた絶対量とは対照的に）を得るためにｐＳＣ１０１プラスミドの相対量で割ることができる。
実施例１０：翻訳強度を探索する非干渉性フィードフォワードループのインビトロでの無細胞調製：インビトロでの実行
インビトロ実験を実行するために、プラスミド３６０（Ｐｌａｃ＿ＢＣＤ２０＿ｌａｓＲ＿Ｔ５００）の全ての実験における濃度を１ｎＭに設定し；ｔｅｔＲ産生ＲＢＳ－改変体プラスミドの濃度を０．５ｎＭに設定し；ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ産生ＲＢＳ－変異体プラスミドの濃度を４ｎＭに設定した。これらの濃度は、ｑＰＣＲによって決定された１：２：８のモル比、およびレポーターの飽和相ＤＮＡ量未満であるように選択した。ここで、飽和相の定義は、ＤＮＡ濃度が２倍になってもシグナルが２倍にならないレベルである。
各実験はまた、１ｍＭのＩＰＴＧ存在下で行い、残留ｌａｃＩ、ｌａｓＲプラスミドの最大誘導のための１μＭの３ＯＣ１２ＨＳＬ、および分注精度の測定を可能にする量子ドットＱＳＨ６２０の１：５０００希釈を除去する。
選ばれた抽出物は、これまでに記載されているｅＺＳ８であった。この抽出物は、インビボプロトタイピングに使用されたＥｘｐｒｅｓｓＩＱ株から作製された。
インビボの場合と同様に、１０μＭ、１μＭ、０．１μＭおよび０μＭの４種類のａＴｃ希釈を行った。各希釈液について、２５６パネルセットの実験を行った。１２時間にわたってデータを収集し、互いに較正したＢｉｏｔｅｋ３プレートリーダーで、ＧＦＰ４８５／５１５ゲイン６１およびゲイン１００で６分ごとに測定した。
生データのサンプルセットを図１４Ａに示す。この１６×１６サンプルセットは、ａＴｃ１０ｕＭレベルで収集された２５６種すべての株の誘導後のＧＦＰシグナルを示す。図１１Ｃに示す生体内データと同様に、各サブパネルは、相対蛍光単位（ｒｆｕ）としてのＹ軸および分単位のＸ軸を有する異なる歪みを表す。ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡプラスミドに対応するリボソーム結合部位を各列の左側に示し、ｔｅｔＲプラスミドに対応するリボソーム結合部位を各列の上部に示す。シグナルは、検出されたｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡのタンパク質のｕＭを絶対値が表すように、蛍光ｄｅＧＦＰ対照に対して較正されている。
図１４Ｂは、１０μＭのａＴｃを有するＵＴＲ１ ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡおよびＵＴＲ１ ｔｅｔＲの場合のＧＦＰ／ＯＤのサンプルデータトレースを示す。この場合、トレースは信号の増加を示す。全てのＣｌｐＸ分解が尽きたため信号の劣化はない。Ｙ軸は相対蛍光単位（ｒｆｕ）であり、Ｘ軸は時間（分）である。この場合、ヒートマップで表現可能な形式にデータを変換するために、６時間または３００分後の最大表現の数値をとった。
ヒートマップ値に変換された２５６個のパネルの各パネルで、色は、実施例８に記載したインビボと同様に、再スケーリングされた０（白色）～１０００（灰色）上にプロットされる。得られた値を図１２Ａに示す。行にはｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡのＲＢＳ変異体があり、列にはｔｅｔＲのＲＢＳ変異体がある。複数のａＴｃ量がプロットされていることに留意する。左のパネルは１０μＭに対応し、中央のパネルは１μＭに、下のパネルは０．１μＭに対応する。
実施例１１：翻訳強度を探索する非干渉性フィードフォワードループのインビボおよびインビトロ無細胞システムの比較
ａＴｃは細胞状態にある細胞に入るのに対して、細胞の外側では測定が困難であるため、ａＴｃの正確な量は、インビトロ条件とインビボ条件との間でスケールされ得ないことに留意されたい。しかしながら、これら２つの環境を比較する挙動に基づいて相対的なスライドスケールを割り当てることができる。つまり、インビトロ（図１２Ａ）のパネルのいずれかをインビボのパネルのいずれかと整列させることができる（図１２Ｂ）。
プロットを水平に見ると（ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ濃度を見ると）、インビトロでもシグナルを有するＲＢＳユニット（ＵＴＲ１、ＢＣＤ２、ＢＣＤ７、ＢＣＤ１１、ＢＣＤ１３、ＢＣＤ１２、ＢＣＤ１４、Ｂ００３０、Ｂ００３４）は、インビボでもシグナルを有することが一般的に注記され得る。同様に、インビトロで最小シグナル（ＢＣＤ２０、ＢＣＤ１６、ＢＣＤ２４、ＢＣＤ２２、Ｂ００３１、Ｂ００３２、Ｂ００３３）を有するＲＢＳユニットの全ては、インビボでの最小シグナルに対応する。
図１２Ｃは、インビトロ（左）およびインビボ（右）からの弱ｔｅｔＲ発現（Ｂ００３４）の１つのカラムを示す。各カラムは、１６のｄｅＧＦＰ変異体、すなわち異なるレベルのｄｅＧＦＰ発現を含む。インビトロデータは１０μＭでのＴｃを有し、インビボデータは１０００ｎｇ／ｍＬでのＴｃを有する。
同様に、プロットを垂直に見ると、インビトロとインビボで同じ相関が観察される。図１２Ｄはインビトロ（上）およびインビボ（下）からのｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ（ＵＴＲ１）の１つの列を示す。各列は１６のｔｅｔＲ変異体、すなわち異なるレベルのｔｅｔＲ発現を含む。インビトロで弱いＲＢＳユニット（ＢＣＤ２０、ＢＣＤ２２、Ｂ００３４など）はインビボでも弱いが、インビトロで強いＲＢＳユニット（ＵＴＲ１、ＢＣＤ２、ＢＣＤ７、ＢＣＤ１１、ＢＣＤ１３、ＢＣＤ１４、ＢＣＤ２０、ＢＣＤ２４、Ｂ００３０、Ｂ００３１）は、インビボでも強い。本明細書における、Ｂ００３２やＢ００３３などの一部のＲＢＳユニットは、確認されていない。
シグナルは、ｔｅｔＲタンパク質量ではなく、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡアウトプットについて記録されることに留意されたい。したがって、より多くのｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡが産生されるほど、より弱いｔｅｔＲ抑制があり、ｔｅｔＲ ＲＢＳユニットは弱くなる。
ｔｅｔＲレベルでの相関は図１２Ｄに示すように観察されるが、そのような相関はｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡレベルほど強力ではないことも注目される（図１２Ｃ）。これは２つの理由から予想される：１）エンドポイントアッセイが下のノード（すなわちｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡレベル）で視覚化され、変化する項目が中間ノードのＲＢＳ、ｔｅｔＲである、および２）ｔｅｔＲ濃度はａＴｃ濃度に強く依存し、インビトロとインビボとを比較するとき、ａＴｃ濃度を調整することは困難である。
図１２Ａ～Ｄの結果は、インビトロデータがインビボデータによく対応していることを示している。図１２Ａ～図１２Ｂに示される２５６のパネルのうち、インビトロとインビボとの間で、およそ７０％の相関が推定され得る。特に、ＭＣＤの場合、Ｂ００３０からＢ００３４まで、インビトロおよびインビボの両方が強く発現したｄｅＧＦＰを有する弱く発現したｔｅｔＲを反映し、これはＢＣＤ活性単独によるものではないことを示している。抑制の時間などの他の分析の測定基準も試験され、同様の結果が得られた。インビトロとインビボとの間の相関関係は、インビトロＴＸ－ＴＬ無細胞環境が、インビボ環境を代表して定型的にプロトタイプ化するために使用され得ることを示す。
実施例１２：生体分子ブレッドボードを使用してインビトロでパートマイニングおよび特徴づけを行う：個々のプロモーターを実行する
フィードフォワードループモチーフを構築し、パルスを生成するためには、ある機能：（１）強いＶｍａｘ（２）良好なダイナミックレンジ（３）３ＯＣ１２ＨＳＬおよびｌａｓＲへの応答、を有するプロモーターが必要である。
前の実施例では、生物学的回路の基本的部分である転写および翻訳がインビトロおよびインビボ環境の間で相関することが確立されている。この知識により、以前に使用された部品と新しい部品を使用して、機能的なフィードフォワードモチーフを構築することができる。
１つは、ｌａｓＲ応答性プロモーターを採掘することから始めることができる。次いで、合成回路として非干渉性フィードフォワードループモチーフを選択して、ｌａｓＲ応答性活性化成分およびｔｅｔＲ応答性抑制成分を調べることができる。この回路はパルスを生成するはずである。しかし、どのアクチベーターパーツを使用するのが最も良いかは不明である。ＴＸ－ＴＬは、Ｋｍ、Ｖｍａｘ、ダイナミックレンジ、およびインビボでの関連性が示された発現リークなどの関連パラメータのスクリーニングパーツのための理想的なプラットフォームであると仮定される。［４４］これらも関連するモデリングパラメータである。ｌａｓＲ応答性プロモーターであるｐＲｓａＬ（Ｐ＿ｏｒｉｇ）は、ｌａｓＲおよび３ＯＣ１２ＨＳＬの存在下で非タグ化ｄｅＧＦＰを発現する能力を試験することによって、以前に発表された研究から最初に特徴付けられた。［４５］プロモーターはｌａｓＲに対して応答性であったが、プロモーターのＶｍａｘは予想よりも低く、ダイナミックレンジは６倍未満であった。より堅牢な部分を見つけるために、Standard Biological Partsの登録簿から得られた４つのより多くのプロモーターまたは既知の反応性エレメントのＲＮＡｓｅｑデータから、ＴＸ－ＴＬを用いてスクリーニングした。［４６］公開された協同性の数値に匹敵するパラメータ化データも収集された。［４７］画面外では、Ｐ１は７倍のＶｍａｘｏｖｅｒＰ＿ｏｒｉｇおよび２９倍のダイナミックレンジを示した。プロモーターの基礎漏出は、ｌａｓＲが存在しない場合にも特徴付けられた。Ｐ１は、その高いＶｍａｘに起因して、下流のｌａｓＲ応答性プロモーターのために使用された。各プロモーターの配列を図３７に示す。
上記の回路を実行するために、各反応物はプラスミド「１６３」を有し、これはｐＬａｃＯ１－ＵＴＲ１－ｌａｓＲ－Ｔ５００である（図１８Ｆ）。この回路は、１ｎＭの濃度で実行される。各反応は１ｍＭのＩＰＴＧ存在下で行われ、これは抽出液に固有の回路から残留ｌａｃＩを除去する。次いで、各「ｐＬａｓ変異体」プラスミドについて、プラスミドを図３７のプロモーター配列を用いて１ｎＭで実行する。次いで、これらの反応のそれぞれを、１０μＭから０．１ｎＭまでの３ＯＣ１２の１：１０希釈液および陰性対照で泳動させる。
図９Ｂ～Ｆは、ｐＬａｓ変異体プロモーターを変化させることによって、異なる最大シグナル強度を得ることができることを示す。ここで、各ＤＮＡはプラスミド形態で異なるＤＮＡ断片に供給される。しかし、ＤＮＡは、直鎖状またはプラスミドであってもよく、同じ鎖上にあっても、異なる鎖上にあってもよい。ＤＮＡは、天然源（細菌由来）であっても、人工供給源（合成、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドなど）であってもよい。（Ａ）各ｌａｓＲプロモーター変異体は、ＴＸ－ＴＬにおいて、３ＯＣ１２ＨＳＬを変化させて試験する。各プロットには３回の独立した実験の平均が示されている。Ｂ）文献からのこれまでのレポーター、ｐＲｓａＬ（Ｐ１）を試験する。Ｃ）－１０領域（Ｐ２）に変異を有するｐＬａｓＩを試験する。Ｄ）ｐＬａｓＩ野生型（Ｐ３）を試験する。Ｅ）ｐＬａｓＢ野生型（Ｐ４）を試験する。Ｆ）拡張領域を有するｐＲｓａＬを試験する。）
図９Ｂ～Ｆにおいて、回路の元の部分Ｐ＿ｏｒｉｇはＰ１と同程度の発現を生成しないことに留意されたい。したがって、インビトロ環境は、Ｐ１がＰ＿ｏｒｉｇよりも好ましいことをユーザに伝える。他のアウトプットは全て弱いＶｍａｘを示す。
教育を受けたユーザーは、回路のコンテキストでさまざまなプロモーターを実行し、理想的なプロモーターユニットを決定して設計／構築テストサイクルを進めるであろう。別々に収集されたデータは、回路の文脈において、インビトロ環境がインビボ環境に適合し、これにより生体分子ブレッドボードに収集されたデータがインビボ環境に匹敵し、生体分子ブレッドボードが標的インビボ環境において遺伝子回路をプロトタイプ化するために使用されるというユーザの信頼を提供するであろう。
実施例１３：生体分子ブレッドボードを使用してインビトロでパーツのマイニングおよび特徴付けを行う：統計の収集
指定されたプロモーターを用いてブレッドボードを実行することから収集した統計は図９Ｇにある。これらは、このインスタンスのヒル関数適合（すなわち、プロモータ伝達関数）にデータを照合することによって収集される。統計は下流の設計で使用される。
実施例１４生体分子ブレッドボードを使用してインビトロでパーツのマイニングおよび特徴付けを行う：小分子に対する応答の理解
プロモーターがどのようにして３ＯＣ１２ＨＳＬに反応するかを理解するために、図９Ｂ～図９Ｆは各３ＯＣ１２トレースの時間の関数としてｄｅＧＦＰシグナルをプロットする。図９Ｈは、各ｐＬａｓ変異体の３ＯＣ１２ＨＳＬ濃度の関数としてのｄｅＧＦＰ量をプロットしたものである。図９Ｈは図９Ｇの統計と共に、各プロモーターの特性を示し、インビボで予想される対応する伝達関数形状を得るために、Ｐ１を完全に活性化するためには、（細胞を含まない）１～１０ｕＭの範囲で３ＯＣ１２ＨＳＬ濃度を有することが必要であることをユーザに留意されたい。
同じデータを使用して、各プロモーターの最大シグナルと最小シグナルを比較し、エンジニアリングの選択に役立つ各プロモーターの倍率変化ダイナミックレンジを決定することもできる（図９Ｉ参照）。この場合、たとえばＰ３を使用すると、３ＯＣ１２に対する応答が低く、ダイナミックレンジが狭く（４ｘ）、選択に乏しくなる。
実施例１５：生体分子ブレッドボードを使用してインビトロでパーツのマイニングおよび特徴付けを行う：インデューサーの有無にかかわらずプロモーター漏出を理解する
実験のプロセスにおけるユーザーは、漏出発現がある場合にタンパク質インデューサーの非存在下で測定することを目的とする。これは、図３８Ａに示すように、ｌａｓＲタンパク質を除去することによって特定の実験で試験することができる。これは、「漏出」と結合の乱れを試験する。この実験では、図３７に列挙したのと同じレポーター配列を１ｎＭの濃度で使用する。ｐＬａｃＯ１－ＵＴＲ１－ｌａｓＲ－Ｔ５００であるプラスミド「１６３」は、存在する（灰色のバー）か存在しない（白いバー）のいずれかである。３ＯＣ１２は１μＭに、ＩＰＴＧは１ｍＭに設定する。５時間後のエンドポイント発現を陰性から減算し、図３８Ｂをプロットするために使用する。
実施例１６：生体分子ブレッドボードを使用してインビトロでパーツのマイニングおよび特徴付けを行う：新規部分設計
ｔｅｔＯ１演算子要素TCCCTATCAGTGATAGAGAを、－３５～－１０領域の周りの既知のプロモーター領域の近傍に置き、ハイブリッドプロモーター、ｐＬａｓ－ｔｅｔＯ変異体を作製する。演算子要素を配置する最適な領域は、実験的にしか決定できない。しかしながら、抑制のメカニズムは立体的であるため、ＲＮＡ転写をブロックするためには、－３５または－１０、または＋１に最も近いと考えられる。試験した変異体の例は図３９Ａに見出すことができ、ここで野生型プロモーター配列は－１０の後の変異体と＋１の後の変異体とで比較される。
この実施例では、プロモーターの有効性がインビボではなくインビトロで試験され得ることに留意すべきである。作製したプロモーターが機能的であるかどうかを試験するために、ｌａｓＲをプラスミド１６３から１ｎＭで発現させた。ｔｅｔＲ供給源、ｐＬａｃＯ１－ＵＴＲ１－ｔｅｔＲ－Ｔ５００も１ｎＭで発現した。ｌａｃ抑制を停止するために１ｍＭのＩＰＴＧも添加した。次に、ｔｅｔＯ１を有さない野生型レポーター、設計された変異体１、ａｋａ２１２（図４０Ａ参照）または設計された変異体２、ａｋａ２１３（図４０Ｂ参照）を１ｎＭで発現させた。全ての実験は、１０μＭの３ＯＣ１２ＨＳＬを含み、ｌａｓＲ活性化を最大にする。最後に、ａＴｃを１０μＭ～０．００１μＭおよび０μＭの１：１０希釈で変化させた。これは、［１５］でセルフリーを実行するためのこれまで条件を使用してｅＺＳ８抽出で実行される。
図３９は、ｔｅｔＯオペレーター部位を有する合理的に設計されたｌａｓプロモーターを示す。図３９Ａは、野生型と比較した、ｔｅｔＯオペレーター部位、変異体１および変異体２の２つの配置の設計を示す。相違は、ｔｅｔＯボックスの場所にある。図３９Ｂは、ａＴｃがｔｅｔＲ産生構築物の存在下で変化する抑制を試験するために使用される回路図を示す。図３９Ｃにおいて、野生型と各プロモーター変異体は、ａＴｃを変化させて抑制能力について試験される。示されているのは、ｔ＝３００分のエンドポイント蛍光である。図３９Ｄは、プロモーターの生成速度を示す一次導関数を示す。
図３９Ｃは、各サンプルについて、５時間後にエンドポイントをプロットして、伝達関数を得る。ここで、野生型プロモーターはｔｅｔＲまたはａＴｃに応答しないが、変異体はｔｅｔＲおよびａＴｃに応答することに留意されたい。したがって、エンジニアリングは成功しており、さらに両方の変種がかなり成功していると結論づけられる。図３９Ｄの別の表示では、ｔｅｔＲが野生型ではなくｔｅｔＯ１変異体で操作されたプロモーターに作用していることを実証するために時間トレースの一次導関数を取った。
実施例１７：生体分子ブレッドボードを使用してインビトロでパーツのマイニングおよび特徴付けを行う：感度分析およびインビトロでの回路全体の組み立て
ユーザは、回路の状況における各パラメータの影響を理解したいと考えており、上記のように、パーツの特徴付けおよびパーツの構築を通じて個々のピースのデータを収集した。この時点で、生物学ブレッドボードは（設計、構築、試験、学習）の複数のサイクルに使用された。このサイクルは、すべてのピースがどのように相互作用するかを測定するためにすべてのピースを統合する。
まず、インビトロで完全に作業することで、回路内の各パラメータを変更し、感度分析を行うことができる。この実施例は、回路の最終性能における各パラメータの変化を示す。この例では、各パネルについて、試験される変数は、物理的ＤＮＡまたはインデューサー濃度のいずれかで変更され、回路の他のすべての側面は同じに保たれることに留意する。このように、アウトプットの摂動は、摂動だけでなく、回路全体への影響も考慮に入れる。
この実施例では、図４１は各実験でどのようなコンポーネントが使用されたかを示す。具体的には、上のノード（Ａ）はプラスミド１６３（これまでに提供された配列）を指し、中間のノード（Ｂ）はプラスミド２２０（ｐＬａｓ（Ｐ１）＿ＵＴＲ１＿ｔｅｔＲ＿Ｂ１００２）（図４２参照）を指し、（Ｃ）はプラスミド２１２（Ｐ１＿ｔｅｔＯ（変異体１）－ＵＴＲ１－ｄｅＧＦＰ－Ｔ５００）（以前に提供された配列）を指す。誘導物質および濃度は実験ごとに付与される。
実験１は、図４３Ｃ、実験２～図４３Ｄ、実験３～図４３Ｅ、実験４～図４３Ｆ、実験５～図４３Ｂに対応することに留意する。すべての実験は無細胞システムｅＺＳ８で行い、１回の標準偏差のエラー（誤差）バーを得るためにそれぞれ３回繰り返した。
図４３は、ＩＦＦＬのインビトロおよびインシリコ感度分析を示す。Ａ）Ｉ－ＦＦＬについては、５つのパラメータのそれぞれが個別に修飾されるが、他のパラメータは１μＭ３ＯＣ１２ＨＳＬ、１０μＭのａＴｃ、１ｎＭのｐＬａｃ－ｌａｓＲ、０．１ｎＭのｐＬａｓ－ｔｅｔＲおよび１ｎＭのｐＬａｓ－ｔｅｔＯ－ｄｅＧＦＰで一定に維持される。すべての反応液には１ｍＭのＩＰＴＧが含まれており、残留するｌａｃＩを除去し、新しいＤＮＡ供給源を使用して３回測定する。Ｂ）ｐＬａｓ－ｔｅｔＯ－ｄｅＧＦＰプラスミドを変化させ、アウトプットｄｅＧＦＰをｔ＝３００分で測定する。実験データは黒で示される。Ｉｎｌｅｔは時系列データを表示する。Ｃ）３ＯＣ１２を変化させ、ｔ＝３００分でアウトプットｄｅＧＦＰを測定する。Ｄ）ｐＬａｃ－ｌａｓＲプラスミドを変化させ、アウトプットｄｅＧＦＰをｔ＝３００分で測定する。Ｅ）ａＴｃは変化し、抑制までの時間が示される。抑圧までの時間は、生産率が最大半量に達する時間として測定される。Ｆ）ｐＬａｓ－ｔｅｔＲプラスミドを変更する。ｔｅｔＲの直接効果を調べるために、この実験にａＴｃを加えなかった。
これらの結果に基づいて、回路機能性の一般的な理解を得ることができる。例えば、この分析は、ｄｅＧＦＰがシグナル（図４２Ｂ）に対する線形応答である一方、誘導因子３ＯＣ１２（図４２Ｃ）およびａＴｃ（図４２Ｅ）およびタンパク質ｔｅｔＲ（図４２Ｆ）はシグモイド応答であると述べている。これは、インビボで正確にｔｅｔＲ ＤＮＡおよび産生濃度を変化させることが極めて困難であることから、些細な分析、特にｔｅｔＲＤＮＡ濃度および回路応答との関係ではない。さらに、非自明な分析は、１ｎＭのＤＮＡを超える直線的な出力応答を示すｌａｓＲＤＮＡ変異モード（図４２Ｄ）である。ここでは、所与の回路内のすべてのパラメータをシステム上で変化させる方法を説明する。このアプローチは、一般に、任意のマルチノード回路に適用することができる。
実施例１８：生体分子ブレッドボードを使用してインビトロでパーツのマイニングおよび特徴付けを行う：インビトロ結果を支持するためのインシリコデータを収集する感度分析
インビトロでの知見を検証するためインシリコモデリングを行うこともできる。図４４は、図４３のインビトロ結果をモデリングデータ（点線）で重ね合わせたものを示す。モデリングデータは、インビトロで個々のピースからの訓練データに基づいて回路性能のインシリコ予測を表す。
実施例１９：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：バックグラウンドおよび方法
インシリコモデリングは、以前に記載されたインビトロ実験と並行して生体分子ブレッドボードで行うことができる。これを行うために、個々の断片をインビトロモデルで特徴付けることができ、インビトロモデルから収集したデータをインシリコモデル用に収集することができる。個々のピースが収集されると、完全回路をコンピュータを用いてシミュレートし、得られたデータを使用してインビトロで収集されたデータを検証することができる。
抽出物は、抽出物対抽出物から較正することができる。あるいは、ユーザは、定量的な妥当性検査が望まれるときに、定量的に一貫したデータを得るために各抽出セットにおいて訓練データを実行することができる。
インシリコモデリングセクションは、前述のＩＦＦＬ回路などの遺伝的回路の挙動を、ＩＦＦＬのパーツの挙動の特徴付けに基づいてＴＸＴＬモデリングツールボックスを使用して予測することに関する。
非干渉性フィードフォワードループは、パーツの特性および回路挙動予測方法論の一実施例として使用される。ＴＸＴＬモデリングツールボックスと呼ばれるMATLAB SimBiologyベースのインシリコパッケージ（「ツールボックス」）が示されており、パーツのモデルを生成するツールとして使用され、パーツのモデルを実験データにフィッティングすることによって特徴付けらる（モデルについてのパラメータを予測することによる）。MATLABのファンクションファイルとパラメータファイルに組み込まれているインシリコパーツは、パーツのインシリコライブラリに保存することができる。このライブラリからパーツを引き出して、シミュレーションすることが可能な回路に組み立てることができ、特に、これはＩＦＦＬ専用である。回路のシミュレーション動作は、回路動作の予測であり、インビトロでのシステム全体の挙動と比較することができる。
インシリコモデリング方法は、図４５のフローチャートに示すように記述されている。図４５のフローチャートは、システム（ＩＦＦＬなど）を部品（ステップ１）に分解し、次にＴＸＴＬモデリングツールボックスを使用してこれらのパーツの化学反応ネットワークと数学モデルを作成することである（ステップ２）。これに続いて、パラメータ推定アルゴリズム（ステップ３）を使用してパーツ挙動を実験データにフィッティングさせることによってパーツの特徴付けが行われる。これらの特徴づけされた部品は、その後、ＩＦＦＬ（ステップ４）のような完全な回路を作成するためにパーツを引き出すことができる特徴づけられたパーツのライブラリを構築するために使用され得る。次のステップとして、ＩＦＦＬをシミュレートしインシリコ挙動を取得し、さまざまな実験条件（ステップ５）のインビトロ挙動と比較することができる。最後に、システムの動作が一致しない場合、ワークフローはステップ２に戻り、これまでに構築された数学モデルが再評価される。その後、ステップ２～６が繰り返される。
図４５の各ステップは、以下の実施例で詳細に説明されている。
実施例２０：生体分子ブレッドボードのインシリコパーツ：（ステップ１）パーツへの分解による部品への回路
図４５のステップ１をこの実施例で説明する。ここで回路は部品またはノードに分解される。
パーツを定義する際には、次の３つのガイドラインに従った。（１）回路とは独立してパーツを定義する必要がある。（２）パーツを他のパーツと組み合わせて、より大きなシステムを形成することができる。（３）これらのパーツは、抑制、活性化、終結などの機能を実行するのに十分な成分（構成要素）を有する。
パーツの実施例は、ｔｅｔＲ－ｐＴｅｔ－ａＴｃ抑制システムである。このシステムは、ＩＦＦＬ、ネガティブオートレギュレーション回路、ガードナーコリンズ遺伝的トグルスイッチ（ガイドライン１）など、形成される回路とは独立して定義される。Genetic ToggleやRepressilator（ガイドライン２）などの回路を形成するために、ＬａｃやＬａｍｂｄａリプレッサーシステムなどの他の同様のシステムで構成することができる。明確に定義された機能、すなわち抑制（ガイドライン３）を有する。一方、ｔｅｔＲタンパク質自体は、抑制を行うことができないため、全体の一部とはみなされない。ｐＴｅｔプロモーターを有するｔｅｔＲタンパク質は一部であるが、ここではｔｅｔＲ－ｐＴｅｔ－ａＴｃは、パーツの定義となるように選択され、機能は誘導性抑制として定義される。
図５ＡのＩＦＦＬ回路から分解されたパーツは、ｐｔｅｔ－ｔｅｔＲ－ａＴｃ抑制誘導システム、ｐｌａｓ－ｌａｓＲ－３ＯＣ１２ＨＳＬ誘導性活性化システムおよびｐＬａｃプロモーター（恒常的タンパク質発現用）である。
特性決定実験（図５０）は、これらのパーツの定義を、ｐｔｅｔプロモーター、ｐｌａｃプロモーター、ｔｅｔＲリプレッサー、ａＴｃインデューサー、ｐｌａｓ－ｌａｓＲ－３ＯＣ１２ＨＳＬ誘導性活性化システムにさらに改変する。
実施例２１：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：（工程２）ツールボックスを用いた、各パーツについての化学反応ネットワーク生成
パーツの数学的モデルに属するパラメータを予測することによりパーツを特徴づける前に、各パーツの数学的モデルを作成する必要がある。異なる部分に対応するモデルの多くの機能が似ている（各部分の機能の実行中に転写や翻訳などのプロセスが発生する）、各部分のモデルを最初から作成するのではなく、ツールボックスが開発され、各パーツに関連する数学的モデルおよび化学反応ネッワーク（ＣＲＮ）を自動的に生成する。
ツールボックスの詳細な説明
ツールボックスは本質的にインビトロブレッドボードをインシリコでシミュレートするソフトウェアパッケージである。これは、電気工学のＳＰＩＣＥソフトウェアパッケージのアナログ、またはより一般的には、他の分野に存在する他のコンピュータ支援設計（ＣＡＤ）ソフトウェアである。ツールボックスは、そのシステムにＤＮＡの一部が追加されたときに、ＴＸＴＬ無細胞ライセートインビトロシステムで起こる化学反応の式を最初に生成することによって、その目標を達成する。パーツの特性評価および回路動作予測の目的で使用できるツールボックスのバージョンについては、ここで説明する。
ツールボックスは、MATLAB SimBiologyパッケージを使用して作成される。しかしながら、インシリコモデリング方法の実装は、特定のプログラミング言語またはフレームワークに限定されない。実装には、Systems Biology Markup Language（ＳＢＭＬ）などの他の言語またはフレームワークも使用できる。コンピュータサイエンス、生物／化学反応およびダイナミクスシステムの理論に関連する一般的な概念は、当業者に理解されるであろう。
高レベルでは、ツールボックスは図４６に示すインプット（入力）とアウトプット（出力）のセットとして記述できる。図４７は、ｔｅｔＲ－ｐＴｅｔ－ａＴｃ部分およびＧＦＰレポーター部分から構築された回路をツールボックスにどのように入力することができるかの実施例を示す。これは、転写因子が自身の産生を抑制することにより、負の自己調節回路のためのインビトロＴＸＴＬ無細胞抽出プロトタイピングシステムの実験プロトコルを厳密に模倣するコマンドのセットである。
図４７の最初の２つのコマンド、txtl_extractおよびtxtl_bufferは、trunk/configディレクトリ内の．ｃｓｖ構成ファイルに格納されているパラメータのリストに対応する抽出およびバッファバッチＥ１に関連するパラメータのリストにアクセスする。各コマンドは、チューブ１とチューブ２を持つモデルオブジェクトを返す。これらのモデルオブジェクトは、種（初期濃度で）および抽出物および緩衝液に関する反応を含む。これらのモデルオブジェクトの詳細な内容を以下に説明する。
次の３行は、チューブ３と呼ばれるハンドルを持つ新しい空のモデルオブジェクトを作成し、このモデルオブジェクトにtxtl_add_dnaコマンドで指定されたＤＮＡに関連するさまざまな種を設定する。txtl_add_dnaコマンドは、以下のように詳細に説明する（tube3、「ptet（50）」、「rbs（20）」、「tetR（1200）」、1、「plasmid」）引数を入力として取る。
（ａ）チューブ３：ＤＮＡおよび関連する種を加えるためのモデルオブジェクト（チューブ３）のハンドル。
（ｂ）ｐｔｅｔ（５０）：任意のプロモーター長（塩基対における）の説明の後に続くユニークなプロモーターＩＤストリング。プロモーターＩＤ文字列（それを＜PROMOTER＞と呼ぶことができる）は、トランク／コンポーネントディレクトリーにある２つのファイルに対応していなければならない：txtl_prom_ <PROMOTER>.mファイルはプロモーターに関連したコードで、プロモーターに関連付けられた種、反応、およびパラメータをセットアップし、<PROMOTER>によって与えられたプロモーターに関連するすべてのパラメータの値を含むtxtl_param_ <PROMOTER>.csvファイルが含まれる。括弧内に指定されていない場合は、パラメータ設定ファイル（txtl_param_ <PROMOTER>.csv）からデフォルトの長さが適用されるため、プロモーターの長さは任意である。
（ｃ）ｒｂｓ（２０）およびｔｅｔＲ（１２００）は、ＲＢＳおよび使用される遺伝子を特定する。ＲＢＳには現在、コードとパラメータの設定ファイルが別々に用意されていないが、ツールボックスはさまざまなＲＢＳに使用されるため、ＲＢＳは異なるプロモーターや遺伝子のように別々のファイルを使用する。
（ｄ）１：ｎＭ（ナノモル）であるとみなされる、添加されるＤＮＡの濃度を指定する数値引数。
（ｅ）プラスミド’：このコマンドによって特定されるＤＮＡがプラスミドであるか直鎖であるかを特定する文字列。プラスミドＤＮＡと直鎖ＤＮＡとの唯一の違いは、インビトロおよびインシリコシステムの両方においてｇａｍＳタンパク質によって減弱され得るプロセスである、ＲｅｃＢＣＤエキソヌクレアーゼの作用下で直鎖ＤＮＡが分解する（その長さに反比例する速度で）ことである。
次のコマンドtxtl_combineは、３つのモデルオブジェクト、すなわち反応オブジェクトと種オブジェクトの内容を単一のモデルオブジェクトに単純に結合し、モデルオブジェクトを作成する。モデルオブジェクトは、３つの構成モデルオブジェクトの量の合計と同じ量を有し、種の量は保存されている。
txtl_addspeciesコマンドは任意である。このコマンドは、５００ｎＭの小分子アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）を表す種オブジェクトをモデルオブジェクトに追加するために使用される。この分子は、ｔｅｔＲリプレッサーに結合して、ｐＴｅｔプロモーターを抑制する能力を隔離し、除去する。
次のコマンドtxtl_runsimは、以前に設定できなかった種やモデルオブジェクト内の特定のイベントオブジェクトを含むモデルオブジェクト内の反応を設定し、結果の完全なモデルオブジェクトをシミュレートし、シミュレーションから出力データを生成する。この特定の場合の出力データは、シミュレーションデータとシミュレーションデータに関連するさまざまなメタデータの両方を有するSimBiology simDataオブジェクトとして配置される。
図４７に示す最後のコマンドはtxtl_plotコマンドであり、モデルオブジェクトとｓｉｍＤａｔａオブジェクトをインプットとして取得し、さまざまなタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびリソース種（アミノ酸、ヌクレオチド、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム）の時間発展の標準プロットをシステムにおいて生成する。
図４８に、txtl_plotコマンドの出力を示す。これは、txtl_plotコマンドによって生成される標準化されたプロットである。このプロットは、システム内の様々なタンパク質（上のサブプロット）、システム内のＤＮＡおよびＲＮＡ（左下）、およびリソースの使用状況（右下）を示す。左下のサブプロットでは、ＲＮＡ濃度は実線で示され、左の軸であるが、ＤＮＡ濃度は同じ配色に従っており、遊離の（結合していない）ＤＮＡに対応し、破線で示され、軸は右側にある。右下のサブプロットでは、リソース濃度は１に正規化される。これらの曲線を生成するさまざまなダイナミクスの詳細は、ツールボックスの詳細な説明で提供される。
この記述レベルでは、シンボル体系（SimBiology）のイベントとルールを指定してモデルオブジェクトに追加することができる。また、ユーザーはデータを使用してカスタムプロットを作成し、範囲がグローバルである（つまり、反応レベルではスコープされていない）パラメータを作成することもできる。
実施例２２：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：ツールボックスおよび種の構文の詳細な下位の説明
このレベルでは、ツールボックスを構成する要素の構文および語義を説明する。
また、ツールボックスは、数学的処理に加えて、文字列を使用して情報を正規表現の形で処理する。特に、それは種によって形成された種および複合体を示すために文字列を使用し、反応は正確な種の文字列に関して直接指定されるか、またはその反応に関与する種のパターンに一致する正規表現に関して指定される。
種と結合複合体を指定する構文を以下に説明し、ツールボックスが生成するすべての反応を列挙する。
種を特定するために使用される構文：ツールボックス内の種の主なクラスは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、小分子（インデューサーなど）、タンパク質多量体、ＲＮＡｓｅまたはＲｅｃＢＣＤなどの特殊酵素である。これらの種の多くは修飾子を有することができる。
ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質を命名する構文は、それぞれの全体のパターン、ＤＮＡ<PROMOTER>--<UTR>--<GENE>、ＲＮＡ<UTR>--<GENE>、タンパク<GENE>に従う。ここで、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質のストリングの後にスペースが続き、次いで、プロモーター、非翻訳領域および遺伝子／コード配列に関連するポリヌクレオチド配列を特定するストリングが続く。これらの文字列は、コンピュータを用いて、ポリヌクレオチド配列をシミュレートするために必要な反応およびパラメータに関する情報を含むファイルにアクセスするために使用される。これらの文字列は、プロモーター指定（<promspec>）、リボソーム結合部位指定（<rbsspec>）および/またはコード配列指定（<genespec>）の３つの指定のセットに含まれる情報から特定される。ここで、<promspec>、<rbsspec>および<genespec>は、塩基対における各ポリヌクレオチド配列の長さとともに、プロモーター、ＵＴＲおよびＤＮＡ上のコード配列領域におけるポリヌクレオチド配列の名前を指定する実際のストリングのプレースホルダーである。
これらの仕様は、図４７に示すtxtl_add_dna関数への入力として使用され、テーブル１で詳述される。
Figure 0007042619000002
テーブル２は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク種の名称を定義するための３つのタイプの仕様からのポリヌクレオチド名情報の使用のいくつかの例を示す。<PROMOTER>、<UTR>、および<GENE>を互いに分離するために二重ダッシュ(--)を使用し、各領域内のポリヌクレオチドを表す文字列を区切るためにダッシュ（－）を１つ使用する。例えば、ｌｖａ分解タグは、単一のハイフンによって主遺伝子名（ｔｅｔＲ）から分離される。同様に、エキソヌクレアーゼによる直鎖ＤＮＡの分解から保護するために使用されるジャンクＤＮＡは、プロモーター名ｐｔｅｔから単一のダッシュで区切られる。
Figure 0007042619000003
二量体化または四量体化が可能なタンパク質については、二量体または四量体文字列がタンパク質文字列の末端に付加される。例えば、ｔｅｔＲタンパク質は二量体化し、ｌａｃＩタンパク質は四量体化する。これらのタンパク質に関連する文字列をテーブル３に示す。
Figure 0007042619000004
小分子は構造を持たない特有の文字列を使用するのみである。小分子の例はテーブル４に示されており、タンパク質命名規則構造を有する文字列を有するｇａｍＳおよびｓｉｇｍａ７０などの特殊なタンパク質も示している。
Figure 0007042619000005
最後に、種名で形成された複合体の命名構文について説明する。条件Ｘ：Ｙは、互いに結合して複合体を形成する種ＸおよびＹに採用される。より大きな複合体は誘導的に定義される。例えば、複合体AA:AGTP:Ribo:RNA rbs--deGFPは、大きな複合体において互いに結合したＡＡ、ＡＧＴＰ、ＲｉｂｏおよびＲＮＡｒｂｓ--ｄｅＧＦＰを表す。種または複合体の名前にスペースがある場合、シンボロジー（SimBiology）は種または複合体の周りに配置された角括弧を必要とする。したがって、[AA：AGTP：Ribo：RNA rbs--deGFP]は、特に反応で使用される場合、上記と同じ複合体を指す（以下の生化学反応のリストを参照）。
実施例２３：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：ツールボックスおよび生化学反応リストの詳細な下位の説明
生化学反応リスト：本明細書に記載されるのは、ＤＮＡ断片が系に加えられたときに設定される生化学反応である。主な反応は、転写、翻訳、翻訳後修飾（成熟、多量体化）、ＲＮＡ分解、直鎖ＤＮＡ分解および保護、タンパク質分解、誘導因子結合、転写因子結合およびエネルギーソースの分解のようなサブセットに分けることができる。外来の部分には他の特別な反応が存在することがある。主要反応の各々は、以下のように示される。
転写:
Ｒ１）シグマ因子に対してＲＮＡポリメラーゼを結合してＲＮＡＰ７０複合体を形成する
RNAP + [protein sigma70] <-> RNAP70

Ｒ２）得られたＲＮＡＰ７０複合体とＤＮＡ結合する
[DNAptet--rbs--TetR] + RNAP70 <-> [RNAP70:DNAptet--rbs--TetR]

Ｒ３）すべての４つの順列における、ＡＧＴＰおよびＣＵＴＰヌクレオチド種に結合するＲＮＡＰ７０：ＤＮＡ複合体
[RNAP70:DNAptet--rbs--TetR] + AGTP <-> [AGTP:RNAP70:DNAptet--rbs--TetR]
[RNAP70:DNAptet--rbs--TetR] + CUTP <-> [CUTP:RNAP70:DNAptet--rbs--TetR]
[AGTP:RNAP70:DNAptet--rbs--TetR] + CUTP <-> [CUTP:AGTP:RNAP70:DNAptet--rbs--TetR]
[CUTP:RNAP70:DNAptet--rbs--TetR] + AGTP <-> [CUTP:AGTP:RNAP70:DNAptet--rbs--TetR]

Ｒ４）ターミネーション部位でＲＮＡＰ７０を有するＤＮＡをも産生する、ＲＮＡ産生ステップ
[CUTP:AGTP:RNAP70:DNAptet--rbs--TetR] -> [term_RNAP70:DNAptet--rbs--TetR] + [RNA rbs--TetR]

Ｒ５）ヌクレオチドを消費してＲＮＡＰ７０およびＤＮＡに戻るがＲＮＡは産生しない、消費反応
[CUTP:AGTP:RNAP70:DNAptet--rbs--TetR] -> RNAP70 + [DNAptet--rbs--TetR]

Ｒ６）ＤＮＡ複合体のターミネーター部位に結合するＲＮＡＰ７０をその成分に分離する
[term_RNAP70:DNAptet--rbs--TetR] -> RNAP70 + [DNAptet--rbs--TetR]
翻訳：
Ｒ７）リボソームに結合するＲＮＡ
[RNA rbs--TetR] + Ribo <-> [Ribo:RNA rbs--TetR]

Ｒ８）アミノ酸およびＡＴＰ ＧＴＰリソースに結合するリボソームＲＮＡ複合体
[Ribo:RNA rbs--TetR] + AA + AGTP <-> [AA:AGTP:Ribo:RNA rbs--TetR]

Ｒ９）翻訳のための消費反応
[AA:AGTP:Ribo:RNA rbs--TetR] -> [RNA rbs--TetR] + Ribo

Ｒ１０）翻訳のためのタンパク産生反応
[AA:AGTP:Ribo:RNA rbs--TetR] -> [RNA rbs--TetR] + [タンハ゜ク TetR] + Ribo
翻訳後修飾：
Ｒ１１ａ）タンパク修飾／フォールディング
[protein deGFP] -> [protein deGFP*]
[protein ClpX] -> [protein ClpX*]
ＲＮＡ分解：
Ｒ１２）ＲＮａｓｅに結合する、種々の結合形態におけるＲＮＡ
[RNA rbs--TetR] + RNase <-> [RNA rbs--TetR:RNase]
[AA:AGTP:Ribo:RNA rbs--TetR] + RNase <-> [AA:AGTP:Ribo:RNA rbs--TetR:RNase]
[Ribo:RNA rbs--TetR] + RNase <-> [Ribo:RNA rbs--TetR:RNase]

Ｒ１３）分解工程
[RNA rbs--TetR:RNase] -> RNase
[AA:AGTP:Ribo:RNA rbs--TetR:RNase] -> AGTP + AA + Ribo + RNase
[Ribo:RNA rbs--TetR:RNase] -> Ribo + RNase
直鎖ＤＮＡ分解（degrdation）および保護
Ｒ１４）ＲｅｃＢＣＤによるＤＮＡ分解、酵素的な反応
[DNAptet--rbs--TetR] + RecBCD <-> [DNAptet--rbs--TetR:RecBCD]
[DNAptet--rbs--TetR:RecBCD] -> RecBCD

Ｒ１５）ｇａｍＳによるＲｅｃＢＣＤ隔離
RecBCD + [protein gamS] <-> [RecBCD:gamS]
転写因子およびインデューサー結合および調節
Ｒ１６）ＴｅｔＲ二量体化
2 [protein tetR] <-> [protein tetRdimer]

Ｒ１７）ＴｅｔＲとのＤＮＡ結合 これは、転写に関するＲＮＡＰ７０と結合できない、または弱く結合し（大きな解離定数）、したがって捕捉される
[DNA ptet--rbs--tetR] + [protein tetRdimer] <-> [DNA ptet--rbs--tetR:protein tetRdimer]

Ｒ１８）ａＴｃにより捕捉されるＴｅｔＲ
[protein tetRdimer] + 2 aTc <-> [2 aTc:protein tetRdimer]
エネルギーソース分解
Ｒ１９）３時間後にＡＧＴＰ分解、つまり、以下の反応がの割合が３時間で０から非ゼロへと変化する。これは、シンボロジーイベントにより実行される。
AGTP -> AGTP_UNUSABLE

Ｒ２０：タンパク分解反応（ＣｌｐＸにより媒介される）
[protein tetR-lva] + [protein ClpX] <-> [protein ClpX:protein tetR-lva]
[protein ClpX:protein tetR-lva] + AGTP -> [protein tetR-lva**] + [protein ClpX]
[protein ClpX] -> null
実施例２４：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：ツールボックスおよび全体的な機能構造の詳細な下位の説明
ツールボックスの全体的な機能構造を以下に説明する。
図４９は、ツールボックス内の情報フローを示しており、ユーザーレベルの機能間の情報の全体的な流れを示す。各機能内の情報フロー（図４９の丸い四角で囲まれたボックスで示されている）について、以下に詳細に説明する。
各機能（図４９の丸い囲みで示されている）はテーブル５に記載されている。
Figure 0007042619000006
Figure 0007042619000007
Figure 0007042619000008
Figure 0007042619000009
Figure 0007042619000010
Figure 0007042619000011
Figure 0007042619000012
Figure 0007042619000013
実施例２５：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：ツールボックスの詳細な下位レベルの記述並びに種および反応のドライバーモード構造のセットアップ
ツールボックス内の関数の大部分（txtl_add_dnaおよびそれが呼び出すほとんどの関数など）は、種のセットアップ（Setup Species）と反応のセットアップ（Setup Reactions）モードがある。まず、これらのファイルはすべて種のセットアップモードで呼び出され、その後、反応のセットアップモードで呼び出される。その理由は、場合によっては、モデルに存在する種の正確なバージョンを条件とする特定の反応を設定する必要があるためである。
例えば、ｔｅｔＲ二量体はｐＴｅｔプロモーターと結合しなければならないため、ｐＴｅｔプロモーターの反応を設定するには、システムに存在するｔｅｔＲ二量体の正確なバージョンを知る必要があるが、この二量体は、ｌｖａでタグされたまたは非ｌｖａタグ形態で存在する。したがって、ｔｅｔＲ二量体に結合するｐＴｅｔプロモーターの反応が確立された時点で、ｔｅｔＲ二量体種がモデルで特定されていなければならない。これを行うフェールセーフの唯一の方法は、上述した別個のセットアップ種およびセットアップ反応モードを使用し、セットアップ種別モードをセットアップ反応モードに先行させることであることがわかる。
実施例２６：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：ツールボックスの詳細な下位の説明およびツールボックスのディレクトリ構造
ツールボックスのディレクトリ構造をテーブル６に示す。最上位ディレクトリはトランクと呼ばれ、テーブル６に示す、すべてのディレクトリはトランクのサブディレクトリである。
Figure 0007042619000014
Figure 0007042619000015
実施例２７：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：ツールボックスの詳細な下位の説明、インシリコで生成されたパーツ
図５０は、トレーニングデータを生成するために実施された５つの特徴付け実験を示す。図５１は、これらの５つの実験のためにツールボックスによって作成されたモデルオブジェクト内のトップレベルのコードおよび対応する種および反応を提供する。推定されたパラメータのリストも、実験２～５への入力として使用されたこれまでの特徴付けからのパラメータと共に提供される。パラメータ推定方法は、図５２および図５３を参照して、次のセクションで詳細に説明される。
モデルを訓練するために、図５０に示すように、これら５つの実験から収集したＴＸ－ＴＬデータを使用した。これらのＴＸ－ＴＬ実験は、最終的な回路が組み込まれているのと同じ抽出物で実施され、基本的な特性を試験するために使用され、インシリコの異なる組成物においてこれらの特性を使用する回路の構築を可能にする。
図５１Ａは、図５０の実験１について推定されたモデル設定およびパラメータを示す。図５１Ｂは、図５０の実験２のモデル設定およびパラメータ推定を示す。この部分について実行されたパラメータ推定は、実験１のパラメータ推定で推定されたパラメータを使用した。特に、リボソーム結合およびアミノ酸結合パラメータもその実験において推定され、したがって固定として、すなわちこの実験におけるパラメータの推定はこれらの値に条件付けられた。
図５１Ｃは、ｔｅｔＲ抑制およびａＴｃ誘導をシミュレートするために使用されるモデルの詳細を示す。これらの実験は密接に関連しているので、図５０の実験３および４のパラメータ推定は同時に実行された。
図５１Ｄは、図５０の実験５に対応するｌａｓＲ活性化システムモデルおよびパラメータ推定を示す。
実施例２８：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：（ステップ３）各部分の特徴づけに続いてライブラリに構築
パラメータ推定アルゴリズムを使用して、部分モデルを実験データに適合させた。当業者に理解されるように、多くの決定論的アルゴリズムまたは確率論的アルゴリズムを使用することができる。
この例では、パラメータ推定方法は、インプットとして、（１）モデルを適合させるための実験データ、（２）実験データに適合するようにシミュレーションデータを生成することができるモデル、（３）フィッティングの過程で推定されるべきモデルのパラメータのリスト、（４）パラメータの初期値、をとることができる。これらはランダムに生成することができるが、多くの場合、パラメータ推定アルゴリズムは、これらの初期値を慎重に選択して実行する方が効率的である。したがって、モデルに手作業でデータを当てはめることによって、パラメータの初期推測が行われる前処理ステップが実行される。これには、パラメータ値を変更し、種の濃度対時間曲線がどのように変化するかを調べ、モデルの挙動がある程度データに似てくるまで繰り返す。このようにして、局所最小値への収束の可能性が高まり（パラメータ空間におけるコスト関数の）、モデルとデータとの間の良好な適合につながる可能性がより高くなる。（５）各モデルは試薬や種の初期濃度を変化させた実験に適合しているため、投与ストラテジーを特定する必要があり、パラメータの推定方法は、パラメータ推定を実行しながらコンピュータを用いて同等の変化を行うことができる。これは投与ストラテジーと呼ばれ、例えば、シンボロジーのパラメータ推定方法で特定することができる。（６）シミュレーションオプションは、許容誤差など、使用する解決や推定方法などを指定できる。これらは、使用されている推定方法に大きく依存しており、しばしば反復する必要がある。
このステップからの出力は、推定されたパラメータのリストと、パラメータ推定値における関連するエラー／信頼性の様々な統計的尺度を提供する。
これらの出力（アウトプット）を使用して、対応するパーツのパラメータコンフィグレーションファイルを生成することができ、これらのパーツを特徴付けられたパーツのライブラリに追加することができる。このライブラリは、表テーブル６に示すように、トランクディレクトリの成分ディレクトリである。パーツコードファイル（ＭＡＴＬＡＢの．ｍファイル）とパラメータ設定ファイル（各パーツのパラメータを含む．ｃｓｖファイル）で構成される。この一般的な方法論は図５２で説明される。
図５２に、パラメータ推定の全体的な手順を示す。これらのパラメータは、局所最適値に近づくように検査および手動調整によって最初に適合された。次に、パラメータ推定アルゴリズムを使用した。このパラメータ推定戦略は、図５１Ａ～Ｄに示されたモデルに適用され、所定の推定値のパラメータが入力として使用されて次の推定値に対して固定された場合（すなわち、次の推定は前のものに条件付けられた）、各モデルについて推定されたパラメータも示される。
図５３は、部品特性決定手順と、実験１で推定されたパラメータが、残りのパーツの他のパラメータの推定にどのように固定されて使用されるかを示す。このように、パラメータがパーツ間で共通する場合は常に、同じ値を有する。
モデルをインビトロデータにフィッティングした結果を図５４に示す。この情報は、図５１に示されたコードを図５２および５３に指定された方法論に従って実行することによって生成され、パーツおよびコア構成ファイルに図５１Ａ～Ｄで指定されたパラメータの値を取り込む。シミュレーションデータは、図５２の２つの点：前処理段階の後（最初のダイヤに対する回答が「シミュレーションがデータにマッチする」が「イエス」である場合）、別の観点から、２回目のダイヤに対する答えが「イエス」であるかどうか、で生成される。このデータは、図５４の「初期」および「適合させた」線に対応する（それぞれ点線および黒の実線）。コードを使用してデータが生成されると、インビトロ実験からの対応するデータがＭＡＴＬＡＢにインポートされ、適切な数値アレイに配列される。シミュレーションデータと実験的インビトロデータのエンドポイントが抽出され、実験データからの平均と標準偏差がＭＡＴＬＡＢで計算され、図５４の各サブプロットの明るい実線としてプロットされる。
図５４において、各サブ図面のＹ軸は、図５０で説明した実験の１つについてのＧＦＰのエンドポイント濃度であり、Ｘ軸は変化する種の濃度である。サブ図面は、以下のような実験に対応する。左上：実験１と同様にｐＴｅｔ－ＧＦＰ ＤＮＡを変化させる。右上：実験２のようにｐＬａｃ－ＧＦＰ ＤＮＡを変化させる。左中央：実験３ごとにｔｅｔＲ ＤＮＡを変化させる。中右：実験４ごとにａＴｃを変化させる。ボトム：実験５ごとに３ＯＣ１２ＨＳＬを変化させる。
実施例２９：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：（工程４）全回路へのパーツの組成、その後の種々の実験条件下での回路のシミュレーション。
完全なＩＦＦＬ回路へのパーツの構成には、成分ディレクトリから特徴付けられたパーツからＩＦＦＬを構築する必要がある。この実装では、ptet（txtl_param_ptet.csv）、plac（txtl_param_plac.csv）、tetR（txtl_param_tetR）、lasR（txtl_param_lasR）、およびplas（txtl_param_lasR）の設定ファイルに通知するとともに、ｐｔｅｔおよびｐｌａｓパラメータはＩＦＦＬ（図４１のコンポーネントＣ）であれば、コンポーネントＣで使用されるコンビナトリアルプロモータのパラメータを知らせるためにも使用される。ＩＦＦＬツールボックスのコードを以下の図５５に示す。
図４４は、図４３のインビトロ結果を、上記の方法から生成されたインシリコモデリングデータ（点線）と比較する。
実施例３０：生体分子ブレッドボードのインシリコ部分：（ステップ６）デバッグおよびパーツ変更
シミュレーション結果が実験データと一致しない場合、モデルを修正したり、パーツを再調整したり、異なる実験条件下で、より多くのデータを収集したりすることができる。
異なる実験条件下でのデータ収集の一例は、ｔｅｔＲタンパク質を精製し、それをｐｔｅｔプロモーターの制御下でレポーターを含むチューブに添加することによるｔｅｔＲ抑制強度の直接測定である。
より良好な特徴付けデータの他の例は、以下を含む：（１）ＲＮＡを直接測定することができるように、全てのＲＮＡをアプタマー配列で標識し、より正確なパラメータ推定値を得る。（２）３ＯＣ１２ＨＳＬの有無やｌａｓＲ量の変化など、より多くの部分でｐｌａｓ－ｌａｓＲ－３ＯＣ１２ＨＳＬシステムデータを収集する。（３）コンビナトリアルプロモーターのためのプラスおよびｐｔｅｔパラメーターを使用する代わりに、ｐｌａｓｔｅｔＯコンビナトリアルプロモーターを試験する。
所望のモデル精度および意図された用途に応じて、異なるモデル調整を行うことができる。多数の極小値が予想される場合には、シミュレーテッドアニーリング、遺伝的アルゴリズム、およびＭＣＭＣ法などの他のパラメータ推定アルゴリズムも使用できる。
図４５のワークフローのステップ６は、手順のあらゆる前のステージに戻り、ステップを繰り返すことができる。
実施例３１：生体分子ブレッドボード感度分析：ａＴｃに対する感受性
生体分子ブレッドボードを用いて、回路内の調節可能なパラメーターの感度分析を行った。この例では、インシリコ試験を並行して実施し、インビトロの結果を重ね合わせることができる。
感度分析の結果は、飽和した３Ｃ１２ＨＳＬで最大のｌａｓＲ活性化を仮定して、パルス状の挙動を誘発するのに必要なｔｅｔＲ、ａＴｃ、ｌａｓＲ、およびｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ ＤＮＡの量を予測するＣｌｐＸＰ分解を遵守した。
ＴＸ－ＴＬにおけるＣｌｐＸＰ分解は、無細胞システムに蛍光標識されたｓｓｒＡバージョンおよび非ｓｓｒＡバージョンのｄｅＧＦＰを添加し、異なる開始濃度のｄｅＧＦＰから経時的に分解を観察することによって理解することができる。図５６から、分解は初期状態では定常状態であるが、ＣｌｐＸＰの分解ポテンシャルが消耗するにつれて低下することが分かる。
図１５に示すように、あまりにも多くのａＴｃまたは少なすぎるｔｅｔＲ発現はオープンループシステムをもたらし、一方、ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡ産生速度がＣｌｐＸＰ分解速度を克服することができる前に回路停止をもたらす。その後、インビボで生体分子ブレッドボードの発見を検証するために進められた。図１５は、インビトロ（左）およびインビボ（右）におけるＴｃ変化を示す。左のインビトロプロットは、ａＴＣ量（ｘ軸）の関数としてのｄｅＧＦＰ発現（ｙ軸）を示す。右のインビボのプロットは、変化するａＴｃ量（左から右：１０００ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、および０ｎｇ／ｍＬ）を有する、これまでに記載した１６×１６グリッドに対応するＧＦＰシグナルデータを示す。ダークグレーはパルスを示し、ライトグレーはパルスなしを示す。
特に、インビボデータは、図１２Ｂに示される定量的データ値に基づくが、０または１の定量的表示に変換された。値０はパルスが生成されない（濃い灰色）ことを意味し、値１はパルスが生成される（明るい灰色）ことを意味する。
ａＴｃの量が減少するにつれて、インビボで信号量も減少することに留意されたい。図１２Ａ～Ｂにおいても同じ傾向が観察される。
実施例３２：生体分子ブレッドボード感度分析：ｌａｓＲに対する感受性
生体分子ブレッドボードを実行するプロセスでは、トップレベルのゲインが回路の最終性能を変化させないなどの予期せぬ結果をユーザが見るかもしれない。この例では、ｌａｓＲの変更に注目しているが、これは予期しない結果に一般化することができる。この予想外の結果はインビトロ環境で収集され、コンピュータを用いてモデリングで確認できる。
この例では、インビボデータは、以下の例外を除いて、これまでの実施例で同じ手順を実行することによって収集された。
高いゲインバージョンおよび低いゲインバージョンについては、２つのプラスミドを３６０に置き換えた（Plac_BCD22_lasR_T500）。高いゲインのためのこれらのプラスミドは、３７３：Plac_BCD2_lasR_T500および３７４：Plac_BCD22_lasR_T500であった。プラスミド３７３および３７４の配列をそれぞれ図２０Ａおよび図２０Ｂに示す。
これらのプラスミド上でＲＢＳを変化させることにより、プラスミド３７３を使用する株は、通常の量のｌａｓＲを産生するプラスミド３６０および有意により少ないｌａｓＲを産生するプラスミド３７４を用いる株を使用して株よりも有意に多くのｌａｓＲを産生するはずである。ここで、「ゲイン」という用語は、回路の上のノードを駆動するｌａｓＲの量を指す。インビトロからの予期せぬ発見は、ある量のｌａｓＲ以上では、回路の出力応答は同じまま、すなわち高いｌａｓＲでは回路の出力はｌａｓＲ濃度に対して不変であるということである。
ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡプラスミドのための８個のＲＢＳ変異体およびｔｅｔＲプラスミド用の同じ８個のＲＢＳ変異体（ＵＴＲ１／ＢＣＤ７／ＢＣＤ１３／ＢＣＤ１４／ＢＣＤ１６／ＢＣＤ２２／Ｂ００３１）の組み合わせを用いて６４株のセットを作製した／Ｂ００３３）。このように、これまでに記載した、３６０を組み合わせた２５６株、１６ＲＢＳ変異体ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡおよび６ＲＢＳ変異体ＴｅｔＲに加えて、６４の３７３×８個のＲＢＳ ｄｅＧＦＰ－ｓｓｒＡｘ８ ＲＢＳ ｔｅｔＲ株と６４の３７４×８個のＲＢＳ ｄｅＧＦＰ株－ｓｓｒＡｘ８ ＲＢＳ ｔｅｔＲ株がある。
実験は、インビボ翻訳実験について以前に記載したのと同じ方法で行った。ＢＣＤ２は、１５～５０単位の強度、２．５～２０単位を有するＢＣＤ２０、およびMutalikらによる以前の刊行物に基づく１単位を有するＢＤＣ２２を有すると推定される。［４８］
図１６は、生体分子ブレッドボードにおける予期せぬ結果、すなわち回路がｌａｓＲ濃度に対して比較的不変であり、インビボデータによる検証であることを示している。左に示すのは、３ノードフィードフォワードループの状況でｌａｓＲ濃度を変化させることによって収集された無細胞データである。右側に示すのは、収集されたインビボのデータであり、上のプラスミド-pLac-BCDX-lasR-はパネル間でＢＣＤ強度が変化する。各パネルにおいて、各行はｄｅＧＦＰプラスミドのＢＣＤに対応し、各列はｔｅｔＲプラスミドのＢＣＤに対応する。
図１６は、インビトロで観察された予期せぬ結果が、インビボと比較して検証可能であることを示している。ｌａｓＲ産生についての、高強度、中強度、または低強度のＲＢＳを使用して対応するゲインをインビボで変化させると、同様の傾向が見られる。つまり、高ゲインと中ゲインが同じパルス出力を生成し、低ゲインはシグナルを生成しない。これは、インビトロでの結果がインビボ結果と相関し、上のノードの強度の増加が出力パルスに影響を及ぼすことを示す。このような相関は、インシリコモデリングおよびインビトロ実験によって予測することができる。
実施例３３：遺伝子学的リングオシレータの無細胞特性解析：ＤＮＡおよび株構築
実施例３３～４０は、遺伝子学的リングオシレータの迅速な無細胞順方向エンジニアリングに関連する。これらの実施例は、３ノード、４ノードおよび５ノードのネガティブフィードバック構造をインビトロで実施および特徴づけることによって、無細胞システムを用いて遺伝子ネットワークの複雑な動態挙動を特徴づけ、操作できることを示す。
ゴールデンゲートアセンブリまたはアイソサーマルアセンブリのいずれかを用いてＤＮＡを構築した。直鎖ＤＮＡについては、以前に発表されたラピッドアセンブリプロトコールを用いて、すべてのＤＮＡを「ｖ１－１」ベクター上に構築した［４９］。直鎖ＤＮＡ構築物を図２１Ａに要約する。オリジナルのリプレッシレータープラスミド、ｐＺＳ１［３］を、ＯＲ２＊突然変異体の初期特性決定および構築のための鋳型として用いた。伝達関数プラスミドは、Transcriptic、Inc.により構成された。他のプラスミドについては、部分配列を、Ａｄｄｇｅｎｅから得たか、またはｇＢｌｏｃｋｓまたはｓｓＤＮＡアニーリングしたオリゴヌクレオチド（Integrated DNA Technologies）上で合成した。特定のプラスミドは、二次構造を持たないセグメントを必要とし、これはＲ２oＤＮＡによって設計された［５０］。ＪＳ００６［５１］を、複製起点プラスミドと共形質転換して操作された株を作製した。具体的には、負のフィードバックオシレータユニットをｐＳＣ１０１＊低コピープラスミド（ａｍｐＲまたはｋａｎＲ）にクローニングし、一方、レポーターをｃｏｌＥ１媒体コピープラスミド（ｋａｎＲまたはｃｍＲ）にクローニングした（図２１Ｂ～Ｄ）。レポーターコピー数を調節するために、すべての実験を３７℃未満で行った［５２］。ＪＳ００６のｒｅｃＡ＋性質および高い複合性のオシレータプラスミドまたはトリプルレポータープラスミドに起因するプラスミド欠失を避けるために、株継代を最小限に抑えた。インビトロおよびインシリコの結果に基づいて、強力な転写および翻訳［１］単位を用いて最大限のゲインを得た。
実施例３４：遺伝子学的リングオシレータの無細胞特性解析：インビトロでの実験および分析
ＴＸ－ＴＬ反応
ＴＸ－ＴＬの調製は、Ｒｏｓｅｔｔａ２プラスミドと同時形質転換した株「ＪＳ００６」を用いて、１：２：１抽出物：ＤＮＡ：緩衝液比を実施することにより、これまで記載されたようにして行った［１５］。これは、８．７ｍｇ／ｍＬのタンパク質、１０．５ｍＭのＭｇ－グルタメート、１００ｍＭのＫ－グルタメート、０．２５ｍＭのＤＴＴ、０．７５ｍＭのロイシンを除く各アミノ酸、０．６３ｍＭのロイシン、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭのＡＴＰおよびＧＴＰ０．９ｍＭのＣＴＰおよびＵＴＰ、０．２ｍｇ／ｍＬのｔＲＮＡ、０．２６ｍＭのＣｏＡ、０．３３ｍＭのＮＡＤ、０．７５ｍＭのｃＡＭＰ、０．０６８ｍＭのフォリン酸、１ｍＭのスペルミジン、３０ｍＭの３－ＰＧＡ、２％のＰＥＧ－８０００を含む抽出物「ｅＺＳ４」をもたらした。直鎖ＤＮＡを利用する実験のために、ＧａｍＳを３．５μＭの最終濃度まで添加した［４９］。
定常状態反応
実験は、溶解物ベースのＴＸ－ＴＬ混合物の条件を最適化するためのいくつかの改変を伴って、以前に記載されているように［１５，２７］マイクロ流体ナノリアクター装置で行った。反応温度は３３℃であった。溶解物を５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ５ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ７．２）中の最終濃度の２倍に希釈した。反応緩衝液混合物を鋳型ＤＮＡと合わせ、最終濃度２ｘにした。２４時間の実験のために、これらのストック３０μｌを調製した。実験中、ライセートとバッファー／ＤＮＡ溶液を別々のチューブに入れ、チップ上に移し、約６℃に冷却し、オンチップで混合した。
実験は、希釈時間（ｔｄ＝ｌｎ（２）μ－１）に相当する約２．８～０．５ｈ－１の間の希釈率（μ）で１５～８５分間実施した。これらは、７～１０分の時間間隔で反応器容積の７～２５％を交換する希釈ステップで達成され、交互に新鮮な溶解物ストックまたは新しいバッファー／ＤＮＡ溶液を反応器に加えた。希釈率は各実験の前に較正した。リプレッシレーターネットワークのリミットサイクル分析の初期条件は、各実験の開始時に予め合成されたリプレッサータンパク質を添加することによって設定した。このために、Ｃ１リプレッサー（Ｃｉｔｒｉｎｅレポーターとともに）とＴｅｔＲリプレッサー（Ｃｅｒｕｌｅａｎレポーターとともに）を２．５時間に一度に発現させた。チップ上で、最初の反応は、合成前反応が２５％、ＴＸ－ＴＬ混合物およびリプレッシレーターテンプレートＤＮＡが７５％新鮮であるように混合した。その後、１９．２±０．３分の時間ｔｄで実験を行った。４ノードの実験の初期条件は、２．５μＭａＴｃまたは２５０μＭＩＰＴＧであり、実験は、４４．５±０．９分で実施した。定常状態反応で使用されるＤＮＡテンプレート濃度を図２１Ｅ～Ｆに列挙する。これまでに公表されたプロトコル、Ｈｉｓ６精製法、その後、サイズ排除クロマトグラフィーおよびブラッドフォードアッセイを用いてタンパク質濃度を決定する）を用いて調製した精製Ｃｉｔｒｉｎｅ、ＣｅｒｕｌｅａｎおよびｍＣｈｅｒｒｙを用いた較正から、任意の蛍光値を絶対濃度に変換した［４９］。
伝達関数測定
リプレッサープロモーター対の伝達関数を、最小２つの異なる希釈時間でナノリアクター装置において決定した（図２６Ａ）。試験した全てのプロモーターを、ＢＣＤ７リボソーム結合部位の前のプラスミドおよびＣｉｔｒｉｎｅのオープンリーディングフレームにクローニングした。非飽和濃度の１ｎＭプラスミドを実験に使用した。リプレッサーは、経時的に濃度を変更させながら、Ｊ２３１５１プロモーターおよびＢＣＤ７リボソーム結合部位を有する直線状の鋳型から発現され、０～２．５ｎＭまで増加し、実験の過程で０に戻った［２７］。同時に、Ｃｅｒｕｌｅａｎは、リプレッサー鋳型と同じ濃度の線状鋳型からのリプレッサー濃度のレポーターとして発現された。Ｃｉｔｒｉｎｅレポーターの濃度から、時間の経過に伴う蛍光タンパク質の合成速度は、ナノリアクターデバイス［２７］における定常状態タンパク合成のモデルを用いて計算された。
Figure 0007042619000016
Figure 0007042619000017
ここで、ＰｄおよびＰｆはそれぞれダーク（暗）および蛍光レポーター濃度であり、ｔは時間であり、Δｔは希釈ステップ間の時間間隔であり、ｄｉｌはデバイスの較正中に決定された希釈ステップごとに交換される体積フラクションであり、ｍａｔは蛍光タンパクの成熟速度である。ＣｉｔｒｉｎｅとＣｅｒｕｌｅａｎの成熟時間は、これまでに記載されているように決定され［２７］、Ｃｅｒｕｌｅａｎでは１５±４分、Ｃｉｔｒｉｎｅでは２９±３分であった。暗色蛍光タンパク質を（式２）から計算し、合成速度は式（1）から計算した。
Figure 0007042619000018
Figure 0007042619000019
実験中の任意の時点で存在する全リプレッサータンパクの尺度として、測定された蛍光Ｃｅｒｕｌｅａｎ濃度とダークＣｅｒｕｌｅａｎ（式３）の合計を使用した。合成速度をそれらのそれぞれの最大値（ｖｍａｘ）に正規化し、１ｎＭより高いリプレッサー濃度のみを用いてリプレッサーレポーターの濃度に対してプロットした。次いで、伝達曲線をＨｉｌｌ関数に適合させた
Figure 0007042619000020
ここで、ｙは合成速度であり、ｙｍｉｎは最小合成速度であり、ｎはヒル係数であり、ＫＭは最大プロモーター活性の半分のミカエリスメンテン定数である。この適合は、Ｉｇｏｒ Ｐｒｏにおいて、ＯＤＲＰＡＣＫ９５を用いた直交距離回帰を使用して、Ｃｉｔｒｉｎｅ（シトリン）およびＣｅｒｕｌｅａｎ（セルリアン）蛍光の測定値において９％の誤差を仮定して行った。
Ｖｍａｘ測定
伝達関数プロモータープラスミドを用いて相対的なプロモーター強度（ｖｍａｘ値）を測定した。インビトロ強度は、１ｎＭのＤＮＡテンプレート濃度で５μｌのＴＸ－ＴＬ反応で測定した。反応は３８４ウェルプレートで構築され、Ｃｈｉｌｌ－Ｏｕｔ液体ワックス（ＢｉｏＲａｄ）３５μｌを重層し、３３℃の反応温度に設定したＢｉｏｔｅｋ ＳｙｎｅｒｇｙＭｘプレートリーダーを用いて分析し、Ｃｉｔｒｉｎｅ蛍光をＥｘｃ：５１０±９ｎｍおよびＥｍ：５４０±９ｎｍで読み取った。比較のために、６時間のＣｉｔｒｉｎｅ蛍光をｐＬａｃＩの値に正規化した。インビボ強度は、同じプラスミドで形質転換した大腸菌ＪＳ００６を用いて測定した。細胞を、０．４％グリセロールおよび０．２％カザミノ酸を補充したＭＯＰＳ培地中にて、２９℃で増殖させた。各株について、３つの独立した一晩の培養物を１：５０に希釈し、対数期中期まで増殖させた。その後、それらを、９６ウェルプレート中の１００μｌ増殖培地中の開始ＯＤ６００の０．１５に希釈し、定期的に振とうしながらＣｉｔｒｉｎｅ蛍光を測定して２９℃でプレートリーダーで増殖させた。蛍光値をＯＤに対して正規化し、２時間後に定常状態値を得た。インビトロ測定値との比較のために、平均定常状態値をｐＬａｃＩに対して正規化した。
実施例３５：遺伝子リングオシレータの無細胞特性決定：インビボ実験および分析
マザーマシン［５３］の実験は、カスタムメイドのマイクロ流体チップを用いて行った（M.DelinceおよびJ. McKinney、EPFLのモールド提供）。大腸菌細胞を、長さ３０μｍ、幅２μｍ、高さ１．２μｍのチャネルにトラップした。装置に装填する前に、細胞を凍結ストックからステーショナリー段階まで増殖させた。次いで、細胞を１０倍濃縮し、チップ上にロードした。実験は、０．０７５％Ｔｗｅｅｎ－２０を補充したＬＢ培地を用いて４００μｌ／ｈの流速で行った。トラップ全体のバックグラウンドを差し引いた平均蛍光強度を用いて、シングルマザーマシントラップからオシレーショントレースを収集した。
ＣｅｌｌＡＳＩＣ実験は、Ｂ０４Ａプレート（Merck Millipore、Darmstadt Germany）を用いて行った。流速は０．２５ｐｓｉ～２ｐｓｉで変化させた。細胞を、凍結ストックから培地中で、実行温度で、ステーショナリー段階まで増殖させた。次いで、細胞を１：１００で２時間希釈し、平衡プレートに１：１０００以下でロードして、チャンバーあたりの単一細胞ローディング効率を達成した。細胞のダブリングタイム（倍加時間）を変化させるために、０．２％グルコース、２ｘＹＴ（MP Bio）、ＭＯＰＳ ＥＺ Ｒｉｃｈ（Teknova）を含むＬＢ（BD Biosciences）、Ｍ９ＣＡ（Sigma Aldrich）の異なる増殖培地を使用した。
細胞を、１００ｘ位相対物レンズを用いて１０～２０分ごとに時系列で画像化し、ランプ強度（１２％Xcite 120、Excelitas Inc. Waltam MAまたは１～２％CoolLED pE-2、Custom Interconnected Ltd.、英国）および暴露時間（＜５００ｍｓ）を最小化して、光毒性を制限した。
必要であれば、Fiji/ImageJ［５５］を用いて、画像を処理してステッチした［５４］。全視野からのバックグラウンド補正された平均蛍光強度を用いて、CellASICムービーから同期振動を有する細胞集団の蛍光トレースを抽出した。完全な視野にわたって同期化されなかった細胞については、微視的コロニーの端にある振動する姉妹細胞の領域がトラックされた。ＩｍａｇｅＪを使用して、これらの細胞の周りの多角形領域を定義し、多面体領域を手作業で移動させて、増殖する細胞の前面を追跡した。１つのオシレーションピークから次のピークまでの時間を測定することによって、マザーマシンおよびＣｅｌｌＡＳＩＣムービーから得られた蛍光トレースから期間を決定した。ダブリングタイムは、少なくとも１０個の個々の細胞のダブリングタイムを平均することによって推定した。
実施例３６：遺伝子リングオシレータの無細胞特性決定：モデル
ｎノード陰性循環フィードバック生体回路が考慮され、遺伝子、ｍＲＮＡおよびタンパクは、それぞれ、Ｇ１、Ｇ２、．．．、ＧｎおよびＭ１、Ｍ２、．．．、ＭｎおよびＰ１、Ｐ２、．．．、Ｐｎとする。ｒｉ（ｔ）およびｐｉ（ｔ）をそれぞれｍＲＮＡ Ｍｉおよびタンパク質Ｐｉの濃度とする。例えば、図２３Ｂの新規な３ノードリングオシレータは、ｎ＝３、ｒ１（ｔ）＝[BetI mRNA]、ｒ２（ｔ）＝[PhlF mRNA]、ｒ３（ｔ）＝[SrpR mRNA]、ｐ１（ｔ）＝[BetI protein]、ｐ２（ｔ）＝[PhlF protein]、ｐ３（ｔ）＝[SrpR protein]］により定義される。
本発明者らの数学モデルは、テーブル７に要約されるように、ｍＲＮＡおよびタンパク質分子の転写、翻訳および分解を考慮する。ここで、ＭｉおよびＰｉの分解速度はそれぞれａｉおよびｂｉで表され、ｃｉおよびβiは、翻訳および転写速度を表す。定数Ｋｉ－１およびνｉは、タンパク質Ｐｉ－１および遺伝子Ｇｉ上のプロモーターに関連するミカエリスメンテン（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ）定数およびヒル係数をである。以後、表記の混乱を避けるために、それぞれ添え字０とｎ＋１をｎと１の代用として使用した。
Figure 0007042619000021
質量作用の法則および準定常状態近似を使用して、ｍＲＮＡおよびタンパク質濃度の動力学は、以下の常微分方程式（ＯＤＥ）によってモデル化することができる
Figure 0007042619000022
ここで、ｉ＝１，２、．．．、ｎであり、ｇは回路プラスミドの濃度である。定数μは、マイクロ流体装置によるｍＲＮＡおよびタンパク質の希釈率である。マイクロ流体デバイスの希釈時間は、以下の式によって定義される。
Figure 0007042619000023
ＯＤＥモデル（式６）は、ＭＡＴＬＡＢ Ｒ２０１３ｂのｏｄｅ４５ソルバを使用して数値的にシミュレートして、周期およびオシレーションパラメータ体系（図２５Ａ～Ｃ）に対する定性的な洞察を得た。テーブル８にまとめたパラメータをシミュレーションに使用した。
Figure 0007042619000024
図２３Ｆでは、プラスミド濃度ｇをｇ＝５．０ｎＭとして設定した。シミュレーションの初期濃度は、ｉ＝２，３、．．．、ｎの場合、ｒ１（０）＝３０、ｐ１（０）＝０、ｒｉ（０）＝ｐｉ（０）＝０であった。
オシレーションの周期は、シミュレートされたタンパク濃度ｐ１（ｔ）の自己相関に基づいて計算された。より具体的には、以下の式で表される。
Figure 0007042619000025
ここで、Ｔ１は、ｐ１（ｔ）がｔ＝Ｔ１で定常状態であり、Ｔ２がオシレーション周期に比べて十分に大きな定数であるような正の定数である。オシレーション周期Ｔｐｅｒｉｏｄは、Ｔｐｅｒｉｏｄ＝ｍｉｎτ＞０ａｒｇｍａｘτＲ（τ）によって決定される。シミュレーション結果はまた、希釈時間Ｔｄに伴って周期が単調に増加する点で、Hori et al.のオシレーション周期の解析的推定［５６］と一致している。
オシレーションのためのパラメータ領域（図２５Ａ）は、Hori et al.［５７］による分析結果（定理３）に基づいて得られた。上のパラメータ表に示すように、パラメータ値は下付き文字ｉに依存しないため、下付き文字ｉは削除され、ａ：＝ａ１（＝ａ２＝．．．ａｎ）が定義される。同じ方法で、ｂ、ｃ、β、Ｋ、およびνが定義された。
不等式の両方が満足されれば、タンパク濃度ｐｉ（ｉ＝１，２，．．．，ｎ）が振動することが示された［５７，５８］。
Figure 0007042619000026
Figure 0007042619000027
図２５Ａのパラメータ領域を得るために、ｎ＝３と上の表に示すパラメータを不等式条件（式１０）の右辺に代入した後、Ｔｄ（＝ｌｎ（２）／μ）は５～８０の間で変化させた。これらのパラメータについては、不等式（式９）が常に満たされていた。
図２５Ｃのパラメータ領域は、モデルの局所的安定性分析によって得られた（式６）。これまでの理論的結果［５７］は、平衡点で評価されたヤコビ行列が開いた右半分の複合体面を有する場合、モデル（式６）が固有の平衡点を持ち、タンパク濃度ｐｉ（ｉ＝１，２、．．．、ｎ）が安定したオシレーションを示す。この結果に基づいて、ヤコビアン固有値を、Ｋｃ１およびＴｄで示されるＫ３を変化させて計算した。上記のパラメータ表の値は、他のパラメータに使用された。プラスミド濃度は、計算においてｇ＝５．０ｎＭとして設定した。
実施例３７：オリジナルのリプレッシレーターおよびその突然変異体の無細胞特性決定
無細胞システムを用いて合成インビボ回路を実行および特徴づけることができるかどうかを試験するために、モデル回路として既存のリプレッシレーターを選択した［３］。オリジナルのリプレッシレーターネットワークは、無細胞システムで実施され、インビボ研究と一致する期間を有する長期持続振動が観察された（図２２）。オリジナルのリプレッシレーターを、ＬａｃＩを調節するプロモーター中のＣＩレプレッサー結合部位の１つに点突然変異を含む修飾バージョンと比較した（図２２のＡ）。この突然変異は、最大半量の抑制（Ｋ）に必要なリプレッサー濃度を増加させ、協同性を減少させる［５９］。長い希釈時間（ｔｄ）では、両方の回路は振動したが、絶対レポータータンパク濃度はシフトしていた（図２２のＢ）。希釈時間が減少すると、振幅は減少し、周期はｔｄに線形依存してより速くなった。しかし、希釈時間を短縮すると、修正されたネットワークのオシレーションはサポートされなかった（図２２のＢ～Ｃ）。実験的に、オシレーションを支持する希釈時間の範囲は、一般に合成速度の低下または１つのリプレッサーのそのプロモーターへの結合がＯＲ２＊突然変異体（図２５Ａ～Ｃ）のように弱まるにつれて減少するロバストオシレータ機能の尺度として役立ち得る。初期条件は、非線形システムの動的挙動に影響を与えることができるが、細胞内で制御することは困難である。種々の初期条件に応答してリプレッシレーターの動態を調べるために、ＴｅｔＲおよびＣＩリプレッサーの開始濃度を変化させた。試験した全ての条件について、システムは限界サイクル振動に素早く接近し、初期条件に対して不変であった（図２２のＤ）。位相空間におけるリプレッシレーターネットワークのこの分析は、細胞環境において実施することが困難または不可能である実験的特徴付けの例を提供する。
実施例３８：新規なネガティブフィードバック回路のエンジニアリング
無細胞システムはまた、個々のネットワーク成分の迅速な特徴付けを可能にする。リプレッシレーターネットワークにおけるリプレッサー－プロモーター対の伝達関数を測定し（図２３のＡおよび図２６Ａ～Ｃ）、このネットワークは伝達関数に関して対称であることが分かった。ＣＩプロモーターＯＲ２＊突然変異体では、Ｋ値の予想されるシフトおよび伝達関数の急峻性が観察された。ＴｅｔＲリプレッサー相同体はまた、新規なネガティブフィードバック回路（図２３のＡ）のビルディングブロックとして特徴づけられ、ＱａｃＲを除いてインビボで似た伝達関数が観察された（図２３および図２６Ｂ～図２６Ｃ）。
３つの新しいリプレッサー、ＢｅｔＩ、ＰｈｌＦおよびＳｒｐＲを使用して、新規な３ノード（３ｎ）回路３ｎ１を構築し、リプレッシレーターに関するｔｄでの振幅および周期の同じ依存性による、広範囲の希釈時間にわたる高振幅振動が観察された（図２３のＢ）。リプレッシレーターネットワークおよび３ｎ１オシレータの特性評価では、オシレーションの存在、周期および振幅に対して希釈率が重要であることがわかった。タンパク分解は、リプレッサータンパクの除去をもたらす点で希釈と同様である。分解の影響を研究するために、直鎖ＤＮＡ上のＴｅｔＲ、ＰｈｌＦおよびＳｒｐＲリプレッサーを用いて第２の３ｎネットワーク（３ｎ２）を構築した。回路の１つのバージョンは強いｓｓｒＡ ＣｌｐＸＰ分解タグを使用し、第２のバージョンはタグのないリプレッサーを使用した。オシレーションは両方の回路で観察された（図２３のＣ）。しかしながら、ｓｓｒＡタグを介するタンパク分解を伴わない回路は、ゆっくりとしたオシレーションを示し、希釈時間が長くなり、希釈と同様にタンパクの分解が振動子の機能および期間に影響することが示された。インビボでのオシレーションの存在および頻度にとって重要であることが示されているＣｌｐＸＰ媒介性タンパク分解の効果は、このように無細胞環境でエミュレートすることができる［６０，６１］。プラスミドで測定した場合、プロモーター強度がよりよく比較されるため、リプレッシレーター（図２２）および新規の３ｎ１ネットワーク（図２３のＢ）は、プラスミドＤＮＡ上で特徴づけられ、これは細胞における状況に最も近い近似であると推論した［４４，４９］。しかしながら、新規なネットワークおよびネットワークの変形をより迅速に分析するためには、回路性能に関する初期結果を得るために面倒なクローンステップが必要でない場合に有利である。直鎖ＤＮＡ鋳型を合成するためにほんの少数のＰＣＲ反応を必要とする２つの３ｎ２ネットワーク変異体の構築および比較は、回路の理論的設計から非常に短い時間枠での最初の実験結果に進むことが可能であることを示した（図２３のＣ）。次に、このコンセプトは、斬新でより複雑なネットワークアーキテクチャで試験された。
理論は、奇数のリプレッサーから構築されたリングアーキテクチャは振動し、偶数のアーキテクチャは安定した定常状態を有すると予測している［５６，６２］。ＬａｃＩ、ＴｅｔＲ、ＰｈｌＦおよびＳｒｐＲからの４ノード回路を実験的に構築し、直鎖ＤＮＡで試験した。ＬａｃＩ誘導因子ＩＰＴＧまたはＴｅｔＲ誘導因子ａＴｃの初期パルスは、発現を２つの安定した定常状態のいずれかに切り替えることを可能にした（図２３のＤ）。安定な定常状態には、初期調整段階が５～１０時間後に達し、２２時間後に実験が終了するまで安定したままであった。これらの結果は、非振動ネットワークも無細胞環境で機能し、３ノードネットワークで観測される振動はネットワーク構造によって決定され、マイクロ流体リアクタ内の特定の反応条件によって確立されないことを示している。
３ｎネットワークで観測されたロバストな振動と４ノード双安定スイッチの予想される動作によって、２つの５ノードリングネットワーク（５ｎ）がプロトタイピング環境を別の新しい合成ネットワークアーキテクチャでテストするために構築された（図２３のＥ）。これらの回路は、奇数個のリプレッサーから構成されているため、発振することが予想される。それらのかなりの複雑さにもかかわらず、両方の回路は実際に広範囲の希釈時間にわたって振動した。５ｎネットワークの期間（最大１９時間）は、３ｎネットワークの期間（最大８時間）よりも大幅に長くなっている。すべてのｓｓｒＡタグ付き３ｎおよび５ｎリングアーキテクチャを比較すると、観測された期間は計算シミュレーションによって４つのネットワークすべてで正確に予測できることが示される（図２３のＦ）。無細胞システムにより、細胞の実施に最も近い、単一のプラスミド上にクローン化されたネットワークの検証に対する直鎖ＤＮＡの迅速な試験から、複雑なネットワークの特徴付けが可能となる（図６および図２４）。
実施例３９：無細胞プロトタイプの３および５ノードオシレータの大腸菌への移入
我々の無細胞アプローチを立証するために、３ｎ１および３ｎ２ネットワークを低コピープラスミド上にクローニングし、中コピーレポータープラスミドをｌａｃＩ－ＪＳ００６大腸菌［５１］に導入した。マイクロ流体装置（マザーマシン［５３］）で試験した場合、３ｎオシレータはいずれも少なくとも３０時間６±１時間の規則的な振動を示した（図２７のＡ）。両方のオシレータは、健康な細胞分裂を起こしている全ての細胞が振動した（ｎ＝７１）ので、驚くほど頑健であった（図２８Ａ）。
５ｎオシレータもインビボで試験した。３ｎネットワークと同様に、５ｎオシレータを低コピー数のプラスミドにクローニングして、最初は直鎖ＤＮＡでプロトタイプ作成した２つのネットワークを大腸菌に移した（図２３のＥ）。図２４は、最終的なクローニングされたオシレータプラスミドの検証まで、直鎖ＤＮＡで試験することにより、設計からの５ｎ１オシレータの完全な無細胞プロトタイプ作成サイクルを示す。大腸菌では、５ｎ１は、高発現強度のレポーターで同時形質転換した場合には生存可能ではなかったが、低発現強度のレポーターでは生存可能であった。具体的には、高発現強度のレポーターを有する５ｎ１は、マザーマシン上で実行した場合、増殖速度が遅く、細胞死率が高くなった。これは、レポーター発現強度の低下が細胞の生存率の問題を解決するため［６３］、高タンパク質産生による負荷効果によるものであると仮定される。低発現強度のレポーターで試験した場合、両方の５ｎオシレーターは、少なくとも７０時間維持された大腸菌での強い振動を示し、健康な細胞を含む分析されたすべてのトラップの９５％以上が振動した（ｎ＝１０４）。さらに、両方の５ｎネットワークは、同様の期間で振動した：５ｎ１では８時間、５ｎ２では９時間であった（図２７のＢおよび図２８Ａ）。
両方の３ｎオシレーターも、平面単層コロニー形成を可能にするＣｅｌｌＡＳＩＣシステムで試験した。単一の細胞から出発して、増殖中のマイクロコロニー全体のオシレーションパルス（図２７のＣおよび図２８Ｂ）を観察した。これらの集団レベルのパルスはまた、３つの異なる蛍光レポーターを同時に使用する場合に明らかであった（図２８Ｃ）。集団レベルのオシレーションは、オリジナルのリプレッシレーター、ＯＲ２＊突然変異体（図２８Ｄ）または５ｎネットワークでは観察されなかった。同期振動はオリジナルのリプレッシレーターでは報告されておらず［３］、細胞間通信を用いたオシレータでのみ観察されている［６４、６５］。能動的に結合してオシレータの状態を同期させることができるこれらのクオラムセンシング機構とは対照的に［６４、６５］、観測された母集団全体の同位相振動は、能動的な結合メカニズムに起因するとは考えられていない。３ｎ１および３ｎ２ネットワークの集団レベルのオシレーションは、期間表現型の継承を増加させ、確率的細胞タンパク変動から予想される急速な脱フェーズを最小限に抑えるオリジナルのリプレッシレーターネットワークと比較して、増加したリプレッサー濃度によるものであるという仮説が立てられている［６６］。しかしながら、この遅い脱フェージング表現型の定量的特徴付けは、インビボでの確率的効果のより深い理解を必要とする。
細胞は同期したままであるため、全体としての母集団を分析して、オシレータ挙動の一般的な結論を出すことができる。希釈時間は、異なる培地条件および培地流速を使用することによって変化させ、収集された無細胞データと一致して、分裂時間および期間の間に直接の関係が見出された。５ｎオシレータの振動周期も、我々の無細胞の結果と一致し、倍加時間に同様の依存性を示した（図２７のＤ）。
最後に、３ｎ１および５ｎ２をインビボで弱いおよび強いレポーターで比較して、タンパク分解がオシレータ期間に及ぼす影響を分析した。一定濃度のＣｌｐＸＰが与えられれば、より強いレポーターはより多くのＣｌｐＸＰ負荷をもたらし、それによりオシレーションの周期を遅くすると理論付けられている。ＣｌｐＸＰは、このようにインビボで振動ダイナミクスに影響を与えると考えられる［６０］。マザーマシンでは、３ｎ１および５ｎ２の期間分布の両方が、この特徴（図２７のＥ）を示し、これは、特異的なｓｓＡタグ依存性の周期長（図２３のＣ）の無細胞所見を反映することが見出されている。
実施例４０：新規な遺伝学的リングオシレータの迅速な無細胞順方向エンジニアリング：さらなる議論
これまでの実施例では、合成動的ネットワークを、無細胞システムにおいて容易に実施、特徴付けおよび操作し、その後、細胞宿主にトランスファーすることが示される（図６および図２４）。この結果は、生物システム工学および構成要素の特徴付けに対するこのアプローチの有用性を実証する。無細胞システムは、偶数および奇数のサイクリックネガティブフィードバック回路についての以前の理論的予測の実験的検証をもたらし［５６，６２］、ロバストな５－ノード遺伝学的オシレータのインビボでの実施を可能にした。したがって、無細胞環境は、理論的ネットワーク設計と生物学的システムのインビボ実装との間のギャップを埋めることができ、設計－構築－試験サイクルを大幅に短縮する簡素化され制御された環境を提供することができる［４９］。可能な限り無細胞環境および細胞環境に適合させるために、インビボ実験に使用した同じ大腸菌株由来の抽出物に基づくＴＸ－ＴＬ発現系を、内因性生合成およびタンパク分解の仕組みを保存する方法によって調製した［１１，１５，３３，６７］。類似の発現系は、プロモーターおよびリボソーム結合部位のプロトタイピングに以前に適用されていた［４４，４９］。ここでは、それらが、細胞増殖をエミュレートするマイクロ流体システムで分析されるとき、遺伝子ネットワーク全体のプロトタイピングにも使用できることが示されている。ネガティブフィードバックリングオシレータのオシレーション周期は、主に分解および希釈速度によって決定され［５６］、我々の無細胞環境および大腸菌におけるオシレーション期間の良好な対応を説明する。新規なネットワークアーキテクチャを構築し、試験することにより、ほぼすべてのプロトタイピングが直鎖ＤＮＡ上で行えることが示されており、組み立ておよび試験に８時間未満しか要しない。これにより、異なるネットワークトポロジの迅速なスクリーニングと、ネットワークの所望の機能にとって重要なパラメータの迅速なスクリーニングが可能になる。
細胞毒性およびインビボでの５ｎオシレーターのローディング効果を予測することが困難であること、およびプロモーターとリプレッサーとの強度の間のいくらかの相違において、無細胞環境と細胞環境との間のいくつかの差異が観察された。ローディング効果をよりよく理解することで、無細胞プロトタイピング環境は、いつ細胞がオーバーロードになるかを予測することができる。５ｎ１（図２４）で機能した完全な無細胞プロトタイピングサイクルは、５ｎ２ネットワークでは完全に成功しなかった。５ｎ２は、無細胞環境（図２３のＥ）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のプラスミドＤＮＡ（図２７）において直鎖ＤＮＡで分析した場合、５ｎ１と比較して同様のオシレーションを示したが、５ｎ２のオシレーションは、無細胞環境下では、同じプラスミドＤＮＡを走らせても観察されなかった。これは、無細胞プロトタイプ環境［４４，４９］における直鎖およびプラスミドＤＮＡとの発現効率の相違、および／または無細胞環境と細胞環境とにおけるリプレッサー強度間の差異（特にＱａｃＲ、図２５Ｂ～Ｃ）に起因するという仮説が立てられる。
インビトロ環境とインビボ環境との間の相違を記述し、説明するためにより多くの作業が必要である一方で、無細胞環境における複雑なネットワークの観察された挙動は、インビボでのネットワーク挙動を十分に反映する。したがって、無細胞システムは、細胞環境の強力なエミュレータであり、実験条件を正確に制御し、細胞において実施するのが困難または時間がかかる研究を可能にする。新規合成システムのプロトタイピングと特徴付けに有用であるだけでなく、簡単な設定で天然の生物学的ネットワークの詳細な分析を容易にする。無細胞ライセートシステムとサポート技術のさらなる進歩により、無細胞アプローチは生物システムエンジニアリングにおいてますます重要な役割を果たすようになり、生物システムを設計、構築、分析するユニークな機会を提供する。
実施例４１：無細胞システムにおける合成生物学的回路の迅速なプロトタイピングのための直鎖ＤＮＡ：直鎖ＤＮＡの迅速な組み立ての概要
実施例４１～４８は、合成回路の迅速なプロトタイピングのための直鎖ＤＮＡを使用するプロトコルおよび方法に関する。
Ｓ３０ベース抽出物で実施されるほとんどの回路はプラスミドＤＮＡを利用して内因性ＲｅｃＢＣＤからのエキソヌクレアーゼ分解を回避するが、インビボおよび他のＳ３０抽出物の両方において、ＲｅｃＢＣＤインヒビターバクテリオファージｇａｍＳタンパクによる直鎖ＤＮＡの分解から保護することができる［６８，６９］。直鎖ＤＮＡを数時間で合成的にまたは完全にインビトロで高収率で作製することができるため、直鎖ＤＮＡから回路を実行する能力により、迅速なプロトタイピングが可能となる。直鎖ＤＮＡはまた、インビボの形質転換および選択をバイパスすることによって毒性タンパクの発現および分析のような、プラスミドＤＮＡでは不可能な用途を可能にし得る。
８時間以内に完全なテストを行い、４時間以内に標準部品またはカスタム部品から調節エレメントと基本回路を組み立てるための、迅速かつ完全なインビトロ組立技術が開発されている。このインビトロ組立技術は、インビトロシステムで試験することができる直鎖ＤＮＡを生成する。図２９は直鎖ＤＮＡの使用を示しており、直鎖ＤＮＡ上での構築およびＴＸ－ＴＬにおける試験は、プラスミドＤＮＡ構築およびインビボでの回路実施の最小サイクルが必要であることを意味する。
実施例４２：無細胞システムにおける合成生物学的回路の迅速なプロトタイプ作成のための直鎖ＤＮＡ：ＧａｍＳタンパク質精製
ｇａｍＳを生成するために、タンパク質精製プロセスを下記のように行う。用いた緩衝液の組成は、緩衝液Ｌ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８，５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ；緩衝液Ｗ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８，５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾール；緩衝液Ｅ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ８，５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール；緩衝液Ｓ：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．５，１００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２％ＤＭＳＯである。ＢＬ２１－ＤＥ３大腸菌株中のＰ＿ａｒａＢＡＤ－ｇａｍＳの凍結ストックをＬＢ－カルベニシリン培地中で一晩増殖させた。１００ｍＬを、３７℃、２２０ｒｐｍで０．４～０．６のＯＤ６００ｎｍとなるように１ＬのＬＢ－カルベニシリンを接種するために使用した。次いで、細胞を０．２５％アラビノース（最終濃度）までインキュベートし、ペレット化して－８０℃で凍結させる前に、２５℃、２２０ｒｐｍでさらに４時間増殖させた。細胞を緩衝液Ｌに再懸濁し、機械的に溶解し、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）と共にインキュベートした。Ｎｉ－ＮＴＡアガロースを１５カラム容量の緩衝液Ｗで２回洗浄し、緩衝液Ｅで溶出した。約１３ｋＤバンドの画分を濃縮し、緩衝液Ｓ中に一晩透析し、２６／６０Ｓｅｐｈａｄｅｘ７５カラムでさらに精製した。タンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ法により確認し、Ｕｌｔｒａ－０．５３Ｋ ＭＷＣＯ遠心フィルター（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて３ｍｇ／ｍｌに濃縮し、－８０℃でバッファーＳに保存した。タンパクの純度はゲルによって確認した。精製工程をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動により確認した。
実施例４３：無細胞システムにおける合成生物学的回路のラピッドプロトタイピングのための直鎖ＤＮＡ：ｇａｍＳ保護アッセイ
ＧａｍＳは、切断された形態のラムダガム（gam）を、それを無細胞系に添加することにより、直鎖ＤＮＡをＲｅｃＢＣＤ分解から保護するために使用される。作動濃度３．５μＭのｇａｍＳは、立体保護なしで２ｎＭの直鎖ＤＮＡに対する精製タンパクの希釈からの保護能力を比較することによって測定された。図３０は、直鎖ＤＮＡを保護する上でのｇａｍＳの活性を示す。図３０Ａは、プラスミドＤＮＡ、ｇａｍＳ保護のない直鎖ＤＮＡ、およびｇａｍＳ保護を有する直鎖ＤＮＡのｄｅＧＦＰ時系列蛍光の比較を示す。用いたプラスミドＤＮＡはｐＢＥＳＴ－ＯＲ２－ＯＲ１－Ｐｒ－ＵＴＲ１－ｄｅＧＦＰ－Ｔ５００であり、直鎖ＤＮＡは立体保護末端のない８１０ｂｐのＰＣＲ産物であり、それぞれ１６ｎＭで供給される。図３０Ｂは、粗抽出物とのタンパク質の事前インキュベーションなしに、ｇａｍｓの異なる作用濃度についてシグナルに対してプロットされた２ｎＭの直鎖ＤＮＡの８時間後のエンドポイントｄｅＧＦＰ発現を示す。図３０Ｃは、増加するＤＮＡ濃度で、ｇａｍＳタンパク質を含むまたは含まないプラスミドおよび直鎖ＤＮＡからのエンドポイントｄｅＧＦＰ発現を示す。プラスミドＤＮＡ上の０．９８の相関は０ｎＭ～４ｎＭ値のみの相関であり、直線ＤＮＡ上の０．９９の相関は０ｎＭ～１６ｎＭである。図３０Ｄは、鋳型末端で異なる量の非コードＤＮＡを用いて２ｎＭの直鎖ＤＮＡの保護を示す。各長さは、直鎖ＤＮＡの各末端における非コード塩基対の量に対応し、配列１は配列２とは無関係である。８時間後のエンドポイントｄｅＧＦＰ蛍光であり、実験はｇａｍＳタンパクの存在下で行う。エラーバーは、３回の独立した実験から１つの標準偏差を表す。
立体的な保護配列は、ｇａｍＳの存在下でさえ直鎖ＤＮＡ分解を防ぐのに好ましい。３セットの配列を立体保護アッセイに使用した。１組は、以前に公開されたｐＢＥＳＴ－ＯＲ２－ＯＲ１－Ｐｒ－ＵＴＲ１－ｄｅＧＦＰ－Ｔ５００（Ａｄｄｇｅｎｅ＃４００１９）のベクター骨格に基づいていた。「配列２」（図３０Ｄ参照）と呼ばれる別のセットは、ｇｌｔＢおよびｌｈｒのコード配列に由来した。これらの配列は、全ての既知のコード配列についてBioPythonのNCBI GenBank MG1655記録を解析することによって見出され、サイズ配列による分類は、Geneious 6.0（Biomatters Ltd）を用いて分析された。
実施例４４：無細胞システムにおける合成生物学的回路の迅速なプロトタイプ作成のための直鎖ＤＮＡ：プラスミドＤＮＡおよびＰＣＲ産物の調製
この研究で用いたプラスミドは、標準的なクローニング手順を用いて構築し、ＯＲ２－ＯＲ１プロモーター（２９℃）を用いる場合のＫＬ７４０株、Ｐｌ－ｔｅｔＯ１またはＰｌ－ｌａｃＯ１プロモーターを用いる場合のＭＧ１６５５Ｚ１株、タンパク質精製のＢＬ２１－ＤＥ３株、プロモーター特性決定のためのＢＬ２１株、または他の全ての構築物のＪＭ１０９株で維持された。ＫＬ７４０は、温度感受性ラムダｃＩリプレッサーをアップレギュレートし、ＭＧ１６５５Ｚ１はｔｅｔＲおよびｌａｃＩをアップレギュレートする。ＰＣＲ産物は、Ｔａｑポリメラーゼ（New England Biolabs）を使用し、ＤｐｎＩ消化したAlexaFluor-588-5-dUTPで標識したものを除いて、全ての構築物についてPfu Phusion Polymerase（New England Biolabs）を用いて増幅した。プラスミドをPureYieldカラム（Promega）を用いてミニプレップしたか、またはNucleoBond Xtra Midiカラム（Macherey-Nagel）を用いてミディプレップした。すべてのプラスミドはステーショナリー段階で処理した。無細胞反応で使用する前に、プラスミドおよびＰＣＲ産物の両方を、ＴＸ－ＴＬに有害な過剰の塩を除去したＱｉａＱｕｉｃｋカラム（Qiagen）を用いて追加のＰＣＲ精製工程を行い、溶出し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ溶液、短期保存の場合は４℃でｐＨは８．５、長期保存の場合は－２０℃で保存した。
実施例４５：無細胞システムにおける合成生物学的回路の迅速なプロトタイプ作成のための直鎖ＤＮＡ：直鎖ＤＮＡの迅速なアセンブリは、通常のＰＣＲと同じ結果をもたらす
直鎖ＤＮＡ回路プロトタイピングを確立した後、４～８時間でアセンブリから試験に移行することが可能になると同時に、形質転換後のプラスミドＤＮＡを生成することを可能にする、直線的なピースの迅速な組み立てのための方法を創り上げることを模索する。最終的に効率および選択性を必要とする他のインビボ組み立て方法とは異なり、テンプレートはＰＣＲによって末端増幅されるので、我々は主に選択性に関心があった。
本明細書に記載されているのは、ラピッドアセンブリによって作製された直鎖ＤＮＡ対ＰＣＲによって作製された直鎖ＤＮＡを比較する迅速な組み立ての概念的方法および結果である。図３１ａ）は、ゴールデンゲートアセンブリ（「ＧＧＡ」）を用いてＤＮＡ部分を組み立ててプラスミドを作製し、次いでこれをＰＣＲ鋳型として直接使用して、ＴＸ－ＴＬに適する直鎖ＤＮＡを高濃度で作製する、迅速な組み立ておよびプロトタイピング手順の概要を示す。並行して、アセンブリ産物は、クローンプラスミドのより多くのコピーを得るためにインビボで増殖させることもできる。両方の方法の時間比較を表９に示す。図３１ｂ）は、６６ｂｐ、１０３ｂｐ、１１０ｂｐ、７０７ｂｐ、および２３７６ｂｐの５つの標準的な断片から組み立てられた遺伝子のアガロースゲルを示す。クローン化後のＰＣＲ産物（「ｐｏｓ」）と比較した、それぞれ５０ｎｇの出発フラグメント（６６ｂｐを除く）、エキソヌクレアーゼ消化前後の組み立て後フラグメント（「ｅｘｏ」）および迅速な組み立てＰＣＲ産物（「ＲＡＰ」）を示す。矢印は８９２ｂｐの予想サイズを示す。図３１ｃ）０．５ｍＭのＩＰＴＧインデューサーの有無にかかわらず、４ｎＭの迅速なアセンブリまたはクローン化後の産物の機能試験。実験は、２ｎＭのＰｌ－ｔｅｔＯ１－ｌａｃＩ直鎖ＤＮＡの存在下で行った。直鎖ＤＮＡは３１ｂｐの立体的保護とｇａｍＳで保護される。エラーバーは、３回の独立した実験からの１標準偏差を表す。
テーブル９において、迅速な組み立て技術を用いてＴＸ－ＴＬにおける即時試験用の直鎖ＤＮＡを生成することにより、従来のプラスミド生成技術と比較してかなりの時間を節約できることが実証されている。
Figure 0007042619000028
実施例４６：無細胞システムにおける合成生物学的回路の迅速なプロトタイピングのための直鎖ＤＮＡ：具体的な直鎖ＤＮＡ技術
直鎖ＤＮＡに組み立てられる、予め作製されたピースのモジュラリティを有することが望ましい。純粋にインビトロでの採用するためのインビボでの組み立ての３つの方法：等温アセンブリ、連鎖反応クローニングおよびゴールデンゲートアセンブリ［４１，４２、７０］を最初に試験した。各方法は、組換えに基づくクローニング、平滑末端クローニング、または粘着末端クローニングの異なるメカニズムの作用に基づいている。これら３つのうち、アイソサーマルアセンブリとゴールデンゲートアセンブリのみがコンストラクトを得るのに十分な収量を生じた。図３２ａ）では、４片のネガティブフィードバック遺伝子が標準的なピースから構築されている。図３２ｂ）は、等温アセンブリ（「ＲＡＰ－ｉｓｏ」）によって作製された迅速な組み立て産物、ゴールデンゲートアセンブリ（「ＲＡＰ－ＧＧＡ」）によって作製された迅速な組み立て産物、およびクローン化後ＰＣＲ産物（「ｐｏｓ」）のアガロースゲル電気泳動により比較される。矢印は予想されるバンドを示す。直鎖ＤＮＡは２５０ｂｐの立体的保護およびｇａｍＳで保護されている。図３２ｃ）は、１０ｎＭ ａＴｃありまたはなしでのクローニング後ＰＣＲ産物と比較した、６ｎＭの迅速な組み立て産物の機能試験の結果を示す。
ゴールデンゲートアセンブリに基づく標準的な組み立て手順が開発された。標準的なアセンブリを使用することにより、ミスライゲーションが、発現可能な誤った組立産物をもたらす可能性を低くする。標準的なゴールデンゲート組立手順により、一般的に使用されるパーツをリサイクルし、所望の産物の機能的な活性を保証することができる。我々の標準は、プロモーター、５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、コード配列、ターミネーター、およびベクターの５つのピースからなっていた。これは、以前に使用された非コード配列およびｐＢＥＳＴベクター主鎖上のプライマーと適合するように設計された。迅速な組み立て手順の具体的なピースを以下に示す。図３３ａ）は、プロモーター、５’ＵＴＲ、コード配列、ターミネーター、および以前に使用されたｐＢＥＳＴ骨格に基づくベクターのための特異的ライゲーション末端で採用された５つのピースの標準を示す。図３３ｂ）は、各部位におけるライゲーション（連結）のための配列の図を示す。
実施例４７：無細胞システムにおける合成生物学的回路の迅速なプロトタイピングのための直鎖ＤＮＡ：ＴＸ－ＴＬ対通常ＰＣＲ産物で試験した迅速な直鎖ＤＮＡの検証
より複雑な回路については、迅速な組み立て産物を、遺伝学的スイッチであるが、迅速な組み立て産物由来であるものの構築を繰り返すことにより確認した。迅速な組み立て産物のＰＣＲオフから特異的なバンドが形成され、ＴＸ－ＴＬの実行は、ＩＰＴＧおよびａＴｃに応答する場合、生成物および陽性対照について同様の結果を示した。このプロトタイピングは７時間もかからなかった。図３４ａ）は４ピースの遺伝学的スイッチである。図３４ｂ）：重複プライマーを用いて形成された４つの直線状ピースについての迅速な組み立て産物（「ＲＡＰ」）対クローン化後ＰＣＲ産物（「ｐｏｓ」）の比較。図３４ｃ）：遺伝子スイッチの「オン」状態または「オフ」状態に対するクローン化ＰＣＲ産物対ＲＡＰ産物の機能アッセイ。２ｎＭのレポーターおよび１ｎＭのリプレッサーが試験され、「＋ＩＰＴＧ」は０．５ｍＭ ＩＰＴＧ、０μＭ ａＴｃ状態を示し、「－ＩＰＴＧ」は０ｍＭ ＩＰＴＧ、１０μＭ ａＴｃ状態を示す。直鎖状のＤＮＡは３１ｂｐの立体的保護とｇａｍＳで保護されている。エラーバーは、３つの独立した実験からの１つの標準偏差を表す。
実施例４８：無細胞システムにおける合成生物学的回路の迅速なプロトタイプ作成のための直鎖ＤＮＡ：重複プライマーの利用
重複プライマーの利用は、得られる迅速な組み立て産物の特異性に対してクリティカルである。より特異性の高い４ｂｐの結合オーバーハングが作製された。［７１］複数の塩基対重複による特異性の低下として、オーバーラップの少ない異なるオーバーハングを用いることが必要であった。ＰＣＲプライマーはまた、ベクターおよびプロモーターならびにベクターおよびターミネーターの接合部位で重複するように設計され、非特異的産物をさらに最小限に抑えた。この立体的保護の低下は３１ｂｐに終わる。これを確認するために、標準的な５ピースアセンブリの図３５では、迅速な組み立て産物（「ＲＡＰ」）を５０μＬのＰＣＲ反応で１μＬ、２μＬまたは５μＬの鋳型から増幅させる。ポストクローン化ＰＣＲ産物（「ｐｏｓ」）も産生される。非重複プライマーとは、ベクターとプロモーターおよびベクターとターミネーターの間の組み立て接合部を横切らない結合部位をいう。重複プライマーがこの接合部を横切る。白い矢印：鋳型ＤＮＡ；青色矢印：重複プライマーによって除去された非特異的産物；赤い矢印：重複プライマーによって保持される非特異的な産物。赤矢印は、サイズから、セルフライゲーションしたベクターであると推定される。
実施例４９：ヴィオラセインを用いた無細胞システムにおける代謝経路エンジニアリング：概要
実施例４９～５９は、代謝経路の例としてヴィオラセインを使用して、無細胞システムにおける代謝経路を工学的に操作するプロトコルおよび方法に関する。この研究は［５］として公開された。
ＴＸ－ＴＬは、強力な天然産物である抗細菌特性および抗癌特性を有する貴重な化学物質であるヴィオラセインの発現を最適化する最適な酵素発現レベルを測定するために使用される。この経路は、無細胞混合物への経路をコードするＤＮＡを提供し、代謝経路の出発成分であるトリプトファンを提供することによるＴＸ－ＴＬにおけるものである。特定の経路の酵素が排除された場合に、得られる反応の色に基づいて中間体が生成されることが測定される。吸収およびＬＣ－ＭＳを用いた最終のビオラセイン生成物の分析は、生成された１０μＬの反応当たり約７０ｎｇを示した。設計スペースの探索を実施することにより、ＶｉｏＣおよびＶｉｏＤ ＤＮＡ濃度を増加させてヴィオラセイン生成物形成を増加させることができると仮定される。
代謝工学は、化学物質とは対照的に、主として生物学的メカニズムを用いて生物学的ベースの物質の生産を可能にする。これは、最終目的が石油への依存を取り除くこと、例えば、バイオエネルギー（ファルネセン、Ａｍｙｒｉｓ）またはプラスチック（１，４ＢＤＯ、Ｇｅｎｏｍａｔｉｃａ）を生産するため、または既存の化学プロセスを使用して製造することができず、代わりに天然産物（アルテミシニン、以前は今やＡｍｙｒｉｓ社の酵母由来の枯草植物、Ｒｏｃｈｅ社の大腸菌由来のスターアニス由来のシキミ酸）である場合に価値がある。しかし、代謝工学のプロセスは面倒であり、インビボでの遺伝学的構成物の重要な操作を必要とする。アルテミシニンの工学は１５０年の研究開発と、４５０人年の研究開発の１，３ＢＤＯ生合成経路の工学をとったと推定されている。クローニングのサイクルは数週間以上かかることがある［７２］。したがって、代謝経路を最適化するためのより迅速な工学プロセスが望まれる。
大腸菌に基づくＴＸ－ＴＬシステムを用いることにより、直鎖ＤＮＡおよびプラスミドＤＮＡを利用して、代謝経路およびその関連産物を迅速に探索することができ、また、発現および最適な酵素濃度のボトルネックを判定することができる。各末端で立体的保護（１００ｂｐ）を有する直鎖ＤＮＡ伸縮性構築物をｇａｍＳの存在下で試験することにより、無細胞混合物中の得られた産物を、ＵＶ可視化のようなハイスループット方法およびＬＣ－ＭＳのような特異性の高い方法を用いて分析することができる。このプロセスのスループットは、代謝回路の迅速かつ効率的な診断および代謝設計空間の理解を可能にする。
実施例５０：ヴィオラセインを用いた無細胞システムにおける代謝経路工学：最終産物収率を増加させるためのＴＸ－ＴＬの使用
この実証において、ヴィオラセイン経路はＴＸ－ＴＬにおいてプロトタイプされている製品歩留まりを向上させることを目標としている。経路を通る律速段階および流束は、これらの試験段階によって決定することができる。各酵素を首尾よく再構成することができる。知見は、ＶｉｏＣおよびＶｉｏＤ ＤＮＡ濃度の増加に伴うヴィオラセイン濃度ボトルネックの解消によって決定される、ＶｉｏＣおよびＶｉｏＤタンパクの潜在的なボトルネックおよびインビトロシステムでの発現レベルに対するコード配列の長さへの依存性が含まれる。これらの知見は、経路がインビボ標的環境において実施される場合に反復可能であると予想される。
実施例５１：ヴィオラセインを用いた無細胞システムにおける代謝経路工学：ＴＸ－ＴＬを用いて回路をデバッグして収量損失面積を決定する
この実施例では、ヴィオラセインの収量を改善するように見えるが、経路をデバッグするために、および組換え遺伝子成分によってアセトン化（aceted）された基質の転換のフラックスを検出するために、無細胞システムを使用することができる。例えば、ヴィオラセインの例では、ｖｉｏＡ１、ｖｉｏＡ２、ｖｉｏＡ３、ｖｉｏＡ４、およびｖｉｏＡ５と命名されたｖｉｏＡの５つの変異体があり、ｖｉｏＡ３がトリプトファンに対するＩＰＡの比率が最も高いことが判明した場合、ｖｉｏＡ３を使用することにより、経路の流束の最大化を図ることができる。さらに、経路全体が実施され、酵素の活性にボトルネックが存在する場合、酵素の前の基質は比較的高い量であるべきである。
実施例５２：ヴィオラセイン：ヴィオラセイン経路および無細胞での再構成を用いた、無細胞システムにおける代謝経路工学
ヴィオラセインは、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Choromobacterium violaceum）から最初に単離された貴重な細菌色素である。しかし、この化学物質は、生産性が低く、非共通利用宿主を用いた生産プロセスの商業化が困難であるため、元の供給源から分離するのに費用がかかる［１６］。ヴィオラセインの産生のための経路は、図５７に示すようにトリプトファンから開始し、中間体であるインドール－３－ピルビン酸（ＩＰＡ）、プロデオキシビオラセイン、デオキシビオラセイン、プロビオラセインを介してヴィオラセインを産生する前に変換する。興味深いことに、この経路にはクロモピロール酸（ＣＰＡ）の副産物など、多くの分岐点がある。この経路はまた、正確な構造が未知であり、「Ｘ」で表すことができるＩＰＡイミンダイマーを含む。この表現において、組み換え遺伝学的成分は、ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＥ、ｖｉｏＣおよびｖｉｏＤであることに留意されたい。
各コード配列ｖｉｏＡ、ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤおよびｖｉｏＥを、各酵素（Ｊ２３１５１）のコード配列の前に強力なプロモーターのもとでクローニングした。プロモーター配列は、図５８に概説されているように、［１］のＵＴＲ、［７３］のＣＤＳ、および［６］のターミネーター配列ＥＣＫ１２００３３７３６（Ｔ１４）由来である。各断片からの[0001]直鎖ＤＮＡを１００ｂｐの立体保護で作製し、ゴールデンゲート手順［７１］を用いてＤＮＡを組み立てた。
反応を実行するには、等モル濃度の各直鎖ＤＮＡを使用することから開始することができる。得られた生成物は不溶性であったが、７０％エタノールで抽出することができた。経路からの中間産物を探索するために、特定の直鎖ＤＮＡを除外することができ、除外された直鎖ＤＮＡによって入力が処理される前に経路の流束を強制的に停止させるはずである。
産生された抽出物は、ＢＬ２１－Ｒｏｓｅｔｔａ２株由来であり、抽出物は、１Ｌの培養物から［１５］に列挙されたプロトコルに基づいて調製された。抽出物は溶解の代わりに均質化を行い、後の処理工程は［７４］に沿って実施されたが、８０分間の熱インキュベーション工程を用いた。
実施例５３：ヴィオラセインを用いた無細胞システムにおける代謝経路工学：無細胞反応の読み取りおよび実行
典型的な実験では、［１５］に記載されているように緩衝液および抽出物の混合物にＤＮＡを添加し、少なくとも４時間反応を実施した。次いで、反応生成物をペレット化して、非溶解性成分を単離し、ペレットを水で洗浄し、次いで、７０％エタノールに溶解して、沈殿したサンプルを可溶化する。次いで、このサンプルを５７２ｎｍで吸光度について測定して、レポート可能な要素を読み取った。
ヴィオラセイン産生のより具体的な測定のためにＬＣ－ＭＳを使用した。ＴＸ－ＴＬでの産生後、反応生成物をペレット化し、水で1回洗浄した後、Acquity UPLCr BEH C18 １．７ｕｍ逆相カラムに流速０．５ｍｌ／分で注入した。反応は、１％のＣＡＮを含む１０ｍＭのギ酸アンモニウム中で行った。アセトニトリルで０～９０％の勾配をかけ、０.２分間保持した。０.３４４ｋＤａ、０.３２８ｋＤａ、および０.３１２Ｄａの質量ウインドウ範囲および１.９３、１.６５および１.８３分の溶出時間が、それぞれヴィオラセイン、デオキシビオラセインおよびプロデオキシビオラセインを検出した。
実施例５４：ヴィオラセインを用いた無細胞システムにおける代謝経路工学：吸光度または視覚アッセイを用いた産生の確認
ＴＸ－ＴＬ中の各酵素の等モル濃度の直鎖ＤＮＡでの経路を実行すると、どのようなヴィオラセイン酵素が混合物から除外されるかに応じて、様々な着色産物の産生が得られる。７０％エタノール中のペレットの抽出後、反応からの色の違いを視覚的に見ることができる（図５９）。ヴィオラセインは特徴的なバイオレットカラーを有し、一方、ＶｉｏＥ／Ｃ／Ｄ、ｖｉｏＣ／Ｄ、ｖｉｏＣ、およびｖｉｏＤを欠く反応から生成された抽出物は、ｖｉｏＥ／Ｃ／Ｄが特に陰性対照と同様の無色生成物を生成する、特徴的に異なる色を生成する。ＶｉｏＤ欠損反応から生成されたライトバイオレット生成物は、酵素発現経路に基づいてデオキシビオラセインであると推定される。
さらに完全な経路を探究するために、試料を吸光度についてＮａｎｏｄｒｏｐ２０００で読み取った。完全な経路（ヴィオラセイン、左）およびＶｉｏＣ（デオキシビオラセイン、右）を欠くサンプルは、青色で公開されたピークと一致するピークを有する［１６、７５］（図６０）。
実施例５５：ヴィオラセインを用いた無細胞システムにおける代謝経路工学：ＬＣ－ＭＳを用いた産生の確認
特異性についてＬＣ－ＭＳを用いて反応をさらに分析することができる。純粋なヴィオラセインスタンダードに対して、各酵素の等モル４ｎＭの直鎖ＤＮＡがＴＸ－ＴＬで実験され、先に記載したプロトコルにおいて、得られた代謝物をＬＣ－ＭＳで読み取った。ＬＣ－ＭＳはａ）に存在するヴィオラセインを検出したが、ｂ）にはデオキシビオラセインの混入があり、ｃ）にはプロデオキシビオラセインの混入があり、これはヴィオラセイン生成の分岐点を考えると予想外ではない（図６１）。
上流の中間体であるプロデオキシビオラセインもまた、ヴィオラセインの１.７倍高い濃度で存在する。このことは、反応が完了するまでには至らず、ｖｉｏＣおよびｖｉｏＤが律速である可能性があることを示唆しており、例えば、ｖｉｏＣおよび／またはｖｉｏＤのＤＮＡの濃度を増加させると、律速段階を緩和することができる（図６２）。市販のスタンダードに対して、我々はビオラセイン産生を１９．８μＭと推定している。
実施例５６：ヴィオラセインを用いた無細胞システムにおける代謝経路工学：ウエスタンブロッティングを用いた産生の確認
ウエスタンブロットアッセイを用いて、システム中の酵素の産生を確認することもできる。これを行うために、ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢおよびＶｉｏＥコード配列をＣ末端Ｓｔｒｅｐタグで修飾した。酵素は直鎖状ＤＮＡ上で等モル濃度４ｎＭで発現させ、次にBiorad's Precision Protein（商標）StrepTactin-HRPコンジュゲート抗体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で視覚化した。ＶｉｏＥ濃度は、完全経路が発現された場合のＶｉｏＡ濃度よりも高く、ｖｉｏＢは別のＴＸ－ＴＬ反応で検出可能であった。モデル結果に対して、バンド強度に基づく酵素レベルも示されている（図６３）。
実施例５７：ヴィオラセインを用いた無細胞システムにおける代謝経路工学：薄層クロマトグラフィーを用いた産生の確認
代謝産物を分析するために、薄層クロマトグラフィーも使用することができる。３つのサンプルを比較した：ビオラセインスタンダード、ｖｉｏＣおよびｖｉｏＤが４ｎＭの他の構築物に対して６．５ｎＭ（ＣＨＤＨ）の濃度の増加で与えられた実験、および各構築物が４ｎＭ（Ｍ）である実験。試料をメタノール中の２０％ジクロロメタンで溶出する。得られた実験は、３つの別々のスポットを提供し、ＵＶの下で視覚化され、Ｒｆ値は０．２１および０．３８であった（図６４）。
実施例５８：ヴィオラセインを用いた無細胞システムにおける代謝経路工学：代謝経路の設計空間探査
設計空間探査を行うために直鎖ＤＮＡの濃度を変化させることができる。これを行うために、４ｎＭの各直鎖ＤＮＡとしてデフォルト経路を設定し、次いで、低濃度として２．５ｎＭの直鎖ＤＮＡおよび高濃度として６．５ｎＭの直鎖ＤＮＡを設定することができる。（また、ヴィオラセイン中間体は、このアッセイにより捕捉でき、区別はできないので、）産生された天然のヴィオラセインの量を量的に測定するために、５７２ｎｍの吸光度を用いて、各ヴィオラセインコード配列の低、中、および高レベルの直鎖ＤＮＡの異なる組み合わせを追加し分析することができる（図６５）。この実験を実施することにより、ＶｉｏＤ濃度を増加させると粗収率が増加し、ＶｉｏＣを独立して増加させることができることが分かる。しかしながら、ＶｉｏＢは粗収率に影響しない。これは、経路において、制限試薬がＶｉｏＣおよびＶｉｏＤ酵素濃度であることを示唆する。
ヴィオラセインと中間体を区別するために、またヴィオラセイン産生の濃度を高める試みとして、ＬＣ－ＭＳを用いてヴィオラセインの特定の産生を分析することができる。ｖｉｏＢ、ｖｉｏＣ、ｖｉｏＤおよびｖｉｏＥの異なる濃度が増加および減少し、最終のヴィオラセイン濃度、デオキシビオラセイン濃度、およびプロデオキシビオラセイン濃度が測定される（図６６）。前の図でサポートされているように、高ＶｉｏＣおよびＶｉｏＤは、通常の（４ｎＭの直鎖ＤＮＡ濃度）でのすべての酵素と比較して、より多くのヴィオラセインおよびより少ないプロデオキシビオラセインを産生することができる。他の改変はヴィオラセインの収量を変化させたが、将来の実験がなければその正確な効果を決定することは困難である。
実施例５９：ヴィオラセインを用いた無細胞システムにおける代謝経路工学：結果およびインビボ目標環境予測の議論
ヴィオラセイン経路の酵素をコードする直鎖ＤＮＡカセットの濃度を変化させるためにＴＸ－ＴＬを用いることにより、経路のボトルネックおよび中間体の産物を探求することができる。中間体酵素の除去は異なるカラー成分をもたらし（例えば、非ヴィオラセイン産物）、一方、ｖｉｏＣおよびｖｉｏＤは経路における産生のボトルネックであり、増加すればプロデオキシビオラセインの蓄積を取り除くことができることが見出されている。
それぞれの酵素の除去およびそれらの特徴的な結果として生じる色は、各酵素がヴィオラセインの産生に必要であることを示す。したがって、回路をインビボで実行する場合、インビボで得られた結果はインビトロと同じであると予想され、例えば、経路中のいずれかの酵素の除去は、中間体の蓄積を引き起こし、すべての酵素が存在する場合よりも顕著に少ないヴィオラセインを生じる。我々は、各酵素のノックアウトバージョンでインビボで行ったサンプルを集めた場合、代謝生成物は図５９のような特徴的な色を示すことが予想される。プロデオキシビオラセインの蓄積がある場合、ｖｉｏＣおよびｖｉｏＤの濃度を増加させることによって蓄積を解消することができ、ｖｉｏＣおよびｖｉｏＤは、すべての酵素が同じＤＮＡコード化濃度で提供される場合、インビボでの律速段階であり得る。
クルー（crue）ヴィオラセイン濃度により並びにヴィオラセインおよび中間体のＬＣ－ＭＳにより測定される、ｖｉｏＣおよびｖｉｏＤが直鎖ＤＮＡの改善された収率で増加するように行われる実験により、ＴＸ－ＴＬにおける律速工程としてのＶｉｏＣおよびＶｉｏＤは、さらに支持される。これは、経路の上流のｖｉｏＢの位置のために予想されるように、有意な効果を有さないｖｉｏＢの改変と対照的である。
要約すると、本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、目標環境で機能する遺伝的回路の分子成分および／またはそれらの組み合わせを選択するために、目標環境の条件下で、無細胞システムにおいて、遺伝的回路の分子成分および／またはそれらの組み合わせを試験することにより、目標環境において作用する遺伝的回路を設計、構築、実施、デバッグおよび／または試験するように構成された方法および配置ならびに関連する無細胞生体分子ブレッドボードである。
上記の例は、当業者に開示の材料、組成物、システムおよび方法の実施形態を作製および使用する方法の完全な開示および説明を付与するために提供され、発明者らがそれらの開示として考えるものの範囲を限定することを意図するものではない。当業者は、特許請求の範囲の様々な実施形態および範囲に従って、例示された方法および配置の特徴を追加の遺伝的回路、関連するノード、分子構成要素、ポリヌクレオチドのセット、ポリペプチドおよび／または代謝生成物に適合させる方法を認識するであろう。
本明細書において言及される全ての特許および刊行物は、本開示が関係する当業者の技術レベルを示すものである。
背景、要約、詳細な説明および実施例における引用された各文献（特許、特許出願、雑誌論文、要約、実験室マニュアル、書籍または他の開示を含む）の全開示は、参照により本明細書に組み込まれる。この開示に引用されている全ての参考文献は、各参考文献が参照によりその全体が個々に援用されたのと同程度に、参照により組み込まれる。しかし、引用文献と本開示との間に矛盾が生じた場合、本開示が優先される。
本明細書で使用される用語および表現は、限定ではなく説明の用語として使用され、示され説明された特徴またはその一部の均等物を排除するような用語および表現を使用する意図はないが、クレームされた開示の範囲内で様々な変更が可能であることを認識している。したがって、本開示は、実施形態、例示的な実施形態、および任意の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示された概念の変更および変形は、当業者によって頼りにされ得、そのような変更および変形が考慮される添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の範囲内にあることを理解されたい。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には、その内容が明確に指示しない限り、複数の指示対象が含まれる。内容が明確に指示しない限り、「複数」という用語は２つ以上の指示対象を含む。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が関係する当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
マーカッシュグループまたは他のグループが本明細書で使用される場合、グループのすべての個々のメンバーおよびグループのすべての組み合わせおよび可能なサブコンビネーションは、個別に開示に含まれることを意図する。本明細書に記載または例示された構成要素または材料のすべての組み合わせは、特に明記しない限り、本開示を実施するために使用することができる。当業者であれば、過度の実験に頼ることなく、本開示の実施において、具体的に例示されたもの以外の方法、デバイス要素、および材料を用いることができることを理解するであろう。任意のこのような方法、デバイス要素、および材料の技術的に既知の機能的等価物は全て、本開示に含まれるものとする。温度範囲、周波数範囲、時間範囲、または組成範囲などの仕様に範囲が指定されている場合、すべての中間範囲とすべての部分範囲、および指定された範囲に含まれるすべての個別値は、本開示に含まれるべきである。本明細書に開示された範囲またはグループの１つまたは複数の個々のメンバーは、この開示の請求から除外することができる。本明細書に例示的に記載される開示は、本明細書に具体的に開示されていない任意の１つの要素もしくは複数の要素または１つの限定もしくは複数の限定がない場合に、適切に実施され得る。
本開示の多くの実施形態が記載されている。本明細書で提供される特定の実施形態は、本発明の有用な実施形態の例であり、本開示が、本明細書に記載されたデバイス、デバイス構成要素、方法ステップの多数の変形を用いて実行され得ることは、当業者にとって明らかである。当業者には自明であるように、本方法に有用な方法および装置は、多数の任意の組成物および処理要素および工程を含むことができる。
特に、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、様々な改変がなされ得ることが理解されるであろう。したがって、他の実施形態は、添付の特許請求の範囲内にある。
参考文献
1. Mutalik, V.K., et al., Precise and reliable gene expression via standard transcription and translation initiation elements. Nat Methods, 2013. 10(4): p. 354-60.
2. Stanton, B.C., et al., Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nat Chem Biol, 2014. 10(2): p. 99-105.
3. Elowitz, M.B. and S. Leibler, A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators. Nature, 2000. 403(6767): p. 335-8.
4. Lutz, R. and H. Bujard, Independent and tight regulation of transcriptional units in Escherichia coli via the LacR/O, the TetR/O and AraC/I1-I2 regulatory elements. Nucleic Acids Res, 1997. 25(6): p. 1203-10.
5. Nguyen, H.B., et al., Design Space Exploration of the Violacein Pathway in Escherichia coli Based Transcription Translation Cell-Free System (TX-TL). bioRxiv, 2016.
6. Chen, Y.-J., et al., Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints. Nat Methods, 2013. 10(7): p. 659-664.
7. Isaacs, F.J., et al., Engineered riboregulators enable post-transcriptional control of gene expression. Nature Biotechnology, 2004. 22(7): p. 841-847.
8. Chappell, J., et al., The centrality of RNA for engineering gene expression. Biotechnology Journal, 2013. 8(12): p. 1379-1395.
9. Brewster, R.C., et al., The transcription factor titration effect dictates level of gene expression. Cell, 2014. 156(6): p. 1312-23.
10. Moon, T.S., et al., Genetic programs constructed from layered logic gates in single cells. Nature, 2012. 491(7423): p. 249-53.
11. Shin, J. and V. Noireaux, An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol, 2012. 1(1): p. 29-41.
12. Mangan, S. and U. Alon, Structure and function of the feed-forward loop network motif. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(21): p. 11980-5.
13. Hooshangi, S., S. Thiberge, and R. Weiss, Ultrasensitivity and noise propagation in a synthetic transcriptional cascade. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005. 102(10): p. 3581-6.
14. Gardner, T.S., C.R. Cantor, and J.J. Collins, Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature, 2000. 403(6767): p. 339-42.
15. Sun, Z.Z., Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments, 2013. 79.
16. Jiang, P.X., et al., Reconstruction of the violacein biosynthetic pathway from Duganella sp. B2 in different heterologous hosts. Appl Microbiol Biotechnol, 2010. 86(4): p. 1077-88.
17. Yim, H., et al., Metabolic engineering of Escherichia coli for direct production of 1,4-butanediol. Nat Chem Biol, 2011. 7(7): p. 445-52.
18. Paddon, C.J., et al., High-level semi-synthetic production of the potent antimalarial artemisinin. Nature, 2013. 496(7446): p. 528-32.
19. Jaitzig, J., et al., Reconstituted biosynthesis of the nonribosomal macrolactone antibiotic valinomycin in Escherichia coli. ACS Synth Biol, 2014. 3(7): p. 432-8.
20. Del Vecchio, D. and R.M. Murray, Biomolecular feedback systems. 2015, Princeton: Princeton University Press. vi, 275 pages.
21. Hucka, M., et al., The systems biology markup language (SBML): a medium for representation and exchange of biochemical network models. Bioinformatics, 2003. 19(4): p. 524-31.
22. Sun, Z.Z., et al., Protocols for Implementing an Escherichia Coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Journal of Visualized Experiments, 2013. e50762.
23. Zubay, G., In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics, 1973. 7: p. 267-287.
24. Shimizu, Y., et al., Cell-free translation reconstituted with purified components. Nature Biotechnology, 2001. 19(8): p. 751-755.
25. Vinarov, D.A., C.L.L. Newman, and J.L. Markley, Wheat germ cell‐free platform for eukaryotic protein production. FEBS Journal, 2006. 273(18): p. 4160-4169.
26. Lodish, H.F., R. Weinberg, and H.L. Ozer, Translation of mRNA from simian virus 40-infected cells into simian virus 40 capsid protein by cell-free extracts. Journal of Virology, 1974. 13(3): p. 590-595.
27. Niederholtmeyer, H., V. Stepanova, and S.J. Maerkl, Implementation of cell-free biological networks at steady state. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013.
28. Pardee, K., et al., Paper-based synthetic gene networks. Cell, 2014. 159(4): p. 940-54.
29. Atsumi, S., et al., Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production. Metab Eng, 2008. 10(6): p. 305-311.
30. Wagner, E.G., S. Altuvia, and P. Romby, Antisense RNAs in bacteria and their genetic elements. Adv Genet, 2002. 46: p. 361-98.
31. Winkler, W., A. Nahvi, and R.R. Breaker, Thiamine derivatives bind messenger RNAs directly to regulate bacterial gene expression. Nature, 2002. 419(6910): p. 952-6.
32. Lee, T.S., et al., BglBrick vectors and datasheets: A synthetic biology platform for gene expression. J Biol Eng, 2011. 5: p. 12.
33. Shin, J. and V. Noireaux, Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng, 2010. 4: p. 8.
34. Whitaker, W.R., et al., Engineering robust control of two-component system phosphotransfer using modular scaffolds. Proc Natl Acad Sci U S A, 2012. 109(44): p. 18090-5.
35. Karzbrun, E., et al., Synthetic biology. Programmable on-chip DNA compartments as artificial cells. Science, 2014. 345(6198): p. 829-32.
36. Zawada, J.F., et al., Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production--a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnol Bioeng, 2011. 108(7): p. 1570-8.
37. Meyer, B.J., R. Maurer, and M. Ptashne, Gene regulation at the right operator (OR) of bacteriophage lambda. II. OR1, OR2, and OR3: their roles in mediating the effects of repressor and cro. J Mol Biol, 1980. 139(2): p. 163-94.
38. Sun, Z.Z., et al., Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coliBased TX-TL Cell-Free System. ACS Synth Biol, 2014. 3(6): p. 387-397.
39. Martin, A., T.A. Baker, and R.T. Sauer, Rebuilt AAA + motors reveal operating principles for ATP-fuelled machines. Nature, 2005. 437(7062): p. 1115-20.
40. Davis, J.H., T.A. Baker, and R.T. Sauer, Engineering synthetic adaptors and substrates for controlled ClpXP degradation. J Biol Chem, 2009. 284(33): p. 21848-55.
41. Gibson, D.G., et al., Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods, 2009. 6(5): p. 343-5.
42. Engler, C., R. Kandzia, and S. Marillonnet, A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability. PLoS One, 2008. 3(11): p. e3647.
43. Baker, T.A. and R.T. Sauer, ClpXP, an ATP-powered unfolding and protein-degradation machine. Biochim Biophys Acta, 2012. 1823(1): p. 15-28.
44. Chappell, J., K. Jensen, and P.S. Freemont, Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Res, 2013. 41(5): p. 3471-81.
45. Tamsir, A., J.J. Tabor, and C.A. Voigt, Robust multicellular computing using genetically encoded NOR gates and chemical 'wires'. Nature, 2011. 469(7329): p. 212-5.
46. Wurtzel, O., et al., The single-nucleotide resolution transcriptome of Pseudomonas aeruginosa grown in body temperature. PLoS Pathog, 2012. 8(9): p. e1002945.
47. Schuster, M., M.L. Urbanowski, and E.P. Greenberg, Promoter specificity in Pseudomonas aeruginosa quorum sensing revealed by DNA binding of purified LasR. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004. 101(45): p. 15833-9.
48. Mutalik, V.K., et al., Precise and reliable gene expression via standard transcription and translation initiation elements. Nat Meth, 2013. 10(4): p. 354-360.
49. Sun, Z.Z., et al., Linear DNA for rapid prototyping of synthetic biological circuits in an Escherichia coli based TX-TL cell-free system. ACS Synth Biol, 2013.
50. Casini, A., et al., R2oDNA Designer: Computational Design of Biologically Neutral Synthetic DNA Sequences. ACS Synth Biol, 2014. 3(8): p. 525-528.
51. Stricker, J., et al., A fast, robust and tunable synthetic gene oscillator. Nature, 2008. 456(7221): p. 516-9.
52. Fitzwater, T., et al., Conditional high copy number ColE1 mutants: resistance to RNA1 inhibition in vivo and in vitro. The EMBO journal, 1988. 7(10): p. 3289-3297.
53. Wang, P., et al., Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol, 2010. 20(12): p. 1099-103.
54. Preibisch, S., S. Saalfeld, and P. Tomancak, Globally optimal stitching of tiled 3D microscopic image acquisitions. Bioinformatics, 2009. 25(11): p. 1463-1465.
55. Schindelin, J., et al., Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods, 2012. 9(7): p. 676-682.
56. Hori, Y., M. Takada, and S. Hara, Biochemical oscillations in delayed negative cyclic feedback: Existence and profiles. Automatica, 2013. 49(9): p. 2581-2590.
57. Hori, Y., T.-H. Kim, and S. Hara, Existence criteria of periodic oscillations in cyclic gene regulatory networks. Automatica, 2011. 47(6): p. 1203-1209.
58. Niederholtmeyer, H., et al., Rapid cell-free forward engineering of novel genetic ring oscillators. eLife, 2015.
59. Rosenfeld, N., et al., Gene regulation at the single-cell level. Science, 2005. 307(5717): p. 1962-1965.
60. Cookson, N.A., et al., Queueing up for enzymatic processing: correlated signaling through coupled degradation. Mol Syst Biol, 2011. 7: p. 561.
61. Prindle, A., et al., Rapid and tunable post-translational coupling of genetic circuits. Nature, 2014. 508(7496): p. 387-91.
62. Smith, H., Oscillations and multiple steady states in a cyclic gene model with repression. Journal of mathematical biology, 1987. 25(2): p. 169-190.
63. Ceroni, F., et al., Quantifying cellular capacity identifies gene expression designs with reduced burden. Nat Methods, 2015. 12(5): p. 415-418.
64. Danino, T., et al., A synchronized quorum of genetic clocks. Nature, 2010. 463(7279): p. 326-30.
65. Prindle, A., et al., A sensing array of radically coupled genetic /`biopixels/&apos;. Nature, 2012. 481(7379): p. 39-44.
66. Kiviet, D.J., et al., Stochasticity of metabolism and growth at the single-cell level. Nature, 2014. 514(7522): p. 376-379.
67. Shin, J. and V. Noireaux, Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system. J Biol Eng, 2010. 4: p. 9.
68. Murphy, K.C., The lambda Gam protein inhibits RecBCD binding to dsDNA ends. J Mol Biol, 2007. 371(1): p. 19-24.
69. Sitaraman, K., et al., A novel cell-free protein synthesis system. J Biotechnol, 2004. 110(3): p. 257-63.
70. Pachuk, C.J., et al., Chain reaction cloning: a one-step method for directional ligation of multiple DNA fragments. Gene, 2000. 243(1-2): p. 19-25.
71. Sarrion-Perdigones, A., et al., GoldenBraid: an iterative cloning system for standardized assembly of reusable genetic modules. PLoS One, 2011. 6(7): p. e21622.
72. Ro, D.K., et al., Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast. Nature, 2006. 440(7086): p. 940-3.
73. Lee, M.E., et al., Expression-level optimization of a multi-enzyme pathway in the absence of a high-throughput assay. Nucleic Acids Res, 2013. 41(22): p. 10668-78.
74. Kwon, Y.-C. and M.C. Jewett, High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific reports, 2015. 5: p. 8663.
75. Balibar, C.J. and C.T. Walsh, In vitro biosynthesis of violacein from L-tryptophan by the enzymes VioA-E from Chromobacterium violaceum. Biochemistry, 2006. 45(51): p. 15444-57.

Claims (24)

  1. 目標環境で動作する遺伝子回路を、無細胞システムに構築する方法であって、
    （a）複数の直鎖ＤＮＡを提供し、各直鎖ＤＮＡは無細胞システム中で反応し、該無細胞システムは無細胞抽出物の化学物質成分を含み、前記無細胞混合物遺伝子回路の分子成分を発現し、該遺伝子回路は相互に作用する成分の完全接続ネットワークを形成するための反応を活性化し、阻害し、結合し、または変換することにより、回路設計にしたがって互いに接続される分子成分を含み、前記遺伝子回路が前記回路設計にしたがって作用するとき、少なくとも１つの分子成分が前記無細胞システムでおよび目標環境で検出できるレポート可能な分子成分であり、
    （b）前記遺伝子回路を表現するモデルを提供し、
    （c）別々の無細胞抽出物中で、前記目標環境の条件下で複数の直鎖ＤＮＡの組み合わせを試験し、前記試験は前記無細胞システム中で反応が可能な直鎖ＤＮＡの組み合わせを選択して、前記目標環境の条件下で前記遺伝子回路の分子成分を提供し、
    （d）前記選択した直鎖ＤＮＡの組み合わせが、前記モデルにマッチする分子成分を産生することが可能になるまで、ステップ（a）～（c）を繰り返し、
    （e）前記選択した直鎖ＤＮＡの組み合わせを、前記無細胞システムと接触させて、前記選択した組み合わせを再試験し、前記目標環境で動作する前記遺伝子回路の前記レポート可能な分子成分を前記無細胞システム中で提供することが可能な前記直鎖ＤＮＡの最終的な組み合わせを選択することを含む、方法。
  2. 前記回路設計は、フィードフォワードループ、カスケード、オシレータ、および代謝経路から選択される１以上のモチーフを含む、請求項１の方法。
  3. 前記レポート可能な分子成分は、前記回路設計にしたがって、前記遺伝子回路の出力を提供する、請求項１または２の方法。
  4. 前記無細胞システムは、転写および翻訳（ＴＸ－ＴＬ）システムである、請求項１から３のいずれか１つの方法。
  5. 前記ステップ（c）の試験は、
    前記遺伝子回路の各分子成分についての異なる方程式モデルを生成し、
    コンピュータを用いて各分子成分を特徴づけ、
    コンピュータを用いて２以上の分子成分を組み立てて前記遺伝子回路にし、
    複数の条件下で前記遺伝子回路のシミュレーションを行なうことを含む、請求項１から４のいずれか１つの方法。
  6. 前記特徴づけは、
    数学的モデル中でおよび前記無細胞システム中で、複数の条件に各分子成分を供し、
    前記数学的モデルを前記無細胞システムに基づいて適合させることを含む、請求項５の方法。
  7. 前記試験は、２以上の組み合わせの並列試験により行われる、請求項１から６のいずれか１つの方法。
  8. 各直鎖ＤＮＡは、前記無細胞システム中で反応することが可能となるように、前記目標環境の条件下で、前記遺伝子回路の所定の分子成分を提供することを含む、請求項１から７のいずれか１つの方法。
  9. 別々の無細胞抽出物中の各直鎖ＤＮＡを前記目標環境の条件下で、試験することをさらに含む、請求項８の方法。
  10. 前記遺伝子回路の前記分子成分は、少なくとも１つの遺伝学的分子成分、任意に、１以上の細胞分子成分、遺伝子またはその一部から転写された前記遺伝子およびＲＮＡにより形成された各遺伝学的分子成分、および任意に転写されたＲＮＡから翻訳されたポリペプチドを含む、請求項１から９のいずれか１つの方法。
  11. 前記ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および細胞環境における調整因子として作用することが可能なＲＮＡから選択される、請求項１０の方法。
  12. 前記少なくとも１つの遺伝学的分子成分の遺伝子は、同じポリヌクレオチド内に含まれる、請求項１０または１１の方法。
  13. 前記同じポリヌクレオチドは、直鎖ＤＮＡである、請求項１２の方法。
  14. 別々の無細胞抽出物中の各直鎖ＤＮＡの試験は、並列試験により行われる、請求項９から１３のいずれか１つの方法。
  15. 前記無細胞システムは、前記目標環境由来の組成成分を含む、請求項１から１４のいずれか１つの方法。
  16. 前記試験よりも前に、前記遺伝子回路を設計することをさらに含む、請求項１から１５のいずれか１つの方法。
  17. 前記試験により選択される置換分子成分で、前記遺伝子回路の１以上の分子成分を置き換えて、変化させた遺伝子回路をもたらすことにより、前記遺伝子回路のバリエーションを提供することをさらに含む、請求項１から１６のいずれか１つの方法。
  18. 前記目標環境で作用する前記遺伝子回路を、前記無細胞システム中でデバッグするために、前記変化させた遺伝子回路における試験および前記バリエーションの提供を繰り返すことをさらに含む、請求項１７の方法。
  19. 前記バリエーションの提供および／または前記繰り返しは、インシリコで行われる、請求項１８の方法。
  20. 前記試験により選択される置換分子成分で、１以上の分子成分を置き換えることにより、前記遺伝子回路のバリエーションを提供し、変化させた遺伝子回路を提供することをさらに含む、請求項８から１９のいずれか１つの方法。
  21. 前記目標環境で作用する前記遺伝子回路を、前記無細胞システム中でデバッグするために、前記変化させた回路および前記バリエーションの提供にて、前記試験を繰り返すことをさらに含む、請求項２０の方法。
  22. 前記バリエーションの提供および／または前記繰り返しは、インシリコで行われる、請求項２１の方法。
  23. ステップ（d）では、連続する繰り返しの間に、
    異なる濃度の、誘導因子のような、追加の化学物質、温度、直鎖ＤＮＡの濃度、直鎖ＤＮＡの配列、緩衝液条件、およびレポータータンパク質の発現レベルに影響を及ぼす可能性がある他の因子のうちの１以上を変化させる、請求項１から２１のいずれか１つの方法。
  24. 請求項１から２３のいずれか１つの、目標環境で作用される遺伝子回路を、無細胞システムに構築するためのアレンジメントであって、
    ステップ（d）からの前記選択した直鎖ＤＮＡの組み合わせを含む、アレンジメント。
JP2017542427A 2015-02-17 2016-02-17 無細胞の生体分子ブレッドボード並びに関連する方法およびアレンジメント Active JP7042619B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562117319P 2015-02-17 2015-02-17
US62/117,319 2015-02-17
US201562143878P 2015-04-07 2015-04-07
US62/143,878 2015-04-07
PCT/US2016/018344 WO2016134069A1 (en) 2015-02-17 2016-02-17 Cell-free biomolecular breadboards and related methods and arrangements

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2018512044A JP2018512044A (ja) 2018-05-10
JP2018512044A5 JP2018512044A5 (ja) 2018-08-30
JP7042619B2 true JP7042619B2 (ja) 2022-03-28

Family

ID=56692743

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017542427A Active JP7042619B2 (ja) 2015-02-17 2016-02-17 無細胞の生体分子ブレッドボード並びに関連する方法およびアレンジメント

Country Status (4)

Country Link
US (1) US11004536B2 (ja)
EP (1) EP3259354A4 (ja)
JP (1) JP7042619B2 (ja)
WO (1) WO2016134069A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210147855A1 (en) * 2019-11-14 2021-05-20 The Trustees Of Princeton University Optogenetic circuits for controlling chemical and protein production in escherichia coli
WO2022082362A1 (zh) * 2020-10-19 2022-04-28 陈振暐 代谢酪氨酸的非病原性细菌基因表现系统及转化株、其用于制备降低尿毒素的组合物的用途以及利用其代谢酪氨酸的方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006068802A2 (en) * 2004-12-22 2006-06-29 Ambrx, Inc. COMPOSITIONS OF AMINOACYL-tRNA SYNTHETASE AND USES THEREOF
US8455231B2 (en) * 2009-02-06 2013-06-04 Uchicago Argonne, Llc Cell-free system for synthesizing membrane proteins cell free method for synthesizing membrane proteins
US9322023B2 (en) * 2011-10-06 2016-04-26 Cornell University Constructs and methods for the assembly of biological pathways
US20160002611A1 (en) 2014-06-09 2016-01-07 Regents Of The University Of Minnesota Methods and Apparatus for Cell-Free Microfluidic-Assisted Biosynthesis

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ACS Synthetic Biology，2012年，Vol.1，pp.29-41
ACS Synthetic Biology，2014年，Vol.3，pp.416-425
Journal of Visualized Experiments，2013年，Vol.79, e50762，pp.1-14
Nature Chemical Biology，2010年，Vol.6，pp.71-78
PNAS，2003年，Vol.100，pp.12672-12677

Also Published As

Publication number Publication date
US11004536B2 (en) 2021-05-11
WO2016134069A1 (en) 2016-08-25
JP2018512044A (ja) 2018-05-10
EP3259354A4 (en) 2018-07-25
US20170024512A1 (en) 2017-01-26
EP3259354A1 (en) 2017-12-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Naseri et al. Application of combinatorial optimization strategies in synthetic biology
Chao et al. Engineering biological systems using automated biofoundries
Meyer et al. Escherichia coli “Marionette” strains with 12 highly optimized small-molecule sensors
Chen et al. Synthetic biology toolkits and applications in Saccharomyces cerevisiae
Hu et al. Generating effective models and parameters for RNA genetic circuits
Lehr et al. Cell-free prototyping of AND-logic gates based on heterogeneous RNA activators
Breitling et al. Synthetic biology advances for pharmaceutical production
Bradley et al. Tools and principles for microbial gene circuit engineering
Takahashi et al. Rapidly characterizing the fast dynamics of RNA genetic circuitry with cell-free transcription–translation (TX-TL) systems
Chappell et al. A renaissance in RNA synthetic biology: new mechanisms, applications and tools for the future
Jiang et al. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology
Kushwaha et al. Using RNA as molecular code for programming cellular function
Sengupta et al. Recent advances in synthetic biology of cyanobacteria
Carr et al. Genome engineering
Copeland et al. Computational tools for metabolic engineering
Zahnd et al. Ribosome display: selecting and evolving proteins in vitro that specifically bind to a target
Lavickova et al. A partially self-regenerating synthetic cell
Chizzolini et al. Cell-free translation is more variable than transcription
Pandi et al. A versatile active learning workflow for optimization of genetic and metabolic networks
Young et al. Combinatorial metabolic pathway assembly approaches and toolkits for modular assembly
Fernández-Castané et al. Computer-aided design for metabolic engineering
Tuza et al. An in silico modeling toolbox for rapid prototyping of circuits in a biomolecular “breadboard” system
Freemont et al. Synthetic Biology-A Primer
Pieters et al. Cell-free characterization of coherent feed-forward loop-based synthetic genetic circuits
JP7042619B2 (ja) 無細胞の生体分子ブレッドボード並びに関連する方法およびアレンジメント

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180627

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20181218

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20191203

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20200225

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200527

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20201013

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20210112

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210311

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20210824

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20211122

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20220308

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20220315

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7042619

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150