JP7028797B2 - 細胞を選抜する方法 - Google Patents
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Description
[1]以下の第1工程および第2工程を含む、細胞を選抜する方法。
第1工程:配列番号1~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子について、細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程
第2工程:前記第1工程において測定した前記遺伝子の発現レベルを、対照細胞における前記遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、又は、それぞれの細胞における前記遺伝子の発現レベルを比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程
[2]以下の第1工程および第2工程を含む、細胞を選抜する方法。
第1工程:配列番号1~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを測定する工程
第2工程:前記第1工程において測定した前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、対照細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの対照値と比較し、又は、それぞれの細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程
[3]以下の第1工程および第2工程を含む、細胞を選抜する方法。
第1工程:配列番号1~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子について、細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程
第2工程:以下に示す(a)~(d)の手順に相対発現量を算出及び比較し、細胞を選抜する工程;
(a)第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値=(第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベル)/(標準遺伝子の発現レベル)
(b)対照細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該対照細胞における標準遺伝子の発現レベルを除して対照値を算出する。
対照値=(対照細胞についての前記遺伝子の発現レベル)/(標準遺伝子の発現レベル)
(c)(a)において算出した被験細胞についての相対定量値を、(b)において算出した対照値で除した相対発現量を算出する。
相対発現量=[(a)において算出した被験細胞についての相対定量値]/[(b)において算出した対照値]
(d)各被験細胞間において、(a)で算出した相対定量値、又は(c)で算出した相対発現量、を比較することにより、それぞれの値が高い又は低い細胞を選抜する。
[4]第2工程(d)において、相対定量値若しくは相対発現量が高い細胞としては、その相対定量値若しくは相対発現量が対照値の2倍以上の細胞であり、又は、相対定量値若しくは相対発現量が低い細胞としては、その相対定量値若しくは相対発現量が対照値の1/2倍以下の細胞である、[3]に記載の方法。
[5]第1工程の前に、配列番号1~9に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子を細胞に導入し、形質転換する工程を含む、[1]~[4]のいずれか1に記載の方法。
[6]第1工程の前に、配列番号10~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子を細胞でノックダウン又はノックアウトする工程を含む、[1]~[5]のいずれか1に記載の方法。
[7]第1工程の前に、組換えタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入し、形質転換する工程を含む、[1]~[6]のいずれか1に記載の方法。
[8][1]~[7]のいずれか1に記載の方法により細胞を選抜する工程を含む、組換えタンパク質を生産する細胞を取得する方法。
[9][1]~[8]のいずれか1に記載の方法により選抜または取得された細胞または細胞を用いて組換えタンパク質を生産する方法。
[10]前記細胞が哺乳類動物細胞由来の細胞である、[1]~[9]のいずれか1に記載の方法。
[11]前記遺伝子がPlet1遺伝子である、[1]~[10]のいずれか1に記載の方法。
[12]前記組換えタンパク質が抗体である[1]~[11]のいずれか1に記載の方法。
[13]配列番号1~9に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子が導入されて形質転換された、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞。
[14]配列番号10~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子がノックダウン又はノックアウトされた、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞。
[15]配列番号1~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子を指標とすることにより、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞の取得確率を上げる方法。
第1工程:配列番号1~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子について、細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程
第2工程:前記第1工程において測定した前記遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程
(a)第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値=(第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベル)/(標準遺伝子の発現レベル)
(b)対照細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該対照細胞における標準遺伝子の発現レベルを除して対照値を算出する。
対照値=(対照細胞についての前記遺伝子の発現レベル)/(標準遺伝子の発現レベル)
(c)(a)において算出した被験細胞についての相対定量値を、(b)において算出した対照値で除した相対発現量を算出する。
相対発現量=[(a)において算出した被験細胞についての相対定量値]/[(b)において算出した対照値]
(d)各被験細胞間において、(a)で算出した相対定量値、又は(c)で算出した相対発現量、を比較することにより、それぞれの値が高い又は低い細胞を選抜する。
(d-1)各被験細胞間で(a)で算出した相対定量値を比較することにより、値が高い(配列番号1~9に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子を用いた場合)又は低い(配列番号10~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子を用いた場合)細胞を選抜する。
(d-2)各被験細胞間で(c)で算出した相対発現量を比較することにより、値が高い(配列番号1~9に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子を用いた場合)又は低い(配列番号10~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子を用いた場合)細胞を選抜する。
(e)第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値=(第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベル)/(標準遺伝子の発現レベル)
(f)(e)において算出した被験細胞についての相対定量値を、他の細胞で同様に算出した相対定量値と比較する。
(g)各被験細胞間で(e)で算出した相対定量値を比較することにより、値が高い(配列番号1~9に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子を用いた場合)又は低い(配列番号10~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子を用いた場合)細胞を選抜する。
第1工程:配列番号1~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを測定する工程
第2工程:前記第1工程において測定した前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、対照細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの対照値と比較し、又は、それぞれの細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程
(a)第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子がコードするタンパク質(標準タンパク質)の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値=(第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベル)/(標準タンパク質の発現レベル)
(b)対照細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、当該対照細胞における標準タンパク質の発現レベルを除して対照値を算出する。
対照値=(対照細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベル)/(標準タンパク質の発現レベル)
(c)(a)において算出した被験細胞についての相対定量値を、(b)において算出した対照値で除した相対発現量を算出する。
相対発現量=[(a)において算出した被験細胞についての相対定量値]/[(b)において算出した対照値]
(d)各被験細胞間において、(a)で算出した相対定量値、又は(c)で算出した相対発現量、を比較することにより、それぞれの値が高い又は低い細胞を選抜する。
(d-1)各被験細胞間で(a)で算出した相対定量値を比較することにより、値が高い(配列番号1~9に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子がコードするタンパク質を用いた場合)又は低い(配列番号10~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子がコードするタンパク質を用いた場合)細胞を選抜する。
(d-2)各被験細胞間で(c)で算出した相対発現量を比較することにより、値が高い(配列番号1~9に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子がコードするタンパク質を用いた場合)又は低い(配列番号10~16に示される塩基配列のいずれか1を有する遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子がコードするタンパク質を用いた場合)細胞を選抜する。
(e)第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子がコードするタンパク質(標準タンパク質)の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値=(第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベル)/(標準タンパク質の発現レベル)
(f)(e)において算出した被験細胞についての相対定量値を、他の細胞で同様に算出した相対定量値と比較する。
(g)各被験細胞間で(e)で算出した相対定量値を比較することにより、値が高い(配列番号1~9で表わされる遺伝子を用いた場合)又は低い(配列番号10~16で表わされる遺伝子を用いた場合)細胞を選抜する。
マイクロアレイ解析を用いた抗体生産細胞の遺伝子発現差解析
生産されるタンパク質(抗体)の還元されやすさの違いと相関して発現する遺伝子(mRNA)を特定する目的でDNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現差解析を行った。
RT-qPCR法を用いたplacenta-expressed transcript 1 protein(以下、Plet1という)遺伝子発現差解析による生産細胞の還元されやすさの判定
実施例1において見出された遺伝子のうち、生産されるタンパク質が還元されにくい生産株で高発現していることが明らかになったPlet1遺伝子を一例として以下の解析を行った。
Plet1遺伝子の発現差解析によるタンパク質が還元されにくい生産細胞の選抜
チャイニーズハムスター卵巣由来細胞(CHO細胞)を無血清培地へ馴化して宿主細胞Xを取得した。米国特許第6946292号明細書に記載の方法を用いて、フコシルトランスフェラーゼ(FUT8)を欠損させたCHO細胞を取得し、宿主細胞Yとした。
Plet1遺伝子の発現差解析による目的タンパク質が還元されにくい生産細胞選抜の汎用性確認
Plet1遺伝子の発現差解析により目的タンパク質が還元されにくい生産株を特定する方法の汎用性を確認する目的で、抗体D生産細胞を用いた検討を行った。
実施例3に示す方法に従い、抗体A、抗体B又は抗体Cと異なる抗原に対する抗体であるIgG4型モノクローナル抗体(以下、抗体Dという)の遺伝子をCHO細胞に導入後、シングルセルクローニングし、6株の抗体D生産細胞を調製し、それぞれ抗体D生産株#1~#6とした。
継代培養中の細胞を用いたPlet1遺伝子の発現解析
実施例3で評価を行った抗体C生産株46細胞のうち、Plet1遺伝子発現量の異なる9細胞に対して80日間の継代培養を行い、Plet1遺伝子の相対発現量を解析した。結果を図2に示す。
組換えタンパク質が還元されにくい宿主細胞(CHO細胞X’、Y’)の取得
実施例3で取得した2種類の宿主細胞(X、Y)を用いて以下の方法でシングルセルクローニングを実施し、サブクローニング株を作製した。
Plet1高発現の宿主細胞を使った生産株が還元されていない抗体を生産できることの確認
Plet1遺伝子発現量を高めた宿主細胞を用いることで、還元されにくいタンパク質の生産細胞を調製することができると考え、以下の試験を実施した。
Claims (10)
- 以下の第1工程および第2工程を含む、細胞を選抜する方法。
第1工程:Plet1遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子について、細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程
第2工程:前記第1工程において測定した前記遺伝子の発現レベルを、対照細胞における前記遺伝子の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程 - 以下の第1工程および第2工程を含む、細胞を選抜する方法。
第1工程:Plet1遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを測定する工程
第2工程:前記第1工程において測定した前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルを、対照細胞における前記遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルの対照値と比較し、その差異に基づき、組換えタンパク質の還元を抑制し得る発現レベルを評価する工程 - 以下の第1工程および第2工程を含む、細胞を選抜する方法。
第1工程:Plet1遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子について、細胞内の当該遺伝子の発現レベルを測定する工程
第2工程:以下に示す(a)~(d)の手順に相対発現量を算出及び比較し、細胞を選抜する工程;
(a)第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該被験細胞中の標準遺伝子の発現レベルで除した相対定量値を算出する。
相対定量値=(第1工程において測定した被験細胞についての前記遺伝子の発現レベル)/(標準遺伝子の発現レベル)
(b)対照細胞についての前記遺伝子の発現レベルを、当該対照細胞における標準遺伝子の発現レベルを除して対照値を算出する。
対照値=(対照細胞についての前記遺伝子の発現レベル)/(標準遺伝子の発現レベル)
(c)(a)において算出した被験細胞についての相対定量値を、(b)において算出した対照値で除した相対発現量を算出する。
相対発現量=[(a)において算出した被験細胞についての相対定量値]/[(b)において算出した対照値]
(d)各被験細胞間において、(a)で算出した相対定量値、又は(c)で算出した相対発現量、を比較することにより、それぞれの値が高い又は低い細胞を選抜する。 - 第2工程(d)において、相対定量値若しくは相対発現量が高い細胞としては、その相対定量値若しくは相対発現量が対照値の2倍以上の細胞であり、又は、相対定量値若しくは相対発現量が低い細胞としては、その相対定量値若しくは相対発現量が対照値の1/2倍以下の細胞である、請求項3に記載の方法。
- 第1工程の前に、組換えタンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入し、形質転換する工程を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1~5のいずれか1項に記載の方法により細胞を選抜する工程を含む、組換えタンパク質を生産する細胞を取得する方法。
- 請求項1~6のいずれか1項に記載の方法により選抜または取得された細胞または細胞を用いて組換えタンパク質を生産する方法。
- 前記細胞が哺乳類動物細胞由来の細胞である、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組換えタンパク質が抗体である請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- Plet1遺伝子又はそのオーソログな遺伝子から選ばれる少なくとも1の遺伝子を指標とすることにより、組換えタンパク質の還元を抑制し得る細胞の取得確率を上げる方法。
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