JP7011145B2 - Modified polynucleotide synthesis method with immobilized polymerase - Google Patents
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Description
本発明は、修飾ポリヌクレオチド合成技術に関する。 The present invention relates to a modified polynucleotide synthesis technique.
近年、疾患に関わる核酸分子が次々に明らかになり、それらを標的とした核酸医薬品の開発が精力的に進められている。核酸医薬品のほとんどは開発中のものも含め、生体内安定性を保持するために化学修飾が施されている。これらの化学修飾核酸は多くの場合、オリゴヌクレオチド固相法によって化学的に合成される。しかし、固相法では、高い純度、収率を達成するために、極めて高度な合成技術を要する。一方、特許文献１にはDNAポリ
メラーゼが電極上の固定支持体に固定化されたバイオセンサが示されている。
In recent years, nucleic acid molecules involved in diseases have been clarified one after another, and the development of nucleic acid drugs targeting them has been energetically promoted. Most nucleic acid drugs, including those under development, have been chemically modified to maintain in vivo stability. These chemically modified nucleic acids are often chemically synthesized by the oligonucleotide solid phase method. However, the solid-phase method requires extremely advanced synthesis techniques in order to achieve high purity and yield. On the other hand,
本発明は、高純度・高収率で修飾核酸を含むポリヌクレオチドを合成するための技術を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a technique for synthesizing a polynucleotide containing a modified nucleic acid with high purity and high yield.
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、鋳型ポリヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチド、修飾核酸を含む核酸基質および核酸ポリメラーゼを含む反応液を用いて核酸増幅反応を行う、修飾核酸を含むポリヌクレチドの合成方法において、核酸ポリメラーゼをタグ付きで発現させ、タグを介して担体に固定化して反応を行うことで、高純度かつ高収率で修飾核酸を含むポリヌクレチドを得ることができることを見出して、本発明を完成させるに至った。 The present inventor has made diligent studies to solve the above problems. As a result, a nucleic acid polymerase is expressed with a tag in a method for synthesizing a polynucleotide containing a modified nucleic acid, in which a nucleic acid amplification reaction is carried out using a nucleic acid substrate containing a template polynucleotide, a primer oligonucleotide, a modified nucleic acid and a reaction solution containing the nucleic acid polymerase. The present invention has been completed by discovering that polynucleotide containing a modified nucleic acid can be obtained with high purity and high yield by immobilizing the nucleic acid on a carrier via a tag and carrying out the reaction.
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］鋳型ポリヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチド、修飾核酸を含む核酸基質および核酸ポリメラーゼを含む反応液を用いて核酸増幅反応を行う、修飾核酸を含むポリヌクレチドの合成方法であって、前記核酸ポリメラーゼがタグ配列を有し、タグ配列を介して担体に固定化されていることを特徴とする方法。
［２］タグがビオチンアクセプター配列であり、前記核酸ポリメラーゼはビオチンリガーゼを発現する宿主において産生されたものである、［１］に記載の方法。
［３］修飾核酸がホスホロチオエートまたは下記のＫＳ９である、［１］または［２］に記載の方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method for synthesizing a polynucleotide containing a modified nucleic acid, wherein a nucleic acid amplification reaction is carried out using a reaction solution containing a template polynucleotide, a primer oligonucleotide, a nucleic acid substrate containing a modified nucleic acid, and a nucleic acid polymerase, wherein the nucleic acid polymerase is a tag. A method characterized by having a sequence and being immobilized on a carrier via a tag sequence.
[2] The method according to [1], wherein the tag is a biotin acceptor sequence, and the nucleic acid polymerase is produced in a host expressing biotin ligase.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the modified nucleic acid is phosphorothioate or KS9 below.
本発明によれば、固定化核酸ポリメラーゼを用いることで、反応触媒である酵素と、生成物である修飾ポリヌクレオチドの分離を容易にし、さらに、固定化ポリメラーゼは繰り返し反応に用いることができる。化学合成とは異なり、純度、収率ともに向上させた修飾ポリヌクレオチド製造システムが構築できると期待される。 According to the present invention, the use of an immobilized nucleic acid polymerase facilitates the separation of the enzyme as a reaction catalyst and the modified polynucleotide as a product, and the immobilized polymerase can be used for repeated reactions. Unlike chemical synthesis, it is expected that a modified polynucleotide production system with improved purity and yield can be constructed.
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明の方法は、鋳型ポリヌクレオチド、プライマーオリゴヌクレオチド、修飾核酸を含む核酸基質および核酸ポリメラーゼを含む反応液を用いて核酸増幅反応を行う、修飾核酸を含むポリヌクレチドの合成方法であって、前記核酸ポリメラーゼがタグ配列を有し、タグ配列を介して担体に固定化されていることを特徴とする方法である。
The present invention will be described in detail below.
The method of the present invention is a method for synthesizing a polynucleotide containing a modified nucleic acid, wherein a nucleic acid amplification reaction is carried out using a reaction solution containing a template polynucleotide, a primer oligonucleotide, a nucleic acid substrate containing a modified nucleic acid and a nucleic acid polymerase. The method is characterized in that the polymerase has a tag sequence and is immobilized on the carrier via the tag sequence.
核酸ポリメラーゼとしては、DNAポリメラーゼやRNAポリメラーゼが挙げられるが、DNA
ポリメラーゼが好ましい。また、PCR反応により増幅を行う場合は耐熱性DNAポリメラーゼが好ましい。より具体的には、Taq DNA ポリメラーゼ(Thermo Fisher Scientific)、Tth DNA ポリメラーゼ(東洋紡)、Vent(exo-) DNA ポリメラーゼ（New England Biolabs）、KOD Dash DNA ポリメラーゼ（東洋紡）などを用いることができる。DNAポリメラーゼはエキソヌクレアーゼ活性を欠失させた変異体が好ましい。
Examples of the nucleic acid polymerase include DNA polymerase and RNA polymerase, but DNA
Polymerases are preferred. Further, when amplification is performed by PCR reaction, thermostable DNA polymerase is preferable. More specifically, Taq DNA polymerase (Thermo Fisher Scientific), Tth DNA polymerase (Toyobo), Vent (exo-) DNA polymerase (New England Biolabs), KOD Dash DNA polymerase (Toyobo) and the like can be used. The DNA polymerase is preferably a mutant lacking exonuclease activity.
核酸ポリメラーゼはタグ付きの融合タンパク質として発現させ、このタグを介してタグ親和性部分を有するアフィニティ担体に結合させることで、核酸ポリメラーゼを担体に固定化することができる。
また、1μLあたりの核酸ポリメラーゼの固定化量は0.65～8.8pmolが好ましい。
The nucleic acid polymerase can be immobilized on the carrier by expressing it as a tagged fusion protein and binding it to an affinity carrier having a tag-affinity moiety via this tag.
The amount of nucleic acid polymerase immobilized per 1 μL is preferably 0.65 to 8.8 pmol.
タグとしては、Hisタグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（GST）タグ、マルトース結合タンパク質（MBP）タグ、Ｓタグ、プロテインＡなどが挙げられ、これに対応する
タグ親和性部分を有するアフィニティ担体としては、コバルト担体、ニッケル担体等の金属キレート担体、グルタチオン結合担体、マルトース結合担体、S-protein結合担体、抗
体結合担体等が挙げられる。
また、タグとしてHAタグ、FLAGタグ、Mycタグ、GFPタグなどを使用し、アフィニティ担体として、抗HA抗体結合担体、抗FLAG抗体結合担体、抗Mycタグ抗体結合担体、抗GFP抗体結合担体等の抗体結合担体を使用してポリメラーゼを担体に固定化することもできる。
Examples of the tag include His tag, glutathione S-transferase (GST) tag, maltose-binding protein (MBP) tag, S tag, protein A, and the like, and cobalt as an affinity carrier having a tag affinity moiety corresponding thereto. Examples thereof include a carrier, a metal chelate carrier such as a nickel carrier, a glutathione-binding carrier, a maltose-binding carrier, an S-protein-binding carrier, and an antibody-binding carrier.
Further, HA tags, FLAG tags, Myc tags, GFP tags and the like are used as tags, and anti-HA antibody binding carriers, anti-FLAG antibody binding carriers, anti-Myc tag antibody binding carriers, anti-GFP antibody binding carriers and the like are used as affinity carriers. An antibody-binding carrier can also be used to immobilize the polymerase on the carrier.
また、好ましい態様としては、核酸ポリメラーゼはAviTag（配列番号７）などのビオチンアクセプター配列が付加され、Lucigen社 Expresso ビオチン化タンパク質発現システ
ムのようなビオチンリガーゼを発現する宿主細胞で発現と同時にビオチンがAviTagに結合
した状態で発現され、（ストレプト）アビジン結合担体に固定化される態様が挙げられる。
In a preferred embodiment, the nucleic acid polymerase is added with a biotin acceptor sequence such as AviTag (SEQ ID NO: 7), and biotin is simultaneously expressed in a host cell expressing biotin ligase such as Lucigen's Expresso biotinylated protein expression system. Examples thereof include an embodiment expressed in a state of being bound to AviTag and immobilized on a (streptavidin) avidin-binding carrier.
アフィニティ担体を構成する担体の種類は、核酸ポリメラーゼを固定化でき、修飾核酸を含むポリヌクレオチドの合成反応が阻害されない担体であれば特に制限されないが、具体的には、アガロース、セルロース、セファロースや、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリアクリレート、テフロン、ポリアセタール等が挙げられる。担体の形状も特に制限されないが、例えば、ビーズ、マイクロプレート等が好ましく使用される。また、担体は磁石などで回収可能とするために磁性体を含むことが好ましい。担体にタグ親和性部分（アフィニティ基）を固定化する方法は公知の方法を採用できる。 The type of carrier constituting the affinity carrier is not particularly limited as long as it is a carrier capable of immobilizing a nucleic acid polymerase and does not inhibit the synthesis reaction of a polynucleotide containing a modified nucleic acid, but specifically, agarose, cellulose, sepharose, and the like. Examples thereof include polystyrene, polyethylene, polyacrylate, teflon, polyacetal and the like. The shape of the carrier is also not particularly limited, but for example, beads, microplates and the like are preferably used. Further, the carrier preferably contains a magnetic material so that it can be recovered by a magnet or the like. As a method for immobilizing a tag affinity moiety (affinity group) on a carrier, a known method can be adopted.
修飾核酸としては、リン酸結合部位を修飾した核酸（例えば、トリエステル型、ホスホロチオエート型、ホスホロジチオエート型、ホスホロジアミデート型、メチルホスホネート型、メチルホスホノチオエート型の核酸など）、糖部を修飾した核酸（例えば、α－アノマー型、β－アノマー型、ポリアミド核酸(PNA)など）、機能をもった分子と複合化し
た核酸（例えば、色素（アクリジン誘導体など）などのインターカレーターを導入した核酸、光架橋性化合物（ソラレン誘導体など）を導入した核酸など）、その他修飾核酸（LNA、BNAなど）などを例示することができる。
The modified nucleic acid includes a nucleic acid having a modified phosphate binding site (for example, a triester type, a phosphorothioate type, a phosphorodithioate type, a phosphorodiamidate type, a methylphosphonate type, a methylphosphonothioate type nucleic acid, etc.), and a sugar. Intercalators such as part-modified nucleic acids (eg, α-anomer type, β-anomer type, polyamide nucleic acid (PNA), etc.), nucleic acids complexed with functional molecules (eg, dyes (acridin derivatives, etc.)) Examples thereof include introduced nucleic acids, nucleic acids into which photocrosslinkable compounds (solarene derivatives, etc.) have been introduced), and other modified nucleic acids (LNA, BNA, etc.).
修飾核酸としては、また、WO2013/162026に開示された修飾核酸や、下記の修飾核酸を
使用することもできる。
As the modified nucleic acid, the modified nucleic acid disclosed in WO2013 / 162026 or the following modified nucleic acid can also be used.
既知のデオキシウリジン誘導体としては、以下のようなものが挙げられる。
また、特開2013-40118号公報に開示された以下のデオキシアデノシン誘導体ＫＳ９でもよい。
既知のデオキシアデノシン誘導体としては、以下のようなものが挙げられる。
また、特開2005-060240号公報に開示された以下のＮ６位置換デオキシアデノシン誘導
体でもよい。
また、特開2007-056001号公報に開示された以下の7位置換デアザデオキシアデノシン
でもよい。
デオキシシチジン誘導体としては、特開2005-060240号公報に開示された式xiiのＣ５位置換デオキシシチジン誘導体が挙げられる。
また、特開2004-238353号公報に開示された式xiiiのＣ５位置換デオキシシチジン誘導
体でもよい。
さらに、特開2004-238353号公報に開示された式xivのＣ５位置換デオキシシチジン誘導体でもよい。
デオキシグアノシン誘導体としては、特開2007-056001号公報に開示された7位置換デアザデオキシグアノシンが挙げられる。
上記のような修飾核酸を１種類以上用い、必要に応じて通常の核酸増幅に用いられる天然型dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)の一種以上を混合して用い、核酸ポリメラーゼによる核酸増幅反応を行う。
なお、本発明の核酸誘導体を用いて合成されるポリヌクレオチドは一本鎖でも二本鎖でもよい。
Nucleic acid amplification reaction by nucleic acid polymerase using one or more of the above modified nucleic acids and, if necessary, one or more of natural dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) used for normal nucleic acid amplification. I do.
The polynucleotide synthesized using the nucleic acid derivative of the present invention may be single-stranded or double-stranded.
DNAポリメラーゼなどを用いた核酸合成は、一般的な核酸増幅法にしたがって行うこと
ができる。具体的には、修飾核酸を含む核酸基質、鋳型ポリヌクレオチド及びプライマーオリゴヌクレオチドを含む反応液に担体に固定化された核酸ポリメラーゼを加え、反応プログラムに応じて温度を制御することにより核酸合成を行うことができる。
鋳型DNAとしては、天然のDNA、化学合成したDNA又は天然のRNAを逆転写して形成されたcDNAなどを挙げることができ、その長さは特に制限されないが、例えば、50～200である
。
プライマーの配列も鋳型の増幅したい領域の配列によって適宜設計することができる。得られた修飾核酸は必要に応じ、担体と分離、精製される。
Nucleic acid synthesis using DNA polymerase or the like can be performed according to a general nucleic acid amplification method. Specifically, nucleic acid synthesis is performed by adding a nucleic acid polymerase immobilized on a carrier to a reaction solution containing a nucleic acid substrate containing a modified nucleic acid, a template polynucleotide and a primer oligonucleotide, and controlling the temperature according to a reaction program. be able to.
Examples of the template DNA include natural DNA, chemically synthesized DNA, cDNA formed by reverse transcription of natural RNA, and the like, and the length thereof is not particularly limited, but is, for example, 50 to 200.
The primer sequence can also be appropriately designed according to the sequence of the region to be amplified in the template. The obtained modified nucleic acid is separated and purified from the carrier, if necessary.
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Examples will be shown below, and the present invention will be described in more detail. However, the present invention is not limited to the following examples.
KOD exo(-) AviTagの発現
図１に発現させたDNAポリメラーゼの模式図を示す。
KOD exo(-) AviTagは以下のようにして発現させた。
pAviTag C-His Kan Vector DNA(Lucigen)に組み込んだKOD exo(-)遺伝子（WO 2016153053）をBiotin CellF’Chemically Component Cells（Lucigen）に混ぜ、ヒートショック法
によって導入し、LB/Km（30μｇ/ｍL）プレートにまいて３７℃で静置した。生えてきた
コロニーをLB培地/１％グルコース/Km（30μｇ/ｍL）にうえて３７℃で振とうした。OD６００ 0.4～0.6に到達した時点で20% L-ラムノース,50mM ビオチンを1/100 vol添加し、10%-アラビノースを1/1000 vol添加し、培養温度を30℃に変更して発現誘導を行った。誘
導物質を添加して6時間後に培養液を遠心して上清を除去し、大腸菌を回収した。大腸菌
は－80℃で保存して、精製の際に融解した。
Expression of KOD exo (-) AviTag Figure 1 shows a schematic diagram of the DNA polymerase expressed.
KOD exo (-) AviTag was expressed as follows.
The KOD exo (-) gene (WO 2016153053) incorporated into pAviTag C-His Kan Vector DNA (Lucigen) was mixed with Biotin CellF'Chemically Component Cells (Lucigen), introduced by the heat shock method, and LB / Km (30 μg / mL). ) It was sprinkled on a plate and allowed to stand at 37 ° C. The growing colonies were placed on LB medium / 1% glucose / Km (30 μg / mL) and shaken at 37 ° C. When OD 600 0.4 to 0.6 was reached, 20% L-rhamnose, 50 mM biotin was added in 1/100 vol, 10% -arabinose was added in 1/1000 vol, and the culture temperature was changed to 30 ° C to induce expression. went. Six hours after the addition of the inducer, the culture broth was centrifuged to remove the supernatant, and E. coli was recovered. E. coli was stored at -80 ° C and thawed during purification.
KOD exo(-) AviTagの発現後の精製
発現誘導8時間の培養液を、遠心(3000g, 15分間)を行い、上清(培地)と沈殿物(菌体)に分けた。沈殿物は緩衝液(10mM リン酸ナトリウム, 100mM NaCl, 1mM ジチオトレイトール, 10%グリセロール)に懸濁し、超音波によって菌体を破砕した。破砕溶液は、遠心(8000g, 5分間)して沈殿物と上清に分けた。上清を0.45μm PVDFメンブレンフィルター(Millipore)に通すことで、微粒子を除去した。得られた溶液は、Hitrap Heparin HP Columns (5mL)(GE health care)を用いて、AKTA (GE health care)で精製した。カラムに吸着したKOD exo(-) AviTagについて、緩衝液(10mM リン酸ナトリウム, 100mM NaCl, 1mM ジチオトレイトール, 10%グリセロール)のNaCl濃度を100mM→2Mへ徐々に上げることで、溶出画分にKOD
exo(-) AviTagのピークを得た。溶出画分は、Amicom Ultra4 (30K) (Millipore)を用い
た限外ろ過によって濃縮後、緩衝液の置換を行い、最終的に保存緩衝液(50mM Tris-HCl, 50mM KCl, 50%グリセロール, 0.1% Tween#20, 0.1% Nonidet p40, pH 8.0)に溶解させて-20℃で保存した。KOD exo(-) AviTagの濃度は、ブラッドフォード法によって決定し保存
緩衝液で目的の濃度に希釈して反応に用いた。
Purification after the expression of KOD exo (-) AviTag The culture medium for 8 hours for induction of expression was centrifuged (3000 g, 15 minutes) and separated into a supernatant (medium) and a precipitate (bacteria). The precipitate was suspended in buffer (10 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 10% glycerol) and the cells were disrupted by ultrasonic waves. The crushed solution was centrifuged (8000 g, 5 minutes) to separate the precipitate and the supernatant. Fine particles were removed by passing the supernatant through a 0.45 μm PVDF membrane filter (Millipore). The resulting solution was purified by AKTA (GE health care) using Hitrap Heparin HP Columns (5 mL) (GE health care). For KOD exo (-) AviTag adsorbed on the column, the NaCl concentration of the buffer solution (10 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 10% glycerol) was gradually increased from 100 mM to 2 M to obtain an elution fraction. KOD
The peak of exo (-) AviTag was obtained. The elution fraction is concentrated by ultrafiltration using Amicom Ultra4 (30K) (Millipore), replaced with a buffer solution, and finally a storage buffer solution (50 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 50% glycerol, 0.1). It was dissolved in% Tween # 20, 0.1% Nonidet p40, pH 8.0) and stored at -20 ° C. The concentration of KOD exo (-) AviTag was determined by the Bradford method, diluted with a storage buffer to the desired concentration, and used in the reaction.
KOD exo(-) AviTagの精製後のSDS-PAGE
発現誘導した大腸菌のSDS-PAGE
発現誘導8時間の培養液をサンプリングし、遠心(3000g, 15分間)を行い、上清(培地)と沈殿物(菌体)に分けた。沈殿物は緩衝液(10mM リン酸ナトリウム, 100mM NaCl, 1mM ジチオトレイトール, 10%グリセロール)に懸濁し、超音波によって菌体を破砕した。遠心によって上清と沈殿物に分けた。上清は、トリクロロ酢酸(最終10%)を加え、氷浴中で30分間イ
ンキュベートした。その後、遠心(12000g, 5分間)を行い、タンパク質の沈殿を得た。こ
のタンパク質の沈殿に緩衝液(10mM リン酸ナトリウム, 100mM NaCl, 1mM ジチオトレイトール, 10%グリセロール)とSDS サンプル緩衝液(125mM Tris-HCl, 4% SDS, 50%グリセロール, 0.02%ブロモフェノールブルー, pH 6.8)を加えて、95℃3分間加熱した。沈殿物は、SDSサンプル緩衝液(62.5mM Tris-HCl, 2% SDS, 25%グリセロール, 0.01%ブロモフェノールブルー, pH 6.8)を加えて、95℃3分間加熱した。また、分子量マーカーとしてUnsteined protein ladder Broad range (10-250 kDa)を用いた。KOD exo(-) AviTag精製過程で得られたカラムを通過したスルー画分は、SDS サンプル緩衝液(125mM Tris-HCl, 4% SDS, 50%グリセロール, 0.02%ブロモフェノールブルー, pH 6.8)を加えて、95℃3分間加熱した。
精製後のKOD exo(-) AviTagは、母液から10倍, 100倍, 1000倍希釈を行い、SDS サンプル緩衝液(125mM Tris-HCl, 4% SDS, 50%グリセロール, 0.02%ブロモフェノールブルー, pH 6.8)を加え、95℃3分間加熱した。泳動は、10%SDS-PAGEを用いて、20mA, 45分間, 室温で行った。泳動後、固定化(40%メタノール,10％酢酸)で30分間行い、染色(CBB)を1時間行った後、洗浄(40%メタノール,10％酢酸)30分間行った。
SDS-PAGE after purification of KOD exo (-) AviTag
SDS-PAGE of expression-induced E. coli
The culture medium for 8 hours of expression induction was sampled, centrifuged (3000 g, 15 minutes), and separated into a supernatant (medium) and a precipitate (bacteria). The precipitate was suspended in buffer (10 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 10% glycerol) and the cells were disrupted by ultrasonic waves. It was separated into a supernatant and a precipitate by centrifugation. The supernatant was added with trichloroacetic acid (final 10%) and incubated in an ice bath for 30 minutes. Then, centrifugation (12000 g, 5 minutes) was carried out to obtain a protein precipitate. Buffer (10 mM sodium phosphate, 100 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol, 10% glycerol) and SDS sample buffer (125 mM Tris-HCl, 4% SDS, 50% glycerol, 0.02% bromophenol blue,) to precipitate this protein. pH 6.8) was added, and the mixture was heated at 95 ° C. for 3 minutes. The precipitate was added with SDS sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, 2% SDS, 25% glycerol, 0.01% bromophenol blue, pH 6.8) and heated at 95 ° C. for 3 minutes. An Unsteined protein ladder Broad range (10-250 kDa) was used as a molecular weight marker. The through fractions passed through the column obtained during the KOD exo (-) AviTag purification process were added with SDS sample buffer (125 mM Tris-HCl, 4% SDS, 50% glycerol, 0.02% bromophenol blue, pH 6.8). Then, it was heated at 95 ° C. for 3 minutes.
After purification, KOD exo (-) AviTag is diluted 10-fold, 100-fold, and 1000-fold from the mother liquor, and SDS sample buffer (125 mM Tris-HCl, 4% SDS, 50% glycerol, 0.02% bromophenol blue, pH). 6.8) was added, and the mixture was heated at 95 ° C. for 3 minutes. The electrophoresis was performed using 10% SDS-PAGE at 20 mA, 45 minutes, at room temperature. After migration, immobilization (40% methanol, 10% acetic acid) was performed for 30 minutes, staining (CBB) was performed for 1 hour, and then washing (40% methanol, 10% acetic acid) was performed for 30 minutes.
結果
図２のレーン5-7は、精製後のポリメラーゼ(KOD exo(-) AviTag)であるが、レーン2(上清)やレーン3(沈殿物)のバンドと見比べると、シングルバンドとなっており、精製されていることが分かる。
Results Lanes 5-7 in Fig. 2 are polymerases (KOD exo (-) AviTag) after purification, but they are single bands when compared with the bands of lane 2 (supernatant) and lane 3 (precipitate). It can be seen that it is purified.
ポリメラーゼの固定化
Streptavidin beadsへのKOD exo(-) AviTagの結合
Streptavidin beadsへのKOD exo(-) AviTagの結合の概要を図３に示した。
Polymerase immobilization
Binding of KOD exo (-) AviTag to Streptavidin beads
The outline of the binding of KOD exo (-) AviTag to Streptavidin beads is shown in FIG.
[1] 10 μLのStreptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、保存液を除き、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄した。その後、ビーズの結合容量に対して過剰なKOD exo(-) AviTag (1000 μg/μL 6 μL)を加え、1×KOD Dash 添付緩衝液84 μL加えた。30分間、室温で転倒混和を行った。その後、Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、上清を除き、1×Tris緩衝液で洗浄を2回行い、1×KOD Dash 添付緩衝液で置換を2回
行った。置換後は、保存緩衝液に入れて-20℃で反応に使用するまで保存した。反応に使
用する際は、1×KOD Dash 添付緩衝液で置換を2回行い、反応に用いた。なお、このStreptavidin Mag Sepharoseの作り方を基準として、KOD exo(-) AviTagの濃度を薄くし、結合量を変えたものを作製した。
[1] After collecting 10 μL of Streptavidin Mag Sepharose close to the magnet, the preservative solution was removed, and the cells were washed 3 times with 1 × KOD Dash attached buffer solution. Then, KOD exo (-) AviTag (1000 μg /
[2] 10 μLのStreptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、保存液を除き、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄した。その後、KOD exo(-) AviTag (100 μg/μL 3 μL)を加え、1×KOD Dash 添付緩衝液42 μL加えた。30分間、室温で転倒混和を行った。その後、Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、上清を除き、1×Tris緩衝液で
洗浄を2回行い、1×KOD Dash 添付緩衝液で置換を2回行った。置換後は、保存緩衝液に入れて-20℃で反応に使用するまで保存した。反応に使用する際は、1×KOD Dash 添付緩衝
液で置換を2回行い、反応に用いた。
[2] After collecting 10 μL of Streptavidin Mag Sepharose close to the magnet, the preservative solution was removed, and the cells were washed 3 times with 1 × KOD Dash attached buffer solution. Then, KOD exo (-) AviTag (100 μg /
[3] 10 μLのStreptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、保存液を除き、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄した。その後、KOD exo(-) AviTag (10 μg/μL 3 μL)を
加え、1×KOD Dash 添付緩衝液42 μL加えた。30分間、室温で転倒混和を行った。その後、Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、上清を除き、1×Tris緩衝液で
洗浄を2回行い、1×KOD Dash 添付緩衝液で置換を2回行った。置換後は、保存緩衝液に入れて-20℃で反応に使用するまで保存した。反応に使用する際は、1×KOD Dash 添付緩衝
液で置換を2回行い、反応に用いた。
[3] After collecting 10 μL of Streptavidin Mag Sepharose close to the magnet, the preservative solution was removed, and the cells were washed 3 times with 1 × KOD Dash attached buffer solution. Then, KOD exo (-) AviTag (10 μg /
[4] 作製したKOD exo(-) AviTagとStreptavidin Mag Sepharoseが、ビオチン-ストレプトアビジン相互作用に結合していることを検証するために、KOD exo(-)を用いてStreptavidin Mag Sepharoseに相互作用させた。10 μLのStreptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、保存液を除き、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄した。その後、KOD exo(-) (1000 μg/μL 3 μL)を加え、1×KOD Dash 添付緩衝液42 μL加えた。30分間、室温で転倒混和を行った。その後、Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、上清を除き、1×Tris緩衝液で洗浄を2回行い、1×KOD Dash 添付緩衝液で置換を2回行った。
置換後は、保存緩衝液に入れて-20℃で反応に使用するまで保存した。反応に使用する際
は、1×KOD Dash 添付緩衝液で置換を2回行い、反応に用いた。
[4] In order to verify that the prepared KOD exo (-) AviTag and Streptavidin Mag Sepharose are bound to the biotin-streptavidin interaction, KOD exo (-) was used to interact with Streptavidin Mag Sepharose. rice field. After collecting 10 μL of Streptavidin Mag Sepharose close to the magnet, the preservative solution was removed, and the cells were washed 3 times with 1 × KOD Dash attached buffer solution. Then, KOD exo (-) (1000 μg /
After the replacement, it was placed in a storage buffer and stored at -20 ° C until it was used for the reaction. When used in the reaction, it was replaced twice with 1 × KOD Dash attached buffer and used in the reaction.
固定化ポリメラーゼによるPCR
ビーズを用いたPCRの概要を図４に示す。
PCR with immobilized polymerase
The outline of PCR using beads is shown in FIG.
実施例１．KOD exo(-) AviTag 固定化ビーズを用いた修飾核酸KS9を含むポリヌクレオチ
ドの合成
・1回目の反応溶液の調製
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag [1])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([1]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Example 1. Synthesis of polynucleotide containing modified nucleic acid KS9 using KOD exo (-) AviTag immobilized beads
・ Preparation of the first reaction solution
Reaction [1] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [1])
1
リアクション[2](酵素: KOD exo(-) AviTag [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM TTP 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [2] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [2])
1
リアクション[3](酵素: KOD exo(-) AviTag [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [3] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [2])
1
・反応
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
·reaction
A TC-312 thermal cycler (Techne, Staffordshire, UK) was used.
Preheating was performed at 94 ° C for 1 minute, and the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds was repeated 16 times. After the cycle, it was carried out at 74 ° C for 5 minutes and cooled to 4 ° C.
・beadsの洗浄
リアクション[1]～[3]は、Streptavidin Mag Sepharoseを用いているため、PCR反応液か
ら回収した。Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
-Beads wash reactions [1] to [3] were recovered from the PCR reaction solution because Streptavidin Mag Sepharose was used. Streptavidin Mag Sepharose was collected close to the magnet, washed 3 times with 1 × KOD Dash attached buffer, and used for the next reaction.
・2回目の反応溶液の調製
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag [1])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([1]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
・ Preparation of the second reaction solution Reaction [1] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [1])
1
リアクション[2](酵素: KOD exo(-) AviTag [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM TTP 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [2] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [2])
1
リアクション[3](酵素: KOD exo(-) AviTag [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [3] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [2])
1
・2回目の反応条件
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
・ Second reaction conditions
A TC-312 thermal cycler (Techne, Staffordshire, UK) was used.
Preheating was performed at 94 ° C for 1 minute, and the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds was repeated 16 times. After the cycle, it was carried out at 74 ° C for 5 minutes and cooled to 4 ° C.
・beadsの洗浄
リアクション[1]～[3]は、Streptavidin Mag Sepharoseを用いているため、PCR反応液か
ら回収した。Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
-Beads wash reactions [1] to [3] were recovered from the PCR reaction solution because Streptavidin Mag Sepharose was used. Streptavidin Mag Sepharose was collected close to the magnet, washed 3 times with 1 × KOD Dash attached buffer, and used for the next reaction.
・3回目の反応溶液の調製
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag [1])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([1]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
・ Preparation of the third reaction solution Reaction [1] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [1])
1
リアクション[2](酵素: KOD exo(-) AviTag [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×添付緩衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [2] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [2])
1
リアクション[3](酵素: KOD exo(-) AviTag [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×添付緩衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [3] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [2])
1
・3回目の反応条件
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
・ Third reaction condition
A TC-312 thermal cycler (Techne, Staffordshire, UK) was used.
Preheating was performed at 94 ° C for 1 minute, and the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds was repeated 16 times. After the cycle, it was carried out at 74 ° C for 5 minutes and cooled to 4 ° C.
・PAGEによる確認
PCR反応液を回収し、ウレア色素(7M Urea, 3mM EDTA, 0.1% BPB)を28 μL加え、95℃, 5
分間変性させた。ウェルには、各サンプル2 μLをロードし、泳動を行った。泳動は、200V, 100mA, 35分, 45℃で行った。バンドの確認は、外部レーザー(488nm)を照射して、確
認した。
・ Confirmation by PAGE
Collect the PCR reaction solution, add 28 μL of urea dye (7M Urea, 3 mM EDTA, 0.1% BPB), and add at 95 ° C, 5
Denatured for minutes. 2 μL of each sample was loaded into the wells and electrophoresed. The electrophoresis was performed at 200 V, 100 mA, 35 minutes, and 45 ° C. The band was confirmed by irradiating an external laser (488 nm).
用いた試薬
KOD exo(-) AviTag
KOD exo(-) AviTag beads
dNTPs (Roche Diagnostics K. K., 日本)
KS9（特開2013-40108号公報）
Reagents used
KOD exo (-) AviTag
KOD exo (-) AviTag beads
dNTPs (Roche Diagnostics KK, Japan)
KS9 (Japanese Patent Laid-Open No. 2013-40108)
用いた配列
DNAテンプレート(70 mer)
5′-/6-FAM/TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA-(30 random bases)-TGG TCC GTG AGC CTG ACA CC-3′（配列番号１）
DNAプライマー[1] (20 mer)
5′-/6-FAM/TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA-3′（配列番号２）
DNAプライマー[2] (20 mer)
5′-GGT GTC AGG CTC ACG ACG GAC CA-3′（配列番号３）
Sequence used
DNA template (70 mer)
5'- / 6-FAM / TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA- (30 random bases)-TGG TCC GTG AGC CTG ACA CC-3'(SEQ ID NO: 1)
DNA Primer [1] (20 mer)
5'- / 6-FAM / TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA-3'(SEQ ID NO: 2)
DNA Primer [2] (20 mer)
5'-GGT GTC AGG CTC ACG ACG GAC CA-3'(SEQ ID NO: 3)
結果
図５では、KOD exo(-) AviTag beadsにおける3回目までの天然型とKS9を用いたPCRの結果
を示した。ビーズへのポリメラーゼの結合量を変えたところ、最も濃いポリメラーゼで処理したビーズ([1])でKS9を用いたPCR反応の結果(レーン2-4)は、1回目では、目的のバン
ドが見られるが、2回目以降では、目的の位置のバンドが薄くなる。3回目では、見られなくなった。最も濃いポリメラーゼ濃度に対して1/20に希釈したポリメラーゼ濃度で処理したビーズ([2])による天然型を用いたPCRの結果(レーン5-7)は、1～3回目共に、反応が進
んでいた。さらに、1/20に希釈したポリメラーゼ濃度で処理したビーズ([2])によるKS9を用いたPCRの結果(レーン8-10)も、1～3回目共に、反応が進んでいた。
Results Figure 5 shows the results of PCR using KOD exo (-) AviTag beads up to the third natural type and KS9. When the amount of polymerase bound to the beads was changed, the results of the PCR reaction using KS9 (lanes 2-4) on the beads treated with the darkest polymerase ([1]) showed the target band in the first time. However, after the second time, the band at the target position becomes thinner. In the third time, it disappeared. The results of PCR using the natural form (lanes 5-7) with beads ([2]) treated with the polymerase concentration diluted to 1/20 of the highest polymerase concentration showed that the reaction proceeded in both the 1st to 3rd times. It was. Furthermore, the results of PCR using KS9 (lanes 8-10) with beads ([2]) treated with the polymerase concentration diluted to 1/20 also showed that the reaction proceeded in both the 1st to 3rd times.
実施例２．KOD exo(-) AviTag 固定化ビーズとKOD exo(-)ビーズを用いた修飾核酸KS9を
含むポリヌクレオチドの合成
・1回目の反応溶液の調製
ネガティブコントロール（比較例：KOD exo(-)をタグを使用せずにNHSビーズに固定化）
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) beads ([4]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Example 2. Synthesis of polynucleotides containing modified nucleic acid KS9 using KOD exo (-) AviTag immobilized beads and KOD exo (-) beads
・ Preparation of the first reaction solution
Negative control (Comparative example: KOD exo (-) is immobilized on NHS beads without using tags)
1
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [1] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [2])
1
・反応
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
·reaction
A TC-312 thermal cycler (Techne, Staffordshire, UK) was used.
Preheating was performed at 94 ° C for 1 minute, and the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds was repeated 16 times. After the cycle, it was carried out at 74 ° C for 5 minutes and cooled to 4 ° C.
・beadsの洗浄
ネガティブコントロールとリアクション[1]は、Streptavidin Mag Sepharoseを用いてい
るため、PCR反応液から回収した。Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後
、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
-Beads wash Negative control and reaction [1] were recovered from the PCR reaction solution because Streptavidin Mag Sepharose was used. Streptavidin Mag Sepharose was collected close to the magnet, washed 3 times with 1 × KOD Dash attached buffer, and used for the next reaction.
・2回目の反応溶液の調製
ネガティブコントロール
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) beads ([4]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
・ Preparation of the second reaction solution
Negative control
1
リアクション[2](酵素: KOD exo(-) AviTag [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [2] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [2])
1
・反応
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
·reaction
A TC-312 thermal cycler (Techne, Staffordshire, UK) was used.
Preheating was performed at 94 ° C for 1 minute, and the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds was repeated 16 times. After the cycle, it was carried out at 74 ° C for 5 minutes and cooled to 4 ° C.
・beadsの洗浄
ネガティブコントロールとリアクション[2]は、Streptavidin Mag Sepharoseを用いてい
るため、PCR反応液から回収した。Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後
、1×KOD Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
-Beads wash Negative control and reaction [2] were recovered from the PCR reaction solution because Streptavidin Mag Sepharose was used. Streptavidin Mag Sepharose was collected close to the magnet, washed 3 times with 1 × KOD Dash attached buffer, and used for the next reaction.
・3回目の反応溶液の調製
ネガティブコントロール
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) beads ([4]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
・ Preparation of the third reaction solution Negative control
1
リアクション[3](酵素: KOD exo(-) AviTag [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, dCTP, dATP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mM KS9 2 μL (最終
濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads ([2]) 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [3] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag [2])
1
・3回目の反応条件
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを16回くり返した。サイクル後、74℃, 5分間行い、4℃に冷却した。
・ Third reaction condition
A TC-312 thermal cycler (Techne, Staffordshire, UK) was used.
Preheating was performed at 94 ° C for 1 minute, and the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds was repeated 16 times. After the cycle, it was carried out at 74 ° C for 5 minutes and cooled to 4 ° C.
・PAGEによる確認
PCR反応液を回収し、ウレア色素(7M Urea, 3mM EDTA, 0.1% BPB)を28 μL加え、95℃, 5
分間変性させた。ウェルには、各サンプル2 μLをロードし、泳動を行った。泳動は、200V, 100mA, 35分, 45℃で行った。バンドの確認は、外部レーザー(488nm)を照射して、確
認した。
・ Confirmation by PAGE
Collect the PCR reaction solution, add 28 μL of urea dye (7M Urea, 3 mM EDTA, 0.1% BPB), and add at 95 ° C, 5
Denatured for minutes. 2 μL of each sample was loaded into the wells and electrophoresed. The electrophoresis was performed at 200 V, 100 mA, 35 minutes, and 45 ° C. The band was confirmed by irradiating an external laser (488 nm).
用いた試薬
KOD exo(-) AviTag beads
KOD exo(-) beads
dNTPs (Roche Diagnostics K. K., 日本)
KS9（特開2013-40108号公報）
Reagents used
KOD exo (-) AviTag beads
KOD exo (-) beads
dNTPs (Roche Diagnostics KK, Japan)
KS9 (Japanese Patent Laid-Open No. 2013-40108)
用いた配列
DNAテンプレート(70 mer)
5′-/6-FAM/TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA-(30 random bases)-TGG TCC GTG AGC CTG ACA CC-3′（配列番号１）
DNAプライマー[1] (20 mer)
5′-/6-FAM/TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA-3′（配列番号２）
DNAプライマー[2] (20 mer)
5′-GGT GTC AGG CTC ACG ACG GAC CA-3′（配列番号３）
Sequence used
DNA template (70 mer)
5'- / 6-FAM / TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA- (30 random bases)-TGG TCC GTG AGC CTG ACA CC-3'(SEQ ID NO: 1)
DNA Primer [1] (20 mer)
5'- / 6-FAM / TCG CCT TGC CGG ATC GCA GA-3'(SEQ ID NO: 2)
DNA Primer [2] (20 mer)
5'-GGT GTC AGG CTC ACG ACG GAC CA-3'(SEQ ID NO: 3)
結果
図６では、KOD exo(-) AviTag beadsとKOD exo(-) beadsにおける3回目までのKS9を用い
たPCRの結果を示した。KOD exo(-)のAviTagが無い場合のビーズ([4])を用いた反応は、反応が進行しなかった(レーン2-4)。1/20に希釈したポリメラーゼ濃度で処理したビーズ([2])によるKS9を用いたPCRの結果(レーン8-10)は、1～3回目共に、反応が進んでいた。これ
らの結果からタグ配列を介して担体に固定化された核酸ポリメラーゼを使用することで修飾核酸を含むポリヌクレオチドが効率よく増幅できることが分かった。
Results Figure 6 shows the results of PCR using KS9 up to the third time on KOD exo (-) AviTag beads and KOD exo (-) beads. The reaction using beads ([4]) in the absence of AviTag of KOD exo (-) did not proceed (lanes 2-4). The results of PCR using KS9 (lanes 8-10) with beads ([2]) treated with the polymerase concentration diluted to 1/20 showed that the reaction proceeded in both the 1st to 3rd times. From these results, it was found that the polynucleotide containing the modified nucleic acid can be efficiently amplified by using the nucleic acid polymerase immobilized on the carrier via the tag sequence.
実施例３．KOD exo(-) AviTag 固定化ビーズを用いた修飾核酸ホスホロチオエートを含むポリヌクレオチドの合成
・1回目の反応溶液の調製
ネガティブコントロール
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 水10 μLを混合した(計20 μL)。
Example 3. Synthesis of polynucleotides containing modified nucleic acid phosphorothioates using KOD exo (-) AviTag immobilized beads
・ Preparation of the first reaction solution
Negative control
1
ポジティブコントロール(酵素: KOD exo(-) AviTag beads [1])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATP, dCTP 2 μL (最終濃度0.2 mM),KOD exo(-) AviTag beads [1] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Positive control (enzyme: KOD exo (-) AviTag beads [1])
1
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag beads [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [1] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag beads [2])
1
(Final concentration 0.2 mM), KOD exo (-) AviTag beads [2] 2 μL, 6 μL of water were mixed (20 μL in total).
リアクション[2](酵素: KOD exo(-) AviTag beads [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [2] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag beads [2])
1
(Final concentration 0.2 mM), KOD exo (-) AviTag beads [2] 2 μL, 6 μL of water were mixed (20 μL in total).
・反応
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを20, 30回くり返した。リアクション[1]は20サイクル, リアクション[2]は30サイクル
·reaction
A TC-312 thermal cycler (Techne, Staffordshire, UK) was used.
Preheating was performed at 94 ° C for 1 minute, and the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds was repeated 20 or 30 times. Reaction [1] has 20 cycles, Reaction [2] has 30 cycles
・beadsの洗浄
リアクション[1]～[2]は、Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、1×KOD
Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
・ The cleaning reactions [1] to [2] of beads are 1 × KOD after streptavidin Mag Sepharose is brought close to the magnet and collected.
It was washed 3 times with the buffer attached to Dash and used for the next reaction.
・2回目の反応溶液の調製
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag beads [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
・ Preparation of the second reaction solution Reaction [1] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag beads [2])
1
(Final concentration 0.2 mM), KOD exo (-) AviTag beads [2] 2 μL, 6 μL of water were mixed (20 μL in total).
リアクション[2](酵素: KOD exo(-) AviTag beads [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [2] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag beads [2])
1
(Final concentration 0.2 mM), KOD exo (-) AviTag beads [2] 2 μL, 6 μL of water were mixed (20 μL in total).
・反応
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを20, 30回くり返した。リアクション[1]は20サイクル, リアクション[2]は30サイクル
·reaction
A TC-312 thermal cycler (Techne, Staffordshire, UK) was used.
Preheating was performed at 94 ° C for 1 minute, and the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds was repeated 20 or 30 times. Reaction [1] has 20 cycles, Reaction [2] has 30 cycles
・beadsの洗浄
リアクション[1]～[2]は、Streptavidin Mag Sepharoseを磁石に近づけ集めた後、1×KOD
Dash 添付緩衝液で3回洗浄し、次の反応へ利用した。
・ The cleaning reactions [1] to [2] of beads are 1 × KOD after streptavidin Mag Sepharose is brought close to the magnet and collected.
It was washed 3 times with the buffer attached to Dash and used for the next reaction.
・3回目の反応溶液の調製
リアクション[1](酵素: KOD exo(-) AviTag beads [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
・ Preparation of the third reaction solution Reaction [1] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag beads [2])
1
(Final concentration 0.2 mM), KOD exo (-) AviTag beads [2] 2 μL, 6 μL of water were mixed (20 μL in total).
リアクション[2](酵素: KOD exo(-) AviTag beads [2])
1 nMのDNAテンプレート 2μL (最終濃度0.1 nM), 4 μMのDNAプライマー[1] 2 μL (最終濃度400 nM), 4 μMのDNAプライマー[2] 2 μL (最終濃度400 nM), 10×KOD Dash添付緩
衝液 2 μL, 2 mMのdGTP, TTP 2 μL (最終濃度0.2 mM), 2 mMのdATPαS, dCTPαS 2 μL
(最終濃度0.2 mM), KOD exo(-) AviTag beads [2] 2μL, 水6 μLを混合した(計20 μL)。
Reaction [2] (Enzyme: KOD exo (-) AviTag beads [2])
1
(Final concentration 0.2 mM), KOD exo (-) AviTag beads [2] 2 μL, 6 μL of water were mixed (20 μL in total).
・反応
TC-312サーマルサイクラー(Techne, Staffordshire, UK )を用いた。
94℃1分間preheatingを行い、94℃ 30秒,54℃ 30秒,74℃ 60秒のサイクルを20, 30回くり返した。リアクション[1]は20サイクル, リアクション[2]は30サイクル
·reaction
A TC-312 thermal cycler (Techne, Staffordshire, UK) was used.
Preheating was performed at 94 ° C for 1 minute, and the cycle of 94 ° C for 30 seconds, 54 ° C for 30 seconds, and 74 ° C for 60 seconds was repeated 20 or 30 times. Reaction [1] has 20 cycles, Reaction [2] has 30 cycles
・PAGEによる確認
PCR反応液を回収し、ウレア色素(7M Urea, 3mM EDTA, 0.1% BPB)を28 μL加え、95℃, 5
分間変性させた。ウェルには、各サンプル2 μLをロードし、泳動を行った。泳動は、200V, 100mA, 35分, 45℃で行った。バンドの確認は、外部レーザー(488nm)を照射して、確
認した。
・ Confirmation by PAGE
Collect the PCR reaction solution, add 28 μL of urea dye (7M Urea, 3 mM EDTA, 0.1% BPB), and add at 95 ° C, 5
Denatured for minutes. 2 μL of each sample was loaded into the wells and electrophoresed. The electrophoresis was performed at 200 V, 100 mA, 35 minutes, and 45 ° C. The band was confirmed by irradiating an external laser (488 nm).
用いた試薬
KOD exo(-) AviTag beads
dNTPs (Roche Diagnostics K. K., 日本)
dATPαS, dCTPαS (Jena Bioscience, ドイツ)
用いた配列
DNAテンプレート(74 mer)
5′-CAG TCC GGA TGC TCT AGA GTG ACT GGT CAA GGC GGG TAC AGG ACA CAA CGA CAC GAA TCT CGT GAA GCC GAG CG-3′（配列番号４）
DNAプライマー[1] (21 mer)
5′-/6-FAM/CGC TCG GCT TCA CGA GAT TCG-3′（配列番号５）
DNAプライマー[2] (23 mer)
5′-/Biotin/CAG TCC GGA TGC TCT AGA GTG AC-3′（配列番号６）
Reagents used
KOD exo (-) AviTag beads
dNTPs (Roche Diagnostics KK, Japan)
dATPαS, dCTPαS (Jena Bioscience, Germany)
Sequence used
DNA template (74 mer)
5'-CAG TCC GGA TGC TCT AGA GTG ACT GGT CAA GGC GGG TAC AGG ACA CAA CGA CAC GAA TCT CGT GAA GCC GAG CG-3'(SEQ ID NO: 4)
DNA Primer [1] (21 mer)
5'- / 6-FAM / CGC TCG GCT TCA CGA GAT TCG-3'(SEQ ID NO: 5)
DNA Primer [2] (23 mer)
5'-/ Biotin / CAG TCC GGA TGC TCT AGA GTG AC-3'(SEQ ID NO: 6)
結果
図６では、ホスホロチオエートを含むアプタマーの相補鎖を鋳型としたKOD exo(-) AviTag beadsのPCR反応の結果を示した。KOD exo(-) AviTag beads [2]の20サイクルの結果(レーン4-6)は、使用回数の増加に伴い、目的の位置のバンドが濃くなった。KOD exo(-) AviTag beads [2]の30サイクルの結果(レーン7-9)は、使用回数の増加に伴い、目的の位置のバンドが濃くなり、プライマーもほぼ消費されていた。
Results Figure 6 shows the results of the PCR reaction of KOD exo (-) AviTag beads using the complementary strand of the aptamer containing phosphorothioate as a template. As a result of 20 cycles of KOD exo (-) AviTag beads [2] (lanes 4-6), the band at the target position became darker as the number of uses increased. As a result of 30 cycles of KOD exo (-) AviTag beads [2] (lanes 7-9), the band at the target position became darker and the primer was almost consumed as the number of uses increased.
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| JP2017050614A JP7011145B2 (en) | 2017-03-15 | 2017-03-15 | Modified polynucleotide synthesis method with immobilized polymerase |
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| 日本化学会第９７春季年会予稿集，2017年03月03日，４Ｃ２－４２欄 |
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