JP6993677B2 - Cancer peptide vaccine for cancer prevention, cancer treatment or cancer metastasis prevention in dogs - Google Patents
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Description
本発明は、犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移の予防に有効なペプチドに関する。本発明は、さらに、前記ぺプチドを有効成分として含むがん予防剤、がん治療剤およびがん転移予防剤に関する。 The present invention relates to peptides that are effective in preventing cancer, treating cancer or preventing metastasis of cancer in dogs. The present invention further relates to a cancer preventive agent, a cancer therapeutic agent, and a cancer metastasis preventive agent containing the peptide as an active ingredient.
犬の悪性腫瘍のうち、口腔内メラノーマは浸潤性が強く予後不良で、このタイプの腫瘍では下顎（または上顎）ごとの外科的切除は、著しいQOL低下を招くため、多くのケースで放射線療法や化学療法に頼る傾向がある。しかし、第一選択治療で一時的に縮小できても再発・転移することがあり、その再発がんのほとんどが同じ治療に対して耐性を示すことが多い。 Of the malignant tumors in dogs, oral melanoma is highly invasive and has a poor prognosis, and in this type of tumor, surgical resection of each lower jaw (or upper jaw) leads to a significant decrease in QOL, so radiation therapy is often used. Tends to rely on chemotherapy. However, even if it can be temporarily reduced by the first-line treatment, it may recur or metastasize, and most of the recurrent cancers are often resistant to the same treatment.
がんペプチドワクチンは、がん細胞のMHC class Iに提示されているエピトープと同じアミノ酸（AA）配列の合成ペプチドを皮膚にワクチン接種することで、皮膚の樹状細胞に抗原提示され、生体内でがん特異的細胞傷害性Tリンパ球（CTL）を誘導し、がん細胞を排除することを期待した治療法の１つである（図１）。がんペプチドワクチンによるがんの予防等については特許文献１や特許文献２に報告されている。マウスを用いた実験報告やヒトでの多数の症例報告があるが、犬ではMHC class I情報が少ないため、犬での実施報告はない。
The cancer peptide vaccine is presented to the dendritic cells of the skin by vaccineing the skin with a synthetic peptide having the same amino acid (AA) sequence as the epitope presented in MHC class I of the cancer cells, and is presented in vivo. It is one of the treatment methods expected to induce cancer-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) and eliminate cancer cells (Fig. 1). Prevention of cancer by a cancer peptide vaccine is reported in
本発明は、犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移の予防のためのがんペプチドワクチンの提供を目的とする。 It is an object of the present invention to provide a cancer peptide vaccine for the prevention of cancer, the treatment of cancer or the prevention of metastasis of cancer in dogs.
本発明者らは、マウスおよびヒトのMHC class I型適合性抗原エピトープ探索技術を参考に、犬のDLA-88型適合性抗原エピトープ検出技術を開発した。この際、抗原として犬のメラノーマに高発現するタンパク質であるmelan-AおよびTRP-2、並びに犬の多くの腫瘍に発現するsurvivin（サバイビン）を用いた。犬のDLA-88型情報は、不明な点が多いため、ペプチドのデザインはヒトHLA型を参考にして、犬がん関連抗原のうちmelan-Aとsurvivinについては６種の合成ペプチドを、TRP-2については12種の合成ペプチドを準備した。これらの合成ペプチドの効果を特異的CTLの誘導によって検証した。 The present inventors have developed a DLA-88 type compatible antigen epitope detection technique for dogs with reference to the MHC class I type I compatible antigen epitope search technique for mice and humans. At this time, melan-A and TRP-2, which are proteins highly expressed in canine melanoma, and survivin (survivin) expressed in many canine tumors were used as antigens. Since there are many unclear points about DLA-88 type information in dogs, the peptide design is based on human HLA type, and 6 synthetic peptides are used for melan-A and survivin among dog cancer-related antigens. For -2, 12 kinds of synthetic peptides were prepared. The effects of these synthetic peptides were verified by the induction of specific CTLs.
犬末梢血単核球（PBMC）から磁気ビーズ抗体を用いてCD8+Ｔ細胞とプレート接着細胞に分離後、プレート接着細胞に犬リコンビナントGM-CSF/IL-4と上記の合成ペプチドを添加して抗原提示細胞（APC）へと分化誘導させた。CD8+Ｔ細胞を活性化する活性の見られた検体からゲノムDNAを精製後、DLA-88型のexon 2-3領域をシークエンスし、タイピングを行った。このようにして、melan-A、survivinおよびTRP-2についてDLA-88型に特異的なペプチドを同定した。 After separating CD8 + T cells and plate-adhered cells from canine peripheral blood mononuclear cells (PBMC) using magnetic bead antibodies, dog recombinant GM-CSF / IL-4 and the above synthetic peptide were added to the plate-adhered cells. Differentiation was induced into antigen-presenting cells (APCs). Genomic DNA was purified from a sample showing activity to activate CD8 + T cells, and then the exon 2-3 region of DLA-88 type was sequenced and typed. In this way, DLA-88 type specific peptides were identified for melan-A, survivalin and TRP-2.
従来のワクチンは、melan-Aタンパク質の全長を抗原として、またはmelan-A遺伝子の全長をDNAワクチン用として、または複数のペプチド（エピトープ）を混合したもの、複数のペプチド（エピトープ）を結合させたポリペプチド状のものなどを用いてワクチン接種し、樹状細胞に取り込まれた後、偶然にその犬のDLA-88型に提示されることを期待した方法であった。この場合は、免疫応答が誘導されない場合、様々な免疫応答（抗体産生、CTL応答、Th反応、免疫抑制など）が同時に誘導される場合が想定される。一方、本発明は今まで偶然性に頼っていたDLA-88型とそのCTLエピトープとの関係を明らかにした点にあり、DLA-88型検査後に、それに適合するペプチドを用いてピンポイントにCTLを誘導することが期待される。 Conventional vaccines use the full length of the melan-A protein as an antigen, the full length of the melan-A gene for a DNA vaccine, a mixture of multiple peptides (epitope), or a combination of multiple peptides (epitope). It was a method expected to be presented to DLA-88 type of the dog by chance after being vaccinated with a polypeptide or the like and taken up by dendritic cells. In this case, if the immune response is not induced, it is assumed that various immune responses (antibody production, CTL response, Th response, immunosuppression, etc.) are induced at the same time. On the other hand, the present invention has clarified the relationship between DLA-88 type and its CTL epitope, which has relied on chance until now, and after the DLA-88 type test, pinpoint CTL using a peptide compatible with it. Expected to induce.
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 配列番号４～２７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、犬のDLA-88抗原と結合して犬のがん細胞を標的とするCTLを誘導し得るペプチド。
[２] 特定のDLA-88型に結合し、そのDLA-88型を有する犬のがん細胞を標的とするCTLを誘導し得る、[１]のペプチド。
[３] がんが、リンパ腫、鼻腔腺癌、メラノーマ（悪性黒色腫）、悪性組織球腫、乳腺癌、骨肉腫、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、膀胱尿路上皮癌、血管肉腫、および肥満細胞腫からなる群から選択される[１]または[２]のペプチド。
[４] [１]～[３]のいずれかのペプチドを含む、犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移予防のためのがんぺプチドワクチン。
[５] 罹患犬のDLA-88型を決定する工程、そのDLA-88型が提示することができるペプチドを配列番号４～２７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドの中から選択する工程、および選択したペプチドを投与する工程を含む、犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移を防止する方法。
[６] がんが、リンパ腫、鼻腔腺癌、メラノーマ（悪性黒色腫）、悪性組織球腫、乳腺癌、骨肉腫、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、膀胱尿路上皮癌、血管肉腫、および肥満細胞腫からなる群から選択される[５]の方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] A peptide consisting of an amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4 to 27, which can induce CTLs that bind to canine DLA-88 antigen and target canine cancer cells.
[2] A peptide of [1] that binds to a specific DLA-88 type and can induce a CTL that targets cancer cells of dogs having the DLA-88 type.
[3] Cancers include lymphoma, nasal adenocarcinoma, melanoma (malignant melanoma), malignant histiocytoma, breast adenocarcinoma, osteosarcoma, non-small cell lung cancer, squamous cell carcinoma, bladder urothelial carcinoma, angiosarcoma, and The peptide of [1] or [2] selected from the group consisting of obese cell carcinoma.
[4] A cancer peptide vaccine for preventing cancer, treating cancer, or preventing metastasis of cancer in dogs, which comprises the peptide according to any one of [1] to [3].
[5] Step of determining DLA-88 type of affected dog, peptides that can be presented by the DLA-88 type are selected from peptides consisting of amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NOs: 4 to 27. A method of preventing cancer, treating cancer, or preventing cancer metastasis in a dog, comprising a step and a step of administering a selected peptide.
[6] Cancers include lymphoma, nasal adenocarcinoma, melanoma (malignant melanoma), malignant histocytoma, mammary adenocarcinoma, osteosarcoma, non-small cell lung cancer, squamous cell carcinoma, bladder urothelial carcinoma, angiosarcoma, and The method of [5] selected from the group consisting of mastocytomas.
本発明は、犬のがんペプチドワクチンの成分の要となる抗原とその抗原ペプチドを提示できるDLA-88型の組み合わせを見出した点にある。がんペプチドワクチンは、犬の様々な悪性腫瘍（特にメラノーマ）に対するCTLを誘導してその悪性腫瘍を排除することができる。本発明に基づいて、がん罹患犬のDLA-88型情報を決定し、それに適合するがん抗原ペプチドの含有するワクチンを選別して提供することができ、犬の個体ごとに適応した免疫療法を施すことが可能となる。 The present invention is in that it has found a combination of an antigen that is a key component of a canine cancer peptide vaccine and DLA-88 type that can present the antigen peptide. Cancer peptide vaccines can induce CTLs against various malignancies in dogs, especially melanoma, to eliminate the malignancies. Based on the present invention, it is possible to determine DLA-88 type information of a dog suffering from cancer, select and provide a vaccine containing a cancer antigen peptide suitable for the information, and immunotherapy adapted to each individual dog. Can be applied.
がんペプチドワクチンの利点は、活性化リンパ球療法や樹状細胞療法とは異なり、培養設備を必要としない点にあり、皮膚にワクチン接種するだけの簡便さで、一般診療の獣医師に普及させることが期待される。 The advantage of the cancer peptide vaccine is that unlike activated lymphocyte therapy and dendritic cell therapy, it does not require a culture facility, and it is easy to vaccinate the skin, and it is widely used by veterinarians in general practice. It is expected to let you.
以下、本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.
本発明のがんペプチドワクチンとして用い得るペプチドは、犬のがん関連抗原であるmelan-A、survivin（サバイビン）またはTRP-2の部分ペプチドである。ここで、がん関連抗原とは、がん細胞だけではなく、正常細胞でも発現するが、がん細胞で正常細胞に比べて遥かに高い発現が認められる抗原をいう。本発明のがんペプチドワクチンとして用い得るペプチドは、樹状細胞等の抗原提示細胞（APC: antigen presenting cell)に抗原提示されるアミノ酸９～１０個、好ましくは９個からなるペプチドである。 The peptide that can be used as the cancer peptide vaccine of the present invention is a partial peptide of melan-A, survivin (survivin) or TRP-2, which are cancer-related antigens in dogs. Here, the cancer-related antigen refers to an antigen that is expressed not only in cancer cells but also in normal cells, but whose expression is much higher in cancer cells than in normal cells. The peptide that can be used as the cancer peptide vaccine of the present invention is a peptide consisting of 9 to 10 amino acids, preferably 9 amino acids, that are presented to an antigen presenting cell (APC) such as a dendritic cell.
犬のmelan-Aの全長アミノ酸配列を配列番号１に、犬のsurvivinの全長アミノ酸配列を配列番号２に、犬のTRP-2の全長アミノ酸配列を配列番号３に示す。本発明のがんペプチドワクチンとして用い得るペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる犬のmelan-Aタンパク質の部分ペプチドであって、９～１０個、好ましくは９個の連続するアミノ酸配列からなる部分ペプチド、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる犬のsurvivinタンパク質の部分ペプチドであって、９～１０個、好ましくは９個の連続するアミノ酸配列からなる部分ペプチド、または配列番号３で表されるアミノ酸配列からなる犬のTRP-2タンパク質の部分ペプチドであって、９～１０個、好ましくは９個の連続するアミノ酸配列からなる部分ペプチドである。 The full-length amino acid sequence of canine melan-A is shown in SEQ ID NO: 1, the full-length amino acid sequence of canine survivin is shown in SEQ ID NO: 2, and the full-length amino acid sequence of canine TRP-2 is shown in SEQ ID NO: 3. The peptide that can be used as the cancer peptide vaccine of the present invention is a partial peptide of the canine melan-A protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and is a partial peptide of 9 to 10 consecutive amino acids, preferably 9 consecutive amino acids. A partial peptide consisting of a sequence, a partial peptide of a canine survivin protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a partial peptide consisting of 9 to 10, preferably 9 consecutive amino acid sequences, or a SEQ ID NO: It is a partial peptide of the dog TRP-2 protein consisting of the amino acid sequence represented by 3, and is a partial peptide consisting of 9 to 10 consecutive amino acid sequences, preferably 9 consecutive amino acid sequences.
また、本発明のがんペプチドワクチンとして用い得るペプチドは、犬のMHC（DLA：Dog Leukocyte Antigen）クラスI分子に結合し得る。すなわち、犬のMHCクラスI分子に提示されているエピトープと同じアミノ酸配列を有する。犬のMHCクラスI分子として、DLA-88分子が挙げられる。 In addition, the peptide that can be used as the cancer peptide vaccine of the present invention can bind to MHC (DLA: Dog Leukocyte Antigen) class I molecules in dogs. That is, it has the same amino acid sequence as the epitope presented on the dog's MHC class I molecule. The MHC class I molecule in dogs includes the DLA-88 molecule.
本発明のがんペプチドワクチンとして用い得るペプチドは、小胞体内で犬のMHCクラスI分子に結合し、複合体を形成し、MHCクラスI分子-ペプチド複合体として樹状細胞などの抗原提示細胞表面に運ばれ、提示される。その結果、その抗原を認識するCD8陽性T細胞の活性化によりCTLを誘導し、MHCクラスI分子-ペプチド複合体を提示しているがん細胞を標的として攻撃する。すなわち、本発明のペプチドはがん抗原ペプチドとして作用し、がんワクチンとしてがん免疫療法に用いることができる。 The peptide that can be used as the cancer peptide vaccine of the present invention binds to a canine MHC class I molecule in the endoplasmic reticulum to form a complex, and as an MHC class I molecule-peptide complex, an antigen-presenting cell such as a dendritic cell. It is carried to the surface and presented. As a result, it induces CTL by activating CD8-positive T cells that recognize the antigen, and targets and attacks cancer cells presenting the MHC class I molecule-peptide complex. That is, the peptide of the present invention acts as a cancer antigen peptide and can be used for cancer immunotherapy as a cancer vaccine.
DLA-88には多数の異なる型（アレル）が存在し、DLA-88の型により結合できるペプチドが異なる。すなわち、ペプチドの免疫原性はがんを予防し、がんを治療し、またはがんの転移を予防しようとする罹患犬のDLA-88型に拘束される。あるペプチドが罹患犬の特定のDLA-88型に拘束される場合、該ペプチドは特定のDLA-88型拘束性であるという。従って、本発明のペプチドをがんペプチドワクチンとして犬に投与する場合、あらかじめ投与の対象となる罹患犬のDLA-88型を決定し、DLA-88型とペプチドの組み合わせを決定し、その個体犬のDLA-88型が提示することができるペプチドをペプチドワクチンとして投与すればよい。具体的には、がん罹患犬から犬末梢血を採取し、末梢血単核球（PBMC）から磁気ビーズ抗体を用いてCD8+Ｔ細胞とプレート接着細胞に分離後、プレート接着細胞に犬リコンビナントGM-CSF/IL-4と合成ペプチドを添加して抗原提示細胞（APC）へと分化誘導させる。精製したCD8+Ｔ細胞とＸ線照射により増殖活性を消失させたAPCとを混合培養し、CD8+Ｔ細胞の活性化の有無を経時的に観察することにより、CTLへ誘導されたかを決定すればよい。CTL誘導能が認められた罹患犬のDLA-88型をDLAタイピングにより決定することにより、用いたペプチドとそのペプチドが結合し得るDLA-88型の組合せを決定することができる。DLA-88型タイピングについては、例えば、Barth et al. PLOS ONE, November 28, 2016 doi.org/10.1371/journal.pone.0167017の記載を参考にすればよい。 There are many different types (alleles) of DLA-88, and the peptides that can be bound differ depending on the type of DLA-88. That is, the immunogenicity of the peptide is restricted to DLA-88 type in affected dogs that seek to prevent, treat, or prevent cancer metastasis. If a peptide is restricted to a particular DLA-88 type in an affected dog, the peptide is said to be specific DLA-88 type restricted. Therefore, when the peptide of the present invention is administered to a dog as a cancer peptide vaccine, the DLA-88 type of the affected dog to be administered is determined in advance, the combination of the DLA-88 type and the peptide is determined, and the individual dog is determined. The peptide that can be presented by DLA-88 type of DLA-88 may be administered as a peptide vaccine. Specifically, dog peripheral blood is collected from cancer-affected dogs, separated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) into CD8 + T cells and plate-adhering cells using magnetic bead antibodies, and then dog recombinant to plate-adhering cells. GM-CSF / IL-4 and synthetic peptides are added to induce differentiation into antigen-presenting cells (APCs). Purified CD8 + T cells and APC whose proliferative activity was lost by X-ray irradiation were mixed and cultured, and the presence or absence of activation of CD8 + T cells was observed over time to determine whether or not they were induced to CTL. Just do it. By determining the DLA-88 type of affected dogs with CTL-inducing ability by DLA typing, it is possible to determine the combination of the peptide used and the DLA-88 type to which the peptide can bind. For DLA-88 type typing, for example, refer to the description in Barth et al. PLOS ONE, November 28, 2016 doi.org/10.1371/journal.pone.0167017.
DLA-88型の決定は、DLA-88型のDNAタイピングにより行うことができる（DLA-88型タイピング）。DNAタイピングとしては、DNAシーケンンス、PCR（Polymerase Chain Reaction）、AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）、SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism）、ASO（Allele Specific Oligonucleotide）プローブ法を用いた方法等が挙げられる。例えば、DLA-88領域を増幅させるプライマーを用いてDLA-88領域を含むDNAを増幅し、シーケンスすればよい。この際、他の犬のMHCクラスI抗原であるDLA-12領域にDLA-88型が入り込むケースがあるので、DLA-12領域も同時に増幅するのが望ましい。 DLA-88 type determination can be made by DLA-88 type DNA typing (DLA-88 type typing). Examples of DNA typing include methods using DNA sequence, PCR (Polymerase Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), and ASO (Allele Specific Oligonucleotide) probe method. For example, the DNA containing the DLA-88 region may be amplified and sequenced using a primer that amplifies the DLA-88 region. At this time, since there are cases where DLA-88 type enters the DLA-12 region, which is the MHC class I antigen of other dogs, it is desirable to amplify the DLA-12 region at the same time.
本発明のがんペプチドワクチンとして用い得る具体的なペプチドとして、犬のmelan-Aの部分ペプチド、犬のsurvivinの部分ペプチド、および犬のTRP-2の部分ペプチドについて以下のペプチドが挙げられる。 Specific peptides that can be used as the cancer peptide vaccine of the present invention include the following peptides for the partial peptide of melan-A in dogs, the partial peptide of survivin in dogs, and the partial peptide of TRP-2 in dogs.
犬のmelan-Aの部分ペプチド
MPREEAHFI （ml-01）（配列番号４）、
LLIACWYCR （ml-41）（配列番号５）、
LRGRCPHEG （ml-70）（配列番号６）、
FQESNCELV （ml-88）（配列番号７）、
LVVPNAPPA （ml-95）（配列番号８）、および
AEQSSPPYL （ml-109）（配列番号９）
Partial peptide of melan-A in dogs
MPREEAHFI (ml-01) (SEQ ID NO: 4),
LLIACWYCR (ml-41) (SEQ ID NO: 5),
LRGRCPHEG (ml-70) (SEQ ID NO: 6),
FQESNCELV (ml-88) (SEQ ID NO: 7),
LVVPNAPPA (ml-95) (SEQ ID NO: 8), and
AEQSSPPYL (ml-109) (SEQ ID NO: 9)
犬のsurvivinの部分ペプチド
MGAPTLPPA （sv-01）（配列番号１０）、
WQPFLKDHR （sv-10）（配列番号１１）、
ISTFKNWPF （sv-19）（配列番号１２）、
FCFKELEGW （sv-59）（配列番号１３）、
SVKKQFEEL （sv-58）（配列番号１４）、および
KKQFEELTLG （sv-90）（配列番号１５）
Partial peptide of canine survivin
MGAPTLPPA (sv-01) (SEQ ID NO: 10),
WQPFLKDHR (sv-10) (SEQ ID NO: 11),
ISTFKNWPF (sv-19) (SEQ ID NO: 12),
FCFKELEGW (sv-59) (SEQ ID NO: 13),
SVKKQFEEL (sv-58) (SEQ ID NO: 14), and
KKQFEELTLG (sv-90) (SEQ ID NO: 15)
犬のTRP-2の部分ペプチド
AMSPLGWGL （trp-1）（配列番号１６）、
MAKECCPPL （trp-2）（配列番号１７）、
WTGHDCNQR （trp-3）（配列番号１８）、
LERDLQQLI （trp-4）（配列番号１９）、
ARQDDPTLI （trp-5）（配列番号２０）、
DDYNRRVTL （trp-6）（配列番号２１）、
KDIQDCLSL （trp-7）（配列番号２２）、
SQVMSLHNL （trp-8）（配列番号２３）、
LHNLVHSFL （trp-9）（配列番号２４）、
FPPVTNEEL （trp-10）（配列番号２５）、
VLFFLQYRR （trp-11）（配列番号２６）、および
LMETHLSDR （trp-12）（配列番号２７）
Partial peptide of TRP-2 in dogs
AMSPLGWGL (trp-1) (SEQ ID NO: 16),
MAKECCPPL (trp-2) (SEQ ID NO: 17),
WTGHDCNQR (trp-3) (SEQ ID NO: 18),
LERDLQQLI (trp-4) (SEQ ID NO: 19),
ARQDDPTLI (trp-5) (SEQ ID NO: 20),
DDYNRRVTL (trp-6) (SEQ ID NO: 21),
KDIQDCLSL (trp-7) (SEQ ID NO: 22),
SQVMSLHNL (trp-8) (SEQ ID NO: 23),
LHNLVHSFL (trp-9) (SEQ ID NO: 24),
FPPVTNEEL (trp-10) (SEQ ID NO: 25),
VLFFLQYRR (trp-11) (SEQ ID NO: 26), and
LMETHLSDR (trp-12) (SEQ ID NO: 27)
本発明のペプチドワクチンとして用い得るペプチドは、上記の配列番号４～２７で表されるアミノ酸配列において、１～３個、好ましくは１若しくは２個、さらに好ましくは１個のアミノ酸が欠失、置換、付加されたアミノ酸配列からなる部分ペプチド（ネオアンチゲン）も含まれる。このようなペプチドは、配列番号４～２７で表されるアミノ酸配列に対する配列同一性が66.7％以上、好ましくは77.8％以上、さらに好ましくは88.9％以上のアミノ酸配列からなるペプチドである。 The peptide that can be used as the peptide vaccine of the present invention lacks or replaces 1 to 3, preferably 1 or 2, more preferably 1 amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 4 to 27 above. , A partial peptide (neoantigen) consisting of the added amino acid sequence is also included. Such a peptide is a peptide having an amino acid sequence having an amino acid sequence of 66.7% or more, preferably 77.8% or more, and more preferably 88.9% or more with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 4 to 27.
本発明のがんペプチドワクチンとして用い得るペプチドは、公知のペプチド合成技術により合成することも、組換えDNA技術により製造することもできる。 The peptide that can be used as the cancer peptide vaccine of the present invention can be synthesized by a known peptide synthesis technique or can be produced by a recombinant DNA technique.
本発明のがんペプチドワクチンとして用い得るペプチドとそれぞれのペプチドに結合し提示することができるDLA-88型の組合せを以下に示す。それぞれのぺプチドについて高い頻度で検出された高親和性のDLA-88型とより低い頻度で検出された低親和性のDLA-88型が存在し、以下には高親和性のDLA-88型と低親和性のDLA-88型を示す。 The combinations of the peptides that can be used as the cancer peptide vaccine of the present invention and the DLA-88 type that can be presented by binding to each peptide are shown below. There are high-affinity DLA-88 types detected with high frequency and low-affinity DLA-88 type detected with lower frequency for each peptide, and the following are high-affinity DLA-88 types. Shows DLA-88 type with low affinity.
Melan-Aのワクチンペプチド
MPREEAHFI （ml-01）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*508:01、*029:01、*nov25、*012:01、*028:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*017:01、*501:01、*005:01、*051:01、*nov24
LLIACWYCR （ml-41）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*501:01、*029:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*012:01、*028:01、*nov8、*502:01、*nov17、*004:02、*032:01、*nov6
LRGRCPHEG （ml-70）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*501:01、*508:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*006:01、*nov25、*001:03、*005:01、*nov15、*nov17
FQESNCELV （ml-88）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*501:01、*508:01、*029:01、*nov15
低親和性のDLA-88型
DLA-88*006:01、*nov25
LVVPNAPPA （ml-95）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*508:01、*006:01、*nov9
AEQSSPPYL （ml-109）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*501:01、*508:01、
低親和性のDLA-88型
DLA-88*006:01、*001:03、*nov8、*502:01
Melan-A vaccine peptide
MPREEAHFI (ml-01):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 003: 02, * 508: 01, * 029: 01, * nov25, * 012: 01, * 028: 01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 017: 01, * 501: 01, * 005: 01, * 051: 01, * nov24
LLIACWYCR (ml-41):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 003: 02, * 017: 01, * 501: 01, * 029: 01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 012: 01, * 028: 01, * nov8, * 50 2:01, * nov17, * 004: 02, * 032:01, * nov6
LRGRCPHEG (ml-70):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 003: 02, * 017: 01, * 501: 01, * 508: 01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 006: 01, * nov25, * 001: 03, * 005: 01, * nov15, * nov17
FQESNCELV (ml-88):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 003: 02, * 017: 01, * 501: 01, * 508: 01, * 029: 01, * nov15
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 06 6:01, * nov25
LVVPNAPPA (ml-95):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 50 1:01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 003: 02, * 017: 01, * 508: 01, * 006: 01, * nov9
AEQSSPPYL (ml-109):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 003: 02, * 017: 01, * 501: 01, * 508: 01,
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 006: 01, * 001: 03, * nov8, * 50 2:01
survivinのワクチンペプチド、
MGAPTLPPA （sv-01）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*003:02、*017:01、*012:01、*029:01、*028:01、*nov37
低親和性のDLA-88型
DLA-88*508:01、*006:01、*004:02、*nov3、*045:01、*038:01
WQPFLKDHR （sv-10）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*034:01、*006:01、*012:01、*029:01、*028:01、*004:02、*nov3
低親和性のDLA-88型
DLA-88*508:01、*502:01、*012:02
ISTFKNWPF （sv-19）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*508:01、*034:01、*006:01、*nov25
低親和性のDLA-88型
DLA-88*002:01
FCFKELEGW （sv-59）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*508:01、*034:01、*003:02、*017:01、*029:01、*004:02
低親和性のDLA-88型
DLA-88*012:01、*028:01
SVKKQFEEL （sv-88）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*508:01、*034:01、*029:01、*028:01、*045:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02、*017:01、*nov25、*nov18
KKQFEELTLG （sv-90）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*501:01、*508:01、*034:01、*003:02、*017:01、*006:01、*012:01、*502:01、
低親和性のDLA-88型
DLA-88*nov25、*001:03、*nov4
Survivin vaccine peptide,
MGAPTLPPA (sv-01):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 501: 01, * 003: 02, * 017: 01, * 012: 01, * 029: 01, * 028: 01, * nov37
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 508: 01, * 006: 01, * 004: 02, * nov3, * 045: 01, * 038: 01
WQPFLKDHR (sv-10):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 501: 01, * 034: 01, * 006: 01, * 012: 01, * 029: 01, * 028: 01, * 004: 02, * nov3
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 508: 01, * 50 2:01, * 012: 02
ISTFKNWPF (sv-19):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 501: 01, * 508: 01, * 034: 01, * 006: 01, * nov25
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 002: 01
FCFKELEGW (sv-59):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 501: 01, * 508: 01, * 034: 01, * 003: 02, * 017: 01, * 029: 01, * 004: 02
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 012: 01, * 028: 01
SVKKQFEEL (sv-88):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 501: 01, * 508: 01, * 034: 01, * 029: 01, * 028: 01, * 045: 01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 003: 02, * 017: 01, * nov25, * nov18
KKQFEELTLG (sv-90):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 501: 01, * 508: 01, * 034: 01, * 003: 02, * 017: 01, * 006: 01, * 012: 01, * 502: 01,
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * nov25, * 001: 03, * nov4
TRP-2のワクチンペプチド
AMSPLGWGL （trp-1）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*051:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*006:01、*034:01
MAKECCPPL （trp-2）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*006:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*034:01、*045:01
WTGHDCNQR （trp-3）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*003:02
低親和性のDLA-88型
DLA-88*029:01、*028:01、*001:03、*nov8、*012:01、*017:01
LERDLQQLI （trp-4）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*508:01、*051:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*012:01、*005:01、*501:01
ARQDDPTLI （trp-5）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*051:01、*001:03
低親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*029:01、*508:01、*028:01、*034:01
DDYNRRVTL （trp-6）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*508:01、*501:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*029:01、*051:01、*006:01、*012:01
KDIQDCLSL （trp-7）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02
低親和性のDLA-88型
DLA-88*029:01、*001:03、*nov8
SQVMSLHNL （trp-8）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*051:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*029:01、*508:01
LHNLVHSFL （trp-9）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*051:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*029:01、*028:01、*nov8、*039:01
FPPVTNEEL （trp-10）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*508:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*nov8
VLFFLQYRR （trp-11）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*508:01、*006:01
低親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*029:01、*051:01、*028:01、*003:02、*017:01、*005:01
LMETHLSDR （trp-12）：
高親和性のDLA-88型
DLA-88*004:02、*029:01、*508:01、*028:01、*039:01
低親和性のDLA-88型
DLA88*006:01、*001:03、*012:01、*003:02、*017:01、*nov19
TRP-2 vaccine peptide
AMSPLGWGL (trp-1):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 051:01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 06 6:01, * 034: 01
MAKECCPPL (trp-2):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 06 6:01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 034: 01, * 045: 01
WTGHDCNQR (trp-3):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 003: 02
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 029: 01, * 028: 01, * 001: 03, * nov8, * 012: 01, * 017: 01
LERDLQQLI (trp-4):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 004: 02, * 508: 01, * 051: 01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 012: 01, * 005: 01, * 501: 01
ARQDDPTLI (trp-5):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 051:01, * 001: 03
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 004: 02, * 029: 01, * 508: 01, * 028: 01, * 034: 01
DDYNRRVTL (trp-6):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 004: 02, * 508: 01, * 501: 01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 029: 01, * 051: 01, * 006: 01, * 012: 01
KDIQDCLSL (trp-7):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 004: 02
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 029: 01, * 001: 03, * nov8
SQVMSLHNL (trp-8):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 051:01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 029: 01, * 50 8:01
LHNLVHSFL (trp-9):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 004: 02, * 051: 01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 029: 01, * 028: 01, * nov8, * 039: 01
FPPVTNEEL (trp-10):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 50 8:01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 004: 02, * nov8
VLFFLQYRR (trp-11):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 50 8:01, * 06: 01
Low affinity DLA-88 type
DLA-88 * 004: 02, * 029:01, * 051: 01, * 028: 01, * 003: 02, * 017: 01, * 005: 01
LMETHLSDR (trp-12):
High affinity DLA-88 type
DLA-88 * 004: 02, * 029: 01, * 508: 01, * 028: 01, * 039: 01
Low affinity DLA-88 type
DLA88 * 006: 01, * 001: 03, * 012: 01, * 003: 02, * 017: 01, * nov19
それぞれのペプチドは、そのペプチドを提示することができるDLA-88型を有する罹患犬に投与することにより、その犬個体においてCTLを誘導し、がん細胞を傷害することができる。また、高親和性のDLA-88型を有する罹患犬に投与した場合により高い効果を得ることができる。例えば、Melan-AのワクチンペプチドであるMPREEAHFI（ml-01）を犬のがんの治療等に用いる場合、罹患犬のDLA-88型はDLA-88*003:02、*017:01、*501:01、*508:01、*029:01、*nov25、*005:01、*012:01、*028:01、*051:01、または*nov24である必要があるので、あらかじめ罹患犬のDLA-88型がこれらの型であることを確認しておくことが必要である。 Each peptide can induce CTLs and damage cancer cells in an individual dog by administration to an affected dog having the DLA-88 type capable of presenting the peptide. In addition, a higher effect can be obtained when administered to affected dogs having high affinity DLA-88 type. For example, when MPREEAHFI (ml-01), a vaccine peptide of Melan-A, is used for the treatment of cancer in dogs, DLA-88 type of affected dogs is DLA-88 * 003: 02, * 017: 01, *. Affected dogs in advance as they must be 501: 01, * 508: 01, * 029: 01, * nov25, * 005: 01, * 012: 01, * 028: 01, * 051: 01, or * nov24. It is necessary to confirm that the DLA-88 type of DLA-88 is these types.
本発明のがんペプチドワクチンは、犬において、がんの予防、がんの治療またはがんの転移予防のために投与することができる。特に、腫瘍の外科的切除、放射線療法後におけるがんの転移予防に適している。ここで、がんの予防とは、がんの発症の予防をいい、がんの治療とは罹患犬のがんの治療をいい、がんの転移予防とは、がん細胞の血液中に浸潤した場合や、リンパ管を介してリンパ節に浸潤した場合にがん細胞を攻撃することによりがん細胞が他の組織、器官に転移することを予防することをいう。 The cancer peptide vaccine of the present invention can be administered in dogs for the prevention of cancer, the treatment of cancer or the prevention of metastasis of cancer. In particular, it is suitable for surgical resection of tumors and prevention of cancer metastasis after radiation therapy. Here, prevention of cancer means prevention of onset of cancer, treatment of cancer means treatment of cancer in affected dogs, and prevention of metastasis of cancer means prevention of cancer metastasis in the blood of cancer cells. It refers to preventing cancer cells from metastasizing to other tissues or organs by attacking the cancer cells when they invade or invade lymph nodes via lymph vessels.
本発明のがんペプチドワクチンが対象とするがんは限定されないが、melan-A、TRP-2またはsurvivinを発現するがんであり、好ましくはリンパ腫、鼻腔腺癌、メラノーマ（悪性黒色腫）、悪性組織球腫、乳腺癌、骨肉腫、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、膀胱尿路上皮癌、血管肉腫、および肥満細胞腫が挙げられる。 The cancers targeted by the cancer peptide vaccine of the present invention are not limited, but are cancers expressing melan-A, TRP-2 or survivin, preferably lymphoma, nasal adenocarcinoma, melanoma (malignant melanoma), and malignant. Included are histocytoma, mammary adenocarcinoma, osteosarcoma, non-small cell lung cancer, squamous cell carcinoma, bladder urothelial carcinoma, angiosarcoma, and obese cell carcinoma.
このうち、melan-Aの部分ペプチドであるペプチドワクチンは、メラノーマに適しており、TRP-2の部分ペプチドであるペプチドワクチンは、メラノーマに適しており、survivinの部分ペプチドであるペプチドワクチンは、リンパ腫、鼻腔腺癌、メラノーマ（悪性黒色腫）、悪性組織球腫、乳腺癌、骨肉腫、非小細胞肺癌、扁平上皮癌、膀胱尿路上皮癌、血管肉腫および肥満細胞腫に適している。 Of these, the peptide vaccine, which is a partial peptide of melan-A, is suitable for melanoma, the peptide vaccine, which is a partial peptide of TRP-2, is suitable for melanoma, and the peptide vaccine, which is a partial peptide of survivin, is lymphoma. Suitable for nasal adenocarcinoma, melanoma, malignant histocytoma, breast adenocarcinoma, osteosarcoma, non-small cell lung cancer, squamous epithelial cancer, bladder urinary tract epithelial cancer, angiosarcoma and obesity cell tumor.
本発明のペプチドワクチンの投与量は、がん種や重篤度等により変えることができるが、１回10μg～100μg、好ましくは50μg前後である。投与は、初回投与から１週間後に１回投与のみでもよく、その維持のために、その後の数週間～数か月毎に１回投与してもよい。本発明のペプチドワクチンは、無菌の水性または脂溶性の溶液、またはエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の免疫増強剤、担体等を含んでいてもよい。ぺプチドワクチンは、皮内下、静脈内、経鼻粘膜内、筋肉内投与等の非経口投与でも、経口投与でもよい。この中でも皮内投与が好ましい。 The dose of the peptide vaccine of the present invention can be changed depending on the type of cancer, severity and the like, but is 10 μg to 100 μg at a time, preferably around 50 μg. The administration may be performed only once one week after the initial administration, or may be administered once every few weeks to several months thereafter to maintain the administration. The peptide vaccine of the present invention may be in the form of a sterile aqueous or lipophilic solution or emulsion. Further, it may contain a salt, a buffer, an immunopotentiator such as an adjuvant, a carrier and the like. The peptide vaccine may be administered parenterally, such as intradermally, intravenously, intranasally, intramuscularly, or orally. Of these, intradermal administration is preferable.
上記のペプチドの１種類を投与してもよいし、複数のペプチドを組合せて投与してもよい。例えば、配列番号４～２７に表されるアミノ酸配列からなる24個のペプチドの２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個または24個を組合せて投与してもよい。本発明は、複数のペプチドを組合せた製剤またはキットも包含する。 One type of the above-mentioned peptide may be administered, or a plurality of peptides may be administered in combination. For example, 2, 3, 4, 5, 6, 6, 8, 8, 9, 10, 11 of 24 peptides consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4 to 27, A combination of 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 19, 20, 21, 22, 23 or 24 may be administered. The present invention also includes a formulation or kit that combines a plurality of peptides.
また、この際、抗原提示されるDLA-88型が異なるペプチドを組合せてよい。このように組合わせることにより、DLA-88型に関係なく、多くの罹患犬に効果があるペプチドの組合せ製剤を提供することができる。 At this time, peptides having different DLA-88 types presented as antigens may be combined. By this combination, it is possible to provide a combination preparation of peptides that is effective for many affected dogs regardless of DLA-88 type.
本発明のがんペプチドワクチンはアジュバントと一緒に投与してもよい。アジュバントとしては、フロイントの不完全アジュバントをはじめ、ミコバクテリウム、グラム陰性菌およびグラム陽性菌等の菌体成分、細菌およびウイルス由来CpG-ODN等の既知のアジュバントを用いることができる。また、本発明のワクチンは飲料水や餌に含ませた状態で犬等の動物に摂取させてもよい。本発明は、ワクチンを含む飲料水および餌も包含する。 The cancer peptide vaccine of the present invention may be administered together with an adjuvant. As the adjuvant, known adjuvants such as Freund's incomplete adjuvant, bacterial cell components such as mycobacterium, gram-negative bacteria and gram-positive bacteria, and bacterial and virus-derived CpG-ODN can be used. In addition, the vaccine of the present invention may be ingested by animals such as dogs in a state of being contained in drinking water or food. The present invention also includes drinking water and food containing vaccines.
本発明のがんペプチドワクチンをコードするDNAまたは該DNAを含むベクターをがんの予防、がんの治療またはがんの転移予防に用いることもできる。ベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスや無毒化したレトロウイルス、ワクシニアウイルス等のウイルスベクターを用いることができる。本発明のがんペプチドワクチンをコードするDNAをこれらのウイルスベクターに導入し、該ウイルスベクターを罹患犬に感染させればよい。投与法は、筋注が好ましい。また、罹患犬より採血後のPBMCの培養系に、プラスミドベクター等の発現ベクターを用いて、目的のDNAを細胞や組織に導入することができる。例えば、リポフェクション法、リン酸-カルシウム共沈法、DEAE-デキストラン法、微小ガラス管を用いたDNAの直接注入法などにより細胞内へ遺伝子を導入することができる。本発明のがんペプチドワクチンをコードするDNAを作動可能にベクターに導入すればよく、この際、DNAを転写するためのプロモーターやエンハンサー、ポリAシグナル等を含んでいてもよい。DNAおよびベクターの投与量はがん種、がんの重篤度により適宜決定することができるが、例えば、ベクターを用いる場合、107～109pfu(plaque forming unit)のベクターを投与すればよい。本発明のがんペプチドワクチンをコードするDNAまたは該DNAを含むベクターを罹患犬に投与した場合、生体内でペプチドが発現し、小胞体内で犬のMHCクラスI分子に結合し、複合体を形成し、MHCクラスI分子-ペプチド複合体として抗原提示細胞表面に運ばれ、提示される。その結果、抗原特異的免疫応答によりCTLを誘導増強し、MHCクラスI分子-ペプチド複合体を提示しているがん細胞を標的として攻撃する。 The DNA encoding the cancer peptide vaccine of the present invention or a vector containing the DNA can also be used for cancer prevention, cancer treatment or cancer metastasis prevention. As the vector, a viral vector such as adenovirus, adeno-associated virus, retrovirus, detoxified retrovirus, and vaccinia virus can be used. The DNA encoding the cancer peptide vaccine of the present invention may be introduced into these viral vectors to infect the affected dog. The administration method is preferably intramuscular injection. In addition, a target DNA can be introduced into cells or tissues by using an expression vector such as a plasmid vector in a PBMC culture system after blood collection from an affected dog. For example, the gene can be introduced into the cell by the lipofection method, the phosphate-calcium coprecipitation method, the DEAE-dextran method, the direct injection method of DNA using a microglass tube, or the like. The DNA encoding the cancer peptide vaccine of the present invention may be operably introduced into a vector, which may include a promoter, enhancer, poly A signal, etc. for transcribing the DNA. The dose of DNA and vector can be appropriately determined depending on the type of cancer and the severity of cancer. For example, when a vector is used, a vector of 10 7 to 10 9 pfu (plaque forming unit) is administered. good. When the DNA encoding the cancer peptide vaccine of the present invention or a vector containing the DNA is administered to an affected dog, the peptide is expressed in vivo and binds to the dog's MHC class I molecule in the endoplasmic reticulum to form a complex. It forms and is transported to and presented on the surface of antigen-presenting cells as an MHC class I molecule-peptide complex. As a result, it induces and enhances CTL by an antigen-specific immune response and targets and attacks cancer cells presenting the MHC class I molecule-peptide complex.
さらに、本発明のペプチド、DNA、ベクターを、抗腫瘍免疫機能を抑制する効果を解除する薬剤と組合せて用いることもできる。このような薬剤として、免疫チェックポイント阻害剤が挙げられ、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体等のPD-1/PD-L1阻害剤や抗CTLA4抗体を挙げることができる。 Furthermore, the peptides, DNAs and vectors of the present invention can also be used in combination with a drug that cancels the effect of suppressing the antitumor immune function. Examples of such agents include immune checkpoint inhibitors, PD-1 / PD-L1 inhibitors such as anti-PD-1 antibody and anti-PD-L1 antibody, and anti-CTLA4 antibody.
本発明は、罹患犬に上記のペプチド、あるいはDNA若しくはベクターを投与してがんを予防し、がんを治療し、がんの転移を防止する方法を包含する。この際、投与する前に罹患犬のDLA-88型を決定し、そのDLA-88型が提示することができるペプチドを選択して投与すればよい。すなわち、本発明は、罹患犬のDLA-88型を決定する工程、そのDLA-88型が提示することができるペプチドを選択する工程、および選択したペプチドを投与する工程を含む犬におけるがんの予防、がんの治療、がんの転移を防止する方法を包含する。 The present invention includes a method of administering the above peptide, DNA or vector to an affected dog to prevent cancer, treat cancer, and prevent metastasis of cancer. At this time, the DLA-88 type of the affected dog may be determined before administration, and the peptide that can be presented by the DLA-88 type may be selected and administered. That is, the present invention comprises a step of determining DLA-88 type of an affected dog, a step of selecting a peptide that can be presented by the DLA-88 type, and a step of administering the selected peptide for cancer in dogs. It includes methods for prevention, treatment of cancer, and prevention of cancer metastasis.
本発明は、本発明のペプチドを用いてin vitroでCTLを誘導し、該CTLを犬に投与し、がんを予防し、がんを治療し、がんの転移を防止する方法を包含する。 The present invention includes a method of inducing a CTL in vitro using the peptide of the present invention, administering the CTL to a dog, preventing cancer, treating cancer, and preventing metastasis of cancer. ..
即ち、本発明のがんペプチドワクチンを罹患犬から採取した末梢血中単球と共に培養し、ペプチドを提示した抗原提示細胞を誘導し製造する方法を含む。さらに、罹患犬から採取した末梢血リンパ球と共に培養し、該ペプチドを提示しているがん細胞を特異的に傷害するCTLを誘導し、製造する方法を包含する。具体的にはペプチドと上記抗原提示細胞とCD8+Ｔ細胞を共培養すればよい。さらに、このようにして製造した抗原提示細胞またはCTLを罹患犬に投与し、がんを予防し、がんを治療し、がんの転移を防止するex vivo法も包含する。 That is, the present invention comprises a method of culturing the cancer peptide vaccine of the present invention together with peripheral blood monocytes collected from an affected dog to induce and produce an antigen-presenting cell presenting the peptide. Furthermore, it includes a method of inducing and producing a CTL that specifically injures a cancer cell presenting the peptide by culturing it together with peripheral blood lymphocytes collected from an affected dog. Specifically, the peptide, the above-mentioned antigen-presenting cells, and CD8 + T cells may be co-cultured. Furthermore, it also includes an ex vivo method in which antigen-presenting cells or CTLs thus produced are administered to affected dogs to prevent cancer, treat cancer, and prevent cancer metastasis.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
材料と方法
1. 犬の末梢血液単核球(PBMC)
日本獣医生命科学大学付属動物医療センターにおける患畜犬の血液検査後の残量分（廃棄対象）を用いた。なお、患畜犬（罹患犬）血液の活用については、日本獣医生命科学大学付属動物医療センター倫理委員会において承認を得ている（H24.5/8）。犬血液（200～800μL）からのPBMC分離は、血液分離溶液Lymphoprep（STEMCELL）2mLを入れた15mL用遠心チューブ(TrueLine)を用いて、密度勾配遠心（800G、15～20分）後、単核球分画の回収によって得た。
Materials and methods
1. Canine peripheral blood mononuclear cells (PBMC)
The remaining amount (subject to disposal) after the blood test of the patient dog at the Animal Medical Center attached to NVLU Animal Medical Center of Japan was used. The use of blood from affected dogs (affected dogs) has been approved by the Ethics Committee of the Animal Medical Center, University of Japan Veterinary and Life Sciences (H24.5 / 8). PBMC separation from dog blood (200-800 μL) is performed using a 15 mL centrifuge tube (TrueLine) containing 2 mL of the blood separation solution Lymphoprep (STEMCELL), followed by density gradient centrifugation (800 G, 15-20 minutes) and then mononuclear cells. Obtained by collecting ball fractions.
2. 合成ペプチド
GenBank登録上の犬melan-A(NM_001194968)、犬survivin(AY741504)、犬TRP-2(AB766380)情報からのアミノ酸配列を入手し、プロテアソーム活性による切断部位の検索サイト（http://www.mpiib-berlin.mpg.de/MAPPP/cleavage.html）および各種MHC分子における提示されうるペプチドの検索サイト（https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/）を用いて、犬DLA-88型への提示に予測されるペプチド配列をデザインした。melan-Aについては表１に、survinvinについては表２に、TRP-2については表３に示す。これらのペプチド配列は受託サービス(Biologica)にて精製度95%以上で合成した。
2. Synthetic peptide
Amino acid sequences from dog melan-A (NM_001194968), dog survivin (AY741504), and dog TRP-2 (AB766380) information registered in GenBank were obtained, and a search site for cleavage sites based on proteasome activity (http://www.mpiib). -Berlin.mpg.de/MAPPP/cleavage.html) and search sites for peptides that can be presented in various MHC molecules (https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/) We designed a peptide sequence that is expected to be presented to DLA-88 type. Table 1 shows melan-A, Table 2 shows survinvin, and Table 3 shows TRP-2. These peptide sequences were synthesized by a contract service (Biologica) with a degree of purification of 95% or higher.
3. CD8+Ｔ細胞の精製
PBMCにFITC標識抗犬CD8抗体（Serotec）を4℃、30分間反応させ、リン酸緩衝液（PBS）で洗浄後、同様にBiotin標識抗FITC抗体（BioLegend）を4℃、30分間反応させ、PBSで洗浄した。これらの細胞にStreptavidin標識磁気ビーズ抗体（BDIMag Particles Plus DM）を4℃、15分間反応させた後、RPMI培養液で600μLまでメスアップし、専用のマグネットスタンドに6分間作用させ、CD8+Ｔ細胞（精製度90％前後）を収集し、細胞数を調節した（3～4x104/well x 6wellまたは12well）。
3. Purification of CD8 + T cells
PBMC was reacted with FITC-labeled anti-dog CD8 antibody (Serotec) at 4 ° C for 30 minutes, washed with phosphate buffer (PBS), and then similarly reacted with Biotin-labeled anti-FITC antibody (BioLegend) at 4 ° C for 30 minutes. Washed with PBS. After reacting these cells with Streptavidin-labeled magnetic bead antibody (BDIMag Particles Plus DM) at 4 ° C for 15 minutes, female up to 600 μL with RPMI culture solution, and let it act on a dedicated magnet stand for 6 minutes to produce CD8 + T cells. (Around 90% purification) was collected and the cell number was adjusted (3-4x10 4 / well x 6 well or 12 well).
4. 抗原提示細胞（APC）（樹状細胞等）への誘導
PBMCを得られた細胞数に応じて平底96wellプレート（Thermo）の6wellまたは12well分に分注し（105/well）、5％CO2、37℃で40～60分間反応させ、プレート接着細胞（4～5x104/well）を準備した。接着しなかった細胞は回収し、DNA精製後、凍結保存した。プレート接着細胞に犬リコンビナントGM-CSF 5ng/mL（PrimeGene）、犬リコンビナントIL-4 5ng/mL （Immunotechnology Co.）と各種合成ペプチド 10μg/mLとなるように各wellに添加して90～120分間の培養により抗原提示細胞（APC）へと分化誘導させた。これらのAPC はX線照射 30 Gy（CP-160型 Faxitron X-ray）により増殖活性を消失させた。
4. Induction to antigen-presenting cells (APC) (dendritic cells, etc.)
Depending on the number of cells obtained, PBMC was dispensed into 6 wells or 12 wells of a flat-bottomed 96-well plate (Thermo) (10 5 / well), reacted at 5% CO 2 , 37 ° C. for 40-60 minutes, and the plate adherent cells. (4-5x10 4 / well) was prepared. The cells that did not adhere were collected, DNA was purified, and then cryopreserved. Add to each well so that dog recombinant GM-
5. ペプチド活性のスクリーニング
増殖活性を消失させたAPCと精製したCD8+Ｔ細胞を混合培養し、10日前後で誘導されるCTL誘導の有無を経時的に鏡検し判定した（図４）。すなわち、犬末梢血は大学付属動物医療センターより検査後の余剰分を入手し、その末梢血単核球（PBMC）から磁気ビーズ抗体を用いてCD8+Ｔ細胞とプレート接着細胞に分離後、プレート接着細胞に犬リコンビナントGM-CSF/IL-4と合成ペプチドを添加して抗原提示細胞（APC）へと分化誘導させた。精製したCD8+Ｔ細胞とＸ線照射により増殖活性を消失させたAPCとを混合培養し、CD8+Ｔ細胞の活性化の有無を経時的に観察した。入手した検体の血液量および精製したCD8+Ｔ細胞の数に応じて、実施する項目数を調整した。
5. Screening for peptide activity APC with lost proliferative activity and purified CD8 + T cells were mixed and cultured, and the presence or absence of CTL induction induced around 10 days was determined by microscopic examination over time (Fig. 4). That is, dog peripheral blood is obtained from the animal medical center attached to the university, and the surplus after the test is obtained, and the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) are separated into CD8 + T cells and plate-adhered cells using magnetic bead antibodies, and then the plate is used. Dog recombinant GM-CSF / IL-4 and synthetic peptides were added to the adherent cells to induce differentiation into antigen-presenting cells (APC). Purified CD8 + T cells and APC whose proliferative activity was lost by X-ray irradiation were mixed and cultured, and the presence or absence of activation of CD8 + T cells was observed over time. The number of items to be performed was adjusted according to the blood volume of the obtained sample and the number of purified CD8 + T cells.
1.～5.までの工程のプロシージャーを図４に示す。
図５にCTL誘導を有するmelan-Aペプチドのスクリーニングの結果の例を示す。
The procedure of the
FIG. 5 shows an example of the results of screening for a melan-A peptide having CTL induction.
6. DLA-88型検査
DLA-12型は数種類しかないが、DLA-12領域においてDLA-88型が入り込むケースが検出された。そのため、DLA-88またはDLA-12領域のみを同時に増幅させるプライマーにより、それら遺伝子全領域(プロモーター領域から全てのエクソンとイントロンおよび非翻訳領域)を含む5.6～5.7kbのPCR産物を得た。その後、DLA-88特異的プライマーならびにDLA-12特異的プライマーを用いて、PCR産物を鋳型として多型に富むエクソン2～エクソン3を含む1.6kbをPCR法により増幅させた。得られるPCR産物の塩基配列をサンガー法により解読した。
6. DLA-88 type inspection
There are only a few types of DLA-12, but cases where DLA-88 entered in the DLA-12 region were detected. Therefore, a 5.6-5.7 kb PCR product containing the entire gene region (all exons, introns, and untranslated regions from the promoter region) was obtained with a primer that simultaneously amplifies only the DLA-88 or DLA-12 regions. Then, using the DLA-88-specific primer and the DLA-12-specific primer, 1.6 kb containing
塩基配列の解読が困難な場合や新規アレルの存在が考えられる場合には、PCR産物のサブクローニングを行い、そのクローンの塩基配列をサンガー法により解読することにより対処した。DLAアレルの判定にはシークエンス解析ソフトAssign(Conexio社)やSequencher ver.5.0.1(Gene Codes社)を用いて、公開されているDLA-88やDLA-12アレルを参照配列として、決定した塩基配列との比較解析を実施し、各検体が保有するDLA-88とDLA-12アレルを判定した。 When it was difficult to decipher the base sequence or the existence of a novel allele was considered, the PCR product was subcloned and the base sequence of the clone was decoded by the Sanger method. Sequence analysis software Assign (Conexio) and Sequencener ver.5.0.1 (Gene Codes) were used to determine DLA alleles, and the bases determined using the published DLA-88 and DLA-12 alleles as reference sequences. A comparative analysis with the sequence was performed to determine the DLA-88 and DLA-12 alleles possessed by each sample.
結果
Melan-Aペプチド提示DLA型の同定
現在まで692検体解析して、Melan-Aについては57検体に６種ペプチドの何れかに対してCTL誘導能があることを認めた。これらの活性のあった検体のDLA-88型のタイピングを実施した結果、DLA-88型アレルと６種ペプチドの活性を記載した表が完成した（表４）。３回以上の頻度で検出されたDLA-88型は、高親和性として003:02、017:01、501:01、028:01、029:01、508:01、nov15＊、nov25＊の８種と、２回検出されたDLA-88型は、低親和性として001:03、004:02、005:01、006:01、012:01、032:01、051:01、502:01、nov6＊、nov8＊、nov9＊、nov17＊、nov24＊の13種が判明した。
result
Identification of DLA type presented by Melan-A peptide Analysis of 692 specimens to date revealed that 57 specimens of Melan-A have CTL-inducing ability for any of the 6 peptides. As a result of typing DLA-88 type of these active samples, a table describing the activities of DLA-88 type allele and 6 kinds of peptides was completed (Table 4). DLA-88 type detected with a frequency of 3 times or more has high affinity of 003: 02, 017: 01, 501: 01, 028: 01, 029: 01, 508: 01, nov15 * ,
表４に示すように、Melan-Aペプチドml-01、ml-41、ml-70、ml-88、ml-95、ml-109を抗原提示できるDLA-88型を特定することができた。この表の見方を例として示すと、DLA-88*003:02型、DLA-88*017:01型、DLA-88*501:01型はこれら６つのペプチド全てを提示できる型であることがわかり、これらの型の犬に対して６種のペプチドをがんワクチンとして用いることができる。 As shown in Table 4, DLA-88 type capable of presenting the Melan-A peptide ml-01, ml-41, ml-70, ml-88, ml-95, and ml-109 could be identified. Taking the view of this table as an example, DLA-88 * 003: 02, DLA-88 * 017: 01, and DLA-88 * 501: 01 can present all six peptides. As you can see, six peptides can be used as cancer vaccines for these types of dogs.
一方、DLA-88*508:01型はml-41以外のml-01、ml-70、ml-88、ml-95、ml-109を抗原提示できるので、５種のペプチドをがんワクチンとして用いることができる。 On the other hand, DLA-88 * 508: 01 type can present ml-01, ml-70, ml-88, ml-95, ml-109 other than ml-41 as antigens, so 5 kinds of peptides can be used as cancer vaccines. Can be used.
同様に、DLA-88*006:01型にはml-70、ml-88、ml-95、ml-109を、DLA-88*029:01型にはml-01、ml-41、ml-88を、DLA-88*001:03型にはml-70、ml-109を（以下省略）というようにそれぞれのDLA-88型に適応したペプチドをがんワクチンとして用いることができる。 Similarly, for DLA-88 * 006: 01 type, ml-70, ml-88, ml-95, ml-109, and for DLA-88 * 029: 01 type, ml-01, ml-41, ml- Peptides adapted to each DLA-88 type, such as 88, ml-70 for DLA-88 * 001: 03 type, and ml-109 (hereinafter omitted), can be used as cancer vaccines.
Survivinペプチド提示DLA型の同定
現在まで692検体解析して、Survivinについては81検体に６種ペプチドの何れかに対してCTL誘導能があることを認めた。これらの活性のあった検体のDLA-88型のタイピングを実施した結果、DLA-88型アレルと６種ペプチドの活性を記載した表が完成した（表５）。３回以上の頻度で検出されたDLA-88型は、高親和性として003:02、004:02、006:01、012:01、017:01、028:01、029:01、034:01、501:01、502:01、508:01、nov25＊、nov37＊の13種と、２回検出されたDLA-88型は、低親和性として001:03、012:02、038:01、045:01、nov3＊、nov4＊、nov18＊の7種が判明した。
Identification of Survivin peptide-presented DLA type To date, 692 samples have been analyzed, and it was confirmed that 81 samples of Survivin have the ability to induce CTLs for any of the 6 peptides. As a result of typing DLA-88 type of these active samples, a table describing the activities of DLA-88 type allele and 6 kinds of peptides was completed (Table 5). DLA-88 type detected 3 times or more has high affinity as 003: 02, 004: 02, 006: 01, 012: 01, 017: 01, 028: 01, 029: 01, 034: 01. , 501: 01, 502: 01, 508: 01, nov25 * , nov37 * and DLA-88 type detected twice have low affinity 001: 03, 012: 02, 038: 01, Seven types of 045: 01, nov3 * , nov4 * , and nov18 * were found.
表５に示すように、survivinペプチドsv-01、sv-10、sv-19、sv-59、sv-88、sv-90を抗原提示できるDLA-88型を特定することができた。この表の見方を例として示すと、DLA-88*501:01型とDLA-88*508:01型はこれら６種のペプチド全てを提示できる型であることがわかり、これらの型の犬に対して６種のペプチドをがんワクチンとして用いることができる。 As shown in Table 5, DLA-88 type capable of presenting the survivin peptides sv-01, sv-10, sv-19, sv-59, sv-88, and sv-90 could be identified. Taking the view of this table as an example, it was found that DLA-88 * 501: 01 type and DLA-88 * 508: 01 type are types that can present all of these 6 types of peptides, and dogs of these types can be treated. On the other hand, 6 kinds of peptides can be used as a cancer vaccine.
一方、DLA-88*034:01型はsv-01以外のsv-10、sv-19、sv-59、sv-88、sv-90を抗原提示できるので、５種のペプチドをがんワクチンとして用いることができる。同様に、DLA-88*003:02型およびDLA-88*017:01型にはsv-01、sv-59、sv-88、sv-90を、DLA-88*006:01型にはsv-01、sv-10、sv-19、sv-90を、DLA-88*012:01型にはsv-01、sv-10、sv-59、sv-90を、DLA-88*028:01型とDLA-88*029:01型にはsv-01、sv-10、sv-59、sv-88を、DLA-88*004:02型にはsv-01、sv-10、sv-59を、DLA-88*nov25にはsv-19、sv-88、sv-90を、DLA-88*502:01型にはsv-10、sv-90を（以下省略）というようにそれぞれのDLA-88型に適応したペプチドをがんワクチンとして用いることができる。 On the other hand, DLA-88 * 034: 01 type can present sv-10, sv-19, sv-59, sv-88, and sv-90 other than sv-01, so 5 kinds of peptides can be used as cancer vaccines. Can be used. Similarly, sv-01, sv-59, sv-88, sv-90 for DLA-88 * 003: 02 and DLA-88 * 017: 01, and sv for DLA-88 * 006: 01. -01, sv-10, sv-19, sv-90, DLA-88 * 012: 01 type sv-01, sv-10, sv-59, sv-90, DLA-88 * 028: 01 Type and DLA-88 * 029:01 type sv-01, sv-10, sv-59, sv-88, DLA-88 * 004: 02 type sv-01, sv-10, sv-59 , Sv-19, sv-88, sv-90 for DLA-88 * nov25, sv-10, sv-90 for DLA-88 * 50 2:01 type (hereinafter omitted), and so on. A peptide adapted to type 88 can be used as a cancer vaccine.
TRP-2ペプチド提示DLA型の同定
現在まで692検体解析して、TRP-2については66検体に12種ペプチドの何れかに対してCTL誘導能があることを認めた。これらの活性のあった検体のDLA-88型のタイピングを実施した結果、DLA-88型アレルと12種ペプチドの活性を記載した表が完成した（表６）。３回以上の頻度で検出されたDLA-88型は、高親和性として001:03、003:02、004:02、006:01、017:01、028:01、029:01、039:01、051:01、501:01、508:01、nov8＊の12種と、２回検出されたDLA-88型は、低親和性として005:01、012:01、034:01、045:01、nov19＊の５種が判明した（＊;新規については系統樹解析により明らかにされる予定である）。表６に示すように、TRP-2ペプチドtrp-1～trp-12を抗原提示できるDLA-88型を特定することができた。この表の見方を例として示すと、DLA-88*004:02型とDLA-88*029:01型はこれら12種のうち８種のペプチドを提示でき、DLA-88*004:02型はtrp-4、trp-5、trp-6、trp-7、trp-9、trp-10、trp-11、trp-12を、DLA-88*029:01型はtrp-3、trp-5、trp-6、trp-7、trp-8、trp-9、trp-11、trp-12をがんワクチンとして用いることができる。
Identification of TRP-2 peptide-presented DLA type To date, 692 samples were analyzed, and it was confirmed that 66 TRP-2 samples have CTL-inducing ability for any of the 12 peptides. As a result of typing DLA-88 type of these active samples, a table describing the activities of DLA-88 type allele and 12 kinds of peptides was completed (Table 6). DLA-88 type detected with a frequency of 3 times or more has high affinity of 001: 03, 003: 02, 004: 02, 006: 01, 017: 01, 028: 01, 029: 01, 039: 01. , 051: 01, 501: 01, 508: 01, nov8 * and DLA-88 type detected twice have low affinity of 005: 01, 012: 01, 034: 01, 045: 01. , Nov19 * were found ( * ; new ones will be clarified by phylogenetic tree analysis). As shown in Table 6, it was possible to identify DLA-88 type that can present the TRP-2 peptides trp-1 to trp-12 as antigens. Taking the view of this table as an example, DLA-88 * 004: 02 and DLA-88 * 029: 01 can present 8 of these 12 peptides, and DLA-88 * 004: 02 trp-4, trp-5, trp-6, trp-7, trp-9, trp-10, trp-11, trp-12, DLA-88 * 029:01 type trp-3, trp-5, trp-6, trp-7, trp-8, trp-9, trp-11, trp-12 can be used as cancer vaccines.
一方、DLA-88*508:01型はtrp-4、trp-5、trp-6、trp-8、trp-10、trp-11、trp-12を、DLA-88*051:01型はtrp-1、trp-4、trp-5、trp-6、trp-8、trp-9、trp-11を抗原提示できるので、７種のペプチドをがんワクチンとして用いることができる。同様に、DLA-88*006:01型はtrp-1、trp-2、trp-6、trp-11、trp-12を、DLA-88*028:01型はtrp-3、trp-5、trp-9、trp-11、trp-12を、DLA-88*001:03型はtrp-3、trp-5、trp-7、trp-12を、DLA-88*012:01型はtrp-3、trp-4、trp-6、trp-12を、DLA-88*nov8型はtrp-3、trp-7、trp-9、trp-10を（以下省略）というようにそれぞれのDLA-88型に適応したペプチドをがんワクチンとして用いることができる。 On the other hand, the DLA-88 * 50 8:01 type is trp-4, trp-5, trp-6, trp-8, trp-10, trp-11, trp-12, and the DLA-88 * 051: 01 type is trp. Since -1, trp-4, trp-5, trp-6, trp-8, trp-9, and trp-11 can be presented as antigens, seven peptides can be used as cancer vaccines. Similarly, the DLA-88 * 006: 01 type has trp-1, trp-2, trp-6, trp-11, trp-12, and the DLA-88 * 02 8:01 type has trp-3, trp-5, trp-9, trp-11, trp-12, DLA-88 * 00 1:03 type trp-3, trp-5, trp-7, trp-12, DLA-88 * 012: 01 type trp- 3, trp-4, trp-6, trp-12, DLA-88 * nov8 type trp-3, trp-7, trp-9, trp-10 (hereinafter omitted), and so on. A type-adapted peptide can be used as a cancer vaccine.
このように本発明は、がん抗原特異的CTLを誘導するための犬のDLA-88型情報に基づいたがん抗原Melan-A、survivin、TRP-2の特定のアミノ酸配列のペプチドとの組合せを明らかにした点にあり、犬PBMCを用いてin vitro系で確立させたものである。これを応用した犬のメラノーマまたは腺癌などに対する免疫療法を実施する上で、予めDLA-88型の検査後、その型に適合する特定のアミノ酸配列のペプチドをがんワクチンとして用いることができる。 Thus, the present invention is combined with peptides of specific amino acid sequences of the cancer antigens Melan-A, survivin, and TRP-2 based on canine DLA-88 type information for inducing cancer antigen-specific CTLs. Was clarified, and it was established in an in vitro system using dog PBMC. In carrying out immunotherapy for canine melanoma or adenocarcinoma to which this is applied, after testing for DLA-88 type in advance, a peptide having a specific amino acid sequence suitable for the type can be used as a cancer vaccine.
犬のがん免疫応答において、in vitro系の成果が、高い確率で生体内でも同様の反応が得られることは、従来研究から示唆されており、過去の事例として、van der Bruggenらは、メラノーマ患者の血液を使ってCTLを誘導できるアミノ酸配列MAGE-1 (MZ2-E)を発表し、新しい免疫療法を提唱した(Science.1991 254(5038):1643-1647.)。その後Rosenberg SAらは実際に合成ペプチドを用いてメラノーマ患者にワクチン接種し、効果の見られたケースの臨床データを報告した(Nat Med. 1998 4(3):321-327.)。その他、今日まで多くのヒトのペプチドワクチンの症例が実施されている。 Previous studies have suggested that in vitro outcomes are more likely to be obtained in vivo in the cancer immune response of dogs, and as a past case, van der Bruggen et al. He published the amino acid sequence MAGE-1 (MZ2-E) that can induce CTL using patient's blood and proposed a new immunotherapy (Science. 1991 254 (5038): 1643-1647.). Rosenberg SA et al. Later vaccinated patients with melanoma using synthetic peptides and reported clinical data on successful cases (Nat Med. 1998 4 (3): 321-327.). In addition, many cases of human peptide vaccines have been carried out to date.
本発明のペプチドは、がんペプチドワクチンとして、犬におけるがんの治療、がんの予防、およびがんの転移予防に用いることができる。 The peptide of the present invention can be used as a cancer peptide vaccine for cancer treatment, cancer prevention, and cancer metastasis prevention in dogs.
配列番号４～２７ 合成 SEQ ID NO: 4-27 synthesis
Claims (2)
DLA-88型と各部分ペプチドの組合わせ
・DLA-88*003:02型：配列番号４、５、６、７、８及び９、
配列番号１０、１３、１４及び１５、並びに
配列番号１８、２６及び２７
・DLA-88*017:01型：配列番号４、５、６、７、８及び９
配列番号１０、１３、１４及び１５、並びに
配列番号１８、２６及び２７
・DLA-88*501:01型：配列番号４、５、６、７、８及び９、
配列番号１０、１１、１２、１３、１４及び１５、並びに
配列番号１９及び２１
・DLA-88*508:01型：配列番号４、６、７、８及び９
配列番号１０、１１、１２、１３、１４及び１５、並びに
配列番号１９、２０、２１、２３、２５、２６及び２７
・DLA-88*006:01型：配列番号６、７、８及び９
配列番号１０、１１、１２及び１５、並びに
配列番号１６、１７、２１、２６及び２７
・DLA-88*029:01型：配列番号４、５及び７
配列番号１０、１１、１３及び１４、並びに
配列番号１８、２０、２１、２２、２３、２４、２６及び２７
・DLA-88*nov25型：配列番号４、６及び７、並びに
配列番号１２、１４及び１５
・DLA-88*001:03型：配列番号６及び９
配列番号１５、並びに
配列番号１８、２０、２２及び２７
・DLA-88*005:01型：配列番号４及び６、並びに
配列番号１９及び２６
・DLA-88*012:01型：配列番号４及び５
配列番号１０、１１、１３及び１５、並びに
配列番号１８、１９、２１及び２７
・DLA-88*028:01型：配列番号４及び５
配列番号１０、１１、１３及び１４、並びに
配列番号１８、２０、２４、２６及び２７
・DLA-88*nov8型：配列番号５及び９、並びに
配列番号１８、２２、２４及び２５
・DLA-88*502:01型：配列番号５及び９、並びに
配列番号１１及び１５
・DLA-88*nov15型：配列番号６及び７
・DLA-88*nov17型：配列番号５及び６
・DLA-88*051:01型：配列番号４、並びに
配列番号１６、１９、２０、２１、２３、２４及び２６
・DLA-88*nov24型：配列番号４
・DLA-88*004:02型：配列番号５
配列番号１０、１１及び１３、並びに
配列番号１９、２０、２１、２２、２４、２５、２６及び２７
・DLA-88*032:01型：配列番号５
・DLA-88*nov6型：配列番号５
・DLA-88*nov9型：配列番号８
・DLA-88*034:01型：配列番号１１、１２、１３、１４及び１５、並びに
配列番号１６、１７及び２０
・DLA-88*nov3型：配列番号１０及び１１
・DLA-88*045:01型：配列番号１０及び１４、並びに
配列番号１７
・DLA-88*002:01型：配列番号１２
・DLA-88*nov4型：配列番号１５
・DLA-88*012:02型：配列番号１１
・DLA-88*nov18型：配列番号１４
・DLA-88*nov37型：配列番号１０
・DLA-88*038:01型：配列番号１０
・DLA-88*039:01型：配列番号２４及び２７
・DLA-88*nov19型：配列番号２７
、および選択したペプチドをがんに罹患している犬に投与する工程を含む、犬におけるがんの予防、がんの治療またはがんの転移を防止する方法。 The step of determining DLA-88 type in a dog suffering from cancer, melan consisting of at least one peptide that DLA-88 type can present and the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 4-9. -Select at least one of the partial peptide of survivin consisting of the partial peptide of A, the amino acid sequence represented by SEQ ID NOs: 10 to 15, and the partial peptide of TRP-2 represented by SEQ ID NOs: 16 to 27 from the following combinations. Process,
Combination of DLA-88 type and each partial peptide
-DLA-88 * 003: 02 type: SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8 and 9,
SEQ ID NOs: 10, 13, 14 and 15, and
SEQ ID NOs: 18, 26 and 27
-DLA-88 * 017: 01 type: SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8 and 9
SEQ ID NOs: 10, 13, 14 and 15, and
SEQ ID NOs: 18, 26 and 27
-DLA-88 * 501: 01 type: SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 8 and 9,
SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 and 15, and
SEQ ID NOs: 19 and 21
-DLA-88 * 508: 01 type: SEQ ID NO: 4, 6, 7, 8 and 9
SEQ ID NOs: 10, 11, 12, 13, 14 and 15, and
SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 23, 25, 26 and 27
-DLA-88 * 006: 01 type: SEQ ID NOs: 6, 7, 8 and 9
SEQ ID NOs: 10, 11, 12 and 15, and
SEQ ID NOs: 16, 17, 21, 26 and 27
-DLA-88 * 029:01 type: SEQ ID NOs: 4, 5 and 7
SEQ ID NOs: 10, 11, 13 and 14, and
SEQ ID NOs: 18, 20, 21, 22, 23, 24, 26 and 27
-DLA-88 * nov25 type: SEQ ID NOs: 4, 6 and 7, and
SEQ ID NOs: 12, 14 and 15
-DLA-88 * 00 1: 03 type: SEQ ID NOs: 6 and 9
SEQ ID NO: 15, as well
SEQ ID NOs: 18, 20, 22 and 27
-DLA-88 * 005: 01 type: SEQ ID NOs: 4 and 6, and
SEQ ID NOs: 19 and 26
-DLA-88 * 012: 01 type: SEQ ID NOs: 4 and 5
SEQ ID NOs: 10, 11, 13 and 15, and
SEQ ID NOs: 18, 19, 21 and 27
-DLA-88 * 028: 01 type: SEQ ID NOs: 4 and 5
SEQ ID NOs: 10, 11, 13 and 14, and
SEQ ID NOs: 18, 20, 24, 26 and 27
-DLA-88 * nov8 type: SEQ ID NOs: 5 and 9, and
SEQ ID NOs: 18, 22, 24 and 25
-DLA-88 * 50 2: 01 type: SEQ ID NOs: 5 and 9, and
SEQ ID NOs: 11 and 15
-DLA-88 * nov15 type: SEQ ID NOs: 6 and 7
-DLA-88 * nov17 type: SEQ ID NOs: 5 and 6
-DLA-88 * 051: 01 type: SEQ ID NO: 4, and
SEQ ID NOs: 16, 19, 20, 21, 23, 24 and 26
-DLA-88 * nov24 type: SEQ ID NO: 4
-DLA-88 * 004: 02 type: SEQ ID NO: 5
SEQ ID NOs: 10, 11 and 13, and
SEQ ID NOs: 19, 20, 21, 22, 24, 25, 26 and 27
-DLA-88 * 032: 01 type: SEQ ID NO: 5
-DLA-88 * nov6 type: SEQ ID NO: 5
-DLA-88 * nov9 type: SEQ ID NO: 8
-DLA-88 * 034: 01 type: SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 and 15, and
SEQ ID NOs: 16, 17 and 20
-DLA-88 * nov3 type: SEQ ID NOs: 10 and 11
-DLA-88 * 045: 01 type: SEQ ID NOs: 10 and 14, and
SEQ ID NO: 17
-DLA-88 * 002: 01 type: SEQ ID NO: 12
-DLA-88 * nov4 type: SEQ ID NO: 15
-DLA-88 * 012: 02 type: SEQ ID NO: 11
-DLA-88 * nov18 type: SEQ ID NO: 14
-DLA-88 * nov37 type: SEQ ID NO: 10
-DLA-88 * 038: 01 type: SEQ ID NO: 10
-DLA-88 * 039: 01 type: SEQ ID NOs: 24 and 27
-DLA-88 * nov19 type: SEQ ID NO: 27
, And methods of preventing cancer prevention, cancer treatment or cancer metastasis in dogs, comprising the step of administering the selected peptide to a dog suffering from cancer .
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