JP6976652B2 - Particle separation method, separation device and separation system - Google Patents
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本開示は、粒子の分離方法、分離装置及び分離システムに関する。本開示は、とりわけ、懸濁液中に含まれる標識された粒子と標識されていない粒子とを分離する方法、それに用いる分離装置及び分離システムに関する。 The present disclosure relates to particle separation methods, separation devices and separation systems. The present disclosure relates, among other things, to methods of separating labeled and unlabeled particles contained in suspensions, separation devices and separation systems used therein.
複数種類の粒子を含む懸濁液から目的の粒子を分離する方法としては、例えば、予め目的粒子を磁気等により標識し、標識された目的粒子を磁石等により引き寄せた状態で懸濁液を除去することによって目的粒子とその他の粒子とを分離する方法がある（例えば、特許文献１）。特許文献１には、磁気標識された細胞を含む試料を、磁束を発生させた管内に導入すること、前記磁束によって磁気標識された細胞を管壁にひきつけつつ、磁気標識された細胞以外の細胞（磁気標識されていない細胞）の管壁への接着を抑制すること、管内の試料を外部に排出すること、及び磁束を終了して管壁から磁気標識された細胞を分離し、液体で洗い流すことにより回収することにより、目的の細胞を分離及び回収する方法を開示する。
As a method for separating the target particles from the suspension containing a plurality of types of particles, for example, the target particles are previously labeled with magnetic force or the like, and the suspension is removed in a state where the labeled target particles are attracted by a magnet or the like. There is a method of separating the target particle and other particles by doing so (for example, Patent Document 1). In
上記の特許文献１のように、一般的には、目的の粒子を標識することにより分離が行われる（ポジティブ選択）。この方法では、標識された目的粒子を磁気等によって捕捉し、その状態で、それ以外の標識されていない粒子を除去することによって分離を行い、その後、磁気等による捕捉を解除することによって目的粒子が回収される。
As in
しかしながら、試料中に含まれる目的粒子の数が、それ以外の粒子よりも少ない場合、上記の方法では、分離精度の問題や、分離後の目的粒子を十分な精度で回収できない場合がある。
本開示は、一又は複数の実施形態において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを効率よく分離し、かつ標識されていない粒子を高い精度で回収可能な方法、分離装置及び分離システムを提供する。
However, when the number of target particles contained in the sample is smaller than that of other particles, the above method may have a problem of separation accuracy or may not be able to recover the target particles after separation with sufficient accuracy.
The present disclosure discloses a method, separation device and separation system capable of efficiently separating labeled and unlabeled particles and recovering unlabeled particles with high accuracy in one or more embodiments. I will provide a.
本開示は、一態様において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを分離する方法であって、流路の一端から、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給すること、前記流路内において、前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させること、前記標識されている粒子を流路内壁面に固定すること、及び前記標識されている粒子が流路内壁面に固定された状態で、前記流路の一端から流路内に気相を導入して前記流路の他端から前記流路内の懸濁液を排出し、前記標識されていない粒子を回収することを含む分離方法に関する。 The present disclosure, in one embodiment, is a method of separating labeled and unlabeled particles from one end of the flow path, the suspension comprising labeled and unlabeled particles. Supplying the liquid, deflecting the labeled particles in the flow path in a direction different from the direction of gravity, fixing the labeled particles to the inner wall surface of the flow path, and the labeling. In a state where the particles are fixed to the inner wall surface of the flow path, a gas phase is introduced into the flow path from one end of the flow path, and the suspension in the flow path is discharged from the other end of the flow path. , The method of separation comprising recovering the unlabeled particles.
本開示は、一態様において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを分離するための装置であって、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給可能な流路と、前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させ、流路内壁面に固定する手段と、前記流路内の懸濁液を排出するための気相を導入するための導入手段とを有する分離装置に関する。 The present disclosure is, in one embodiment, a device for separating labeled and unlabeled particles, capable of supplying a suspension comprising labeled and unlabeled particles. Introduces a means for deflecting the labeled particles in a direction different from the direction of gravity and fixing them to the inner wall surface of the flow path, and a gas phase for discharging the suspension in the flow path. With respect to a separation device having an introduction means for
本開示は、一態様において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを分離するためのシステムであって、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給可能な流路、及び前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させ、流路内壁面に固定する手段を有する分離部と、前記流路内の懸濁液を排出するための気相を導入するための導入手段とによって構成された分離システムに関する。 The present disclosure is, in one embodiment, a system for separating labeled and unlabeled particles, capable of supplying a suspension comprising labeled and unlabeled particles. For discharging the suspension in the flow path, the separation portion having a means for deflecting the water flow path and the labeled particles in a direction different from the direction of gravity and fixing the particles to the inner wall surface of the flow path. It relates to a separation system composed of introduction means for introducing a gas phase.
本開示によれば、一態様において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを効率よく分離することができ、標識されていない粒子を高い精度で回収できる。 According to the present disclosure, in one embodiment, labeled particles and unlabeled particles can be efficiently separated, and unlabeled particles can be recovered with high accuracy.
特許文献１のように、管内で磁気分離することにより目的の細胞を分離及び回収することが行われている。管内で磁気分離する手法は、流路構造を持つためシステム化や装置化しやすいという利点や、管の内径を小さくすることで標識した粒子懸濁液と磁気との距離を近くすることができるという利点がある。特に磁気を用いる場合、磁力は距離の二乗に反比例するため、距離を近づけることによる磁気分離の性能向上は極めて重要である。しかしながら、この方法にはいくつか課題が残されている。
１つ目は、回収したい細胞を管内から効率的に回収することが困難である点である。ポジティブ選択であれ、ネガティブ選択であれ、回収したい粒子は磁力や重力等によって管の壁へ集められる。壁に集められた粒子を回収するために、一般的には管内に液体を送液するが、管の壁面は液流れが生じにくく、管の中央は速い速度で液は流れるが、壁面の速度は極めて遅い。このため、送液によって効率的に壁面の細胞を移動させることが困難となり、結果として目的の粒子の回収率を低下させる。
２つ目は、管内で処理（分離）する前の液量に対して、管内で処理（分離）後の回収液量を維持する又は削減することが困難、すなわち分離処理後の回収液の液量が処理前の液量と比較して増加する傾向があるため、稀少な粒子の取り扱いとして適さない点である。
１つ目の課題である回収したい粒子の回収効率が悪いことを補うための手段としては、例えば、追加の送液を行うことで回収されなかった粒子を回収する手段がある。しかしながらこの場合、処理後の回収液量が増えることになる。回収対象の粒子が稀少な粒子である場合、回収液量が増えると粒子の濃度が極めて薄くなり、取り扱いが困難となる。稀少な粒子を扱う場合は、むしろ回収液量を減らして少量での取り扱いが望まれるため、稀少な粒子の取り扱いとして適していない。
As in
The first is that it is difficult to efficiently collect the cells to be collected from the tube. Regardless of whether it is a positive selection or a negative selection, the particles to be collected are collected on the wall of the tube by magnetic force, gravity, or the like. In order to collect the particles collected on the wall, the liquid is generally sent into the pipe, but the liquid flow is difficult to occur on the wall surface of the pipe, and the liquid flows at a high speed in the center of the pipe, but the speed of the wall surface. Is extremely slow. Therefore, it becomes difficult to efficiently move the cells on the wall surface by the liquid feeding, and as a result, the recovery rate of the target particles is lowered.
The second is that it is difficult to maintain or reduce the amount of recovered liquid after treatment (separation) in the pipe with respect to the amount of liquid before treatment (separation) in the pipe, that is, the liquid of the recovered liquid after separation treatment. Since the amount tends to increase as compared with the amount of the liquid before the treatment, it is not suitable for handling rare particles.
As a means for compensating for the poor recovery efficiency of the particles to be recovered, which is the first problem, for example, there is a means for recovering the particles that have not been recovered by performing additional liquid feeding. However, in this case, the amount of recovered liquid after the treatment increases. When the particles to be recovered are rare particles, the concentration of the particles becomes extremely thin as the amount of the recovered liquid increases, which makes handling difficult. When handling rare particles, it is rather desirable to reduce the amount of recovered liquid and handle it in a small amount, so it is not suitable for handling rare particles.
本開示は、一態様において、分離を行う懸濁液中に含まれる目的粒子（検出対象の粒子）の数が少ない場合、検出対象外の粒子を標識して分離することによって、検出対象の粒子の分離及び回収精度を向上できる、という本発明者が見出した新たな知見に基づく。
また、本開示は、一態様において、検出対象の粒子を流路の底面側に移動させ、かつ検出対象外の粒子を流路の底面以外の部分に捕捉（固定）した状態で、流路内に気相を導入し流路内の懸濁液を回収することによって、検出対象の粒子の分離及び回収精度を向上できる、という本発明者が見出した新たな知見に基づく。
In one aspect of the present disclosure, when the number of target particles (particles to be detected) contained in the suspension to be separated is small, the particles to be detected are labeled and separated by labeling the particles not to be detected. Based on the new finding found by the present inventor that the separation and recovery accuracy of the particles can be improved.
Further, in one aspect of the present disclosure, the particles to be detected are moved to the bottom surface side of the flow path, and the particles not to be detected are captured (fixed) in a portion other than the bottom surface of the flow path in the flow path. It is based on the new finding found by the present inventor that the separation and recovery accuracy of the particles to be detected can be improved by introducing a gas phase into the water and recovering the suspension in the flow path.
本開示によって、検出対象の粒子を高い精度で分離し、回収できるメカニズムは明らかではないが、以下のように推測される。
検出対象の粒子を含む懸濁液が存在する流路に気相を導入すると流路内に気液界面が形成される。さらに気相を導入することによって気液界面に押出圧力が加わり、気液界面が流入口側から流出口側に向かって流路内を移動する。この気液界面の移動によって、懸濁液とともに流路内の検出対象の粒子は押し出されるが、検出対象外の粒子は流路内に捕捉（固定）されているため押し出されることなく保持される。また、検出対象外の粒子が、検出対象の粒子とは異なる流路の壁面に捕捉されていれば、検出対象の粒子が押し出される際の障害になることなく、スムーズに検出対象の粒子を押し出すことができる。この結果、検出対象の粒子を高い精度で分離し、回収できると考えられる。ただし、本開示はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。
According to the present disclosure, the mechanism by which the particles to be detected can be separated and recovered with high accuracy is not clear, but it is presumed as follows.
When a gas phase is introduced into a flow path in which a suspension containing particles to be detected exists, a gas-liquid interface is formed in the flow path. Further introduction of the gas phase applies an extrusion pressure to the gas-liquid interface, and the gas-liquid interface moves in the flow path from the inlet side to the outlet side. Due to this movement of the gas-liquid interface, the particles to be detected in the flow path are extruded together with the suspension, but the particles not to be detected are trapped (fixed) in the flow path and are retained without being extruded. .. Further, if the particles to be detected are captured on the wall surface of the flow path different from the particles to be detected, the particles to be detected are smoothly extruded without being an obstacle when the particles to be detected are extruded. be able to. As a result, it is considered that the particles to be detected can be separated and recovered with high accuracy. However, the present disclosure may not be construed as being limited to these mechanisms.
血中循環腫瘍細胞／Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ（ＣＴＣ）等の稀少細胞は、通常、１０ｍｌの血液中に通常０〜１０個程度しか含まれていない。本開示の方法によれば、一又は複数の実施形態において、稀少細胞よりも多量に白血球を含有する試料から、稀少細胞と白血球とを分離し、稀少細胞を高い回収率で回収することができる。血液中のＣＴＣ数は、転移性のがんの治療効果の判定や予後予測の因子としての有用性が認められており、より正確な分析を行うことが求められている。よって、本開示の方法は、一又は複数の実施形態において、これらの分野における治療効果の判定及び予後予測においてきわめて重要な技術であるといえる。 Rare cells such as circulating tumor cells / Circulating Tumor Cell (CTC) are usually contained in 10 ml of blood in an amount of usually only about 0 to 10. According to the method of the present disclosure, in one or more embodiments, rare cells and leukocytes can be separated from a sample containing leukocytes in a larger amount than rare cells, and the rare cells can be recovered with a high recovery rate. .. The number of CTCs in blood has been confirmed to be useful as a factor for determining the therapeutic effect of metastatic cancer and predicting prognosis, and more accurate analysis is required. Therefore, it can be said that the method of the present disclosure is an extremely important technique for determining the therapeutic effect and predicting the prognosis in these fields in one or more embodiments.
［分離方法］
本開示は、一態様において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを分離する方法（本開示の分離方法）に関する。本開示の分離方法は、流路の一端から、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給すること、前記流路内において、前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させること、前記標識されている粒子を流路内壁面に固定すること、及び前記標識されている粒子が流路内壁面に固定された状態で、前記流路の一端から流路内に気相を導入して前記流路の他端から前記流路内の懸濁液を排出し、前記標識されていない粒子を回収することを含む。本開示の分離方法によれば、一又は複数の実施形態において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを高い精度で分離することができるとともに、標識されていない粒子を高い精度で回収することができる。
[Separation method]
The present disclosure relates to, in one embodiment, a method of separating labeled and unlabeled particles (separation method of the present disclosure). The separation method of the present disclosure is to supply a suspension containing labeled particles and unlabeled particles from one end of the flow path, and in the flow path, the labeled particles are subjected to gravity. One end of the flow path is deflected in a direction different from the direction, the labeled particles are fixed to the inner wall surface of the flow path, and the labeled particles are fixed to the inner wall surface of the flow path. Includes introducing a gas phase into the flow path from the channel, discharging the suspension in the flow path from the other end of the flow path, and recovering the unlabeled particles. According to the separation method of the present disclosure, in one or more embodiments, labeled particles and unlabeled particles can be separated with high accuracy, and unlabeled particles can be recovered with high accuracy. can do.
本開示の分離方法は、流路の一端から、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給することを含む。これにより、懸濁液を流路内に充填する。 The separation method of the present disclosure comprises supplying a suspension containing labeled and unlabeled particles from one end of the flow path. This fills the flow path with the suspension.
流路は、一又は複数の実施形態において、流入口と流出口とを有する。流路の長手方向の長さは、一又は複数の実施形態において、流路中での標識されていない粒子（目的粒子）のロスを低減する点から、８０ｃｍ以下、６０ｃｍ以下若しくは４０ｃｍ以下であり、又は２ｃｍ以上、５ｃｍ以上若しくは１０ｃｍ以上である。 The flow path has an inlet and an outlet in one or more embodiments. The longitudinal length of the flow path is 80 cm or less, 60 cm or less or 40 cm or less from the viewpoint of reducing the loss of unlabeled particles (target particles) in the flow path in one or more embodiments. , Or 2 cm or more, 5 cm or more, or 10 cm or more.
流路の内径は、一又は複数の実施形態において、安定した気液界面を形成でき、標識されていない粒子の回収精度をより向上できる点から、５０ｍｍ以下、２０ｍｍ以下若しくは１０ｍｍ以下であり、又は０．５ｍｍ以上、１ｍｍ以上若しくは２ｍｍ以上である。 The inner diameter of the flow path is 50 mm or less, 20 mm or less, or 10 mm or less, or 10 mm or less, because in one or more embodiments, a stable gas-liquid interface can be formed and the recovery accuracy of unlabeled particles can be further improved. It is 0.5 mm or more, 1 mm or more, or 2 mm or more.
流路の体積は、一又は複数の実施形態において、標識されていない粒子の回収精度をより向上できる点から、１，００００μｌ以下、５，０００μｌ以下若しくは２，０００μｌ以下であり、又は１０μｌ以上、５０μｌ以上若しくは１００μｌ以上である。 The volume of the flow path is 1,000 μl or less, 5,000 μl or less, 2,000 μl or less, or 10 μl or more, from the viewpoint of further improving the recovery accuracy of unlabeled particles in one or more embodiments. It is 50 μl or more or 100 μl or more.
流路は、流入口と流出口との直線方向（流路の長手方向）に対して直交する断面形状が、一又は複数の実施形態において、円形、楕円形、矩形や、三角形、四角形、五角形、六角形、七角形及び八角形等の多角形等が挙げられる。路中での標識されていない粒子（目的粒子）のロスを防止する点から、円形又は楕円形が好ましい。流路の形状は、一又は複数の実施形態において、中空状の円筒形状、略直方体形状又は多角形筒状等が挙げられる。 The flow path has a cross-sectional shape orthogonal to the linear direction (longitudinal direction of the flow path) between the inlet and the outlet in one or more embodiments, such as a circle, an ellipse, a rectangle, a triangle, a quadrangle, or a pentagon. , Hexagon, heptagon, octagon and other polygons. A circular or elliptical shape is preferable from the viewpoint of preventing loss of unlabeled particles (target particles) in the road. Examples of the shape of the flow path include a hollow cylindrical shape, a substantially rectangular parallelepiped shape, a polygonal tubular shape, and the like in one or a plurality of embodiments.
流路は、一又は複数の実施形態において、垂直方向（重力方向）に対して直交する方向（略水平方向）に配置されることが好ましい。 In one or more embodiments, the flow paths are preferably arranged in a direction (substantially horizontal) orthogonal to the vertical direction (gravitational direction).
本開示の分離方法の一又は複数の実施形態において、標識されていない粒子が検出対象の粒子（目的粒子）であり、標識されている粒子が検出対象外の粒子である。懸濁液は、一又は複数の実施形態において、標識されていない粒子よりも標識されている粒子を多く含む。懸濁液における標識されている粒子に対する標識されていない粒子の割合（［標識されていない粒子］／［標識されている粒子］）は、一又は複数の実施形態において、１％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、０．１％以下又は０．０９％以下である。本開示の分離方法は、一又は複数の実施形態において、標識されていない粒子よりも標識されている粒子を多く含む懸濁液から、標識されていない粒子を分離・回収する場合に有用な技術である。 In one or more embodiments of the separation method of the present disclosure, the unlabeled particles are the particles to be detected (target particles), and the labeled particles are the particles not to be detected. The suspension contains more labeled particles than unlabeled particles in one or more embodiments. The ratio of unlabeled particles to labeled particles in the suspension ([unlabeled particles] / [labeled particles]) is 1% or less, 0. 5% or less, 0.4% or less, 0.3% or less, 0.2% or less, 0.1% or less or 0.09% or less. The separation method of the present disclosure is a technique useful for separating and recovering unlabeled particles from a suspension containing more labeled particles than unlabeled particles in one or more embodiments. Is.
粒子の標識は、一又は複数の実施形態において、磁気標識又は金属標識等が挙げられる。磁気標識の場合、粒子の標識は、一又は複数の実施形態において、粒子の結合分子と、磁性ビーズ（磁気ビーズ）の表面に固定された物質（結合分子に特異的に反応する物質）とが結合して粒子に磁気ビーズが固定化されることにより行うことができる。磁性ビーズに固定される物質は、一又は複数の実施形態において、標識する粒子の結合分子に応じて適宜決定できる。磁性ビーズとしては、一又は複数の実施形態において、表面にアビジンが固定された磁性ビーズ、表面にストレプトアビジンが固定された磁性ビーズ、表面にニュートラアビジンが固定された磁性ビーズ、表面にビオチンが固定された磁性ビーズ、表面にビオチン誘導体が固定された磁性ビーズ、表面に抗体が固定された磁性ビーズ、表面に抗原が固定された磁性ビーズ等があげられる。磁性ビーズのサイズは、特に制限されるものではなく、標識対象となる粒子のサイズに応じて適宜決定できる。標識対象となる粒子のサイズが、白血球やＣＴＣのように直径が５〜２０μｍである場合、一又は複数の実施形態において、標識効率向上の点から、１μｍ以下、８００μｍ以下、又は５００μｍ以下である。また、磁気応答性の点から、５０μｍ以上、又は１００μｍ以上である。 Particle labeling may include, in one or more embodiments, magnetic labeling, metal labeling, and the like. In the case of a magnetic label, in one or more embodiments, the particle label is composed of a bound molecule of the particle and a substance immobilized on the surface of the magnetic bead (magnetic bead) (a substance that specifically reacts with the bound molecule). This can be done by binding and immobilizing the magnetic beads on the particles. The substance to be immobilized on the magnetic beads can be appropriately determined depending on the binding molecule of the particles to be labeled in one or more embodiments. As the magnetic beads, in one or more embodiments, magnetic beads having avidin fixed on the surface, magnetic beads having streptavidin fixed on the surface, magnetic beads having neutral avidin fixed on the surface, and biotin fixed on the surface. Examples thereof include magnetic beads on which a biotin derivative is immobilized on the surface, magnetic beads on which an antibody is immobilized on the surface, magnetic beads on which an antigen is immobilized on the surface, and the like. The size of the magnetic beads is not particularly limited and can be appropriately determined according to the size of the particles to be labeled. When the size of the particle to be labeled has a diameter of 5 to 20 μm such as leukocytes or CTC, it is 1 μm or less, 800 μm or less, or 500 μm or less from the viewpoint of improving labeling efficiency in one or more embodiments. .. Further, from the viewpoint of magnetic responsiveness, it is 50 μm or more, or 100 μm or more.
懸濁液の供給は、一又は複数の実施形態において、流路の他端（懸濁液の供給側とは反対側の流路の端）が閉じられた状態で行われることが好ましい。流路内に供給された懸濁液は、一又は複数の実施形態において、略全量が流路内に充填することが好ましい。懸濁液の供給は、流路への懸濁液の充填をスムーズに行う点から、流路内に磁界又は電界を生じさせない状態で行うことが好ましい。 In one or more embodiments, the suspension is preferably supplied with the other end of the flow path (the end of the flow path opposite to the suspension supply side) closed. It is preferable that substantially the entire amount of the suspension supplied into the flow path is filled in the flow path in one or more embodiments. The suspension is preferably supplied in a state where a magnetic field or an electric field is not generated in the flow path from the viewpoint of smoothly filling the flow path with the suspension.
流路に供給する懸濁液の量は、一又は複数の実施形態において、標識されていない粒子の回収精度をより向上できる点から、１０，０００μｌ以下、５，０００μｌ以下若しくは２，０００μｌ以下であり、又は１０μｌ以上、５０μｌ以上若しくは１００μｌ以上である。 The amount of suspension supplied to the flow path is 10,000 μl or less, 5,000 μl or less, or 2,000 μl or less, in that the recovery accuracy of unlabeled particles can be further improved in one or more embodiments. Yes, or 10 μl or more, 50 μl or more, or 100 μl or more.
本開示の分離方法は、一又は複数の実施形態において、充填された懸濁液を静置することを含んでもよい。これにより、標識されていない粒子を、該粒子に作用する重量等を利用することによって、標識されていない粒子を流路の底面側に移動させることができる。静置時間は、細胞の沈降速度と効率的な磁気分離の点から、一又は複数の実施形態において、１分以上、５分以上若しくは１０分以上であり、又は６０分以下若しくは３０分以下である。 The separation method of the present disclosure may include, in one or more embodiments, allowing the filled suspension to stand. Thereby, the unlabeled particles can be moved to the bottom surface side of the flow path by utilizing the weight acting on the particles or the like. The standing time is 1 minute or more, 5 minutes or more or 10 minutes or more, or 60 minutes or less or 30 minutes or less in one or more embodiments in terms of cell sedimentation rate and efficient magnetic separation. be.
本開示の分離方法は、流路内において、標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させることを含む。 The separation method of the present disclosure comprises deflecting the labeled particles in a flow path in a direction different from the direction of gravity.
偏向は、一又は複数の実施形態において、流路内に磁界又は電界を生じさせることにより行うことができる。磁界又は電界は、一又は複数の実施形態において、流路の長手方向全体に発生させてもよいし、流路の一部に発生させていてもよい。
標識されている粒子を標識されていない粒子とは異なる方向、つまり重力方向とは異なる方向に偏向させることとしては、一又は複数の実施形態において、標識されていない粒子を流路の底面側に移動させ、かつ標識されている粒子を流路の底面以外の部分に移動させることにより行うことができる。磁界は、一又は複数の実施形態において、流路の磁場照射体を配置すること等により行うことができる。配置箇所は、標識されている粒子を偏向させる方向に応じて適宜決定でき、流路の底面以外の部分に移動させる場合は、一又は複数の実施形態において、流路の上部及び側面の少なくとも一方に配置すればよく、流路上面に配置した場合と比較して弱い磁界で標識されている粒子を偏向できることから、流路の側面の一方又は双方に配置することが好ましい。磁場照射体は、一又は複数の実施形態において、流路の長手方向にわたって配置してもよいし、流路の長手方向の少なくとも一部に配置してもよい。磁場照射体の数は、一又は複数の実施形態において、１個であってもよいし、２個以上の複数であってもよい。磁場照射体としては、一又は複数の実施形態において、磁石又は電磁石等が挙げられる。
Deflection can be done in one or more embodiments by creating a magnetic field or electric field in the flow path. In one or more embodiments, the magnetic field or electric field may be generated in the entire longitudinal direction of the flow path, or may be generated in a part of the flow path.
To deflect the labeled particles in a direction different from the unlabeled particles, that is, in a direction different from the direction of gravity, in one or more embodiments, the unlabeled particles are placed on the bottom side of the flow path. This can be done by moving and moving the labeled particles to a portion other than the bottom of the flow path. The magnetic field can be generated by arranging a magnetic field irradiator in the flow path in one or more embodiments. The placement location can be appropriately determined according to the direction in which the labeled particles are deflected, and when moving to a portion other than the bottom surface of the flow path, in one or more embodiments, at least one of the upper part and the side surface of the flow path. It is preferable to arrange the particles on one or both of the side surfaces of the flow path because the particles labeled with a weak magnetic field can be deflected as compared with the case where the particles are arranged on the upper surface of the flow path. In one or more embodiments, the magnetic field irradiator may be arranged over the longitudinal direction of the flow path or at least a portion of the longitudinal direction of the flow path. In one or more embodiments, the number of magnetic field irradiators may be one, or may be two or more. Examples of the magnetic field irradiator include magnets, electromagnets, and the like in one or more embodiments.
本開示の分離方法は、一又は複数の実施形態において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を流路内で静置することにより、標識されていない粒子に作用する重力を利用して標識されていない粒子を流路の底面側に移動させること、及び、流路内に磁界又は電界を生じさせることにより、標識されている粒子を流路の底面以外の部分に移動させることを含む。 The separation method of the present disclosure acts on unlabeled particles in one or more embodiments by allowing a suspension containing labeled and unlabeled particles to stand in a flow path. By using the force of gravity to move unlabeled particles to the bottom surface side of the flow path and by creating a magnetic field or electric field in the flow path, the labeled particles can be moved to a part other than the bottom surface of the flow path. Including moving to.
本開示の分離方法は、偏向させた標識されている粒子を流路内壁面に固定することを含む。 The separation method of the present disclosure comprises fixing the deflected labeled particles to the inner wall surface of the flow path.
固定は、標識されている粒子の標識方法によって適宜決定できる。標識されている粒子が磁気標識されている粒子である場合、固定は、流路内に磁界を発生させることにより行うことができる。 Immobilization can be appropriately determined by the labeling method of the labeled particles. When the labeled particles are magnetically labeled particles, fixation can be performed by generating a magnetic field in the flow path.
本開示の分離方法における一又は複数の実施形態において、懸濁液の静置、並びに標識されている粒子の偏向及び固定は同時に行ってもよいし、別々のタイミングで行ってもよい。 In one or more embodiments of the separation method of the present disclosure, the suspension may be allowed to stand, and the labeled particles may be deflected and fixed at the same time or at different timings.
本開示の分離方法は、一又は複数の実施形態において、標識されている粒子が流路内壁面に固定された状態で、気相を流路の一端から流路内に導入して流路の他端から流路内の懸濁液を排出し、標識されていない粒子を回収することを含む。気相を導入することにより、気液界面の移動によって懸濁液を排出させて流路内の標識されていない粒子を押し出すことにより、効率よく粒子を回収することができる。また、気相を導入することにより、粒子回収時の液量を、分離前の懸濁液の液量と同量又は少ない量にすることが可能である。 In the separation method of the present disclosure, in one or more embodiments, a gas phase is introduced into the flow path from one end of the flow path in a state where the labeled particles are fixed to the inner wall surface of the flow path. It involves draining the suspension in the flow path from the other end and collecting unlabeled particles. By introducing the gas phase, the suspension can be discharged by the movement of the gas-liquid interface to push out the unlabeled particles in the flow path, so that the particles can be efficiently recovered. Further, by introducing a gas phase, it is possible to make the liquid amount at the time of particle recovery the same as or smaller than the liquid amount of the suspension before separation.
本開示における「気相」とは、気体によって構成される相のことをいう。気相の導入は、一又は複数の実施形態において、導入された気相の圧力で流路内の懸濁液を標識されていない粒子とともに流路の他端側から排出されるように行うことができる。気相の導入は、一又は複数の実施形態において、流路内の懸濁液と導入した気相との間に気液界面が形成されるように行うことができ、さらには、この気液界面が流路の一端（流入口）から他端（流出口）に向かって移動するように行うことができる。本開示において導入される気相は、一又は複数の実施形態において、流路の内壁面において、点でも線でもない一定の領域を占拠することが好ましく、気相がこのような形態をとる場合、泡とは相違するものとなる。また、気相を導入することにより形成される気液界面と流路の内壁面との接触点は、一又は複数の実施形態において、連続したラインを形成している。気体としては、一又は複数の実施形態において、空気、酸素、窒素、アルゴン又は炭酸ガス等が使用できる。 The "gas phase" in the present disclosure refers to a phase composed of a gas. The introduction of the gas phase is carried out in one or more embodiments so that the pressure of the introduced gas phase causes the suspension in the flow path to be discharged from the other end of the flow path together with unlabeled particles. Can be done. The introduction of the gas phase can be carried out in one or more embodiments so that a gas-liquid interface is formed between the suspension in the flow path and the introduced gas phase, and further, this gas-liquid can be introduced. The interface can be moved from one end (inlet) of the flow path to the other end (outlet). In one or more embodiments, the gas phase introduced in the present disclosure preferably occupies a certain region on the inner wall surface of the flow path that is neither a point nor a line, and the gas phase takes such a form. , It will be different from bubbles. Further, the contact point between the gas-liquid interface formed by introducing the gas phase and the inner wall surface of the flow path forms a continuous line in one or a plurality of embodiments. As the gas, air, oxygen, nitrogen, argon, carbon dioxide or the like can be used in one or more embodiments.
気相は、一又は複数の実施形態において、流路の一端に配置された圧力発生機構等によって導入することができる。圧力発生機構としては、一又は複数の実施形態において、シリンジポンプ、チューブポンプ又は真空ポンプ等が挙げられる。 The gas phase can be introduced in one or more embodiments by a pressure generating mechanism or the like arranged at one end of the flow path. Examples of the pressure generating mechanism include, in one or more embodiments, a syringe pump, a tube pump, a vacuum pump, and the like.
気相の流量は、安定した気液界面形成でき、標識されていない粒子の回収精度をより向上できる点、及び流路内壁面に固定した標識粒子の固定を維持する点から、一又は複数の実施形態において、２５μｌ／分以上、５０μｌ／分以上若しくは７５μｌ／分以上であり、又は５００μｌ／分以下若しくは２５０μｌ／分以下である。 The flow rate of the gas phase is one or more because a stable gas-liquid interface can be formed, the recovery accuracy of unlabeled particles can be further improved, and the fixation of the labeled particles fixed to the inner wall surface of the flow path is maintained. In embodiments, it is 25 μl / min or more, 50 μl / min or more, 75 μl / min or more, or 500 μl / min or less or 250 μl / min or less.
懸濁液の排出は、一又は複数の実施形態において、流路内の全量を排出してもよいし、少なくとも一部の量を排出してもよい。排出量を流路内の懸濁液の一部とすることによって、一又は複数の実施形態において、標識されていない粒子を濃縮した状態で回収することができる。 For the discharge of the suspension, in one or more embodiments, the entire amount in the flow path may be discharged, or at least a partial amount may be discharged. By making the effluent part of the suspension in the flow path, the unlabeled particles can be recovered in a concentrated state in one or more embodiments.
本開示の分離方法は、一又は複数の実施形態において、標識されている粒子の固定を解除し、流路内に液体を導入することにより、標識されている粒子を回収することを含んでいてもよい。 The separation method of the present disclosure comprises recovering the labeled particles by releasing the fixation of the labeled particles and introducing a liquid into the flow path in one or more embodiments. May be good.
本開示において懸濁液としては、一又は複数の実施形態において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む試料であって、ヒト、患者又は動物等から得られる試料が挙げられる。試料は、一又は複数の実施形態において、血液、血漿又は血清等を調製して得ることができる。
本開示における粒子としては、特に限定されるものではなく、ヒト又はヒト以外の動物の細胞が挙げられる。特に限定されない細胞の例としては、稀少細胞、白血球、赤血球、血小板およびそれらの未分化細胞等が挙げられる。稀少細胞とは、ヒト又はヒト以外の動物の血液中に含まれ得る血球成分（赤血球、白血球、及び血小板）以外の細胞をいう。稀少細胞としては、一又は複数の実施形態において、がん細胞、循環腫瘍細胞、血管内皮細胞、血管内皮前駆細胞、がん幹細胞、上皮細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胎児細胞、幹細胞、未分化白血球、未分化赤血球及びこれらの組み合わせからなる群から選択される細胞等が挙げられる。
本開示において、標識されている粒子は検出対象粒子であり、前記標識されていない粒子は検出対象外の粒子である。検出対象粒子としては、一又は複数の実施形態において、稀少細胞が挙げられ、検出対象外の粒子としては、一又は複数の実施形態において、白血球が挙げられる。
In the present disclosure, the suspension includes, in one or more embodiments, a sample containing labeled particles and unlabeled particles, which is obtained from a human, a patient, an animal, or the like. The sample can be obtained by preparing blood, plasma, serum or the like in one or more embodiments.
The particles in the present disclosure are not particularly limited, and examples thereof include human or non-human animal cells. Examples of cells without particular limitation include rare cells, leukocytes, erythrocytes, platelets and their undifferentiated cells. Rare cells refer to cells other than blood cell components (erythrocytes, white blood cells, and platelets) that can be contained in the blood of humans or non-human animals. Rare cells include, in one or more embodiments, cancer cells, circulating tumor cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial precursor cells, cancer stem cells, epithelial cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, fetal cells, stem cells, Examples thereof include undifferentiated leukocytes, undifferentiated erythrocytes, and cells selected from the group consisting of combinations thereof.
In the present disclosure, the labeled particles are the detection target particles, and the unlabeled particles are the non-detection target particles. The particles to be detected include rare cells in one or more embodiments, and the particles not to be detected include leukocytes in one or more embodiments.
［分離装置］
本開示は、一態様において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを分離するための装置（本開示の分離装置）に関する。本開示の分離装置は、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給可能な流路と、標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させ、流路内壁面に固定する手段と、流路内の懸濁液を排出するための気相を導入するための導入手段とを有する。本開示の分離装置によれば、一又は複数の実施形態において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを高い精度で分離することができるとともに、標識されていない粒子を高い精度で回収することができる。
[Separator]
The present disclosure relates to, in one embodiment, a device for separating labeled and unlabeled particles (separation device of the present disclosure). The separation device of the present disclosure deflects and flows a flow path capable of supplying a suspension containing labeled and unlabeled particles and the labeled particles in a direction different from the direction of gravity. It has a means for fixing to the inner wall surface of the road and an introduction means for introducing a gas phase for discharging the suspension in the flow path. According to the separation device of the present disclosure, in one or more embodiments, labeled particles and unlabeled particles can be separated with high accuracy, and unlabeled particles can be recovered with high accuracy. can do.
流路は、上記のとおりである。導入手段は、上記の圧力発生機構等が挙げられる。標識されている粒子を、標識されていない粒子とは異なる方向、つまり重力方向とは異なる方向に偏向させ、流路内壁面に固定する手段は、一又は複数の実施形態において、偏向及び固定の双方を行うことができる手段であってもよいし、偏向手段と固定手段と別々の手段であってもよい。偏向及び固定の双方を行うことができる手段としては、一又は複数の実施形態において、磁場照射体等が挙げられる。 The flow path is as described above. Examples of the introduction means include the above-mentioned pressure generation mechanism and the like. Means for deflecting labeled particles in a direction different from the unlabeled particles, that is, in a direction different from the direction of gravity and fixing them to the inner wall surface of the flow path, are deflected and fixed in one or more embodiments. It may be a means capable of performing both, or it may be a means different from the deflection means and the fixing means. As a means capable of performing both deflection and fixation, in one or more embodiments, a magnetic field irradiator or the like can be mentioned.
［分離システム］
本開示は、一態様において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを分離するためのシステム(本開示の分離システム)に関する。本開示の分離システムは、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給可能な流路、及び標識されている粒子を、標識されていない粒子とは異なる方向、つまり重力方向とは異なる方向に偏向させ、流路内壁面に固定する手段を有する分離部と、流路内の懸濁液を排出するための気相を導入するための導入手段とによって構成されている。本開示の分離システムによれば、一又は複数の実施形態において、標識されている粒子と標識されていない粒子とを高い精度で分離することができるとともに、標識されていない粒子を高い精度で回収することができる。
[Separation system]
The present disclosure relates to, in one aspect, a system for separating labeled and unlabeled particles (separation system of the present disclosure). The separation system of the present disclosure allows a flow path capable of supplying a suspension containing labeled and unlabeled particles, and the labeled particles in a direction different from that of the unlabeled particles. It is composed of a separation part having a means for deflecting in a direction different from the direction of gravity and fixing to the inner wall surface of the flow path, and an introduction means for introducing a gas phase for discharging the suspension in the flow path. There is. According to the separation system of the present disclosure, in one or more embodiments, labeled and unlabeled particles can be separated with high accuracy and unlabeled particles can be recovered with high accuracy. can do.
［その他の態様］
本開示は、その他の態様において、検出対象粒子と前記検出対象粒子より多数を占める検出対象外の粒子を含む検体中の前記検出対象外の粒子を標識し、前記検体中の標識した前記検出対象外の粒子を捕捉し、前記検体中の検出対象粒子を分離する方法に関する。検体としては、一又は複数の実施形態において、ヒト、患者又は動物等から得られる試料が挙げられる。試料は、一又は複数の実施形態において、血液、血漿又は血清等が挙げられる。
[Other aspects]
In another aspect of the present disclosure, the non-detection target particles in a sample containing the detection target particles and the non-detection target particles occupying a larger number than the detection target particles are labeled, and the labeled detection target in the sample is labeled. The present invention relates to a method of capturing external particles and separating the detection target particles in the sample. Examples of the sample include samples obtained from humans, patients, animals and the like in one or more embodiments. The sample may be blood, plasma, serum or the like in one or more embodiments.
以下に、本開示の分離方法について、限定されない一実施形態を説明する。 Hereinafter, an embodiment, which is not limited to the separation method of the present disclosure, will be described.
図１に示す分離装置を用い、標識されていない粒子（目的粒子）がＣＴＣであり、標識されている粒子が磁気標識された白血球である場合を例にとり説明する。懸濁液中には、磁気標識された白血球が、磁気標識されていない粒子（ＣＴＣ）よりも多く含まれている。なお、本開示は、該実施形態に限定されるものではない。 Using the separation device shown in FIG. 1, the case where the unlabeled particles (target particles) are CTCs and the labeled particles are magnetically labeled leukocytes will be described as an example. The suspension contains more magnetically labeled leukocytes than non-magnetically labeled particles (CTC). The present disclosure is not limited to the embodiment.
本開示の分離方法に利用可能な分離装置の一例を図１に示す。
図１に示す分離装置は、流路１と、磁場照射体２と、気相導入手段（圧力発生機構）３と、流路１と気相導入手段３とを連通する管４とを有する。流路１は、流入口１１と流出口１２とを備え、流出口１２には回収容器５を配置可能である。流路１は、長手方向の中心軸が略水平になるように配置されている。図２に、図１の分離装置における流路１と磁界照射体２との配置の一例を示す。図２に示すように、磁場照射体２は、略水平方向に配置された流路１の一方の側面に長手方向に沿って配置されている。管４には三方弁４１が配置され、三方弁４１により流路１内に懸濁液を導入可能である。
FIG. 1 shows an example of a separation device that can be used for the separation method of the present disclosure.
The separation device shown in FIG. 1 has a
つぎに、図１の分離装置を用いた、標識されていない粒子と標識されている粒子とを分離する方法の一例について説明する。 Next, an example of a method for separating unlabeled particles and labeled particles using the separation device of FIG. 1 will be described.
まず、ＣＴＣと、磁気標識された白血球とを含有する懸濁液を三方弁４１から流入口１１を通じて流路１内に供給して充填する。流路１への懸濁液の充填をスムーズに行う点から、懸濁液の充填は磁界を発生しない状態で行うことが好ましい。白血球の磁気標識は、結合分子を結合させた抗体等により白血球を抗体染色した後、該結合分子に特異的に反応する物質が固定化された磁性ビーズと反応させることにより行うことができる。結合分子としては、一又は複数の実施形態において、ビオチン等が挙げられる。特異的に反応する物質としては、一又は複数の実施形態において、ストレプトアビジン及びニュートラアビジン等のタンパク質が挙げられる。
First, a suspension containing CTC and magnetically labeled leukocytes is supplied into the
充填終了後、流路１内で懸濁液を静置するとともに、流路１の一方の側面に配置された磁場照射体２により流路１内に磁界を発生させる。これにより、磁気標識された白血球は偏向して流路１の磁場照射体２が配置された側の内壁面に移動するとともにその内壁面（流路１の底面以外の内壁）で捕捉（固定）される。一方、標識されていない粒子（ＣＴＣ）は、磁界の影響は受けないため、重力によって流路１の底面側に移動する。
After the filling is completed, the suspension is allowed to stand in the
ＣＴＣが流路１の底面に位置し、磁気標識された白血球が流路１の底面以外の内壁に捕捉された状態で、気相導入手段３から管４及び流入口１１を通じて流路１内に気相を導入する。気相は、流路内１の懸濁液及び標識されていない粒子（ＣＴＣ）が流路１の外部に排出可能であって、かつ流路１の底面以外の内壁に捕捉された白血球が流路１の内部に捕捉された状態が維持されるように導入すればよい。流路１の外部に排出されたＣＴＣを含む懸濁液は、流出口１２を通じてチューブ等の回収容器５に回収される。これにより、標識されていない粒子（ＣＴＣ）と、磁気標識された白血球とを分離することができるとともに、標識されていない粒子（ＣＴＣ）を回収することができる。気相を導入することにより、って、気液界面の移動によって懸濁液を排出させて流路内の標識されていない粒子を押し出すことにより、効率よく粒子を回収することができる。また、気相を導入することより、白血球の分離前後で液量を増やすことなく回収することができる。また、流路１の外部に排出する懸濁液の量を調整することによって、ＣＴＣを濃縮した状態で回収することもできる。
With the CTC located on the bottom surface of the
上記実施形態では、懸濁液及び気相をいずれも流入口１１から導入する形態を例にとり説明したが、本開示はこれに限定されるものではなく、懸濁液の導入方向と気相の導入方向とが異なる方向であってもよい。例えば、懸濁液を流入口１１から導入し、気相を流出口１２から導入してもよい。
また、上記実施形態では、流路１内に懸濁液を充填後、流路１内に磁界を発生させる形態を例にとり説明したが、本開示はこれに限定されるものではない。流路１内に磁界を発生させた状態で懸濁液を充填し、懸濁液の充填と標識されている粒子の移動方向の偏向とを同時に行ってもよい。
上記実施形態では、磁場照射体２を流路１の一方の側面に配置に配置した形態を例にとり説明したが、本発明はこれに限定されるものではない。標識されていない粒子は、重力によって流路１の底面側に向かって移動するため、磁気標識されていない粒子が磁気標識された粒子に巻き込まれて捕捉されることを避け、磁気標識されていない粒子の回収率を向上させる点から、磁場照射体２は流路１の底面側以外の位置に配置するのが望ましい。また、流路１上面に配置した場合と比較して弱い磁界で標識されている粒子を偏向できることから、磁場照射体２は、流路１の側面に配置することが好ましい。
In the above embodiment, the embodiment in which both the suspension and the gas phase are introduced from the
Further, in the above embodiment, the embodiment in which the suspension is filled in the
In the above embodiment, the embodiment in which the
本開示は、以下の一又は複数の実施形態に関しうる。
〔１〕 標識されている粒子と標識されていない粒子とを分離する方法であって、
流路の一端から、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給すること、
前記流路内において、前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させること、
前記標識されている粒子を流路内壁面に固定すること、及び
前記標識されている粒子が流路内壁面に固定された状態で、前記流路の一端から流路内に気相を導入して前記流路の他端から前記流路内の懸濁液を排出し、前記標識されていない粒子を回収すること、を含む分離方法。
〔２〕 前記標識されている粒子は、磁気標識されている粒子である、〔１〕記載の分離方法。
〔３〕 前記偏向は、前記流路内に磁界又は電界を生じさせることにより行う、〔１〕又は〔２〕に記載の分離方法。
〔４〕 前記固定は、前記流路内に磁界を生じさせることにより行う、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の分離方法。
〔５〕 前記懸濁液は、前記標識されていない粒子よりも前記標識されている粒子を多く含む、〔１〕から〔４〕のいずれかに記載の分離方法。
〔６〕 標識されている粒子と標識されていない粒子とを分離するための装置であって、
標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給可能な流路と、
前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させ、流路内壁面に固定する手段と、
前記流路内の懸濁液を排出するための気相を導入するための導入手段とを有する、分離装置。
〔７〕 標識されている粒子と標識されていない粒子とを分離するためのシステムであって、
標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給可能な流路、及び前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させ、流路内壁面に固定する手段を有する分離部と、
前記流路内の懸濁液を排出するための気相を導入するための導入手段とによって構成された、分離システム。
The present disclosure may relate to one or more of the following embodiments:
[1] A method for separating labeled particles and unlabeled particles.
Supplying a suspension containing labeled and unlabeled particles from one end of the flow path,
To deflect the labeled particles in the flow path in a direction different from the direction of gravity.
The gas phase is introduced into the flow path from one end of the flow path while the labeled particles are fixed to the inner wall surface of the flow path and the labeled particles are fixed to the inner wall surface of the flow path. A separation method comprising discharging the suspension in the flow path from the other end of the flow path and recovering the unlabeled particles.
[2] The separation method according to [1], wherein the labeled particles are magnetically labeled particles.
[3] The separation method according to [1] or [2], wherein the deflection is performed by generating a magnetic field or an electric field in the flow path.
[4] The separation method according to any one of [1] to [3], wherein the fixing is performed by generating a magnetic field in the flow path.
[5] The separation method according to any one of [1] to [4], wherein the suspension contains more labeled particles than the unlabeled particles.
[6] A device for separating labeled particles and unlabeled particles.
A flow path capable of supplying a suspension containing labeled and unlabeled particles, and
A means for deflecting the labeled particles in a direction different from the direction of gravity and fixing them to the inner wall surface of the flow path.
A separation device having an introduction means for introducing a gas phase for discharging the suspension in the flow path.
[7] A system for separating labeled particles and unlabeled particles.
A flow path capable of supplying a suspension containing labeled and unlabeled particles, and the labeled particles are deflected in a direction different from the direction of gravity and fixed to the inner wall surface of the flow path. Separation part with means and
A separation system composed of an introduction means for introducing a gas phase for discharging the suspension in the flow path.
以下に、実施例を用いて本開示をさらに説明する。以下の実施例では、標識した粒子を磁界により偏向させているが、電圧を印加した電線などを用いて電界により偏向させてもよい。但し、本開示は以下の実施例に限定して解釈されない。 Hereinafter, the present disclosure will be further described with reference to examples. In the following examples, the labeled particles are deflected by a magnetic field, but they may be deflected by an electric field using a voltage-applied electric wire or the like. However, this disclosure is not construed as being limited to the following examples.
（実施例１）
磁気粒子で標識した白血球とヒト結腸腺癌細胞とを含有する懸濁液を用い、図１に示す磁気分離装置による分離及び回収を行った。
(Example 1)
Using a suspension containing leukocytes labeled with magnetic particles and human colon adenocarcinoma cells, separation and recovery were performed by the magnetic separation device shown in FIG.
［磁気分離装置］
図１に示す磁気分離装置を準備した。
サフィード（商標）チューブ（内径３．１ｍｍ、チューブ長２６ｃｍ、容積２ｃｍ3）の一端には、三方弁及びシリンジ（１０ｍＬ）を介してシリンジポンプを接続し、かつ、他端にはサフィード（商標）チューブから排出された液を回収するための容器を配置した。サフィード（商標）チューブの側面には、磁石（ネオジム磁石（Ｎ４０、角型、２００ｘ１５ｘ５（ｍｍ）、５ｍｍ方向、表面磁束密２２９ｍＴ））を配置した。
[Magnetic separation device]
The magnetic separation device shown in FIG. 1 was prepared.
A syringe pump is connected to one end of a Sufeed ™ tube (inner diameter 3.1 mm, tube length 26 cm,
［細胞懸濁液の調製］
細胞懸濁液は、全血から採取した白血球（ＷＢＣ）とヒト結腸腺癌細胞とをそれぞれ別々に染色後、細胞数を調整した後、磁気粒子と両方の細胞（白血球及びヒト結腸腺癌細胞）とを混合して、磁気粒子で標識することにより、準備した。白血球はビオチン標識し、ストレプトアビジンをコーティングした磁気粒子を使用することにより、上記の混合によって磁気粒子は白血球に特異的に結合し、白血球のみが磁気標識される。
＜白血球の調製＞
真空採血管（ＥＤＴＡ・２Ｋ入り）を用いてヒトから採血を行った。ＨｅｔａＳｅｐ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ社）の添付文書に従い、採血した全血から白血球の分離を行った。
＜癌細胞の調製＞
常法に従い、培養したヒト結腸腺癌細胞株（SW620 American Type Culture Collection(ATCC)社）を、トリプシン（インビトロジェン社）を用いて回収した。回収した癌細胞の細胞懸濁液を遠心し、上清を除いた。ダルベッコＰＢＳ（-）（ニッスイ社）で再懸濁して、遠心し、再度上清を除き、癌細胞(SW620)を得た。
＜白血球のBiotin標識及び染色＞
常法に従い、血球計算盤を用いて、細胞数をカウントし、HetaSepで分離した白血球を分取し、１０5個〜１０6個の白血球を含有する試料（細胞懸濁液）を調製した。遠心し上清を除いてから、10%ヤギ血清、0.000001%Avidin、0.2%BSAをダルベッコPBS（−）に溶解したブロッキング液で23℃、10分間反応させた。遠心し上清を除き、ダルベッコPBS（−）を用いて再懸濁した。再度遠心し、上清を除いた。10%ヤギ血清、0.01%Biotin、0.2%BSAを溶解したダルベッコPBS（−）に抗CD45抗体及び、抗CD50抗体をそれぞれ添付文書に従い添加した1次抗体反応液で細胞を懸濁し、23℃、15分間反応させた。遠心し上清を除き、ダルベッコPBS（−）を用いて懸濁した。遠心し、再度上清を除く工程を合計３回行い、細胞を十分に洗浄する。2μg/ml Hoechst33342、10%ヤギ血清、0.2%BSAを溶解したダルベッコPBS（−）にAlexa594標識抗マウスIgG(Fab)及び、Biotin標識抗マウスIgG(Fc)をそれぞれ添付文書に従い添加した2次抗体反応液で細胞を懸濁し、23℃、15分間反応させた。遠心し上清を除き、ダルベッコPBS（−）を用いて懸濁した。遠心し、再度上清を除く工程を合計３回行い、細胞を十分に洗浄した。
＜がん細胞の追加染色＞
NeuroDio（緑色標識）を添付文書に従い添加した反応液にSW620を懸濁し、23℃、10分間反応させた。遠心し上清を除き、ダルベッコPBS（−）を用いて懸濁した。遠心し、再度上清を除く工程を合計３回行い、細胞を十分に洗浄した。
＜磁気標識＞
0.2%BSAを溶解したダルベッコPBS（−）に懸濁した磁気粒子（Bio-Adembeads StreptaDivin、粒径300nm：アデムテック社）を添付文書に従い調製し、NeuroDioで染色したSW620とBiotin標識した白血球とを混合し、30分間反応させた。懸濁液を短軸径５μｍ、長軸径８８μｍの孔を有するフィルターに通し、未反応の余剰磁気粒子を除去した。0.2%BSAを溶解したダルベッコPBS（−）を送液し、フィルター上の細胞を回収して細胞懸濁液を得た。
[Preparation of cell suspension]
In the cell suspension, leukocytes (WBC) collected from whole blood and human colon adenocarcinoma cells are stained separately, and after adjusting the cell number, the magnetic particles and both cells (leukocytes and human colon adenocarcinoma cells) are prepared. ) And labeled with magnetic particles to prepare. By using biotin-labeled leukocytes and streptavidin-coated magnetic particles, the above mixing causes the magnetic particles to specifically bind to leukocytes and only leukocytes are magnetically labeled.
<Preparation of white blood cells>
Blood was collected from humans using a vacuum blood collection tube (with EDTA / 2K). Leukocytes were isolated from the collected whole blood according to the package insert of HetaSep (STEMCELL).
<Preparation of cancer cells>
A cultured human colon adenocarcinoma cell line (SW620 American Type Culture Collection (ATCC)) was recovered using trypsin (Invitrogen) according to a conventional method. The cell suspension of the recovered cancer cells was centrifuged and the supernatant was removed. It was resuspended in Dulbecco PBS (-) (Nissui), centrifuged, and the supernatant was removed again to obtain cancer cells (SW620).
<Biotin labeling and staining of leukocytes>
According to a conventional method, using a hemocytometer, and counting the number of cells, fractionated leukocytes separated by HetaSep, samples were prepared containing 10 5 to 10 6 white blood cells (cell suspension). After centrifuging and removing the supernatant, 10% goat serum, 0.000001% Avidin, and 0.2% BSA were reacted with a blocking solution dissolved in Dulbecco PBS (−) at 23 ° C. for 10 minutes. The supernatant was removed by centrifugation and resuspended using Dulbecco PBS (-). Centrifuge again to remove the supernatant. The cells were suspended in a primary antibody reaction solution prepared by adding anti-CD45 antibody and anti-CD50 antibody to Dulbecco PBS (-) in which 10% goat serum, 0.01% Biotin, and 0.2% BSA were dissolved according to the package insert. It was allowed to react for 15 minutes. The supernatant was removed by centrifugation and suspended using Dulbecco PBS (-). Centrifuge and remove the supernatant again a total of 3 times to thoroughly wash the cells. Secondary antibody to which Alexa594-labeled anti-mouse IgG (Fab) and Biotin-labeled anti-mouse IgG (Fc) were added to Dulbecco PBS (-) in which 2 μg / ml Hoechst33342, 10% goat serum, and 0.2% BSA were dissolved, respectively, according to the package insert. The cells were suspended in the reaction solution and reacted at 23 ° C. for 15 minutes. The supernatant was removed by centrifugation and suspended using Dulbecco PBS (-). The cells were thoroughly washed by centrifuging and removing the supernatant again three times in total.
<Additional staining of cancer cells>
SW620 was suspended in a reaction solution to which NeuroDio (green label) was added according to the package insert, and reacted at 23 ° C. for 10 minutes. The supernatant was removed by centrifugation and suspended using Dulbecco PBS (-). The cells were thoroughly washed by centrifuging and removing the supernatant again three times in total.
<Magnetic sign>
Magnetic particles (Bio-Adembeads StreptaDivin, particle size 300 nm: Ademtec) suspended in Dulbecco PBS (-) in which 0.2% BSA was dissolved were prepared according to the package insert, and SW620 stained with NeuroDio and Biotin-labeled leukocytes were mixed. And allowed to react for 30 minutes. The suspension was passed through a filter having pores having a minor axis diameter of 5 μm and a major axis diameter of 88 μm to remove unreacted excess magnetic particles. Dulbecco PBS (-) in which 0.2% BSA was dissolved was sent, and the cells on the filter were collected to obtain a cell suspension.
［分離方法］
液相のない、空気で満たされた気相の状態のサフィード（商標）チューブに、三方弁（三方活栓弁）を通じて細胞懸濁液１０００μＬを導入し、細胞懸濁液からなる液相をサフィード（商標）チューブ内で構築した。細胞懸濁液を導入した導入口を三方弁で閉じることで、シリンジポンプ内から細胞懸濁液の末端界面までを一続きの気相にした。その後にネオジム磁石（Ｎ４０、角型、２００ｘ１５ｘ５（ｍｍ）、５ｍｍ方向）をサフィード（商標）チューブの側面に隣接する位置に移動させ１５分間、室温で静置した。シリンジポンプから流量１００μＬ／ｍｉｎでサフィード（商標）チューブに空気を導入し、サフィード（商標）チューブ内の液体すべてをサフィード（商標）チューブから排出し、排出した液体をチューブに回収した。チューブに回収された液体に含まれる白血球及びＳＷ６２０を蛍光検出した。その結果を表１に示す。
なお、上述のように気相の形成と空気の導入を行うことで、流路内の懸濁液と導入した気相との間に気液界面を形成することができ、かつ、この気液界面を流路の導入口から流出口に向かって移動させることができる。当該気相は、上述のとおり、シリンジポンプから懸濁液の末端界面まで一続きになっており、当該気相は、流路の内壁において、点でも線でもない一定の領域を占拠している。また、気液界面と流路の内壁面との接触点は、連続したラインを形成している。
[Separation method]
Introduce 1000 μL of cell suspension through a three-way valve (three-way stopcock) into a supply (trademark) tube in a gas phase filled with air without a liquid phase, and subfeed the liquid phase consisting of the cell suspension. Trademark) Constructed in a tube. By closing the inlet into which the cell suspension was introduced with a three-way valve, a continuous gas phase was formed from the inside of the syringe pump to the terminal interface of the cell suspension. After that, a neodymium magnet (N40, square, 200x15x5 (mm), 5 mm direction) was moved to a position adjacent to the side surface of the Suffed ™ tube and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Air was introduced into the Suffed ™ tube from a syringe pump at a flow rate of 100 μL / min, all the liquid in the Suffed ™ tube was discharged from the Suffed ™ tube, and the discharged liquid was collected in the tube. Leukocytes and SW620 contained in the liquid collected in the tube were fluorescently detected. The results are shown in Table 1.
By forming the gas phase and introducing air as described above, a gas-liquid interface can be formed between the suspension in the flow path and the introduced gas phase, and this gas-liquid can be formed. The interface can be moved from the inlet of the flow path to the outlet. As described above, the gas phase is continuous from the syringe pump to the terminal interface of the suspension, and the gas phase occupies a certain region on the inner wall of the flow path, which is neither a point nor a line. .. Further, the contact points between the gas-liquid interface and the inner wall surface of the flow path form a continuous line.
（比較例１）
実施例１で使用した細胞懸濁液１０００μＬを１．５ｍＬチューブに加えた。Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ（ＴＯＹＯＢＯ製）磁石スタンドにあてた状態で１５分間室温で静置した。ついで、ピペットで上清を全量回収し。回収した上清中に含まれる白血球及びＳＷ６２０を計測した。その結果を表１に示す。
(Comparative Example 1)
1000 μL of the cell suspension used in Example 1 was added to a 1.5 mL tube. It was allowed to stand at room temperature for 15 minutes while being placed on a Magical Trapper (manufactured by TOYOBO) magnet stand. Then, collect the entire supernatant with a pipette. Leukocytes and SW620 contained in the collected supernatant were measured. The results are shown in Table 1.
（比較例２）
ネオジム磁石を当てなかった以外は、実施例１と同様に磁気分離を行った。その結果を表１に示す。
(Comparative Example 2)
Magnetic separation was performed in the same manner as in Example 1 except that the neodymium magnet was not applied. The results are shown in Table 1.
（比較例３）
空気に替えて０．２％ＢＳＡを溶解したダルベッコＰＢＳ（−）を流量１００μｌ／ｍｉｎで送液した以外は、実施例１と同様に磁気分離を行った。その結果を表１に示す。
（比較例４）
空気に替えて０．２％ＢＳＡを溶解したダルベッコＰＢＳ（−）を流量１０００μｌ／ｍｉｎで送液した以外は、実施例１と同様に磁気分離を行った。その結果を表１に示す。
(Comparative Example 3)
Magnetic separation was performed in the same manner as in Example 1 except that Dulbecco PBS (−) in which 0.2% BSA was dissolved instead of air was sent at a flow rate of 100 μl / min. The results are shown in Table 1.
(Comparative Example 4)
Magnetic separation was performed in the same manner as in Example 1 except that Dulbecco PBS (−) in which 0.2% BSA was dissolved instead of air was sent at a flow rate of 1000 μl / min. The results are shown in Table 1.
表１に示すように、実施例１によれば、標識されている粒子（ＷＢＣ）と標識されていない粒子（ＳＷ６２０）とを効果的に分離することができ、目的の細胞（ＳＷ６２０）を高い回収率で回収できることが確認できた。
表１に示すように、ネオジム磁石を当てない比較例２では、サフィード（商標）チューブから排出されるＷＢＣの量が多く、十分に分離できなかった。空気（気相）に替えて実施例１と同じ流量で液体（液相）により回収した比較例３では、ＳＷ６２０もＷＢＣも全く回収できなかった。この理由としては、空気（気相）と同じ流量で送液したが、液体の場合、流路の中央でのみ高い流速が乗じるが、壁面では流速が生じにくく、自重により流路に沈降した細胞を押し出す効果がこの流量では不十分であったと考えられる。また、特許文献１の実施例に開示された流量（１０００μL／分）の液体を送液して回収した比較例４では、ＷＢＣは全く回収されなかったものの、ＳＷ６２０の回収率が１２％と極めて低く、ＳＷ６２０（標識されていない粒子）が十分に回収できないという結果となった。
As shown in Table 1, according to Example 1, labeled particles (WBC) and unlabeled particles (SW620) can be effectively separated, and the target cells (SW620) are high. It was confirmed that the recovery rate could be recovered.
As shown in Table 1, in Comparative Example 2 to which the neodymium magnet was not applied, the amount of WBC discharged from the Suffed ™ tube was large and could not be sufficiently separated. In Comparative Example 3 in which liquid (liquid phase) was recovered at the same flow rate as in Example 1 instead of air (gas phase), neither SW620 nor WBC could be recovered at all. The reason for this is that the liquid was sent at the same flow rate as air (gas phase), but in the case of liquid, a high flow velocity is applied only in the center of the flow path, but the flow velocity is unlikely to occur on the wall surface, and cells that have settled in the flow path due to their own weight. It is probable that the effect of pushing out was insufficient at this flow rate. Further, in Comparative Example 4 in which the liquid having a flow rate (1000 μL / min) disclosed in the examples of
（実施例２）
サフィード（商標）チューブから排出される液体を１００μＬずつ１０回に分けて回収した以外は、実施例１と同様に磁気分離を行った。回収した順番に１００μＬごとにフラクション番号を付し、各フラクションに含まれるＳＷ６２０の数を計測した。その結果を表２に示す。
(Example 2)
Magnetic separation was performed in the same manner as in Example 1 except that the liquid discharged from the Sufeed ™ tube was collected in 10 batches of 100 μL each. Fraction numbers were assigned to each 100 μL in the order of collection, and the number of SW620 contained in each fraction was measured. The results are shown in Table 2.
全フラクション（フラクション１〜１０の合計）におけるＳＷ６２０の回収率は８８％であり、白血球の回収率（残存率）は０．０９７％であった。これにより、回収目的以外の細胞（白血球）を磁石で保持した状態で、気相（空気）を導入することによって、回収目的の細胞（稀少細胞）を効果的に回収できることが確認できた。
また、表２に示すように、本実施例で回収された稀少細胞のうち８割以上が、最後の３フラクションに含まれていた。このため、排出される液体を分取するか又は後半のみを回収することによって、回収目的の細胞（稀少細胞）と回収目的以外の細胞（白血球）との分離を行うとともに濃縮できることが示された。
The recovery rate of SW620 in all fractions (total of
In addition, as shown in Table 2, more than 80% of the rare cells recovered in this example were contained in the last 3 fractions. Therefore, it was shown that cells for recovery purposes (rare cells) and cells for non-recovery purposes (leukocytes) can be separated and concentrated by separating the discharged liquid or collecting only the latter half. ..
Claims (7)
流路の一端から、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給すること、
前記流路内において、前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させること、
前記流路内に磁界を生じさせることにより、前記標識されている粒子を流路内壁面に固定すること、及び
前記標識されている粒子が流路内壁面に固定された状態で、前記流路の一端から流路内に気相を導入して前記流路の他端から前記流路内の懸濁液を排出し、前記標識されていない粒子を回収すること、を含み、
前記粒子は、細胞であり、
前記標識されている粒子は、磁気標識されている粒子である、分離方法。 A method of separating labeled and unlabeled particles.
Supplying a suspension containing labeled and unlabeled particles from one end of the flow path,
To deflect the labeled particles in the flow path in a direction different from the direction of gravity.
By generating a magnetic field in the flow path, the labeled particles are fixed to the inner wall surface of the flow path, and the labeled particles are fixed to the inner wall surface of the flow path. of introducing the gas phase in the flow channel from one end to discharge the suspension in the flow path from the other end of the channel, to recover the particles which are not said label, only including,
The particles are cells
The separation method , wherein the labeled particles are magnetically labeled particles.
重力方向と直交する方向に配置された流路の一端から、標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を流路に充填し静置すること、Filling the flow path with a suspension containing labeled and unlabeled particles from one end of the flow path arranged in the direction orthogonal to the direction of gravity, and allowing it to stand.
前記懸濁液を充填し静置した流路内において、前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させること、To deflect the labeled particles in a direction different from the direction of gravity in the flow path filled with the suspension and allowed to stand.
前記流路内に磁界を生じさせることにより、前記標識されている粒子を流路内壁面に固定すること、及びBy generating a magnetic field in the flow path, the labeled particles are fixed to the inner wall surface of the flow path, and
前記標識されている粒子が流路内壁面に固定された状態で、前記流路の一端から流路内に気相を導入して前記流路の他端から前記流路内の懸濁液を排出し、重力によって前記流路の底面方向に移動した前記標識されていない粒子を回収すること、を含み、With the labeled particles fixed to the inner wall surface of the flow path, a gas phase is introduced into the flow path from one end of the flow path, and the suspension in the flow path is introduced from the other end of the flow path. Containing the recovery of the unlabeled particles that have been ejected and moved towards the bottom of the flow path by gravity.
前記粒子は、細胞であり、The particles are cells
前記標識されている粒子は、磁気標識されている粒子である、分離方法。The separation method, wherein the labeled particles are magnetically labeled particles.
標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給可能な流路と、
前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させ、流路内壁面に固定する手段と、
前記流路内の懸濁液を排出するための気相を導入するための導入手段とを有し、
前記固定する手段は、前記流路内に磁界を生じさせることができ、
前記粒子は、細胞であり、
前記標識されている粒子は、磁気標識されている粒子である、分離装置。 A device for separating labeled and unlabeled particles.
A flow path capable of supplying a suspension containing labeled and unlabeled particles, and
A means for deflecting the labeled particles in a direction different from the direction of gravity and fixing them to the inner wall surface of the flow path.
It has an introduction means for introducing a gas phase for discharging the suspension in the flow path .
The fixing means can generate a magnetic field in the flow path.
The particles are cells
The labeled particles are magnetically labeled particles, a separator.
標識されている粒子と標識されていない粒子とを含む懸濁液を供給可能な流路、及び前記標識されている粒子を、重力方向とは異なる方向に偏向させ、流路内壁面に固定する手段を有する分離部と、
前記流路内の懸濁液を排出するための気相を導入するための導入手段とによって構成された、分離システムであって、
前記固定する手段は、前記流路内に磁界を生じさせることができ、
前記粒子は、細胞であり、
前記標識されている粒子は、磁気標識されている粒子である、分離システム。 A system for separating labeled and unlabeled particles.
A flow path capable of supplying a suspension containing labeled and unlabeled particles, and the labeled particles are deflected in a direction different from the direction of gravity and fixed to the inner wall surface of the flow path. Separation part with means and
A separation system composed of an introduction means for introducing a gas phase for discharging the suspension in the flow path .
The fixing means can generate a magnetic field in the flow path.
The particles are cells
The labeled particles are magnetically labeled particles, a separation system .
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