JP6970510B2

JP6970510B2 - 微細藻類においてトリアシルグリセロールの産生を誘導するための一酸化窒素又は一酸化窒素供与体の使用

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Publication number: JP6970510B2
Application number: JP2017014721A
Authority: JP
Inventors: マルシャルエリック; ジュアンドルチリナ
Original assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2016-01-29
Filing date: 2017-01-30
Publication date: 2021-11-24
Anticipated expiration: 2037-01-30
Also published as: JP2017195873A; US20170218412A1; EP3199620A1; CN107034244B; EP3199620B1; US10975399B2; CN107034244A

Description

本発明は一酸化窒素供与体を増殖培地に添加することにより微細藻類においてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を蓄積させる方法に関する。本発明は本発明による微細藻類におけるトリアシルグリセロール蓄積工程を含む、脂肪酸、バイオ燃料、医薬組成物又は化粧品組成物、更には栄養補助食品を作製する方法にも関する。最後に、本発明は微細藻類においてトリグリセリドを蓄積するための一酸化窒素供与体の使用に関する。

穀物から生産される油糧種子は栄養学的な目的以外には利用する（diverted from）ことができないと認識されている（非特許文献１）。そのため、藻類のような他の生物における油（oil）生産へと取り組みが移行している（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。藻類のトリアシルグリセロール（ＴＡＧ、油とも呼ばれる）生産について行われた研究（下記表１）は細胞質滴におけるＴＡＧの増大に着目している。

陸上植物に勝る微細藻類の利点がＥＰＯＢＩＯレポートに要約されている（非特許文献７）。耕作地にて栽培可能な植物（穀物）及びオープンポンド又は密閉リアクタにおいて生育される微細藻類はどちらも工業用のＴＡＧ及び脂肪酸、並びにバイオ燃料の潜在源である（非特許文献４）。しかしながら、集約的な農作業、及び食品から非食品への穀物の転用により深刻な懸念が生じている。そのため、光合成微生物に基づいた新世代のバイオ燃料を開発する取り組みが必要とされている。

ＴＡＧ生産用の植物についての微細藻類の主な利点は下記である：
この生物資源は動物又はヒトの栄養補給に用いられる農業資源と競合しない。
藻類の増殖は他のヒトの活動により生じた無機老廃物及び有機老廃物を再利用する環境に優しいプロセスにて制御及び閉鎖条件下でモニタリングすることができ、微細藻類を使用することで、産業副産ガス（例えばＣＯ_２）を捕捉し、有益な有機分子へと変換させることが可能である（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献８）。
藻類のバイオマス生産性が高く、微細藻類はコストを抑えつつも陸上植物に比べて非常に高い生産能を示す（表２を参照されたい）。その収率は多様であり、用いられる培養アプローチによって決まる：収率はオープンポンド系では比較的低く、培養パラメータが制御可能な閉じたフォトバイオリアクタでは大きく増大することができる。
この生物資源は立地又は季節に左右されない。

このバイオインダストリー分野の経済的実行可能性には、バイオマス全収率、すなわち１リットル当たりに生産される藻類有機物の乾燥重量と有益な分子の割合とを合わせること、すなわち工業用抽出及び処理にとって十分高い割合の乾燥重量当たりのＴＡＧが現在制限されていることから課題が残っている（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献８）。

特に微細藻類の脂質組成物はバイオディーゼル生産に適合している（非特許文献４、非特許文献５）。微細藻類からバイオディーゼルを生産する原理は、太陽光を用いて水及び二酸化炭素をバイオマスに変換させ、次いで栄養素ストレスのような外部刺激を加えること、及び／又は代謝の遺伝子操作により、特にこのバイオマスを油の合成へと再び移行させることで、バイオ燃料を生成させる（非特許文献９）。

存在量についての３つの最も重要な微細藻類群は、緑藻（緑色植物亜界（group）、緑藻綱）、珪藻（クロムアルベオラータ上門、不等毛植物門、珪藻綱）及び黄金色藻（クロムアルベオラータ上門、不等毛植物門、黄金色藻網）である（ＥＰＯＢＩＯ定義）。珪藻は海洋、淡水及び様々な土壌生息地における生物多様性のある（biodiversity）主な植物プランクトンの門である。珪藻は地球全体の一次生産の最大２５％を担っている。この真核生物群の研究は羽状珪藻モデルであるフェオダクチラム・トリコルヌタム（Phaeodactylum tricornutum）における近年の進展の恩恵を受けてきた。珪藻は他の微細藻類と同様に化石燃料又は石油化学由来の化学物質に代わる有望な代替炭化水素源であると考えられ、光合成によりＣＯ_２及び水を効率的にバイオマスへと変換させることができ、エネルギーの豊富なＴＡＧが蓄積するように炭素代謝を制御することができるという仮説に基づき、ＣＯ_２のバランスを保つという利点がある。フェオダクチラム・トリコルヌタムを含むクロムアルベオラータ上門の様々な植物プランクトン生物は、そのＴＡＧ蓄積能、有望な初期収率、並びに工業プロセスにて実行するのに適したロバスト性及び物理特性から注目されている。フェオダクチラム・トリコルヌタムは現在、ω−３多価不飽和脂肪酸の工業生産に使用されているが、この用途及びバイオ燃料等の他の用途での工業実施は依然、窒素飢餓等の従来の栄養素飢餓アプローチを用いてＴＡＧ蓄積を誘起させる場合、増殖遅延及び低バイオマス収率により制限されている（非特許文献８）。

このため現在、増殖培地における硝酸イオン（ＮＯ_３ ⁻）の利用低減が微細藻類においてＴＡＧの蓄積を誘起するのに最も用いられているプロセスである。しかしながら、増殖培地における硝酸イオンの利用低減によって細胞の増殖も妨げられる（非特許文献１０）。したがってＴＡＧの蓄積は実際にこのようなプロセスによって高められるが（微細藻類の細胞当たりのＴＡＧ）、この蓄積は増殖低減による損失を補うには十分有効であるとはいえず、結果として生産性（微細藻類の培養物体積当たり及び１日当たりのトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）量当たり）の増大は限られている。

このことから、これらのアプローチには窒素飢餓が増殖制限を誘導するという重大な欠点がある。フェオダクチラム・トリコルヌタムはケイ素の非存在下での増殖能又は採取法に有用であり得る細胞の沈降のような工業実施に関する興味深い特性を呈する。ＴＡＧ蓄積を促す試みは脂肪酸及びＴＡＧ生合成の刺激、炭素を代替的代謝経路へと転用させる経路遮断、並びに最終的なＴＡＧ異化の停止を含む、組み合わせることができる様々な戦略に依拠するものであり得る。小分子はＴＡＧ代謝のこれら３つの側面それぞれに作用することができる。

別のアプローチとして、炭素フラックスを代替代謝産物へと移行させる代謝経路の阻害又は遮断により微生物において油の蓄積を促すことが可能である。例えば、デンプン等の貯蔵糖類での炭水化物の蓄積の遮断は油の蓄積を促すことができることが知られている（非特許文献１１）。しかしながら、炭水化物の貯蔵の遮断は、特に細胞に栄養を与えるのにこれらの貯蔵炭水化物が必要である暗所において細胞増殖に（非特許文献１２）、ひいては生産性に悪影響がある。

炭素を用いる他の代謝経路を遮断し、炭素代謝をＴＡＧ代謝へと再び移行させることが可能である。それにより、ステロールの代謝阻害に基づくアプローチが最近になって開発されている（特許文献１）。

国際公開第２０１５／１１１０２９号

Durrett et al., The Plant Journal (2008) 54, 593-607 Chisti, Biotechnology Advances 25 (2007) 294-306 Chisti, Trends in Biotechnology, 2008, Vol 26, No. 3 Dismukes et al., Current Opinion in Biotechnology 2008, 19:235-240 Scott et al., Current Opinion in Biotechnology 2010, 21:277-286 Singh et al., Bioresource Technology 102 (2011) 26-34 Micro- and macro-algae: utility for industrial application, September 2007, Editor: Dianna Bowles Chisti, Journal of Biotechnology 167 (2013) 201-214 Dorval Courchesne et al., Journal of Biotechnology 141 (2009) 31-41 Adams C, Godfrey V, Wahlen B, Seefeldt L, Bugbee B. Bioresour Technol. 2013, 131, 188-194 Siaut et al., BMC Biotechnology 2011, 11:7 Ball et al. Plant Science 1990, 66:1-9

しかしながら、最大のバイオマス生産性にて脂質を生成し、細胞の脂質含量を最大にすることが可能な代替法が依然必要とされている。

予期せぬことに本発明者らは、ＴＡＧの蓄積及び更には生産性の両方を増大させることが有益に可能な微細藻類の処理方法を発見した。より具体的には、フリーラジカル源である一酸化窒素（^・Ｎ＝Ｏ、ＮＯと略記される）を増殖培地に添加することにより、微細藻類においてＴＡＧの蓄積を誘起することができることが分かっている。更なる利点としては、この方法は硝酸塩又は他の栄養素の供給を低減させることなく行うことができ、そのため微細藻類によるＴＡＧの生産性を増大させることも可能である。付加的な利点としては、この方法は代謝経路を遮断させる必要がなく、代謝経路は細胞の適切な機能化に使用することができる状態を保つ。

本発明の枠組み内において、微細藻類という用語は真核生物の微細藻類、特に珪藻を指す。

また本発明において、トリアシルグリセロールはトリアシルグリセリド又はＴＡＧとも呼ばれ、３つの脂肪酸によるグリセロールの３つのヒドロキシル基のエステル化により生じるエステルである。下記スキームでは、ＴＡＧが３つの脂肪酸（Ｒ_１ＣＯＯＨ、Ｒ_２ＣＯＯＨ、Ｒ_３ＣＯＯＨ）によるグリセロール骨格のエステル化により合成される。

スキーム１：３つの脂肪酸（Ｒ_１ＣＯＯＨ、Ｒ_２ＣＯＯＨ、Ｒ_３ＣＯＯＨ）によるグリセロールの３つのヒドロキシル基のエステル化により生じるＴＡＧの構造。

本明細書で使用される場合、「微細藻類においてＴＡＧの蓄積を誘起する」という表現は上記微細藻類における細胞のＴＡＧ含量（微細藻類の細胞重量当たりのＴＡＧ重量）が特に十分な窒素下において、正常な栄養及び培養条件下で、すなわち非ストレス培養条件にて観察されるものに比べて増大していることを意味する。本発明による方法により、通例非処理条件に比べて１２０％〜３００％の細胞の脂質生産の増大が可能である。

本明細書で使用される場合、「生産性」又は「バイオマス生産性」という用語は微細藻類の培養物体積当たり及び１日当たりに生じるＴＡＧの量を指し、ナイルレッドを用いた染色による１リットル当たり及び１日当たりのＴＡＧの相対強度、又は１リットル当たり及び１日当たりのＴＡＧのグラム数（ｇ／ｌ／日）のいずれかで表される。本発明による方法により、特に珪藻を用いて０．０２５ｇ／ｌ／日〜１ｇ／ｌ／日の範囲にある生産性を達成することが可能となることが有益である。

そのため一目的（正：object）において、本発明は微細藻類においてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の蓄積を誘起する方法であって、微細藻類の増殖培地において外因性の窒素酸化物（ＮＯ）源を上記微細藻類と接触させる工程（ｉ）を含む、方法に関する。

一態様では、増殖培地は窒素が十分な、すなわち硝酸イオン（ＮＯ_３ ⁻）及び／又は亜硝酸イオン（ＮＯ_２ ⁻）の含量が十分な増殖培地である。増殖培地は特に０．５ｍＭ〜１０ｍＭの硝酸イオン（ＮＯ_３ ⁻）及び／又は亜硝酸イオン（ＮＯ_２ ⁻）を含有し得る。

別の態様では、微細藻類は珪藻植物門、クロムアルベオラータ門、及びアーケプラスチダ門の微細藻類から選択される。

好ましい態様では、微細藻類はフェオダクチラム・トリコルヌタム及びタラシオシラ・シュードナナ（Thalassiosira pseudonana）の珪藻の微細藻類種、並びにアーケプラスチダのクラミドモナス属、オストレオコッカス属、クロレラ属の微細藻類種から選択される。微細藻類はフェオダクチラム・トリコルヌタム及びタラシオシラ・シュードナナの珪藻の微細藻類種から選択されることがより好ましい。外因性の窒素酸化物源は窒素酸化物供与体（ＮＯ供与体）、特に有機物である窒素酸化物供与体（有機物であるＮＯ供与体）とすることができる。

本明細書で使用される場合、「窒素酸化物供与体」という用語はＮＯの放出が必要となるときまでＮＯラジカルを安定化させることが可能なＮＯの分子担体を意味する。好ましいＮＯ供与体にはＮＯを放出することが可能なものが含まれる。

更なる態様では、有機物であるＮＯ供与体はジアゼニウムジオレート（ＮＯＮＯエート）及びＳ−ニトロソチオールから選択される。

ジアゼニウムジオレート［Ｒ_１Ｒ_２Ｎ−（Ｎ^＋Ｏ⁻）＝ＮＯ⁻］は窒素原子を介して求核付加物、特に第一級又は第二級のアミン又はポリアミンに結合したジオレート基のみからなる。ＮＯＮＯエートは生理学的なｐＨ及び温度の溶液中にて自然分解し、最大２モル当量のＮＯを生成するが、事前に分子を切断し末端酸素を放出させる必要があり得る（例えば下記スキームにおけるＶ−ＰＹＲＲＯ／ＮＯ及びＪＳ−Ｋについて）。ＮＯＮＯエートの例は刊行物（Miller et al., British Journal of Pharmacology (2007) 151, 305-321）に見ることができ、下記スキームに表される：

スキーム２：ジアゼニウムジオレートの例

ＮＯ供与体のＳ−ニトロソチオール群にはチオール（スルフヒドリル）基（Ｒ−ＳＨ）とＮＯ部分との間の化学的な単結合を含む多くの異なる化合物が含まれる。Ｓ−ニトロソチオールの例は刊行物（例えばMiller et al., British Journal of Pharmacology (2007) 151, 305-321）にて報告され、下記のスキームにて報告されるものを含む：

Ｓ−ニトロソ−グルタチオン（ＧＳＮＯ）
Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）
Ｓ−ニトロソ−Ｎ−バレリルペニシラミン（ＳＮＶＰ）
スキーム３：Ｓ−ニトロソチオールの例

有機物であるＮＯ供与体はＳ−ニトロソチオール、特にＳ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−バレリルペニシラミン（ＳＮＶＰ）、Ｓ−ニトロソ−グルタチオン（ＧＳＮＯ）から選択されるＳ−ニトロソチオールであることが好ましい。

窒素酸化物源は特に微細藻類とともに１時間〜４８時間インキュベートすることができる。

更なる態様では、増殖培地に存在するか、又は放出されるＮＯの濃度は０．２５ｍＭ〜５ｍＭである。

別の態様では本発明の方法は、１つ又は複数の抽出工程を含み得る、微細藻類において蓄積したトリアシルグリセロールを回収する工程（ｉｉ）を更に含む。抽出工程は溶媒又は当業者に既知の別の抽出法を用いて行うことができる。

第２の目的によれば、本発明は脂肪酸、バイオ燃料、医薬組成物若しくは化粧品組成物、又は栄養補助食品を生産するための、上記に規定の微細藻類においてトリアシルグリセロールの蓄積を誘起する方法の使用に関する。

更なる目的によれば、本発明は、
上記のＴＡＧの蓄積を誘起する方法に規定される工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）と、
例えばZhang et al., Bioresource Technology 147 (2013) 59-64に記載されているような工程（ｉｉ）で回収したトリアシルグリセロールをエステル交換する工程（ｉｉｉ）と、任意に、
得られたエステル交換したトリアシルグリセロールを回収する工程（ｉｖ）と、
を含む、バイオ燃料を作製する方法に関する。

付加的な目的によれば、本発明は微細藻類においてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の蓄積を誘起するための外因性の窒素酸化物、特にＮＯ供与体の使用に関する。

上記の規定に加えて、本発明は以下の残りの記載、また添付の図面から明らかとなる他の規定も含む。

図１〜図４：フェオダクチラム・トリコルヌタムにおけるＴＡＧの生産に対する漸増濃度のＳＮＡＰの効果。使用培地は１０×ＥＳＡＷであり、インキュベーションを５００μｌで行い、１×１０^６細胞／ｍｌにて接種し、化学物質を即座に添加した。測定は２日間のインキュベーション後に行った。図１及び図２及び図３のデータは３回の生物学的反復の結果であり、図４は反復なしの時間経過とした。ＮＡＰはＳＮＡＰの非活性アナログとして使用した。

増殖に対する漸増濃度のＳＮＡＰの効果を示す図である。増殖は細胞／ｍＬで測定する。細胞当たりのＴＡＧレベルに対する漸増濃度のＳＮＡＰの効果を示す図である。細胞当たりのＴＡＧレベルは相対蛍光単位／１０^６細胞で与えられる。ＴＡＧ生産性に対する漸増濃度のＳＮＡＰの効果を示す図である。ＴＡＧ生産性は１ｍＬ当たり及び１日当たりのナイルレッドの蛍光に相当する相対蛍光単位（Ｒｆｕ）で与えられる。非処理対照と比較した１ｍＭ又は３ｍＭＳＮＡＰによる処理後のＮＯ放出を示す図である。

１）材料及び方法
細胞培養
フェオダクチラム・トリコルヌタム（Ｐｔ１）ボーリン株８.６ＣＣＭＰ２５６１（海洋植物プランクトンカルチャーコレクション（Culture Collection of Marine Phytoplankton）、現在ではＮＣＭＡ：国立海洋藻類及びミクロビオームセンター（National Center for Marine Algae and Microbiota）としても知られる）を全ての実験で使用した。Ｐｔ１を、「１０×ＥＳＡＷ」と呼ばれる１０倍濃縮窒素及びリン酸塩源（５．４９×１０^−３ＭＮａＮＯ_３及び２．２４×１０^−４ＮａＨ_３ＰＯ_４）を用いた人工海水（ＥＳＡＷ）培地（培地の組成は表１を参照されたい）、又は窒素枯渇培地の入った２５０ｍＬ容のフラスコ内にて２０℃で増殖させた。細胞を１２時間：１２時間の明（３０μＥ／ｍ^２／秒）／暗サイクルにて増殖させた。新鮮培地を用いて１ｍｌ当たり１×１０^６の細胞を接種させることにより１週間に２回細胞を継代培養した。増殖はマラッセ計算板を用いて細胞数により、又はプレートリーダーを用いて７５０ｎｍでの吸光により評価した。

一酸化窒素（ＮＯ）供与体作用物質とのインキュベーション
Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）は溶解することでＮＯを自然放出する化合物である。ニトロソ−アセチルペニシラミン（ＮＡＰ）はＮＯを放出しない非活性化合物として使用されるものであることから、対照実験に使用することができる。

蛍光レポーターを用いた一酸化窒素の測定
フルオロフォアである４−アミノ−５−メチルアミノ−２’，７’−ジフルオレセイン二酢酸塩（ＤＡＦ−ＦＭ）により、ＮＯと平衡状態にあることから、ＮＯレベルを示すものである低レベルのペルオキシ亜硝酸イオン（nitric peroxide）（ＯＮＯＯ⁻）の高感度検出が可能となり（St Laurent CD, Moon TC, Befus AD. 2015. Measurement of nitric oxide in mast cells with the fluorescent indicator DAF-FM diacetate. Methods Mol Biol. 1220:339-45）、Ｐ．トリコルヌタム細胞におけるＮＯレベルを検出するのにこれまで使用されてきた（Vardi et al., 2008）。１０ｍｌの培養物を希釈し１０^６細胞／ｍｌにし、細胞を２０μｌの５ｍＭＤＡＦ−ＦＭとともにインキュベーションした（１．５時間、室温、暗所、振盪）。細胞を洗浄し、１０ｍｌの１０×ＥＳＡＷ培地に再懸濁して、４８ウェルの培養プレート上の５００μｌの培養物へと分注し、そこにＳＮＡＰを添加した。ペルオキシ亜硝酸イオンのＤＡＦ−ＦＭ依存性の検出実験のために、１５０μｌの培養物を９６ウェルプレートに移し、TECANのインフィニットＭ１０００Ｐｒｏプレートリーダー（４８８ｎｍの励起波長、５２９ｎｍの発光波長）を用いて蛍光を測定した。

ナイルレッド染色によるＴＡＧ蓄積の測定
ＴＡＧ滴の蓄積は、これまでに記載の原理（Abida et al., 2015）に従ってナイルレッド（Sigma Aldrich）蛍光染色（４８５ｎｍの励起波長、５２５ｎｍの発光波長）によりモニタリングした。簡潔に述べると、細胞を希釈し、ナイルレッド蛍光と線形相関になる細胞密度に調整した。ナイルレッド溶液（１００％ＤＭＳＯ中、４０μｌの２.５μｇ／ｍＬストック濃度）を１６０μｌの細胞懸濁液に添加した。次いで、ナイルレッドによって染色された油体（Oil bodies）を、ZeissのＡｘｉｏＳｃｏｐｅ．Ａ１顕微鏡（ＦＩＴＣフィルター、４８８ｎｍの励起波長、５１９ｎｍの発光波長）を用いて可視化した。体積当たり及び単位時間当たりのＴＡＧの蓄積に相当する生産性をナイルレッドによる染色に基づき算出し、１ｍＬ当たり及び１日のインキュベーション当たりのナイルレッドの相対蛍光単位（Ｒｆｕ）で表した。代替的に、ナイルレッドの蛍光値を細胞濃度に正規化させた。

２）結果
５００μＬ容量でのＰ．トリコルヌタムの１ｍＭＳＮＡＰとの２日間のインキュベーションが細胞増殖の低減を誘導するが（図１）、細胞当たりのＴＡＧの２．２倍の増大（図２）、更には培養体積当たり及び１日当たりのＴＡＧのレベルに相当する生産性の２倍を超える増大（図３）を誘起した。

Claims

珪藻植物門の微細藻類においてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の蓄積を誘起する方法であって、微細藻類の増殖培地において外因性の窒素酸化物（ＮＯ）源を前記微細藻類と接触させる工程（ｉ）を含む、方法。
前記外因性の窒素酸化物源が窒素酸化物供与体（ＮＯ供与体）、特に有機物であるＮＯ供与体である、請求項１に記載の方法。
前記増殖培地が硝酸イオン（ＮＯ_３ ⁻）及び／又は亜硝酸イオン（ＮＯ_２ ⁻）を含有する、請求項１又は２に記載の方法。
珪藻植物門の前記微細藻類が、
珪藻の微細藻類種の、フェオダクチラム・トリコルヌタム及びタラシオシラ・シュードナナから選択される、請求項３に記載の方法。
有機物である前記ＮＯ供与体が、ジアゼニウムジオレート（ＮＯＮＯエート）及びＳ−ニトロソチオールから選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
有機物である前記ＮＯ供与体がＳ−ニトロソチオールである、請求項５に記載の方法。
前記Ｓ−ニトロソチオールが、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−アセチルペニシラミン（ＳＮＡＰ）、Ｓ−ニトロソ−Ｎ−バレリルペニシラミン（ＳＮＶＰ）、及びＳ−ニトロソ−グルタチオン（ＧＳＮＯ）から選択される、請求項６に記載の方法。
前記増殖培地中の外因性ＮＯの濃度が０．２５ｍＭ〜５ｍＭである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
微細藻類に蓄積されたトリアシルグリセロールを回収する工程（ｉｉ）を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
脂肪酸、バイオ燃料、医薬組成物若しくは化粧品組成物、又は栄養補助食品を生産するための、請求項１〜９のいずれか一項に記載の微細藻類においてトリアシルグリセロールの蓄積を誘起する方法の使用。
請求項１〜９のいずれか一項に記載の工程（ｉ）及び工程（ｉｉ）と、
工程（ｉｉ）で回収したトリアシルグリセロールをエステル交換する工程（ｉｉｉ）と、任意に、
得られたエステル交換したトリアシルグリセロールを回収する工程（ｉｖ）と、
を含む、バイオ燃料を作製する方法。
珪藻植物門の微細藻類においてトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の蓄積を誘起するための外因性の窒素酸化物の使用。
前記外因性の窒素酸化物が、窒素酸化物供与体、特に有機物である窒素酸化物供与体から放出されたものである、請求項１２に記載の使用。