JP6968380B2 - Method for manufacturing elastic fiber tissue regeneration base material and elastic fiber tissue regeneration base material - Google Patents
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Description
本発明は、生体に移植することにより弾性線維組織の再生を促進させることができる弾性線維組織再生基材、及び、該弾性線維組織再生基材の製造方法に関する。 The present invention relates to an elastic fiber tissue regeneration base material capable of promoting the regeneration of elastic fiber tissue by transplanting into a living body, and a method for producing the elastic fiber tissue regeneration base material.
ヒトの生体組織の中でも肺や血管、皮膚等の組織は、弾性、伸縮性に富んだ組織であるが、加齢とともに血管が硬くなる、あるいは皮膚がたるむといった生体組織の弾性が失われていく加齢現象が生じる。これは、生体組織に存在する弾性線維という、ゴムのような柔軟性と弾力を有する線維組織が劣化してしまうためであると考えられている。この弾性線維は、劣化・分解しても再生されることはないとされており、このような弾性線維の再生についての研究が数多くなされている。 Among human living tissues, tissues such as lungs, blood vessels, and skin are highly elastic and elastic, but the elasticity of living tissues such as blood vessels becoming stiff or the skin sagging is lost with aging. An aging phenomenon occurs. It is considered that this is because the elastic fibers existing in the living tissue, which are flexible and elastic like rubber, are deteriorated. It is said that these elastic fibers are not regenerated even if they deteriorate or decompose, and many studies have been conducted on the regeneration of such elastic fibers.
弾性線維は、エラスチンタンパク質がミクロフィブリル（Ｆｉｂｒｉｌｌｉｎ−１、２のホモポリマー）に沈着し、リシルオキシダーゼ酵素によった架橋されることにより形成される。このミクロフィブリルに共局在することが知られているタンパク質にＬＴＢＰ（ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦβ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーがある。現在までにこのファミリーにはＬＴＢＰ１〜４タンパク質の４つのファミリーメンバーの存在が確認されている。特許文献１には、ＬＴＢＰ−４タンパク質を含有する弾性線維再生剤が開示されている。 Elastic fibers are formed by the deposition of elastin proteins on microfibrils (homomopolymers of Fibrillin-1, 2) and cross-linking with lysyloxidase enzymes. Proteins known to co-localize with this microfibril include the LTBP (latent TGFβ-binding protein) family. To date, the presence of four family members of the LTBP1-4 proteins has been confirmed in this family. Patent Document 1 discloses an elastic fiber regenerating agent containing an LTBP-4 protein.
特許文献１においては、ＬＴＢＰ−４タンパク質を含有する弾性線維再生剤を用いて、２４ウェルプレートに播種したヒト線維芽細胞を培養して、弾性線維組織の形成を確認していた。しかしながら、実際の生体組織は三次元構造であることから、三次元構造の弾性線維組織を再生することが重要である。また、ＬＴＢＰ−４タンパク質を含有する弾性線維再生剤をどのような形態で生体に適用すれば弾性線維組織の再生を促進させることができるかについても課題となっていた。
本発明は、上記現状に鑑み、生体に移植することにより弾性線維組織の再生を促進させることができる弾性線維組織再生基材、及び、該弾性線維組織再生基材の製造方法を提供することを目的とする。
In Patent Document 1, the formation of elastic fibrous tissue was confirmed by culturing human fibroblasts seeded on a 24-well plate using an elastic fiber regenerating agent containing LTBP-4 protein. However, since the actual living tissue has a three-dimensional structure, it is important to regenerate the elastic fiber tissue having the three-dimensional structure. Further, it has been a problem as to what form the elastic fiber regenerating agent containing the LTBP-4 protein should be applied to a living body to promote the regeneration of the elastic fiber tissue.
In view of the above situation, the present invention provides an elastic fiber tissue regeneration base material capable of promoting the regeneration of elastic fiber tissue by transplanting into a living body, and a method for producing the elastic fiber tissue regeneration base material. The purpose.
本発明は、ＬＴＢＰ−４タンパク質と、該ＬＴＢＰ−４タンパク質を担持する架橋されたコラーゲンスポンジとを含む弾性線維組織再生基材である。
以下に本発明を詳述する。
The present invention is an elastic fiber tissue regeneration substrate containing an LTBP-4 protein and a crosslinked collagen sponge carrying the LTBP-4 protein.
The present invention will be described in detail below.
本発明者は、鋭意検討の結果、ＬＴＢＰ−４タンパク質を架橋されたコラーゲンスポンジに担持させた弾性線維組織再生基材は、生体に移植したときに線維芽細胞等が侵入、増殖できるとともに、ＬＴＢＰ−４タンパク質によって弾性線維組織の形成を促進できることを見出し、本発明を完成した。 As a result of diligent studies, the present inventor has found that the elastic fiber tissue regeneration substrate in which the LTBP-4 protein is supported on a crosslinked collagen sponge can invade and proliferate fibroblasts and the like when transplanted into a living body, and also LTBP. -4 We have found that proteins can promote the formation of elastic fibrous tissue, and completed the present invention.
本発明の弾性線維組織再生基材は、ＬＴＢＰ−４タンパク質と、該ＬＴＢＰ−４タンパク質を担持する架橋されたコラーゲンスポンジとを含む。架橋されたコラーゲンスポンジに担持させることにより、ＬＴＢＰ−４タンパク質を安定に保持して生体に移植することが可能となり、弾性線維組織の形成を促進させることができる。また、移植された架橋されたコラーゲンスポンジは徐々に分解することから、該分解に従ってＬＴＢＰ−４タンパク質を徐放させることもできる。 The elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention contains an LTBP-4 protein and a crosslinked collagen sponge carrying the LTBP-4 protein. By supporting it on a crosslinked collagen sponge, the LTBP-4 protein can be stably held and transplanted into a living body, and the formation of elastic fiber tissue can be promoted. In addition, since the transplanted crosslinked collagen sponge is gradually decomposed, the LTBP-4 protein can be slowly released according to the decomposition.
上記架橋されたコラーゲンスポンジは、ＬＴＢＰ−４タンパク質を担持するための基材であるとともに、線維芽細胞等が侵入、増殖し、ＬＴＢＰ−４タンパク質によって弾性線維組織を促進させるための足場材としての役割を有する。 The crosslinked collagen sponge is a base material for supporting the LTBP-4 protein, and also as a scaffolding material for invading and proliferating fibroblasts and promoting elastic fibrous tissue by the LTBP-4 protein. Has a role.
上記架橋されたコラーゲンスポンジの原料となるコラーゲンとしては特に限定されず、例えば、牛、豚等の皮膚や腱等に由来するもの等を用いることができる。抗原性を排除してより安全性を高める観点から、コラーゲンをプロテアーゼやペプシン等の酵素で処理して、テロペプチドをできる限り除去したアテロコラーゲンが好ましい。アテロコラーゲンには、Ｉ〜ＩＶ型があるが、適宜選択することができる。 The collagen used as a raw material for the crosslinked collagen sponge is not particularly limited, and for example, collagen derived from the skin or tendon of cows, pigs, etc. can be used. From the viewpoint of eliminating antigenicity and increasing safety, atelocollagen in which collagen is treated with an enzyme such as protease or pepsin to remove terror peptide as much as possible is preferable. Atelocollagen includes types I to IV, which can be appropriately selected.
上記架橋されたコラーゲンスポンジは、平均孔径の好ましい下限が０．１μｍ、好ましい上限が５００μｍである。上記平均孔径が０．１μｍ未満であると、線維芽細胞等が弾性線維組織再生基材中に侵入することができず、充分な弾性線維組織が再生されにくくなる。上記平均孔径が５００μｍを超えると、侵入した線維芽細胞等の密度が不充分となって、弾性線維組織が再生されにくくなる。上記平均孔径のより好ましい下限は１μｍ、より好ましい上限は３００μｍであり、更に好ましい下限は５μｍ、更に好ましい上限は１００μｍである。 In the crosslinked collagen sponge, the preferable lower limit of the average pore size is 0.1 μm, and the preferable upper limit is 500 μm. If the average pore size is less than 0.1 μm, fibroblasts and the like cannot invade the elastic fiber tissue regeneration substrate, and it becomes difficult for sufficient elastic fiber tissue to be regenerated. When the average pore size exceeds 500 μm, the density of invaded fibroblasts and the like becomes insufficient, and elastic fibrous tissue is difficult to be regenerated. The more preferable lower limit of the average pore diameter is 1 μm, the more preferable upper limit is 300 μm, the further preferable lower limit is 5 μm, and the further preferable upper limit is 100 μm.
上記架橋されたコラーゲンスポンジの厚みは特に限定されないが、好ましい下限は０．１ｍｍ、好ましい上限は３ｍｍである。上記厚みが０．１ｍｍ未満であると、充分な厚さをもった弾性線維組織が形成されなかったり、移植時の取扱い性等に劣ったりすることがあり、３ｍｍを超えると、侵入した線維芽細胞等への栄養供給に劣ることがある。 The thickness of the crosslinked collagen sponge is not particularly limited, but the preferred lower limit is 0.1 mm and the preferred upper limit is 3 mm. If the thickness is less than 0.1 mm, elastic fiber tissue having sufficient thickness may not be formed, or the handleability at the time of transplantation may be inferior. If the thickness exceeds 3 mm, invaded fibroblasts may be formed. It may be inferior in supplying nutrients to cells and the like.
上記架橋されたコラーゲンスポンジを製造する方法としては特に限定されず、例えば、コラーゲン水溶液を真空凍結乾燥して得る方法等により得た未架橋コラーゲンスポンジを、熱架橋、紫外線架橋又は架橋剤による化学架橋により架橋する方法等が挙げられる。
具体的には例えば、蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等により好ましくは０．１〜１重量％、より好ましくは０．１〜０．５重量％に調整されたコラーゲン溶液を凍結乾燥して、未架橋コラーゲンスポンジを製造する。この際、コラーゲン溶液にクロロホルム等の脂溶性有機溶媒をごく少量配合したり、コラーゲン溶液をホモジナイズして発泡させたりしてもよい。凍結乾燥の条件は特に限定されないが、例えば、コラーゲン溶液を−１３５〜−４０℃に冷却して凍結し、−４０℃から４０℃まで温度を上昇させながら６〜２４時間凍結乾燥を行うことができる。得られた未架橋コラーゲンスポンジに、熱架橋、紫外線架橋、化学架橋等の架橋処理を施すことにより架橋されたコラーゲンスポンジが得られる。架橋されたコラーゲンスポンジは、生分解速度が調整されていることから、弾性線維組織を形成するための足場としての機能を発揮させることができる。上記熱架橋は、例えば、コラーゲンスポンジを、真空乾燥機を用いて１００〜１５０℃程度で６〜２４時間程度処理して実施することができる。上記化学架橋としては、例えば、コラーゲンスポンジをグルタルアルデヒド溶液に浸漬して実施することができる。具体的には、０〜１０℃（特に４℃程度）で、０．１〜１％（特に０．２％）のグルタルアルデヒド溶液に１〜５０時間（特に３〜１５時間）浸漬することによって実施できる。
The method for producing the crosslinked collagen sponge is not particularly limited, and for example, an uncrosslinked collagen sponge obtained by vacuum freeze-drying an aqueous collagen solution is thermally crosslinked, crosslinked with ultraviolet rays, or chemically crosslinked with a crosslinking agent. Examples thereof include a method of cross-linking.
Specifically, for example, collagen adjusted to preferably 0.1 to 1% by weight, more preferably 0.1 to 0.5% by weight with distilled water, physiological saline, phosphate buffered saline (PBS) or the like. The solution is lyophilized to produce an uncrosslinked collagen sponge. At this time, a very small amount of a fat-soluble organic solvent such as chloroform may be added to the collagen solution, or the collagen solution may be homogenized and foamed. The conditions for freeze-drying are not particularly limited, but for example, the collagen solution may be cooled to −135 to −40 ° C., frozen, and freeze-dried for 6 to 24 hours while raising the temperature from −40 ° C. to 40 ° C. can. A crosslinked collagen sponge can be obtained by subjecting the obtained uncrosslinked collagen sponge to a cross-linking treatment such as thermal cross-linking, ultraviolet cross-linking, and chemical cross-linking. Since the crosslinked collagen sponge has a regulated biodegradation rate, it can exert a function as a scaffold for forming elastic fiber tissue. The thermal cross-linking can be carried out, for example, by treating the collagen sponge with a vacuum dryer at about 100 to 150 ° C. for about 6 to 24 hours. The chemical cross-linking can be carried out, for example, by immersing a collagen sponge in a glutaraldehyde solution. Specifically, by immersing in a 0.1 to 1% (particularly 0.2%) glutaraldehyde solution at 0 to 10 ° C. (particularly about 4 ° C.) for 1 to 50 hours (particularly 3 to 15 hours). Can be carried out.
上記ＬＴＢＰ−４タンパク質は、ミクロフィブリルに共局在するタンパク質として知られている、ＬＴＢＰ（ｌａｔｅｎｔ ＴＧＦβ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）ファミリーの１種である。
本発明においてＬＴＢＰ−４タンパク質は、特許文献１に開示された配列番号１に記載の塩基配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０５１３４４）若しくはそのオルソログ、又は、これらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）に由来するポリペプチドをいう。ＬＴＢＰ−４タンパク質のオルソログは特に限定されず、例えば任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来するものであり得る。哺乳動物としては、例えばウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウスなどが挙げられる。ＬＴＢＰ−４タンパク質は、分泌タンパク質であり、プロセシングによりシグナル配列（例えば、ＭＡＧＧＶＲＬＬＷＶＳＬＬＶＬＬＡＱＬＧＰＱＰＧＬＧ）が除去され得る。本発明においては、ＬＴＢＰ−４タンパク質として、シグナル配列が除去されたもの、シグナル配列が除去されていないもののいずれでも使用できるが、シグナル配列が除去されたものが好ましい。また、ＬＴＢＰ−４変異体は、弾性線維の再生を可能とするものであれば特に限定されず、例えば、特許文献１に開示された配列番号１に示される塩基配列に相補的な配列を有するＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし且つＬＴＢＰ−４をコードするＤＮＡに由来するポリペプチドが挙げられる。
ＬＴＢＰ−４タンパク質については、特許文献１のほかに、例えば、「中邨智之、弾性線維形成に必須のＬＴＢＰ−４、生化学、第８６巻第６号、７７０−７７３頁（２０１４）」等に詳しく記載されている。
The LTBP-4 protein is a member of the LTBP (latent TGFβ-binding protein) family known as a protein co-localized to microfibrils.
In the present invention, the LTBP-4 protein is derived from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 disclosed in Patent Document 1 (GenBank Accession No. AF051344) or its ortholog, or a variant thereof (including SNP and haplotype). Refers to a polypeptide that is used. The ortholog of the LTBP-4 protein is not particularly limited and may be, for example, derived from any animal, preferably a mammal. Mammals include, for example, cows, sheep, pigs, goats, monkeys, rabbits, rats, hamsters, guinea pigs, mice and the like. The LTBP-4 protein is a secretory protein and the signal sequence (eg, MAGGVRLLWVSLLVLAQLGPQPGLG) can be removed by processing. In the present invention, as the LTBP-4 protein, either one from which the signal sequence has been removed or one in which the signal sequence has not been removed can be used, but the one from which the signal sequence has been removed is preferable. Further, the LTBP-4 mutant is not particularly limited as long as it enables regeneration of elastic fibers, and has, for example, a sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 disclosed in Patent Document 1. Examples thereof include polypeptides derived from DNA that hybridizes with DNA under stringent conditions and encodes LTBP-4.
Regarding the LTBP-4 protein, in addition to Patent Document 1, for example, "Tomoyuki Nakamura, LTBP-4 essential for elastic fiber formation, Biochemistry, Vol. 86, No. 6, pp. 770-773 (2014)" and the like. It is described in detail.
上記ＬＴＢＰ−４タンパク質は、上記架橋されたコラーゲンスポンジに担持されている。これにより、ＬＴＢＰ−４タンパク質を安定に保持されて、本発明の弾性線維組織再生基材を移植したときに、弾性線維組織の形成を促進させることができる。また、移植された架橋されたコラーゲンスポンジは徐々に分解することから、該分解に従ってＬＴＢＰ−４タンパク質を徐放させることもできる。 The LTBP-4 protein is supported on the crosslinked collagen sponge. As a result, the LTBP-4 protein can be stably retained, and the formation of elastic fiber tissue can be promoted when the elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention is transplanted. In addition, since the transplanted crosslinked collagen sponge is gradually decomposed, the LTBP-4 protein can be slowly released according to the decomposition.
本発明の弾性線維組織再生基材中の上記ＬＴＢＰ−４タンパク質の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は０．０８重量％、好ましい上限は８．０重量％である。ＬＴＢＰ−４タンパク質の含有量がこの範囲内であると、弾性線維組織の形成を確実に促進させることができる。上記ＬＴＢＰ−４タンパク質の含有量のより好ましい下限は０．１６重量％、より好ましい上限は１．６重量％である。 The content of the LTBP-4 protein in the elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention is not particularly limited, but the preferred lower limit is 0.08% by weight, and the preferred upper limit is 8.0% by weight. When the content of the LTBP-4 protein is within this range, the formation of elastic fibrous tissue can be reliably promoted. The more preferable lower limit of the content of the LTBP-4 protein is 0.16% by weight, and the more preferable upper limit is 1.6% by weight.
本発明の弾性線維組織再生基材は、更にＤＡＮＣＥ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ａｒ ｔｅｒｉｅｓ ａｎｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｃｒｅｓｔ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）−ｌｉｋｅ；ｆｉｂｕｌｉｎ−５ともいう）タンパク質を含むことが好ましい。ＤＡＮＣＥタンパク質をＬＴＢＰ−４タンパク質と併用することにより、更に弾性線維組織の形成を促進することができる。
ここで、「ＤＡＮＣＥタンパク質」とは、ｆｉｂｕｌｉｎ−５とも呼ばれる分泌蛋白質であり、弾性線維を構成する分子であることが知られている。ＤＡＮＣＥタンパク質は、ヒト由来のヒトＤＡＮＣＥタンパク質、又は、そのオルソログ、あるいはそれらの変異体（ＳＮＰ、ハプロタイプを含む）を含む。ＤＡＮＣＥタンパク質のオルソログは特に限定されず、例えば任意の動物、好ましくは哺乳動物に由来するものであり得る。哺乳動物としては、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、マウス等が挙げられる。
ＤＡＮＣＥタンパク質については、例えば、国際公開第２００６／０８２７６３号等に詳しく記載されている。
The elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention preferably further contains a DANCE (Developmental Arteries and Neural Crest Epidermal growth factor (EGF) -like; fibulin-5) protein. By using the DANCE protein in combination with the LTBP-4 protein, the formation of elastic fiber tissue can be further promoted.
Here, the "DANCE protein" is a secretory protein also called fibulin-5, and is known to be a molecule constituting elastic fibers. DANCE proteins include human DANCE proteins of human origin, orthologs thereof, or variants thereof (including SNPs, haplotypes). The ortholog of the DANCE protein is not particularly limited and may be, for example, derived from any animal, preferably a mammal. Examples of mammals include cows, sheep, pigs, goats, monkeys, rabbits, rats, hamsters, guinea pigs, mice and the like.
The DANCE protein is described in detail in, for example, International Publication No. 2006/082763.
本発明の弾性線維組織再生基材中の上記ＤＡＮＣＥタンパク質の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は０．００１重量％、好ましい上限は１重量％である。ＤＡＮＣＥタンパク質の含有量がこの範囲内であると、移植したときに弾性線維組織の形成をより促進することができる。上記ＤＡＮＣＥタンパク質の含有量のより好ましい下限は０．０１重量％、より好ましい上限は０．８重量％である。 The content of the DANCE protein in the elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention is not particularly limited, but the preferable lower limit is 0.001% by weight, and the preferable upper limit is 1% by weight. When the content of DANCE protein is within this range, the formation of elastic fiber tissue can be further promoted at the time of transplantation. The more preferable lower limit of the content of the DANCE protein is 0.01% by weight, and the more preferable upper limit is 0.8% by weight.
本発明の弾性線維組織再生基材は、更にムコ多糖類を含んでもよい。ムコ多糖類を含むことにより、基材からのＬＴＢＰ−４タンパク質やＤＡＮＣＥタンパク質の徐放速度を制御することができる。これは、ムコ多糖類は親水基を有するため、該ムコ多糖類の添加量により基材の親水基の量をコントロールすることで含水率を制御できるためと考えられる。
上記ムコ多糖類としては、例えば、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパラン硫酸等が挙げられる。なかでも、コラーゲンとの溶解性、安価に入手できる点から、コンドロイチン硫酸、ヘパリンが好適である。
The elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention may further contain mucopolysaccharide. By containing the mucopolysaccharide, the sustained release rate of the LTBP-4 protein and the DANCE protein from the substrate can be controlled. It is considered that this is because the mucopolysaccharide has a hydrophilic group, and therefore the water content can be controlled by controlling the amount of the hydrophilic group of the base material by the amount of the mucopolysaccharide added.
Examples of the mucopolysaccharide include chondroitin sulfate, heparin, hyaluronic acid, dermatan sulfate, keratan sulfate, heparan sulfate and the like. Of these, chondroitin sulfate and heparin are preferable because of their solubility in collagen and their low cost.
本発明の弾性線維組織再生基材中の上記ムコ多糖類の含有量は特に限定されないが、好ましい下限は０．１重量％、好ましい上限は５０重量％である。ムコ多糖類の含有量がこの範囲内であると、ＬＴＢＰ−４タンパク質等の徐放速度を確実に制御することができる。上記ムコ多糖類の含有量のより好ましい下限は１重量％、より好ましい上限は２０重量％である。 The content of the mucopolysaccharide in the elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention is not particularly limited, but the preferable lower limit is 0.1% by weight and the preferable upper limit is 50% by weight. When the content of the mucopolysaccharide is within this range, the sustained release rate of the LTBP-4 protein or the like can be reliably controlled. The more preferable lower limit of the content of the mucopolysaccharide is 1% by weight, and the more preferable upper limit is 20% by weight.
本発明の弾性線維組織再生基材を製造する方法は特に限定されないが、上記架橋されたコラーゲンスポンジに、上記ＬＴＢＰ−４タンパク質（必要に応じて上記ＤＡＮＣＥタンパク質及びムコ多糖類）を含有するコラーゲン溶液を含浸させ、その後に凍結乾燥する方法が好適である。このような製造方法によれば、上記ＬＴＢＰ−４タンパク質等を上記架橋されたコラーゲンスポンジに確実に担持させることができる。また、上記ＬＴＢＰ−４タンパク質等を担持させた後に、コラーゲンスポンジを架橋させる処理を行う必要がないことから、架橋処理によってＬＴＢＰ−４タンパク質等が失活する恐れがない。従って、組織再生のための足場としての充分な強度、生分解性速度と、ＬＴＢＰ−４タンパク質の安定担持とを両立させることができる。
架橋されたコラーゲンスポンジに、ＬＴＢＰ−４タンパク質を含有するコラーゲン溶液を含浸させ、その後に凍結乾燥する弾性線維組織再生基材の製造方法もまた、本発明の１つである。
The method for producing the elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention is not particularly limited, but a collagen solution containing the LTBP-4 protein (if necessary, the DANCE protein and the mucopolysaccharide) in the crosslinked collagen sponge. Is impregnated, and then freeze-dried. According to such a production method, the LTBP-4 protein or the like can be reliably supported on the crosslinked collagen sponge. Further, since it is not necessary to carry out a treatment for cross-linking the collagen sponge after supporting the above-mentioned LTBP-4 protein or the like, there is no possibility that the LTBP-4 protein or the like is inactivated by the cross-linking treatment. Therefore, it is possible to achieve both sufficient strength and biodegradability rate as a scaffold for tissue regeneration and stable support of LTBP-4 protein.
A method for producing an elastic fiber tissue regeneration substrate in which a crosslinked collagen sponge is impregnated with a collagen solution containing an LTBP-4 protein and then freeze-dried is also one of the present inventions.
本発明の弾性線維組織再生基材の製造方法では、具体的には、まず、上記架橋されたコラーゲンスポンジに、ＬＴＢＰ−４タンパク質等を含有するコラーゲン溶液（以下、「タンパク質含有コラーゲン溶液」ともいう。）を含浸させる。含浸させる具体的な方法は特に限定されず、例えば、上記架橋されたコラーゲンスポンジ上の特定の箇所に溶液を受ける部位（例えば、リング）を設け、そのなかに上記タンパク質含有コラーゲン溶液を添加する方法が挙げられる。また、上記タンパク質含有コラーゲン溶液中に、架橋されたコラーゲンスポンジを浸漬してもよい。 In the method for producing an elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention, specifically, first, a collagen solution containing LTBP-4 protein or the like in the crosslinked collagen sponge (hereinafter, also referred to as "protein-containing collagen solution"). .) Is impregnated. The specific method for impregnation is not particularly limited, and for example, a method in which a site (for example, a ring) for receiving the solution is provided at a specific location on the crosslinked collagen sponge, and the protein-containing collagen solution is added thereto. Can be mentioned. Further, the crosslinked collagen sponge may be immersed in the protein-containing collagen solution.
上記タンパク質含有コラーゲン溶液に用いるコラーゲンとしては特に限定されず、上記架橋されたコラーゲンスポンジの原料となるコラーゲンと同様のものを用いることができる。
上記タンパク質含有コラーゲン溶液中のコラーゲンの濃度は特に限定されず、０．１〜１重量％程度であることが好ましく、０．１〜０．５重量％程度であることがより好ましい。
上記タンパク質含有コラーゲン溶液に用いる溶媒としては特に限定されず、例えば、水（蒸留水）、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、Ｃａｒｍｏｄｙ緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液等が挙げられる。なかでも、不純物が混入していない点から水（蒸留水）が好適である。
The collagen used in the protein-containing collagen solution is not particularly limited, and the same collagen as the raw material of the crosslinked collagen sponge can be used.
The concentration of collagen in the protein-containing collagen solution is not particularly limited, and is preferably about 0.1 to 1% by weight, more preferably about 0.1 to 0.5% by weight.
The solvent used for the protein-containing collagen solution is not particularly limited, and examples thereof include water (distilled water), phosphate buffered saline (PBS), Carmody buffer, and Tris buffer. Of these, water (distilled water) is preferable because it does not contain impurities.
なお、本発明の弾性線維組織再生基材がムコ多糖類を含む場合、コラーゲン溶液にムコ多糖類を直接添加してもよいが、取扱性の観点からは、ムコ多糖類を蒸留水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）等の溶媒に溶解した溶液にして、これをコラーゲン溶液に添加することが好ましい。 When the elastic fibrous tissue regeneration substrate of the present invention contains mucopolysaccharide, the mucopolysaccharide may be added directly to the collagen solution, but from the viewpoint of handleability, the mucopolysaccharide may be added to distilled water or physiological saline. It is preferable to prepare a solution dissolved in a solvent such as water or phosphate buffered saline (PBS) and add this to the collagen solution.
本発明の弾性線維組織再生基材の製造方法では、次いで、上記タンパク質含有コラーゲン溶液を含浸させた架橋コラーゲンスポンジを凍結乾燥する。
凍結乾燥の条件は特に限定されないが、例えば、コラーゲン溶液を−１３５〜−４０℃に冷却して凍結し、−４０℃から４０℃まで温度を上昇させながら６〜２４時間凍結乾燥を行うことができる。
In the method for producing an elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention, a crosslinked collagen sponge impregnated with the protein-containing collagen solution is then freeze-dried.
The conditions for freeze-drying are not particularly limited, but for example, the collagen solution may be cooled to −135 to −40 ° C., frozen, and freeze-dried for 6 to 24 hours while raising the temperature from −40 ° C. to 40 ° C. can.
本発明の弾性線維組織再生基材は、生体に移植することにより弾性線維組織の再生を促進させることができる。
本発明の弾性線維組織再生基材は、生体の弾性線維組織を再生させようとする部位に直接移植してもよい。この場合には、移植した弾性線維組織再生基材中に線維芽細胞等が侵入、増殖して、弾性線維組織が形成される。
また、本発明の弾性線維組織再生基材に線維芽細胞を播種して培養することによっても弾性線維組織を形成することができる。弾性線維組織が形成された弾性線維組織再生基材を生体の弾性線維組織を再生させようとする部位に移植することにより、より早期の弾性線維組織の再生が期待される。
The elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention can promote the regeneration of elastic fiber tissue by transplanting it into a living body.
The elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention may be directly transplanted to a site where the elastic fiber tissue of a living body is to be regenerated. In this case, fibroblasts and the like invade and proliferate in the transplanted elastic fiber tissue regeneration substrate, and elastic fiber tissue is formed.
In addition, elastic fiber tissue can also be formed by seeding and culturing fibroblasts on the elastic fiber tissue regeneration substrate of the present invention. By transplanting the elastic fiber tissue regeneration substrate on which the elastic fiber tissue is formed to the site where the elastic fiber tissue of the living body is to be regenerated, earlier regeneration of the elastic fiber tissue is expected.
本発明によれば、生体に移植することにより弾性線維組織の再生を促進させることができる弾性線維組織再生基材、及び、該弾性線維組織再生基材の製造方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide an elastic fiber tissue regeneration base material capable of promoting the regeneration of elastic fiber tissue by transplanting into a living body, and a method for producing the elastic fiber tissue regeneration base material.
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
（実施例１）
コラーゲン（新田ゼラチン社製、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩ−Ｐ）を原料とし、０．２重量％、ｐＨ３のコラーゲン水溶液を調整した。この０．２％コラーゲン溶液を−１３５℃にて凍結した後、凍結乾燥機にて真空減圧下（０．１ＭＰａ）、−４０℃から４０℃まで昇温して凍結乾燥することによってコラーゲンスポンジを得た。
得られたコラーゲンスポンジを、１４０℃で１４時間加熱することにより熱架橋を行い、架橋されたコラーゲンスポンジを得た。
得られた架橋されたコラーゲンスポンジの平均孔径は約１５μｍであった。
(Example 1)
Using collagen (Cellmatic Type I-P, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) as a raw material, a 0.2% by weight, pH 3 collagen aqueous solution was prepared. After freezing this 0.2% collagen solution at −135 ° C., the collagen sponge is freeze-dried by raising the temperature from −40 ° C. to 40 ° C. under vacuum reduced pressure (0.1 MPa) in a freeze-dryer. Obtained.
The obtained collagen sponge was thermally crosslinked by heating at 140 ° C. for 14 hours to obtain a crosslinked collagen sponge.
The average pore size of the obtained crosslinked collagen sponge was about 15 μm.
得られた架橋されたコラーゲンスポンジに、直径８ｍｍのポリプロピレン製のリングを接着した。ポリプロピレン製のリングの中に、濃度が３２μｇ／ｍＬとなるようにＬＴＢＰ−４タンパク質を含有させた０．２重量％コラーゲン溶液８０μＬを添加した。これを−１３５℃で凍結した後に、凍結乾燥機を用いて真空減圧下（０．１ＭＰａ）、−４０℃から４０℃まで昇温して１４時間凍結乾燥することにより、厚さ１ｍｍの弾性線維組織再生基材を得た。 A polypropylene ring having a diameter of 8 mm was adhered to the obtained crosslinked collagen sponge. In a polypropylene ring, 80 μL of a 0.2 wt% collagen solution containing the LTBP-4 protein was added to a concentration of 32 μg / mL. After freezing this at −135 ° C., the elastic fiber having a thickness of 1 mm was freeze-dried for 14 hours by raising the temperature from −40 ° C. to 40 ° C. under vacuum reduced pressure (0.1 MPa) using a freeze-dryer. A tissue-regenerated substrate was obtained.
（実施例２）
コラーゲン（新田ゼラチン社製、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩ−Ｐ）を原料とし、０．２重量％、ｐＨ３のコラーゲン水溶液を調整した。この０．２％コラーゲン溶液を−１３５℃にて凍結した後、凍結乾燥機にて真空減圧下（０．１ＭＰａ）、−４０℃から４０℃まで昇温して凍結乾燥することによってコラーゲンスポンジを得た。
得られたコラーゲンスポンジを、１４０℃で１４時間加熱することにより熱架橋を行い、架橋されたコラーゲンスポンジを得た。
得られた架橋されたコラーゲンスポンジの平均孔径は約１５μｍであった。
(Example 2)
Using collagen (Cellmatic Type I-P, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) as a raw material, a 0.2% by weight, pH 3 collagen aqueous solution was prepared. After freezing this 0.2% collagen solution at −135 ° C., the collagen sponge is freeze-dried by raising the temperature from −40 ° C. to 40 ° C. under vacuum reduced pressure (0.1 MPa) in a freeze-dryer. Obtained.
The obtained collagen sponge was thermally crosslinked by heating at 140 ° C. for 14 hours to obtain a crosslinked collagen sponge.
The average pore size of the obtained crosslinked collagen sponge was about 15 μm.
得られた架橋されたコラーゲンスポンジに、直径８ｍｍのポリプロピレン製のリングを接着した。ポリプロピレン製のリングの中に、濃度が各々３２μｇ／ｍＬ、３２μｇ／ｍＬとなるようにＬＴＢＰ−４タンパク質とＤＡＮＣＥタンパク質を含有させた０．２重量％コラーゲン溶液８０μＬを添加した。これを−１３５℃で凍結した後に、凍結乾燥機を用いて真空減圧下（０．１ＭＰａ）、−４０℃から４０℃まで昇温して１４時間凍結乾燥することにより、厚さ１ｍｍの弾性線維組織再生基材を得た。 A polypropylene ring having a diameter of 8 mm was adhered to the obtained crosslinked collagen sponge. 80 μL of 0.2 wt% collagen solution containing LTBP-4 protein and DANCE protein was added into a polypropylene ring so that the concentrations were 32 μg / mL and 32 μg / mL, respectively. After freezing this at −135 ° C., the elastic fiber having a thickness of 1 mm was freeze-dried for 14 hours by raising the temperature from −40 ° C. to 40 ° C. under vacuum reduced pressure (0.1 MPa) using a freeze-dryer. A tissue-regenerated substrate was obtained.
（比較例１）
コラーゲン（新田ゼラチン社製、Ｃｅｌｌｍａｔｒｉｘ ＴｙｐｅＩ−Ｐ）を原料とし、０．２重量％、ｐＨ３のコラーゲン水溶液を調整した。この０．３％コラーゲン溶液を−１３５℃にて凍結した後、凍結乾燥機にて真空減圧下（０．１ＭＰａ）、−４０℃から４０℃まで昇温して凍結乾燥することによってコラーゲンスポンジを得た。
得られたコラーゲンスポンジを、１４０℃で１４時間加熱することにより熱架橋を行い、架橋されたコラーゲンスポンジを得た。
得られた架橋されたコラーゲンスポンジの平均孔径は約１５μｍであった。
(Comparative Example 1)
Using collagen (Cellmatic Type I-P, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) as a raw material, a 0.2% by weight, pH 3 collagen aqueous solution was prepared. After freezing this 0.3% collagen solution at −135 ° C., the collagen sponge is freeze-dried by raising the temperature from −40 ° C. to 40 ° C. under vacuum reduced pressure (0.1 MPa) in a freeze-dryer. Obtained.
The obtained collagen sponge was thermally crosslinked by heating at 140 ° C. for 14 hours to obtain a crosslinked collagen sponge.
The average pore size of the obtained crosslinked collagen sponge was about 15 μm.
得られた架橋されたコラーゲンスポンジに、直径８ｍｍのポリプロピレン製のリングを接着した。ポリプロピレン製のリングの中に、０．２重量％コラーゲン溶液８０μＬを添加した。これを−１３５℃で凍結した後に、凍結乾燥機を用いて真空減圧下（０．１ＭＰａ）、−４０℃から４０℃まで昇温して１４時間凍結乾燥することにより、厚さ１ｍｍの弾性線維組織再生基材を得た。 A polypropylene ring having a diameter of 8 mm was adhered to the obtained crosslinked collagen sponge. 80 μL of 0.2 wt% collagen solution was added into a polypropylene ring. After freezing this at −135 ° C., the elastic fiber having a thickness of 1 mm was freeze-dried for 14 hours by raising the temperature from −40 ° C. to 40 ° C. under vacuum reduced pressure (0.1 MPa) using a freeze-dryer. A tissue-regenerated substrate was obtained.
（評価）
実施例１及び比較例１で得られた弾性線維組織再生基材を用いた弾性線維組織の形成を、以下の方法により評価した。
ヒト皮膚を処理することによって得られたヒト線維芽細胞を、線維芽細胞を１０％ウシ血清添加ＤＭＥＭ培地にて培養し、フルコンフルエントになった細胞をトリプシン処理によって回収した。得られたヒト線維芽細胞を１０％ウシ血清添加ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に懸濁し、線維芽細胞懸濁液を調製した。
得られた線維芽細胞懸濁液を、実施例１及び比較例１で得られた弾性線維組織再生基材の直径８ｍｍのポリプロピレン製のリング内部に、線維芽細胞が１×１０６ｃｅｌｌｓとなるように播種した。
その後、ＣＯ２インキュベーター中で、３７℃にて１４日間培養した。
(evaluation)
The formation of elastic fiber tissue using the elastic fiber tissue regeneration substrate obtained in Example 1 and Comparative Example 1 was evaluated by the following method.
Human fibroblasts obtained by treating human skin were cultured in DMEM medium supplemented with 10% fetal bovine serum, and the cells that became fluconfluent were recovered by trypsin treatment. The obtained human fibroblasts were suspended in DMEM / F12 medium supplemented with 10% bovine serum to prepare a fibroblast suspension.
The obtained fibroblast suspension has 1 × 10 6 cells in a polypropylene ring having a diameter of 8 mm of the elastic fiber tissue regeneration substrate obtained in Example 1 and Comparative Example 1. Was sown.
Then, the cells were cultured in a CO 2 incubator at 37 ° C. for 14 days.
培養後の弾性線維組織再生基材を新鮮未固定で凍結させ、凍結切片を作製し、アセトン固定後に弾性線維構成成分であるＥｌａｓｔｉｎの免疫染色を行った。実施例１で得られた弾性線維組織再生基材を用いた場合のＥｌａｓｔｉｎ免疫染色像を図１（ａ）に、比較例１で得られた弾性線維組織再生基材を用いた場合のＥｌａｓｔｉｎ免疫染色像を図１（ｂ）に示した。
図１より、ＬＴＢＰ−４タンパク質を含有する実施例１で得られた弾性線維組織再生基材を用いた場合には、含有しない比較例１で得られた弾性線維組織再生基材を用いた場合に比べて、Ｅｌａｓｔｉｎ染色面積が大きくなっていることがわかる。
The elastic fiber tissue regeneration substrate after culturing was frozen in a fresh unfixed state to prepare frozen sections, and after fixing with acetone, immunostaining of elastin, which is an elastic fiber component, was performed. The Elastin immunostaining image when the elastic fiber tissue regeneration substrate obtained in Example 1 is used is shown in FIG. 1 (a), and the Elastin immunostaining image when the elastic fiber tissue regeneration substrate obtained in Comparative Example 1 is used is shown in FIG. 1 (a). The stained image is shown in FIG. 1 (b).
From FIG. 1, when the elastic fiber tissue regeneration substrate obtained in Example 1 containing the LTBP-4 protein was used, the elastic fiber tissue regeneration substrate obtained in Comparative Example 1 not containing the LTBP-4 protein was used. It can be seen that the area of Elastin staining is larger than that of.
本発明によれば、生体に移植することにより弾性線維組織の再生を促進させることができる弾性線維組織再生基材、及び、該弾性線維組織再生基材の製造方法を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide an elastic fiber tissue regeneration base material capable of promoting the regeneration of elastic fiber tissue by transplanting into a living body, and a method for producing the elastic fiber tissue regeneration base material.
Claims (3)
前記ＬＴＢＰ−４タンパク質の含有量が０．１６重量％以上１．６重量％以下であり、
前記ＤＡＮＣＥタンパク質の含有量が０．０１重量％以上０．８重量％以下である
ことを特徴とする弾性線維組織再生基材。 And LTBP-4 protein, and DANCE protein, and a cross-linked collagen sponge carrying the LTBP-4 protein and DANCE protein seen including,
The content of the LTBP-4 protein is 0.16% by weight or more and 1.6% by weight or less.
An elastic fiber tissue regeneration base material characterized in that the content of the DANCE protein is 0.01% by weight or more and 0.8% by weight or less.
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