JP6956402B2 - analysis method - Google Patents
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Description
本発明は、解析方法に関し、詳しくは、検体中の目的生体物質を解析する方法に関する。 The present invention relates to an analysis method, and more particularly to a method for analyzing a target biological substance in a sample.
ダウン症(Ｄown syndrome）は２１番染色体のトリソミーが原因で起こる、ヒトで最も多い染色体異常症である。ダウン症の患者は合併症として、白血病、特に巨核芽球性白血病（ＡＭＫＬ；acute megakaryoblastic leukemia）の幼少期における発症リスクが高いことが知られており、０〜４才におけるダウン症児のＡＭＫＬ発症リスクは非ダウン症児に比較して４００〜５００倍とされている。ダウン症の新生児の５〜１０％において、白血病様芽球が末梢血中に増加する病態を示す血液疾患である、一過性骨髄異常増殖症（Transient Abnormal Myelopoiesis；ＴＡＭ）が発症する。ＴＡＭ患者の多くは寛解するが、その後患者の２０〜３０％が生後３年以内にＡＭＫＬを発症する。ＡＭＫＬを発症した場合は治療介入が必要であることから、ＴＡＭを早期に診断し、またＴＡＭと診断された場合には経過観察を行い、さらに反復して検査を繰り返すことにより迅速にＡＭＫＬの確定診断を行うことが、臨床上求められている。 Down syndrome is the most common chromosomal abnormality in humans caused by trisomy 21. It is known that patients with Down's syndrome have a high risk of developing leukemia, especially acute megakaryoblastic leukemia (AMKL) in early childhood, as a complication, and the risk of developing AMKL in children with Down's syndrome between the ages of 0 and 4 is high. It is said to be 400 to 500 times that of children with non-Down syndrome. Transient Abnormal Myelopoiesis (TAM), a blood disorder that presents with an increase in leukemic blasts in the peripheral blood, develops in 5-10% of newborns with Down syndrome. Most TAM patients are in remission, but 20-30% of patients subsequently develop AMKL within the first 3 years of life. Since treatment intervention is required when AMKL develops, TAM is diagnosed early, and if TAM is diagnosed, follow-up is performed, and AMKL is quickly confirmed by repeating the examination. It is clinically required to make a diagnosis.
近年、ＴＡＭおよびＡＭＫＬを発症したダウン症児のほぼ全例において、転写因子ＧＡＴＡ−１遺伝子（Gene ID；2623）の変異が認められ、Ｎ末端にある転写活性化領域を欠くバリアントであるＧＡＴＡ−１ｓが発現するようになることが報告されている（非特許文献１）。 In recent years, mutations in the transcription factor GATA-1 gene (Gene ID; 2623) have been observed in almost all children with Down syndrome who have developed TAM and AMKL, and GATA-1s is a variant lacking the transcriptional activation region at the N-terminus. Has been reported to be expressed (Non-Patent Document 1).
ＧＡＴＡ−１が変異を起こしているかどうかを確認するためには遺伝子レベルでの解析が必要であるが、患者から採取した細胞から核酸を抽出して遺伝子を増幅して塩基配列を解析するなど、遺伝子の解析には非常に時間がかかるという問題がある。 Analysis at the gene level is necessary to confirm whether GATA-1 is mutated, but nucleic acids are extracted from cells collected from patients, the genes are amplified, and the base sequence is analyzed. There is a problem that gene analysis takes a very long time.
また、ＡＭＫＬを含む急性骨髄性白血病の診断においては、患者から採取した骨髄で作製した骨髄塗抹標本に、形態染色（ＨＥ染色等）、細胞染色（ペルオキシダーゼ染色等）、免疫染色などによる病理検査が一般的に行われている。これらの方法においては結果がでるまでに時間がかかったり、検査を行う技師の経験や技術、または検査を行う際の温度・時間などの環境条件により結果が左右されるなどの問題がある。 In the diagnosis of acute myeloid leukemia including AMKL, pathological examination by morphological staining (HE staining, etc.), cell staining (peroxidase staining, etc.), immunostaining, etc. is performed on the bone marrow smear prepared from the bone marrow collected from the patient. It is commonly done. These methods have problems that it takes time to obtain the result, and the result depends on the experience and skill of the inspecting engineer or the environmental conditions such as the temperature and time at the time of the inspection.
近年では、フローサイトメーターを用いて蛍光色素で標識した細胞マーカーを検出する方法が用いられるようになってきた。この方法では短時間に多量（数千個から数百万個）の細胞について高精度かつ高速で解析することができることから、従来行われてきた方法よりも検査にかかる時間が大幅に短縮でき、さらに高い精度で定量的に解析が可能である。特許文献１には、造血器腫瘍細胞株における細胞や、患者から採取した末梢血から分離した単核球表面におけるタンパク質の発現を、フローサイトメトリーで測定する方法が記載されている。しかし特許文献１においては一つのタンパク質について一つの抗体を用いて検出をおこなっており、この方法を用いたとしてもＧＡＴＡ−１が変異を起こしているか否かの判断をすることができない。
In recent years, a method of detecting a cell marker labeled with a fluorescent dye using a flow cytometer has been used. Since this method can analyze a large number of cells (thousands to millions) in a short time with high accuracy and high speed, the time required for the test can be significantly shortened compared to the conventional method. Quantitative analysis is possible with even higher accuracy.
遺伝子変異に基づいた変異を確認するには上述したように遺伝子レベルでの解析が必要である。本発明は検体に含まれる細胞について、染色体上の遺伝情報に由来するバリアント（多型）を含む目的生体物質について解析するための手段である解析方法に関する。 As described above, analysis at the gene level is required to confirm mutations based on gene mutations. The present invention relates to an analysis method that is a means for analyzing a target biological substance containing a variant (polymorphism) derived from genetic information on a chromosome in a cell contained in a sample.
本発明者は、目的生体物質に対して、２種類の標識物質を用いてフローサイトメトリーによる解析を行うことにより、検体中の目的生体物質が、生物が本来保有する遺伝子配列を有する遺伝子（野生型遺伝子）に由来するものであるか、あるいはそのバリアントであるかを迅速に判定できることを見出した。 The present inventor analyzes the target biological substance by flow cytometry using two types of labeling substances, so that the target biological substance in the sample has a gene having a gene sequence originally possessed by the organism (wild). It was found that it is possible to quickly determine whether it is derived from a type gene) or a variant thereof.
すなわち、本発明は次のような解析方法を提供する。
［１］
下記工程（１）〜（３）を含む、検体中の目的生体物質を解析する方法であって、
前記目的生体物質が、第１目的生体物質および第１目的生体物質のバリアントである第２目的生体物質の少なくとも一種を含む、解析方法。
工程（１） 検体に含まれる細胞を細胞固定液で固定する、固定処理工程
工程（２） 工程（１）を行った後、第１目的生体物質に結合する第１標識物質および第２目的生体物質に結合する第２標識物質を、前記細胞に接触させる蛍光染色工程
工程（３） 工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって前記細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析する解析工程
［２］
前記工程（１）を行った後、前記工程（２）を行う前または前記工程（２）を行うと同時に、さらに下記工程（Ａ）を行う、項１に記載の解析方法。
工程（Ａ） 前記細胞を細胞膜透過処理液に接触させる、細胞膜透過処理工程
［３］
前記工程（３）が、下記工程（３’）である、項１または２に記載の解析方法。
工程（３’） 工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって、蛍光染色処理された細胞を測定し、さらに細胞を分取する解析工程
［４］
前記第１目的生体物質および／または前記第２目的生体物質が疾患のマーカーとなる物質である、項１〜３のいずれか１項に記載の解析方法。
［５］
前記疾患が、がん、神経変性疾患、炎症性疾患、血液疾患、代謝異常から選択される、請求項４に記載の解析方法。
［６］
前記第１目的生体物質および前記第２目的生体物質がタンパク質である、項１〜５のいずれか１項に記載の解析方法。
［７］
前記質第１目的生体物質が野生型タンパク質であり、前記第２目的生体物質が変異型タンパク質である、項１〜６のいずれか１項に記載の解析方法。
［８］
前記変異型タンパク質が短縮型タンパク質である項７に記載の解析方法。
［９］
前記質第１目的生体物質がＧＡＴＡ−１ｆであり、前記第２目的生体物質がＧＡＴＡ−１ｓである、項１〜８のいずれか１項に記載の解析方法。
［１０］
上記検体が、ヒトまたはヒト以外の動物から採取した、組織、血液または骨髄液から調製される、項１〜９のいずれか１項に記載の解析方法。
That is, the present invention provides the following analysis method.
[1]
A method for analyzing a target biological substance in a sample, which comprises the following steps (1) to (3).
An analysis method, wherein the target biological substance contains at least one of a first target biological substance and a second target biological substance which is a variant of the first target biological substance.
Step (1) Fixation treatment step of fixing cells contained in a sample with a cell-fixing solution Step (2) After performing step (1), the first labeling substance and the second target living body that bind to the first target biological substance Fluorescence staining step of bringing the second labeling substance to be bound to the substance into contact with the cells Step (3) After performing step (2), fluorescence from the cells is acquired as detection data by flow cytometry, and the detection data. Analysis process to analyze [2]
Step (A) Cell membrane permeation treatment step of bringing the cells into contact with the cell membrane permeation treatment liquid [3]
Step (3') After performing step (2), the cells subjected to fluorescence staining are measured by flow cytometry, and the cells are further separated. [4]
Item 3. The analysis method according to any one of
[5]
The analysis method according to
[6]
Item 6. The analysis method according to any one of
[7]
Item 6. The analysis method according to any one of
[8]
Item 8. The analysis method according to
[9]
[10]
Item 8. The analysis method according to any one of
本発明の解析方法によれば、従来の評価手法と比べて、目的生体物質の検出・解析を、より迅速にまた高精度で行うことが可能になる。 According to the analysis method of the present invention, it is possible to detect and analyze the target biological substance more quickly and with high accuracy as compared with the conventional evaluation method.
本発明の「解析方法」においては、第１標識物質および第２標識物質として、例えば蛍光色素で修飾した抗体を用いることができる。前記標識物質を用いた標識した細胞をフローサイトメトリーで測定することによって、検体に含まれる細胞における第１目的生体物質および第２目的生体物質の量並びにそれぞれの生体物質が存在している細胞の割合を測定・解析することができる。 In the "analysis method" of the present invention, for example, an antibody modified with a fluorescent dye can be used as the first labeling substance and the second labeling substance. By measuring the labeled cells using the labeling substance by flow cytometry, the amounts of the first target biological substance and the second target biological substance in the cells contained in the sample, and the cells in which the respective biological substances are present The ratio can be measured and analyzed.
＜フローサイトメトリーによる解析方法＞
本発明の解析方法は、下記工程（１）〜（３）を含む、検体中の目的生体物質を解析する方法である。本発明において、前記目的生体物質としては、第１目的生体物質および第１目的生体物質のバリアントである第２目的生体物質の少なくとも一種を含む。
工程（１） 検体に含まれる細胞を細胞固定液で固定する、固定処理工程
工程（２） 工程（１）を行った後、第１目的生体物質に結合する第１標識物質および第２目的生体物質に結合する第２標識物質を、前記細胞に接触させる蛍光染色工程
工程（３） 工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって前記細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析する解析工程
<Analysis method by flow cytometry>
The analysis method of the present invention is a method for analyzing a target biological substance in a sample, which comprises the following steps (1) to (3). In the present invention, the target biological substance includes at least one of a first target biological substance and a second target biological substance which is a variant of the first target biological substance.
Step (1) Fixation treatment step of fixing cells contained in a sample with a cell-fixing solution Step (2) After performing step (1), the first labeling substance and the second target living body that bind to the first target biological substance Fluorescence staining step of bringing the second labeling substance to be bound to the substance into contact with the cells Step (3) After performing step (2), fluorescence from the cells is acquired as detection data by flow cytometry, and the detection data. Analysis process to analyze
（工程（１）、固定処理工程）
前記工程（１）は、本発明の解析方法の対象となる検体に含まれる細胞を細胞固定液で固定する、固定処理工程である。工程（１）では、細胞に含まれるタンパク質を固定化される。前記細胞固定液は特に限定されないが、メタノール、エタノール、アセトン、ホルマリン、パラホルムアルデヒド等を用いることができる。細胞固定液の濃度は、使用する細胞固定液に応じて決定すればよく、例えばパラホルムアルデヒドを用いる場合には、３％（ｗ／ｖ）〜５％（ｗ／ｖ）にするとよい。工程（１）を行ったあと工程（２）を行う前に、ＰＢＳ（Phosphate buffered saline）等で細胞を洗浄して細胞固定液を細胞から除去することが好ましい。
(Step (1), fixing process)
The step (1) is a fixation treatment step of fixing cells contained in a sample subject to the analysis method of the present invention with a cell fixative. In step (1), the protein contained in the cell is immobilized. The cell fixative is not particularly limited, but methanol, ethanol, acetone, formalin, paraformaldehyde and the like can be used. The concentration of the cell fixative may be determined according to the cell fixative to be used. For example, when paraformaldehyde is used, the concentration may be 3% (w / v) to 5% (w / v). After the step (1) and before the step (2), it is preferable to wash the cells with PBS (Phosphate buffered saline) or the like to remove the cell fixation solution from the cells.
（工程（Ａ）、細胞膜透過処理工程）
本発明の解析方法では、工程（１）を行った後、工程（２）を行う前または工程（２）を行うと同時に、さらに、前記細胞を細胞膜透過処理液に接触させる、細胞膜透過処理工程（工程（Ａ））を行なってもよい。特に後述する目的生体物質が細胞内に存在するタンパク質または核酸である場合には、標識物質を細胞内の目的生体物質と結合させるために工程（Ａ）を行うことがより好ましい。
(Step (A), cell membrane permeation treatment step)
In the analysis method of the present invention, a cell membrane permeation treatment step in which the cells are brought into contact with the cell membrane permeation treatment liquid after the step (1) is performed, before the step (2) is performed, or at the same time as the step (2) is performed. (Step (A)) may be performed. In particular, when the target biological substance described later is a protein or nucleic acid existing in the cell, it is more preferable to carry out the step (A) in order to bind the labeling substance to the target biological substance in the cell.
細胞膜透過処理液は、細胞の形態を保持しつつ細胞膜及び核膜の透過性を増大させるものであれば特に限定されないが、市販の細胞膜透過処理試薬を用いてもよいし、任意の界面活性剤等を用いて調製したものを用いてもよい。このような目的の膜透過処理液としては、特に限定されないが、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）４０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）６０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０、ＮＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００等の非イオン系界面活性剤やメタノール等のアルコール類が好適に用いられる。細胞膜透過処理液の濃度は、使用する細胞膜透過処理液に応じて決定すればよく、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）２０を用いる場合には０．０５％（ｖ／ｖ）〜１．０％（ｖ／ｖ）とするとよく、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００やＮＰ−４０を用いる場合には０．１〜０．５％（ｖ／ｖ）とするとよく、またメタノールを用いる場合には９０％（ｖ／ｖ）〜１００％（ｖ／ｖ）とするとよい。工程（Ａ）を行ったあと工程（２）を行う前に、ＰＢＳ等で細胞を洗浄して細胞固定液を細胞から除去することが好ましい。 The cell membrane permeation treatment solution is not particularly limited as long as it increases the permeability of the cell membrane and the nuclear membrane while maintaining the cell morphology, but a commercially available cell membrane permeation treatment reagent may be used, or any surfactant. You may use the one prepared by using the above. The membrane permeation treatment liquid for such a purpose is not particularly limited, but for example, TWEEN (registered trademark) 20, TWEEN (registered trademark) 40, TWEEN (registered trademark) 60, TWEEN (registered trademark) 80, NP-40. Nonionic surfactants such as (Noidet P-40) and Triton® X-100 and alcohols such as methanol are preferably used. The concentration of the cell membrane permeation treatment solution may be determined according to the cell membrane permeation treatment solution to be used. For example, when TWEEN® 20 is used, it is 0.05% (v / v) to 1.0% (v). / V), 0.1 to 0.5% (v / v) when using Triton® X-100 or NP-40, and 90% when using methanol. It may be (v / v) to 100% (v / v). After the step (A) and before the step (2), it is preferable to wash the cells with PBS or the like to remove the cell fixative from the cells.
（工程（２）、蛍光染色工程）
前記工程（２）は、工程（１）を行った後に行われる工程であり、第１目的生体物質に結合する第１標識物質および第２目的生体物質に結合する第２標識物質を、前記細胞に接触させる蛍光染色工程である。
前記蛍光染色工程における蛍光染色は、第１標識物質および第２標識物質によって行われる。蛍光染色としては、特に限定されないが、蛍光免疫染色であることが好ましい。工程（２）は、検体に含まれる細胞と標識物質とを接触させることにより、該蛍光色素を直接的または間接的に目的生体物質に結合させて行うことが好ましい。
(Step (2), Fluorescent dyeing step)
The step (2) is a step performed after the step (1) is performed, and the cells are subjected to the first labeling substance that binds to the first target biological substance and the second labeling substance that binds to the second target biological substance. It is a fluorescent dyeing step of contacting with.
The fluorescent dyeing in the fluorescent dyeing step is performed by the first labeling substance and the second labeling substance. The fluorescent staining is not particularly limited, but is preferably fluorescent immunostaining. The step (2) is preferably carried out by directly or indirectly binding the fluorescent dye to the target biological substance by bringing the cells contained in the sample into contact with the labeling substance.
蛍光染色の時間、好ましくは、細胞と標識物質とを接触させる時間は、一般的な蛍光染色を行う場合に準じて、蛍光染色が充分に行われるよう適宜調整することができるが、通常は５分〜半日程度とすればよい。 The time for fluorescent staining, preferably the time for contacting the cells with the labeling substance, can be appropriately adjusted so that the fluorescent staining can be sufficiently performed, as in the case of general fluorescent staining, but usually 5 It may be about a minute to half a day.
蛍光染色の温度、すなわち反応温度は、一般的な蛍光染色を行う場合に準じて、蛍光染色が充分に行われるよう適宜調整することができるが、通常は４〜３７℃程度とすればよい。 The temperature of the fluorescent dyeing, that is, the reaction temperature can be appropriately adjusted so that the fluorescent dyeing can be sufficiently performed in the same manner as in the case of performing general fluorescent dyeing, but it is usually about 4 to 37 ° C.
蛍光染色において、細胞に接触させる標識物質の濃度は、特に限定されないが、標識物質および目的生体物質の選択に応じて、蛍光染色が充分に行われるよう適宜調整することができる。 In the fluorescent staining, the concentration of the labeling substance in contact with the cells is not particularly limited, but can be appropriately adjusted so that the fluorescent staining is sufficiently performed according to the selection of the labeling substance and the target biological substance.
(工程（３）、解析工程)
前記工程（３）は、工程（２）を行った後に行われる工程であり、フローサイトメトリーによって前記細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析する解析工程である。
前記工程（３）は前記蛍光染色工程を行った後、フローサイトメトリーによって、蛍光染色処理された細胞の蛍光強度や波長等を検出・測定し、得られた測定結果（検出データ）を用いて解析を行う工程である。
(Step (3), analysis step)
The step (3) is a step performed after the step (2) is performed, and is an analysis step of acquiring fluorescence from the cells as detection data by flow cytometry and analyzing the detection data.
In the step (3), after performing the fluorescence staining step, the fluorescence intensity, wavelength, etc. of the cells subjected to the fluorescence staining are detected and measured by flow cytometry, and the obtained measurement results (detection data) are used. This is the process of performing analysis.
検出データは相関ヒストグラムとして示され、これらのヒストグラムを解析することにより、検体に含まれる細胞の特性を、細胞ごとに明らかにできる。近年では複数の光線と検出器を装備した装置が市販されており、複数の測定情報から相関解析や統計解析を行うことができる。 The detected data are shown as correlation histograms, and by analyzing these histograms, the characteristics of the cells contained in the sample can be clarified for each cell. In recent years, devices equipped with a plurality of light rays and detectors are commercially available, and correlation analysis and statistical analysis can be performed from a plurality of measurement information.
蛍光の検出に先行して、前方散乱光（Forward Scatter: FSC）及び側方散乱光（Side Scatter: SSC）を測定してゲートをかけることで、目的の細胞集団の蛍光強度のみを測定してもよい。具体的には例えば、前方散乱光及び側方散乱光をそれぞれＸ軸及びＹ軸にとり、ドットプロット展開から得られるデータにおいて目的細胞と思われる細胞集団にゲートをかけ、ゲート内の蛍光強度を測定することで目的の細胞集団の測定結果のみを取得することで、より精度の高い解析が可能になる。
(工程（３’）、解析工程)
Prior to the detection of fluorescence, forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) are measured and gated to measure only the fluorescence intensity of the target cell population. May be good. Specifically, for example, the forward scattered light and the lateral scattered light are taken on the X-axis and the Y-axis, respectively, and the cell population considered to be the target cell is gated in the data obtained from the dot plot expansion, and the fluorescence intensity in the gate is measured. By doing so, more accurate analysis becomes possible by acquiring only the measurement results of the target cell population.
(Process (3'), analysis process)
本発明の解析方法においては、前記工程（３)として、工程（３’）を行ってもよい。工程（３’）は工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析するとともに、該データに基づいて特定の細胞を分取する工程である。工程（３’）を行うことにより、例えば、蛍光染色処理を行った細胞から第１標識物質および／または第２標識物質で標識されている細胞を選別して分取することができる。 In the analysis method of the present invention, step (3') may be performed as the step (3). In step (3'), after performing step (2), fluorescence from cells is acquired as detection data by flow cytometry, the detection data is analyzed, and specific cells are sorted based on the data. It is a process. By performing the step (3'), for example, cells labeled with the first labeling substance and / or the second labeling substance can be selected and sorted from the cells subjected to the fluorescent staining treatment.
＜フローサイトメトリー＞
フローサイトメトリーとは流体中に分散させた細胞を光学的に分析する手法であり、蛍光標識した細胞を分散させた流体に、一定波長の光線（レーザー光線）を照射することで生じた蛍光を蛍光検出器によって検出し、得られた検出データに基づいて、標識された細胞の数や全細胞中に占める割合、各細胞における蛍光標識された生体物質の量などを定量測定することができる。フローサイトメトリーに用いられる装置をフローサイトメーターと呼び、例えば日本ベクトン・ディッキンソン株式会社、ベックマン・コールター株式会社などから販売されており、本発明ではこれらを利用することができる。基本的な操作法、解析条件などは装置に添付の取扱説明書に従えばよい。また、フローサイトメトリー解析に関する論文や成書も数多く存在し、例えば、国際サイトメトリー学会（ISAC）による学会誌「Cytometry」や、一般社団法人日本サイトメトリー学会による学会誌「Cytometry Research」等が参考になる。
<Flow cytometry>
Flow cytometry is a method of optically analyzing cells dispersed in a fluid, and fluoresces the fluorescence generated by irradiating the fluid in which fluorescently labeled cells are dispersed with a light beam (laser beam) of a constant wavelength. Based on the detection data obtained by detecting with a detector, the number of labeled cells, the proportion of the cells in the total cells, the amount of the fluorescently labeled biological substance in each cell, and the like can be quantitatively measured. The device used for flow cytometry is called a flow cytometer, and is sold by, for example, Japan Becton Dickinson Co., Ltd., Beckman Coulter Co., Ltd., etc., and these can be used in the present invention. The basic operation method, analysis conditions, etc. may follow the instruction manual attached to the device. In addition, there are many papers and books on flow cytometry analysis. For example, the journal "Cytometry" by the International Cytometry Society (ISAC) and the journal "Cytometry Research" by the Japan Cytometry Society can be referred to. become.
また上述したように細胞の分取を行うためには、セルソーターを装備したフローサイトメーターを用いることができる。セルソーターは、例えば、フローサイトメーターにおいて前述のように検出データが取得された後、この検出データに基づいて、細胞をソーティングする装置である。市販のセルソーター装備フローサイトメーターとして、例えば、ＰＥＲＦｌｏｗ Ａｌｌ（古河電気工業社製）等が挙げられる。 Further, in order to sort the cells as described above, a flow cytometer equipped with a cell sorter can be used. The cell sorter is, for example, a device that sorts cells based on the detection data after the detection data is acquired by the flow cytometer as described above. Examples of a commercially available flow cytometer equipped with a cell sorter include PERFlow All (manufactured by Furukawa Electric Co., Ltd.).
＜検体＞
本発明において「検体」は、特に限定されないが、典型的には培養細胞、またはヒトまたはヒト以外の動物から採取した、組織、血液（末梢血）、骨髄液等から適切な方法で調製した、細胞浮遊液であることが好ましい。
<Sample>
In the present invention, the "specimen" is not particularly limited, but is typically prepared by an appropriate method from cultured cells or tissues, blood (peripheral blood), bone marrow fluid, etc. collected from humans or non-human animals. It is preferably a cell suspension.
検体の調整方法は、特に限定されないが、フローサイトメトリーに用いる試料を調製する際に従来慣用されている手順に従って行うことができる。例えばヒトから採取した血液を用いて検体を調製する場合、ＥＤＴＡ、クエン酸等の抗凝固剤が添加された採血チューブに採血した血液を、溶血処理溶液により溶液処理して赤血球を除去することで検体とすることができる。溶血処理の代わりに、採取した血液を遠心分離することで取得した単核球画分を検体としてもよい。組織から検体を調製する場合には酵素処理またはホモジナイザーを用いた処理により、組織に含まれる細胞以外の物質（間質等）を除去し、組織に含まれる細胞のみを回収してＰＢＳ等に懸濁したものを検体とすることが好ましい。検体に含まれる細胞は特に限定されないが、例えば、がん細胞、免疫細胞、白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）等が挙げられる。 The method for preparing the sample is not particularly limited, but the sample can be prepared according to a conventionally used procedure when preparing a sample to be used for flow cytometry. For example, when preparing a sample using blood collected from a human, the blood collected in a blood collection tube to which an anticoagulant such as EDTA or citric acid is added is treated with a hemolytic solution to remove red blood cells. It can be a sample. Instead of the hemolysis treatment, the mononuclear cell fraction obtained by centrifuging the collected blood may be used as a sample. When preparing a sample from a tissue, substances other than the cells contained in the tissue (stomach, etc.) are removed by enzyme treatment or treatment using a homogenizer, and only the cells contained in the tissue are collected and suspended in PBS or the like. It is preferable to use a turbid sample as a sample. The cells contained in the sample are not particularly limited, and examples thereof include cancer cells, immune cells, white blood cells (lymphocytes, monocytes, neutrophils, eosinophils, basophils) and the like.
本発明の実施形態の一例において、検体は疾患に罹患したヒト（患者）や健常者から採取した組織、血液、骨髄液から調製することが好ましい。疾患は特に限定されないが、がん（固形がん、血液がん、リンパ腫等）、神経変性疾患、炎症性疾患、血液疾患、代謝異常等の、遺伝子変異によって引き起こされる疾患やその発病に遺伝子変異が関与していると推定される疾患、および患者の多くに特定の遺伝子変異が確認される疾患等が挙げられる。 In an example of the embodiment of the present invention, the sample is preferably prepared from tissues, blood, and bone marrow fluid collected from a diseased human (patient) or a healthy person. Diseases are not particularly limited, but gene mutations in diseases caused by gene mutations such as cancer (solid cancer, blood cancer, lymphoma, etc.), neurodegenerative diseases, inflammatory diseases, blood diseases, metabolic disorders, etc. Diseases that are presumed to be involved in leukemia, and diseases in which a specific gene mutation is confirmed in many patients.
患者とは、疾患に罹患していることが疑われる者、他の方法により疾患に罹患していると判断された者、疾患に罹患するリスクが高い者等を含んでいてもよい。具体的な例としては、ダウン症新生児、ＴＡＭを発症した患者、染色等の病理検査でＡＭＫＬが疑われている者等が挙げられる。 Patients may include those who are suspected of having the disease, those who are determined to have the disease by other means, those who are at high risk of developing the disease, and the like. Specific examples include newborns with Down's syndrome, patients who have developed TAM, and those who are suspected of having AMKL by pathological examination such as staining.
＜目的生体物質＞
本発明において「目的生体物質」とは、検体に含まれる細胞に存在している生体物質であり、好ましくは検体に含まれる細胞が発現している生体物質である。本発明において検出される目的生体物質は、特に限定されないが、タンパク質であることが好ましく、染色体上の遺伝情報に由来するバリアント（多型）を含むことがより好ましい。本明細書においては目的生体物質の１つを第１目的生体物質、そのバリアントを第２目的生体物質という。本発明の目的生体物質には、第１目的生体物質および第２目的生体物質に加えてさらに別のバリアント（第Ｎ目的生体物質（Ｎ≧３））が含まれていてもよいし、第１目的生体物質および第２目的生体物質に加えてさらに別の生体物質が含まれていてもよい。
<Target biological substance>
In the present invention, the "target biological substance" is a biological substance present in the cells contained in the sample, and preferably a biological substance in which the cells contained in the sample are expressed. The target biological substance detected in the present invention is not particularly limited, but is preferably a protein, and more preferably contains a variant (polymorphism) derived from genetic information on a chromosome. In the present specification, one of the target biological substances is referred to as a first target biological substance, and a variant thereof is referred to as a second target biological substance. The target biological material of the present invention may contain yet another variant (Nth target biological material (N ≧ 3)) in addition to the first target biological material and the second target biological material, or the first. In addition to the target biological substance and the secondary target biological substance, another biological substance may be contained.
典型的な例を挙げると、目的生体物質がタンパク質である場合、第１目的生体物質は、該タンパク質をコードする遺伝子であって生物が本来保有する遺伝子配列を有する遺伝子（野生型遺伝子）に由来する野生型タンパク質であり、第２目的生体物質は変異型の遺伝子配列を有する遺伝子（変異型遺伝子）に由来する変異型タンパク質である。第１目的生体物質と野生型タンパク質および第２目的生体物質と変異型タンパク質の組み合わせはそれぞれ逆（つまり第１目的生体物質が変異型タンパク質であり、第２目的生体物質が野生型タンパク質である）であってもよい。また、第１目的生体物質および第２目的生体物質がそれぞれ異なった変異型遺伝子に由来する変異型タンパク質であってもよい。 To give a typical example, when the target biological substance is a protein, the first target biological substance is derived from a gene encoding the protein and having a gene sequence originally possessed by the organism (wild type gene). The second target biological substance is a mutant protein derived from a gene having a mutant gene sequence (mutant gene). The combinations of the first target biological substance and the wild-type protein and the second target biological substance and the mutant protein are opposite (that is, the first target biological substance is the mutant protein and the second target biological substance is the wild-type protein). May be. Further, the first target biological substance and the second target biological substance may be mutant proteins derived from different mutant genes.
前記変異型タンパク質は特に限定されないが、野生型タンパク質と大きく構造が異なったものが好ましい。例えば、野生型の遺伝子配列のある部分の塩基が変化することで、タンパク質中のあるアミノ酸をコードしていたコドンがストップコドンに変化する、ナンセンス突然変異(nonsense mutation)により生じる、正常タンパク質よりも短い短縮型タンパク質（truncated protein）が好ましい例として挙げられる。遺伝子変異により短縮型タンパク質を形成し得るタンパク質としては、特に限定されないが、ＧＡＴＡ−１、ＣＥＢＰ／α、ＢＲＣＡ２、ＡＰＣ、ＰＬＥＣ１等が挙げられる。例えば、第１目的物質および第２目的物質の具体的な一例としては、第１目的物質が野生型（全長型）のＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｆ）であり、第２目的物質がＧＡＴＡ−１の変異型（短縮型）タンパク質であるＧＡＴＡ−１ｓである組み合せが挙げられる。 The mutant protein is not particularly limited, but a protein having a structure significantly different from that of the wild-type protein is preferable. For example, a change in the base of a part of a wild-type gene sequence changes the codon that encoded an amino acid in the protein to a stop codon, which is caused by a nonsense mutation, compared to a normal protein. Short truncated proteins are preferred examples. The protein capable of forming a shortened protein by gene mutation is not particularly limited, and examples thereof include GATA-1, CEBP / α, BRCA2, APC, and PLEC1. For example, as a specific example of the first target substance and the second target substance, the first target substance is a wild type (full length type) GATA-1 (GATA-1f), and the second target substance is GATA-1. A combination of GATA-1s, which is a mutant (shortened) protein of.
本発明の実施形態の一例においては、第１目的物質または第２目的物質が疾患のマーカーなど、疾患に関連する生体物質であることが好ましい。例えば、第１目的物質が野生型タンパク質であり、第２目的物質が変異型タンパク質（第１目的物質である野生型タンパク質の変異型タンパク質）であって、該変異タンパク質が疾患関連タンパク質である。このような疾患関連タンパク質は、ある疾患の患者に由来する細胞に特徴的に発現しているタンパク質であってもよいし、患者に由来する細胞においてのみ修飾（リン酸化、脱リン酸化、アセチル化、糖鎖化等）を受けるタンパク質であってもよい。疾患関連タンパク質は特に限定されないが、例えば腫瘍関連タンパク質、免疫関連タンパク質、炎症系タンパク質等が挙げられる。より具体的には例えばシグナル伝達にかかわる受容体またはリガンドであることが挙げられ、さらに具体的には、転写因子、増殖因子、サイトカイン、およびそれらの受容体等が挙げられる。 In an example of an embodiment of the present invention, it is preferable that the first-target substance or the second-target substance is a biological substance related to a disease, such as a marker for the disease. For example, the first target substance is a wild-type protein, the second target substance is a mutant protein (mutant protein of the wild-type protein which is the first target substance), and the mutant protein is a disease-related protein. Such disease-related proteins may be proteins that are characteristically expressed in cells derived from a patient with a certain disease, or are modified (phosphorylated, dephosphorylated, acetylated) only in cells derived from the patient. , Sugar chain formation, etc.). Disease-related proteins are not particularly limited, and examples thereof include tumor-related proteins, immune-related proteins, and inflammatory proteins. More specifically, for example, it is a receptor or a ligand involved in signal transduction, and more specifically, a transcription factor, a growth factor, a cytokine, and a receptor thereof and the like can be mentioned.
＜標識物質＞
本発明の標識物質は、前記目的生体物質を特異的に認識して結合することにより、前記目的生体物質を標識する物質であり、典型的には、目的生体物質を認識して結合する構成要素と検出のための標識である構成要素とを含み、それぞれの構成要素が直接的にまたは間接的に結合したものである。検出のための標識である構成要素としては、通常蛍光色素が用いられるが、生体物質を検出するための標識として用いることができるものであれば特に限定されない。目的生体物質を特異的に認識して結合する構成要素としては、典型的には、目的生体物質がタンパク質である場合には抗体であり、目的生体物質が核酸である場合、目的生体物質と相補的な配列を有する核酸である。標識物質は、例えば、市販されている蛍光標識試薬（キット）を利用して、抗体または核酸と蛍光色素とを結合させることで作製することができる。また、あらかじめ所望の抗体に所望の蛍光色素が結合されている蛍光標識抗体が市販されていれば、それを標識物質として利用してもよい。
<Labeling substance>
The labeling substance of the present invention is a substance that labels the target biological substance by specifically recognizing and binding the target biological substance, and is typically a component that recognizes and binds to the target biological substance. And components that are markers for detection, and each component is directly or indirectly combined. A fluorescent dye is usually used as a component that is a label for detection, but is not particularly limited as long as it can be used as a label for detecting a biological substance. A component that specifically recognizes and binds to a target biological substance is typically an antibody when the target biological substance is a protein, and complements the target biological substance when the target biological substance is a nucleic acid. It is a nucleic acid having a specific sequence. The labeling substance can be produced, for example, by binding an antibody or nucleic acid to a fluorescent dye using a commercially available fluorescent labeling reagent (kit). Further, if a fluorescently labeled antibody in which a desired fluorescent dye is bound to a desired antibody in advance is commercially available, it may be used as a labeling substance.
本発明においては、前記第１目的生体物質に結合する標識物質を第１標識物質、第２目的生体物質に結合する標識物質を第２標識物質と称する。第１標識物質および第２標識物質は、それぞれ第１目的生体物質、第２目的生体物質のみに結合するものであってもよいし、第１標識物質および第２標識物質のどちらか一方が第１目的生体物質および第２目的生体物質の両方に共通する部分と結合するものであってもよい。但し、第１標識物質および第２標識物質それぞれが、共に第１目的生体物質および第２目的生体物質の両方に共通する部分と結合するものではない。 In the present invention, the labeling substance that binds to the first target biological substance is referred to as a first labeling substance, and the labeling substance that binds to the second target biological substance is referred to as a second labeling substance. The first labeling substance and the second labeling substance may be those that bind only to the first target biological substance and the second target biological substance, respectively, or either the first labeling substance or the second labeling substance is the first. It may be bound to a portion common to both the 1-objective biological substance and the 2nd-objective biological substance. However, each of the first labeling substance and the second labeling substance does not bind to a portion common to both the first target biological substance and the second target biological substance.
例えば、第１目的物質が野生型タンパク質であり、第２目的物質が変異型タンパク質である場合、第１標識物質は野生型タンパク質のみが有する構造をエピトープとして認識する抗体を含み、第２標識物質は変異型タンパク質のみが有する構造をエピトープとして認識する抗体を含む様態が挙げられる。また別の様態としては、第１標識物質が野生型タンパク質および変異型タンパク質に共通する構造をエピトープとして認識する抗体を含み、第２標識物質が変異型タンパク質のみが有する構造をエピトープとして認識する抗体を含む態様が挙げられる。さらに別の様態としては、第１標識物質が野生型タンパク質のみが有する構造をエピトープとして認識する抗体を含み、第２標識物質が野生型タンパク質および変異型タンパク質に共通する構造をエピトープとして認識する抗体を含む態様が挙げられる。 For example, when the first target substance is a wild-type protein and the second target substance is a mutant protein, the first labeling substance contains an antibody that recognizes the structure of only the wild-type protein as an epitope, and the second labeling substance. Is a mode containing an antibody that recognizes a structure possessed only by a mutant protein as an epitope. As another aspect, an antibody in which the first labeling substance recognizes a structure common to wild-type proteins and mutant proteins as an epitope and an antibody in which the second labeling substance recognizes a structure possessed only by the mutant protein as an epitope. Examples thereof include. In yet another mode, the first labeling substance contains an antibody that recognizes the structure of only the wild-type protein as an epitope, and the second labeling substance includes an antibody that recognizes the structure common to the wild-type protein and the mutant protein as an epitope. Examples thereof include.
第１標識物質および第２標識物質が含む検出のための標識である構成要素として蛍光色素を用いる場合、それぞれの標識は異なった励起波長の蛍光色素であってもよいし、同じ励起波長の蛍光色素であってもよい。また、それぞれの標識は異なる発光波長の蛍光色素であることが好ましい。それぞれの標識としては、励起波長および発光波長が異なる蛍光色素を用いることが最も好ましい。標識物質は市販の蛍光標識抗体や蛍光標識核酸を用いてもよいし、常法に従って、所望の蛍光色素で抗体・核酸を修飾したものを用いてもよい。 When a fluorescent dye is used as a component which is a label for detection contained in the first labeling substance and the second labeling substance, each label may be a fluorescent dye having a different excitation wavelength, or fluorescence having the same excitation wavelength. It may be a dye. Further, it is preferable that each label is a fluorescent dye having a different emission wavelength. It is most preferable to use fluorescent dyes having different excitation wavelengths and emission wavelengths as each label. As the labeling substance, a commercially available fluorescently labeled antibody or fluorescently labeled nucleic acid may be used, or an antibody / nucleic acid modified with a desired fluorescent dye according to a conventional method may be used.
＜蛍光色素＞
本発明において用いられる蛍光色素は特に限定されるものではなく、たとえば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などを例示することができる。あるいは、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、DYOMICS社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ATTO-TEC社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Mobitec社製）系色素分子などを用いることができる。なお、このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。
<Fluorescent dye>
The fluorescent dye used in the present invention is not particularly limited, and is, for example, a rhodamine-based dye molecule, a squarylium-based dye molecule, a cyanine-based dye molecule, an aromatic ring-based dye molecule, an oxazine-based dye molecule, a carbopyronine-based dye molecule, and pyromesene. Examples thereof include system dye molecules. Alternatively, Alexa Fluor (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye molecule, BODIPY (registered trademark, manufactured by Invitrogen) dye molecule, Cy (registered trademark, manufactured by GE Healthcare) dye molecule, DY dye molecule (registered). Trademarks, DYOMICS (manufactured by DYOMICS), HiLite (registered trademark, manufactured by Anaspec) -based dye molecules, DyLight (registered trademark, manufactured by Thermo Scientific) -based dye molecules, ATTO (registered trademark, manufactured by ATTO-TEC) -based dyes Molecules, MFP (registered trademark, manufactured by Mobitec) -based dye molecules and the like can be used. It should be noted that such dye molecules are generically named based on the main structure (skeleton) in the compound or a registered trademark, and the range of fluorescent dyes belonging to each of them requires excessive trial and error by those skilled in the art. It can be grasped properly without any problem.
＜抗体＞
本発明の標識物質における、目的生体物質を特異的に認識して結合する構成要素が抗体である場合、該抗体は、通常免疫染色法に用いる場合に検出目的となるタンパク質（抗原）と直接的にまたは間接的に結合できる抗体であれば特に限定されない。前記抗体は、抗原に特異的に結合する１次抗体であってもよいし、その１次抗体に特異的に結合する２次抗体、またはそれ以上の高次抗体であってもよいが、１次抗体または２次抗体であることが好ましい。
<Antibody>
When the component of the labeling substance of the present invention that specifically recognizes and binds to the target biological substance is an antibody, the antibody is directly linked to the protein (antigen) to be detected when it is usually used in immunostaining. The antibody is not particularly limited as long as it can bind to or indirectly. The antibody may be a primary antibody that specifically binds to an antigen, a secondary antibody that specifically binds to the primary antibody, or a higher-order antibody that is higher than that. It is preferably a secondary antibody or a secondary antibody.
１次抗体は、抗原にユニークなエピトープを認識して結合する抗体であり、目的タンパク質の定量の安定性の観点から、ポリクローナル抗体よりもモノクローナル抗体が好ましい２種類以上のモノクローナル抗体を混合して使用する場合、抗体ごとに異なるエピトープについて特異的に結合するモノクローナル抗体の組合せが好ましい。
１次抗体を産生する免疫動物としては特に限定されず、一般的な動物から選択することができ、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどが挙げられる。
The primary antibody is an antibody that recognizes and binds to a unique epitope on an antigen, and is used by mixing two or more types of monoclonal antibodies in which a monoclonal antibody is preferable to a polyclonal antibody from the viewpoint of stability of quantification of a target protein. In this case, a combination of monoclonal antibodies that specifically binds to different epitopes for each antibody is preferable.
The immune animal that produces the primary antibody is not particularly limited and can be selected from general animals, and examples thereof include mice, rats, guinea pigs, rabbits, goats, and sheep.
２次抗体またはそれ以上の高次抗体は、１次抗体または低次抗体にユニークなエピトープ、好ましくはそれらの抗体の目的タンパク質（抗原）等との結合に関与していない領域（Ｆｃ等）に存在するエピトープを認識して結合する抗体である。２次抗体等は、目的タンパク質の定量の安定性の観点から、モノクローナル抗体が好ましいが、経済的な観点からポリクローナル抗体を用いてもよい。
２次抗体等を産生する免疫動物は、１次抗体を産生する免疫動物として例示した動物種等の中から、１次抗体等を産生する動物種またはＦｃ等の領域を形成している動物種に応じて、適切な動物を選択すればよい。例えば、１次抗体として天然型のマウス抗体（マウスが産生したＩｇＧ）を用いる場合は、２次抗体として、マウス以外の免疫動物（ウサギ等）が産生する、マウスＩｇＧに特異的に結合する抗体を用いることが適切である。
Secondary antibodies or higher-order antibodies are located in epitopes unique to primary or lower-order antibodies, preferably in regions (Fc, etc.) that are not involved in binding to the target protein (antigen), etc. of those antibodies. An antibody that recognizes and binds to an existing epitope. As the secondary antibody or the like, a monoclonal antibody is preferable from the viewpoint of stability of quantification of the target protein, but a polyclonal antibody may be used from the economical viewpoint.
The immune animal that produces the secondary antibody or the like is an animal species that produces the primary antibody or the like or an animal species that forms a region such as Fc among the animal species exemplified as the immune animal that produces the primary antibody or the like. The appropriate animal may be selected according to the situation. For example, when a natural mouse antibody (IgG produced by mouse) is used as the primary antibody, an antibody that specifically binds to mouse IgG produced by an immune animal other than mouse (rabbit, etc.) is used as the secondary antibody. Is appropriate.
前記抗体は、いずれのアイソタイプを用いてもよいが、通常はＩｇＧまたはＩｇＭであり、特にＩｇＧが好ましい。抗体は、目的タンパク質または低次抗体を特異的に認識して結合する能力を有する限り、完全長のＩｇＧのような天然型の抗体であってもよいし、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')2、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体断片、または、これらの抗体断片を用いて多機能化（多価化または多重特異性化）された人工抗体などの、非天然型の抗体であってもよい。また、特定の免疫動物に由来する天然型の抗体（例えばマウスによって産生されるマウス抗体）であってもよいし、ベクター等を用いた人工的な手段により作製されるキメラ抗体、ヒト型化抗体または完全ヒト抗体であってもよい。 The antibody may use any isotype, but is usually IgG or IgM, and IgG is particularly preferable. The antibody may be a native antibody, such as full-length IgG, as long as it has the ability to specifically recognize and bind to the target protein or lower-order antibody, or Fab, Fab', F (ab'). ) 2 , It may be an unnatural antibody such as an antibody fragment such as Fv or scFv, or an artificial antibody that is multifunctional (multivalent or multispecific) using these antibody fragments. .. Further, it may be a natural antibody derived from a specific immune animal (for example, a mouse antibody produced by a mouse), a chimeric antibody produced by artificial means using a vector or the like, or a humanized antibody. Alternatively, it may be a fully human antibody.
［作製例１］
＜ＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞株の作製＞
ｇＲＮＡ（GATA1 C1 Target 配列；GTGTCCTCCACACCAGAATC）およびGeneArt(登録商標)CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit；（Thermo Fisher Scientific社；Cat# A21174）を用いて、遺伝子導入装置4D-Nucleofector(商標）システム(Lonza社) ＸユニットおよびプログラムＦＦ−１２０により、ヒト慢性白血病由来細胞株Ｋ５６２細胞１ｘ１０6個に対して、ＧＡＴＡ−１遺伝子の編集をおこなった。トランスフェクション後のプール細胞から、ゲノムＤＮＡを抽出し、ターゲット領域をＰＣＲにて増幅し、ＰＣＲ産物のダイレクトシークエンスを行うことでＧＡＴＡ−１遺伝子の配列を確認した。ＧＡＴＡ−１遺伝子に変異が確認された細胞プールから、限界希釈法によりシングルクローン化した２８クローンについて、シークエンスを行うことによりゲノムＤＮＡの配列を確認をおこなった。その結果３つのクローン細胞（＃２４、＃２６、＃２７）のＧＡＴＡ−１遺伝子においてエキソン２の中にフレームシフト変異を有することが確認された。以下図２にそれぞれの配列を示す。
[Production Example 1]
<Preparation of GATA-1 genetically modified cell line>
Gene transfer device 4D-Nucleofector ™ system (Lonza) using gRNA (GATA1 C1 Target sequence; GTGTCCTCCACACCAGAATC) and GeneArt® CRISPR Nuclease Vector with OFP Reporter Kit; (Thermo Fisher Scientific; Cat # A21174) ) The GATA-1 gene was edited for 1x10 6 human chronic leukemia-derived cell lines K562 cells using the X unit and program FF-120. Genomic DNA was extracted from the pooled cells after transfection, the target region was amplified by PCR, and the sequence of the GATA-1 gene was confirmed by performing direct sequencing of the PCR product. Genomic DNA sequences were confirmed by sequencing 28 clones single-cloned by the limiting dilution method from a cell pool in which mutations in the GATA-1 gene were confirmed. As a result, it was confirmed that the GATA-1 gene of three cloned cells (# 24, # 26, # 27) had a frameshift mutation in
野生型（遺伝子を編集していない）Ｋ５６２細胞および上記クローン細胞である３つのＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞について、それぞれ２０μｇの細胞を用いて、常法によりウェスタンブロット用のサンプルを作成した。野生型（遺伝子を編集していない）Ｋ５６２細胞および上記クローン細胞である３つのＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞からタンパクを抽出し、各20μｇのサンプルを用い常法によりSDS-PAGEおよび膜への転写を実施した。抗ＧＡＴＡ−１ウサギモノクローナル抗体（Cell signaling社；Ｄ２４Ｅ４）および抗ウサギＩｇＧ抗体を用いてウェスタンブロットを行うと、得られた３つのクローンからは野生型ＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｆ）のものよりも短いＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｓ）のみが存在することが確認された（図３）。抗ＧＡＴＡ−１ウサギモノクローナル抗体（Cell signaling社；Ｄ２４Ｅ４）および抗ウサギＩｇＧ抗体を用いてウェスタンブロットを行うと、得られた３つのクローンからは野生型ＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｆ）のものよりも短いＧＡＴＡ−１（ＧＡＴＡ−１ｓ）のみが存在することが確認された（図３）。 Samples for Western blot were prepared by a conventional method using 20 μg of each of wild-type (gene-unedited) K562 cells and the above cloned cells, three GATA-1 gene-modified cells. Proteins were extracted from wild-type (gene-unedited) K562 cells and the above cloned cells, three GATA-1 gene-modified cells, and each 20 μg sample was used for SDS-PAGE and transcription to the membrane by a conventional method. carried out. Western blotting using an anti-GATA-1 rabbit monoclonal antibody (Cell signaling) and an anti-rabbit IgG antibody revealed that the three clones obtained were more than wild GATA-1 (GATA-1f). It was confirmed that only short GATA-1 (GATA-1s) was present (Fig. 3). Western blotting using an anti-GATA-1 rabbit monoclonal antibody (Cell signaling) and an anti-rabbit IgG antibody revealed that the three clones obtained were more than wild GATA-1 (GATA-1f). It was confirmed that only short GATA-1 (GATA-1s) was present (Fig. 3).
［作製例２］
Lightning Link Rapid Conjugation System（Innova Biosciences社;326-0030）を用いて、抗ＧＡＴＡ−１ゴートポリクローナル抗体抗体（Ｍ−２０）（Santa Cruz Biotechnology社；sc-1234）をAlexaFlour（登録商標）488で標識した。
[Production Example 2]
Anti-GATA-1 Goat polyclonal antibody antibody (M-20) (Santa Cruz Biotechnology; sc-1234) labeled with
［実施例１］
(細胞の回収)
野生型Ｋ５６２細胞および作製例１で作製したＧＡＴＡ−１遺伝子改変細胞株３クローンの細胞それぞれについて以下の処理を行った。１×１０6個の細胞をＦａｌｃｏｎ（登録商標）ラウンドチューブ（falcon社；製品番号352053）（１２×７５ｍｍ）に入れ、４００ｘｇで３分間遠心分離を行い、細胞を回収した。
回収した細胞に対して、０．５％ＢＳＡ（Bovine Serum Albumin）（Sigma-Aldrich社；製品番号A2153）含有生理食塩水で洗浄し、４００ｘｇで３分間遠心分離を行い、続いて上清を除去する処理を、２回行った。
[Example 1]
(Recovery of cells)
The following treatment was performed on each of the wild-type K562 cells and the cells of the GATA-1 gene-modified cell line 3 clones prepared in Production Example 1. 1 × 10 6 cells were placed in a Falcon® round tube (falcon; product number 352053) (12 × 75 mm) and centrifuged at 400 × g for 3 minutes to collect the cells.
The collected cells were washed with saline containing 0.5% BSA (Bovine Serum Albumin) (Sigma-Aldrich; product number A2153), centrifuged at 400 xg for 3 minutes, and then the supernatant was removed. The process of performing the process was performed twice.
（固定処理工程）
回収した細胞に、FIX & PERM（登録商標）Cell Permeabilization Kit（Invitrogen社）のMedium A（固定用試薬）１００μＬを添加し、室温で３分間インキュベーションを行った。なお、本実施例において、Medium A（固定用試薬）が本発明の「細胞固定液」に相当する。
(Fixing process)
To the collected cells, 100 μL of Medium A (fixing reagent) of FIX & PERM® Cell Permeabilization Kit (Invitrogen) was added, and the cells were incubated at room temperature for 3 minutes. In this example, Medium A (fixing reagent) corresponds to the "cell fixative" of the present invention.
（細胞膜透過処理工程・蛍光染色処理工程）
固定処理を行った細胞を、０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水で洗浄し、４００ｘｇで３分間遠心分離を行い、続いて上清を除去する処理を、２回行った。さらに−２０℃に調整した１００％メタノールを３ｍｌ加えてゆっくりと攪拌した後、氷上で３０分間インキュベーションを行い、同様に０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水で２回洗浄した。 FIX & PERM（登録商標）Cell Permeabilization Kit（Invitrogen社）のMedium B（透過処理用試薬）１００μＬに、抗ＧＡＴＡ−１ゴートポリクローナル抗体（Ｍ−２０）４μＬおよびＲ−フィコエリスリン標識抗ＧＡＴＡ−１抗体（Cell Signaling Technology社；#13353）４μＬを加えたものを細胞に添加し、室温で１０分間インキュベーションをおこなった。その後、細胞を０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水で洗浄し、４００ｘｇで３分間遠心分離を行い、続いて上清を除去する処理を、２回行った後、０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水１００μＬに懸濁した。そこに、０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水４９５μＬにＡｌｅｘａ４８８標識ドンキー抗ゴートＩｇＧ抗体５μＬ(Invitrogen社 ；Molecular A11055）を加えたものを添加しさらに室温で１０分間インキュベーションをおこなった。
(Cell membrane permeation treatment step / fluorescent staining treatment step)
The fixed cells were washed with 0.5% BSA-containing physiological saline, centrifuged at 400 xg for 3 minutes, and then the supernatant was removed twice. Further, 3 ml of 100% methanol adjusted to −20 ° C. was added, and the mixture was slowly stirred, incubated on ice for 30 minutes, and similarly washed twice with 0.5% BSA-containing physiological saline. 100 μL of Medium B (permeabilization reagent) from FIX & PERM® Cell Permeabilization Kit (Invitrogen), 4 μL of anti-GATA-1 Goat polyclonal antibody (M-20) and R-phycoerythrin-labeled anti-GATA-1 4 μL of antibody (Cell Signaling Technology Co., Ltd .; # 13353) was added to the cells, and the cells were incubated at room temperature for 10 minutes. Then, the cells were washed with 0.5% BSA-containing saline, centrifuged at 400 xg for 3 minutes, and then the supernatant was removed twice. After that, 0.5% BSA-containing saline was performed. Suspended in 100 μL of water. To this, 5 μL of Alexa488-labeled Donkey anti-Goat IgG antibody (Invitrogen; Molecular A11055) was added to 495 μL of 0.5% BSA-containing physiological saline, and the mixture was further incubated at room temperature for 10 minutes.
（解析工程）
その後、０．５％ＢＳＡ含有生理食塩水で細胞を２回洗浄して、懸濁したうえで、すみやかにフローサイトメ−ター（BD FACS Aria;励起波長４８８ｎｍ）により解析をおこなった。
(Analysis process)
Then, the cells were washed twice with a physiological saline containing 0.5% BSA, suspended, and then immediately analyzed by a flow cytometer (BD FACS Aria;
本実施例で用いた抗ＧＡＴＡ−１ゴートポリクローナル抗体（Ｍ−２０）はＧＡＴＡ‐１タンパク質のＣ末端を認識する抗体であり、Ｒ−フィコエリスリン標識抗ＧＡＴＡ−１抗体はＧＡＴＡ‐１タンパク質のＮ末端を認識する抗体であり、上述したようにＧＡＴＡ−１ｓはＧＡＴＡ−１のＮ末端にある転写活性化領域を欠くバリアントである。したがってＡｌｅｘａ４８８はＧＡＴＡ−１ｆおよびＧＡＴＡ−１ｓを含む全ＧＡＴＡ−１タンパク質を、Ｒ−フィコエリスリンはＧＡＴＡ−１ｆのみを標識している。図４に示すように、野生型Ｋ５６２細胞にはＧＡＴＡ−１ｆが、３つのクローン細胞（＃２４、＃２６、＃２７）においてはＧＡＴＡ−１ｓのみが発現している結果が確認できた。
The anti-GATA-1 goat polyclonal antibody (M-20) used in this example is an antibody that recognizes the C-terminal of the GATA-1 protein, and the R-phycoerythrin-labeled anti-GATA-1 antibody is a GATA-1 protein. It is an antibody that recognizes the N-terminal, and as described above, GATA-1s is a variant lacking the transcriptional activation region at the N-terminal of GATA-1. Therefore, Alexa488 labels all GATA-1 proteins, including GATA-1f and GATA-1s, and R-phycoerythrin only labels GATA-1f. As shown in FIG. 4, it was confirmed that GATA-1f was expressed in wild-type K562 cells and only GATA-1s was expressed in three cloned cells (# 24, # 26, # 27).
［実施例２］
作製例１で得られた遺伝子改変細胞＃２６と野生型Ｋ５６２細胞をそれぞれ１×１０6個ずつ回収して、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）ラウンドチューブ中で混和した。実施例１と同様の手法で洗浄し、さらに固定処理工程、細胞膜透過処理工程、蛍光染色処理工程を行ない、解析工程を行った。
[Example 2]
The genetically modified
ドットプロットおよびヒストグラムによる検出データからは、解析に用いた細胞群においてＧＡＴＡ−１ｆを発現している細胞およびＧＡＴＡ−１ｓを発現している細胞がそれぞれ検出されていることがわかる。さらに得られた検出データを解析することで、それぞれのＧＡＴＡ−１が発現している細胞数、およびその割合について算出することができる。結果を図５に示す。 From the detection data by the dot plot and the histogram, it can be seen that the cells expressing GATA-1f and the cells expressing GATA-1s were detected in the cell group used for the analysis, respectively. Further, by analyzing the obtained detection data, it is possible to calculate the number of cells expressing each GATA-1 and the ratio thereof. The results are shown in FIG.
［実施例３］
実施例３と同様に遺伝子改変細胞＃２６と野生型Ｋ５６２細胞を混和したサンプルを用いて解析を行い、さらにフローサイトメーターによりＧＡＴＡ−１ｆを発現している細胞およびＧＡＴＡ−１ｓを発現している細胞をそれぞれ分取した。分取前の細胞および分取された細胞のそれぞれについて、次世代シーケンサー（イルミナ社）を用いて遺伝子解析を行うことで、それぞれの細胞群に発現しているＧＡＴＡ−１の遺伝子型を調べ、より分取精度を確認した。分取前の細胞群においてはＧＡＴＡ−１ｆを発現している細胞およびＧＡＴＡ−１ｓを発現している細胞はほぼ半々の割合であったが、分取後の細胞群においてはほぼ９８％と高い割合でＧＡＴＡ−１ｆを発現している細胞およびＧＡＴＡ−１ｓを発現している細胞を分取できていることがわかる。結果を図６に示す。
[Example 3]
Analysis was performed using a sample in which gene-modified
［実施例４］
ＪＣＲＢ細胞バンクより購入したＡＭＫＬ患者骨髄由来細胞株ＣＭＫ１１−５を用いた以外は実施例１と同じ手法で解析を行った。結果を図７に示す。検出されたほとんどのＧＡＴＡ−１がＧＡＴＡ−１ｓであることが確認できる。
[Example 4]
The analysis was performed by the same method as in Example 1 except that the AMKL patient bone marrow-derived cell line CMK11-5 purchased from the JCRB cell bank was used. The results are shown in FIG. It can be confirmed that most of the detected GATA-1 is GATA-1s.
［実施例５］
リンパ球分離溶液Lymphoprep(商標)（リンホプレップ）(コスモバイオ株式会社；1114544)を用いて、ＴＡＭ患者から採取した血液からＰＢＭＣ(Peripheral Blood Mononuclear Cell；末梢血単核細胞)を単離した。単離したＰＢＭＣについて実施例１と同様の手法で洗浄、解析を行った。結果を図８に示す。検出されたほとんどのＧＡＴＡ−１がＧＡＴＡ−１ｓであることが確認できる。
[Example 5]
PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) was isolated from blood collected from TAM patients using Lymphocyte Separation Solution Lymphoprep ™ (Cosmo Bio Co., Ltd .; 1114544). The isolated PBMC was washed and analyzed in the same manner as in Example 1. The results are shown in FIG. It can be confirmed that most of the detected GATA-1 is GATA-1s.
＜考察＞
上記実施例から明らかなように、異なるエピトープを認識する複数の抗体を用いることで、検出に用いたそれぞれの細胞において、ＧＡＴＡ−１ｆが発現しているか、ＧＡＴＡ−１ｓが発現しているか、を検出することができる。また、実施例３で示したようにＧＡＴＡ−１ｆが発現している細胞およびＧＡＴＡ−１ｓを発現している細胞が混在している場合においても、それぞれの細胞の割合や蛍光強度について解析を行うことが可能である。またＧＡＴＡ−１の遺伝子を改変した細胞のみならず、ＡＭＫＬ患者由来の培養細胞株であるＣＭＫ１１−５細胞株やＴＡＭ患者から採取した血液から単離したＰＢＭＣにおいても、本発明の解析を行うことが可能であり、いずれの細胞においても発現しているＧＡＴＡ−１が変異型（ＧＡＴＡ−１ｓ）であるという結果が得られた。
<Discussion>
As is clear from the above examples, by using a plurality of antibodies recognizing different epitopes, whether GATA-1f is expressed or GATA-1s is expressed in each cell used for detection can be determined. Can be detected. Further, even when cells expressing GATA-1f and cells expressing GATA-1s are mixed as shown in Example 3, the ratio and fluorescence intensity of each cell are analyzed. It is possible. Further, the analysis of the present invention should be carried out not only in cells in which the GATA-1 gene has been modified, but also in CMK11-5 cell lines, which are cultured cell lines derived from AMKL patients, and PBMCs isolated from blood collected from TAM patients. It was possible, and the result was obtained that GATA-1 expressed in all cells was a mutant type (GATA-1s).
上記の結果から、例えば、ダウン症児から採取した血液等を用いて本発明の解析方法を行なうことにより、発現しているＧＡＴＡ−１が、ＧＡＴＡ−１ｆであるかＧＡＴＡ−１ｓであるかを検出することで患者のＧＡＴＡ−１遺伝子において変異が起きているかどうかを迅速に判定することができる。このことから、ＴＡＭまたはＡＭＫＬに罹患する可能性の高いダウン症の新生児において、本発明の解析方法を適用することで、今後の発病の可能性を予測することができると考えられる。また、あわせてセルソーターを用いて変異タンパク質が検出された細胞集団を分取し、遺伝子解析をおこなうことで当該遺伝子にどのような変異が起きているかどうかを高い精度で決定することができる。またＡＭＫＬのみならず、本発明の解析方法を他の生体物質および細胞に適用することも考えられる。特に遺伝子変異に基づいて多数の病型に分類される白血病やリンパ腫において本発明の解析方法を行なうことで、その病型を迅速に判定したり、予後の予測や治療の有効性の有無を判断することができるという可能性を提示することができる。 From the above results, for example, by performing the analysis method of the present invention using blood collected from a child with Down's syndrome, it is detected whether the expressed GATA-1 is GATA-1f or GATA-1s. By doing so, it is possible to quickly determine whether or not a mutation has occurred in the GATA-1 gene of a patient. From this, it is considered that the possibility of future onset can be predicted by applying the analysis method of the present invention to a newborn baby with Down's syndrome who is likely to suffer from TAM or AMKL. In addition, by using a cell sorter to sort out the cell population in which the mutant protein is detected and performing gene analysis, it is possible to determine with high accuracy what kind of mutation has occurred in the gene. It is also conceivable to apply the analysis method of the present invention not only to AMKL but also to other biological substances and cells. In particular, by performing the analysis method of the present invention for leukemia and lymphoma classified into a large number of disease types based on gene mutation, the disease type can be quickly determined, the prognosis can be predicted, and the effectiveness of treatment can be determined. Can present the possibility of being able to.
Claims (5)
前記目的生体物質が、第１目的生体物質および第１目的生体物質のバリアントである第２目的生体物質の少なくとも一種を含み、
前記第１目的生体物質がＧＡＴＡ−１ｆであり、前記第２目的生体物質がＧＡＴＡ−１ｓである、解析方法。
工程（１） 検体に含まれる細胞を細胞固定液で固定する、固定処理工程
工程（Ａ） 前記細胞を細胞膜透過処理液に接触させる、細胞膜透過処理工程
工程（２） 工程（１）を行った後、第１目的生体物質に結合する第１標識物質および第２目的生体物質に結合する第２標識物質を、前記細胞に接触させる蛍光染色工程
工程（３） 工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって前記細胞からの蛍光を検出データとして取得し、前記検出データを解析する解析工程 Look including the following steps (1) to (3), after the following steps (1), and at the same time carried out prior to or following step (2) performing the steps (2), further performing the steps of (A) , A method for analyzing a target biological substance in a sample,
The target biological substance contains at least one of a first target biological substance and a second target biological substance which is a variant of the first target biological substance.
An analysis method in which the first target biological substance is GATA-1f and the second target biological substance is GATA-1s.
Step (1) Fixation process in which cells contained in a sample are fixed with a cell fixative.
Step (A) Cell membrane permeation treatment step of bringing the cells into contact with the cell membrane permeation treatment step (2) After performing step (1), the first labeling substance and the second target biological substance that bind to the first target biological substance. Fluorescence staining step of contacting the second labeling substance bound to the cells Step (3) After performing step (2), fluorescence from the cells is acquired as detection data by flow cytometry, and the detection data is obtained. Analysis process to analyze
工程（３′） 工程（２）を行った後、フローサイトメトリーによって、蛍光染色処理された細胞を測定し、さらに細胞を分取する解析工程 The analysis method according to claim 1, wherein the step (3) is the following step (3').
Step (3') After performing step (2), the cells treated with fluorescence staining are measured by flow cytometry, and the cells are further separated.
The analysis method according to any one of claims 1 to 4 , wherein the sample is prepared from a tissue, blood or cerebrospinal fluid collected from a human or a non-human animal.
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