JP6954646B2

JP6954646B2 - ナノカプセルの集積方法

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Publication number: JP6954646B2
Application number: JP2018522489A
Authority: JP
Inventors: 琢也飯田; 志保床波; 千恵児島; 勇姿西村
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Priority date: 2016-06-07
Filing date: 2017-06-05
Publication date: 2021-10-27
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Description

本開示は、ナノカプセルの集積方法に関し、より特定的には、金属ナノ粒子を内包したナノカプセルの集積方法に関する。

近年、薬物を特定箇所に送達するための薬物送達システム（ＤＤＳ：Drug Delivery System）が注目されている。薬物送達システムにおいては、薬物を内包した高分子が担体（キャリア）として用いられる。このような担体は一般にナノメートルのオーダーのサイズを有するため、「ナノカプセル」とも称される。

国際公開ＷＯ２０１４／９２９３７号国際公開ＷＯ２０１５／１７０７５８号特開２０１２−２３２９６１号公報

D. Fukushima, U. H. Sk, Y. Sakamoto, I. Nakase, C. Kojima, "Dual stimuli-sensitive dendrimers: Photothermogenic gold nanoparticle-loaded thermo-responsive elastin-mimetic dendrimers", Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 132, 155-160 (2015)

金属ナノ粒子が分散した液体中に光を照射することによって、ナノメートルのオーダー〜マイクロメートルのオーダー程度のサイズを有する微小物体を集積する技術が提案されている（たとえば本発明者らによる国際公開ＷＯ２０１４／９２９３７号（特許文献１）および国際公開ＷＯ２０１５／１７０７５８号（特許文献２）参照）。

金属ナノ粒子が分散した液体中に光を照射すると、光誘起力が作用することにより光照射位置近傍の金属ナノ粒子が光照射位置に捕捉される。捕捉された金属ナノ粒子は、局在表面プラズモン共鳴により光を熱へと変換する効果（以下「光発熱効果」とも称する）によって周囲の液体を加熱する。それにより生じた温度勾配によって、光照射位置へと向かう対流が発生する。この対流に乗って微小物体が光照射位置へと運ばれて集積される。

このように、金属ナノ粒子の光発熱効果により発生した対流を用いることによって微小物体を集積することができる。この金属ナノ粒子の光発熱効果は、金属ナノ粒子がナノカプセルに内包された状態でも起こり得る。そこで、金属ナノ粒子が内包されたナノカプセルへの光照射によりナノカプセルを集積することが考えられる。

金属ナノ粒子に作用する光誘起力の強さは、金属ナノ粒子のサイズ（体積）に依存する（詳細は後述）。金属ナノ粒子は、その粒子径が小さいほど光誘起力により捕捉されにくくなる。光照射により捕捉可能な金属ナノ粒子の粒子径は、典型的な光強度（たとえば数１００ｍＷ程度）では数十ｎｍ以上とされる。

その一方で、ナノカプセルのサイズによっては、より微小な金属ナノ粒子、すなわち１ｎｍから１０ｎｍまでの範囲を示す「シングルナノメートルのオーダー」のサイズを有する金属ナノ粒子を用いることが望ましい場合がある。しかし、シングルナノメートルのオーダーの金属ナノ粒子の捕捉は難しい。光誘起力により金属ナノ粒子を捕捉できないと、対流も発生せず、ナノカプセルを集積することができない。よって、シングルナノメートルのオーダーの金属ナノ粒子を用いるための技術が要望される。

また、液体中（たとえば水中）における金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長は一般に可視光の波長域に含まれるところ、ナノカプセルの応用分野（たとえば上述の薬物送達システム）によっては、局在表面プラズモン共鳴の波長域外の非共鳴光（たとえば赤外光）を使用可能であることが望ましい場合がある。しかしながら、非共鳴光を用いる場合には、共鳴光を用いる場合と比べて、金属ナノ粒子の捕捉が一層難しくなり得る。

本開示は上記課題を解決するためになされたものであって、その目的は、シングルナノメートルのオーダーの金属ナノ粒子を内包したナノカプセルを、金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外の波長を有する非共鳴光を用いて集積可能な技術を提供することである。

本開示のある局面に従うナノカプセルの集積方法は、複数のナノカプセルを集積する。複数のナノカプセルの各々は、１ナノメートルから１０ナノメートルまでの範囲を示すシングルナノメートルのオーダーのサイズを有する金属ナノ粒子と、金属ナノ粒子を内包するポリマー殻と、ポリマー殻の表面に修飾され、温度上昇により親水性から疎水性へと変化する有機分子とを含む。上記集積方法は、複数のナノカプセルが分散した水性の液体に金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外の非共鳴光を照射することで、有機分子の温度上昇により有機分子を親水性から疎水性へ変化させて複数のナノカプセルの一部を凝集させるステップと、凝集により形成されたナノカプセル凝集体を非共鳴光の照射位置に捕捉するステップと、ナノカプセル凝集体に含まれる金属ナノ粒子によって非共鳴光を熱に変換させてナノカプセル凝集体の周囲の液体を加熱するステップと、上記液体を加熱することで生じた対流によって複数のナノカプセルを集積するステップとを含む。

本開示の他の局面に従うナノカプセルの集積方法は、複数のナノカプセルを集積する。複数のナノカプセルの各々は、１ナノメートルから１０ナノメートルまでの範囲を示すシングルナノメートルのオーダーのサイズを有する金属ナノ粒子と、金属ナノ粒子を内包するポリマー殻と、ポリマー殻の表面に修飾され、温度上昇により疎水性から親水性へと変化する有機分子とを含む。上記集積方法は、複数のナノカプセルが分散した有機溶媒である液体に金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外の非共鳴光を照射することで、有機分子の温度上昇により有機分子を疎水性から親水性へ変化させて複数のナノカプセルの一部を凝集させるステップと、凝集により形成されたナノカプセル凝集体を非共鳴光の照射位置に捕捉するステップと、ナノカプセル凝集体に含まれる金属ナノ粒子によって非共鳴光を熱に変換させてナノカプセル凝集体の周囲の液体を加熱するステップと、上記液体を加熱することで生じた対流によって複数のナノカプセルを集積するステップとを含む。

好ましくは、上記集積するステップは、液体を加熱することで気泡を発生させ、気泡に向かう対流を生じさせることによって複数のナノカプセルを集積する。

好ましくは、非共鳴光は、赤外の波長域に含まれる波長を有するレーザ光である。
好ましくは、有機分子は、温度上昇に伴い親水性から疎水性へと変化するポリマーを示す温度応答性ポリマーである。

より好ましくは、ポリマー殻は、デンドリマーである。温度応答性ポリマーは、（Ｘ_１ＰＧＸ_２Ｇ）_ｎで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。Ｘ_１はバリンまたはイソロイシンを示し、Ｘ_２はプロリンを除くアミノ酸を示し、Ｐはプロリンを示し、Ｇはグリシンを示し、ｎは１以上の自然数を示す。

本開示のさらに他の局面に従うナノカプセルの集積装置は、複数のナノカプセルを集積する。複数のナノカプセルの各々は、１ナノメートルから１０ナノメートルまでの範囲を示すシングルナノメートルのオーダーのサイズを有する金属ナノ粒子と、金属ナノ粒子を内包するポリマー殻と、ポリマー殻の表面に修飾され、温度上昇により親水性から疎水性へと変化する有機分子とを含む。集積装置は、複数のナノカプセルが分散した水性の液体を保持可能に構成された保持部材と、金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外の非共鳴光を発する光源とを備える。光源は、上記液体に非共鳴光を照射することで、有機分子の温度上昇により有機分子を親水性から疎水性へと変化させて複数のナノカプセルの一部を凝集させ、凝集により形成されたナノカプセル凝集体を非共鳴光の照射位置に捕捉し、ナノカプセル凝集体に含まれる金属ナノ粒子によって非共鳴光を熱に変換させてナノカプセル凝集体の周囲の液体を加熱し、上記液体を加熱することで生じた対流によって複数のナノカプセルを集積する。

本開示のさらに他の局面に従うナノカプセルの集積装置は、複数のナノカプセルを集積する。複数のナノカプセルの各々は、１ナノメートルから１０ナノメートルまでの範囲を示すシングルナノメートルのオーダーのサイズを有する金属ナノ粒子と、金属ナノ粒子を内包するポリマー殻と、ポリマー殻の表面に修飾され、温度上昇により疎水性から親水性へと変化する有機分子とを含む。集積装置は、複数のナノカプセルが分散した有機溶媒である液体を保持可能に構成された保持部材と、金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外の非共鳴光を発する光源とを備える。光源は、上記液体に非共鳴光を照射することで、有機分子の温度上昇により有機分子を疎水性から親水性へと変化させて複数のナノカプセルの一部を凝集させ、凝集により形成されたナノカプセル凝集体を非共鳴光の照射位置に捕捉し、ナノカプセル凝集体に含まれる金属ナノ粒子によって非共鳴光を熱に変換させてナノカプセル凝集体の周囲の液体を加熱し、上記液体を加熱することで生じた対流によって複数のナノカプセルを集積する。

好ましくは、光源は、金属ナノ粒子によって非共鳴光を熱に変換することにより保持部材に付着した気泡を発生させ、気泡に向かう対流を生じさせることによって複数のナノカプセルを集積する。

好ましくは、光源は、複数のナノカプセルの各々の近傍に細胞が存在する場合に、非共鳴光の照射により生じたナノカプセル凝集体に含まれる金属ナノ粒子の発熱によって、上記細胞を死滅させるように構成されている。

本開示によれば、シングルナノメートルのオーダーの金属ナノ粒子を内包したナノカプセルを、金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外の波長を有する非共鳴光を用いて集積することができる。

金属ナノ粒子が捕捉されるメカニズムを説明するための図である。本実施の形態に係るナノカプセルを説明するための図である。本実施の形態に係るナノカプセルおよび比較例に係るナノカプセルを説明するための図である。ナノカプセルのサイズの温度依存性の一例を示す図である。本実施の形態に係るナノカプセルの集積装置の構成を概略的に示す図である。基板の周囲の構成をより詳細に示す図である。本実施の形態に係るナノカプセルの集積方法を示すフローチャートである。光熱変換の原理を説明するための図である。本実施の形態におけるナノカプセルの集積メカニズムの各段階を説明するための図である。対流発生時のレーザスポット近傍の様子を説明するための図である。第１〜第７のサンプルにおけるナノカプセルの集積条件を説明するための図である。第１のサンプルへの光照射結果を示す連続画像である。第２のサンプルへの光照射結果を示す連続画像である。第３のサンプルへの光照射結果を示す連続画像である。第４のサンプルへの光照射結果を示す連続画像である。第５のサンプルへの光照射結果を示す連続画像である。第６のサンプルへの光照射結果を示す連続画像である。第７のサンプルへの光照射結果を示す連続画像である。図示しない分光器を用いて第６のサンプルにおけるレーザスポット近傍の消衰スペクトルを測定した結果の一例を説明するための図である。生体組織への影響を確認するための測定に用いた集積装置の構成を示す図である。第６のサンプルにおける光照射前後の分光結果を説明するための図である。第６のサンプルにおける光照射前後の分光結果を説明するための他の図である。第８のサンプルにおける光照射前後の分光結果を説明するための図である。第６のサンプルにおける生死判定結果を説明するための図である。

以下、本開示の実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、図中同一または相当部分には同一符号を付してその説明は繰り返さない。

本開示およびその実施の形態において、「シングルナノメートルのオーダー」とは、１ｎｍから１０ｎｍまでの範囲を意味する。「ナノメートルのオーダー」とは、１ｎｍから１０００ｎｍ（＝１μｍ）までの範囲を意味する。「マイクロメートルのオーダー」とは、１μｍから１０００μｍ（＝１ｍｍ）までの範囲を意味する。

本開示およびその実施の形態において、「ナノカプセル」とは、ある物質（いわゆるホスト分子）の内部の空隙に、形状およびサイズが適合する他の物質（いわゆるゲスト分子）が包接された、ナノメートルのオーダーのサイズを有する構造体である。「ナノカプセル凝集体」とは、複数のナノカプセルが凝集することによって形成された塊である。「凝集」とは、媒質中に分散して存在する物質が密な集合状態をとる現象を意味する。「集積」とは、物質が所定領域に集められることによって当該所定領域内の物質の密度が他の領域内の物質の密度よりも高くなる現象を意味する。

本開示およびその実施の形態において、「共鳴光」とは、金属ナノ粒子への入射によって金属ナノ粒子に大きな光誘起分極を生じさせる光を意味する。光誘起分極とは、たとえば金属ナノ粒子を対象とした場合には、その内部の電子が光によって励起されることにより生じる電気分極である。「金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域」とは、たとえば金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴のピークの半値全幅に対応する波長域である。この波長域は、多くの場合、４００ｎｍ〜７００ｎｍの可視光の波長域に含まれる。一方、「非共鳴光」とは、金属ナノ粒子への入射によって金属ナノ粒子に生じる光誘起分極が小さな光を意味する。「金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外」とは、たとえば金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴のピークの半値全幅の外の波長域である。この波長域は、典型的には赤外の波長域に含まれる。「赤外の波長域」とは、７００ｎｍ〜１０，０００μｍ（＝１ｍｍ）の波長域を指し、好ましくは７００ｎｍ〜２，５００ｎｍの波長域を指し、より好ましくは７００ｎｍ〜１，４００ｎｍの波長域を指す。なお、「金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外」が紫外の波長域（たとえば１０ｎｍ〜４００ｎｍの波長域）に含まれる場合もある。

本開示およびその実施の形態において、「生体適合性」とは、物質がその本来の機能を果たしつつ、長期間に亘って生体に悪影響も強い刺激も与えず、生体に異常を引き起こさせない当該物質の性質を意味する。

［実施の形態］
本実施の形態では、金属ナノ粒子の一つの例示的形態として金ナノ粒子を採用する。ただし、金属ナノ粒子の種類は特に限定されず、たとえば銀ナノ粒子または銅ナノ粒子であってもよい。

＜金ナノ粒子の捕捉＞
本実施の形態では以下に詳細に説明するように、媒質（たとえば液体）中に分散した複数の金ナノ粒子１が光誘起力によって捕捉される。

図１は、金ナノ粒子１が捕捉されるメカニズムを説明するための図である。図１を参照して、複数の金ナノ粒子１が分散した媒質にレーザ光Ｌを照射すると、光誘起力により複数の金ナノ粒子１がレーザ光Ｌのビームウエスト近傍に捕捉される。「光誘起力」とは、散逸力、勾配力および物質間光誘起力の総称として用いられる。「散逸力」とは、光散乱または光吸収といった散逸的過程において、光の運動量が金ナノ粒子１に与えられることによって発生する力である。「勾配力」は、光誘起分極が生じた金ナノ粒子１が不均一な電磁場の中に置かれた場合に、電磁気学的なポテンシャルの安定点（ビームウエスト）に金ナノ粒子１を移動させる力である。「物質間光誘起力」とは、光励起された複数の金ナノ粒子１中の誘起分極から生じる縦電場による力と横電場による力との和である。光誘起力Ｆは、下記式（１）によって表される（詳細は、たとえばT. Iida and H. Ishihara, Phys. Rev. B77, 245319 (2008)参照）。

式（１）は、散逸力、勾配力および物質間光誘起力を含む光誘起力の一般的表式である。式（１）におけるＶは、すべての金ナノ粒子１の体積の総和を表す。たとえば金ナノ粒子１が媒質中に１つだけ存在する場合には、上記式（１）は下記式（２）のように表される。

式（２）において、ｖは、ある金ナノ粒子１の体積を表す。式（２）から分かるように、金ナノ粒子１の体積ｖが大きいほど光誘起力Ｆは強くなる。

＜ナノカプセル＞
本実施の形態に係るナノカプセルには、３次元的に分枝した樹状構造または分岐状構造を有する樹状ポリマーの１種であるデンドリマーが用いられる。一般に、デンドリマーは、ホスト分子として機能してデンドリマー内部にゲスト分子を包接（すなわち内包）可能な性質を有するとともに、デンドリマーの表面に様々な有機分子を修飾可能な性質を有する。

図２は、本実施の形態に係るナノカプセル１０を説明するための図である。図２（Ａ）に示すように、ナノカプセル１０は、ゲスト分子としての金ナノ粒子１と、ホスト分子として金ナノ粒子１を内包するデンドリマー２と、デンドリマー２の表面に修飾された有機分子３とを含む。

図２（Ｂ）にデンドリマー２の内部構造を模式的に示す。デンドリマー２の形状は球殻状である。デンドリマー２の直径Ｄ２は、たとえば数ｎｍから数十ｎｍまでの範囲内である。デンドリマー２は、コア２Ａと、分岐部分２Ｂと、末端基２Ｃとを含む。コア２Ａは、１以上の官能基を有する化合物から誘導されて形成される。

分岐部分２Ｂは、３以上の原子価を有する原子（炭素、窒素、ケイ素、リンなど）を含む分岐構造の繰り返しからなる。図２（Ｂ）では、分岐構造の繰り返し数（「世代数」とも称する）が４のデンドリマーを示す。第０世代〜第４世代をＧ０〜Ｇ４でそれぞれ表す。分岐部分２Ｂに金ナノ粒子１が内包される。

金ナノ粒子１の粒子径Ｄ１は、デンドリマー２の直径Ｄ２よりも小さく、シングルナノメートルのオーダーである。金ナノ粒子１の粒子径Ｄ１は、好ましくは１ｎｍ〜５ｎｍであり、より好ましくは１ｎｍ〜３ｎｍであり得る。なお、図２（Ａ）ではデンドリマー２の内部に金ナノ粒子１が１つのみ内包される例を示すが、２以上の金ナノ粒子１が内包されてもよい。金属ナノ粒子をデンドリマーに内包させる手法は公知であり、たとえばY.Haba, C. Kojima, A. Harada, T. Ura, H. Horinaka, K. Kono, Langmuir 23 (2007) 5243に開示されている。

末端基２Ｃは、デンドリマー２の表面に存在する部分構造（基）である。末端基２Ｃには所定の繰り返し構造を含む有機分子３が修飾される。より詳細には、本実施の形態ではポリペプチドが末端基２Ｃに修飾される。このポリペプチドは、（Ｘ_１ＰＧＸ_２Ｇ）_ｎで表されるアミノ酸配列のペンタペプチドを含む。Ｘ_１は、バリンまたはイソロイシンである。Ｘ_２は、プロリンを除くアミノ酸である。Ｐはプロリンであり、Ｇはグリシンである。繰り返し数ｎは１以上の自然数である。

なお、「プロリンを除くアミノ酸」とは、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンを意味する（特開２０１２−２３２９６１号公報（特許文献３）参照）。

上記ポリペプチドは、デンドリマー２のすべての末端基２Ｃに修飾されていてもよいし、一部の末端基２Ｃのみに修飾されていてもよい。また、上記ポリペプチドは、天然由来のものであってもよいし、公知の合成法により得られたものであってもよい。さらに、繰り返し数ｎが２以上の場合、上記アミノ酸配列におけるＸ_１およびＸ_２は、繰り返し構造間で同一であってもよいし異なっていてもよい。

＜本実施の形態および比較例に係るナノカプセルの対比＞
ナノカプセル１０は、比較的低い温度で熱変性を起こして凝集体を形成する点に特徴を有する。この特徴について、比較例に係るナノカプセル９０と対比しながら説明する。

図３は、本実施の形態に係るナノカプセル１０および比較例に係るナノカプセル９０を説明するための図である。図３を参照して、まず、本実施の形態に係るナノカプセル１０について説明する。

各デンドリマー２に内包される金ナノ粒子１の数は、たとえば１である。金ナノ粒子１の粒子径Ｄ１は、たとえば１．５ｎｍである。デンドリマー２の直径Ｄ２は、たとえば４．４ｎｍである。なお、デンドリマー２の世代数は４であり、デンドリマー２の分子量は約１４，０００である。

有機分子３としては、生体（たとえば靭帯、皮膚または動脈）に含まれるエラスチンを模倣したポリペプチドであるエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ：Elastin-Like-Peptides）が用いられる。より詳細には、（ＶＰＧＶＧ）とのアミノ酸配列（Ｖはバリン）で表されるペンタペプチドを２つ含むポリペプチドが用いられる。つまり、上述のアミノ酸配列（Ｘ_１ＰＧＸ_２Ｇ）_ｎにおいてＸ_１およびＸ_２がいずれもバリンであり、繰り返し数ｎが２である。以下、このエラスチン様ペプチドを「ＥＬＰ２」とも記載する。ＥＬＰ２の長さ（有機分子長）Ｌ３は約３ｎｍである。

次に、比較例に係るナノカプセル９０について説明する。各デンドリマー２に内包される金ナノ粒子１の数は、たとえば１である。金ナノ粒子１の粒子径Ｄ１は、たとえば２．０ｎｍである。一方、デンドリマー２については、本実施の形態に係るナノカプセル１０のデンドリマー２と同等である。すなわち、デンドリマー２の直径Ｄ２は、たとえば４．４ｎｍである。

有機分子３としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ：polyethylene glycol）が用いられる。ＰＥＧは親水性を示すため、デンドリマー２の表面をＰＥＧにより修飾することによってナノカプセル９０の水和性が高まる。これにより、水性の液体中でのナノカプセル９０の分散性を高めることができる。また、ナノカプセルを薬物送達システムに応用するためにはナノカプセルが生体適合性を有することが必要であるところ、デンドリマー２の表面をＰＥＧにより修飾することによってナノカプセルに生体適合性を付与することができる。このことは、たとえば細胞生物学の分野では細胞へのＤＮＡ導入、細胞の融合などにＰＥＧが用いられることからも分かる。

図４は、ナノカプセル１０，９０のサイズの温度依存性の一例を示す図である。図４において、横軸は、ナノカプセル１０またはナノカプセル９０が分散した水性の液体（たとえば純水）の温度（単位：℃）を示す。縦軸は、ナノカプセル１０，９０のサイズ（直径の平均値）（単位：ｎｍ）を示す。

ナノカプセル１０は、中性領域（たとえばｐＨ６〜ｐＨ８の領域）において比較的低い温度範囲内（たとえば２５℃〜５０℃の範囲内）で熱変性を起こして凝集体を形成する。より詳細に説明すると、液体の温度上昇に伴い、ＥＬＰ２の立体構造（コンフォメーション）が親水性のランダムコイル構造から疎水性のβ−ターン構造へと変化することによって、ナノカプセル１０の表面が親水性から疎水性へと変化する。このような熱変性が起こると、水性の液体中では疎水性の部位の表面積が小さいほど表面エネルギーが小さく安定な状態であるため、ナノカプセル１０同士が凝集してナノカプセル凝集体が形成される。図４に示す例では、ナノカプセル凝集体のサイズは、液体の加熱により約５００ｎｍまで増加する。

このように、デンドリマー２の表面をＥＬＰ２により修飾することによって、ナノカプセル１０に温度応答性を付与することができる。なお、デンドリマー２の表面をＥＬＰ２により修飾することによって、ナノカプセル１０に生体適合性を付与することも可能である。

これに対し、ＰＥＧは熱変性を起こさないので、比較例に係るナノカプセル９０では、液体の温度が上昇してもナノカプセル凝集体は形成されない。したがって、ナノカプセル９０のサイズは、液体の温度にかかわらずほぼ一定である。

なお、本実施の形態ではデンドリマーを本開示に係る「ポリマー殻」として用いる例について説明するが、他の樹状ポリマーを「ポリマー殻」として用いてもよい。デンドリマー以外の樹状ポリマーとしては、ポリエチレンイミン、ポリエーテル、ポリエステル、ポリアミド等が挙げられる。あるいは、これら樹状ポリマーのうちの２種類以上を組み合わせてもよい。

また、金属ナノ粒子を内包可能であり、かつ温度上昇により親水性から疎水性へと変化する有機分子を殻表面に修飾可能である高分子により形成された構造体であれば、樹状ポリマーとは異なる構造を有するポリマーを樹状ポリマーに代えてまたは加えて用いることも可能である。そのようなポリマーとしては、リポソーム（リポソーム膜）またはミセルが挙げられる。リポソーム膜は、たとえばＤＭＰＣ（dimerystoyl phosphatidylcholine）、ＤＰＰＣ（dipalmitoyl phophatidylcholine）、ＤＳＰＣ（distearoyl phosphatidylcholine）等を用いて形成される。

また、上記した特定のアミノ酸配列を有するエラスチン様ポリペプチドに代えて、加熱により親水性から疎水性へと変化する他の物質を有機分子３として用いてもよい。そのような物質は、「温度応答性ポリマー」とも称され、その具体例としては、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍとも略される）、ポリ（Ｎ−アルキルアクリルアミド）、ポリ（Ｎ−ビニルアルキルアミド）、ポリビニルアルキルエーテル、ポリエチレングリコール／ポリプロピレングリコールブロック共重合体、オシキエチレン鎖を有する種々のビニルエーテル系ポリマー等が挙げられる。あるいは、別のポリペプチドまたはタンパク質を温度応答性ポリマーとして用いることも可能である（たとえばMasamichi Nakamura, Drug Delivery System 23-6, 627-636 (2008)参照）。

＜ナノカプセルの集積装置の構成＞
図５は、本実施の形態に係るナノカプセル１０の集積装置の構成を概略的に示す図である。集積装置１００は、基板２１と、ＸＹＺ軸ステージ２２と、サンプル供給部２３と、調整機構２４と、レーザ光源２５と、光学部品２６と、対物レンズ２７と、照明光源２８と、撮影機器２９と、制御部３０とを備える。以下、ｘ方向およびｙ方向は水平方向を表す。ｘ方向とｙ方向とは互いに直交する。ｚ方向は鉛直方向を表す。重力の向きはｚ方向下方である。

基板２１は、ＸＹＺ軸ステージ２２上に配置され、サンプルＳを保持する。基板２１の詳細な構成については図６にて説明する。

サンプル供給部２３は、制御部３０からの指令に応じて、基板２１上にサンプルＳを供給する。サンプル供給部２３としては、たとえばディスペンサを用いることができる。

調整機構２４は、制御部３０からの指令に応じて、基板２１が配置されたＸＹＺ軸ステージ２２のｘ方向、ｙ方向およびｚ方向の位置を調整する。本実施の形態では対物レンズ２７の位置が固定されているので、ＸＹＺ軸ステージ２２の位置を調整することによって、基板２１と対物レンズ２７との相対的な位置関係が調整される。調整機構２４としては、たとえば顕微鏡に付属のサーボモータおよび焦準ハンドルなどの駆動機構を用いることができるが、調整機構２４の具体的な構成は特に限定されるものではない。なお、調整機構２４は、固定された基板２１に対して対物レンズ２７の位置を調整してもよい。

レーザ光源２５は、制御部３０からの指令に応じて、たとえば近赤外（たとえば波長１０６４ｎｍ）のレーザ光Ｌ１を発する。なお、レーザ光源２５は本開示に係る「光源」に相当する。

光学部品２６は、たとえばミラー、ダイクロイックミラーまたはプリズムを含む。集積装置１００の光学系は、レーザ光源２５からのレーザ光Ｌ１が光学部品２６により対物レンズ２７へと導かれるように調整される。

対物レンズ２７は、レーザ光源２５からのレーザ光Ｌ１を集光する。対物レンズ２７により集光された光は基板２１に照射される。ここで「照射する」とは、レーザ光Ｌ１がサンプルＳを通過する場合を含み、対物レンズ２７により集光された光のビームウエストがサンプルＳ内に位置する場合に限定されない。なお、光学部品２６および対物レンズ２７は、たとえば倒立型または正立型の顕微鏡本体に組み込むことができる。

照明光源２８は、制御部３０からの指令に応じて、基板２１内のサンプルＳを照らすための白色光Ｌ２を発する。１つの実施例として、ハロゲンランプを照明光源２８として用いることができる。対物レンズ２７は、照明光源２８から基板２１に照射された白色光Ｌ２を取り込むためにも用いられる。対物レンズ２７により取り込まれた白色光Ｌ２は、光学部品２６により撮影機器２９へと導かれる。

撮影機器２９は、制御部３０からの指令に応じて、白色光Ｌ２が照射された基板２１内のサンプルＳを撮影し、撮影された画像を制御部３０に出力する。撮影機器２９には、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）イメージセンサまたはＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）イメージセンサを含むビデオカメラが用いられる。

制御部３０は、サンプル供給部２３、調整機構２４、レーザ光源２５、照明光源２８および撮影機器２９を制御する。また、制御部３０は、撮影機器２９により撮影された画像に所定の画像処理を施す。制御部３０は、いずれも図示しないが、ＣＰＵ（Central Processing Unit）と、メモリと、入出力バッファとを含んで構成されるマイクロコンピュータによって実現される。

なお、集積装置１００の光学系は、レーザ光源２５からのレーザ光Ｌ１を基板２１に照射することが可能であるととともに基板２１からの白色光Ｌ２を撮影機器２９に取り込むことが可能であれば、図５に示した構成に限定されず、光ファイバ等を含んで構成されてもよい。また、集積装置１００において、サンプル供給部２３、照明光源２８および撮影機器２９は必須の構成要素ではない。

図６は、基板２１の周囲の構成をより詳細に示す図である。基板２１上に保持されるサンプルＳは、ナノカプセル１０が分散した水性の液体（たとえば超純水）Ｗである。基板２１は、レーザ光Ｌ１による金ナノ粒子１の局在表面プラズモン共鳴（後述）に影響を与えず、かつ白色光Ｌ２に対して透明な材料により形成される。そのような材料としては石英、シリコンなどが挙げられる。基板２１には、たとえばカバーガラスを用いることができる。この場合、基板２１上に滴下されたサンプルＳは、図６に示すような半楕円球状になる。

対物レンズ２７は、たとえば基板２１の下方に配置され、下方からのレーザ光Ｌ１を集光する。集光された光は、対物レンズ２７の上方のサンプルＳに照射される。レーザ光Ｌ１の水平方向の照射位置は、たとえば、サンプルＳの円形（または楕円形）の底面の中心近傍とすることが好ましい。また、レーザ光Ｌ１の焦点（ビームウエスト）の鉛直方向の位置は、サンプルＳと基板２１との界面近傍とすることが好ましい。レーザ光Ｌ１の照射位置（レーザスポット）の様子が撮影機器２９により上方から下方に向けて撮影される（図５参照）。

なお、基板２１の周囲の構成は、図６に示した構成に限定されるものではない。たとえば、上方から下方に向けてレーザ光Ｌ１を照射してもよい。基板２１は、本開示に係る「保持部材」に相当する。「保持部材」の形状は、サンプルＳを保持することが可能であれば特に限定されず、立体形状を有していてもよい。具体的には、あるいは、サンプルＳを滴下すべき位置を示すとともに滴下されたサンプルＳの形状を規定する液面ガイド（図示せず）を基板２１上に設けてもよい。また、「保持部材」は、図２０にて説明するような容器４１（たとえばガラスボトムディッシュ）であってもよい。

＜ナノカプセルの集積フロー＞
以上のように構成された集積装置１００においては、以下に示すフローチャートに従って各機器が制御されることによって、液体Ｗ中に分散したナノカプセル１０がレーザスポット近傍に集積される。

図７は、本実施の形態に係るナノカプセル１０の集積方法を示すフローチャートである。このフローチャートに含まれる各ステップは、基本的には制御部３０によるソフトウェア処理によって実現されるが、その一部または全部が制御部３０内に作製されたハードウェア（電気回路）によって実現されてもよい。なお、このフローチャートの開始時には、ナノカプセル１０が分散したサンプルＳがサンプル供給部２３内に設置されているものとする。

図１および図７を参照して、ステップＳ１０において、制御部３０は、基板２１を準備してＸＹＺ軸ステージ２２上に設置する。この処理は、たとえば基板２１の送り機構（図示せず）により実現される。

ステップＳ２０において、制御部３０は、サンプルＳが基板２１上に供給（滴下）されるようにサンプル供給部２３を制御する。サンプルＳの滴下量は、数μＬ〜数ｍＬ程度の微量であってもよい。

ステップＳ３０において、制御部３０は、サンプルＳに照射するための白色光Ｌ２を発するように照明光源２８を制御するとともに、サンプルＳの撮影を開始するように撮影機器２９を制御する。

ステップＳ４０において、制御部３０は、調整機構２４を制御することによって、レーザ光源２５からのレーザ光Ｌ１がサンプルＳの適切な位置（たとえば図６にて説明した位置）に照射されるようにＸＹＺ軸ステージ２２の位置を調整する。一例として、水平方向については、撮影機器２９により撮影された画像からパターン認識の画像処理技術を用いてサンプルＳの液滴の輪郭を抽出することによって、現在位置から適切な位置（たとえばサンプルＳの円形の輪郭の中心近傍）までの調整量を演算することができる。一方、鉛直方向については、調整機構２４内のサーボモータ（図示せず）により基板２１の現在位置は既知であるため、所定の位置（たとえばサンプルＳと基板２１との界面の位置）へと調整することが可能である。

ステップＳ５０において、制御部３０は、レーザ光Ｌ１を発するようにレーザ光源２５を制御する。レーザ光Ｌ１は対物レンズ２７により集光され、集光された光がサンプルＳに照射される。これにより、サンプルＳの液体Ｗ中に対流が生じ、液体Ｗ中に分散しているナノカプセル１０がレーザスポット近傍に集積される。ナノカプセル１０の集積メカニズムおよび集積される様子については図８〜図１９および図２１〜図２５にて詳細に説明する。

ステップＳ６０において、制御部３０は、レーザ光源２５を制御して基板２１へのレーザ光Ｌ１の照射を停止させる。これにより、一連の処理が終了する。

なお、ステップＳ３０の処理は、サンプルＳを観察するための処理であって、ナノカプセル１０を集積するために必須の処理ではない。また、基板２１がＸＹＺ軸ステージ２２上に固定されている場合には、ステップＳ１０の処理を省略することができる。したがって、ステップＳ１０，Ｓ３０の処理を含まないフローチャートを実行した場合でもナノカプセル１０を集積することが可能である。

＜ナノカプセルの集積メカニズム＞
集積装置１００においては、レーザ光源２５からのレーザ光Ｌ１がサンプルＳに照射されると、ナノカプセル１０内の金ナノ粒子１が光熱変換により熱を発生させる。

図８は、光熱変換の原理を説明するための図である。図８を参照して、金ナノ粒子１の自由電子は局在表面プラズモンを形成し、レーザ光Ｌ１によって振動する。これにより分極が生じる。この分極のエネルギーは、自由電子と原子核との間のクーロン相互作用により格子振動のエネルギーに変換される。その結果、金ナノ粒子１は熱を発生させる。この効果は「光発熱効果」とも称される。なお、金ナノ粒子１がデンドリマー２に内包された状態であっても光発熱効果により熱が発生することが確認されている。

図９は、本実施の形態におけるナノカプセル１０の集積メカニズムの各段階を説明するための図である。レーザ光Ｌ１の照射（以下「光照射」とも略す）の開始前には、水性の液体Ｗ中にナノカプセル１０が分散した状態である（図９（Ａ）参照）。その後、光照射が開始される（図９（Ｂ）参照）。

図１にて説明したように、金属ナノ粒子の体積が大きいほど金属ナノ粒子に作用する光誘起力は大きくなる。言い換えると、金属ナノ粒子は、その粒子径が小さいほど光誘起力により捕捉されにくくなる。光照射により捕捉可能な金属ナノ粒子の粒子径は、典型的なレーザ光の強度（たとえば対物レンズ透過後に数１００ｍＷ程度）では数１０ｎｍ以上とされる。

一方、金ナノ粒子１の粒子径Ｄ１は、シングルナノメートルのオーダー（図３に示した例では１．５ｎｍ）であり、一般的に捕捉可能な金属ナノ粒子の粒子径よりも１桁小さい。この場合、金ナノ粒子１の体積Ｖは、一般的に捕捉可能な金属ナノ粒子の体積よりも３桁以上小さいことになる。よって、金ナノ粒子１が単体で液体Ｗ中に分散している場合には、光誘起力により金ナノ粒子１を捕捉することは難しい。

そこで、本実施の形態においては、金ナノ粒子１が内包されたナノカプセル１０の性質を利用する。光照射を開始すると、レーザスポット近傍のナノカプセル１０内の金ナノ粒子１が光発熱効果により熱を発生させる。この段階ではレーザスポット近傍に存在する金ナノ粒子１はわずかであるため、発生する熱は微量と考えられる。しかしながら、図４にて説明したようにナノカプセル１０の熱変性は比較的低い温度で起こるので、微量の熱であってもレーザスポット近傍のナノカプセル１０同士が凝集してナノカプセル凝集体１０Ａ（図１０参照）が形成される（図９（Ｃ）参照）。

ナノカプセル凝集体１０Ａには多数の金ナノ粒子１が含まれるので、ナノカプセル凝集体１０Ａは金ナノ粒子１の集合体であるとも言える。したがって、光誘起力によりナノカプセル凝集体１０Ａを捕捉することが可能になる（図９（Ｄ）参照）。

レーザスポットに捕捉されたナノカプセル凝集体１０Ａ内の金ナノ粒子１は、レーザ光Ｌ１を継続的に受けることになるので、図９（Ｃ）に示した段階と比べて、より大きな熱を光発熱効果によって発生させる。これにより、ナノカプセル凝集体１０Ａの周囲の液体が加熱される（図９（Ｅ）参照）。その結果、レーザスポット近傍の液体Ｗが局所的に沸騰してレーザスポットにマイクロバブル（マイクロメートルのオーダーの気泡）ＭＢが発生する（図９（Ｆ）参照）。マイクロバブルＭＢは時間の経過とともに成長し得る。

レーザスポットに近いほど液体Ｗの温度は高い。つまり、光照射により液体Ｗ中に温度勾配が生じる。この温度勾配に起因して、液体Ｗ中には規則的な熱対流（層流）が定常的に発生する（図９（Ｇ）参照）。以下では、この熱対流を「対流」と略す。

図１０は、対流発生時のレーザスポット近傍の様子を説明するための概念図である。なお、図１０では図面が煩雑になるのを避けるため、基板２１および液体Ｗの図示を省略している。

図１０を参照して、対流の方向は、マイクロバブルＭＢ（あるいはレーザスポット）に一旦向かい、その後マイクロバブルＭＢから離れる方向である。このように狭い領域に対流が生じる理由は以下のように説明することができる。すなわち、マイクロバブルＭＢの鉛直方向上方に存在する液体が加熱により希薄となり浮力によって上昇する。それとともに、マイクロバブルＭＢの水平方向に存在する相対的に低温の液体が、加熱された領域に向けて流入する。

図９に戻り、ナノカプセル１０が対流に乗ってマイクロバブルＭＢに向けて運ばれることによって、ナノカプセル１０がレーザスポット近傍に集積される。より詳細には、マイクロバブルＭＢと基板２１の上面との間には対流の流速がゼロとなる淀み領域Ｒが生じるので、対流に乗って運ばれてきたナノカプセル１０は淀み領域Ｒに滞留して集積される。その後、光照射を停止すると対流は弱まる（図９（Ｈ）参照）。

このように、本実施の形態によれば、ナノカプセル１０の熱変性（ＥＬＰ２の立体構造の変化）による凝集作用と、ナノカプセル１０の発熱（金ナノ粒子１の光発熱効果）による対流作用とを積極的に利用することによって、短時間かつ高密度にナノカプセル１０をレーザスポット近傍に集積することができる。なお、「ナノカプセル１０がレーザスポット近傍に集積される」には、ナノカプセル１０がマイクロバブルＭＢの表面に集積される場合を含み得る。

＜ナノカプセルの集積結果＞
続いて、ナノカプセル１０の集積結果について、比較例と対比しながら詳細に説明する。本実施の形態および比較例では以下に示す８つのサンプルを準備した。

図１１は、第１〜第８のサンプルにおけるナノカプセルの集積条件を説明するための図である。図１１に示すように、比較例のために第１〜第４および第８のサンプルを準備するとともに、本実施の形態のために第５〜第７のサンプルを準備した。

第１のサンプルと第２のサンプルとでは、ナノカプセルに金ナノ粒子１が内包されない点が共通する一方で、ナノカプセルの表面に修飾された有機分子３が互いに異なる。第１のサンプルではナノカプセルの表面がＰＥＧにより修飾され、第２のサンプルではナノカプセルの表面がＥＬＰ２により修飾される。

第３および第４のサンプルでは、いずれもナノカプセルに金ナノ粒子１が内包されるとともに、ナノカプセルの表面がＰＥＧにより修飾される。第３のサンプルと第４のサンプルとでは、ナノカプセルの濃度が１桁異なる。

第５〜第７のサンプルでは、ナノカプセル１０に金ナノ粒子１が内包される点、および、ナノカプセル１０の表面がＥＬＰ２により修飾される点は共通である一方で、ナノカプセル１０の濃度が１桁ずつ異なる。

第８のサンプルでは、第２のサンプルと同様に、ナノカプセルに金ナノ粒子１が内包されず、かつ、ナノカプセルの表面がＥＬＰ２により修飾される。ただし、第２のサンプルと第８のサンプルとでは、ナノカプセルの濃度が１桁異なる。

レーザ光源２５からのレーザ光Ｌ１の強度（レーザ出力）は１．０Ｗであった。対物レンズ２７の倍率は１００倍であった。対物レンズ２７通過後のレーザ出力は、レーザ光源２５からのレーザ出力よりも低下し、約２０％になる。つまり、サンプルＳへのレーザ出力は約２００ｍＷであった。

図１２〜図１５は、第１〜第４のサンプルへの光照射結果をそれぞれ示す連続画像である。図１２〜図１５および後述する図１６〜図１９において、図中の数字は、光照射開始時刻からの経過時間（単位：秒）を示す。

図１２および図１３を参照して、金ナノ粒子１が含まれない第１および第２のサンプルでは、ナノカプセルの表面に修飾された有機分子３の種類にかかわらず、光照射開始から１１０秒が経過してもマイクロバブルＭＢは発生しなかった。

次に第１４および図１５を参照して、第３および第４のサンプルは、いずれもナノカプセルに金ナノ粒子１が内包されるものの、ナノカプセルの表面がＰＥＧにより修飾されたものである。この場合、ナノカプセルの濃度が相対的に低い第３のサンプルでは、マイクロバブルＭＢは発生しなかった。ナノカプセルの濃度がより高い第４のサンプルでは、光照射開始から約６０秒経過後にマイクロバブルＭＢの発生が確認されたものの、マイクロバブルＭＢのサイズは、後述するサンプルと比べて著しく小さかった。

図１６〜図１８は、第５〜第７のサンプルへの光照射結果をそれぞれ示す連続画像である。第５〜第７のサンプルでは、いずれもナノカプセル１０に金ナノ粒子１が内包され、かつナノカプセル１０の表面がＥＬＰ２により修飾される。ナノカプセル１０の濃度が最も低い第５のサンプルでは、マイクロバブルＭＢは発生しなかった。

一方、第５のサンプルと比較した場合にナノカプセル１０の濃度が１桁高い第６のサンプルでは、光照射開始から数秒経過後にマイクロバブルＭＢが発生した。さらに、マイクロバブルＭＢと基板２１との接触領域（マイクロバブルＭＢが基板２１に付着した領域）の周りにナノカプセル１０が環状に集積される様子が確認された。第６のサンプルにおけるナノカプセル１０の濃度と、第３のサンプル（図１４参照）におけるナノカプセルの濃度とは等しい。これらのサンプルを比較すると、ナノカプセルの表面がＥＬＰ２により修飾された場合にはナノカプセルが集積される一方で、ナノカプセルの表面がＰＥＧにより修飾された場合にはナノカプセルが集積されないことが分かる。

ナノカプセル１０の濃度が最も高い第７のサンプルでは、光照射開始直後にマイクロバブルＭＢが発生した。マイクロバブルＭＢのサイズは、第６のサンプルにおけるマイクロバブルＭＢのサイズよりもさらに大きかった。また、対流が発生している様子が確認されるとともに、マイクロバブルＭＢの近傍に大量のナノカプセル１０が集積した。なお、ナノカプセルの濃度が等しい第４および第７のサンプルを比較すると、ナノカプセルの表面に修飾された有機分子３の種類によってマイクロバブルＭＢの大きさに明確な違いが存在する。

以上の結果より、マイクロバブルＭＢの発生およびそれに続くナノカプセルの集積には、金ナノ粒子１が必須であることが分かる。また、ナノカプセルの濃度が等しい場合、有機分子３がＥＬＰ２である方が、有機分子３がＰＥＧであるときと比べて、マイクロバブルＭＢが発生しやすく、その後のナノカプセルの集積も起こりやすいことが分かる。さらに、有機分子３が同種である場合には、ナノカプセルが高濃度であるほどマイクロバブルＭＢの発生およびナノカプセルの集積が起こりやすいことが分かる。

図１９は、図示しない分光器を用いて第６のサンプルにおけるレーザスポット近傍の消衰スペクトルを測定した結果の一例を説明するための図である。図１９（Ａ）の連続画像に示すように、光照射中にはマイクロバブルＭＢが基板２１上に付着した状態であったものの、光照射開始から１８０秒経過後に光照射を停止すると、その直後にマイクロバブルＭＢは液体Ｗ中を浮上して消失した。

光照射開始前、光照射開始から１８３秒、２１０秒および２４０秒経過後（すなわち光照射停止から３秒、３０秒および６０秒経過後）に消衰スペクトルを測定した。光照射中の消衰スペクトルの測定結果が示されていないのは、光照射中にマイクロバブルＭＢが存在しているときにはレーザ光Ｌ１のマイクロバブルＭＢによる散乱光強度が高過ぎて消衰スペクトルを正確に測定することができないので、マイクロバブルＭＢが存在しない状態での測定が必要であったためである。消衰スペクトルの測定範囲は、光照射開始から１８３秒経過後の画像に示した範囲である。

図１９（Ｂ）において、横軸は波長（単位：ｎｍ）を示し、縦軸は強度を示す。光照射開始から１８３秒経過の消衰スペクトルの強度は、光照射開始前の消衰スペクトルの強度の約２倍であった。ランベルト・ベールの法則によれば、消衰スペクトルの強度が高いほど、ナノカプセルの集積度が高いという関係がある。したがって、図１７に示した連続画像に加えて、消衰スペクトルからもナノカプセル１０の集積化を確認することができたと言える。

その一方で、光照射開始から２１０秒または２４０秒経過後（すなわち光照射停止から３０秒または６０秒経過後）の消衰スペクトルの強度は、いずれも光照射開始前の消衰スペクトルの強度とほぼ等しい。これは、レーザスポット近傍の温度が光照射停止後には速やかに低下し、それにより、一旦集積されたナノカプセル１０が液体Ｗ中へと再び分散したためと考えられる。つまり、ＥＬＰ２の立体構造の変化は可逆的であるため、温度低下に伴いナノカプセル１０の表面が疎水性から親水性へと戻り、その結果、ナノカプセル１０が再び分散したと考えられる。

仮にレーザ光Ｌ１が可視光の波長域に含まれる波長を有する場合、白色光Ｌ２の照射下で撮影機器２９によりレーザスポット近傍を撮影する際にレーザ光Ｌ１が障害となり得る。これに対し、本実施の形態においては、近赤外の波長域に含まれる１０６４ｎｍの波長を有するレーザ光Ｌ１が用いられる。これにより、レーザ光Ｌ１が撮影の障害となることを避けることができる。それとともに以下の事実が示される。

金ナノ粒子１の局在表面プラズモン共鳴の波長域は、水中では可視光の波長域である。そのため、局在表面プラズモン共鳴の波長域の共鳴光（可視光）を用いる場合には、局在表面プラズモン共鳴の波長域外の非共鳴光（近赤外光）を用いる場合と比べて、同じレーザ出力でより大量の熱を発生させることができる。よって、より容易にナノカプセル凝集体１０Ａを捕捉し、それにより光発熱効果による対流を生じさせてナノカプセル１０を集積することが可能である。このことを逆の視点から見ると、本実施の形態によれば、たとえ非共鳴光である近赤外光を用いた場合であっても（言い換えれば、より厳しい条件下であっても）ナノカプセル１０を集積可能であることが分かる。

＜細胞および生体組織への影響＞
近赤外光は、たとえば生体イメージングの分野で広く用いられているように、生体組織による減衰（散乱等）が比較的起こりにくく生体組織内での透過性が高い。本実施の形態によれば、近赤外光を用いてナノカプセル１０を集積可能であることから、生体組織への応用可能性が示唆される。以下、本開示に係るナノカプセルの集積方法の生体組織（以下では特に、生体組織の構成要素である細胞）への応用可能性について説明する。

図２０は、細胞への影響を確認するための測定に用いた集積装置の構成を示す図である。この集積装置では、基板２１に代えて容器４１が用いられる。図２０（Ａ）には容器４１の側面図が示されており、図２０（Ｂ）には容器４１の上面図が示されている。

図５、図２０（Ａ）および図２０（Ｂ）を参照して、容器４１は、たとえばガラスボトムディッシュである。容器４１は、円柱形状の底部４１１と、底部から垂直方向（Ｚ方向）に延在する壁部４１２と、底部４１１の中央に形成された円柱形状の窪みである測定ウェル４１３とを含む。測定ウェル４１３の材料はガラスである。底部４１１および壁部４１２の材料には、たとえば樹脂（たとえばポリプロピレン）が用いられる。

集積対象とするサンプルとしては、図１１にて説明した第６および第８のサンプルのうちのいずれか一方を用いた。第６のサンプルは、金ナノ粒子１を内包するナノカプセル１０を含むサンプルである。一方、第８のサンプルは、金ナノ粒子１を内包しないナノカプセルを含むサンプルである。以下に示す測定結果では、第６および第８のサンプルは、細胞４をさらに含む。細胞４には、ヒト子宮頸ガン由来の細胞であるヒーラ（ＨｅＬａ）細胞を用いた。なお、環境温度は室温（具体的には２４．３℃）であり、光照射前にはナノカプセル１０の熱変性（親水性から疎水性への変化）は起こっていない。

ヒーラ細胞を含む第６または第８のサンプルの液滴（ヒーラ細胞の培地の液滴）が測定ウェル４１３に１０μＬ滴下された状態でレーザ光Ｌ１を照射した。この測定においても、倍率４０倍の対物レンズ２７を用いた。レーザ光Ｌ１のビームウエストの高さは、調整機構２４の駆動機構（具体的には、顕微鏡に付属のサーボモータおよび焦準ハンドルなど）を制御することによって、測定ウェル４１３の上面から５目盛りだけ上の位置になるように設定した。この１目盛りは、空気中では１μｍに相当する。レーザ光源２５からのレーザ出力は１．０Ｗであり、対物レンズ７通過後のレーザ出力は２００ｍＷであった。レーザ光Ｌ１の照射時間は６０秒に設定した。そして、図５、図２０（Ａ）および図２０（Ｂ）には示されていないが、照明光源２８からの白色光Ｌ２によるサンプルの吸収および散乱を測定するための分光器を設け、サンプルの消衰スペクトル（特定の位置の局所的な消衰スペクトル）を測定した。

図２１は、第６のサンプルにおける光照射前後の分光結果を説明するための図である。図２１〜図２３では、消衰スペクトルの測定領域を白丸で示す。

図２１（Ａ）は、光照射前の画像（光学顕微像）および消衰スペクトル（すなわちマイクロバブルＭＢの発生前の消衰スペクトル）と、光照射により発生したマイクロバブルＭＢが消滅した直後の画像および消衰スペクトルとを示す。マイクロバブルＭＢの発生前と消滅後とで、いずれもマイクロバブルＭＢが存在しない状態という点では共通するものの、消衰スペクトルの強度が異なる。光照射後における消衰スペクトルの強度の方が、光照射前における消衰スペクトルの強度よりも高い。

図２１（Ｂ）は、細胞４の位置における光照射前の消衰スペクトルと、細胞４の位置における光照射後の細胞のスペクトルとを示す。細胞４が存在する位置での消衰スペクトルの強度も、光照射前の方が光照射後と比べて高いことが分かる。

図２２は、第６のサンプルにおける光照射前後の他の分光結果を説明するための図である。図２２には、図２１に示した細胞４以外の細胞４ａ，４ｂへの照射スペクトルの測定結果を示す。図２２（Ａ）は、光照射前の細胞４ａの画像を示す。図２２（Ｂ）は、光照射後の細胞４ａの画像を示す。図２２（Ｃ）は、光照射後の細胞４ｂの画像を示す。図２２（Ｄ）は、細胞４ａ，４ｂの消衰スペクトルを示す。図２２（Ｄ）に示す分光結果においても、光照射後の方が光照射前と比べて、消衰スペクトルの強度が高いことが分かる。

図２３は、第８のサンプルにおける光照射前後の分光結果を説明するための図である。図２３（Ａ）および図２２（Ｂ）は、第８のサンプルにおける光照射前および光照射後の画像をそれぞれ示す。金ナノ粒子１を内包しないナノカプセルを含む第８のサンプルにおいては、マイクロバブルＭＢは発生しなかった。また、図２３（Ｃ）は、消衰スペクトルを示す。光照射前と光照射後とで消衰スペクトルがほとんど変化しないことが分かる。

次に、光照射後の細胞４の生死の判定結果について説明する。細菌を染色するための蛍光色素として、カルセイン（Calcein）−ＡＭとＰＩ（Propidium Iodide）とが知られている。カルセイン-ＡＭは、それ自体は蛍光をほとんど発しないが、細胞内で加水分解されると、励起波長の光照射に伴い黄緑色の強い蛍光を発する。よって、蛍光観察像において黄緑色に観察される領域は細胞が生存していることを示す。一方、ＰＩは膜透過性を有さない。そのため、細胞膜に損傷が生じている細胞（すなわち死菌）のみがＰＩにより染色される。ＰＩを外部から励起すると、赤色の蛍光を発する。

図２４は、第６のサンプルにおける生死判定結果を説明するための図である。ここでは測定ウェル４１３を４つの領域に仮想的に分割し、領域Ｂ、領域Ｃ、領域Ｄの順にレーザ光Ｌ１を照射した（図２０参照）。各領域Ｂ〜Ｄにおけるレーザ光Ｌ１の照射時間は６０秒に設定した。なお、領域Ａは、レーザ光Ｌ１が照射されない対照実験のための領域である。

図２４（Ａ）は、左から順に、図２０に示した領域Ｃにおける光照射後の画像（光学顕微鏡像）、位相差像および蛍光観察像を示す。図２４（Ｂ）は、領域Ｄにおける光照射後の画像、位相差像および蛍光観察像を示す。蛍光観察像では、死滅した細胞（赤色の蛍光を発する細胞）が生存している細胞から区別して示されている。

図２４（Ａ）および図２４（Ｂ）に示すように、レーザスポット近傍の細胞４が死滅していることが分かる。このように、非共鳴光であるレーザ光Ｌ１の照射位置に金ナノ粒子１を内包したナノカプセル１０を集積させ、金ナノ粒子１の発熱により、金ナノ粒子１の近傍の細胞４を死滅させることができる。つまり、狙った位置のガン細胞を選択的に死滅させることができる。このことから薬物送達システム（ＤＤＳ）への利用が可能であることが示された。なお、金ナノ粒子１の「近傍」とは、好ましくは、レーザ光Ｌ１の照射により生成するマイクロバブルＭＢの直径の数倍（たとえば２〜３倍）よりも内側の領域を意味する。

なお、本実施の形態では、温度上昇に伴い親水性から疎水性へと変化する有機分子である温度応答性ポリマーがナノカプセル表面に修飾される構成を例に説明した。このように、水性の液体中において、低温では親水性のため溶解するが、ある温度まで昇温すると親水性から疎水性へと変化して不溶化する温度応答性ポリマーは、下限限界共溶温度（ＬＣＳＴ：Lower Critical Solution Temperature）型温度応答性ポリマーとも称される。

ＬＣＳＴ型温度応答性ポリマーに代えて、以下のような温度応答性ポリマーを用いることも可能である。すなわち、有機溶媒である液体（非水性の液体）中において、低温では疎水性のため溶解するが、ある温度まで上昇すると疎水性から親水性へと変化して不溶化する温度応答性ポリマーを用いてもよい。このような温度応答性ポリマーは、上限限界共溶温度（ＵＣＳＴ：Upper Critical Solution Temperature）型温度応答性ポリマーとも称される。有機溶媒である液体とＵＣＳＴ型温度応答性ポリマーとの組合せについては、親水性／疎水性の変化の方向が逆であるものの、基本的には上記した実施の形態と同様であるため、詳細な説明は繰り返さない。なお、有機溶媒中においても金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の共鳴波長が可視光の波長域に含まれ得るので、非共鳴の波長域は、たとえば赤外（または紫外）の波長域となり得る。

今回開示された実施の形態はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本開示の範囲は、上記した説明ではなく、請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

本開示は、たとえば、金属ナノ粒子とともに薬物が内包されたナノカプセルを集積する方法として利用することができる。一例として、新薬開発において微量の薬物を光照射位置に集積させて細胞または生体組織への影響を評価するなど医療分野に利用することができる。

１金ナノ粒子、２デンドリマー、２Ａコア、２Ｂ分岐部分、２Ｃ末端基、３有機分子、１０，９０ナノカプセル、１０Ａナノカプセル凝集体、２１基板、２２ＸＹＺ軸ステージ、２３サンプル供給部、２４調整機構、２５レーザ光源、２６光学部品、２７対物レンズ、２８照明光源、２９撮影機器、３０制御部、４，４ａ，４ｂ細胞、４１容器、４１１底部、４１２壁部、４１３測定ウェル、１００集積装置、Ｓサンプル、Ｗ液体。

Claims

保持部材に保持され、複数のナノカプセルが分散した水性の液体中で前記複数のナノカプセルを集積する、ナノカプセルの集積方法であって、
前記複数のナノカプセルの各々は、
１ナノメートルから１０ナノメートルまでの範囲を示すシングルナノメートルのオーダーのサイズを有する金属ナノ粒子と、
前記金属ナノ粒子を内包するポリマー殻と、
前記ポリマー殻の表面に修飾され、温度上昇により親水性から疎水性へと変化する有機分子とを含み、
前記集積方法は、
前記複数のナノカプセルが分散した前記液体に前記金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外の非共鳴光を照射することで、前記有機分子の温度上昇により前記有機分子を親水性から疎水性へ変化させて前記複数のナノカプセルの一部を凝集させるステップと、
凝集により形成されたナノカプセル凝集体を前記非共鳴光の照射位置に捕捉するステップと、
前記ナノカプセル凝集体に含まれる前記金属ナノ粒子によって前記非共鳴光を熱に変換させて前記ナノカプセル凝集体の周囲の液体を加熱するステップと、
前記液体を加熱することで生じた対流によって前記複数のナノカプセルを集積するステップとを含む、ナノカプセルの集積方法。
保持部材に保持され、複数のナノカプセルが分散した有機溶媒である液体中で前記複数のナノカプセルを集積する、ナノカプセルの集積方法であって、
前記複数のナノカプセルの各々は、
１ナノメートルから１０ナノメートルまでの範囲を示すシングルナノメートルのオーダーのサイズを有する金属ナノ粒子と、
前記金属ナノ粒子を内包するポリマー殻と、
前記ポリマー殻の表面に修飾され、温度上昇により疎水性から親水性へと変化する有機分子とを含み、
前記集積方法は、
前記複数のナノカプセルが分散した前記液体に前記金属ナノ粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外の非共鳴光を照射することで、前記有機分子の温度上昇により前記有機分子を疎水性から親水性へ変化させて前記複数のナノカプセルの一部を凝集させるステップと、
凝集により形成されたナノカプセル凝集体を前記非共鳴光の照射位置に捕捉するステップと、
前記ナノカプセル凝集体に含まれる前記金属ナノ粒子によって前記非共鳴光を熱に変換させて前記ナノカプセル凝集体の周囲の液体を加熱するステップと、
前記液体を加熱することで生じた対流によって前記複数のナノカプセルを集積するステップとを含む、ナノカプセルの集積方法。
前記集積するステップは、前記液体を加熱することで気泡を発生させ、前記気泡に向かう前記対流を生じさせることによって前記複数のナノカプセルを集積する、請求項１または２に記載のナノカプセルの集積方法。
前記非共鳴光は、赤外の波長域に含まれる波長を有するレーザ光である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のナノカプセルの集積方法。
前記有機分子は、温度上昇に伴い親水性から疎水性へと変化するポリマーを示す温度応答性ポリマーである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のナノカプセルの集積方法。
前記ポリマー殻は、デンドリマーであり、
前記温度応答性ポリマーは、（Ｘ_１ＰＧＸ_２Ｇ）_ｎで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
Ｘ_１はバリンまたはイソロイシンを示し、Ｘ_２はプロリンを除くアミノ酸を示し、Ｐはプロリンを示し、Ｇはグリシンを示し、ｎは１以上の自然数を示す、請求項５に記載のナノカプセルの集積方法。