JP6948059B2 - Promotion of osteocalcin production from osteoblasts by miR-140-3p - Google Patents
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Description
本発明は、ｍｉＲ−１４０−３ｐを有効成分として含むオステオカルシン産生促進剤及び骨形成促進剤、ｍｉＲ−１４０−３ｐを利用したオステオカルシン産生促進剤をスクリーニングする方法、並びに、健康状態を把握するため、骨形成の判定をするため、及び骨粗鬆症の治療効果を判定するためのバイオマーカーに関する。 The present invention provides a method for screening an osteocalcin production promoter and a bone formation promoter containing miR-140-3p as an active ingredient, an osteocalcin production promoter using miR-140-3p, and a method for ascertaining the health condition. It relates to a biomarker for determining bone formation and for determining the therapeutic effect of osteoporosis.
骨は破壊と形成を繰り返しつつ支持組織としての形態の維持や体内のカルシウム代謝に貢献している。この骨吸収と骨形成を骨リモデリングと呼んでおり、骨組織中の骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞が関与している。この骨リモデリングには骨芽細胞と破骨細胞の直接的作用だけでなく、女性ホルモンなどの液性因子も複雑に関与している。骨吸収が優位になると骨量の減少が起こり、骨粗鬆症の状態となり、脆弱性骨折の原因となって、寝たきりや認知症の発症に関与する。高齢社会の現在では脆弱性骨折を予防することが寝たきりや認知症などの加齢に伴う疾患を予防する上で重要と考えられる。 Bone repeatedly destroys and forms and contributes to the maintenance of morphology as a supporting tissue and calcium metabolism in the body. This bone resorption and bone formation is called bone remodeling, and osteoblasts, osteoocytes, and osteoclasts in bone tissue are involved. In addition to the direct action of osteoblasts and osteoclasts, humoral factors such as female hormones are also involved in this bone remodeling in a complex manner. When bone resorption becomes dominant, bone loss occurs, resulting in osteoporosis, which causes fragile fractures and is involved in the development of bedridden and dementia. In today's aging society, prevention of fragile fractures is considered important in preventing age-related diseases such as bedridden and dementia.
これまで骨粗鬆症の治療には破骨細胞機能の阻害を目的にしたビスフォスフォネート製剤や骨芽細胞に作用する副甲状腺ホルモン製剤、女性ホルモン製剤などが用いられてきた。 So far, bisphosphonate preparations for the purpose of inhibiting osteoclast function, parathyroid hormone preparations that act on osteoblasts, female hormone preparations, and the like have been used for the treatment of osteoporosis.
現在、骨粗鬆症治療に主に用いられているビスフォスフォネート製剤は破骨細胞機能を抑制することで骨量を維持する。また、副甲状腺ホルモン製剤は骨芽細胞に作用して骨形成を促進し、選択的エストロゲン受容体モジュレーターは骨質の改善作用も有する。このように骨粗鬆症治療薬はそれぞれ特徴的な作用を有しているが、ビスフォスフォネート製剤は長期投与により大腿骨の非定型骨折を引き起こすことがある。また、副甲状腺ホルモン製剤は骨芽細胞に直接作用するが、骨折の危険性の高い骨粗鬆症患者に２４ヶ月までの期間限定で投与することと定められている。以上のようにこれまでの骨粗鬆症治療薬は副作用を含め、投薬に際して種々の制限が存在する。 Currently, bisphosphonate preparations, which are mainly used for the treatment of osteoporosis, maintain bone mass by suppressing osteoclast function. In addition, parathyroid hormone preparations act on osteoblasts to promote bone formation, and selective estrogen receptor modulators also have an effect of improving bone quality. As described above, each therapeutic agent for osteoporosis has a characteristic action, but a bisphosphonate preparation may cause an atypical fracture of the femur by long-term administration. In addition, although parathyroid hormone preparations act directly on osteoblasts, it is stipulated that they should be administered to osteoporotic patients at high risk of fracture for a limited period of up to 24 months. As described above, conventional osteoporosis therapeutic agents have various restrictions on administration, including side effects.
このような副作用や投薬に際して種々の制限が課されない、従来とは異なる作用機序に基づく骨粗鬆症治療薬の提供が課題とされている。 It is an issue to provide a therapeutic agent for osteoporosis based on a mechanism of action different from the conventional one, which is not subject to various restrictions on such side effects and medications.
近年生体内の機能調節をしている因子としてマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）が注目されている。ｍｉＲＮＡは約２２塩基からなる１本鎖ノンコーディングＲＮＡであり、分泌顆粒のエクソソーム中に含まれて遠隔細胞において標的遺伝子の３’ＵＴＲ部に結合し、標的遺伝子の転写後にその遺伝子発現を調節すると考えられている。ｍｉＲＮＡは、分化、発生、腫瘍形成、および感染に対する細胞防御において、重要な役割を果たしていることが知られている。また、ｍｉＲＮＡの中には骨芽細胞から産生、分泌されるものがある。
骨芽細胞分化の過程で、ＢＭＰ経路に作用するのはｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１３８であり、Ｗｎｔ経路に作用するのはｍｉＲ−２９とｍｉＲ−３３５である（非特許文献１）。ｍｉＲ−２９は両経路に作用するが、作用機序は独立していると考えられる。
ゲノム中に存在するｍｉＲＮＡは５００種類以上報告されているが、その多くのｍｉＲＮＡに関する機能は依然不明である。
In recent years, microRNA (miRNA) has been attracting attention as a factor that regulates functions in vivo. MiRNA is a single-stranded non-coding RNA consisting of about 22 bases, which is contained in the exosomes of secretory granules, binds to the 3'UTR portion of the target gene in distant cells, and regulates its gene expression after transcription of the target gene. It is considered. MiRNAs are known to play important roles in cell defense against differentiation, development, tumorigenesis, and infection. In addition, some miRNAs are produced and secreted from osteoblasts.
In the process of osteoblast differentiation, it is miR-29, miR-208, miR-133, miR-135, miR-138 that act on the BMP pathway, and miR-29 and miR- that act on the Wnt pathway. 335 (Non-Patent Document 1). Although miR-29 acts on both pathways, the mechanism of action is considered to be independent.
More than 500 types of miRNAs present in the genome have been reported, but the functions of many miRNAs are still unknown.
ｍｉＲ−１４０−３ｐ遺伝子に関して、その機能については具体的に報告がされていない。ｍｉＲ−１４０−３ｐを含む医薬組成物について開示する文献がある（特許文献１）。しかしながら、特許文献１は、ｍｉＲ−１４０−３ｐとオステオカルシンの関係について言及するものでなく、ｍｉＲ−１４０−３ｐを用いた実施例を開示するものでもなく、ｍｉＲ−１４０−３ｐの機能は依然として不明である。オステオカルシンを含む医薬組成物についても知られているが（特許文献２）、ｍｉＲＮＡやＴＧＦβとオステオカルシンの関連性については開示も示唆もなく、当該医薬組成物の対象疾患は糖尿病等である。
The function of the miR-140-3p gene has not been specifically reported. There is a document that discloses a pharmaceutical composition containing miR-140-3p (Patent Document 1). However,
本発明の目的は、従来とは異なる作用機序に基づく新たな骨粗鬆症治療薬を提供するために、骨粗鬆症を治療可能な新たな作用機序を解明し、その新規作用機序に基づく、オステオカルシン産生促進剤及び骨形成促進剤を提供すること、オステオカルシン産生促進剤、骨粗鬆症の治療及び／又は予防剤をスクリーニングするための新規な方法を提供すること、並びに、健康状態を把握するため、骨形成の判定をするため、及び骨粗鬆症の治療効果を判定するための新規バイオマーカーを提供することである。 An object of the present invention is to elucidate a new mechanism of action that can treat osteoporosis in order to provide a new therapeutic agent for osteoporosis based on a mechanism of action different from the conventional one, and to produce osteocalcin based on the new mechanism of action. To provide promoters and bone formation promoters, to provide new methods for screening osteocalcin production promoters, treatments and / or preventive agents for osteoporosis, and to understand the health status of bone formation. To provide a novel biomarker for making a determination and for determining the therapeutic effect of osteoporosis.
本発明者らは、ｍｉＲ−１４０−３ｐがＴＧＦβ３とＷｎｔ経路を直接結びつける働きをしていること、および、骨形成マーカーであるオステオカルシンの発現を促進させるという骨粗鬆症を治療可能な新たな作用機序を見出し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下からなる：
１．ｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む、オステオカルシン産生促進剤。２．ｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つがＴＧＦβ３の遺伝子発現を抑制するものである、前項１に記載の剤。
３．ＴＧＦβ３の遺伝子発現の抑制がＴＧＦβ３の３’ＵＴＲへの結合によるものである、前項２に記載の剤。
４．ｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つは、Ｗｎｔ３ａの過剰発現によりその発現が抑制されるものである、前項１に記載の剤。
５．前項１〜４のいずれか一項に記載の剤を含む、骨形成促進剤。
６．前項１〜４のいずれか一項に記載の剤をインビトロにおいて細胞に供給することにより、オステオカルシン産生を促進する方法。
７．オステオカルシン産生促進がＴＧＦβ３の発現の抑制によるものである、前項６に記載の方法。
８．ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進及び／又はＴＧＦβ３の発現量の抑制をマーカーとして、オステオカルシン産生促進に有効な物質をスクリーニングする方法であって、
(a)被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における各ｍｉＲ−１４０−３ｐ及び／又はＴＧＦβ３の発現量を測定する工程、及び
(c) ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を増加させる物質及び／又はＴＧＦβ３の発現量を抑制する物質を選択する工程、
を含む、方法。
９．細胞が骨芽細胞である、前項８に記載のスクリーニング方法。
１０．ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進及び／又はＴＧＦβ３の発現量の抑制をマーカーとして、骨粗鬆症の治療又は予防に有効な物質をスクリーニングする方法であって、
(a)被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における各ｍｉＲ−１４０−３ｐ及び／又はＴＧＦβ３の発現量を測定する工程、及び
(c) ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を増加させる物質及び／又はＴＧＦβ３の発現量を抑制する物質を選択する工程、
を含む、方法。
１１．ｍｉＲ−１４０−３ｐからなる、健康状態を把握するためのバイオマーカー。
１２．ｍｉＲ−１４０−３ｐからなる、骨形成を判定するためのバイオマーカー。
１３．ｍｉＲ−１４０−３ｐからなる、骨粗鬆症の治療効果を判定するためのバイオマーカー。
１４．前項１〜４のいずれか一項に記載の剤を含む、骨粗鬆症予防治療剤。
１５．前項１〜４のいずれか一項に記載の剤を含む、代謝機能改善剤。
１６．代謝機能改善が膵臓β細胞におけるインスリン産生の促進である、前項１５に記載の剤。
１７．代謝機能改善が脂肪細胞におけるインスリン感受性の促進である、前項１５に記載の剤。
１８．少なくとも前項１〜５及び１４〜１７のいずれか一項に記載の剤を含む医薬組成物であって、薬学的に許容される担体、アジュバント、塩、希釈剤及び／又は賦形剤を含む、医薬組成物。
The present inventors have a novel mechanism of action that can treat osteoporosis that miR-140-3p acts to directly link TGFβ3 and the Wnt pathway and promotes the expression of osteocalcin, which is a bone formation marker. And completed the present invention.
That is, the present invention comprises:
1. 1. An osteocalcin production promoter comprising miR-140-3p, a precursor thereof and at least one selected from the group consisting of DNA constructs encoding them as an active ingredient. 2. The agent according to
3. 3. The agent according to
4. The agent according to
5. An agent for promoting bone formation, which comprises the agent according to any one of the
6. A method for promoting osteocalcin production by supplying the agent according to any one of the
7. The method according to item 6 above, wherein the promotion of osteocalcin production is due to the suppression of TGFβ3 expression.
8. A method for screening a substance effective in promoting osteocalcin production, using the promotion of the expression level of miR-140-3p and / or the suppression of the expression level of TGFβ3 as a marker.
(a) The step of culturing cells in the presence of the test substance,
(b) A step of measuring the expression level of each miR-140-3p and / or TGFβ3 in the cells, and
(c) A step of selecting a substance that increases the expression level of miR-140-3p and / or a substance that suppresses the expression level of TGFβ3.
Including methods.
9. The screening method according to item 8 above, wherein the cells are osteoblasts.
10. A method for screening a substance effective for the treatment or prevention of osteoporosis, using the promotion of the expression level of miR-140-3p and / or the suppression of the expression level of TGFβ3 as a marker.
(a) The step of culturing cells in the presence of the test substance,
(b) A step of measuring the expression level of each miR-140-3p and / or TGFβ3 in the cells, and
(c) A step of selecting a substance that increases the expression level of miR-140-3p and / or a substance that suppresses the expression level of TGFβ3.
Including methods.
11. A biomarker consisting of miR-140-3p for grasping the health condition.
12. A biomarker consisting of miR-140-3p for determining bone formation.
13. A biomarker comprising miR-140-3p for determining the therapeutic effect of osteoporosis.
14. An osteoporosis preventive and therapeutic agent containing the agent according to any one of the
15. A metabolic function improving agent containing the agent according to any one of the
16. The agent according to item 15 above, wherein the improvement of metabolic function is the promotion of insulin production in pancreatic β cells.
17. The agent according to item 15 above, wherein the improvement of metabolic function is the promotion of insulin sensitivity in adipocytes.
18. A pharmaceutical composition comprising at least the agent according to any one of the
本発明によれば、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進及び／又はＴＧＦβ３の発現量の抑制を作用機序とする、オステオカルシン産生促進剤及び骨形成促進剤を得ることができる。 According to the present invention, it is possible to obtain an osteocalcin production-promoting agent and a bone formation-promoting agent whose mechanism of action is to promote the expression level of miR-140-3p and / or suppress the expression level of TGFβ3.
Ｗｎｔは分子量が約４万のパルミチン酸による脂質修飾を受けた分泌性糖タンパクである。Ｗｎｔの受容体としては７回膜貫通型受容体であるFrizzled、１回膜貫通型受容体であるLRP5/6の２種類が報告されている。従来、Ｗｎｔシグナルは、骨形成に対し促進的に作用すると考えられている(Rawadi, G.& Roman-Roman, S., Expert Opin TherTargets.2005Oct;9(5):1063-77)。 Wnt is a secretory glycoprotein that has undergone lipid modification with palmitic acid having a molecular weight of about 40,000. Two types of Wnt receptors have been reported: Frizzled, which is a 7-transmembrane receptor, and LRP5 / 6, which is a 1-transmembrane receptor. Traditionally, Wnt signaling has been thought to promote bone formation (Rawadi, G. & Roman-Roman, S., Expert Opin TherTargets. 2005 Oct; 9 (5): 1063-77).
骨形成性骨芽細胞は多能性間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）に由来する。Ｗｎｔ−βカテニンシグナリングは間葉系幹細胞が骨芽細胞系譜への分化に必要とされ、脂肪細胞や軟骨細胞への細胞運命を抑制する。一旦細胞運命が決定すると、骨芽細胞の前駆細胞の増殖と分化に古典的Ｗｎｔシグナルが必須となる。全ての場合ではないが、Ｗｎｔ−βカテニンシグナリングは、骨芽細胞のアポトーシスの下方制御にも関与する。また、最終分化細胞であり最も豊富にある骨細胞を包含する骨芽細胞系譜において、Ｗｎｔ−βカテニンシグナリングは、破骨細胞性骨吸収を阻害する。実際に、Ｗｎｔ−βカテニンシグナリングは、骨芽細胞および骨細胞でのＲＡＮＫＬのおとり受容体である抗破骨細胞因子ＯＰＧの発現に必要である（Roland Baron & Michaela Kneissel, NatMed. 2013 Feb;19(2):179-92）。 Osteoblastic osteoblasts are derived from pluripotent mesenchymal stem cells (MSCs). Wnt-β-catenin signaling is required for mesenchymal stem cells to differentiate into osteoblast lineages and suppresses cell fate to adipocytes and chondrocytes. Once the cell fate is determined, classical Wnt signaling is essential for the proliferation and differentiation of osteoblast progenitor cells. Wnt-β-catenin signaling, but not in all cases, is also involved in the downregulation of osteoblast apoptosis. In addition, Wnt-β-catenin signaling inhibits osteoclastic bone resorption in the osteoblast lineage, which is the final differentiated cell and contains the most abundant osteoocytes. In fact, Wnt-β-catenin signaling is required for the expression of the anti-osteoclast factor OPG, a decoy receptor for RANKL in osteoblasts and osteoocytes (Roland Baron & Michaela Kneissel, NatMed. 2013 Feb; 19). (2): 179-92).
形質転換増殖因子β（ＴＧＦβ）は、特定の組合せの標的遺伝子の発現を調節することによって、細胞増殖、細胞死、細胞分化、炎症、免疫反応を含む幅広い生物活性に関連すると考えられている。ＴＧＦβには３つのサブタイプ、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３が存在する。これら３つのサブタイプはいずれも、タイプＩとタイプＩＩのＴＧＦβ受容体に結合する。これらの受容体は、セリン／スレオニンキナーゼファミリーに属し、Ｓｍａｄファミリーの転写因子を介して標的遺伝子へのシグナル伝達系を活性化する。一般的には、ＴＧＦβファミリーに属する増殖因子の機能は細胞の状態と細胞のタイプによりさまざまであると考えられている。 Transforming growth factor β (TGFβ) is thought to be associated with a wide range of biological activities, including cell proliferation, cell death, cell differentiation, inflammation, and immune response, by regulating the expression of specific combinations of target genes. There are three subtypes of TGFβ, TGFβ1, TGFβ2 and TGFβ3. All three subtypes bind to type I and type II TGFβ receptors. These receptors belong to the serine / threonine kinase family and activate signal transduction systems to target genes via transcription factors of the Smad family. It is generally believed that the functions of growth factors belonging to the TGFβ family vary depending on the state of the cell and the type of cell.
オステオカルシン（ＯＣＮ）はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）とともに骨形成マーカーとして使用されている。これらのマーカーは、骨芽細胞由来のタンパク質であり、骨芽細胞が増殖したときに濃度が上昇する。特に、オステオカルシンは骨芽細胞から特異的に産生されるタンパク質であり、生体において血清オステオカルシン値の上昇が骨形成の指標とされている。また、これらのマーカーは、通常、骨粗鬆症の骨代謝疾患における骨代謝マーカーとしても用いられている。 Osteocalcin (OCN) is used as a bone formation marker along with alkaline phosphatase (ALP). These markers are osteoblast-derived proteins that increase in concentration as osteoblasts proliferate. In particular, osteocalcin is a protein specifically produced from osteoblasts, and an increase in serum osteocalcin level in a living body is regarded as an index of bone formation. In addition, these markers are also usually used as bone metabolism markers in osteoporosis bone metabolism diseases.
本明細書中で使用する用語は、以下の定義を有する。 The terms used herein have the following definitions:
本明細書において、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの略号による表示は、三極特許庁共通のガイドラインである「塩基配列又はアミノ酸配列を含む明細書等の作成のためのガイドライン」（日本国特許庁編）及び当技術分野における慣用に従うものとする。 In this specification, the abbreviations of nucleotides, polynucleotides, DNA, RNA, etc. are referred to as "Guidelines for preparing specifications including base sequences or amino acid sequences" (Japan), which is a guideline common to the Trilateral Offices. (Edited by the Japan Patent Office) and the conventions in this technical field shall be followed.
本明細書において「核酸」には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、それらの修飾ポリヌクレオチドのいずれも包含するものとして用いられる。なお、上記ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡのいずれもが含まれる。また上記ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、及び合成ＲＮＡのいずれもが含まれる。また上記修飾ポリヌクレオチドには、核酸の天然の糖部分、塩基部分又はホスホジエステル結合を非天然構造に変換したポリヌクレオチドが含まれ、例えばＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）、ホスホロチオエート結合を有するポリヌクレオチド、２'−Ｏ−アルキルリボース基を有する人工的ポリヌクレオチドなどが含まれる。また、本明細書では、核酸はポリヌクレオチドと互換的に使用される。 As used herein, the term "nucleic acid" is used to include RNA, DNA, and modified polynucleotides thereof. The DNA includes any of cDNA, genomic DNA, and synthetic DNA. Further, the RNA includes any of total RNA, mRNA, rRNA, miRNA, siRNA, snoRNA, snRNA, shRNA, non-coding RNA, pri-miRNA, pre-miRNA, and synthetic RNA. Further, the modified polynucleotide includes a polynucleotide obtained by converting a natural sugar portion, base portion or phosphodiester bond of a nucleic acid into an unnatural structure, for example, LNA (Locked Nucleic Acid), PNA (Peptide Nucleic Acid), phosphorothioate. Polynucleotides having a bond, artificial polynucleotides having a 2'-O-alkylribose group, and the like are included. Also, herein, nucleic acids are used interchangeably with polynucleotides.
本明細書において「遺伝子」とは、ＲＮＡ、及び２本鎖ＤＮＡのみならず、それを構成する正鎖（又はセンス鎖）又は相補鎖（又はアンチセンス鎖）などの各１本鎖ＤＮＡを包含することを意図して用いられる。またその長さによって特に制限されるものではない。 As used herein, the term "gene" includes not only RNA and double-stranded DNA, but also single-stranded DNA such as the positive strand (or sense strand) or complementary strand (or antisense strand) that compose it. It is used with the intention of doing so. Moreover, the length is not particularly limited.
本明細書において「遺伝子」は、特に言及しない限り、ヒトゲノムＤＮＡを含む２本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む１本鎖ＤＮＡ（正鎖）、該正鎖と相補的な配列を有する１本鎖ＤＮＡ（相補鎖）、及びこれらの断片、及びヒトゲノムのいずれも含む。また該「遺伝子」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「遺伝子」だけではなく、これらによってコードされるＲＮＡと生物学的機能が同等であるＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「遺伝子」が包含される。かかる同族体、変異体又は誘導体をコードする「遺伝子」としては、具体的には、ストリンジェントな条件下（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ＴＨＩＲＤ ＥＤＩＴＩＯＮ（Sambrookら、ColdSpring Harbor LaboratoryPress）に記載の条件が挙げられる。）で、配列番号１又は２に示されるいずれかの特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「遺伝子」を挙げることができる。なお、「遺伝子」は、機能領域の別を問うものではなく、例えば発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンを含むことができる。また、「遺伝子」は細胞に含まれていてもよく、細胞外に放出されて単独で存在していてもよく、またエキソソームと呼ばれる脂質二重膜に包まれた小胞に内包された状態にあってもよい。 Unless otherwise specified, the term "gene" as used herein refers to double-stranded DNA containing human genomic DNA, single-stranded DNA containing cDNA (positive strand), and single-stranded DNA having a sequence complementary to the positive strand (single-stranded DNA). Complementary strands), and fragments thereof, and any of the human genomes. Further, the "gene" is not only a "gene" represented by a specific base sequence (or SEQ ID NO:), but also an RNA having a biological function equivalent to that of RNA encoded by these, for example, a homologue (that is, homologue). , Mutants such as gene polymorphisms, and "genes" encoding derivatives are included. Specific examples of the "gene" encoding such a homologue, mutant, or derivative include the conditions described in molecular cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press). In (), a "gene" having a base sequence that hybridizes with the complementary sequence of any specific base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 2 can be mentioned. The "gene" does not ask whether the functional region is different, and may include, for example, an expression control region, a coding region, an exon, or an intron. In addition, the "gene" may be contained in a cell, may be released extracellularly and exist alone, or may be contained in a vesicle surrounded by a lipid bilayer called an exosome. There may be.
本明細書において「転写産物」とは、遺伝子のＤＮＡ配列を鋳型にして合成されたＲＮＡのことをいう。ＲＮＡポリメラーゼが遺伝子の上流にあるプロモーターと呼ばれる部位に結合し、ＤＮＡの塩基配列に相補的になるように３’末端にリボヌクレオチドを結合させていく形でＲＮＡが合成される。このＲＮＡには遺伝子そのもののみならず、発現制御領域、コード領域、エキソン又はイントロンをはじめとする転写開始点からポリＡ配列の末端にいたるまでの全配列が含まれる。 As used herein, the term "transcript" refers to RNA synthesized using the DNA sequence of a gene as a template. RNA is synthesized in such a way that RNA polymerase binds to a site called a promoter upstream of a gene and ribonucleotides are bound to the 3'end so as to be complementary to the base sequence of DNA. This RNA includes not only the gene itself, but also the entire sequence from the transcription start site to the end of the poly A sequence, including the expression control region, coding region, exon or intron.
本明細書において「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は、特に言及しない限り、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５〜２５塩基のＲＮＡを意図して用いられる。また該「ｍｉＲＮＡ」は特定の塩基配列（又は配列番号）で示される「ｍｉＲＮＡ」だけではなく、該「ｍｉＲＮＡ」の前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）を含有し、これらによってコードされるｍｉＲＮＡと生物学的機能が同等であるｍｉＲＮＡ、例えば同族体（すなわち、ホモログ）、遺伝子多型などの変異体、及び誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」も包含する。かかる前駆体、同族体、変異体又は誘導体をコードする「ｍｉＲＮＡ」としては、ｍｉＲＢａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ.ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）により同定することができ、ストリンジェントな条件下で、特定塩基配列の相補配列とハイブリダイズする塩基配列を有する「ｍｉＲＮＡ」を挙げることができる。 Unless otherwise stated, "microRNA (miRNA)" herein is transcribed as an RNA precursor with a hairpin-like structure, cleaved by dsRNA cleaving enzyme with RNase III cleaving activity, and incorporated into a protein complex called RISC. It is intended to use 15-25 bases of RNA that are involved in the suppression of mRNA translation. Further, the "miRNA" contains not only the "miRNA" represented by a specific base sequence (or SEQ ID NO:) but also the precursors (pre-miRNA, tri-miRNA) of the "miRNA", and is encoded by these. Also included are miRNAs that are biologically equivalent to miRNAs, such as "miRNAs" that encode homologues (ie, homologues), variants such as gene polymorphisms, and derivatives. The "miRNA" encoding such a precursor, homologue, mutant or derivative can be identified by miRBase (http://www.mirbase.org/) and has a specific base sequence under stringent conditions. Can be mentioned as "miRNA" having a base sequence that hybridizes with the complementary sequence of.
本明細書において「変異体」とは、核酸の場合、多型性、突然変異、転写時の選択的スプライシングなどに起因した天然の変異体、又は配列番号１〜２で示される塩基配列若しくはその相補的塩基配列において１又は２個のヌクレオチドの欠失、置換、付加又は挿入、好ましくは置換、を含む変異体、或いは該塩基配列又はその部分配列と約９０％以上、約９５％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上の％同一性を示す変異体、或いは該塩基配列又はその部分配列を含むポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズする核酸を意味する。 As used herein, the term "variant" means, in the case of a nucleic acid, a natural variant due to polymorphism, mutation, selective splicing during transcription, etc., or the nucleotide sequence shown by SEQ ID NOs: 1 and 2 or a nucleotide sequence thereof. A mutant containing a deletion, substitution, addition or insertion, preferably substitution of one or two nucleotides in a complementary base sequence, or about 90% or more, about 95% or more, about with the base sequence or a partial sequence thereof. It means a mutant showing 97% or more, about 98% or more, about 99% or more% identity, or a nucleic acid that hybridizes with a polynucleotide or an oligonucleotide containing the base sequence or a partial sequence thereof under stringent conditions. ..
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１４０−３ｐ」という用語は、配列番号１に示されるＲＮＡ配列「UACCACAGGGUAGAACCACGG」からなるｍｉＲＮＡ（ｍｉＲｂａｓｅ ＩＤ：hsa-miR-140-3p、ｍｉＲｂａｓｅ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．MIMAT0004597）やその他生物種ホモログなどが包含される。本明細書において、「ｍｉＲ−１４０−３ｐ」は、配列番号１に示されるＲＮＡ配列からなるＲＮＡ又はその他生物種ホモログ（例えば、マウスホモログであるｍｉＲｂａｓｅ ＩＤ：mmu-miR-140-3p、ｍｉＲｂａｓｅ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．MIMAT0000152が挙げられる）であればよく、配列番号１に示されるＲＮＡ配列をコードするＤＮＡから発現されるＲＮＡや、次に説明する配列番号２に示されるＲＮＡ配列をコードするＤＮＡから発現された後、プロセシングを受けたものであってもよい。 As used herein, the term "miR-140-3p" refers to miRNA (miRbase ID: hsa-miR-140-3p, miRbase Accession No. MIMAT0004597) consisting of the RNA sequence "UACCACAGGGUAGAACCACGG" shown in SEQ ID NO: 1. Other species such as homologs are included. In the present specification, "miR-140-3p" refers to RNA consisting of the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or other biological homologues (for example, miRbase ID: mmu-miR-140-3p, miRbase Accession No. which are mouse homologues). MIMAT0000152) may be used, and it may be expressed from RNA encoding the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 1 or from DNA encoding the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 described below. Later, it may have been processed.
本明細書で使用される「ｍｉＲ−１４０」または「ｍｉＲ−１４０−３ｐの前駆体」という用語は、配列番号２に示されるＲＮＡ配列「UGUGUCUCUCUCUGUGUCCUGCCAGUGGUUUUACCCUAUGGUAGGUUACGUCAUGCUGUUCUACCACAGGGUAGAACCACGGACAGGAUACCGGGGCACC」からなるＲＮＡ（ｍｉＲｂａｓｅ ＩＤ：hsa-miR-140、ｍｉＲｂａｓｅ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．MI0000456）やその他生物種ホモログ（例えば、マウスホモログであるｍｉＲｂａｓｅ ＩＤ：mmu-mir-140、ｍｉＲｂａｓｅ ＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．MI0000165が挙げられる）が包含される。本明細書において、「ｍｉＲ−１４０」は「ｍｉＲ−１４０−３ｐの前駆体」をいい、ｍｉＲ−１４０−３ｐのＲＮＡ配列を包含するものである。 As used herein, the term "miR-140" or "precursor of miR-140-3p" consists of the RNA sequence "UGUGUCUCUCUCUGUGUCCUGCCAGUGGUUUUCCUAUGGUAGGUUACGUCAUGCUGUUCUACCACAGGGUAGAACCACGGACAGGAUACCGGGGCACC" shown in SEQ ID NO: 2. , MiRbase Accession No. MI0000456) and other species homologues (eg, miRbase ID: mmu-mir-140, miRbase Accession No. MI0000165, which are mouse homologues) are included. As used herein, "miR-140" refers to "a precursor of miR-140-3p" and includes the RNA sequence of miR-140-3p.
ＲＮＡ分子が単一ポリヌクレオチドである場合、ｍｉＲＮＡ領域と相補領域との間にリンカー領域がある。いくつかの態様において、単一ポリヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ領域と相補領域との間の結合の結果としてヘアピンループ構造を形成することが可能である。リンカーは、ヘアピンループを構成する。いくつかの態様において、リンカー領域は、長さが少なくとももしくは多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、もしくは40残基、またはそこに導き出せる任意の範囲であることが意図される。特定の態様において、リンカーは、長さが3〜30残基（両端の数値を含む）である。 When the RNA molecule is a single polynucleotide, there is a linker region between the miRNA region and the complementary region. In some embodiments, the single polynucleotide is capable of forming a hairpin loop structure as a result of binding between the miRNA region and the complementary region. The linker constitutes the hairpin loop. In some embodiments, the linker region is at least or at most 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 in length. , 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, or 40 residues, or there It is intended to be any range that can be derived from. In certain embodiments, the linker is 3 to 30 residues in length (including the numbers at both ends).
ｍｉＲＮＡ領域および相補領域を有することに加えて、領域の5'または3'末端のいずれかにさらにフランキング配列があり得る。いくつかの態様においては、これらの領域の片側または両側に隣接する、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10ヌクレオチドもしくはそれより多く、またはそこに導き出せる任意の範囲が存在する。 In addition to having miRNA and complementary regions, there can be additional flanking sequences at either the 5'or 3'end of the region. In some embodiments, at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 nucleotides or more, or any deriving there, adjacent to one or both sides of these regions. There is a range.
本発明の一態様において、オステオカルシン産生促進剤又は骨形成促進剤は、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐの前駆体、およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む剤であってもよい。ｍｉＲ−１４０−３ｐは、配列番号１に示されるＲＮＡ配列からなるＲＮＡ又はその他生物種ホモログである。ｍｉＲ−１４０−３ｐの前駆体はｍｉＲ−１４０−３ｐのＲＮＡ配列を含むものであり、配列番号２に示されるＲＮＡ配列からなるＲＮＡ又はその他生物種ホモログである。前記ＤＮＡ構築物はｍｉＲ−１４０を発現するＤＮＡ配列を含むものであればよい。前記ＤＮＡ構築物の例としては、ｍｉＲ−１４０−３ｐを発現するベクターが挙げられる。 In one aspect of the invention, the osteocalcin production promoter or bone formation promoter is at least one selected from the group consisting of miR-140-3p, miR-140-3p precursors, and DNA constructs encoding them. May be an agent containing as an active ingredient. miR-140-3p is an RNA or other species homolog consisting of the RNA sequence set forth in SEQ ID NO: 1. The precursor of miR-140-3p comprises the RNA sequence of miR-140-3p and is an RNA consisting of the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a homologue of other species. The DNA construct may include a DNA sequence expressing miR-140. Examples of the DNA construct include a vector expressing miR-140-3p.
本発明の一態様において、オステオカルシン産生促進剤はＴＧＦβ３の遺伝子発現を抑制することに基づく。ここで、「遺伝子発現を抑制する」とは、遺伝子発現をｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで抑制することを意味する。たとえば、遺伝子発現の対象となる遺伝子が発現した後にｍＲＮＡが分解されることでｍＲＮＡレベルが抑制されるものであってもよい。本発明の一態様において、ＴＧＦβ３の発現の抑制は、ｍｉＲ−１４０−３ｐがＴＧＦβ３の３’ＵＴＲに結合することによって生じるものであってもよい。 In one aspect of the invention, the osteocalcin production promoter is based on suppressing the gene expression of TGFβ3. Here, "suppressing gene expression" means suppressing gene expression at the mRNA level or the protein level. For example, the mRNA level may be suppressed by degrading the mRNA after the gene to be expressed by the gene is expressed. In one aspect of the invention, suppression of TGFβ3 expression may result from miR-140-3p binding to the 3'UTR of TGFβ3.
本発明の一態様において、ＴＧＦβ３の３’ＵＴＲは、ＴＧＦβ３ ｍＲＮＡのコーディング領域の３’側に位置するタンパク質に翻訳されない非翻訳領域であれば特に限定されない。ＴＧＦβ３の３’ＵＴＲは、「ＧＣＵＵＵＧＡＧＡＡＵＣＡＣＵＧＵＧＧＵＡ」からなるＲＮＡ配列及び「ＡＣＡＵＧＧＡＡＵＵＵＣＵＧＵＧＧＵＧ」からなるＲＮＡ配列を含むものが好ましい。 In one aspect of the present invention, the 3'UTR of TGFβ3 is not particularly limited as long as it is an untranslated region that is not translated into a protein located on the 3'side of the coding region of TGFβ3 mRNA. The 3'UTR of TGFβ3 preferably contains an RNA sequence consisting of "GCUUGAGAAUCACUGUGGUA" and an RNA sequence consisting of "ACAUGGAAAUUCUGUGGUG".
本発明の一態様において、ｍｉＲ−１４０−３ｐは、Ｗｎｔ３ａの過剰発現によりその発現が抑制される。 In one aspect of the present invention, miR-140-3p is suppressed by overexpression of Wnt3a.
本発明の一態様において、オステオカルシン産生を促進する方法は、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１４０−３ｐの前駆体、およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む剤を、細胞に供給することにより行われる。好ましくは、当該供給は細胞に導入することにより行われる。細胞に供給することはインビトロで行われてもよい。好ましくは、該細胞は骨芽細胞である。また、オステオカルシン産生の促進はＴＧＦβ３の発現が抑制されることにより生じるものであってもよい。 In one aspect of the invention, the method of promoting osteocalcin production comprises at least one selected from the group consisting of miR-140-3p, miR-140-3p precursors, and DNA constructs encoding them as active ingredients. This is done by supplying the cell with an agent containing as. Preferably, the supply is done by introducing into cells. Feeding the cells may be done in vitro. Preferably, the cell is an osteoblast. In addition, promotion of osteocalcin production may be caused by suppression of TGFβ3 expression.
本発明の一態様において、オステオカルシンの産生を促進する対象となる細胞としては、オステオカルシンを産生する細胞ならどのような細胞でもよく、例えば、骨芽細胞、骨芽細胞の前駆細胞を挙げることができる。骨芽細胞の前駆細胞としては、骨髄間質細胞やそれ由来の細胞株を例示することができる。 In one aspect of the present invention, the cell to be targeted for promoting the production of osteocalcin may be any cell that produces osteocalcin, and examples thereof include osteoblasts and precursor cells of osteoblasts. .. Examples of osteoblast progenitor cells include bone marrow stromal cells and cell lines derived from them.
骨芽細胞分化の程度は、例えば細胞中のアルカリホスファターゼ活性を測定することにより、評価することができる。骨芽細胞分化の程度の評価方法については、例えば、J. Biol. Chem. 2006, 281(26), 18015-24等を参照することができる。 The degree of osteoblast differentiation can be assessed, for example, by measuring the intracellular alkaline phosphatase activity. For the method of evaluating the degree of osteoblast differentiation, for example, J. Biol. Chem. 2006, 281 (26), 18015-24 and the like can be referred to.
本発明の一態様において、オステオカルシンの産生を促進する対象となる細胞として組換え細胞を挙げることができる。当該組換え細胞は、例えば、ｍｉＲ−１４０−３ｐを発現するベクターを培養骨芽細胞等（以下に説明する、マウス骨芽細胞前駆細胞、ラット大腿骨・頸骨骨髄由来間葉系幹細胞、ヒトの骨髄単核球）に導入することにより調製できる。 In one aspect of the present invention, recombinant cells can be mentioned as target cells for promoting the production of osteocalcin. The recombinant cell is, for example, a vector expressing miR-140-3p, such as cultured osteoblast cells (mouse osteoblast progenitor cells, rat femoral / cervical bone marrow-derived mesenchymal stem cells, human bone marrow-derived stem cells, which will be described below). It can be prepared by introducing it into bone marrow mononuclear cells).
マウス骨芽細胞前駆細胞は、胎生１８．５日のマウス胎仔あるいは、新生仔の頭蓋冠を切り取り、はさみで細かい断片にした後、コラーゲンゲル(cell matrix type I-A)を加え、ゲルが固まった後、αＭＥＭを加え１０〜１４日間培養する。その後、０．２％コラゲナーゼで処理、遠心して細胞を集め、αＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含）で細胞を再懸濁し、培養プレートに細胞を播種し培養することによって調製することができる。 For mouse osteoblast progenitor cells, cut the cranial crown of a 18.5 day embryonic mouse fetus or newborn, cut it into small pieces with scissors, add collagen gel (cell matrix type IA), and then after the gel has hardened. , ΑMEM is added and cultured for 10 to 14 days. Then, the cells are treated with 0.2% collagenase, centrifuged to collect the cells, the cells are resuspended in αMEM (containing 10% FBS), and the cells are seeded and cultured on a culture plate.
ラット大腿骨・頸骨骨髄由来間葉系幹細胞は、大腿骨・頸骨を取り出した後、培養液で骨髄をフラッシュアウト、ピペッティング後遠心、上澄みを破棄し、αＭＥＭ（１０％ＦＢＳ含）で細胞を再懸濁し、ラミニンでコートした培養プレートに細胞を播種し培養し、播種後９日目にｂＦＧＦを最終濃度３ｎｇ／ｍｌ加えて培養することにより調製することができる。 For rat femoral / cervical bone marrow-derived mesenchymal stem cells, after removing the femoral bone / cervical bone, flush out the bone marrow with a culture medium, centrifuge after pipetting, discard the supernatant, and use αMEM (including 10% FBS) to remove the cells. It can be prepared by resuspending, seeding and culturing cells on a culture plate coated with laminin, and culturing by adding bFGF at a final concentration of 3 ng / ml on the 9th day after seeding.
ヒトの骨髄単核球画分は、例えば、ＡＬＬＣＥＬＬＳ社又はＬＯＮＺＡ社から入手することができる。 Human bone marrow mononuclear cell fractions can be obtained, for example, from ALLCELLS or LONZA.
本発明の一態様において、核酸は、リン酸カルシウムトランスフェクション、脂質トランスフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクション、またはインジェクションによって細胞に導入される。加えて、細胞は、患者または動物モデルであり得る被験体におけるものであってもよい。この場合において、核酸は、特に治療的適用に対する、当業者にとって周知である投与の様式を使用して、被験体または患者に投与され得る。患者が、ヒトまたは任意のその他の哺乳動物またはｍｉＲＮＡを有する動物であることが特に意図される。 In one aspect of the invention, the nucleic acid is introduced into cells by calcium phosphate transfection, lipid transfection, electroporation, microinjection, or injection. In addition, the cells may be in a subject that can be a patient or animal model. In this case, the nucleic acid can be administered to the subject or patient using a mode of administration well known to those of skill in the art, especially for therapeutic applications. It is specifically intended that the patient is a human or any other mammal or animal with miRNA.
本発明の一態様において、望ましい生理学的結果を達成するのに有効な量で、細胞におけるｍｉＲ−１４０−３ｐの発現に影響を与える被験物質を細胞に導入する段階を含む。本発明の一態様において、細胞におけるｍｉＲ−１４０−３ｐの発現のレベルにおける上昇または低下は、正常細胞におけるそのｍｉＲ−１４０−３ｐの発現レベルと比較して、疾患状態と相関がある。ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現レベルが、査定される生物学的試料において測定され、次いで正常細胞の発現レベルと比較される場合に、この相関によって以下のスクリーニング方法や診断方法の実施が可能になる。 In one aspect of the invention, it comprises introducing into the cell a test substance that affects the expression of miR-140-3p in the cell in an amount effective to achieve the desired physiological result. In one aspect of the invention, an increase or decrease in the level of expression of miR-140-3p in cells correlates with the disease state as compared to the level of expression of miR-140-3p in normal cells. This correlation allows the following screening and diagnostic methods to be performed when the expression level of miR-140-3p is measured in the assessed biological sample and then compared to the expression level of normal cells. ..
本発明の一態様において、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進をマーカーとして、オステオカルシン産生促進に有効な物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、以下の工程：
(a) 被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞における各ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を測定する工程、及び
(c) ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を増加させる物質を選択する工程、を含む方法でスクリーニングすることができる。
In one aspect of the present invention, a substance effective in promoting osteocalcin production can be screened using the promotion of the expression level of miR-140-3p as a marker. More specifically, the following steps:
(a) The step of culturing cells in the presence of the test substance,
(b) A step of measuring the expression level of each miR-140-3p in the cells, and
(c) Screening can be performed by a method including the step of selecting a substance that increases the expression level of miR-140-3p.
本発明の一態様において、ＴＧＦβ３の発現量の抑制をマーカーとして、オステオカルシン産生促進に有効な物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、以下の工程：
(a) 被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞におけるＴＧＦβ３の発現量を測定する工程、及び
(c)ＴＧＦβ３の発現量を減少させる物質を選択する工程、を含む方法でスクリーニングすることができる。
In one aspect of the present invention, a substance effective in promoting osteocalcin production can be screened using the suppression of the expression level of TGFβ3 as a marker. More specifically, the following steps:
(a) The step of culturing cells in the presence of the test substance,
(b) A step of measuring the expression level of TGFβ3 in the cells, and
Screening can be performed by a method including (c) a step of selecting a substance that reduces the expression level of TGFβ3.
本発明の一態様において、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量の促進及び／又はＴＧＦβ３の発現量の抑制をマーカーとして、骨粗鬆症の治療又は予防に有効な物質をスクリーニングすることができる。より具体的には、以下の工程：
(a) 被検物質の存在下に細胞を培養する工程、
(b)該細胞におけるｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量及び／又はＴＧＦβ３の発現量を測定する工程、及び
(c) ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を増加させる物質及び／又はＴＧＦβ３の発現量を減少させる物質を選択する工程、を含む方法でスクリーニングすることができる。
In one aspect of the present invention, a substance effective for the treatment or prevention of osteoporosis can be screened using the promotion of the expression level of miR-140-3p and / or the suppression of the expression level of TGFβ3 as markers. More specifically, the following steps:
(a) The step of culturing cells in the presence of the test substance,
(b) A step of measuring the expression level of miR-140-3p and / or the expression level of TGFβ3 in the cells, and
(c) Screening can be performed by a method including a step of selecting a substance that increases the expression level of miR-140-3p and / or a substance that decreases the expression level of TGFβ3.
本発明の一態様において、本発明のスクリーニング方法において、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量は当業者に公知の任意の方法で測定することが出来る。例えば、ｍｉＲ−１４０−３ｐに特異的にハイブリダイズするプライマー又はプローブを用いてｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を測定することが出来る。このようなプライマー又はプローブは、当業者であれば、データベースの情報等を参考にして、ｍｉＲ−１４０−３ｐの塩基配列に基づき適宜設計することが可能である。 In one aspect of the present invention, in the screening method of the present invention, the expression level of miR-140-3p can be measured by any method known to those skilled in the art. For example, the expression level of miR-140-3p can be measured using a primer or probe that specifically hybridizes to miR-140-3p. Such a primer or probe can be appropriately designed by a person skilled in the art based on the base sequence of miR-140-3p with reference to the information in the database and the like.
このようなプライマー又はプローブを用いる測定方法としては、ノーザンブロット法が古典的方法である。ｍｉＲＮＡマイクロアレイ（Liu et al, 2004; Lim et al, 2005）、改良型インベーダー法（Allawi et al, 2004）、ビーズを基にしたフローサイトメータ法（Luetal,2005）などの報告がある。また、定量性のある方法としてリアルタイムPCRがある（Chen et al, 2005）。 Northern blotting is a classical method as a measurement method using such a primer or probe. There are reports of miRNA microarrays (Liu et al, 2004; Lim et al, 2005), improved invader methods (Allawi et al, 2004), and bead-based flow cytometer methods (Luetal, 2005). In addition, there is real-time PCR as a quantitative method (Chen et al, 2005).
ｍｉＲＮＡマイクロアレイは成熟ｍｉＲＮＡの定量することができる方法であり、一般的に用いられている方法を用いればよい。例えば、次のＵＲＬ（https://www.m-chemical.co.jp/genome/products/micro_rna.html）のマイクロＲＮＡチップを利用することができる。 The miRNA microarray is a method capable of quantifying mature miRNA, and a commonly used method may be used. For example, a microRNA chip at the following URL (https://www.m-chemical.co.jp/genome/products/micro_rna.html) can be used.
プライマー又はプローブの塩基配列は、鋳型との特異的な結合が可能となるような適当な塩基数、例えば、数十ｂｐ、１０〜３０ｂｐ程度を有することが好ましい。また、塩基配列は、ｍｉＲＮＡマイクロアレイプローブデザインにおいてプライマー内でヘアピン構造をとってもよい。例えば、Ｏｌｉｇｏ（商標） (National Bioscience Inc.)のような市販のプライマー設計用のソフトウェアを使用することも可能である。 The base sequence of the primer or probe preferably has an appropriate number of bases that enables specific binding with the template, for example, about several tens of bp and 10 to 30 bp. In addition, the base sequence may have a hairpin structure within the primer in the miRNA microarray probe design. For example, commercially available primer design software such as Oligo ™ (National Bioscience Inc.) can also be used.
本発明の一態様において、本発明の剤は、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含む。 In one aspect of the invention, the agent of the invention comprises at least one selected from the group consisting of miR-140-3p, a precursor thereof and a DNA construct encoding them as an active ingredient.
本発明の一態様において、本発明の剤は、オステオカルシン産生促進剤、骨形成促進剤、骨芽細胞分化の促進剤、又は骨粗鬆症の予防治療剤として有用である。骨粗鬆症としては、原発性骨粗鬆症（退行期骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症）、特発性骨粗鬆症）、続発性骨粗鬆症（薬剤性、関節リウマチ、糖尿病、甲状腺機能亢進症、性機能異常、不動性、栄養性、先天性疾患）等が挙げられるが、これらに限定されない。 In one aspect of the present invention, the agent of the present invention is useful as an osteocalcin production promoter, a bone formation promoter, an osteoblast differentiation promoter, or a preventive and therapeutic agent for osteoporosis. Osteoporosis includes primary osteoporosis (degenerative osteoporosis (postmenopausal osteoporosis, senile osteoporosis), idiopathic osteoporosis), secondary osteoporosis (drug-induced, rheumatoid arthritis, diabetes, hyperthyroidism, sexual dysfunction, immobility, etc.) (Nutrition, congenital diseases), etc., but are not limited to these.
本発明の剤の投与対象は、通常哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、カニクイザル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジーなどの霊長類等を挙げることが出来るが、これらに限定されるものではない。哺乳動物は、好ましくは霊長類（ヒト等）又はげっ歯類（マウス等）である。 The subject of administration of the agent of the present invention is usually a mammal. Mammals include, for example, rodents such as mice, rats, hamsters and guinea pigs, experimental animals such as rabbits, domestic animals such as pigs, cows, goats, horses, sheep and minks, pets such as dogs and cats, and humans. Primates such as monkeys, crab monkeys, red-tailed monkeys, guinea pigs, oran wootans, and chimpanzees can be mentioned, but are not limited thereto. Mammals are preferably primates (such as humans) or rodents (such as mice).
本発明の剤の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状及び投与経路等に応じて適宜決定されるべきであり、以下に限定されないが、例えば成人一日あたり約０．１μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲内であり、好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。製剤の投与は、治療中毎日投与してもよいし、４週間連日投与してもよく、数日間隔、２週間間隔又は１ヶ月間隔等時間間隔をとって投与してもよい。 The dose of the agent of the present invention should be appropriately determined according to the age, sex, body weight, symptoms, administration route, etc. of the patient, and is not limited to the following, but is, for example, about 0.1 μg / kg per adult day. It is in the range of ~ 100 mg / kg, preferably in the range of about 1 μg / kg to 10 mg / kg. The pharmaceutical product may be administered daily during the treatment, every day for 4 weeks, or at intervals of several days, 2 weeks, or 1 month at equal time intervals.
オステオカルシンは膵臓からのインスリン分泌促進や脂肪組織におけるインスリン感受性を促進することが知られており、ｍｉＲ−１４０−３ｐの投与は全身に好ましい影響を与えうる（図１５）。このことより、ｍｉＲ−１４０−３ｐは単なる骨形成促進剤や骨粗鬆症予防治療剤としてだけでなく、生体内の代謝系全体を改善する代謝機能改善剤又は予防剤として有用であり、健康寿命延伸に寄与すると考えられる。 Osteocalcin is known to promote insulin secretion from the pancreas and insulin sensitivity in adipose tissue, and administration of miR-140-3p may have a positive effect on the whole body (Fig. 15). From this, miR-140-3p is useful not only as a mere bone formation promoting agent and an osteoporosis preventive and therapeutic agent, but also as a metabolic function improving agent or a preventive agent for improving the entire metabolic system in the living body, and is useful for extending healthy life expectancy. It is thought to contribute.
本発明の一態様において、ｍｉＲ−１４０−３ｐをマーカーとする診断手段を提供する。例えば、体内のｍｉＲ−１４０−３ｐを測定することにより、健康状態を把握しうるバイオマーカーとして有用と考えられる。体内のｍｉＲ−１４０−３ｐの測定は、測定対象から得られた試料を使用することができる。本明細書において対象から得られた試料は、本発明のｍｉＲ−１４０−３ｐが発現変化する生体組織及びそれら生体組織由来の物質、生体組織と接触する物質を指し、例えば血液試料が挙げられる。試料からトータルＲＮＡを抽出し、その中から目的のｍｉＲ−１４０−３ｐを測定する方法は上述のとおり当業者に公知の任意の方法で測定することが出来る。また、ｍｉＲ−１４０−３ｐをバイオマーカーとして使用する場合、オステオカルシンをバイオマーカーとして測定するよりも早期に、骨形成や骨粗鬆症の治療の効果が判定でき有用と考えられる。 In one aspect of the present invention, a diagnostic means using miR-140-3p as a marker is provided. For example, by measuring miR-140-3p in the body, it is considered to be useful as a biomarker capable of grasping the health condition. For the measurement of miR-140-3p in the body, a sample obtained from the measurement target can be used. In the present specification, the sample obtained from the subject refers to a biological tissue in which the expression of miR-140-3p of the present invention changes, a substance derived from the biological tissue, and a substance in contact with the biological tissue, and examples thereof include a blood sample. The method of extracting total RNA from a sample and measuring the target miR-140-3p from the sample can be measured by any method known to those skilled in the art as described above. In addition, when miR-140-3p is used as a biomarker, it is considered useful because the effect of treatment for bone formation and osteoporosis can be determined earlier than the measurement of osteocalcin as a biomarker.
本発明の一態様において、ｍｉＲ−１４０−３ｐを発現するベクターは、本発明の医薬組成物の有効成分であるｍｉＲ−１４０−３ｐの製造のために使用、又は、ベクター自体を製剤化して医薬組成物として使用することができる。 In one aspect of the present invention, the vector expressing miR-140-3p is used for the production of miR-140-3p, which is the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention, or the vector itself is formulated to form a pharmaceutical. It can be used as a composition.
ベクターは、例えばプラスミド、ファージ、ウイルス等を含む。プラスミドの例は、非限定的に、大腸菌由来プラスミド(例えばpRSET、pTZ19R、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119等)、枯草菌由来プラスミド(例えばpUB110、pTP5等)、酵母由来プラスミド(例えばYEp13、YEp24、YCp50等)、Tiプラスミド等が挙げられ、ファージの例はλファージ等が挙げられ、さらに、ウイルスベクターの例は、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス等の動物ウイルスベクター、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクター等が挙げられる。 Vectors include, for example, plasmids, phages, viruses and the like. Examples of plasmids include, but are not limited to, E. coli-derived plasmids (eg, pRSET, pTZ19R, pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, etc.), bacteriophage-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, etc.), yeast-derived plasmids (eg, YEp13, YEp24, etc.). YCp50 etc.), Ti plasmid, etc., examples of phages include λ phages, etc. Further, examples of virus vectors include animal virus vectors such as retrovirus, vaccinia virus, lentivirus, adenovirus, adeno-associated virus, etc. , Insect virus vectors such as bacteriophage.
ベクターは、目的ＤＮＡを組み込むためのポリリンカーもしくはマルチクローニングサイトを含んでもよく、また、ｍｉＲ−１４０−３ｐ遺伝子をコードするＤＮＡを発現するためにいくつかの制御エレメントを含むことができる。制御エレメントには、例えばプロモーター、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、複製開始点、選択マーカー、リボソーム結合配列、ターミネーター等が含まれる。 The vector may include a polylinker or multicloning site for incorporating the DNA of interest, and may also include several regulatory elements to express the DNA encoding the miR-140-3p gene. Control elements include, for example, promoters, enhancers, poly-A addition signals, replication origins, selectable markers, ribosome binding sequences, terminators and the like.
選択マーカーの例は、薬剤耐性遺伝子（例えばネオマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等）、栄養要求性相補遺伝子（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子、HIS3遺伝子、LEU2遺伝子、URA3遺伝子等）等である。 Examples of selection markers are drug resistance genes (eg neomycin resistance gene, ampicillin resistance gene, canamycin resistance gene, puromycin resistance gene, etc.), nutritional requirement complementary genes (eg dihydrofolate reductase (DHFR) gene, HIS3 gene, LEU2 gene, etc.) , URA3 gene, etc.).
宿主細胞の例としては、非限定的に、大腸菌等のエシェリヒア属、バチルス・ズブチリス等のバチルス属、シュードモナス・プチダ等のシュードモナス属等の細菌、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ等のサッカロミセス属、カンジダ属、ピキア属等の酵母、CHO、COS、HEK293、NIH3T3、NS0等の動物細胞、Sf9、Sf21等の昆虫細胞、植物細胞等が挙げられる。 Examples of host cells include, but are not limited to, Escherichia genus such as Escherichia coli, Bacillus genus such as Bacillus subtilis, Pseudomonas genus such as Pseudomonas petita, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces genus Pombe and the like. , Yeasts such as Candida and Pikia, animal cells such as CHO, COS, HEK293, NIH3T3 and NS0, insect cells such as Sf9 and Sf21, plant cells and the like.
本発明の一態様において、本発明の医薬組成物は、医薬的に有効量の本発明のｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを有効成分として含んでおり、無菌の水性又は非水性の溶液、懸濁液、又はエマルションの形態であってもよい。さらに、塩、緩衝剤、アジュバント等の薬理学的に許容される担体、添加剤等を含んでいてもよい。 In one aspect of the invention, the pharmaceutical composition of the invention is at least one selected from the group consisting of pharmaceutically effective amounts of miR-140-3p of the invention, precursors thereof and DNA constructs encoding them. As an active ingredient, it may be in the form of a sterile aqueous or non-aqueous solution, suspension, or emulsion. Further, it may contain a pharmacologically acceptable carrier such as a salt, a buffer, an adjuvant, an additive and the like.
薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が用いられる。具体例としては、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤などが挙げられる。製剤化の際には、必要に応じて、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの製剤添加剤を用いてもよい。 As the pharmacologically acceptable carrier, various organic or inorganic carrier substances commonly used as pharmaceutical materials are used. Specific examples include excipients, lubricants, binders, disintegrants in solid formulations, solvents in liquid formulations, solubilizers, suspending agents, tonicity agents, buffers, soothing agents and the like. Be done. At the time of formulation, if necessary, formulation additives such as preservatives, antioxidants, colorants, and sweeteners may be used.
薬理学的に許容される添加剤としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニトール、ソルビトール、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルメロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム-グリコール-スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン酸二アンモニウム、グリシン、オレンジ油等の矯味剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定化剤、メチルセルロース、ポビドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。 Pharmaceutically acceptable additives include, for example, excipients such as sucrose, starch, mannitol, sorbitol, lactose, glucose, cellulose, talc, calcium phosphate, calcium carbonate, cellulose, methylcellulose, hydroxypropylcellulose, poly. Excipients such as propylpyrrolidone, gelatin, gum arabic, polyethylene glycol, sucrose, starch, starch, carmellose, hydroxypropyl starch, sodium-glycol-starch, disintegrants such as sodium hydrogen carbonate, calcium phosphate, calcium citrate, stearic acid Lubricants such as magnesium, talc, sodium lauryl sulfate, citric acid, menthol, diammonium glycyrrhizinate, glycine, orange oil and other flavoring agents, sodium benzoate, sodium hydrogen sulfite, methylparaben, propylparaben and other preservatives, citrate Stabilizers such as acid, sodium citrate, acetic acid, suspending agents such as methylcellulose, povidone, aluminum stearate, dispersants such as surfactants, diluents such as water, physiological saline, orange juice, cacao butter, Examples thereof include base waxes such as polyethylene glycol and white kerosene, but the present invention is not limited thereto.
本発明の剤は、有効成分であるｍｉＲ−１４０−３ｐ、その前駆体およびこれらをコードするＤＮＡ構築物からなる群から選択される少なくとも１つを薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造することができる。本発明の剤は、骨疾患用の他の治療のための任意の有効成分を更に含んでいてもよい。そのような治療剤には、以下のものに限定されないが、例えばカルシウム製剤(L-アスパラギン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、乳酸カルシウム等)、活性型ビタミンD3製剤(アルファカルシドール、カルシトリオール等)、女性ホルモン薬(エストリオール、結合型エストロゲン等)、カルシトニン製剤(サケカルシトニン、エルカトニン等)、ビタミンK製剤(メナテトレノン等)、ビスホスホネート製剤(エチドロン酸二ナトリウム、アレンドロン酸ナトリウム水和物、リセドロン酸ナトリウム水和物等)、選択的エストロゲン受容体モジュレーター(塩酸ラロキシフェン等)、イプリフラボン、又は抗ＲＡＮＫＬ抗体等が含まれる。 The agent of the present invention is one or more carriers that are pharmacologically acceptable for at least one selected from the group consisting of the active ingredient miR-140-3p, a precursor thereof, and a DNA construct encoding them. It can be mixed with and manufactured by any method well known in the technical field of pharmaceutics. The agents of the present invention may further comprise any active ingredient for other treatments for bone disease. Such therapeutic agents include, but are not limited to, calcium preparations (calcium L-aspartate, calcium gluconate, calcium lactate, etc.), active vitamin D3 preparations (alphacalcidol, calcitriol, etc.), etc. Female hormone drugs (estriol, bound estrogen, etc.), calcium preparations (sake calcitonin, elcatonin, etc.), vitamin K preparations (menatetrenone, etc.), bisphosphonate preparations (disodium etidronate, sodium alendronate hydrate, sodium lysedronate, etc.) Hydrate, etc.), selective estrogen receptor modulators (laroxyphenic acid hydrochloride, etc.), ipriflavon, anti-RANKL antibody, etc. are included.
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、通常は、経皮、静脈内等の非経口又は経口で投与される。非経口製剤には、これらに限定されるものではないが、静脈内投与製剤、筋肉内投与製剤、腹腔内投与製剤、皮下投与製剤、局所投与製剤等が含まれる。局所投与は、損傷、骨折、障害を受けた骨部、例えば頭蓋骨、大腿骨、胸骨、椎骨、肋骨等の患部への直接的投与を含み、例えばハイドロキシアパタイト等の人工骨成分に有効成分を含有させた形態の移植用製剤として投与してもよい。非経口投与製剤には、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤、リポソーム、ナノ粒子封入製剤等が含まれる。経口製剤には、例えば、錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、遅延放出製剤、腸溶性製剤等が含まれる。 It is desirable to use the most effective route of administration for treatment, and it is usually administered parenterally or orally, such as transdermally or intravenously. The parenteral preparation includes, but is not limited to, an intravenous preparation, an intramuscular preparation, an intraperitoneal preparation, a subcutaneous preparation, a topical preparation and the like. Topical administration includes direct administration to injured, fractured, or damaged bones such as the skull, femur, sternum, vertebrae, ribs, etc., and contains the active ingredient in an artificial bone component such as hydroxyapatite. It may be administered as a transplanted preparation in the form of a fracture. Parenteral-administered preparations include, for example, injections, infusions, suppositories, transdermal absorbents, liposomes, nanoparticle-encapsulated preparations, and the like. Oral preparations include, for example, tablets, pills, granules, capsules, powders, solutions, suspensions, delayed release preparations, enteric-coated preparations and the like.
骨粗鬆症モデル非ヒト哺乳動物は、当業者に周知であり、例えば、卵巣摘出非ヒト哺乳動物（Am.J.Pathol.2007, 170(4), 1277-1290等）、関節炎非ヒト哺乳動物（BiochemicalPharmacol.2005,70(12),1744-1755等）、尾部懸垂による重力低下非ヒト哺乳動物（Exp.Cell.Res.2006,312(16), 3075-3083等）等を挙げることができるが、これらに限定されない。 Osteoporosis model non-human mammals are well known to those skilled in the art and include, for example, ovariectomized non-human mammals (Am.J.Pathol.2007, 170 (4), 1277-1290, etc.), arthritis non-human mammals (Biochemical Pharmacol). .2005,70 (12), 1744-1755, etc.), gravity reduction due to tail suspension Non-human mammals (Exp.Cell.Res.2006,312 (16), 3075-3083, etc.), etc. Not limited to these.
骨粗鬆症の症状の評価は、当業者に周知のパラメーター、例えば、骨密度、骨量、血中アルカリホスファターゼ活性等に基づき行われる。 The evaluation of the symptoms of osteoporosis is performed based on parameters well known to those skilled in the art, such as bone density, bone mass, and blood alkaline phosphatase activity.
被検物質を投与した非ヒト哺乳動物における骨粗鬆症の症状が、被検物質を投与していない対照非ヒト哺乳動物における骨粗鬆症の症状よりも有意に軽減されている場合には、当該被検物質を、骨粗鬆症を予防及び／又は治療する活性、骨形成促進活性、及び骨芽細胞分化を促進する活性を有する物質として得ることが出来る。 If the symptoms of osteoporosis in non-human mammals treated with the test substance are significantly reduced compared to the symptoms of osteoporosis in control non-human mammals not treated with the test substance, the test substance is used. , Can be obtained as a substance having an activity of preventing and / or treating osteoporosis, an activity of promoting bone formation, and an activity of promoting osteoblast differentiation.
以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例の記載によって限定して解釈されるものではない。当業者であれば、本明細書の記載に基づき、本発明の技術的範囲を逸脱せずに、多くの変形及び修飾を実施することができる。また、特に記載のない場合には、以下の実施例は、例えば、Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-ALaboratoryManual,ColdSpring Harbor Laboratory Press, New York, 1989;Ausubel, F.M.etal.,CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,NewYork,N.Y,1995等に記載されている、当業者に公知の標準的な遺伝子工学及び分子生物学的技術に従い実施することが出来る。また、キットを使用する場合は、キットの説明書に従って行う。なお、本明細書中に引用された文献の記載内容は本明細書の開示、及び、内容の一部を構成するものである。 Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples, but the technical scope of the present invention is not construed as being limited by the description of the following examples. One of ordinary skill in the art can make many modifications and modifications based on the description herein without departing from the technical scope of the invention. Unless otherwise specified, the following examples include, for example, Sambrook and Maniatis, in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989; Ausubel, FMetal., Current Protocols in Molecular Biology, John. It can be performed according to standard genetic engineering and molecular biology techniques known to those skilled in the art as described in Wiley & Sons, New York, NY, 1995, etc. When using the kit, follow the instruction manual of the kit. The contents of the documents cited in the present specification constitute the disclosure of the present specification and a part of the contents.
本実施例において、ｍｉＲ−１４０−３ｐがＷｎｔ３ａの過剰発現によりその発現が抑制されたこと、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現がＴＧＦβ３の発現を抑制してオステオカルシン（ＯＣＮ）の発現を促進したことを示す。
１．Ｗｎｔ３ａの過剰発現
マウス由来骨芽細胞を４ウェルプレート（５ｍｌ）の各ウェルに２．５ｘ１０４個ずつ及び６ウェルプレート（２ｍｌ）の各ウェルに１ｘ１０５個ずつ培養した。各ウェル内の培地は、phenol red-free α minimum essentialmedium、10% fetal bovine serum、penicillin、streptomycinを含むものからなる。培養したマウス由来骨芽細胞に、Ｗｎｔ３ａ（NM-009522、開始コドンから1275bp）を発現するベクター(pAd/CMV/V5-DEST)又はｅＧＦＰ(L29345、開始コドンから820bp)を発現するベクター（コントロール）を感染させ（ＭＯＩ：２００）、感染から１、３、７日経過後の細胞からＲＮＡの抽出を行い、感染から３日経過後の細胞を使用してｍｉＲＮＡマイクロアレイ、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色、ウェスタンブロットを行った。
ＲＮＡ抽出はmiRNeasy Mini kit又はTRIzolで行い、ウェスタンブロットには抗リン酸化βカテニン抗体(Cell Signaling Technology)、抗ＴＧＦβ３抗体(Abcam)、抗ＲＵＮＸ２抗体(CellSignaling Technology)を使用した。概要を図１に示す。
In this example, the expression of miR-140-3p was suppressed by overexpression of Wnt3a, and the expression of miR-140-3p suppressed the expression of TGFβ3 and promoted the expression of osteocalcin (OCN). show.
1. 1. Overexpressing Wnt3a Mouse-derived osteoblasts were cultured in each well of a 4-well plate (5 ml) with 2.5x10 4 cells and in each well of a 6-well plate (2 ml) with 1x10 5 cells. The medium in each well consists of one containing phenol red-free α minimum essential medium, 10% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin. Vector (control) expressing Wnt3a (NM-009522, 1275 bp from start codon) or eGFP (L29345, 820 bp from start codon) in cultured mouse-derived osteoblasts (MOI: 200), RNA is extracted from
RNA extraction was performed with miRN easy Mini kit or TRIzol, and anti-phosphorylated β-catenin antibody (Cell Signaling Technology), anti-TGFβ3 antibody (Abcam), and anti-RUNX2 antibody (Cell Signaling Technology) were used for Western blotting. The outline is shown in FIG.
（１） Ｗｎｔ３ａの過剰発現が骨芽細胞分化に及ぼす影響
図１に示すとおりに、マウス由来骨芽細胞におけるＷｎｔ３ａの過剰発現の解析を行ったところ、骨芽細胞においてリン酸化（Ｓｅｒ６７５）状態のβカテニンの発現が多くみられた（図２）。リン酸化βカテニンは核内に移行し、他の転写因子と複合体を形成して標的遺伝子であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の発現を促進すると考えられる。
(1) Effect of overexpression of Wnt3a on osteoblast differentiation As shown in FIG. 1, analysis of overexpression of Wnt3a in mouse-derived osteoblasts revealed that the osteoblasts were in a phosphorylated (Ser675) state. High expression of β-catenin was observed (Fig. 2). Phosphorylated β-catenin is thought to translocate into the nucleus and form a complex with other transcription factors to promote the expression of the target gene, alkaline phosphatase (ALP).
そこで、コントロールであるｅＧＦＰを過剰発現させたマウス由来骨芽細胞と、Ｗｎｔ３ａを過剰発現させたマウス由来骨芽細胞におけるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の発現について調べた。アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）染色は常法により行った。
その結果、Ｗｎｔ３ａの過剰発現により、マウス由来骨芽細胞においてアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性が促進されたことが認められた（図３）。
Therefore, the expression of alkaline phosphatase (ALP) in mouse-derived osteoblasts overexpressing the control eGFP and mouse-derived osteoblasts overexpressing Wnt3a was investigated. Alkaline phosphatase (ALP) staining was performed by a conventional method.
As a result, it was confirmed that the overexpression of Wnt3a promoted the activity of alkaline phosphatase (ALP) in mouse-derived osteoblasts (Fig. 3).
同様にして、Ｗｎｔ３ａの過剰発現によるマウス由来骨芽細胞でのＩ型コラーゲン及びオステオカルシン（ＯＣＮ）の発現を調べた。Ｉ型コラーゲンの結果と比較からもわかるように、オステオカルシン（ＯＣＮ）はＷｎｔ３ａの過剰発現によりその発現が顕著に抑制された（図４）。 Similarly, the expression of type I collagen and osteocalcin (OCN) in mouse-derived osteoblasts due to overexpression of Wnt3a was examined. As can be seen from the results of type I collagen and comparison, the expression of osteocalcin (OCN) was significantly suppressed by the overexpression of Wnt3a (Fig. 4).
（２） ｍｉＲＮＡマイクロアレイ解析
Ｗｎｔ３ａとｅＧＦＰをそれぞれマウス由来骨芽細胞に導入し、miRNeasy Mini kitを用いてｍｉＲＮＡの精製を行った。マイクロアレイ解析は3D-Gene miRNAMicroarray Platform（東レ）を用いて行った。
Ｗｎｔ３ａの蛍光強度をグローバルノーマライゼーションしたものを縦軸に、コントロールのｅＧＦＰの蛍光強度をグローバルノーマライゼーションしたものを横軸とし、スキャッタープロットが得られた（図５）。
図５に示すとおり、Ｗｎｔ３ａの過剰発現により２倍以上変動したｍｉＲＮＡのうち、発現の上昇したｍｉＲＮＡが１４種、発現の減少したｍｉＲＮＡが２１種得られた。
図５中の矢印で示すスポットはｍｉＲ−１４０−３ｐであり、Ｗｎｔ３ａの過剰発現による発現の変動が大きく、かつ発現量が高いｍｉＲＮＡとして得られた。
(2) MiRNA microarray analysis Wnt3a and eGFP were introduced into mouse-derived osteoblasts, respectively, and miRNA was purified using the miRNeasy Mini kit. Microarray analysis was performed using 3D-Gene miRNA Microarray Platform (Toray).
A scatter plot was obtained with the global normalization of the fluorescence intensity of Wnt3a on the vertical axis and the global normalization of the fluorescence intensity of the control eGFP on the horizontal axis (FIG. 5).
As shown in FIG. 5, among the miRNAs that fluctuated more than twice due to overexpression of Wnt3a, 14 types of miRNAs with increased expression and 21 types of miRNAs with decreased expression were obtained.
The spot indicated by the arrow in FIG. 5 is miR-140-3p, which was obtained as a miRNA having a large variation in expression due to overexpression of Wnt3a and a high expression level.
（３）ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現解析
図１に示すとおりに、Ｗｎｔ３ａを過剰発現させたマウス由来骨芽細胞の発現解析を行ったところ、ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現の抑制が認められた（図６）。
(3) Expression analysis of miR-140-3p As shown in FIG. 1, when the expression analysis of mouse-derived osteoblasts overexpressing Wnt3a was performed, suppression of the expression of miR-140-3p was observed. (Fig. 6).
（４）Ｗｎｔ３ａの過剰発現がＴＧＦβ３の発現に及ぼす影響
Ｗｎｔ３ａの発現に関連するｍｉＲＮＡ遺伝子として得られたｍｉＲ−１４０−３ｐの標的遺伝子を公知のデータベース［ｍｉＲＢａｓｅ（http://www.mirbase.org/）、ｍｉＲＤＢ(http://www.mirdb.org/)、ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇ(http://www.microrna.org/microrna/home.do)］を使用して予測した。その結果、ｍｉＲ−１４０−３ｐの標的遺伝子としてＴＧＦβ３が候補に挙がった。そこで、図１に示すとおりに、Ｗｎｔ３ａの過剰発現がＴＧＦβ３の発現に及ぼす影響を調べた。
その結果、Ｗｎｔ３ａの過剰発現によりマウス由来骨芽細胞においてＴＧＦβ３の発現が上昇することがわかった（図７）。
(4) Effect of overexpression of Wnt3a on TGFβ3 expression The target gene of miR-140-3p obtained as a miRNA gene related to the expression of Wnt3a is stored in a known database [miRBase (http://www.mirbase.org). /), miRDB (http://www.mirdb.org/), microRNA. Forecast using org (http://www.microrna.org/microrna/home.do)]. As a result, TGFβ3 was nominated as a target gene for miR-140-3p. Therefore, as shown in FIG. 1, the effect of overexpression of Wnt3a on the expression of TGFβ3 was investigated.
As a result, it was found that the overexpression of Wnt3a increased the expression of TGFβ3 in mouse-derived osteoblasts (Fig. 7).
以上の結果をまとめると、マウス由来骨芽細胞におけるＷｎｔ３ａの過剰発現の結果、（１）アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）の活性が促進され、（２）ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現が抑制され、（３）ＴＧＦβ３の遺伝子及びタンパクの発現が上昇した（図１４Ａ）。
アルカリホスファターゼは骨芽細胞の初期分化マーカーであり、オステオカルシンは骨芽細胞の後期分化マーカーである。初期分化の段階ではｍｉＲ−１４０−３ｐは弱い発現しか認められないが、分化が進むにつれてｍｉＲ−１４０−３ｐとオステオカルシンの発現促進が認められた。
Summarizing the above results, as a result of overexpression of Wnt3a in mouse-derived osteoblasts, (1) the activity of alkaline phosphatase (ALP) was promoted, (2) the expression of miR-140-3p was suppressed, and (3) ) Increased expression of TGFβ3 gene and protein (Fig. 14A).
Alkaline phosphatase is an early differentiation marker for osteoblasts, and osteocalcin is a late differentiation marker for osteoblasts. At the stage of early differentiation, only weak expression of miR-140-3p was observed, but as the differentiation progressed, the expression of miR-140-3p and osteocalcin was promoted.
２．ｍｉＲ−１４０−３ｐ発現のＴＧＦβ３発現への影響
マウス由来骨芽細胞にｍｉＲ−１４０−３ｐと同様の配列を持つｍｉＲ−１４０−３ｐ ｍｉｍｉｃ又はコントロールｍｉＲ−ＮＣ（mirVana（商標） miRNA mimic又はmimic negative control、Ambion）を導入したのちに、マウス由来骨芽細胞を３日間培養し、ＴＧＦβ３の遺伝子発現及びタンパク質発現を調べた。
ｍｉＲ−ＮＣを導入した細胞と比較して、ｍｉＲ−１４０−３ｐ ｍｉｍｉｃを導入した細胞では、ＴＧＦβ３の発現がｍＲＮＡ、タンパク質レベルとも低下した（図８）。
2. Effect of miR-140-3p expression on TGFβ3 expression miR-140-3p mimic or control miR-NC (mirVana ™ miRNA mimic or mimic negative) having a sequence similar to miR-140-3p in mouse-derived osteoblasts After introducing control, Ambion), mouse-derived osteoblasts were cultured for 3 days, and the gene expression and protein expression of TGFβ3 were examined.
TGFβ3 expression was reduced at both mRNA and protein levels in miR-140-3p mimic-introduced cells as compared to miR-NC-introduced cells (FIG. 8).
ＰＧＫプロモーターの下流においてルシフェラーゼ遺伝子と野生型ＴＧＦβ３遺伝子の３’ＵＴＲ部分を連結して配置したレポーター発現ベクターコンストラクトを作製し、該レポーター発現ベクターコンストラクトをｍｉＲ−ＮＣ又はｍｉＲ−１４０−３ｐ ｍｉｍｉｃと共にマウス由来骨芽細胞に共導入して培養し、ルシフェラーゼアッセイを行った。
ＴＧＦβ３の３’ＵＴＲ領域とｍｉＲ−１４０−３ｐは相補的な配列を有している（図９）。ｍｉＲ−１４０−３ｐを発現させた細胞ではルシフェラーゼの発現が抑制された（図９）。よって、ｍｉＲ−１４０−３ｐはＴＧＦβ３の３’ＵＴＲ領域を介してＴＧＦβ３の転写活性を抑制することが示された。
A reporter expression vector construct was prepared by ligating the 3'UTR portion of the luciferase gene and the wild-type TGFβ3 gene downstream of the PGK promoter, and the reporter expression vector construct was derived from mice together with miR-NC or miR-140-3p mimic. It was co-introduced into osteoblasts and cultured, and a luciferase assay was performed.
The 3'UTR region of TGFβ3 and miR-140-3p have complementary sequences (Fig. 9). The expression of luciferase was suppressed in the cells expressing miR-140-3p (Fig. 9). Therefore, it was shown that miR-140-3p suppresses the transcriptional activity of TGFβ3 via the 3'UTR region of TGFβ3.
以上の結果をまとめると、ｍｉＲ−１４０−３ｐ ｍｉｍｉｃの骨芽細胞への導入により、ＴＧＦβ３の発現が低下し、遺伝子発現の低下はルシフェラーゼ遺伝子の下流に連結されたＴＧＦβ３の３’ＵＴＲを介して行われたことから、ｍｉＲ−１４０−３ｐはＴＧＦβ３の３’ＵＴＲに作用してＴＧＦβ３の遺伝子発現を抑制することが示された。 Summarizing the above results, introduction of miR-140-3p mimic into osteoblasts reduced TGFβ3 expression, and the reduction in gene expression was via the 3'UTR of TGFβ3 linked downstream of the luciferase gene. From what was done, it was shown that miR-140-3p acts on the 3'UTR of TGFβ3 and suppresses the gene expression of TGFβ3.
３．ｍｉＲ−１４０−３ｐ発現による骨代謝に関連する遺伝子への影響α
マウス由来骨芽細胞を２４ウェルプレート（１ｍｌ）の各ウェルに３ｘ１０４個ずつ培養した。各ウェル内の培地はphenol red-free α minimum essentialmedium、10% fetal bovine serum、penicillin、streptomycinを含むものからなる。培養したマウス由来骨芽細胞に、ｍｉＲ−１４０−３ｐ ｍｉｍｉｃ又はnegative control（ＮＣ）のｍｉＲＮＡをトランスフェクションし、１日経過後に培地交換（ＭＣ）を行い、トランスフェクションから２日後の細胞のＲＮＡの抽出を行い、トランスフェクションから３日後の細胞をウェスタンブロットに使用した。概要を図１０に示す。
3. 3. Effect of miR-140-3p expression on genes related to bone metabolism α
Mouse-derived osteoblasts were cultured in 3x10 4 cells in each well of a 24-well plate (1 ml). The medium in each well consists of one containing phenol red-free α minimum essential medium, 10% fetal bovine serum, penicillin, streptomycin. Cultured mouse-derived osteoblasts were transfected with miR-140-3p mimic or negative control (NC) miRNA, and medium exchange (MC) was performed 1 day later to obtain RNA from the
図１０に示すとおりに、ｍｉＲ−ＮＣ若しくはｍｉＲ−１４０−３ｐ ｍｉｍｉｃをマウス由来骨芽細胞に導入し、骨形成マーカーとして知られるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、骨吸収マーカーとして知られるＩ型コラーゲン（Ｃｏｌ１）、骨芽細胞分化において機能する転写因子Ｒｕｎｘ２、骨形成マーカーとして知られるオステオカルシン（ＯＣＮ）のそれぞれの遺伝子発現及びタンパクの発現を調べた。
その結果、ｍｉＲ−１４０−３ｐ ｍｉｍｉｃをマウス由来骨芽細胞へ導入することにより、オステオカルシンの発現が促進された（図１１）。
As shown in FIG. 10, miR-NC or miR-140-3p mimic was introduced into mouse-derived osteoblasts, and alkaline phosphatase (ALP) known as a bone formation marker and type I collagen (Col1) known as a bone resorption marker were introduced. ), The transcription factor Runx2 that functions in osteoblast differentiation, and osteocalcin (OCN), which is known as a bone formation marker, were examined for gene expression and protein expression.
As a result, the expression of osteocalcin was promoted by introducing miR-140-3p mimic into mouse-derived osteoblasts (Fig. 11).
４．ＴＧＦβ３投与によるオステオカルシン（ＯＣＮ）発現への影響
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＴＧＦβ３（ｒＴＧＦβ３、Cell Signaling Technologyから購入）を投与する２４時間前に、マウス由来骨芽細胞を２４ウェルプレート（１ｍｌ）の各ウェルに４ｘ１０４個ずつ培養した。各ウェル内の培地はphenolred-free α minimum essential medium、10% fetal bovineserum、penicillin、streptomycinを含むものからなる。ｒＴＧＦβ３を５ｎｇ／ｍｌの濃度で培地に投与し、ｒＴＧＦβ３の投与から２、５、２４、７２時間後にＲＮＡの抽出を行った。概要を図１２に示す。
4. Effect of TGFβ3 administration on osteocalcin (OCN)
ＴＧＦβ３を投与したマウス由来骨芽細胞ではＴＧＦβ３を投与していないマウス由来骨芽細胞（コントロール）と比較してオステオカルシンの発現が抑制された（図１３）。 The expression of osteocalcin was suppressed in the mouse-derived osteoblasts to which TGFβ3 was administered as compared with the mouse-derived osteoblasts (control) to which TGFβ3 was not administered (FIG. 13).
本実施例に示すとおり、ｍｉＲ−１４０−３ｐはＷｎｔ３ａ／ＴＧＦβ３シグナル伝達経路に関与して骨芽細胞分化を調節することが明らかになった。また、ｍｉＲ−１４０−３ｐはＴＧＦβ３シグナル伝達経路を抑制して、オステオカルシン（ＯＣＮ）の発現を促進させることから（図１４）、オステオカルシン（ＯＣＮ）促進剤として使用することができる。 As shown in this example, it was revealed that miR-140-3p is involved in the Wnt3a / TGFβ3 signaling pathway and regulates osteoblast differentiation. In addition, miR-140-3p can be used as an osteocalcin (OCN) promoter because it suppresses the TGFβ3 signaling pathway and promotes the expression of osteocalcin (OCN) (FIG. 14).
本発明者らはｍｉＲ−１４０−３ｐがＴＧＦβ３とＷｎｔ３ａ経路を直接結びつける働きをするものであることを見出した。ｍｉＲ−１４０−３ｐを骨芽細胞に遺伝子導入すると骨形成マーカーであるオステオカルシンの発現が促進した。この作用機序はこれまでの骨粗鬆症治療薬とは全く異なっており、骨形成に有効と考えられる。また、ｍｉＲＮＡは生理状態で存在するものであり、ｍｉＲ−１４０−３ｐを有効成分として含む治療薬は、従来の治療薬と比べて副作用が少ないことが期待される。
今後の高齢化社会の進展を考慮すると、骨粗鬆症の発症予防は健康寿命の延伸に重要な役割を果たすと考えられる。従来の骨粗鬆症治療薬の使用は骨粗鬆症と診断されることが必須であり、副作用の発生も懸念される。本発明に係るｍｉＲ−１４０−３ｐは治療だけでなく予防にも活用できると考えられ、病気や介護の予防の促進と、公的保険に依存しない健康産業の創出に貢献し、健康産業を創出できると思われる。
The present inventors have found that miR-140-3p acts to directly link TGFβ3 and the Wnt3a pathway. Gene transfer of miR-140-3p into osteoblasts promoted the expression of osteocalcin, a bone formation marker. This mechanism of action is completely different from conventional osteoporosis therapeutic agents, and is considered to be effective for bone formation. In addition, miRNA exists in a physiological state, and a therapeutic agent containing miR-140-3p as an active ingredient is expected to have fewer side effects than conventional therapeutic agents.
Considering the progress of the aging society in the future, prevention of the onset of osteoporosis is considered to play an important role in extending healthy life expectancy. It is essential to be diagnosed with osteoporosis in the use of conventional therapeutic agents for osteoporosis, and there is concern about the occurrence of side effects. It is considered that miR-140-3p according to the present invention can be used not only for treatment but also for prevention, and contributes to promotion of prevention of illness and long-term care and creation of a health industry that does not depend on public insurance, and creates a health industry. I think I can.
Claims (7)
(a)被検物質の存在下に骨芽細胞を培養する工程、
(b)該細胞におけるｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を測定する工程、及び
(c) ｍｉＲ−１４０−３ｐの発現量を増加させる物質を選択する工程、
を含む、方法。 A method for screening a substance effective in promoting osteocalcin production using the promotion of the expression level of miR-140-3p as a marker.
(a) Step of culturing osteoblasts in the presence of the test substance,
(b) measuring the expression level of miR-140-3p that put in the cell and,
(c) A step of selecting a substance that increases the expression level of miR-140-3p,
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