JP6942381B2 - Method for detecting cell proliferation using fluorescence in water-in-oil emulsion culture - Google Patents
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Description
本発明は、water-in-oil(W/O)エマルションを用いた微生物の培養・検出・分取の方法に関する。特に、微生物が増殖したドロップレットを見出す手法として、微生物による自家蛍光を用いた手法およびシグナル検出用レポーター分子として蛍光修飾核酸を用いた方法に関する。 The present invention relates to a method for culturing, detecting, and preparating microorganisms using a water-in-oil (W / O) emulsion. In particular, as a method for finding a droplet in which a microorganism has grown, a method using autofluorescence by the microorganism and a method using a fluorescence-modified nucleic acid as a reporter molecule for signal detection are described.
環境中には様々な微生物が生息しており、私たちはこれら微生物の活性や微生物が産生する物質を利用してきた。しかしながら、環境中の微生物の99%は未だ培養に成功しておらず、生物資源の多くは手付かずのままとなっている。これら未知微生物を培養することで、環境中での微生物の生理学的特性を明らかにするだけでなく、医学・産業の発展にも応用されることが期待される。
近年、微生物の分離・培養法の一つとして、W/Oエマルションを用いた手法が注目されつつある(非特許文献１および非特許文献２)。本手法では、油相中に水滴(微生物培養培地を使用)を分散させ、各水滴(ドロップレット)を一つの培養場として用いる。マイクロ流路を用いることにより、数分で数十万〜数百万単位のドロップレットを作製することが可能となりハイスループット化が見込まれる。また、水相中に存在する微生物数とドロップレット数の調整により、一細胞が封入されたドロップレットを作ることができれば、シングルセルからの培養が可能となる(非特許文献３)。
本手法を用いて微生物を培養する場合、１つのドロップレットあたりの細胞数はポワソン分布に従う。１つのドロップレットに一細胞が入る確率を高くしていくにつれ、微生物が存在しないドロップレットが生じる確率も高くなる。この時、微生物の増殖が見られるドロップレットを選択的に分取することができれば各微生物の解析、スケールアップ等に活用できる。微生物が存在するドロップレットの検出には細胞内分子と反応する蛍光基質が使用されてきたが、これらは同時に細胞破砕が必要となるので、微生物を生きたまま分取することができない(非特許文献４、非特許文献５)。Various microorganisms live in the environment, and we have utilized the activity of these microorganisms and the substances produced by them. However, 99% of the microorganisms in the environment have not yet been successfully cultivated, and many of the biological resources remain untouched. By culturing these unknown microorganisms, it is expected that they will not only clarify the physiological characteristics of microorganisms in the environment, but also be applied to the development of medicine and industry.
In recent years, a method using a W / O emulsion has been attracting attention as one of the methods for separating and culturing microorganisms (Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2). In this method, water droplets (using a microbial culture medium) are dispersed in the oil phase, and each water droplet (droplet) is used as one culture medium. By using the microchannel, it is possible to produce hundreds of thousands to millions of droplets in a few minutes, and high throughput is expected. Further, if a droplet in which one cell is enclosed can be produced by adjusting the number of microorganisms and the number of droplets present in the aqueous phase, culturing from a single cell becomes possible (Non-Patent Document 3).
When culturing microorganisms using this technique, the number of cells per droplet follows a Poisson distribution. As the probability of one cell entering one droplet increases, so does the probability of producing a droplet in which no microorganism exists. At this time, if the droplets in which the growth of microorganisms is observed can be selectively separated, it can be utilized for analysis, scale-up, etc. of each microorganism. Fluorescent substrates that react with intracellular molecules have been used to detect droplets in which microorganisms are present, but these require cell disruption at the same time, so microorganisms cannot be separated alive (non-patented). Document 4, Non-Patent Document 5).
本発明の課題は、微生物が増殖したドロップレットを非侵襲的に検出・分取を可能とする方法の提供である。 An object of the present invention is to provide a method capable of non-invasively detecting and sorting droplets in which microorganisms have grown.
本発明者らは、ドロップレット内の微生物を非侵襲的に検出する手法として、微生物による自家蛍光を用いた手法およびシグナル検出用レポーター分子として蛍光修飾核酸を用いた手法について着想した。自家蛍光を用いた手法では、ラベルフリーの状態で微生物細胞によって代謝されたNADHやフラビンといった自家蛍光分子の検出を試みた。一方で蛍光修飾核酸は微生物細胞を侵襲せずに、ドロップレット内で微生物の分泌・放出したヌクレアーゼによって分解を受け、生じたシグナルの検出を試みた。上記手法について鋭意検討したところ、二つの手法ともに、微生物を含むドロップレット内の微生物の増殖を検出できることを見出した。さらに微生物の増殖を検出できたドロップレットをシグナルの違いにより回収できた。本発明は上記知見により完成されたものである。
すなわち、本発明は以下のとおりである。
本発明は、一態様において、
〔１〕W/Oエマルションにおけるドロップレット内の微生物の増殖を検出する方法であって、
（ａ）微生物を含むドロップレットを作製する工程と
（ｂ）前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
（ｃ）前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、前記微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光特性の変化を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定する工程と
を含み、
蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットであることを示す、検出方法に関する。
また、本発明の検出方法は、一実施の形態において、
〔２〕上記〔１〕に記載の検出方法であって、
前記（ｃ）の検出工程における前記蛍光修飾核酸プローブが前記微生物より体外に分泌または放出されたRNaseまたはDNaseの作用により蛍光特性に変化を生じるものであることを特徴とする。
また、本発明の検出方法は、一実施の形態において、
〔３〕上記〔１〕または〔２〕に記載の検出方法であって、
前記（ｃ）の検出工程がマイクロ流路上で行われることを特徴とする。
また、本発明の検出方法は、一実施の形態において、
〔４〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の検出方法であって、
前記微生物が環境由来であることを特徴とする。
また、本発明の検出方法は、一実施の形態において、
〔５〕上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の検出方法であって、
前記微生物が人工的に作製されたものではないことを特徴とする。
また、本発明の検出方法は、一実施の形態において、
〔６〕上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の検出方法であって、
前記微生物が遺伝子組換え微生物であることを特徴とする。
また、本発明の検出方法は、一実施の形態において、
〔７〕上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の検出方法であって、
前記（ａ）ドロップレットを作製する工程が、二種以上の微生物を含むドロップレットを作製する工程であることを特徴とする。
また、本発明の検出方法は、一実施の形態において、
〔８〕上記〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載の検出方法であって、
前記（ａ）ドロップレットを作製する工程が、微生物を一細胞単位で含むドロップレットを作製する工程であって、
前記（ｃ）の検出工程において蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物であって、単一の細胞由来の微生物を含むものであることを特徴とする。
また、本発明の検出方法は、一実施の形態において、
〔９〕上記〔１〕〜〔８〕のいずれかに記載の検出方法であって、
前記（ｃ）の検出工程において前記蛍光修飾核酸プローブは、
（ア）前記（ａ）のドロップレットの作製工程において、ドロップレット中に封入されるか、または、
（イ）前記（ｃ）の検出工程の前に、微生物を含むドロップレットと蛍光修飾核酸プローブを含むドロップレットとを合一させることにより、微生物を含むドロップレット中に封入されることを特徴とする。
また、本発明の検出方法は、一実施の形態において、
〔１０〕上記〔９〕に記載の検出方法であって、
前記蛍光修飾核酸プローブがFRET型蛍光修飾核酸プローブであることを特徴とする。
また、本発明は、別の態様において、
〔１１〕 W/Oエマルションからインタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットを回収する方法であって、
（ｉ）微生物を含むドロップレットを作製する工程と
（ｉｉ）前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
（ｉｉｉ）前ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、
前記微生物より分泌または放出された物質に作用して蛍光特性に変化を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定するか、または、
微生物の自家蛍光を測定する工程と
（ｉｖ）蛍光特性の変化を検出したドロップレットを回収する工程と
を含む、回収方法に関する。
また、本発明の回収方法は、一実施の形態において、
〔１２〕上記〔１１〕に記載の回収方法であって、
前記(ｉｉｉ)および(ｉｖ)の工程をさらに１回または複数回繰り返すことを特徴とする。
また、本発明の回収方法は、一実施の形態において、
〔１３〕上記〔１１〕または〔１２〕に記載の回収方法であって、前記(ｉｖ)の回収工程の後に
（ｖ）前記ドロップレットから微生物を回収することを含むことを特徴とする。
また、本発明は、別の態様において、
〔１４〕上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の検出方法、または、上記〔１１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の回収方法に使用されるキットであって、
W/Oエマルション水相用の培養液と
W/Oエマルション油相用の油成分と
W/Oエマルションを安定化するための界面活性剤と
蛍光修飾核酸プローブと
を含む、キットに関する。The present inventors have conceived a method using autofluorescence by microorganisms and a method using fluorescence-modified nucleic acid as a reporter molecule for signal detection as a method for non-invasively detecting microorganisms in droplets. In the method using autofluorescence, we attempted to detect autofluorescent molecules such as NADH and flavin metabolized by microbial cells in a label-free state. On the other hand, the fluorescence-modified nucleic acid was degraded by the nuclease secreted and released by the microorganism in the droplet without invading the microbial cell, and an attempt was made to detect the generated signal. As a result of diligent studies on the above methods, it was found that both methods can detect the growth of microorganisms in droplets containing microorganisms. Furthermore, droplets that could detect the growth of microorganisms could be recovered by the difference in signal. The present invention has been completed based on the above findings.
That is, the present invention is as follows.
The present invention, in one aspect,
[1] A method for detecting the growth of microorganisms in a droplet in a W / O emulsion.
A step of preparing a droplet containing a microorganism, a step of culturing the microorganism in the droplet, and a step of detecting the growth of the microorganism in the droplet, which are extracorporeal than the microorganism. Including a step of measuring the fluorescence produced by the fluorescence-modified hybridization probe using a fluorescence-modified hybridization probe that acts on a substance secreted or released from the microorganism to cause a change in fluorescence characteristics.
The present invention relates to a detection method for indicating that the droplet in which a change in fluorescence characteristics is detected is a droplet containing an intact and proliferated microorganism.
Moreover, in one embodiment, the detection method of the present invention
[2] The detection method according to the above [1].
The fluorescence-modified nucleic acid probe in the detection step (c) is characterized in that the fluorescence characteristics are changed by the action of RNase or DNase secreted or released from the microorganism.
Moreover, in one embodiment, the detection method of the present invention
[3] The detection method according to the above [1] or [2].
The detection step (c) is performed on a microchannel.
Moreover, in one embodiment, the detection method of the present invention
[4] The detection method according to any one of the above [1] to [3].
It is characterized in that the microorganism is derived from the environment.
Moreover, in one embodiment, the detection method of the present invention
[5] The detection method according to any one of the above [1] to [4].
It is characterized in that the microorganism is not artificially produced.
Moreover, in one embodiment, the detection method of the present invention
[6] The detection method according to any one of the above [1] to [3].
The microorganism is a genetically modified microorganism.
Moreover, in one embodiment, the detection method of the present invention
[7] The detection method according to any one of the above [1] to [6].
The step (a) for producing a droplet is a step for producing a droplet containing two or more types of microorganisms.
Moreover, in one embodiment, the detection method of the present invention
[8] The detection method according to any one of the above [1] to [7].
The step (a) for producing a droplet is a step for producing a droplet containing a microorganism in a cell unit.
The droplet in which a change in fluorescence characteristics is detected in the detection step (c) is characterized in that it is an intact and proliferated microorganism and contains a microorganism derived from a single cell.
Moreover, in one embodiment, the detection method of the present invention
[9] The detection method according to any one of the above [1] to [8].
In the detection step of (c), the fluorescence-modified nucleic acid probe is used.
(A) In the step of producing the droplet of the above (a), it is enclosed in the droplet or is sealed in the droplet.
(A) Prior to the detection step of (c) above, a droplet containing a microorganism and a droplet containing a fluorescence-modified nucleic acid probe are combined to be encapsulated in the droplet containing the microorganism. do.
Moreover, in one embodiment, the detection method of the present invention
[10] The detection method according to the above [9].
The fluorescence-modified nucleic acid probe is a FRET-type fluorescence-modified nucleic acid probe.
Further, the present invention, in another aspect,
[11] A method for recovering droplets containing intact and proliferated microorganisms from a W / O emulsion.
These are (i) a step of preparing a droplet containing a microorganism, (ii) a step of culturing the microorganism in the droplet, and (iii) a step of detecting the growth of the microorganism in the pre-droplet.
The fluorescence produced by the fluorescence-modified nucleic acid probe is measured by using a fluorescence-modified nucleic acid probe that acts on a substance secreted or released from the microorganism to change the fluorescence characteristics, or
The present invention relates to a recovery method including a step of measuring the autofluorescence of a microorganism and (iv) a step of recovering a droplet in which a change in fluorescence characteristics is detected.
Moreover, in one embodiment, the recovery method of the present invention
[12] The collection method according to the above [11].
It is characterized in that the steps (iii) and (iv) are repeated once or a plurality of times.
Moreover, in one embodiment, the recovery method of the present invention
[13] The recovery method according to the above [11] or [12], which comprises recovering (v) microorganisms from the droplet after the recovery step of (iv).
Further, the present invention, in another aspect,
[14] A kit used for the detection method according to any one of the above [1] to [10] or the recovery method according to any one of the above [11] to [13].
With culture solution for W / O emulsion aqueous phase
With oil components for W / O emulsion oil phase
The present invention relates to a kit containing a surfactant for stabilizing a W / O emulsion and a fluorescence-modified nucleic acid probe.
本発明の検出方法によれば、ドロップレット内で増殖した微生物を非侵襲的に検出することが可能となる。また、検出したドロップレットに含まれる微生物は、他のドロップレットに含まれる微生物と区別して分取することができる。 According to the detection method of the present invention, microorganisms grown in the droplet can be detected non-invasively. In addition, the microorganisms contained in the detected droplets can be sorted separately from the microorganisms contained in other droplets.
本発明は、一態様において、W/Oエマルションにおけるドロップレット内の微生物の増殖を検出する方法であって、
（ａ）微生物を含むドロップレットを作製する工程と
（ｂ）前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
（ｃ）前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、
（ｃ１）前記微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定するか、または、
（ｃ２）微生物の自家蛍光を測定する工程と
を含み、
蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットであることを示す、検出方法に関する。The present invention, in one aspect, is a method of detecting the growth of microorganisms in a droplet in a W / O emulsion.
A step of preparing a droplet containing a microorganism, a step of culturing the microorganism in the droplet, and a step of detecting the growth of the microorganism in the droplet.
(C1) The fluorescence produced by the fluorescence-modified nucleic acid probe is measured or measured using a fluorescence-modified nucleic acid probe that produces fluorescence by acting on a substance secreted or released from the microorganism.
(C2) Including the step of measuring the autofluorescence of microorganisms.
The present invention relates to a detection method for indicating that the droplet in which a change in fluorescence characteristics is detected is a droplet containing an intact and proliferated microorganism.
ここで、本明細書において、W/Oエマルションとは連続相である油相中に、分散相として微粒子状の水滴(ドロップレット)が存在している状態をいう。
また、本明細書において「ドロップレット」とは、エマルション中の区画化された水滴をいう。
W/Oエマルションを構成する水相は、油相と混和しない親水性の液体であればよい。このような水相に用いることのできる溶液としては、以下に限定されないが、例えば、LB、R2Aなどを挙げることができる。また、湖沼水や海水をそのまま水相として用いることもできる。
W/Oエマルションを構成する油相は、水相と混和しない疎水性の液体であればよい。このような油相は公知であり、以下に限定されないが、例えば、FC40、Novec7500、ミネラルオイルなど、またはこれらの組み合わせを挙げることができる。
W/Oエマルションを安定化させるために、界面活性剤を水相あるいは油相、もしくはその両方に添加する必要がある。用いられる界面活性剤には、例えば、水相用の界面活性剤としてはSpan80、Tween20など、油相用の界面活性剤としてはPico-surf1、Krytoxなど、またはこれらの組み合わせを挙げることができる。水相または油相に添加される界面活性剤の濃度は、用いる界面活性剤の種類や所望するドロップレットの大きさ等の条件により適宜調整することができる。
本発明に用いられるW/Oエマルションは、エマルション中に区画化されたドロップレット内で微生物が増殖でき、かつ、微生物の増殖を検出可能なものであれば制限されない。また、W/Oエマルション中に含まれるドロップレットの大きさも、微生物が増殖でき、かつ、微生物の増殖を検出可能なものである限り特に制限されない。
上記の水相および油相からなるW/Oエマルションの作製方法は公知であり、例えば、QX100(Bio-RAD)などの市販の装置を用いて作成することができる。Here, in the present specification, the W / O emulsion refers to a state in which fine particle-like water droplets (droplets) are present as a dispersed phase in an oil phase which is a continuous phase.
Further, as used herein, the term "droplet" refers to a compartmentalized water droplet in an emulsion.
The aqueous phase constituting the W / O emulsion may be a hydrophilic liquid that is immiscible with the oil phase. Examples of the solution that can be used for such an aqueous phase include, but are not limited to, LB and R2A. In addition, lake water or seawater can be used as it is as an aqueous phase.
The oil phase constituting the W / O emulsion may be a hydrophobic liquid that is immiscible with the aqueous phase. Such oil phases are known and include, but are not limited to, FC40, Novec7500, mineral oils and the like, or combinations thereof.
Surfactants need to be added to the aqueous phase and / or oil phase to stabilize the W / O emulsion. Examples of the surfactant used include Span80 and Tween20 as the surfactant for the aqueous phase, Pico-surf1, Krytox and the like as the surfactant for the oil phase, or a combination thereof. The concentration of the surfactant added to the aqueous phase or the oil phase can be appropriately adjusted according to conditions such as the type of the surfactant used and the desired droplet size.
The W / O emulsion used in the present invention is not limited as long as the microorganism can grow in the droplets partitioned in the emulsion and the growth of the microorganism can be detected. Further, the size of the droplet contained in the W / O emulsion is not particularly limited as long as the microorganism can grow and the growth of the microorganism can be detected.
The method for producing a W / O emulsion composed of the above-mentioned aqueous phase and oil phase is known, and can be produced using, for example, a commercially available device such as QX100 (Bio-RAD).
本発明の方法を適用可能な微生物としては、ドロップレット内で増殖可能であり、かつ、分泌物を蛍光修飾核酸プローブで検出可能、または、自家蛍光を検出可能な微生物であれば特に制限されず、例えば、大腸菌、枯草菌、放線菌などを挙げることができる。微生物は、環境由来の微生物であってもよく、または遺伝子導入などが施された組換え微生物など、人工的に作製されたものであってもよい。 The microorganism to which the method of the present invention can be applied is not particularly limited as long as it is a microorganism that can grow in a droplet and can detect secretions with a fluorescence-modified nucleic acid probe or can detect autofluorescence. For example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, actinomycetes and the like can be mentioned. The microorganism may be an environment-derived microorganism, or may be an artificially produced microorganism such as a recombinant microorganism that has undergone gene transfer or the like.
一実施の形態においては、微生物は環境由来のものである。本発明の方法は、例えば、土壌等の環境中に含まれる微生物群を対象とすることができる。環境中に含まれる微生物群をドロップレットに封入させることで、各ドロップレットに含まれる微生物ごとの性質に応じた増殖を検出でき、異なる増殖能を示すドロップレットごとに単離や分取することができる。特に、一細胞ごとに微生物をドロップレット中に封入することで、異なる増殖能を示す微生物を含むドロップレットごとに単離が可能となる。 In one embodiment, the microorganism is of environmental origin. The method of the present invention can target, for example, a group of microorganisms contained in an environment such as soil. By encapsulating a group of microorganisms contained in the environment in a droplet, growth can be detected according to the properties of each microorganism contained in each droplet, and each droplet showing different proliferative ability can be isolated or sorted. Can be done. In particular, by encapsulating the microorganism in the droplet for each cell, it is possible to isolate each droplet containing the microorganism showing different proliferative ability.
また、別の実施の形態においては、微生物は人工的に作製されたものではない。すなわち、本発明の検出方法は、一実施の形態において、
W/Oエマルションにおけるドロップレット内の微生物の増殖を検出する方法であって、
（ａ）微生物を含むドロップレットを作製する工程と
（ｂ）前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
（ｃ）前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、
（ｃ１）前記微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定するか、または、
（ｃ２）微生物の自家蛍光を測定する工程と
を含み、
蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットであることを示す、検出方法(ただし、前記微生物が人工的に作製されたものである検出方法を除く)である。Moreover, in another embodiment, the microorganism is not artificially produced. That is, the detection method of the present invention, in one embodiment,
A method of detecting the growth of microorganisms in droplets in a W / O emulsion.
A step of preparing a droplet containing a microorganism, a step of culturing the microorganism in the droplet, and a step of detecting the growth of the microorganism in the droplet.
(C1) The fluorescence produced by the fluorescence-modified nucleic acid probe is measured or measured using a fluorescence-modified nucleic acid probe that produces fluorescence by acting on a substance secreted or released from the microorganism.
(C2) Including the step of measuring the autofluorescence of microorganisms.
A detection method indicating that the droplet in which a change in fluorescence characteristics is detected is a droplet containing an intact and proliferated microorganism (excluding a detection method in which the microorganism is artificially produced). Is.
本発明の検出方法は、（ａ）微生物を含むドロップレットを作製する工程を含む。
上記工程（ａ）において、微生物を含むドロップレットが作製される。
このとき、ドロップレット内に封入される微生物は、一つの種に由来するものであってもよく、また、二種以上の微生物が封入されていてもよい。
すなわち、本発明の検出方法は、一実施の形態において、（ａ）ドロップレットを作製する工程を、二種以上の微生物を含むドロップレットを作製する工程とすることができる。一つのドロップレット内に二種以上の微生物を含むことにより、一つのドロップレット内に封入された微生物間の相互作用の影響について検証することが可能となる。The detection method of the present invention includes (a) a step of producing a droplet containing a microorganism.
In the above step (a), a droplet containing a microorganism is produced.
At this time, the microorganism enclosed in the droplet may be derived from one species, or two or more types of microorganisms may be enclosed.
That is, in the detection method of the present invention, in one embodiment, the step of (a) producing a droplet can be a step of producing a droplet containing two or more types of microorganisms. By including two or more kinds of microorganisms in one droplet, it is possible to verify the influence of the interaction between the microorganisms enclosed in one droplet.
また、ドロップレット内に封入される微生物の数は、一細胞単位で封入されてもよく、または、二細胞以上の複数の細胞単位で封入されても良い。
すなわち、本発明の検出方法は、一実施の形態において、（ａ）ドロップレットを作製する工程が、微生物を一細胞単位で含むドロップレットを作製する工程とすることができる。これにより、蛍光特性の変化が検出されたドロップレット内には、インタクトかつ増殖した微生物であって、単一の細胞由来の微生物が含まれることになる。特に、複数種の微生物を含む試料から特定の微生物種の単離を目的とする場合、ドロップレット内には一細胞単位で微生物を含むことが好ましい。なお、１つのドロップレット内に微生物が一細胞ずつ含まれるように、W/Oエマルションを作製する方法は公知である(例えば、非特許文献３)。ドロップレット内に微生物が一細胞単位で含まれる限り製造方法は制限されないが、例えば、ポワソン分布に従い、水相中に存在する微生物数とドロップレット数の調整をすることで、一細胞が封入されたドロップレットを作製することができる。このようなドロップレット内に含まれる微生物は、単一の細胞由来の微生物である。よって、複数の微生物種を含む微生物群を試料とした場合、異なる増殖能を示すドロップレットごとに選択的に分取することで、各微生物の解析、スケールアップに寄与することができる。
また、ドロップレット内に二種以上の微生物を封入する際にも、各種ごとに一細胞単位でドロップレット内に微生物を封入させることもできる。
また、上述のように、本発明の検出方法は、一実施の形態において、（ａ）ドロップレットを作製する工程が、微生物を二細胞以上で含むドロップレットを作製する工程とすることができる。各ドロップレット中に複数の細胞を封入することで、検出可能な微生物数までの増殖に必要な培養時間を抑えることができ好ましい。また、共生関係を持つ微生物同士が同一ドロップレットに封入された場合、微生物相互間作用等によって増殖が促進されるという効果も期待される。In addition, the number of microorganisms encapsulated in the droplet may be encapsulated in units of one cell, or may be encapsulated in units of a plurality of cells of two or more cells.
That is, in the detection method of the present invention, in one embodiment, the step of (a) producing a droplet can be a step of producing a droplet containing a microorganism in a cell unit. As a result, the droplets in which the change in fluorescence characteristics is detected include microorganisms that are intact and proliferated and are derived from a single cell. In particular, when the purpose is to isolate a specific microorganism species from a sample containing a plurality of species of microorganisms, it is preferable that the droplet contains the microorganisms in units of one cell. A method for preparing a W / O emulsion so that each cell contains a microorganism in one droplet is known (for example, Non-Patent Document 3). The production method is not limited as long as the microorganisms are contained in the droplets in units of one cell. For example, one cell is encapsulated by adjusting the number of microorganisms present in the aqueous phase and the number of droplets according to the Poisson distribution. Droplets can be made. The microorganisms contained in such droplets are microorganisms derived from a single cell. Therefore, when a group of microorganisms containing a plurality of microbial species is used as a sample, it is possible to contribute to the analysis and scale-up of each microorganism by selectively sorting each droplet showing different growth ability.
Further, when two or more kinds of microorganisms are encapsulated in the droplet, the microorganisms can be encapsulated in the droplet in units of one cell for each type.
Further, as described above, in the detection method of the present invention, in one embodiment, the step of (a) producing a droplet can be a step of producing a droplet containing two or more microorganisms. By encapsulating a plurality of cells in each droplet, the culture time required for growth up to a detectable number of microorganisms can be suppressed, which is preferable. In addition, when microorganisms having a symbiotic relationship are encapsulated in the same droplet, it is expected that the growth is promoted by the interaction between microorganisms.
本発明の検出方法は、（ｂ）上記工程（ａ）において作製されたドロップレット中で微生物を培養する工程を含む。
W/Oエマルション中のドロップレットを用いて微生物を培養する方法は公知であり、マイクロ流路上など当業者であれば適宜培養に必要な装置を選択して培養することができる。培養条件についても、ドロップレットに含まれる微生物が増殖できる条件であれば特に制限されず、当業者であれば、培養の目的や培養の対象となる微生物に応じて適宜好ましい培養条件を設定することができる。以下に限定されないが、例えば、温度条件は4〜95℃とすることができ、培養時間は最大85日間行うことができる。The detection method of the present invention includes (b) a step of culturing a microorganism in the droplet prepared in the above step (a).
A method of culturing a microorganism using a droplet in a W / O emulsion is known, and a person skilled in the art can appropriately select and cultivate an apparatus necessary for culturing, such as on a microchannel. The culture conditions are not particularly limited as long as the microorganisms contained in the droplets can grow, and those skilled in the art can appropriately set preferable culture conditions according to the purpose of the culture and the microorganisms to be cultured. Can be done. For example, the temperature condition can be 4 to 95 ° C., and the culture time can be up to 85 days, although not limited to the following.
本発明の検出方法は、（ｃ）ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程を含む。また、工程（ｃ）の検出工程は、（ｃ１）微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定するか、または、（ｃ２）微生物の自家蛍光を測定することにより行われる。
ここで、本明細書における「微生物より体外に分泌または放出された物質」とは、核酸関連酵素などを意味し、具体的にはRNase、DNaseなどを挙げることができる。
また、「上記微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光を生じる蛍光修飾核酸プローブ」とは蛍光修飾核酸であり、以下に制限されないが、例えば、FRET型蛍光修飾核酸プローブ、PET型蛍光修飾核酸プローブなどを挙げることができる。
FRET型蛍光修飾核酸プローブを蛍光修飾核酸プローブとして用いる際には、市販のものを用いることができ、例えば、下記表１に記載のものを使用することができる。
Here, the “substance secreted or released from a microorganism to the outside of the body” in the present specification means a nucleic acid-related enzyme or the like, and specific examples thereof include RNase and DNase.
Further, the "fluorescence-modified nucleic acid probe that causes fluorescence by acting on a substance secreted or released from the above microorganism to the outside of the body" is a fluorescence-modified nucleic acid, and is not limited to the following, but for example, a FRET-type fluorescence-modified nucleic acid probe, PET. Type fluorescence modified nucleic acid probe and the like can be mentioned.
When the FRET type fluorescence-modified nucleic acid probe is used as the fluorescence-modified nucleic acid probe, a commercially available one can be used, and for example, the one shown in Table 1 below can be used.
表１に記載のFRET型蛍光修飾核酸プローブは、5’末端および3’末端にそれぞれ蛍光基および消光基を有する。例えば、一実施の形態において、表１に記載のFRET型蛍光修飾核酸プローブは5’末端にAlexa488、3’末端にBHQ1の修飾を有する。その他、FRET型蛍光修飾核酸プローブに用いることのできる蛍光基、消光基、および、それらの組み合わせは公知のものを使用することができる。以下に限定されないが、蛍光基としてはFAM、TET、HEXなど、消光基としてはDabcyl、Eclipse、BHQ2などを挙げることができ、代表的な組み合わせの使用例としては、FAM／Dabcyl(蛍光基／消光基)などを挙げることができる。通常はFRETにより消光状態が維持されているが、微生物により体外に放出された酵素により核酸の切断が生じるとFRETが解消され、蛍光強度が上昇する(図１)(Kelemen B. R. et al., “Hypersensitive substrate for ribonucleases” Nucleic Acids Research, 1999; 27, 3696-3701、Sato S. and Takenaka S., “Highly Sensitive Nuclease Assays Based on Chemically Modified DNA or RNA” Sensors, 2014; 14, 12437-12450)。また、FRET型蛍光修飾核酸プローブの塩基配列部分は、FRETによる消光状態を維持することが可能な配列であって、検出対象酵素が認識して切断あるいは結合するような内部配列を含むようにして設計することができる。微生物が産生するRNaseまたはDNaseを標的とする際、当業者であればドロップレット内に封入する微生物に応じて標的とする具体的なRNaseまたはDNaseを選択し、当該RNaseまたはDNaseが認識して切断あるいは結合する内部配列を含むようにFRET型蛍光修飾核酸プローブを設計することができる。
なお、大腸菌、枯草菌、放線菌などの微生物はRNaseI、RNaseY、RNaseEなどのRNaseを複数種有していることが知られており、各微生物により保有するRNaseのパターンが異なる。またRNaseはその種類ごとに配列特異性が異なり、例えば、大腸菌が保有するRNaseIは配列特異性を有さず、バチルス属(Bacillus)が保有するRNaseYはssRNAのA/U部分を優先的に分解し、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)が保有するRNaseEはssRNAのA/U部分を優先的に分解する。このように微生物が体外に放出するRNaseを標的とする場合、ドロップレット内に封入する微生物ごとに標的とするRNaseを選択し、FRET型蛍光修飾核酸プローブがRNaseIの非存在下ではFRETによる消光状態を維持し、標的とし選択したRNase存在下では当該RNaseによって切断されることが可能な任意のリボヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。FRET型蛍光修飾核酸プローブは、複数種のRNaseの認識配列を含んでいてもよいし、特定のRNaseの認識配列のみを含むように設計してもよい。当業者であれば、標的とするRNaseおよびその認識配列の選択とFRET型蛍光修飾核酸プローブの設計は公知の情報に基づいて適宜行うことができる。
本発明の好ましい一実施の形態において、蛍光修飾核酸プローブは微生物由来RNaseによるRNA切断が生じると蛍光強度が増大するものである。本発明で微生物が産生するRNaseを標的とする利点は５つあげられる。まず、RNaseはあらゆる生物に保存されており、検出できる微生物種を限定しない。２つ目として、RNAを切断する際に特殊な環境(温度、pH、塩濃度等)やバッファーを必要としないRNaseも存在するため、通常培養環境下で検出可能である。３つ目として、RNaseは非常に安定した酵素であり、一度反応系に含まれれば高感度に活性を検出することが可能である。４つ目として、蛍光修飾核酸プローブの切断反応は細胞外で生じるため、細胞非侵襲的な検出が可能となる。最後に５つ目として、本発明で使用する核酸プローブは水溶性であり、オイルに溶け出すことや近傍のドロップレットに移動することなく、封入されたドロップレット内に維持されるため長期間の検出が可能である。
蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定する方法は、当業者であれば市販の装置を用いて適宜行うことができる。本発明の検出方法においては、微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定することにより、ドロップレット内の微生物の増殖を検出することできる。The FRET-type fluorescently modified nucleic acid probes shown in Table 1 have a fluorescent group and a quenching group at the 5'end and the 3'end, respectively. For example, in one embodiment, the FRET type fluorescence modified nucleic acid probe shown in Table 1 has Alexa488 at the 5'end and BHQ1 at the 3'end. In addition, known fluorescent groups, quenching groups, and combinations thereof that can be used in the FRET type fluorescence modified nucleic acid probe can be used. Although not limited to the following, examples of the fluorescent group include FAM, TET, HEX, etc., and examples of the quenching group include Dabcyl, Eclipse, BHQ2, etc. Quenching group) and the like. Normally, the quenching state is maintained by FRET, but when nucleic acid is cleaved by an enzyme released from the body by a microorganism, FRET is eliminated and the fluorescence intensity increases (Fig. 1) (Kelemen BR et al., “ Hypersensitive substrate for ribonucleases ”Nucleic Acids Research, 1999; 27, 3696-3701, Sato S. and Takenaka S.,“ Highly Sensitive Nuclease Assays Based on Chemically Modified DNA or RNA ”Sensors, 2014; 14, 12437-12450). In addition, the base sequence portion of the FRET-type fluorescence-modified nucleic acid probe is a sequence capable of maintaining the quenching state by FRET, and is designed to include an internal sequence that the enzyme to be detected recognizes and cleaves or binds to. be able to. When targeting RNases or DNases produced by microorganisms, those skilled in the art will select a specific RNase or DNase to be targeted according to the microorganism to be encapsulated in the droplet, and the RNase or DNase will recognize and cleave. Alternatively, the FRET-type fluorescence-modified nucleic acid probe can be designed to contain an internal sequence that binds.
It is known that microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and actinomycetes have a plurality of RNases such as RNaseI, RNaseY, and RNaseE, and the pattern of RNase possessed by each microorganism is different. In addition, RNase has different sequence specificity depending on the type. For example, RNase I possessed by Escherichia coli does not have sequence specificity, and RNase Y possessed by Bacillus preferentially decomposes the A / U portion of ssRNA. However, RNase E possessed by the genus Bradyrhizobium preferentially degrades the A / U portion of ssRNA. When targeting RNases released from the body by microorganisms in this way, the target RNase is selected for each microorganism encapsulated in the droplet, and the FRET-type fluorescence-modified nucleic acid probe is quenched by FRET in the absence of RNase I. It may be designed to contain any ribonucleotide sequence that can be cleaved by the RNase in the presence of the targeted and selected RNase. The FRET-type fluorescence-modified nucleic acid probe may contain a recognition sequence of a plurality of RNases, or may be designed to contain only a recognition sequence of a specific RNase. Those skilled in the art can appropriately select the target RNase and its recognition sequence and design the FRET-type fluorescence-modified nucleic acid probe based on known information.
In a preferred embodiment of the present invention, the fluorescence-modified nucleic acid probe increases its fluorescence intensity when RNA is cleaved by a microorganism-derived RNase. There are five advantages of targeting RNase produced by microorganisms in the present invention. First, RNases are conserved in all organisms and do not limit the species of microorganisms that can be detected. Second, since there are RNases that do not require a special environment (temperature, pH, salt concentration, etc.) or buffer when cleaving RNA, they can be detected in a normal culture environment. Third, RNase is a very stable enzyme, and once it is included in the reaction system, its activity can be detected with high sensitivity. Fourth, since the cleavage reaction of the fluorescence-modified nucleic acid probe occurs extracellularly, non-cellular detection is possible. Finally, fifth, the nucleic acid probe used in the present invention is water-soluble and is maintained in the encapsulated droplet for a long period of time without dissolving in oil or moving to a nearby droplet. It can be detected.
A method for measuring the fluorescence generated by the fluorescence-modified nucleic acid probe can be appropriately carried out by those skilled in the art using a commercially available device. In the detection method of the present invention, a fluorescence-modified nucleic acid probe that produces fluorescence by acting on a substance secreted or released from a microorganism to the outside of the body is used to measure the fluorescence generated by the fluorescence-modified nucleic acid probe in the droplet. The growth of microorganisms can be detected.
(ｃ)の検出工程において蛍光修飾核酸プローブを使用する場合、蛍光の測定前に、ドロップレット内に蛍光修飾核酸プローブを封入する。蛍光修飾核酸プローブの封入のタイミングは、ドロップレット内の微生物の増殖を検出できる限り制限されず、具体的には、下記(ア)または(イ)のタイミングで封入することができる：
（ア）(ａ)のドロップレットの作製工程において、蛍光修飾核酸プローブをドロップレット中に封入する、または、
（イ）(ｃ)の検出工程の前に、微生物を含むドロップレットと蛍光修飾核酸プローブを含むドロップレットとを合一させることにより、蛍光修飾核酸プローブを、微生物を含むドロップレット中に封入する。
(ア)ドロップレットの作製工程において、蛍光修飾核酸プローブをドロップレット中に封入する場合には、ドロップレット作製直前に、水相として使用する溶液に蛍光修飾核酸プローブを混合するようにすればよい。
また、(イ)微生物を含むドロップレットと蛍光修飾核酸プローブを含むドロップレットとを合一させる手法は、例えば、W/Oエマルションディスタビライザー存在下でこれら２つのドロップレット同士を会合させるようにして行うことができる。When the fluorescence-modified nucleic acid probe is used in the detection step of (c), the fluorescence-modified nucleic acid probe is enclosed in a droplet before the measurement of fluorescence. The timing of encapsulation of the fluorescently modified nucleic acid probe is not limited as long as the growth of microorganisms in the droplet can be detected, and specifically, encapsulation can be performed at the following timing (a) or (b):
(A) In the step of preparing the droplet of (a), the fluorescence-modified nucleic acid probe is encapsulated in the droplet or
(A) Before the detection step of (c), the fluorescence-modified nucleic acid probe is encapsulated in the droplet containing the microorganism by combining the droplet containing the microorganism and the droplet containing the fluorescence-modified nucleic acid probe. ..
(A) In the step of producing a droplet, when the fluorescence-modified nucleic acid probe is encapsulated in the droplet, the fluorescence-modified nucleic acid probe may be mixed with the solution used as the aqueous phase immediately before the droplet is produced. ..
In addition, (a) the method of combining a droplet containing a microorganism and a droplet containing a fluorescence-modified nucleic acid probe is, for example, to associate these two droplets with each other in the presence of a W / O emulsion stabilizer. It can be carried out.
また、本明細書において「微生物の自家蛍光」とは微生物および培地が特定の蛍光色素で標識されていない状態で励起光を照射した時に検出できる蛍光をいう。微生物の自家蛍光は公知であり、以下に制限されないが、例えば、NADH、フラビン、アミノ酸からの蛍光をいう。本発明の検出方法においては、微生物の自家蛍光を測定することにより、ドロップレット内の微生物の増殖を検出することできる。また、当業者であれば適宜対象とする微生物の自家蛍光を測定することができる。 Further, in the present specification, "autofluorescence of microorganisms" refers to fluorescence that can be detected when the microorganism and the medium are irradiated with excitation light in a state where they are not labeled with a specific fluorescent dye. The autofluorescence of microorganisms is known and is not limited to the following, but refers to, for example, fluorescence from NADH, flavin, amino acids. In the detection method of the present invention, the growth of microorganisms in the droplet can be detected by measuring the autofluorescence of the microorganisms. In addition, those skilled in the art can appropriately measure the autofluorescence of the target microorganism.
本発明の検出方法により蛍光が検出されたドロップレットは、非侵襲的な手法により微生物の増殖を検出するため、インタクトかつ増殖した状態の微生物を含むドロップレットを検出することができる。
ここで、本明細書において「インタクトの微生物」というとき、本微生物の細胞膜が維持されており、増殖が可能であり、生理活性を示す状態にある微生物をいう。すなわち、「インタクトの微生物」からは、細胞溶解液等の処理により細胞膜が溶解した状態の微生物は除かれる。また、本明細書において「増殖した微生物」とは、上記(ｃ)の検出工程における検出限界を超えて増殖した微生物をいう。ドロップレット作製時に封入される微生物数は検出限界未満であり、培養工程によりドロップレット内の微生物が増殖することで検出限界を超える。Since the droplet in which fluorescence is detected by the detection method of the present invention detects the growth of microorganisms by a non-invasive method, it is possible to detect a droplet containing microorganisms in an intact and proliferated state.
Here, the term "intact microorganism" as used herein refers to a microorganism in which the cell membrane of the present microorganism is maintained, proliferated, and exhibits physiological activity. That is, from the "intact microorganisms", microorganisms in which the cell membrane is dissolved by treatment with a cytolytic solution or the like are excluded. Further, in the present specification, the “proliferated microorganism” means a microorganism that has grown beyond the detection limit in the detection step (c) above. The number of microorganisms enclosed during the production of the droplet is less than the detection limit, and the detection limit is exceeded by the growth of the microorganisms in the droplet during the culture step.
また、(ｃ)ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程は、一実施の形態において、マイクロ流路上で行うことができる。これにより市販のセルソーターなどと組み合わせることで、ハイスループットに蛍光の検出と検出結果に応じた分取が可能になる。 Further, (c) the step of detecting the growth of microorganisms in the droplet can be performed on the microchannel in one embodiment. This makes it possible to detect fluorescence with high throughput and sort according to the detection result by combining it with a commercially available cell sorter or the like.
また、本発明は、別の態様において、
W/Oエマルションからインタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットを回収する方法であって、
（ｉ）微生物を含むドロップレットを作製する工程と
（ｉｉ）前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
（ｉｉｉ）前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、
前記微生物より分泌または放出された物質に作用して蛍光を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定するか、または、
微生物の自家蛍光を測定する工程と
（ｉｖ）蛍光を検出したドロップレットを回収する工程と
を含む、回収方法を提供する。
本発明の回収方法において、工程(ｉ)〜(ｉｉｉ)は、上記検出方法の工程(ａ)〜(ｃ)に準じて行うことができる。Further, the present invention, in another aspect,
A method of recovering droplets containing intact and proliferated microorganisms from a W / O emulsion.
(I) A step of preparing a droplet containing a microorganism, (ii) a step of culturing the microorganism in the droplet, and (iii) a step of detecting the growth of the microorganism in the droplet.
The fluorescence produced by the fluorescence-modified nucleic acid probe is measured by using a fluorescence-modified nucleic acid probe that acts on a substance secreted or released from the microorganism to generate fluorescence, or
Provided is a recovery method including a step of measuring the autofluorescence of a microorganism and (iv) a step of recovering a droplet in which fluorescence is detected.
In the recovery method of the present invention, steps (i) to (iii) can be performed according to steps (a) to (c) of the above detection method.
また、本発明の回収方法は、微生物の増殖を示す蛍光を検出した後、(ｉｖ)蛍光を検出したドロップレットを回収する工程を含む。
ドロップレット群より、蛍光が検出された、または、蛍光が検出されなかったドロップレットを分取または回収する手法は公知である。当業者であれば、ドロップレット群を培養および蛍光検出に供している器具(マイクロ流路や培養ディッシュなど)に応じて、適宜好ましい回収方法を選択することができる。以下に制限されないが、例えば、市販のチップ式セルソーターを利用して、蛍光強度が上昇したドロップレットをソーティングすることができる。In addition, the recovery method of the present invention includes the step of recovering (iv) the droplet in which the fluorescence is detected after detecting the fluorescence indicating the growth of the microorganism.
A method for collecting or recovering a droplet in which fluorescence is detected or no fluorescence is detected from the droplet group is known. One of ordinary skill in the art can appropriately select a preferred recovery method depending on the instrument (microchannel, culture dish, etc.) for culturing and detecting fluorescence of the droplet group. Although not limited to the following, for example, a commercially available chip-type cell sorter can be used to sort droplets having increased fluorescence intensity.
また、本発明は、別の態様において、上記検出方法または上記回収方法に使用されるキットを提供する。
本発明のキットは、W/Oエマルション水相用の培養液と、W/Oエマルション油相用の油成分と、W/Oエマルション安定化のための界面活性剤と蛍光修飾核酸プローブとを含むことを特徴とする。本発明のキットには、上記の構成以外のものも含まれてよく、培養等に用いるマイクロ流路、培養皿などが含まれていても良い。The present invention also provides, in another embodiment, a kit used for the detection method or the recovery method.
The kit of the present invention contains a culture solution for the aqueous phase of the W / O emulsion, an oil component for the oil phase of the W / O emulsion, a surfactant for stabilizing the W / O emulsion, and a fluorescence-modified hybridization probe. It is characterized by that. The kit of the present invention may include a structure other than the above, and may include a microchannel, a culture dish, or the like used for culturing or the like.
以下に、具体的な実施例を示すが、本発明の核酸アプタマーは以下に開示するものに限定されない。また、本明細書中で引用する文献の内容は、本明細書に参照として組み込まれる。 Specific examples will be shown below, but the nucleic acid aptamers of the present invention are not limited to those disclosed below. In addition, the contents of the documents cited herein are incorporated herein by reference.
（試験例１：大腸菌培養液による蛍光修飾核酸への影響評価）
蛍光修飾核酸(DR-Ale-UACAU)(日本バイオサービス)1μMと、(i)大腸菌を含まないLB培養液、(ii)大腸菌を含むLB培養液（OD600=2.77）、または、(iii)大腸菌を含まないLB培養液にRNaseA 2.5ng/μLを添加したものをそれぞれ混合しトータル20μLとした。混合直後および37℃で４時間インキュベーション後の蛍光強度をLight Cycler480(Roche)を用いて測定した。(i)LBと蛍光修飾核酸(DR-Ale-UACAU)を混合した時には蛍光強度は低いまま維持されていた。一方、(ii)大腸菌培養液と蛍光修飾核酸(DR-Ale-UACAU)を混合した場合には時間が経つと蛍光強度の上昇が見られた。(iii)RNaseAを添加した時には高い蛍光強度が維持されていた(図２)。このことから大腸菌培養液によって蛍光修飾核酸の切断、続く蛍光強度の上昇が生じることが明らかとなった。(Test Example 1: Evaluation of the effect of E. coli culture solution on fluorescence-modified nucleic acid)
Fluorescent modified nucleic acid (DR-Ale-UACAU) (Nippon Bioservice) 1 μM and (i) E. coli-free LB culture, (ii) E. coli-containing LB culture (OD 600 = 2.77), or (iii) RNase A 2.5 ng / μL was added to the LB culture medium containing no E. coli and mixed to make a total of 20 μL. Fluorescence intensity immediately after mixing and after incubation at 37 ° C. for 4 hours was measured using a Light Cycler 480 (Roche). (i) When LB and the fluorescence-modified nucleic acid (DR-Ale-UACAU) were mixed, the fluorescence intensity was maintained at a low level. On the other hand, (ii) when the Escherichia coli culture solution and the fluorescence-modified nucleic acid (DR-Ale-UACAU) were mixed, an increase in fluorescence intensity was observed over time. (iii) High fluorescence intensity was maintained when RNase A was added (Fig. 2). From this, it was clarified that the Escherichia coli culture solution cleaves the fluorescence-modified nucleic acid and subsequently increases the fluorescence intensity.
（試験例２：ドロップレット内における蛍光修飾核酸の反応）
ドロップレット内において蛍光修飾核酸(R-Ale-UCUCG)(日本バイオサービス)の切断による蛍光強度の変化を調べた。(i)LB培養液に蛍光修飾核酸(R-Ale-UCUCG)1μMのみを添加した溶液、または、(ii)LB培養液に蛍光修飾核酸(R-Ale-UCUCG)1μMとRNaseA 5ng/μLをそれぞれ添加した溶液を水相として、DG oil(Bio-RAD)とFC-40(3M)を油相として、Pico-surf1(Dolomite, final 1%)を界面活性剤として使用してW/Oエマルションを作製した。W/Oエマルション作製装置QX100(Bio-RAD)を使用したところ、直径130μm程度の大きさのドロップレットが作製できた。それぞれのW/Oエマルションを顕微鏡によって蛍光観察をしたところ、蛍光修飾核酸のみの系において蛍光強度は上昇せず、RNaseAを添加した系において蛍光強度の上昇が見られ、これら２系のW/Oエマルションを蛍光の強さで区別することができた（図3）。(Test Example 2: Reaction of Fluorescent Modified Nucleic Acid in Droplet)
The change in fluorescence intensity due to cleavage of the fluorescence-modified nucleic acid (R-Ale-UCUCG) (Nippon Bioservice) in the droplet was investigated. (i) A solution in which only 1 μM of fluorescently modified nucleic acid (R-Ale-UCUCG) is added to the LB culture solution, or (ii) 1 μM of fluorescently modified nucleic acid (R-Ale-UCUCG) and 5 ng / μL of RNase A in the LB culture solution. W / O emulsion using each added solution as an aqueous phase, DG oil (Bio-RAD) and FC-40 (3M) as an oil phase, and Pico-surf1 (Dolomite, final 1%) as a surfactant. Was produced. When the W / O emulsion preparation device QX100 (Bio-RAD) was used, a droplet having a diameter of about 130 μm could be prepared. When each W / O emulsion was fluorescently observed with a microscope, the fluorescence intensity did not increase in the system containing only the fluorescence-modified nucleic acid, and the fluorescence intensity increased in the system to which RNase A was added. Emulsions could be distinguished by the intensity of fluorescence (Fig. 3).
（試験例３：蛍光修飾核酸を用いた微生物増殖の検出および分取）
蛍光修飾核酸の蛍光を測定することによりドロップレット内における微生物増殖の検出を試みた。W/Oエマルションの水相には蛍光修飾核酸(R-Ale-UCUCG)1μMを混入した大腸菌培養液（LB培養液）を用いた。また、油相にはDG oil(Bio-RAD)とFC-40(3M)を使用した。界面活性剤としてPico-surf1(Dolomite, final 1%)を使用した。大腸菌培養液は、ポワソン分布で90%以上のドロップレットに大腸菌が0細胞、残りのドロップレットに一細胞以上が含まれるように濃度調整を行った。W/Oエマルション作製装置QX100(Bio-RAD)を使用したところ、直径130μm程度の大きさのドロップレットが作製できた。作製したW/Oエマルションは1.5mLチューブに回収し、37℃で24時間静置培養した。W/Oエマルション作製直後および24時間培養後に顕微鏡観察を行なったところ、一部のドロップレットにて大腸菌の増殖および蛍光強度の上昇が確認できた(図４)。On-chip Sort(株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ)を用いた蛍光検出を行なったところ、一部蛍光強度の高いドロップレット集団が生じていた(図５)。蛍光強度の高いドロップレット集団を分取し、顕微鏡観察を行なった結果、大腸菌が増殖したドロップレットが濃縮された(図６)。(Test Example 3: Detection and preparative of microbial growth using fluorescence-modified nucleic acid)
We attempted to detect microbial growth in droplets by measuring the fluorescence of fluorescence-modified nucleic acids. An Escherichia coli culture solution (LB culture solution) mixed with 1 μM of fluorescence-modified nucleic acid (R-Ale-UCUCG) was used as the aqueous phase of the W / O emulsion. In addition, DG oil (Bio-RAD) and FC-40 (3M) were used as the oil phase. Pico-surf1 (Dolomite, final 1%) was used as the surfactant. The concentration of the E. coli culture solution was adjusted so that 90% or more of the Poisson distributions contained 0 cells of E. coli and the remaining droplets contained 1 or more cells. When the W / O emulsion preparation device QX100 (Bio-RAD) was used, a droplet having a diameter of about 130 μm could be prepared. The prepared W / O emulsion was collected in a 1.5 mL tube and statically cultured at 37 ° C. for 24 hours. Microscopic observation was performed immediately after preparation of the W / O emulsion and after culturing for 24 hours, and it was confirmed that Escherichia coli grew and the fluorescence intensity increased in some of the droplets (Fig. 4). When fluorescence detection was performed using On-chip Sort (On-chip Biotechnology Co., Ltd.), some droplet populations with high fluorescence intensity were generated (Fig. 5). As a result of collecting a population of droplets having high fluorescence intensity and observing them under a microscope, the droplets in which Escherichia coli grew were concentrated (Fig. 6).
（試験例４：自家蛍光を用いた微生物増殖の検出および分取）
ドロップレット内の微生物の自家蛍光を測定することで微生物の増殖を検出可能か検証した。W/Oエマルションの水相には、ポワソン分布で90%以上のドロップレットに大腸菌が0細胞、残りのドロップレットに一細胞以上が含まれるように濃度調整を行った大腸菌培養液を用いた。油相にはDG oil (Bio-RAD)とFC-40 (3M)を使用した。界面活性剤としてPico-surf1(Dolomite, final 1%)を使用した。W/Oエマルション作製装置QX100(Bio-RAD)を使用したところ、直径130μm程度の大きさのドロップレットが作製できた。作製したW/Oエマルションは1.5mLチューブに回収し、37℃で24時間静置培養した。W/Oエマルション作製直後および24時間培養後に顕微鏡観察を行なったところ、一部のドロップレットにて大腸菌の増殖および蛍光強度の上昇が確認できた(図７)。On-chip Sort(株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ)を用いた蛍光測定を行なったところ、一部蛍光強度の高いドロップレット集団が生じていた(図８)ことから蛍光強度の差による分取が可能であると示唆される。(Test Example 4: Detection and preparative of microbial growth using autofluorescence)
It was verified whether the growth of microorganisms could be detected by measuring the autofluorescence of the microorganisms in the droplets. For the aqueous phase of the W / O emulsion, an Escherichia coli culture solution whose concentration was adjusted so that 90% or more of the droplets in the Poisson distribution contained 0 cells of Escherichia coli and the remaining droplets contained 1 or more cells was used. DG oil (Bio-RAD) and FC-40 (3M) were used as the oil phase. Pico-surf1 (Dolomite, final 1%) was used as the surfactant. When the W / O emulsion preparation device QX100 (Bio-RAD) was used, a droplet having a diameter of about 130 μm could be prepared. The prepared W / O emulsion was collected in a 1.5 mL tube and statically cultured at 37 ° C. for 24 hours. Microscopic observation was performed immediately after preparation of the W / O emulsion and after culturing for 24 hours, and it was confirmed that Escherichia coli grew and the fluorescence intensity increased in some of the droplets (Fig. 7). When fluorescence measurement was performed using On-chip Sort (On-chip Biotechnology Co., Ltd.), a droplet group with high fluorescence intensity was partially generated (Fig. 8). It is suggested that it is possible.
（試験例５：蛍光修飾核酸を用いた微生物増殖の検出および分取）
蛍光修飾核酸の蛍光を測定することによりドロップレット内における微生物増殖の検出を試みた。W/Oエマルションの水相には蛍光修飾核酸(R-Ale-UCUCG) 200nMを混入したBacillus subtilis培養液(LB培養液)を用いた。また、油相にはNovec7500を使用した。界面活性剤としてPico-surf1(Dolomite, final 1%)を使用した。B.subtilis培養液は、ポワソン分布で50%程度のドロップレットにB.subtilisが0細胞、残りのドロップレットに一細胞以上が含まれるように濃度調整を行った。W/Oエマルション作製装置QX100(Bio-RAD)を使用したところ、直径130μm程度の大きさのドロップレットが作製できた。作製したW/Oエマルションは1.5mLチューブに回収し、30℃で48時間静置培養した。W/Oエマルション作製直後および48時間培養後に顕微鏡観察を行ったところ、一部のドロップレットにてB.subtilisの増殖および蛍光強度の上昇が確認できた(図９)。48時間培養後にOn-chip Sortを用いた蛍光検出を行なったところ、一部蛍光強度の高いドロップレット集団が生じていた(図１０)。蛍光強度の高いドロップレット集団を分取し、顕微鏡観察を行なった結果、B.subtilisが増殖したドロップレットが濃縮された(図１１)。 (Test Example 5: Detection and preparative of microbial growth using fluorescence-modified nucleic acid)
We attempted to detect microbial growth in droplets by measuring the fluorescence of fluorescence-modified nucleic acids. A Bacillus subtilis culture solution (LB culture solution) mixed with 200 nM of fluorescently modified nucleic acid (R-Ale-UCUCG) was used as the aqueous phase of the W / O emulsion. In addition, Novec 7500 was used as the oil phase. Pico-surf1 (Dolomite, final 1%) was used as the surfactant. The concentration of the B. subtilis culture solution was adjusted so that the droplets having a Poisson distribution of about 50% contained 0 cells of B. subtilis and the remaining droplets contained 1 or more cells. When the W / O emulsion preparation device QX100 (Bio-RAD) was used, a droplet having a diameter of about 130 μm could be prepared. The prepared W / O emulsion was collected in a 1.5 mL tube and statically cultured at 30 ° C. for 48 hours. Microscopic observation was performed immediately after preparation of the W / O emulsion and after culturing for 48 hours, and it was confirmed that B. subtilis grew and the fluorescence intensity increased in some droplets (Fig. 9). Fluorescence detection using an on-chip sort after culturing for 48 hours revealed that some droplet populations with high fluorescence intensity were generated (Fig. 10). As a result of collecting a population of droplets having high fluorescence intensity and observing them under a microscope, the droplets in which B. subtilis grew were concentrated (Fig. 11).
（試験例６：蛍光修飾核酸を用いた微生物増殖の検出および分取）
蛍光修飾核酸の蛍光を測定することによりドロップレット内における微生物増殖の検出を試みた。W/Oエマルションの水相には蛍光修飾核酸(R-Ale-UCUCG) 200nMを混入したStreptomyces aureofaciens培養液(LB培養液)を用いた。また、油相にはNovec7500を使用した。界面活性剤としてPico-surf1(Dolomite, final 1%)を使用した。S.aureofaciens培養液は、ポワソン分布で80%程度のドロップレットにS.aureofaciensが０細胞、残りのドロップレットに一細胞以上が含まれるように濃度調整を行った。W/Oエマルション作製装置QX100を使用したところ、直径130μm程度の大きさのドロップレットレットが作製できた。作製したW/Oエマルションは1.5mLチューブに回収し、28℃で48時間静置培養した。W/Oエマルション作製直後および48時間培養後に顕微鏡観察を行なったところ、一部のドロップレットにてS.aureofaciensの増殖および蛍光強度の上昇が確認できた(図１２)。48時間培養後にOn-chip Sort(株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ)を用いた蛍光検出を行なったところ、一部蛍光強度の高いドロップレット集団が生じていた(図１３)。蛍光強度の高いドロップレット集団を分取し、顕微鏡観察を行なった結果、S.aureofaciensが増殖したドロップレットが濃縮された(図１４)。(Test Example 6: Detection and preparative of microbial growth using fluorescence-modified nucleic acid)
We attempted to detect microbial growth in droplets by measuring the fluorescence of fluorescence-modified nucleic acids. A Streptomyces aureofaciens culture solution (LB culture solution) mixed with 200 nM of fluorescence-modified nucleic acid (R-Ale-UCUCG) was used as the aqueous phase of the W / O emulsion. In addition, Novec 7500 was used as the oil phase. Pico-surf1 (Dolomite, final 1%) was used as the surfactant. The concentration of the S. aureofaciens culture solution was adjusted so that about 80% of the droplets in the Poisson distribution contained 0 cells of S. aureofaciens and the remaining droplets contained 1 or more cells. When the W / O emulsion preparation device QX100 was used, a droplet with a diameter of about 130 μm could be produced. The prepared W / O emulsion was collected in a 1.5 mL tube and statically cultured at 28 ° C. for 48 hours. Microscopic observation was performed immediately after preparation of the W / O emulsion and after culturing for 48 hours, and it was confirmed that S. aureofaciens proliferated and the fluorescence intensity increased in some droplets (Fig. 12). Fluorescence detection using On-chip Sort (On-chip Biotechnology Co., Ltd.) after culturing for 48 hours revealed that some droplet populations with high fluorescence intensity were generated (Fig. 13). As a result of collecting the droplet population having high fluorescence intensity and observing under a microscope, the droplets in which S. aureofaciens grew were concentrated (Fig. 14).
（試験例７：蛍光修飾核酸を用いた微生物増殖の検出および分取）
蛍光修飾核酸の蛍光を測定することによりドロップレット内における微生物増殖の検出を試みた。W/Oエマルションの水相には蛍光修飾核酸(R-Ale-UCUCG)200nMを混入したBradyrhizobium japonicum培養液(NBRC805培養液)を用いた。また、油相にはNovec7500を使用した。界面活性剤としてPico-surf1(Dolomite,final 1%)を使用した。B.japonicum培養液は、ポワソン分布で95%程度のドロップレットにB.japonicumが０細胞、残りのドロップレットに一細胞以上が含まれるように濃度調整を行った。W/Oエマルション作製装置QX100(Bio-RAD)を使用したところ、直径130μm程度の大きさのドロップレットが作製できた。作製したW/Oエマルションは1.5mLチューブに回収し、28℃で6日間静置培養した。W/Oエマルション作製直後および6日間培養後に顕微鏡観察を行なったところ、一部のドロップレットにてB.japonicumの増殖および蛍光強度の上昇が確認できた(図１５)。On-chip Sortを用いた蛍光検出を行なったところ、一部蛍光強度の高いドロップレット集団が生じていた(図１６)。蛍光強度の高いドロップレット集団を分取し、顕微鏡観察を行なった結果、B.japonicumが増殖したドロップレットが濃縮された(図１７)。(Test Example 7: Detection and preparative of microbial growth using fluorescence-modified nucleic acid)
We attempted to detect microbial growth in droplets by measuring the fluorescence of fluorescence-modified nucleic acids. Bradyrhizobium japonicum culture solution (NBRC805 culture solution) mixed with 200 nM of fluorescently modified nucleic acid (R-Ale-UCUCG) was used as the aqueous phase of the W / O emulsion. In addition, Novec 7500 was used as the oil phase. Pico-surf1 (Dolomite, final 1%) was used as a surfactant. The concentration of the B. japonicum culture solution was adjusted so that the droplets having a Poisson distribution of about 95% contained 0 cells of B. japonicum and the remaining droplets contained 1 or more cells. When the W / O emulsion preparation device QX100 (Bio-RAD) was used, a droplet having a diameter of about 130 μm could be prepared. The prepared W / O emulsion was collected in a 1.5 mL tube and statically cultured at 28 ° C. for 6 days. Microscopic observation was performed immediately after preparation of the W / O emulsion and after culturing for 6 days, and it was confirmed that the growth of B. japonicum and the increase in fluorescence intensity were confirmed in some droplets (Fig. 15). When fluorescence detection using the On-chip Sort was performed, a droplet population with high fluorescence intensity was partially generated (Fig. 16). As a result of collecting the droplet population having high fluorescence intensity and observing under a microscope, the droplets in which B. japonicum was grown were concentrated (Fig. 17).
本技術を環境サンプルに応用できれば、環境微生物を増殖速度ごとに分離培養することが可能になる。環境微生物中で同一の基質を使用し、増殖速度の異なる微生物群においては、増植速度の遅い微生物は増殖速度が速い微生物に淘汰される。本手法の一応用例としては、同一基質を使用する微生物間の競合を緩和させ、これまで淘汰されてきた微生物を分離培養するアプローチを提供する。また環境中には異種微生物間相互作用を利用した増殖制御を行う微生物も数多く存在する。同一ドロップレット内に複数種の微生物が封入され、微生物間相互作用が働くことによって、それぞれの微生物の増殖が促進されることが期待される。 If this technology can be applied to environmental samples, it will be possible to separate and culture environmental microorganisms at each growth rate. In a group of microorganisms that use the same substrate among environmental microorganisms and have different growth rates, microorganisms with a slow growth rate are selected by microorganisms with a high growth rate. As an application example of this method, we provide an approach of alleviating the competition between microorganisms using the same substrate and separating and culturing the microorganisms that have been culled so far. In addition, there are many microorganisms in the environment that control their growth by utilizing the interaction between different microorganisms. It is expected that the growth of each microorganism will be promoted by encapsulating a plurality of types of microorganisms in the same droplet and engaging in the interaction between the microorganisms.
Claims (13)
（ａ）微生物を含むドロップレットを複数作製する工程と
（ｂ）前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
（ｃ）前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、前記微生物より体外に分泌または放出されたRNaseまたはDNaseに作用して蛍光特性の変化を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定する工程と
を含み、
前記複数のドロップレットのうち蛍光特性の変化が検出されたドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットであることを示す、検出方法。 A method for detecting the growth of microorganisms in droplets in a W / O emulsion.
A step of producing a plurality of droplets containing microorganisms, a step of culturing microorganisms in the droplets, and a step of detecting the growth of microorganisms in the droplets, from the microorganisms. Including a step of measuring the fluorescence produced by the fluorescence-modified hybridization probe using a fluorescence-modified hybridization probe that acts on RNase or DNase secreted or released from the body to cause a change in fluorescence characteristics.
Indicates that Droplet change in fluorescence properties is detected among the plurality of droplets, a droplet containing the intact and growing microorganism, the detection method.
前記（ｃ）の検出工程がマイクロ流路上で行われる、検出方法。 The detection method according to claim 1.
A detection method in which the detection step (c) is performed on a microchannel.
前記微生物が環境由来である、検出方法。 The detection method according to claim 1 or 2.
A detection method in which the microorganism is derived from the environment.
前記微生物が人工的に作製されたものではない、検出方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 3.
A detection method in which the microorganism is not artificially produced.
前記微生物が遺伝子組換え微生物である、検出方法。 The detection method according to claim 1 or 2.
A detection method in which the microorganism is a genetically modified microorganism.
前記（ａ）ドロップレットを作製する工程が、二種以上の微生物を含むドロップレット
を作製する工程である、検出方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 5.
(A) A detection method in which the step of producing a droplet is a step of producing a droplet containing two or more types of microorganisms.
前記（ａ）ドロップレットを作製する工程が、微生物を一細胞単位で含むドロップレッ
トを作製する工程であって、
前記（ｃ）の検出工程において蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、イ
ンタクトかつ増殖した微生物であって、単一の細胞由来の微生物を含むものである、検出
方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 6.
The step (a) for producing a droplet is a step for producing a droplet containing a microorganism in a cell unit.
The detection method, wherein the droplet in which a change in fluorescence characteristics is detected in the detection step (c) is an intact and proliferated microorganism and contains a microorganism derived from a single cell.
前記（ｃ）の検出工程において前記蛍光修飾核酸プローブは、
（ア）前記（ａ）のドロップレットの作製工程において、ドロップレット中に封入される
か、または、
（イ）前記（ｃ）の検出工程の前に、微生物を含むドロップレットと蛍光修飾核酸プロー
ブを含むドロップレットとを合一させることにより、微生物を含むドロップレット中に封
入される、検出方法。 The detection method according to any one of claims 1 to 7.
In the detection step of (c), the fluorescence-modified nucleic acid probe is used.
(A) In the step of producing the droplet of the above (a), it is enclosed in the droplet or is sealed in the droplet.
(A) A detection method in which a droplet containing a microorganism and a droplet containing a fluorescence-modified nucleic acid probe are combined before the detection step of (c) above to be encapsulated in the droplet containing the microorganism.
前記蛍光修飾核酸プローブがFRET型蛍光修飾核酸プローブである、検出方法。 The detection method according to claim 8.
A detection method in which the fluorescence-modified nucleic acid probe is a FRET-type fluorescence-modified nucleic acid probe.
方法であって、
（ｉ）微生物を含むドロップレットを複数作製する工程と
（ｉｉ）前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
（ｉｉｉ）前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、
前記微生物より分泌または放出されたRNaseまたはDNaseに作用して蛍光特性に変化を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定する工程と
（ｉｖ）前記複数のドロップレットのうち蛍光特性の変化を検出したドロップレットを回収する工程と
を含む、回収方法。 A method of recovering droplets containing intact and proliferated microorganisms from a W / O emulsion.
These are (i) a step of producing a plurality of droplets containing microorganisms, (ii) a step of culturing microorganisms in the droplets, and (iii) a step of detecting the growth of microorganisms in the droplets.
A step of measuring the fluorescence produced by the fluorescence-modified nucleic acid probe using a fluorescence-modified nucleic acid probe that acts on RNase or DNase secreted or released from the microorganism to cause a change in fluorescence characteristics, and (iv) the plurality of droplets. A recovery method including a step of recovering a droplet in which a change in fluorescence characteristics is detected.
前記（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の工程をさらに１回または複数回繰り返す、回収方法。 The collection method according to claim 10.
A recovery method in which the steps (iii) and (iv) are repeated one or more times.
（ｖ）前記ドロップレットから微生物を回収することを含む、回収方法。 The recovery method according to claim 10 or 11, which comprises recovering the microorganism from the droplet (v) after the recovery step of (iv).
一項に記載の回収方法に使用するためのキットであって、
W/Oエマルション水相用の培養液と
W/Oエマルション油相用の油成分と
W/Oエマルションを安定化するための界面活性剤と
RNaseまたはDNaseに作用して蛍光特性に変化を生じる蛍光修飾核酸プローブと
を含む、キット。 A kit for use in the detection method according to any one of claims 1 to 9 or the collection method according to any one of claims 10 to 12.
With culture solution for W / O emulsion aqueous phase
With oil components for W / O emulsion oil phase
With a surfactant to stabilize the W / O emulsion
A kit containing a fluorescence modified nucleic acid probe that acts on RNase or DNase to cause changes in fluorescence properties.
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