JP6936383B2 - Progesterone measurement kit, progesterone measurement method and progesterone measurement reagent - Google Patents

Progesterone measurement kit, progesterone measurement method and progesterone measurement reagent Download PDF

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Description

本発明は、プロゲステロン測定キット、プロゲステロンの測定方法およびプロゲステロン測定試薬に関する。 The present invention relates to a progesterone measuring kit, a progesterone measuring method, and a progesterone measuring reagent.

タンパク質、酵素又は無機化合物などを定量するための高感度かつ容易な測定法として蛍光検出法が広く用いられている。蛍光検出法は、特定波長の光により励起されて蛍光を発する測定対象物質を含むと考えられる試料に上記特定波長の励起光を照射した際に発する蛍光を検出することによって測定対象物質の存在を確認する方法である。測定対象物質が蛍光体でない場合には、例えば、測定対象物質と特異的に結合する物質を蛍光色素で標識した物質を、試料に接触させ、その後上記と同様にして、励起光を照射した際に発する蛍光を検出することにより、測定対象物質の存在を確認することができる。 The fluorescence detection method is widely used as a highly sensitive and easy measurement method for quantifying proteins, enzymes, inorganic compounds and the like. The fluorescence detection method detects the presence of a substance to be measured by detecting the fluorescence emitted when the sample is irradiated with the excitation light of the specific wavelength, which is considered to contain the substance to be measured that is excited by light of a specific wavelength and emits fluorescence. This is a method to confirm. When the substance to be measured is not a phosphor, for example, when a substance in which a substance specifically bound to the substance to be measured is labeled with a fluorescent dye is brought into contact with the sample and then irradiated with excitation light in the same manner as described above. The presence of the substance to be measured can be confirmed by detecting the fluorescence emitted from the substance.

上記のような蛍光検出法において、微量に存在する測定対象物質を検出するための感度を向上させるため、プラズモン共鳴による電場増強の効果を利用する方法が知られている。この方法では、プラズモン共鳴を生じさせるため、透明な支持体上の所定領域に金属層を設けたセンサチップを用意し、支持体と金属層との界面に対して支持体の金属層形成面と反対の面側から、全反射角以上の所定の角度で励起光を入射させる。かかる励起光の照射により金属層に表面プラズモンが発生するが、この表面プラズモンの発生による電場増強作用によって、蛍光を増強させることによりシグナル/ノイズ比(S/N比)が向上し高感度な測定が可能となる。表面プラズモン励起による蛍光検出法(以下、「SPF法」ともいう)は、落射励起による蛍光検出法(落射蛍光法とも称する)に対して、信号増強度が約10倍得られ、高感度に測定することができる。 In the fluorescence detection method as described above, in order to improve the sensitivity for detecting a substance to be measured that is present in a trace amount, a method that utilizes the effect of increasing the electric field by plasmon resonance is known. In this method, in order to generate plasmon resonance, a sensor chip having a metal layer provided in a predetermined region on the transparent support is prepared, and the metal layer forming surface of the support is applied to the interface between the support and the metal layer. From the opposite surface side, the excitation light is incident at a predetermined angle equal to or greater than the total reflection angle. Surface plasmons are generated in the metal layer by irradiation with such excitation light, and the signal / noise ratio (S / N ratio) is improved by enhancing the fluorescence by the electric field enhancing action due to the generation of the surface plasmons, and the measurement is highly sensitive. Is possible. The fluorescence detection method by surface plasmon excitation (hereinafter, also referred to as “SPF method”) provides about 10 times the signal intensity of the fluorescence detection method by epi-radiation excitation (also referred to as epi-fluorescence fluorescence method) and measures with high sensitivity. can do.

特許文献1には、好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有する最終受容体染料とをポリマー微小粒子中に配合させることにより製造される蛍光微小粒子が記載されている。特許文献1では、上記染料としてポリアザインダセン染料を使用することが記載されている。 Patent Document 1 describes fluorescent fine particles produced by blending an initial donor dye having a preferable excitation peak and a final acceptor dye having a preferable emission peak into polymer fine particles. Patent Document 1 describes that a polyazaindacene dye is used as the above dye.

非特許文献1には、新規なジスチリルBODIPY(登録商標)(boron-dipyrrometheneの略称である)染料を設計及び合成したことが記載され、合成したジスチリルBODIPY(登録商標)染料について、クロロメタン溶液中での吸収及び発光スペクトルが分析されている。 Non-Patent Document 1 describes the design and synthesis of a novel dystilyl BODIPY® (abbreviation for boron-dipyrromethene) dye, and the synthesized dystyryl BODIPY® dye is contained in a chloromethane solution. Absorption and emission spectra at the site have been analyzed.

また、免疫測定方法では、被検物質を含む陽性となる被検試料だけでなく、被検物質を含まない陰性の被検試料に対しても反応し、陽性となる被検試料が存在し、偽陽性を示す問題が従来から認識されている。このような擬陽性を示す原因は明確にはなっていないが、血清中に含まれる何らかの因子が存在して非特異反応を起こすことが原因の一つではないかと考えられている。 Further, in the immunoassay method, there is a test sample that reacts not only with a positive test sample containing a test substance but also with a negative test sample that does not contain a test substance and becomes positive. The problem of false positives has traditionally been recognized. The cause of such false positives has not been clarified, but it is thought that one of the causes is that some factor contained in serum causes a non-specific reaction.

非特異反応を抑制する技術として、特許文献2には、免疫学的測定方法、特に、凝集を利用した免疫学的測定方法において、0.3〜2.0μmの感作粒子の非特異的免疫反応を阻止するために、非特異的免疫反応の原因物質と反応性を有する物質を結合した0.2μm以下の超微粒子を使用することが記載されている。特許文献3には、0.4μm以上の感作粒子を用いた免疫凝集反応により被検物質を検出する方法において、ブロッキングに使用する粒子として0.01μm〜0.5μmの不溶性担体粒子を用いることが記載されている。また、特許文献4には、非特異反応の抑制を目的として、特異的に反応する粒子よりも小さい粒子に非測定物質と免疫学的に反応しない抗体、又は抗原を固定したものを添加する方法が記載されている。さらに、特許文献5には、被測定物質に対して免疫学的に反応する抗体あるいは抗原を平均粒子径0.05〜0.5μmの担体に担持した免疫測定粒子を使用する免疫測定方法に用いられる非特異反応抑制剤であって、被測定物質に対して免疫学的に反応しない抗体又は抗原を有機溶媒存在下で担持した不溶性担体からなり、不溶性担体の平均粒子径が担体の平均粒子径よりも小さいことを特徴とする非特異反応抑制剤が記載されている。特許文献6には、蛍光分光技術を使用した免疫検出方法において、外径1μm以下の粒子により非特異反応の影響を抑止することが記載されている。 As a technique for suppressing non-specific reactions, Patent Document 2 describes non-specific immunization of sensitized particles of 0.3 to 2.0 μm in an immunological measurement method, particularly an immunological measurement method using aggregation. It is described that in order to block the reaction, ultrafine particles of 0.2 μm or less in which a substance having a reactivity with a causative substance of a non-specific immune reaction is bound are used. In Patent Document 3, in a method of detecting a test substance by an immunoagglutination reaction using sensitized particles of 0.4 μm or more, insoluble carrier particles of 0.01 μm to 0.5 μm are used as particles used for blocking. Is described. Further, in Patent Document 4, for the purpose of suppressing a non-specific reaction, a method of adding an antibody that does not immunologically react with a non-measurement substance or an antigen immobilized on particles smaller than the particles that specifically react with each other. Is described. Further, Patent Document 5 uses an immunological measurement method using an immunological measurement particle in which an antibody or antigen that immunologically reacts with a substance to be measured is supported on a carrier having an average particle size of 0.05 to 0.5 μm. This non-specific reaction inhibitor is composed of an insoluble carrier carrying an antibody or antigen that does not immunologically react with the substance to be measured in the presence of an organic solvent, and the average particle size of the insoluble carrier is the average particle size of the carrier. Non-specific reaction inhibitors characterized by being smaller than are described. Patent Document 6 describes that in an immunodetection method using fluorescence spectroscopy, particles having an outer diameter of 1 μm or less suppress the influence of a non-specific reaction.

特許文献7には、誘電体プレートの一面に、誘電体プレートに隣接する金属層を含む積層構造からなるセンサ部を備えるセンサチップを用いて被検出物質の量を検出する検出方法が記載されている。具体的には、センサ部に試料を接触させることにより、試料に含有される被検出物質の量に応じた量の、蛍光標識と蛍光標識に標識された結合物質とからなる蛍光標識結合物質を、センサ部上に結合させ、センサ部に励起光を照射することにより、センサ部上に増強した光電場を発生せしめ、増強した光電場により、蛍光標識を励起し、励起に起因して生じる光の量に基づいて、被検出物質の量が検出される。特許文献7においては、蛍光標識として、複数の第1の蛍光色素分子と、複数の第1の蛍光色素分子から生じる蛍光を透過する透光材料からなりかつ複数の第1の蛍光色素分子を包含する第1の粒子とから構成される蛍光物質を用いている。また、センサ部に対する蛍光標識結合物質の非特異的吸着性により蛍光標識結合物質がセンサ部に吸着することを防ぐためのブロッキング剤として、第1の蛍光色素分子を含まずかつ結合物質の特異的結合性を有さないブロッキング物質であって、蛍光標識結合物質の非特異的吸着性と同等の非特異的吸着性を有するブロッキング物質を用いている。 Patent Document 7 describes a detection method for detecting the amount of a substance to be detected by using a sensor chip including a sensor unit having a laminated structure including a metal layer adjacent to the dielectric plate on one surface of the dielectric plate. There is. Specifically, by bringing the sample into contact with the sensor unit, a fluorescently labeled binding substance composed of a fluorescent label and a binding substance labeled with the fluorescent label in an amount corresponding to the amount of the substance to be detected contained in the sample is produced. , By coupling on the sensor part and irradiating the sensor part with excitation light, an enhanced photoelectric field is generated on the sensor part, and the enhanced photoelectric field excites the fluorescent label, and the light generated due to the excitation. The amount of the substance to be detected is detected based on the amount of the substance to be detected. In Patent Document 7, the fluorescent label includes a plurality of first fluorescent dye molecules, and a plurality of first fluorescent dye molecules composed of a translucent material that transmits fluorescence generated from the plurality of first fluorescent dye molecules. A fluorescent substance composed of the first particles to be used is used. Further, as a blocking agent for preventing the fluorescent label-binding substance from being adsorbed on the sensor unit due to the non-specific adsorptivity of the fluorescent label-binding substance to the sensor unit, the first fluorescent dye molecule is not contained and the binding substance is specific. A blocking substance having no binding property and having a non-specific adsorptivity equivalent to that of the fluorescent label binding substance is used.

特許文献8には、粒子サイズを規定した乾燥粒子を用いて非特異吸着を抑制する免疫測定法が開示されている。 Patent Document 8 discloses an immunoassay method for suppressing nonspecific adsorption using dry particles having a defined particle size.

特許文献9には、黄体ホルモンであるプロゲステロン測定の初期妊娠テストにおける重要性に関して記載されている。プロゲステロン測定により、様々な哺乳動物種における排卵サイクル、発情期、妊娠又は繁殖失調に関し結論を出すことができる。 Patent Document 9 describes the importance of measuring progesterone, which is a luteal hormone, in an early pregnancy test. Progesterone measurements can draw conclusions about the ovulation cycle, estrous cycle, pregnancy or ataxia in various mammalian species.

特許第3442777号公報Japanese Patent No. 3442777 特開昭60−256057号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 60-256057 特開2000−221196号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-22196 特開平11−337551号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 11-337551 特開2007−127438号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2007-127438 特開2010−19553号公報JP-A-2010-19553 特開2010−112748号公報JP-A-2010-112748 特開2015−072249号公報JP 2015-072249 特表平8-503547号公報Special Table No. 8-503547 Gazette

Olivier Galangau et al.,Org.Biomol.Chem.,2010,8,4546−4553Oliver Galangau et al. , Org. Biomol. Chem. , 2010, 8, 4546-4553

上記の通り、簡易的な測定方法で高感度に測定が可能な方法としてはSPF法が知られているが、非常に微量な測定対象物質の測定に対しては十分に満足のいくものではなかった。検出法の中で、プロゲステロンのように抗体でサンドイッチできないような低分子を測定する競合法においては、測定対象物質の濃度が低い領域の検出感度を上げるためには反応系中の蛍光標識濃度を低く抑える必要があるが、その場合、測定対象物質の高濃度域側における蛍光強度が不足し、高濃度域では、誤差が非常に大きくなるため測定対象物質が精度よく測定できない問題があった。 As described above, the SPF method is known as a method capable of highly sensitive measurement by a simple measurement method, but it is not sufficiently satisfactory for the measurement of a very small amount of a substance to be measured. rice field. Among the detection methods, in the competitive method for measuring small molecules such as progesterone that cannot be sandwiched by an antibody, the fluorescent label concentration in the reaction system is adjusted in order to increase the detection sensitivity in the region where the concentration of the substance to be measured is low. It is necessary to keep it low, but in that case, the fluorescence intensity of the substance to be measured on the high concentration region side is insufficient, and in the high concentration region, the error becomes very large, so that there is a problem that the substance to be measured cannot be measured accurately.

また、特許文献2から6に記載のように、試料中に存在する非特異的免疫反応原因物質による偽陽性が問題となる特定の試料があり、非特異的免疫反応原因物質と相互作用する物質を付与した微粒子を用いて、偽陽性の問題を回避することが開示されているが、特許文献2、3、4及び5に記載の方法では、凝集法による測定は低感度であり非常に微量な測定対象物質の検出には使用できない問題があった。また、特許文献2に開示された免疫測定法は、洗浄工程や、遠心分離操作が必要であり、簡便な測定方法ではないという欠点を有していた。 Further, as described in Patent Documents 2 to 6, there is a specific sample in which false positive due to a non-specific immune reaction causative substance present in the sample becomes a problem, and a substance that interacts with the non-specific immune reaction causative substance. It is disclosed that the problem of false positives is avoided by using the fine particles to which the above is added, but in the methods described in Patent Documents 2, 3, 4 and 5, the measurement by the aggregation method is low in sensitivity and very small amount. There was a problem that it could not be used to detect a substance to be measured. Further, the immunoassay method disclosed in Patent Document 2 has a drawback that it is not a simple measurement method because it requires a washing step and a centrifugation operation.

特許文献6には、蛍光分光技術を使用した免疫検出方法において、外径1μm以下の粒子により非特異反応の影響を抑止することが記載されているが、非常に簡易な測定ではなかった。また、特許文献7及び8は共に、流路を用いた簡易的な免疫測定法を開示し、蛍光法を用いた測定方法として検体を測定しているが、測定対象物質の濃度が低い領域の検出感度を上げる技術に関しては開示していない。 Patent Document 6 describes that in an immunodetection method using fluorescence spectroscopy, particles having an outer diameter of 1 μm or less suppress the influence of a non-specific reaction, but this is not a very simple measurement. Further, both Patent Documents 7 and 8 disclose a simple immunoassay method using a flow path and measure a sample as a measurement method using a fluorescence method, but in a region where the concentration of the substance to be measured is low. The technology for increasing the detection sensitivity is not disclosed.

更に感度を上げて微量の検出物質を検出可能とすることで、非特異吸着による偽陽性の問題に限らず、ノイズも増加してしまうという問題がある。 By further increasing the sensitivity so that a trace amount of the detected substance can be detected, there is a problem that not only the problem of false positives due to non-specific adsorption but also noise increases.

本発明は、生体試料中のプロゲステロンの測定において、非特異吸着による偽陽性の問題を防止し、発生するノイズの増加を抑え、低濃度から高濃度にわたる広範囲の濃度域においてプロゲステロンの高精度の測定を実現することができるキット、方法及び試薬を提供することを解決すべき課題とした。 The present invention prevents the problem of false positives due to non-specific adsorption in the measurement of progesterone in biological samples, suppresses the increase in generated noise, and measures progesterone with high accuracy in a wide range of concentrations from low to high concentrations. The problem to be solved is to provide a kit, a method and a reagent capable of realizing the above.

本発明者らは上記課題を解決するために、プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、上記プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、上記第一の粒子及び上記第二の粒子を流すための流路と、上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板と、を含むプロゲステロンを測定するためのキットの構成について鋭意検討した。その結果、標識を有する第一の粒子として、680nm以上という長波長領域に発光極大波長を有し、かつ高い量子収率を示す標識粒子を用い、さらに第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ第一の粒子の平均粒子径より第二の粒子の平均粒子径が大きいという条件を満たすことにより、上記課題を解決できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。 In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have prepared a labeled first particle modified with a first binding substance having a specific binding property to progesterone, and a specific binding property to the progesterone. For the second unlabeled particle modified with the second binding substance which does not have, the flow path for flowing the first particle and the second particle, and the first binding substance. The composition of the kit for measuring progesterone containing a substrate having a binding substance and containing the substance was intensively examined. As a result, as the labeled first particles, labeled particles having a maximum emission wavelength in a long wavelength region of 680 nm or more and showing a high quantum yield are used, and the average particle diameter of the first particles is 50 to 50 to. The above problem is solved by satisfying the conditions that the particle size is 250 nm, the average particle size of the second particle is 70 to 500 nm, and the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of the first particle. I found out what I could do. The present invention has been completed based on these findings.

即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
[1] プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
上記第一の粒子及び上記第二の粒子を流すための流路と、
上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板と、
を含むプロゲステロン測定キットであって、
上記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
上記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、上記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ上記第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
キット。

Figure 0006936383
式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 0006936383
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。That is, according to the present invention, the following invention is provided.
[1] A labeled first particle modified with a first binding substance having a specific binding property to progesterone,
An unlabeled second particle modified with a second binding agent that does not have specific binding to progesterone,
The flow path for flowing the first particle and the second particle, and
A substrate having a substance having a binding property to the first binding substance,
A progesterone measurement kit that contains
The first particle having the above-mentioned label contains at least one compound represented by the following formula (1) and the particle, and contains the particle.
The average particle size of the first particle is 50 to 250 nm, the average particle size of the second particle is 70 to 500 nm, and the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of the first particle. Large particle size,
kit.
Figure 0006936383
In the formula, R 11 to R 15 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group. , Or arylthio groups, which may have substituents, and at least three of R 11 to R 15 represent atoms or groups other than hydrogen atoms. X 1 and X 2 independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, a hydroxy group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an ethenyl group, or an ethynyl group. It may have a substituent and X 1 and X 2 may be linked to each other to form a ring. Ar 1 and Ar 2 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent. L 1 and L 2 independently represent any of the formulas (L-1) to (L-4).
Figure 0006936383
In the formula, R 111 to R 116 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group, respectively. , Or arylthio groups, which may have substituents. A represents -O-, -S-, or -NH-.

[2] 上記第一の粒子及び上記第二の粒子がラテックス粒子である、[1]に記載のキット。
[3] 上記の標識を有する第一の粒子が、少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する発光性粒子であって、上記エネルギードナー化合物及び上記エネルギーアクセプター化合物の少なくとも一種が、上記式(1)で示される化合物である、[1]又は[2]に記載のキット。
[4] 上記エネルギードナー化合物として、少なくとも一種の上記式(1)で示される化合物を含有し、上記エネルギーアクセプター化合物として、少なくとも一種の上記式(1)で示される化合物を含有する、[3]に記載のキット。
[5] エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が1:10〜10:1である、[3]又は[4]に記載のキット。
[6] 上記第一の粒子に対する上記第二の粒子の質量比が1〜20である、[1]から[5]の何れか一に記載のキット。
[7] プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、[1]から[6]の何れか一に記載のキット。
[2] The kit according to [1], wherein the first particle and the second particle are latex particles.
[3] The first particle having the above-mentioned label is a luminescent particle containing at least one kind of energy donor compound, at least one kind of energy acceptor compound, and particles, and the above-mentioned energy donor compound and the above-mentioned energy. The kit according to [1] or [2], wherein at least one of the acceptor compounds is a compound represented by the above formula (1).
[4] The energy donor compound contains at least one compound represented by the above formula (1), and the energy acceptor compound contains at least one compound represented by the above formula (1) [3]. ] The kit described in.
[5] The kit according to [3] or [4], wherein the molar ratio of the energy donor compound to the energy acceptor compound is 1:10 to 10: 1.
[6] The kit according to any one of [1] to [5], wherein the mass ratio of the second particle to the first particle is 1 to 20.
[7] The kit according to any one of [1] to [6], wherein the first binding substance having specific binding property to progesterone is an antibody.

[8] (i)(a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
(b)プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
(c)プロゲステロンを含む被検試料と、
を混合して、混合物を得る工程と、
(ii)上記工程(i)で得た混合物を、基板上に適用する工程と、
(iii)上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する、上記基板上の反応部位において、上記第一の結合物質を捕捉する工程と、
(iv)上記反応部位上に捕捉された上記第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を検出する工程と、
を含むプロゲステロンの測定方法であって、
上記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
上記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、上記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ上記第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
プロゲステロンの測定方法。

Figure 0006936383
式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 0006936383
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。[8] (i) (a) A labeled first particle modified with a first binding agent having a specific binding property to progesterone.
(B) An unlabeled second particle modified with a second binding agent that does not have specific binding to progesterone.
(C) A test sample containing progesterone and
To obtain a mixture by mixing
(Ii) A step of applying the mixture obtained in the above step (i) onto a substrate, and
(Iii) A step of capturing the first binding substance at a reaction site on the substrate having a substance having a binding property to the first binding substance.
(Iv) A step of detecting a labeled first particle modified with the first binding agent captured on the reaction site.
A method for measuring progesterone, including
The first particle having the above-mentioned label contains at least one compound represented by the following formula (1) and the particle, and contains the particle.
The average particle size of the first particle is 50 to 250 nm, the average particle size of the second particle is 70 to 500 nm, and the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of the first particle. Large particle size,
How to measure progesterone.
Figure 0006936383
In the formula, R 11 to R 15 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group. , Or arylthio groups, which may have substituents, and at least three of R 11 to R 15 represent atoms or groups other than hydrogen atoms. X 1 and X 2 independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, a hydroxy group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an ethenyl group, or an ethynyl group. It may have a substituent and X 1 and X 2 may be linked to each other to form a ring. Ar 1 and Ar 2 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent. L 1 and L 2 independently represent any of the formulas (L-1) to (L-4).
Figure 0006936383
In the formula, R 111 to R 116 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group, respectively. , Or arylthio groups, which may have substituents. A represents -O-, -S-, or -NH-.

[9] 上記第一の粒子及び上記第二の粒子がラテックス粒子である、[8]に記載の方法。
[10] 上記の標識を有する第一の粒子が、少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する発光性粒子であって、上記エネルギードナー化合物及び上記エネルギーアクセプター化合物の少なくとも一種が、上記式(1)で示される化合物である、[8]又は[9]に記載の方法。
[11] 上記エネルギードナー化合物として、少なくとも一種の上記式(1)で示される化合物を含有し、上記エネルギーアクセプター化合物として、少なくとも一種の上記式(1)で示される化合物を含有する、[10]に記載の方法。
[12] 上記第一の粒子に対する上記第二の粒子の質量比が1〜20である、[8]から[11]の何れか一に記載の方法。
[13] 工程(iv)において、上記反応部位上に捕捉された上記第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を表面プラズモン蛍光法により検出する、[8]から[12]の何れか一に記載の方法。
[9] The method according to [8], wherein the first particle and the second particle are latex particles.
[10] The first particle having the above-mentioned label is a luminescent particle containing at least one kind of energy donor compound, at least one kind of energy acceptor compound, and particles, and the above-mentioned energy donor compound and the above-mentioned energy. The method according to [8] or [9], wherein at least one of the acceptor compounds is a compound represented by the above formula (1).
[11] The energy donor compound contains at least one compound represented by the above formula (1), and the energy acceptor compound contains at least one compound represented by the above formula (1) [10]. ] The method described in.
[12] The method according to any one of [8] to [11], wherein the mass ratio of the second particle to the first particle is 1 to 20.
[13] In the step (iv), the first labeled particles modified with the first binding substance captured on the reaction site are detected by the surface plasmon fluorescence method, [8] to [12]. ] The method according to any one of.

[14] (a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、(b)プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子とを含む、プロゲステロン測定試薬であって、
上記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
上記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、上記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ上記第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
プロゲステロン測定試薬。

Figure 0006936383
式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 0006936383
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。[14] (a) a labeled first particle modified with a first binding agent that has specific binding to progesterone, and (b) a second that does not have specific binding to progesterone. A progesterone-measuring reagent comprising a second unlabeled particle modified with a binding agent.
The first particle having the above-mentioned label contains at least one compound represented by the following formula (1) and the particle, and contains the particle.
The average particle size of the first particle is 50 to 250 nm, the average particle size of the second particle is 70 to 500 nm, and the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of the first particle. Large particle size,
Progesterone measurement reagent.
Figure 0006936383
In the formula, R 11 to R 15 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group. , Or arylthio groups, which may have substituents, and at least three of R 11 to R 15 represent atoms or groups other than hydrogen atoms. X 1 and X 2 independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, a hydroxy group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an ethenyl group, or an ethynyl group. It may have a substituent and X 1 and X 2 may be linked to each other to form a ring. Ar 1 and Ar 2 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent. L 1 and L 2 independently represent any of the formulas (L-1) to (L-4).
Figure 0006936383
In the formula, R 111 to R 116 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group, respectively. , Or arylthio groups, which may have substituents. A represents -O-, -S-, or -NH-.

[15] 上記式(1)で示される化合物が、下記式(3)で示される化合物である、[14]に記載のプロゲステロン測定試薬。

Figure 0006936383
式中、R11、R12、R14、R15、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、但し、R11、R12、R14及びR15の少なくとも2つは水素原子以外の原子又は基である。R31〜R35はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R31、R32、R34及びR35のいずれか一つは2原子以上からなる基である。[15] The progesterone measuring reagent according to [14], wherein the compound represented by the above formula (1) is a compound represented by the following formula (3).
Figure 0006936383
In the formula, R 11 , R 12 , R 14 , R 15 , X 1 , X 2 , Ar 1 , Ar 2 , L 1 and L 2 are synonymous with the definitions in formula (1), except that R 11 , At least two of R 12 , R 14 and R 15 are atoms or groups other than hydrogen atoms. R 31 to R 35 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, or arylthio. Representing a group, these may have a substituent , and any one of R 31 , R 32 , R 34 and R 35 is a group consisting of two or more atoms.

[16] 上記式(1)で示される化合物が、下記式(4)で示される化合物である、[14]に記載のプロゲステロン測定試薬。

Figure 0006936383
式中、R12、R13、R14、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、但し、R12、R13及びR14の少なくとも1つは水素原子以外の原子又は基である。R41及びR42はそれぞれ独立に、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。[16] The progesterone measuring reagent according to [14], wherein the compound represented by the above formula (1) is a compound represented by the following formula (4).
Figure 0006936383
In the formula, R 12 , R 13 , R 14 , X 1 , X 2 , Ar 1 , Ar 2 , L 1 and L 2 are synonymous with the definitions in formula (1), except that R 12 , R 13 and At least one of R 14 is an atom or group other than a hydrogen atom. R 41 and R 42 each independently represent an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, or an ethynyl group, which may have a substituent.

[17] 上記式(1)で示される化合物が、下記式(5)で示される化合物である、[14]に記載のプロゲステロン測定試薬。

Figure 0006936383
式中、R11〜R15、X、X、L及びLは、式(1)における定義と同義である。R51及びR52はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Q及びQはそれぞれ独立に、芳香族炭化水素環又は芳香族ヘテロ環を表し、これらは置換基を有していてもよい。[17] The progesterone measuring reagent according to [14], wherein the compound represented by the above formula (1) is a compound represented by the following formula (5).
Figure 0006936383
In the formula, R 11 to R 15 , X 1 , X 2 , L 1 and L 2 are synonymous with the definition in the formula (1). R 51 and R 52 each independently represent an alkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an amino group, an acyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, or an arylthio group, and these have a substituent. You may. Q 1 and Q 2 each independently represent an aromatic hydrocarbon ring or aromatic hetero ring, which may have a substituent.

[18] 上記第一の粒子に対する上記第二の粒子の質量比が1〜20である、[14]から[17]の何れか一に記載のプロゲステロン測定試薬。
[19] 上記プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、[14]から[18]の何れか一に記載のプロゲステロン測定試薬。
[20] 上記標識を有する第一の粒子が、蛍光ラテックス粒子であり、上記第二の粒子がラテックス粒子である、[14]から[19]の何れか一に記載のプロゲステロン測定試薬。
[18] The reagent for measuring progesterone according to any one of [14] to [17], wherein the mass ratio of the second particle to the first particle is 1 to 20.
[19] The reagent for measuring progesterone according to any one of [14] to [18], wherein the first binding substance having specific binding property to the progesterone is an antibody.
[20] The reagent for measuring progesterone according to any one of [14] to [19], wherein the first particle having the label is a fluorescent latex particle and the second particle is a latex particle.

本発明のプロゲステロン測定キット、プロゲステロンの測定方法およびプロゲステロン測定試薬によれば、非特異吸着による偽陽性の問題を防止し、発生するノイズの増加を抑え、低濃度から高濃度にわたる広範囲の濃度域においてプロゲステロンの高精度の測定を実現することができる。 According to the progesterone measurement kit, the progesterone measurement method, and the progesterone measurement reagent of the present invention, the problem of false positives due to nonspecific adsorption is prevented, the increase in generated noise is suppressed, and in a wide range of concentrations from low to high concentrations. Highly accurate measurement of progesterone can be realized.

図1は、センサチップの概略図を示す。FIG. 1 shows a schematic view of a sensor chip. 図2は、センサチップの分解図を示す。FIG. 2 shows an exploded view of the sensor chip.

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
本明細書において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を意味する。
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail.
The numerical range indicated by using "~" in the present specification means a range including the numerical values before and after "~" as the minimum value and the maximum value, respectively.

[プロゲステロン測定キット]
本発明によるプロゲステロン測定キットは、
プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
上記第一の粒子及び上記第二の粒子を流すための流路と、
上記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板と、
を含むプロゲステロン測定キットであって、
上記の標識を有する第一の粒子は、本明細書で規定する式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
上記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、上記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ上記第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
キットである。
[Progesterone measurement kit]
The progesterone measurement kit according to the present invention
A labeled first particle modified with a first binding agent that has specific binding to progesterone,
An unlabeled second particle modified with a second binding agent that does not have specific binding to progesterone,
The flow path for flowing the first particle and the second particle, and
A substrate having a substance having a binding property to the first binding substance,
A progesterone measurement kit that contains
The first particle having the above-mentioned label contains at least one compound and particles represented by the formula (1) specified in the present specification.
The average particle size of the first particle is 50 to 250 nm, the average particle size of the second particle is 70 to 500 nm, and the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of the first particle. Large particle size,
It is a kit.

(生体試料)
本発明では、生体試料中のプロゲステロンを測定することができる。
生体試料としては、プロゲステロンを含む可能性のある試料である限り、特に限定されるものではなく、例えば、生物学的試料、特には動物(例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマなど)の体液(例えば、血液、血清、血漿、髄液、涙液、汗、尿、膿、鼻水、又は喀痰)若しくは排泄物(例えば、糞便)、臓器、組織、粘膜や皮膚などを挙げることができる。
(Biological sample)
In the present invention, progesterone in a biological sample can be measured.
The biological sample is not particularly limited as long as it is a sample that may contain progesterone. For example, a biological sample, particularly a body fluid of an animal (for example, human, dog, cat, horse, etc.) (for example, human, dog, cat, horse, etc.) For example, blood, serum, plasma, spinal fluid, tears, sweat, urine, pus, runny nose, or sputum) or excrement (eg, feces), organs, tissues, mucous membranes, skin, and the like can be mentioned.

(プロゲステロン)
プロゲステロンは、卵巣と胎盤から分泌され、黄体機能や妊娠に関係する性ホルモンである。月経の周期異常、不妊症の診断に利用される。また、犬の交配時期、猫の卵巣遺残確認にも使用される。
(Progesterone)
Progesterone is a sex hormone secreted by the ovaries and placenta that is involved in luteal function and pregnancy. It is used to diagnose abnormal menstrual cycles and infertility. It is also used to confirm the mating time of dogs and the residual ovaries of cats.

(粒子)
本発明における粒子(第一の粒子及び第二の粒子)の材質及び形態は特に限定されず、例えば、ポリスチレンビーズなどの有機高分子粒子、又はガラスビーズ等の無機粒子を用いることができる。粒子の材質の具体例としては、スチレン、メタクリル酸、グリシジル(メタ)アクリレート、ブタジエン、塩化ビニル、酢酸ビニルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、フェニルメタクリレート、又はブチルメタクリレートなどのモノマーを重合させたホモポリマー、並びに2種以上のモノマーを重合させたコポリマーなどが挙げられ、上記のホモポリマー又はコポリマーを均一に懸濁させたラテックスでもよい。また、粒子としては、その他の有機高分子粉末、無機物質粉末、微生物、血球、細胞膜片、リポソーム、マイクロカプセルなどが挙げられる。第一の粒子及び第二の粒子としては、ラテックス粒子が好ましい。
(particle)
The material and form of the particles (first particles and second particles) in the present invention are not particularly limited, and for example, organic polymer particles such as polystyrene beads or inorganic particles such as glass beads can be used. Specific examples of particle materials include homopolymers obtained by polymerizing monomers such as styrene, methacrylic acid, glycidyl (meth) acrylate, butadiene, vinyl chloride, vinyl acetate acrylate, methyl methacrylate, ethyl methacrylate, phenyl methacrylate, or butyl methacrylate. , And a copolymer obtained by polymerizing two or more kinds of monomers, and the above homopolymer or a latex in which the copolymer is uniformly suspended may be used. Examples of the particles include other organic polymer powders, inorganic substance powders, microorganisms, blood cells, cell membrane fragments, liposomes, microcapsules and the like. Latex particles are preferable as the first particles and the second particles.

ラテックス粒子を使用する場合、ラテックスの材質の具体例としては、ポリスチレン、スチレン−アクリル酸共重合体、スチレン−メタクリル酸共重合体、スチレン−グリシジル(メタ)アクリレート共重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル酸エステル共重合体、ポリ酢酸ビニルアクリレートなどが挙げられる。ラテックスとしては、単量体としてスチレンを少なくとも含む共重合体が好ましく、スチレンと、アクリル酸又はメタクリル酸との共重合体が特に好ましい。ラテックスの作製方法は特に限定されず、任意の重合方法により作製することができる。但し、本発明の発光性粒子に抗体を標識して使用する場合には、界面活性剤が存在すると抗体固定化が困難となるため、ラテックスの作製には、無乳化剤乳化重合、即ち界面活性剤などの乳化剤を用いない乳化重合が好ましい。 When latex particles are used, specific examples of the material of the latex include polystyrene, styrene-acrylic acid copolymer, styrene-methacrylic acid copolymer, styrene-glycidyl (meth) acrylate copolymer, and styrene-styrene sulfonic acid. Examples thereof include salt copolymers, methacrylic acid polymers, acrylic acid polymers, acrylonitrile-butadiene-styrene copolymers, vinyl chloride-acrylic acid ester copolymers, and polyvinyl acetate acrylates. As the latex, a copolymer containing at least styrene as a monomer is preferable, and a copolymer of styrene and acrylic acid or methacrylic acid is particularly preferable. The method for producing the latex is not particularly limited, and the latex can be produced by any polymerization method. However, when the luminescent particles of the present invention are labeled with an antibody and used, the presence of a surfactant makes it difficult to immobilize the antibody. Therefore, in the production of latex, emulsifier-free emulsion polymerization, that is, a surfactant Emulsion polymerization that does not use an emulsifier such as is preferable.

(第一の結合物質)
本発明で用いる第一の結合物質は、プロゲステロンと特異的な結合性を有する物質である。第一の結合物質としては、抗体を使用できるが、これに限定されるものではない。好ましくは、第一の結合物質は抗体である。第一の結合物質が抗体である場合は、例えば、そのプロゲステロンによって免疫された動物の血清から調製する抗血清や、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、プロゲステロンによって免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)、Fab、Fab’、又はFv]などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清又は培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
(First binding substance)
The first binding substance used in the present invention is a substance having a specific binding property to progesterone. Antibodies can be used, but are not limited to, as the first binding agent. Preferably, the first binding agent is an antibody. When the first binding substance is an antibody, for example, an antiserum prepared from the serum of an animal immunized with the progesterone, an immunoglobulin fraction purified from the antiserum, or a spleen cell of an animal immunized with the progesterone. Monoclonal antibodies obtained by cell fusion using, or fragments thereof [eg, F (ab') 2 , Fab, Fab', or Fv] and the like can be used. Preparation of these antibodies can be carried out by a conventional method. Further, the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody or the like, and a commercially available antibody or an antibody prepared by a known method from animal serum or culture supernatant can be used.

本発明においては、第一の結合物質としては、プロゲステロンと特異的な結合性を有する(好ましくは、プロゲステロンを特異的に認識する)抗プロゲステロン抗体を使用することが好ましい。 In the present invention, as the first binding substance, it is preferable to use an anti-progesterone antibody having specific binding property to progesterone (preferably, which specifically recognizes progesterone).

抗プロゲステロン抗体の作製方法の一つを例に挙げて以下に説明する。
プロゲステロンと、牛血清アルブミン(Bovine Serum Albumin、以下BSAと略す)と、縮合剤を混合してプロゲステロン−BSA結合体を作製することができる。結合体をマウス免疫感作抗原として用いて、数回、マウス背部皮下に免疫する。この場合、完全アジュバント(Complete Freund‘s Adjuvant:CFA)、および/又は不完全アジュバント(Incomplete Freund‘s Adjuvant:IFA)を適宜選択して免疫感作抗原と混合して使用することができる。完全アジュバントとは、免疫を刺激する物質であって、パラフィンとアラセルの混合物である。不完全アジュバントとは、完全アジュバントに死滅したミコバクテリア又は結核菌の死菌を加え、抗原性をさらに増強させたものである。数週間で数回、適宜免疫感作を行った後にマウスから採血し抗体価の測定を実施する。抗体価の十分な上昇が認められた場合に腹腔内に抗原を投与し、数日後に脾臓を摘出する。こうして免疫マウスより摘出した脾臓細胞を、変異株骨髄腫細胞(ミエローマ)と融合させることで、抗体産生能力を備えた融合細胞を作製することができる。この融合細胞の中から目的とする抗原に対する抗体産生細胞のみを選択し、さらにその細胞株だけを増殖するために限界希釈を行う。希釈後の細胞の培養(クローニング)を行うことができる。このようにして得られる融合細胞株を、マウスの腹腔内に注射して、腹水型の抗体産生細胞を増殖させることによってモノクローナル抗体を腹水中に産生することが可能となり、これらの抗体を回収することで、目的の抗体を入手することができる。
One of the methods for producing an anti-progesterone antibody will be described below as an example.
A progesterone-BSA conjugate can be prepared by mixing progesterone, bovine serum albumin (hereinafter abbreviated as BSA), and a condensing agent. The conjugate is used as a mouse immunosensitizing antigen and immunized several times subcutaneously on the back of the mouse. In this case, a complete adjuvant (CFA) and / or an incomplete adjuvant (Incomplete Fluid's Adjuvant: IFA) can be appropriately selected and used in combination with the immunosensitizing antigen. A complete adjuvant is a substance that stimulates immunity and is a mixture of paraffin and alasel. The incomplete adjuvant is one in which dead mycobacterium or tubercle bacillus is added to the complete adjuvant to further enhance the antigenicity. After performing immunosensitization several times in a few weeks, blood is collected from mice and antibody titers are measured. When a sufficient increase in antibody titer is observed, the antigen is administered intraperitoneally, and the spleen is removed several days later. By fusing the spleen cells thus removed from the immune mouse with the mutant myeloma cell (myeloma), a fused cell having an antibody-producing ability can be produced. Only antibody-producing cells against the target antigen are selected from these fusion cells, and limiting dilution is performed to proliferate only the cell line. The diluted cells can be cultured (cloned). By injecting the fusion cell line thus obtained into the abdominal cavity of a mouse and proliferating ascites-type antibody-producing cells, it becomes possible to produce a monoclonal antibody in the ascites, and these antibodies are recovered. By doing so, the target antibody can be obtained.

(標識を有する第一の粒子)
本発明で使用される標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有する粒子であり、標識粒子又は蛍光標識粒子とも表記する。標識を有する第一の粒子は、好ましくはラテックス粒子であり、より好ましくは蛍光ラテックス粒子である。

Figure 0006936383
式(1)中の各記号の意味は、本明細書中に定義した通りである。(First particle with label)
The first particle having a label used in the present invention is a particle containing at least one compound represented by the following formula (1) and a particle, and is also referred to as a labeled particle or a fluorescently labeled particle. The first labeled particles are preferably latex particles, more preferably fluorescent latex particles.
Figure 0006936383
The meaning of each symbol in the formula (1) is as defined in the present specification.

通常の色素化合物は、粒子への取り込み量を増やすと会合の影響を受け、量子収率が低下していくことが知られている(これを濃度消光とも言う)。特に、吸収波長が650nm以上の長波長である蛍光色素化合物は粒子に取り込まれると濃度消光しやすく、量子収率を維持することは困難である。 It is known that when the amount of ordinary dye compounds incorporated into particles is increased, the quantum yield is affected by the association (this is also called concentration quenching). In particular, a fluorescent dye compound having an absorption wavelength of 650 nm or more, which has a long wavelength, is easily quenched when incorporated into particles, and it is difficult to maintain a quantum yield.

本発明で使用する式(1)で示される化合物は、共役系置換基を有することで長波長発光を可能としており、かつ、ジピロメテン骨格に複数の置換基を持たせることによりポリマー粒子中での量子収率の低下を抑制することができる。量子収率低下抑制の要因としては、ジピロメテン骨格に対して垂直方向に張り出す複数の置換基による分子間の相互作用(例えばπ−π相互作用)の抑制が考えられる。式(1)で示される化合物によれば、特に長波長領域において輝度の高い標識を有する第一の粒子(好ましくは蛍光粒子、より好ましくは蛍光ナノ粒子)を製造することができる。なお、標識を有する第一の粒子が蛍光粒子である場合、輝度とは、蛍光強度のことである。本発明によれば、生体の窓の領域(生体を透過しやすい近赤外波長域である650〜900nm付近)で発光量子収率が高いことから、発光を用いたセンシングの感度向上が可能である。 The compound represented by the formula (1) used in the present invention is capable of long-wavelength emission by having a conjugated substituent, and has a plurality of substituents in the dipyrromethene skeleton in the polymer particles. The decrease in quantum yield can be suppressed. As a factor for suppressing the decrease in quantum yield, it is considered that the interaction between molecules (for example, π-π interaction) due to a plurality of substituents extending in the direction perpendicular to the dipyrromethene skeleton is suppressed. According to the compound represented by the formula (1), first particles (preferably fluorescent particles, more preferably fluorescent nanoparticles) having a label having high brightness can be produced particularly in a long wavelength region. When the first particle having a label is a fluorescent particle, the brightness means the fluorescence intensity. According to the present invention, since the emission quantum yield is high in the window region of the living body (around 650 to 900 nm, which is a near-infrared wavelength region that easily transmits the living body), it is possible to improve the sensitivity of sensing using light emission. be.

本明細書において、アルキル基とは、直鎖、分岐鎖、環状又はこれらの組み合わせの何れでもよく、直鎖又は分岐鎖アルキル基の炭素数は好ましくは1〜36であり、より好ましくは1〜18であり、さらに好ましくは1〜12であり、特に好ましくは1〜6である。環状のアルキル基としては、例えば炭素数3〜8のシクロアルキルなどが挙げられる。アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、iso−ブチル基、sec−ブチル基、t−ブチル基、n−ペンチル基、n−ヘキシル基、n−ヘプチル基、n−オクチル基、n−ノニル基、n−デシル基、n−ウンデシル基、n−ドデシル基、n−トリデシル基、n−テトラデシル基、n−ペンタデシル基、n−ヘキサデシル基、n−ヘプタデシル基、n−オクタデシル基、及びシクロヘキシル基などが挙げられる。 In the present specification, the alkyl group may be a linear group, a branched chain, a cyclic group, or a combination thereof, and the straight chain or branched chain alkyl group preferably has 1 to 36 carbon atoms, more preferably 1 to 36 carbon atoms. It is 18, more preferably 1 to 12, and particularly preferably 1 to 6. Examples of the cyclic alkyl group include cycloalkyl having 3 to 8 carbon atoms. Specific examples of the alkyl group include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, iso-butyl group, sec-butyl group, t-butyl group, n-pentyl group and n-hexyl. Group, n-heptyl group, n-octyl group, n-nonyl group, n-decyl group, n-undecyl group, n-dodecyl group, n-tridecyl group, n-tetradecyl group, n-pentadecyl group, n-hexadecyl group. Examples include a group, an n-heptadecyl group, an n-octadecyl group, a cyclohexyl group and the like.

本明細書において、アリール基とは、炭素数が6〜48のアリール基が好ましく、炭素数が6〜24のアリール基がより好ましく、炭素数が6〜14のアリール基がさらに好ましく、例えば、フェニル基、ナフチル基、アントリル基、ピレニル基、フェナントレニル基、ビフェニル基、フルオレニル基などが挙げられる。 In the present specification, the aryl group is preferably an aryl group having 6 to 48 carbon atoms, more preferably an aryl group having 6 to 24 carbon atoms, and further preferably an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, for example. Examples thereof include a phenyl group, a naphthyl group, an aryl group, a pyrenyl group, a phenanthrenyl group, a biphenyl group and a fluorenyl group.

本明細書において、ヘテロ環基としては、好ましくは5〜7員の置換もしくは無置換、飽和もしくは不飽和、芳香族もしくは非芳香族、単環もしくは縮環のヘテロ環基の何れでもよい。ヘテロ環基は、好ましくは、環構成原子が炭素原子、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択され、かつ窒素原子、酸素原子及び硫黄原子の何れかのヘテロ原子を少なくとも一個有するヘテロ環基であり、さらに好ましくは、炭素数3〜30の5もしくは6員の芳香族のヘテロ環基である。ヘテロ環基としては、例えば、フリル基、ベンゾフリル基、ジベンゾフリル基、チエニル基、ベンゾチエニル基、ジベンゾチエニル基、ピリジル基、ピリミジニル基、キノリル基、イソキノリル基、アクリジニル基、フェナントリジニル基、プテリジニル基、ピラジニル基、キノキサリニル基、ピリミジニル基、キナゾリル基、ピリダジニル基、シンノリニル基、フタラジニル基、トリアジニル基、オキサゾリル基、ベンゾオキサゾリル基、チアゾリル基、ベンゾチアゾリル基、イミダゾリル基、ベンゾイミダゾリル基、ピラゾリル基、インダゾリル基、イソオキサゾリル基、ベンゾイソオキサゾリル基、イソチアゾリル基、ベンゾイソチアゾリル基、オキサジアゾリル基、チアジアゾリル基、トリアゾリル基、テトラゾリル基、フリル基、チエニル基、ピロリル基、インドリル基、イミダゾピリジニル基、カルバゾリル基等が挙げられる。 In the present specification, the heterocyclic group is preferably any of a 5- to 7-membered substituted or unsubstituted, saturated or unsaturated, aromatic or non-aromatic, monocyclic or condensed heterocyclic group. The heterocyclic group is preferably a heterocyclic group in which the ring-constituting atom is selected from a carbon atom, a nitrogen atom, an oxygen atom and a sulfur atom, and has at least one heteroatom of any one of the nitrogen atom, the oxygen atom and the sulfur atom. Yes, more preferably a 5- or 6-membered aromatic heterocyclic group having 3 to 30 carbon atoms. Examples of the heterocyclic group include a frill group, a benzofuryl group, a dibenzofuryl group, a thienyl group, a benzothienyl group, a dibenzothienyl group, a pyridyl group, a pyrimidinyl group, a quinolyl group, an isoquinolyl group, an acridinyl group and a phenanthridinyl group. Pteridinyl group, pyrazinyl group, quinoxalinyl group, pyrimidinyl group, quinazolyl group, pyridazinyl group, cinnolinyl group, phthalazinyl group, triazinyl group, oxazolyl group, benzoxazolyl group, thiazolyl group, benzothiazolyl group, imidazolyl group, benzoimidazolyl group, pyrazolyl group , Indazolyl group, isooxazolyl group, benzoisooxazolyl group, isothiazolyl group, benzoisothiazolyl group, oxadiazolyl group, thiadiazolyl group, triazolyl group, tetrazolyl group, furyl group, thienyl group, pyrrolyl group, indolyl group, imidazoly pyridini Examples thereof include a ru group and a carbazolyl group.

本明細書において、アシル基としては、好ましくは炭素数2〜15の直鎖、又は分岐アルカノイル基であり、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、ヘプタノイル基、ベンゾイル基などが挙げられる。 In the present specification, the acyl group is preferably a linear or branched alkanoyl group having 2 to 15 carbon atoms, and is, for example, an acetyl group, a propionyl group, a butyryl group, an isobutyryl group, a valeryl group, an isovaleryl group, or a pivaloyl group. , Hexanoyl group, heptanoyle group, benzoyl group and the like.

本明細書において、アルコキシ基としては、好ましくは、炭素数1〜20のアルコキシ基であり、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、n−ブトキシ基、ペンチルオキシ基、ヘキシルオキシ基、ヘプチルオキシ基などが挙げられる。
本明細書において、アリールオキシ基としては、好ましくは炭素数6〜14のアリールオキシ基であり、例えば、フェノキシ基、ナフトキシ基、アントリルオキシ基などが挙げられる。
In the present specification, the alkoxy group is preferably an alkoxy group having 1 to 20 carbon atoms, for example, a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, an n-butoxy group, a pentyloxy group, a hexyloxy group, and a heptyloxy group. The group and the like can be mentioned.
In the present specification, the aryloxy group is preferably an aryloxy group having 6 to 14 carbon atoms, and examples thereof include a phenoxy group, a naphthoxy group, and an anthryloxy group.

アルキルチオ基としては、好ましくは、炭素数1から30のアルキルチオ基であり、例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、n−ヘキサデシルチオ基等が挙げられる。
アリールチオ基としては、好ましくは、炭素数6から30のアリールチオ基であり、例えば、フェニルチオ基、p−クロロフェニルチオ基、m−メトキシフェニルチオ基等が挙げられる。
The alkylthio group is preferably an alkylthio group having 1 to 30 carbon atoms, and examples thereof include a methylthio group, an ethylthio group, an n-hexadecylthio group and the like.
The arylthio group is preferably an arylthio group having 6 to 30 carbon atoms, and examples thereof include a phenylthio group, a p-chlorophenylthio group, and an m-methoxyphenylthio group.

本明細書において、ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子が挙げられる。 In the present specification, examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom.

本明細書において、芳香環とは、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナンスレン環、ピレン環、ペリレン環及びテリレン環等の芳香族炭化水素環;インデン環、アズレン環、ピリジン環、ピラジン環、ピリミジン環、ピラゾール環、ピラゾリジン環、チアゾリジン環、オキサゾリジン環、ピラン環、クロメン環、ピロール環、ピロリジン環、ベンゾイミダゾール環、イミダゾリン環、イミダゾリジン環、イミダゾール環、ピラゾール環、トリアゾール環、トリアジン環、ジアゾール環、インドリン環、チオフェン環、チエノチオフェン環、フラン環、オキサゾール環、オキサジアゾール環、チアジン環、チアゾール環、インドール環、ベンゾチアゾール環、ベンゾチアジアゾール環、ナフトチアゾール環、ベンゾオキサゾール環、ナフトオキサゾール環、インドレニン環、ベンゾインドレニン環、ピラジン環、キノリン環及びキナゾリン環等の芳香族ヘテロ環;並びにフルオレン環及びカルバゾール環等の縮合型芳香環等が挙げられ、炭素数5〜16の芳香環(芳香環及び芳香環を含む縮合環)が好ましい。
なお、芳香環は置換基を有していてもよく、「芳香環」との用語は、置換基を有する芳香環、及び置換基を有さない芳香環の両方を意味する。芳香環が有する置換基としては、後記する置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
In the present specification, the aromatic ring refers to an aromatic hydrocarbon ring such as a benzene ring, a naphthalene ring, an anthracene ring, a phenanthrene ring, a pyrene ring, a perylene ring and a terylene ring; an inden ring, an azulene ring, a pyridine ring, a pyrazine ring, and the like. Pyrimidine ring, pyrazole ring, pyrazolidine ring, thiazolidine ring, oxazolidine ring, pyran ring, chromium ring, pyrrole ring, pyrrolidine ring, benzoimidazoline ring, imidazoline ring, imidazoline ring, imidazoline ring, pyrazole ring, triazole ring, triazine ring, Diazole ring, indolin ring, thiophene ring, thienothiophene ring, furan ring, oxazole ring, oxadiazole ring, thiazine ring, thiazole ring, indole ring, benzothiazole ring, benzothiazol ring, naphthozole ring, benzoxazole ring, naphtho Aromatic heterocycles such as oxazole ring, indorenin ring, benzoindrenin ring, pyrazine ring, quinoline ring and quinazoline ring; and condensed aromatic rings such as fluorene ring and carbazole ring, etc., which have 5 to 16 carbon atoms. Aromatic rings (condensed rings containing aromatic rings and aromatic rings) are preferable.
The aromatic ring may have a substituent, and the term "aromatic ring" means both an aromatic ring having a substituent and an aromatic ring having no substituent. Examples of the substituent contained in the aromatic ring include the substituents described in Substituent Group A described later.

本明細書において、アミノ基としては、アミノ基;モノ又はジメチルアミノ基、モノ又はジエチルアミノ基並びにモノ又はジ(n−プロピル)アミノ基等のアルキル置換アミノ基;モノ又はジフェニルアミノ基並びにモノ又はジナフチルアミノ基等の芳香族残基で置換されたアミノ基;モノアルキルモノフェニルアミノ基等のアルキル基と芳香族残基が一つずつ置換したアミノ基;ベンジルアミノ基、アセチルアミノ基、フェニルアセチルアミノ基等が挙げられる。ここで芳香族残基とは、芳香環から水素原子1個を除いた基を意味し、芳香環は本明細書中上記した通りである。 As used herein, the amino group includes an amino group; a mono or dimethylamino group, a mono or diethylamino group and an alkyl substituted amino group such as a mono or di (n-propyl) amino group; a mono or diphenylamino group and a mono or diphenyl group. Amino groups substituted with aromatic residues such as naphthylamino groups; Amino groups substituted one by one with alkyl groups such as monoalkyl monophenylamino groups; benzylamino groups, acetylamino groups, phenylacetyl Amino groups and the like can be mentioned. Here, the aromatic residue means a group obtained by removing one hydrogen atom from the aromatic ring, and the aromatic ring is as described above in the present specification.

11〜R15が表すアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基は、置換基を有していてもよく、上記置換基としては、下記の置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。The alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, or arylthio group represented by R 11 to R 15 has a substituent. Examples of the substituent include the substituents described in the following substituent group A.

置換基群A:
スルファモイル基、シアノ基、イソシアノ基、チオシアナト基、イソチオシアナト基、ニトロ基、ニトロシル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、アミノ基、メルカプト基、アミド基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、カルバモイル基、アシル基、アルデヒド基、カルボニル基、アリール基、アルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基、エテニル基、エチニル基、シリル基、及びトリアルキルシリル基(トリメチルシリル基等)。
Substituent group A:
Sulfamoyl group, cyano group, isocyano group, thiocyanato group, isothiocyanato group, nitro group, nitrosyl group, halogen atom, hydroxy group, amino group, mercapto group, amide group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, carbamoyl Group, acyl group, aldehyde group, carbonyl group, aryl group, alkyl group, alkyl group substituted with halogen atom, ethenyl group, ethynyl group, silyl group, and trialkylsilyl group (trimethylsilyl group, etc.).

及びXが表すアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基は、置換基を有していてもよく、上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。The alkyl group, aryl group, heterocyclic group, hydroxy group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, ethenyl group, or ethynyl group represented by X 1 and X 2 may have a substituent. As the above-mentioned substituent, the substituent described in the substituent group A can be mentioned.

Ar及びArが表すアリール基又はヘテロ環基は、置換基を有していてもよく、上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
111〜R116が表すアルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基は、置換基を有していてもよく、上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
The aryl group or heterocyclic group represented by Ar 1 and Ar 2 may have a substituent, and examples of the above-mentioned substituent include the substituents described in the substituent group A.
The alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, or arylthio group represented by R 111 to R 116 has a substituent. The substituent may include the substituent described in the substituent group A.

<式(1)で示される化合物>
式(1)中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表し、好ましくはR11〜R15のうち少なくとも4つは水素原子以外の原子又は基を表し、より好ましくはR11〜R15の全てが水素原子以外の原子又は基を表す。
<Compound represented by formula (1)>
In the formula (1), R 11 to R 15 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group and aryloxy group. , Alkylthio group, or arylthio group, which may have a substituent. At least three of R 11 to R 15 represent atoms or groups other than hydrogen atoms, preferably at least four of R 11 to R 15 represent atoms or groups other than hydrogen atoms, and more preferably R 11 to R 15. All of R 15 represent an atom or group other than a hydrogen atom.

11及びR15は、同一の又は異なる原子又は基でもよいが、好ましくは同一の原子又は基である。R12及びR14は、同一の又は異なる原子又は基でもよいが、好ましくは同一の原子又は基である。
11及びR15は、好ましくは、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
12及びR14は、好ましくは、アルキル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
13は、好ましくは、アリール基を表し、これは置換基を有していてもよい。
R 11 and R 15 may be the same or different atoms or groups, but are preferably the same atom or group. R 12 and R 14 may be the same or different atoms or groups, but are preferably the same atom or group.
R 11 and R 15 preferably represent a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, or an ethynyl group, which may have a substituent.
R 12 and R 14 preferably represent alkyl groups, which may have substituents.
R 13 preferably represents an aryl group, which may have a substituent.

式(1)中、X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。
及びXは、好ましくは、ハロゲン原子、又はアルコキシ基を表す。X及びXは、フッ素原子、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、t−ブチルオキシ基であることがより好ましく、これらはフッ素原子、アルコキシ基によって置換されていることも好ましい。
In formula (1), X 1 and X 2 are independently halogen atoms, alkyl groups, aryl groups, heterocyclic groups, hydroxy groups, alkoxy groups, aryloxy groups, alkylthio groups, arylthio groups, ethenyl groups, or ethynyl groups. Representing groups, they may have substituents and X 1 and X 2 may be linked to each other to form a ring.
X 1 and X 2 preferably represent a halogen atom or an alkoxy group. It is more preferable that X 1 and X 2 are a fluorine atom, a methoxy group, an ethoxy group, an isopropyloxy group, and a t-butyloxy group, and it is also preferable that these are substituted with a fluorine atom and an alkoxy group.

式(1)中、Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。In formula (1), Ar 1 and Ar 2 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent.

式(1)中、L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。

Figure 0006936383
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
及びLは、好ましくは、式(L−1)又は式(L−2)の何れかを表し、より好ましくは式(L−1)を表す。
111〜R116は、好ましくは水素原子である。In the formula (1), L 1 and L 2 independently represent any of the formulas (L-1) to (L-4).
Figure 0006936383
In the formula, R 111 to R 116 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group, respectively. , Or arylthio groups, which may have substituents. A represents -O-, -S-, or -NH-.
L 1 and L 2 preferably represent either the formula (L-1) or the formula (L-2), and more preferably the formula (L-1).
R 111 to R 116 are preferably hydrogen atoms.

<式(2)で示される化合物について>
式(1)で示される化合物の好ましい例としては、下記式(2)で示される化合物が挙げられる。

Figure 0006936383
式中、R11〜R15、X、X、Ar及びArは式(1)における定義と同義であり、好ましい範囲も、式(1)における好ましい範囲と同じである。L21及びL22はそれぞれ独立に、式(L−1)又は式(L−2)で表される基を表わす。L21及びL22は、好ましくは式(L−1)で表される基を表わす。
Figure 0006936383
<About the compound represented by the formula (2)>
Preferred examples of the compound represented by the formula (1) include a compound represented by the following formula (2).
Figure 0006936383
In the formula, R 11 to R 15 , X 1 , X 2 , Ar 1 and Ar 2 are synonymous with the definition in the formula (1), and the preferable range is also the same as the preferable range in the formula (1). L 21 and L 22 each independently represent a group represented by the formula (L-1) or the formula (L-2). L 21 and L 22 preferably represent a group represented by the formula (L-1).
Figure 0006936383

<式(3)で示される化合物について>
式(1)で示される化合物の好ましい例としては、下記式(3)で示される化合物が挙げられる。

Figure 0006936383
<About the compound represented by the formula (3)>
Preferred examples of the compound represented by the formula (1) include a compound represented by the following formula (3).
Figure 0006936383

式(3)中、R11、R12、R14、R15、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、好ましい範囲も、式(1)における好ましい範囲と同じである。但し、R11、R12、R14及びR15の少なくとも2つは水素原子以外の原子又は基であり、好ましくは、R11、R12、R14及びR15の少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基であり、より好ましくは、R11、R12、R14及びR15は、水素原子以外の原子又は基である。In formula (3), R 11 , R 12 , R 14 , R 15 , X 1 , X 2 , Ar 1 , Ar 2 , L 1 and L 2 are synonymous with the definitions in formula (1) and are in a preferable range. Is the same as the preferable range in the formula (1). However, at least two of R 11 , R 12 , R 14 and R 15 are atoms or groups other than hydrogen atoms, and preferably at least three of R 11 , R 12 , R 14 and R 15 are other than hydrogen atoms. Of, and more preferably, R 11 , R 12 , R 14 and R 15 are atoms or groups other than hydrogen atoms.

式(3)中、R31〜R35はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、シアノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基(上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる)を有していてもよく、R31、R32、R34及びR35のいずれか一つは2原子以上からなる基である。2原子以上からなる基としては、アルキル基、アリール基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、シアノ基、アルコキシ基が好ましく、アルキル基がより好ましい。アルキル基の中でも、炭素原子と水素原子のみで構成されるアルキル基、ハロゲン原子で置換されたアルキル基が好ましく、炭素数1〜6の炭素原子と水素原子のみで構成されるアルキル基、フッ素原子で置換されたアルキル基がより好ましく、メチル基、イソプロピル基、t−ブチル基、トリフルオロメチル基がさらに好ましく、メチル基が特に好ましい。In formula (3), R 31 to R 35 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, cyano group, acyl group, alkoxy group, respectively. It represents an aryloxy group, an alkylthio group, or an arylthio group, and these may have a substituent (the above-mentioned substituent includes the substituent described in the substituent group A), and R 31 and R 32. , R 34 and R 35 are groups consisting of two or more atoms. As the group composed of two or more atoms, an alkyl group, an aryl group, an ethenyl group, an ethynyl group, an amino group, a cyano group and an alkoxy group are preferable, and an alkyl group is more preferable. Among the alkyl groups, an alkyl group composed of only a carbon atom and a hydrogen atom and an alkyl group substituted with a halogen atom are preferable, and an alkyl group and a fluorine atom composed of only carbon atoms having 1 to 6 carbon atoms and a hydrogen atom are preferable. Alkyl groups substituted with are more preferable, methyl groups, isopropyl groups, t-butyl groups and trifluoromethyl groups are even more preferable, and methyl groups are particularly preferable.

<式(4)で示される化合物について>
式(1)で示される化合物の好ましい例としては、下記式(4)で示される化合物が挙げられる。

Figure 0006936383
式(4)中、R12、R13、R14、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、好ましい範囲も、式(1)における好ましい範囲と同じである。但し、R12、R13及びR14の少なくとも1つは水素原子以外の原子又は基であり、好ましくは、R12、R13及びR14の少なくとも2つは水素原子以外の原子又は基であり、より好ましくは、R12、R13及びR14は水素原子以外の原子又は基である。
式(4)中、R41及びR42はそれぞれ独立に、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。R41及びR42はそれぞれ独立に、アリール基、エテニル基、又はエチニル基であることが好ましく、量子収率向上の観点からは、アリール基が好ましく、長波長化の観点からは、エテニル基、エチニル基であることが好ましい。アリール基である場合、アリール基のオルト位又はメタ位に少なくとも一つ置換基を有していることが好ましく、オルト位に少なくとも一つ置換基を有していることがより好ましい。アリール基に置換する置換基の数は、1〜3つが好ましく、2つ又は3つがより好ましい。アリール基に置換する置換基としては、アルキル基であることが好ましく、メチル基、イソプロピル基、t−ブチル基であることがより好ましく、メチル基であることがさらに好ましい。<About the compound represented by the formula (4)>
Preferred examples of the compound represented by the formula (1) include a compound represented by the following formula (4).
Figure 0006936383
In the formula (4), R 12 , R 13 , R 14 , X 1 , X 2 , Ar 1 , Ar 2 , L 1 and L 2 are synonymous with the definitions in the formula (1), and the preferable range is also the formula. It is the same as the preferable range in (1). However, at least one of R 12 , R 13 and R 14 is an atom or group other than a hydrogen atom, and preferably at least two of R 12 , R 13 and R 14 are atoms or groups other than a hydrogen atom. , More preferably, R 12 , R 13 and R 14 are atoms or groups other than hydrogen atoms.
In formula (4), R 41 and R 42 each independently represent an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, or an ethynyl group, which may have a substituent. Examples of the substituent include the substituents described in the substituent group A. Each of R 41 and R 42 is preferably an aryl group, an ethenyl group, or an ethynyl group independently, an aryl group is preferable from the viewpoint of improving the quantum yield, and an ethenyl group is preferable from the viewpoint of lengthening the wavelength. It is preferably an ethynyl group. In the case of an aryl group, it is preferable to have at least one substituent at the ortho-position or meta-position of the aryl group, and it is more preferable to have at least one substituent at the ortho-position. The number of substituents substituted with the aryl group is preferably 1 to 3, more preferably 2 or 3. The substituent to be substituted with the aryl group is preferably an alkyl group, more preferably a methyl group, an isopropyl group, or a t-butyl group, and even more preferably a methyl group.

<式(5)で示される化合物について>
式(1)で示される化合物の好ましい例としては、下記式(5)で示される化合物が挙げられる。

Figure 0006936383
<About the compound represented by the formula (5)>
Preferred examples of the compound represented by the formula (1) include a compound represented by the following formula (5).
Figure 0006936383

式(5)中、R11〜R15、X、X、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、好ましい範囲も、式(1)における好ましい範囲と同じである。In the formula (5), R 11 to R 15 , X 1 , X 2 , L 1 and L 2 are synonymous with the definitions in the formula (1), and the preferable range is also the same as the preferable range in the formula (1). be.

式(5)中、R51及びR52はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。R51及びR52はそれぞれ独立に、アルキル基、アルコキシ基であることが好ましく、量子収率向上の観点では、アルキル基であることがより好ましく、メチル基、エチル基、イソプロピル基、t−ブチル基であることがさらに好ましく、メチル基であることが特に好ましい。長波長化の観点では、アルコキシ基であることがより好ましく、メトキシ基、エトキシ基、イソプロピルオキシ基、t−ブチルオキシ基であることがさらに好ましく、メトキシ基であることが特に好ましい。In formula (5), R 51 and R 52 independently represent an alkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an amino group, an acyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, or an arylthio group, respectively. It may have a substituent. Examples of the substituent include the substituents described in the substituent group A. R 51 and R 52 are preferably alkyl groups and alkoxy groups, respectively, and are more preferably alkyl groups from the viewpoint of improving quantum yield, and are methyl group, ethyl group, isopropyl group, and t-butyl. It is more preferably a group, and particularly preferably a methyl group. From the viewpoint of lengthening the wavelength, an alkoxy group is more preferable, a methoxy group, an ethoxy group, an isopropyloxy group, and a t-butyloxy group are more preferable, and a methoxy group is particularly preferable.

及びQはそれぞれ独立に、芳香族炭化水素環又は芳香族ヘテロ環を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。Q及びQは、芳香族炭化水素環であることが好ましく、ベンゼン環、ナフタレン環、アントラセン環、フェナンスレン環、ピレン環であることがより好ましく、ベンゼン環、ナフタレン環であることがさらに好ましく、ベンゼン環であることが特に好ましい。R51を含みQを形成する基、及び、R52を含みQを形成する基としては、トリル基、キシリル基、メシチル基が好ましく、キシリル基、メシチル基であることがより好ましく、LあるいはLとの結合位置に対してオルト位の両方にメチル基を有するキシリル基、LあるいはLとの結合位置に対してオルト位の両方及びパラ位にメチル基を有するメシチル基であることがさらに好ましく、LあるいはLとの結合位置に対してオルト位の両方及びパラ位にメチル基を有するメシチル基であることが特に好ましい。Q 1 and Q 2 each independently represent an aromatic hydrocarbon ring or aromatic hetero ring, which may have a substituent. Examples of the substituent include the substituents described in the substituent group A. Q 1 and Q 2 is preferably an aromatic hydrocarbon ring, a benzene ring, a naphthalene ring, anthracene ring, phenanthrene ring, more preferably a pyrene ring, a benzene ring, it is a naphthalene ring and more preferably , A benzene ring is particularly preferable. The group containing R 51 and forming Q 1 and the group containing R 52 and forming Q 2 are preferably a tolyl group, a xsilyl group and a mesityl group, more preferably a xsilyl group and a mesityl group, and L. 1 or xylyl group having a methyl group at both ortho position with respect to the binding position with the L 2, with a mesityl group having a methyl group at both ortho and para position with respect to the binding position with the L 1 or L 2 It is more preferable to have a mesityl group having a methyl group at both the ortho position and the para position with respect to the bond position with L 1 or L 2.

<式(6)で示される化合物について>
式(5)で示される化合物は、下記式(6)で示される化合物であることがより好ましい。

Figure 0006936383
式中、R11、R12、R14及びR15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11、R12、R14及びR15の少なくとも2つは水素原子以外の原子又は基である。
及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。
31〜R35はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、シアノ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R31〜R35のいずれか一つは水素原子である。
51及びR52はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
及びQはそれぞれ独立に、芳香族炭化水素環又は芳香族ヘテロ環を表し、これらは置換基を有していてもよい。
及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 0006936383
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。<About the compound represented by the formula (6)>
The compound represented by the formula (5) is more preferably the compound represented by the following formula (6).
Figure 0006936383
In the formula, R 11 , R 12 , R 14 and R 15 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, respectively. Representing an aryloxy group, an alkylthio group, or an arylthio group, which may have a substituent , at least two of R 11 , R 12 , R 14 and R 15 are atoms or groups other than hydrogen atoms. ..
X 1 and X 2 independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, a hydroxy group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an ethenyl group, or an ethynyl group. It may have a substituent and X 1 and X 2 may be linked to each other to form a ring.
R 31 to R 35 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, cyano group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group. , Or an arylthio group, which may have a substituent, and any one of R 31 to R 35 is a hydrogen atom.
R 51 and R 52 each independently represent an alkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an amino group, an acyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, or an arylthio group, and these have a substituent. You may.
Q 1 and Q 2 each independently represent an aromatic hydrocarbon ring or aromatic hetero ring, which may have a substituent.
L 1 and L 2 independently represent any of the formulas (L-1) to (L-4).
Figure 0006936383
In the formula, R 111 to R 116 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group, respectively. , Or arylthio groups, which may have substituents. A represents -O-, -S-, or -NH-.

11及びR15はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基であることが好ましく、上記R41及びR42と同義であること、すなわち、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、又はエチニル基であることがより好ましく、アリール基、エテニル基、エチニル基であることがさらに好ましい。量子収率向上の観点からは、アリール基がより好ましく、長波長化の観点からは、エテニル基、エチニル基であることがより好ましい。アリール基である場合、アリール基のオルト位又はメタ位に少なくとも一つ置換基を有していることが好ましく、オルト位に少なくとも一つ置換基を有していることがより好ましい。アリール基に置換する置換基の数は、1〜3つが好ましく、2つ又は3つがより好ましい。アリール基に置換する置換基としては、アルキル基であることが好ましく、メチル基、イソプロピル基、t−ブチル基であることがより好ましく、メチル基であることがさらに好ましい。R 11 and R 15 are preferably alkyl groups, aryl groups, heterocyclic groups, ethenyl groups, ethynyl groups, and amino groups, respectively, and are synonymous with R 41 and R 42 , that is, aryl groups. , Heterocyclic group, ethenyl group, or ethynyl group is more preferable, and aryl group, ethenyl group, ethynyl group is further preferable. From the viewpoint of improving the quantum yield, an aryl group is more preferable, and from the viewpoint of lengthening the wavelength, an ethenyl group and an ethynyl group are more preferable. In the case of an aryl group, it is preferable to have at least one substituent at the ortho-position or meta-position of the aryl group, and it is more preferable to have at least one substituent at the ortho-position. The number of substituents substituted with the aryl group is preferably 1 to 3, more preferably 2 or 3. The substituent to be substituted with the aryl group is preferably an alkyl group, more preferably a methyl group, an isopropyl group, or a t-butyl group, and even more preferably a methyl group.

<式(1)〜式(6)で示される化合物の具体例>
式(1)〜式(6)で示される化合物の具体例を以下に記載する。Meはメチル基を示し、Etはエチル基を示し、iPrはイソプロピル基を示す。
<Specific examples of compounds represented by formulas (1) to (6)>
Specific examples of the compounds represented by the formulas (1) to (6) are described below. Me indicates a methyl group, Et indicates an ethyl group, and iPr indicates an isopropyl group.

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

標識粒子は、少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する標識粒子であってもよく、その場合、上記エネルギードナー化合物及び上記エネルギーアクセプター化合物の少なくとも一種が、上記式(1)で示される化合物であればよい。 The labeled particles may be labeled particles containing at least one energy donor compound, at least one energy acceptor compound, and particles, in which case at least one of the energy donor compound and the energy acceptor compound. However, any compound represented by the above formula (1) may be used.

本発明の別の例においては、発光性粒子は、エネルギードナー化合物及びエネルギーアクセプター化合物の何れか一方として、式(1)で示される化合物を含有し、エネルギードナー化合物及びエネルギーアクセプター化合物の何れか他方として、後記する式(10)で示される化合物を含有する。即ち、発光性粒子としては、エネルギードナー化合物として式(1)で示される化合物を含有し、エネルギーアクセプター化合物として式(10)で示される化合物を含有する発光性粒子でもよいし、エネルギーアクセプター化合物として式(1)で示される化合物を含有し、エネルギードナー化合物として式(10)で示される化合物を含有する発光性粒子でもよい。 In another example of the present invention, the luminescent particle contains a compound represented by the formula (1) as either an energy donor compound or an energy acceptor compound, and is either an energy donor compound or an energy acceptor compound. On the other hand, it contains a compound represented by the formula (10) described later. That is, the luminescent particles may be luminescent particles containing the compound represented by the formula (1) as the energy donor compound and the compound represented by the formula (10) as the energy acceptor compound, or the energy acceptor. Luminescent particles containing the compound represented by the formula (1) as the compound and the compound represented by the formula (10) as the energy donor compound may be used.

<式(10)で示される化合物>

Figure 0006936383
<Compound represented by formula (10)>
Figure 0006936383

式(10)中、m1及びm2はそれぞれ独立に0〜4の整数を表し、m1及びm2の何れかは少なくとも1以上である。Mは半金属原子又は金属原子を表す。R、R及びRはそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Y及びYはそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Y及びYは互いに連結して環を形成してもよい。Ar11及びAr12はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。Z及びZはそれぞれ独立にアリール基、ヘテロ環基又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。m1が2以上である場合、複数のZは同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、m2が2以上である場合、複数のZは同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。In the formula (10), m1 and m2 each independently represent an integer of 0 to 4, and any one of m1 and m2 is at least 1 or more. M represents a metalloid atom or a metal atom. R 1 , R 2 and R 3 independently represent a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, an acyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group or an arylthio group. These may have substituents. Y 1 and Y 2 independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, a hydroxy group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an ethenyl group, or an ethynyl group, which are substituted. It may have a group, and Y 1 and Y 2 may be connected to each other to form a ring. Ar 11 and Ar 12 each independently represent an aromatic ring which may have a substituent. Z 1 and Z 2 each independently represent an aryl group, a heterocyclic group or an amino group, which may have a substituent. If m1 is 2 or more, a plurality of Z 1 may be different each be the same group group, when m2 is 2 or more, a plurality of Z 2 may each be the same group different groups.

式(10)中、m1及びm2はそれぞれ独立に0〜4の整数を表し、好ましくは、m1及びm2は共に1以上である。m1及びm2は同一でも異なる整数でもよいが、好ましくは同一の整数である。好ましくは、m1及びm2はそれぞれ独立に1又は2であり、より好ましくは、m1及びm2は共に1又は共に2であり、特に好ましくはm1及びm2は共に1である。 In the formula (10), m1 and m2 each independently represent an integer of 0 to 4, and preferably m1 and m2 are both 1 or more. m1 and m2 may be the same or different integers, but are preferably the same integer. Preferably, m1 and m2 are independently 1 or 2, respectively, more preferably m1 and m2 are both 1 or both, and particularly preferably m1 and m2 are both 1.

式(10)中、Mは半金属原子又は金属原子を表し、好ましくは半金属原子を表し、特に好ましくは、ホウ素原子を示す。 In formula (10), M represents a metalloid atom or a metal atom, preferably a metalloid atom, and particularly preferably a boron atom.

式(10)中、R、R及びRはそれぞれ独立に水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、R及びRはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
及びRはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
及びRは、連結して環を形成することはない。
好ましくは、Rは、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。より好ましくは、Rは、水素原子である。
In formula (10), R 1 , R 2 and R 3 are independently hydrogen atoms, alkyl groups, aryl groups, heterocyclic groups, ethenyl groups, ethynyl groups, acyl groups, alkoxy groups, aryloxy groups, alkylthio groups, respectively. Alternatively, it represents an arylthio group, which may have a substituent.
Preferably, R 1 and R 2 are independently aryl groups or heterocyclic groups, which may have substituents.
R 1 and R 2 may be the same or different, but are preferably the same.
R 1 and R 2 do not connect to form a ring.
Preferably, R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent. More preferably, R 3 is a hydrogen atom.

式(10)中、Y及びYはそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Y及びYは互いに連結して環を形成してもよい。
好ましくは、Y及びYはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、又はアリールオキシ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、Y及びYは互いに連結して環を形成してもよい。
より好ましくは、Y及びYはそれぞれ独立に、ハロゲン原子である。
さらに好ましくは、Y及びYはフッ素原子である。
及びYはそれぞれ同一でも異なっていてもよいが、好ましくは同一である。
In formula (10), Y 1 and Y 2 are independently halogen atoms, alkyl groups, aryl groups, heterocyclic groups, hydroxy groups, alkoxy groups, aryloxy groups, alkylthio groups, arylthio groups, ethenyl groups, or ethynyl groups, respectively. These may have substituents, and Y 1 and Y 2 may be linked to each other to form a ring.
Preferably, Y 1 and Y 2 independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a hydroxy group, an alkoxy group, or an aryloxy group, which may have a substituent, Y 1 and Y 2. Y 2 may be connected to each other to form a ring.
More preferably, Y 1 and Y 2 are independent halogen atoms.
More preferably, Y 1 and Y 2 are fluorine atoms.
Y 1 and Y 2 may be the same or different, but are preferably the same.

式(10)中、Ar11及びAr12はそれぞれ独立に、置換基を有していてもよい芳香環を表す。
好ましくは、Ar11及びAr12はベンゼン環を表す。
In formula (10), Ar 11 and Ar 12 each independently represent an aromatic ring which may have a substituent.
Preferably, Ar 11 and Ar 12 represent a benzene ring.

式(10)中、Z及びZはそれぞれ独立に、アリール基、ヘテロ環基又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。m1が2以上である場合、複数のZは同じ基でもそれぞれ異なる基でもよく、m2が2以上である場合、複数のZは同じ基でもそれぞれ異なる基でもよい。
好ましくは、Z及びZは、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアリール基を表す。
より好ましくは、Z及びZは、それぞれ独立に、フェニル基、ナフチル基、又はアントリル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、m1が2以上である場合、複数のZは同じ基である。
好ましくは、m2が2以上である場合、複数のZは同じ基である。
式(10)で示される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。
In formula (10), Z 1 and Z 2 independently represent an aryl group, a heterocyclic group or an amino group, which may have a substituent. If m1 is 2 or more, a plurality of Z 1 may be different each be the same group group, when m2 is 2 or more, a plurality of Z 2 may each be the same group different groups.
Preferably, Z 1 and Z 2 each independently represent an aryl group that may have a substituent.
More preferably, Z 1 and Z 2 independently represent a phenyl group, a naphthyl group, or an anthryl group, which may have a substituent.
Preferably, when m1 is 2 or more, a plurality of Z 1 are the same group.
Preferably, when m2 is 2 or more, a plurality of Z 2 are the same group.
The compound represented by the formula (10) preferably does not have an acidic group such as a carboxylic acid group, a phosphoric acid group or a sulfonic acid group in the molecule.

<式(10A)で示される化合物について>
式(10)で示される化合物の好ましい例としては、下記式(10A)で示される化合物が挙げられる。

Figure 0006936383
<About the compound represented by the formula (10A)>
Preferred examples of the compound represented by the formula (10) include a compound represented by the following formula (10A).
Figure 0006936383

式(10A)中、Y及びYはそれぞれ独立にハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。
好ましくは、Y及びYはそれぞれ独立にハロゲン原子を表す。
特に好ましくは、Y及びYはフッ素原子である。
In formula (10A), Y 1 and Y 2 are independently halogen atoms, alkyl groups, aryl groups, heterocyclic groups, hydroxy groups, alkoxy groups, aryloxy groups, alkylthio groups, arylthio groups, ethenyl groups, or ethynyl groups, respectively. , And these may have substituents. Examples of the substituent include the substituents described in the substituent group A.
Preferably, Y 1 and Y 2 each independently represent a halogen atom.
Particularly preferably, Y 1 and Y 2 are fluorine atoms.

式(10A)中、Rは水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、又はアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
好ましくは、Rは、水素原子、アルキル基、アリール基又はヘテロ環基であり、これらは置換基を有していてもよい。
より好ましくは、Rは、水素原子である。
In formula (10A), R 3 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, or an acyl group, which may have a substituent.
Preferably, R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent.
More preferably, R 3 is a hydrogen atom.

式(10A)中、Ar及びArはそれぞれ独立にアリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。In formula (10A), Ar 3 and Ar 4 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent. Examples of the substituent include the substituents described in the substituent group A.

式(10A)中、R34〜R41はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。In formula (10A), R 34 to R 41 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, respectively. It represents an arylthio group or an amino group, which may have a substituent. Examples of the substituent include the substituents described in the substituent group A.

式(10A)中、好ましくは、R34〜R41の少なくとも1つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である。
さらに好ましくは、R34〜R37の少なくとも1つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基であり、R38〜R41の少なくとも1つ以上が、置換基を有していてもよいアリール基である。
In formula (10A), preferably at least one or more of R 34 to R 41 is an aryl group which may have a substituent.
More preferably, at least one or more of R 34 to R 37 are aryl groups which may have a substituent, and at least one or more of R 38 to R 41 may have a substituent. A good aryl group.

より好ましくは、R34〜R41の少なくとも1つ以上が、式(11)で表される基である。さらに好ましくは、R34〜R37の少なくとも1つ以上が、式(11)で表される基であり、R38〜R41の少なくとも1つ以上が、式(11)で表される基である。

Figure 0006936383
式(11)中、R201〜R205は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、又はアミノ基であり、R201及びR205の少なくとも一方は水素原子以外の原子又は基である。R201とR202は互いに連結して環を形成してもよく、R202とR203は互いに連結して環を形成してもよく、R203とR204は互いに連結して環を形成してもよく、R204とR205は互いに連結して環を形成してもよい。More preferably, at least one or more of R 34 to R 41 is a group represented by the formula (11). More preferably, at least one or more of R 34 to R 37 is a group represented by the formula (11), and at least one or more of R 38 to R 41 is a group represented by the formula (11). be.
Figure 0006936383
In formula (11), R 201 to R 205 are hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, arylthio group, Alternatively, it is an amino group, and at least one of R 201 and R 205 is an atom or group other than a hydrogen atom. R 201 and R 202 may be connected to each other to form a ring, R 202 and R 203 may be connected to each other to form a ring, and R 203 and R 204 may be connected to each other to form a ring. R 204 and R 205 may be connected to each other to form a ring.

別の好ましい態様によれば、R34〜R41の少なくとも1つ以上が、式(12)で表される基である。さらに好ましくは、R34〜R37の少なくとも1つ以上が、式(12)で表される基であり、R38〜R41の少なくとも1つ以上が、式(12)で表される基である。

Figure 0006936383
式(12)中、R101は、水素原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、又はアシル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。Ar101はアリール基、又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。上記置換基としては、置換基群Aに記載の置換基が挙げられる。Ar101とR101は互いに連結して環を形成してもよい。
式(10A)で示される化合物は、分子内に、カルボン酸基、リン酸基、スルホン酸基などの酸性基を有さないことが好ましい。According to another preferred embodiment, at least one or more of R 34 to R 41 is a group represented by the formula (12). More preferably, at least one or more of R 34 to R 37 is a group represented by the formula (12), and at least one or more of R 38 to R 41 is a group represented by the formula (12). be.
Figure 0006936383
In formula (12), R 101 represents a hydrogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, an ethynyl group, or an acyl group, which may have a substituent. Examples of the substituent include the substituents described in the substituent group A. Ar 101 represents an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent. Examples of the substituent include the substituents described in the substituent group A. Ar 101 and R 101 may be connected to each other to form a ring.
The compound represented by the formula (10A) preferably does not have an acidic group such as a carboxylic acid group, a phosphoric acid group, or a sulfonic acid group in the molecule.

<式(10)又は式(10A)で示される化合物の具体例>
式(10)又は式(10A)で示される化合物の具体例を以下に記載する。Meはメチル基を示し、Buはn−ブチル基を示し、Phはフェニル基を示す。
<Specific example of the compound represented by the formula (10) or the formula (10A)>
Specific examples of the compound represented by the formula (10) or the formula (10A) are described below. Me represents a methyl group, Bu represents an n-butyl group, and Ph represents a phenyl group.

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

<エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の組み合わせの具体例について>
エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の組み合わせの具体例を以下に記載する。
<Specific examples of combinations of energy donor compounds and energy acceptor compounds>
Specific examples of the combination of the energy donor compound and the energy acceptor compound are described below.

Figure 0006936383
Figure 0006936383

Figure 0006936383
Figure 0006936383

エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の選択に関しては、吸収が短波長の化合物がエネルギードナー化合物であり、吸収が長波長の化合物がエネルギーアクセプター化合物であり、エネルギードナー化合物の発光とエネルギーアクセプター化合物の吸収が少しでも重なっている場合には、本発明の粒子において使用できる可能性がある。エネルギーアクセプター化合物の吸収の極大波長が、エネルギードナー化合物の吸収の波長より10〜100nm程度長波長側にある場合が好ましい。エネルギーアクセプター化合物の吸収の極大波長が、エネルギードナー化合物の吸収の波長より10〜70nm長波長側にある場合がより好ましい。 Regarding the selection of energy donor compounds and energy acceptor compounds, compounds with short absorption wavelengths are energy donor compounds, compounds with long absorption wavelengths are energy acceptor compounds, and light emission and energy acceptor compounds of energy donor compounds. If the absorptions of the compounds overlap even a little, it may be possible to use them in the particles of the present invention. It is preferable that the maximum absorption wavelength of the energy acceptor compound is on the long wavelength side of about 10 to 100 nm from the absorption wavelength of the energy donor compound. It is more preferable that the maximum absorption wavelength of the energy acceptor compound is 10 to 70 nm longer than the absorption wavelength of the energy donor compound.

エネルギードナー化合物の発光が吸収のどの程度長波長に出るか(ストークスシフトの大きさ)は化合物によって異なるため、一概には言えないが、式(1)で示される化合物では吸収極大波長+30nm程度に発光の極大があり、そこから+100nm程度までは発光スペクトルが存在するため、その付近に吸収を持つアクセプター化合物を併用することによりエネルギー移動の系が実現できることが想定される。 How long the emission of the energy donor compound is emitted at the long wavelength of absorption (the magnitude of the Stokes shift) differs depending on the compound, so it cannot be said unconditionally. Since there is a maximum emission and an emission spectrum exists from there to about +100 nm, it is assumed that an energy transfer system can be realized by using an acceptor compound having absorption in the vicinity thereof.

なお、各化合物の吸収波長に関しては、化合物を合成して測定するだけでなく、Gaussian等による計算から予測することも可能であり、計算値の関係から、エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の組み合わせを推定することもできる。 The absorption wavelength of each compound can be predicted not only by synthesizing the compound but also by calculation by Gaussian or the like, and from the relationship of the calculated values, the combination of the energy donor compound and the energy acceptor compound. Can also be estimated.

本発明においては、ストークスシフトの大きさが、好ましくは25nm以上であり、より好ましくは30nm以上であり、より一層好ましくは35nm以上であり、さらに好ましくは40nm以上であり、さらに一層好ましくは45nm以上であり、特に好ましくは50nm以上であり、最も好ましくは60nm以上である。ストークスシフトの大きさの上限は特に限定されないが、一般的には、150nm以下である。 In the present invention, the magnitude of the Stokes shift is preferably 25 nm or more, more preferably 30 nm or more, even more preferably 35 nm or more, still more preferably 40 nm or more, still more preferably 45 nm or more. It is particularly preferably 50 nm or more, and most preferably 60 nm or more. The upper limit of the size of the Stokes shift is not particularly limited, but is generally 150 nm or less.

<式(1)〜式(6)で示される化合物の使用量>
本発明で用いる粒子(即ち、式(1)〜式(6)で示される化合物を添加する前の粒子)に対する式(1)〜式(6)で示される化合物の含有量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは0.5μmol/g〜400μmol/gであり、より好ましくは1μmol/g〜300μmol/gであり、さらに好ましくは2μmol/g〜200μmol/gであり、特に好ましくは3μmol/g〜100μmol/gである。
<Amount of compounds represented by formulas (1) to (6) used>
The content of the compound represented by the formulas (1) to (6) with respect to the particles used in the present invention (that is, the particles before adding the compound represented by the formulas (1) to (6)) is the content of the present invention. It is not particularly limited as long as the effect is not impaired, but is preferably 0.5 μmol / g to 400 μmol / g, more preferably 1 μmol / g to 300 μmol / g, and further preferably 2 μmol / g to 200 μmol / g. Particularly preferably, it is 3 μmol / g to 100 μmol / g.

本発明で用いる粒子(即ち、式(1)〜式(6)で示される化合物を添加する前の粒子)に対する式(1)〜式(6)で示される化合物の含有量は、本発明の効果を損なわない限り特に限定されないが、好ましくは0.1質量%〜30質量%であり、より好ましくは0.2質量%〜20質量%であり、さらに好ましくは0.3質量%〜10質量%であり、特に好ましくは0.4質量%〜8質量%である。 The content of the compound represented by the formulas (1) to (6) with respect to the particles used in the present invention (that is, the particles before adding the compounds represented by the formulas (1) to (6)) is the content of the present invention. It is not particularly limited as long as the effect is not impaired, but is preferably 0.1% by mass to 30% by mass, more preferably 0.2% by mass to 20% by mass, and further preferably 0.3% by mass to 10% by mass. %, Especially preferably 0.4% by mass to 8% by mass.

本発明の発光性粒子において、式(1)〜式(6)で示される化合物は少なくとも一種使用するが、二種以上の式(1)〜式(6)で示される化合物を使用してもよい。二種以上の式(1)〜式(6)で示される化合物を使用する場合には、合計量が、上記の範囲内となることが好ましい。 In the luminescent particles of the present invention, at least one compound represented by the formulas (1) to (6) is used, but even if two or more kinds of compounds represented by the formulas (1) to (6) are used. good. When two or more compounds represented by the formulas (1) to (6) are used, the total amount is preferably within the above range.

エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物の組み合わせを使用する場合には、エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比は、1:10〜20:1であることが好ましく、1:10〜10:1であることがより好ましく、1:5〜10:1であることがより好ましい。 When a combination of the energy donor compound and the energy acceptor compound is used, the molar ratio of the energy donor compound and the energy acceptor compound is preferably 1:10 to 20: 1, preferably 1:10 to 10: 1. Is more preferable, and 1: 5 to 10: 1 is more preferable.

エネルギードナー化合物として式(1)で示される少なくとも一種の化合物を使用し、エネルギーアクセプター化合物として、式(1)で示される少なくとも一種の化合物を使用する場合においては、エネルギードナー化合物として二種以上の式(1)で示される化合物を使用してもよく、またエネルギーアクセプター化合物として二種以上の式(1)で示される化合物を使用してもよい。上記の場合、使用される式(1)で示される化合物の合計量が、上記の範囲内となることが好ましい。 When at least one compound represented by the formula (1) is used as the energy donor compound and at least one compound represented by the formula (1) is used as the energy acceptor compound, two or more kinds are used as the energy donor compound. The compound represented by the formula (1) may be used, or two or more kinds of compounds represented by the formula (1) may be used as the energy acceptor compound. In the above case, it is preferable that the total amount of the compounds represented by the formula (1) used is within the above range.

<式(1)〜式(6)で示される化合物の製造方法>
式(1)〜式(6)で示される化合物は、例えば、後記する実施例に示す合成スキームにより製造することができる。
<Method for producing compounds represented by formulas (1) to (6)>
The compounds represented by the formulas (1) to (6) can be produced, for example, by the synthetic scheme shown in Examples described later.

一例として、化合物(1)の合成の概要を以下に示す。3,5−ビス(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド及びジクロロメタンの混合物に、水冷しながら3−エチル−2,4−ジメチルピロールとトリフルオロ酢酸を加えた後、室温で撹拌し、水冷しながらクロラニルを加え、室温で撹拌した後、水冷しながらジイソプロピルエチルアミンを滴下し、室温で撹拌し、続いて、水冷しながら三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体を滴下し、室温で撹拌して反応を行うことにより、化合物(1−A)を合成することができる。続いて、化合物(1−A)、2,4,6−トリメチルベンズアルデヒド、及び脱水トルエンを混合し、室温で撹拌する。ピペリジン及びp−トルエンスルホン酸1水和物1片を加えて溶媒を留去しながら撹拌し、放冷後に脱水トルエンを加えて溶媒を留去しながら撹拌して反応を行うことにより、化合物(1)を製造することができる。 As an example, an outline of the synthesis of compound (1) is shown below. To a mixture of 3,5-bis (trifluoromethyl) benzaldehyde and dichloromethane, 3-ethyl-2,4-dimethylpyrrole and trifluoroacetic acid are added while cooling with water, the mixture is stirred at room temperature, and chloranyl is added while cooling with water. After stirring at room temperature, diisopropylethylamine was added dropwise while cooling with water, and the mixture was stirred at room temperature. Then, boron trifluoride diethyl ether complex was added dropwise while cooling with water, and the mixture was stirred at room temperature to carry out the reaction. (1-A) can be synthesized. Subsequently, compound (1-A), 2,4,6-trimethylbenzaldehyde, and dehydrated toluene are mixed and stirred at room temperature. A compound (a compound (1) of piperidine and p-toluenesulfonic acid monohydrate was added and stirred while distilling off the solvent, and after allowing to cool, dehydrated toluene was added and the solvent was stirred while stirring to carry out the reaction. 1) can be manufactured.

別の例としては、化合物(5)は、後記する実施例における合成スキームに従って、2,3,5,6−テトラフルオロベンズアルデヒドと2,4−ジメチルピロールを出発化合物として、化合物(5−A)、化合物(5−B)、及び化合物(5−C)を経由して製造することができる。 As another example, compound (5) is compound (5-A) starting from 2,3,5,6-tetrafluorobenzaldehyde and 2,4-dimethylpyrrole according to the synthetic scheme in the examples described below. , Compound (5-B), and compound (5-C).

化合物(1)及び化合物(5)は、式(1)で示される化合物の定義の範囲内である。化合物(1)及び化合物(5)以外の式(1)で示される化合物についても、反応に使用する化合物を、所望の式(1)で示される目的化合物に対応する置換基を有する化合物に置き換えることによって、製造することができる。 Compound (1) and compound (5) are within the definition of the compound represented by the formula (1). For compounds represented by the formula (1) other than the compound (1) and the compound (5), the compound used in the reaction is replaced with a compound having a substituent corresponding to the desired compound represented by the desired formula (1). By doing so, it can be manufactured.

<式(10)で示される化合物の製造方法>
式(10)で示される化合物は、例えば、以下に示す合成スキームにより製造することができる。
<Method for producing the compound represented by the formula (10)>
The compound represented by the formula (10) can be produced, for example, by the synthetic scheme shown below.

Figure 0006936383
Figure 0006936383

上記合成スキームにおけるR及びZの定義は、式(10)におけるR及びZの定義と同義である。
化合物A−10と化合物A−20とをMacromolecules 2010、43、193−200に記載の方法に従って反応させることにより、化合物A−30を合成することができる。次いで、化合物A−30、式:Z−B(OH)で表される化合物、及びフッ化セシウム(CsF)をジメトキシエタン(DME)と水の混合溶液に加え、真空引き、窒素置換を繰り返して脱気を行う。酢酸パラジウム(Pd(OAc))、及び2−ジシクロヘキシルホスフィノ−2’、6’−ジメトキシビフェニル(SPhos)を加え、昇温し、還流下、所定の時間(例えば、2〜24時間)反応させることにより、化合物D−10を製造することができる。
The definitions of R 1 and Z 1 in the above synthesis scheme are synonymous with the definitions of R 1 and Z 1 in the formula (10).
Compound A-30 can be synthesized by reacting compound A-10 with compound A-20 according to the method described in Macromolecules 2010, 43, 193-200. Then, Compound A-30, wherein: Z 1 -B (OH) compounds represented by 2, and added cesium fluoride (CsF) in a mixed solution of water and dimethoxyethane (DME), evacuated, and purged with nitrogen Repeat degassing. Palladium acetate (Pd (OAc) 2 ) and 2-dicyclohexylphosphino-2', 6'-dimethoxybiphenyl (SPhos) are added, the temperature is raised, and the reaction is carried out under reflux for a predetermined time (for example, 2 to 24 hours). By allowing the compound D-10 to be produced, the compound D-10 can be produced.

化合物D−10は、式(10)で示される化合物の定義の範囲内である。化合物D−10以外の式(10)で示される化合物についても、化合物A−10、化合物A−20、及び式:Z−B(OH)で表される化合物の何れか一種以上の化合物を、対応する化合物に置き換えることによって、製造することができる。Compound D-10 is within the definition of the compound represented by the formula (10). For even compounds compounds represented by the D-10 other than the formula (10), Compound A-10 Compound A-20, and the formula: Z 1 -B (OH) any one or more compounds of the compounds represented by the 2 Can be produced by replacing with the corresponding compound.

(標識を有する第一の粒子)
本発明における標識を有する第一の粒子は、式(1)で示される化合物を含むことにより、高い量子収率と高い輝度を示す。
標識を有する第一の粒子の励起極大波長とは、励起スペクトルで蛍光強度の最も大きい波長である。標識を有する第一の粒子の蛍光極大波長とは、蛍光スペクトルで蛍光強度の最も大きい波長のことである。また、励起スペクトルとは、蛍光標識強度の励起波長依存性を示し、蛍光スペクトルは、蛍光強度の蛍光波長依存性を示す。
標識を有する第一の粒子の励起極大波長は、好ましくは640nm〜900nmであり、より好ましくは640nm〜800nmであり、さらにより好ましくは650nm〜750nmである。
標識を有する第一の粒子の蛍光極大波長は、好ましくは660nm〜900nmであり、より好ましくは660nm〜800nmであり、さらに好ましくは670nm〜750nmである。
標識を有する第一の粒子の蛍光強度とは、ある測定条件で測定した際の蛍光の強度のことであり、測定条件に依存するため一般的には相対的な比較をするために用いられる。
(First particle with label)
The labeled first particle in the present invention exhibits a high quantum yield and high brightness by containing the compound represented by the formula (1).
The maximum excitation wavelength of the first labeled particle is the wavelength with the highest fluorescence intensity in the excitation spectrum. The fluorescence maximum wavelength of the first particle having a label is the wavelength having the highest fluorescence intensity in the fluorescence spectrum. Further, the excitation spectrum indicates the excitation wavelength dependence of the fluorescence labeling intensity, and the fluorescence spectrum indicates the fluorescence wavelength dependence of the fluorescence intensity.
The maximum excitation wavelength of the labeled first particle is preferably 640 nm to 900 nm, more preferably 640 nm to 800 nm, and even more preferably 650 nm to 750 nm.
The maximum fluorescence wavelength of the labeled first particle is preferably 660 nm to 900 nm, more preferably 660 nm to 800 nm, and even more preferably 670 nm to 750 nm.
The fluorescence intensity of the first particle having a label is the fluorescence intensity when measured under certain measurement conditions, and is generally used for relative comparison because it depends on the measurement conditions.

標識を有する第一の粒子の励起極大波長、蛍光極大波長、及び蛍光強度は、市販の蛍光分光光度計を使用して測定することができ、例えば、島津製作所製の蛍光分光光度計RF−5300PCを使用して測定することができる。 The excitation maximum wavelength, fluorescence maximum wavelength, and fluorescence intensity of the first particle having a label can be measured using a commercially available fluorescence spectrophotometer, for example, a fluorescence spectrophotometer RF-5300PC manufactured by Shimadzu Corporation. Can be measured using.

標識を有する第一の粒子の量子収率とは、標識を有する第一の粒子が吸収した光子数に対する蛍光として発光した光子数の割合のことである。
標識を有する第一の粒子が示す量子収率は、好ましくは0.25以上であり、より好ましくは0.30以上であり、さらに好ましくは0.40以上である。量子収率の上限は特に限定されないが、一般的には、1.0以下である。
標識を有する第一の粒子の量子収率は、市販の量子収率測定装置を使用して測定することができ、例えば、浜松ホトニクス社製の絶対PL量子収率測定装置C9920−02を使用して測定することができる。
The quantum yield of the labeled first particle is the ratio of the number of photons emitted as fluorescence to the number of photons absorbed by the labeled first particle.
The quantum yield of the labeled first particle is preferably 0.25 or more, more preferably 0.30 or more, still more preferably 0.40 or more. The upper limit of the quantum yield is not particularly limited, but is generally 1.0 or less.
The quantum yield of the labeled first particle can be measured using a commercially available quantum yield measuring device, for example, using an absolute PL quantum yield measuring device C9920-02 manufactured by Hamamatsu Photonics. Can be measured.

<標識を有する第一の粒子の製造方法>
標識を有する第一の粒子の製造方法は特に限定されないが、式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを混合することによって製造することができる。例えば、ラテックス粒子などの粒子に、式(1)で示される化合物を添加することによって、標識を有する第一の粒子を作製することができる。より具体的には、水及び水溶性有機溶剤(テトラヒドロフラン、メタノール等)の何れか一種以上を含む粒子の溶液に、式(1)で示される化合物を含む溶液を添加して攪拌することにより、標識を有する第一の粒子を製造することができる。
<Method for producing the first particle with a label>
The method for producing the first particles having a label is not particularly limited, but the first particles can be produced by mixing at least one compound represented by the formula (1) with the particles. For example, by adding the compound represented by the formula (1) to particles such as latex particles, the first particles having a label can be prepared. More specifically, by adding a solution containing the compound represented by the formula (1) to a solution of particles containing any one or more of water and a water-soluble organic solvent (tetrahydrofuran, methanol, etc.) and stirring the mixture. A first particle with a label can be produced.

本発明においては、上記した標識を有する第一の粒子を含む分散液を調製してもよい。
分散液は、標識を有する第一の粒子を分散媒に分散することにより製造することができる。分散媒としては、水、有機溶媒、又は水と有機溶媒との混合物等が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール、テトラヒドロフラン等のエーテル系溶媒などを使用することができる。
分散液における標識を有する第一の粒子の固形分濃度は特に限定されないが、一般的には0.1〜20質量%であり、好ましくは0.5〜10質量%であり、より好ましくは1〜5質量%である。
In the present invention, a dispersion liquid containing the first particles having the above-mentioned label may be prepared.
The dispersion can be produced by dispersing the labeled first particles in a dispersion medium. Examples of the dispersion medium include water, an organic solvent, or a mixture of water and an organic solvent. As the organic solvent, alcohols such as methanol, ethanol and isopropanol, ether solvents such as tetrahydrofuran and the like can be used.
The solid content concentration of the labeled first particles in the dispersion is not particularly limited, but is generally 0.1 to 20% by mass, preferably 0.5 to 10% by mass, and more preferably 1. ~ 5% by mass.

(第一の結合物質による標識を有する第一の粒子の修飾)
第一の結合物質を、標識を有する第一の粒子に固定化する方法は、例えば、特開2000−206115号公報やThermo Fisher 社FluoSpheres(登録商標)ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤(即ち、第一のブロッキング剤)としては、例えば、アルブミン(BSAなど)、スキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、又はポリエチレングリコールなど、並びに上記物質又は上記物質と性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。さらに、第一のブロッキング剤としては、プロゲステロンと結合性を有しない抗体(グロブリン)、あるいはテストエリアに使用しないタンパク質(Protein A、Protein G)などを使用することもできる。
(Modification of the first particle with the label by the first binding agent)
The method for immobilizing the first binding substance on the labeled first particles is described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-206115 and the protocol attached to Thermo Fishers (registered trademark) polystyrene microspheres F8813. Any known method for preparing a reagent for immunoagglutination reaction can be used. Further, as a principle of immobilizing an antibody on particles as a binding substance, either the principle of physical adsorption or the principle of chemical bond by covalent bond can be adopted. Blocking agents (ie, first blocking agents) that cover the surface of particles that are not coated with the antibody after the antibody is immobilized on the particles include, for example, albumin (BSA, etc.), skim milk, casein, soybean-derived components, fish-derived. Commercially available blocking agents for immune reactions containing the above-mentioned substances or substances having the same properties as the above-mentioned substances can be used. These blocking agents can also be pretreated with heat, acid, alkali or the like, if necessary, such as partial denaturation. Further, as the first blocking agent, an antibody (globulin) having no binding property to progesterone, a protein not used in the test area (Protein A, Protein G), or the like can also be used.

抗体を粒子に固定化する具体的な方法を、以下に例示する。粒子の固形分濃度が0.1〜10質量%になるよう分散させた液に、0.01〜20mg/mLの濃度に調整した抗体溶液を添加して、混合する。温度4〜50℃の条件下で5分間〜48時間撹拌を継続する。次いで遠心分離その他の方法により粒子と溶液を分離して、溶液に含まれている、粒子に結合しなかった抗体を十分に除去する。その後、粒子を緩衝液にて洗浄する操作を0〜10回繰り返す。粒子と抗体とを混合して、粒子に抗体を結合させる操作を実施した後に、抗原抗体反応に関与しない成分、好ましくはタンパク質、より好ましくはグロブリン、アルブミン、ブロックエース(登録商標)、スキムミルク及びカゼインなどのブロッキング剤を使用して粒子表面の抗体が結合していない部分を保護することが望ましい。 Specific methods for immobilizing the antibody on the particles are illustrated below. An antibody solution adjusted to a concentration of 0.01 to 20 mg / mL is added to a solution dispersed so that the solid content concentration of the particles is 0.1 to 10% by mass, and the mixture is mixed. Stirring is continued for 5 minutes to 48 hours under the condition of a temperature of 4 to 50 ° C. Then, the particles and the solution are separated by centrifugation or other methods to sufficiently remove the antibody contained in the solution that has not bound to the particles. Then, the operation of washing the particles with the buffer solution is repeated 0 to 10 times. After the operation of mixing the particles and the antibody to bind the antibody to the particles, components not involved in the antigen-antibody reaction, preferably proteins, more preferably globulin, albumin, Block Ace®, skim milk and casein. It is desirable to protect the part of the particle surface where the antibody is not bound by using a blocking agent such as.

抗原や抗体等を粒子に固定化する際に、安定化剤を必要に応じて添加可能である。安定化剤としては、ショ糖や多糖類などの合成高分子あるいは天然高分子など、抗原や抗体を安定化するものであれば特に制限されず、Immunoassay Stabilizer(Advanced Biotechnologies Inc (ABI社))などの市販の安定化剤も使用可能である。 When immobilizing an antigen, an antibody or the like on particles, a stabilizer can be added as needed. The stabilizer is not particularly limited as long as it stabilizes antigens and antibodies such as synthetic polymers such as sucrose and polysaccharides or natural polymers, such as Immunoassay Stabilizer (Advanced Biotechnologies Inc (ABI)). Commercially available stabilizers can also be used.

第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子は、本発明のキットに含まれており、キットの一部である容器、たとえばカップに含まれている態様が好ましい。この場合、プロゲステロンを含む生体試料を、標識を有する第一の粒子を含む容器に注入して混合および攪拌することにより、生体試料中のプロゲステロンと第一の結合物質とを結合させることができる。 The labeled first particles, modified with the first binding agent, are included in the kit of the invention, preferably in a container, eg, a cup, which is part of the kit. In this case, the progesterone in the biological sample and the first binding substance can be bound by injecting the biological sample containing progesterone into a container containing the first labeled particles, mixing and stirring.

(第二の結合物質)
本発明における標識を有しない第二の粒子は、プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾されている。第二の結合物質としては、例えば、結合物質(抗体)、あるいは結合物質(抗体)に対して結合するタンパク質(Protein A、Protein G)など、プロゲステロンと特異的な結合性を有しない化合物であり、かつ、第一の結合物質に対して親和性を有しない化合物であれば特に限定されず、いずれの化合物でも好ましく用いることができる。例えば、第二の結合物質が抗体である場合には、免疫された動物の血清から調製する抗血清、抗血清から精製された免疫グロブリン画分、免疫された動物の脾臓細胞を用いる細胞融合によって得られるモノクローナル抗体、あるいは、それらの断片[例えば、F(ab’)2、Fab、Fab’、又はFv]などを用いることができる。これらの抗体の調製は、常法により行なうことができる。さらに、その抗体がキメラ抗体などの場合のように、修飾を加えられたものでもよいし、また市販の抗体でも、動物血清や培養上清から公知の方法により調製した抗体でも使用可能である。
(Second binding substance)
The unlabeled second particle in the present invention is modified with a second binding agent that does not have specific binding to progesterone. The second binding substance is, for example, a compound having no specific binding property to progesterone, such as a binding substance (antibody) or a protein (Protein A, Protein G) that binds to the binding substance (antibody). Moreover, the compound is not particularly limited as long as it does not have an affinity for the first binding substance, and any compound can be preferably used. For example, when the second binding agent is an antibody, by cell fusion using an antiserum prepared from the serum of an immunized animal, an immunoglobulin fraction purified from the antiserum, and spleen cells of an immunized animal. The obtained monoclonal antibody or a fragment thereof [for example, F (ab') 2, Fab, Fab', or Fv] can be used. Preparation of these antibodies can be carried out by a conventional method. Further, the antibody may be modified as in the case of a chimeric antibody or the like, and a commercially available antibody or an antibody prepared by a known method from animal serum or culture supernatant can be used.

抗体などの第二の結合物質を粒子に固定化する方法は、例えば、特開2000−206115号公報やモレキュラープローブ社FluoSpheres(登録商標)ポリスチレンマイクロスフィアF8813に添付のプロトコールなどに記載されており、免疫凝集反応用試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、結合物質として抗体を粒子に固定化する原理として、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。抗体を粒子に固定させた後に抗体が被覆されていない粒子表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、BSAやスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。 A method for immobilizing a second binding substance such as an antibody on particles is described in, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-206115 and a protocol attached to Molecular Probes Co., Ltd. FluoroSpheres (registered trademark) polystyrene microspheres F8813. Any known method for preparing a reagent for an immunoaggregation reaction can be used. Further, as a principle of immobilizing an antibody on particles as a binding substance, either the principle of physical adsorption or the principle of chemical bond by covalent bond can be adopted. Known substances, such as BSA, skim milk, casein, soybean-derived components, fish-derived components, polyethylene glycol, and the like, are known substances as blocking agents that cover the surface of particles not coated with the antibody after the antibody is immobilized on the particles. And commercially available blocking agents for immune reactions containing substances having the same properties as these can be used. These blocking agents can also be pretreated with heat, acid, alkali or the like, if necessary, such as partial denaturation.

(第一の粒子及び第二の粒子)
第一の粒子と第二の粒子の使用比率については、第一の粒子に対する第二の粒子の質量比が一般的には1〜20であり、1〜10であることが好ましく、2〜8であることがより好ましく、4〜6がさらに好ましい。
(First particle and second particle)
Regarding the usage ratio of the first particle and the second particle, the mass ratio of the second particle to the first particle is generally 1 to 20, preferably 1 to 10, and 2 to 8 Is more preferable, and 4 to 6 is even more preferable.

本発明においては、第一の粒子の平均粒子径は50〜250nmであり、第二の粒子の平均粒子径は70〜500nmであり、かつ第一の粒子の平均粒子径より第二の粒子の平均粒子径が大きい。
第一の粒子の平均粒子径は、好ましくは70〜130nmであり、より好ましくは80〜120nmであり、さらに好ましくは85〜110nmである。
第二の粒子の平均粒子径は、好ましくは130〜300nmであり、より好ましくは135〜260nmであり、さらに好ましくは140〜200nmである。
In the present invention, the average particle size of the first particle is 50 to 250 nm, the average particle size of the second particle is 70 to 500 nm, and the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of the first particle. The average particle size is large.
The average particle size of the first particles is preferably 70 to 130 nm, more preferably 80 to 120 nm, and even more preferably 85 to 110 nm.
The average particle size of the second particle is preferably 130 to 300 nm, more preferably 135 to 260 nm, and even more preferably 140 to 200 nm.

平均粒子径の測定方法としては、光学顕微鏡法、共焦点レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、静的光散乱法、レーザー回折法、動的光散乱法、遠心沈降法、電気パルス計測法、クロマトグラフィー法、超音波減衰法等が知られており、それぞれの原理に対応した装置が市販されている。これらの測定方法のうち、粒子径範囲及び測定の容易さから、動的光散乱法を用いて蛍光粒子の平均粒径を測定することが好ましい。動的光散乱を用いた市販の測定装置としては、ナノトラックUPA(日機装(株))、動的光散乱式粒径分布測定装置LB−550((株)堀場製作所)、濃厚系粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))等が挙げられる。本発明では、平均粒径は、25℃にて、粘度0.8872CP(但し、1Pa・s=1000cP)、水の屈折率1.330の条件で測定したメジアン径(d=50)として求めるものとする。 The methods for measuring the average particle size include optical microscopy, confocal laser microscopy, electron microscopy, interatomic force microscopy, static light scattering, laser diffraction, dynamic light scattering, centrifugal sedimentation, and electricity. Pulse measurement methods, chromatography methods, ultrasonic attenuation methods, etc. are known, and devices corresponding to each principle are commercially available. Among these measuring methods, it is preferable to measure the average particle size of fluorescent particles by using a dynamic light scattering method because of the particle size range and ease of measurement. Commercially available measuring devices using dynamic light scattering include Nanotrack UPA (Nikkiso Co., Ltd.), dynamic light scattering particle size distribution measuring device LB-550 (HORIBA, Ltd.), and concentrated particle size analyzer. FPAR-1000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.) and the like can be mentioned. In the present invention, the average particle size is determined as the median diameter (d = 50) measured at 25 ° C. under the conditions of viscosity 0.8872 CP (however, 1 Pa · s = 1000 cP) and refractive index of water 1.330. And.

本発明で用いる第一の粒子(標識を有する粒子)及び第二の粒子は、乾燥状態で保存し、測定時にプロゲステロンを含む生体試料と混合することによって使用してもよい。第一の粒子及び第二の粒子を溶液状態で保存した場合、粒子同士が凝集や融着することにより大サイズ化し、測定精度が変化する場合があるので、このような場合には、第一の粒子及び第二の粒子は乾燥状態で保存することができる。乾燥状態で保存した粒子は、乾燥粒子とも言う。乾燥粒子とは、水分を含まない標識物質を含む粒子の固形分の質量に対する水分の質量(含水量)として、好ましくは30質量%以下、より好ましくは25質量%以下、更に好ましくは20質量%以下の水分の質量になるまで、含有する水分量を除去した状態の粒子をいう。乾燥を行う手段としては特に制限はなく、例えば、除湿剤を使用した乾燥方法、減圧乾燥方法、凍結乾燥方法などの公知の乾燥手段を用いることができる。本発明においては、第一の粒子及び第二の粒子を別々に乾燥して乾燥粒子を得てもよいし、第一の粒子と第二の粒子を、溶液状態で所望の質量比で混合した後に乾燥して乾燥粒子を得てもよい。 The first particle (labeled particle) and the second particle used in the present invention may be stored in a dry state and used by mixing with a biological sample containing progesterone at the time of measurement. When the first particle and the second particle are stored in a solution state, the particles may agglomerate or fuse with each other to increase the size, and the measurement accuracy may change. Particles and second particles can be stored in a dry state. Particles stored in a dry state are also called dry particles. The dry particles are preferably 30% by mass or less, more preferably 25% by mass or less, still more preferably 20% by mass, as the mass of water (water content) with respect to the mass of the solid content of the particles containing the labeling substance containing no water. Particles in which the amount of water contained is removed until the mass of water is as follows. The means for drying is not particularly limited, and for example, known drying means such as a drying method using a dehumidifying agent, a vacuum drying method, and a freeze-drying method can be used. In the present invention, the first particles and the second particles may be dried separately to obtain dried particles, or the first particles and the second particles are mixed in a solution state at a desired mass ratio. It may be dried later to obtain dried particles.

(流路)
本発明のキットは、第一の粒子及び第二の粒子を流すための流路を含む。本発明においては、プロゲステロンを含む可能性のある生体試料と、標識を有する第一の粒子と、標識を有しない第二の粒子とを混合した混合液を、基板上に適用し、流路に展開することができる。流路とは、生体試料と、標識を有する第一の粒子と、第二の粒子とを反応部位まで流下する通路であれば、特に制限はない。好ましい流路の態様としては、標識を有する第一の粒子及び第二の粒子を含む生体試料液を点着する点着口、第三の結合物質が固定化された反応部位としての金属薄膜、及び金属薄膜を超えて流路が存在し、生体試料が、金属薄膜上を通過できる構造を有するものである。好ましくは、金属薄膜に対して、点着口とは反対側に、吸引口を設けることができる。
(Flow path)
The kit of the present invention includes a flow path for flowing the first particle and the second particle. In the present invention, a mixed solution of a biological sample that may contain progesterone, a first particle having a label, and a second particle without a label is applied onto a substrate and applied to a flow path. Can be deployed. The flow path is not particularly limited as long as it is a flow path through which the biological sample, the first particle having a label, and the second particle flow down to the reaction site. Preferred flow path embodiments include a spotting port for instilling a biological sample solution containing a labeled first particle and a second particle, a metal thin film as a reaction site on which a third binding substance is immobilized, and the like. In addition, there is a flow path beyond the metal thin film, and the biological sample has a structure that allows it to pass over the metal thin film. Preferably, the suction port can be provided on the side of the metal thin film opposite to the spotting port.

(基板)
本発明では、高感度な測定を達成するために、後述する表面プラズモン蛍光(SPF)検出を行う測定法を採用することが好ましい。この場合における基板としては、表面に金属膜を有する基板を使用することが好ましい。金属膜を構成する金属としては、表面プラズモン共鳴が生じ得るようなものであれば特に限定されない。好ましくは金、銀、銅、アルミニウム、又は白金等の自由電子金属が挙げられ、特に金が好ましい。金を使用する場合、後記する検出領域は、金膜上にある。上記の金属は単独又は組み合わせて使用することができる。また、上記基板への付着性を考慮して、基板と金属からなる層との間にクロム等からなる介在層を設けてもよい。金属膜の膜厚は任意であるが、例えば、1nm以上500nm以下であるのが好ましく、特に10nm以上200nm以下であるのが好ましい。500nmを超えると、媒質の表面プラズモン現象を十分検出することができない。また、クロム等からなる介在層を設ける場合、その介在層の厚さは、0.1nm以上、10nm以下であることが好ましい。
(substrate)
In the present invention, in order to achieve highly sensitive measurement, it is preferable to adopt a measurement method for detecting surface plasmon fluorescence (SPF), which will be described later. As the substrate in this case, it is preferable to use a substrate having a metal film on the surface. The metal constituting the metal film is not particularly limited as long as it can cause surface plasmon resonance. Free electron metals such as gold, silver, copper, aluminum, and platinum are preferred, with gold being particularly preferred. When gold is used, the detection region described later is on the gold film. The above metals can be used alone or in combination. Further, in consideration of the adhesiveness to the substrate, an intervening layer made of chromium or the like may be provided between the substrate and the layer made of metal. The film thickness of the metal film is arbitrary, but is preferably 1 nm or more and 500 nm or less, and particularly preferably 10 nm or more and 200 nm or less. If it exceeds 500 nm, the surface plasmon phenomenon of the medium cannot be sufficiently detected. When an intervening layer made of chromium or the like is provided, the thickness of the intervening layer is preferably 0.1 nm or more and 10 nm or less.

金属膜の形成は常法によって行えばよく、例えば、スパッタ法、蒸着法、イオンプレーティング法、電気めっき法、又は無電解めっき法等によって行うことができるが、基板材質と金属膜との混合層を設けて、金属膜の密着性を良くするためには、スパッタ法により金属膜を作製することが好ましい。この場合、基板材質と金属膜との混合層の厚さは十分な密着性が確保できれば特に制限はないが、10nm以下が好ましい。 The metal film may be formed by a conventional method, for example, by a sputtering method, a vapor deposition method, an ion plating method, an electroplating method, an electrolytic plating method, or the like, but a mixture of the substrate material and the metal film is performed. In order to provide the layer and improve the adhesion of the metal film, it is preferable to prepare the metal film by a plating method. In this case, the thickness of the mixed layer of the substrate material and the metal film is not particularly limited as long as sufficient adhesion can be ensured, but is preferably 10 nm or less.

金属膜は好ましくは基板上に配置されている。ここで、「基板上に配置される」とは、金属膜が基板上に直接接触するように配置されている場合のほか、金属膜が基板に直接接触することなく、他の層を介して配置されている場合をも含む。本発明で使用することができる基板の材質としては例えば、一般的な光学ガラスの一種であるBK7(ホウ珪酸ガラス)等の光学ガラス、あるいは合成樹脂、具体的にはポリメチルメタクリレート、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、又はシクロオレフィンポリマーなどのレーザー光に対して透明な材料からなるものが使用できる。このような基板は、好ましくは、偏光に対して異方性を示さずかつ加工性の優れた材料が望ましい。 The metal film is preferably arranged on the substrate. Here, "arranged on the substrate" means that the metal film is arranged so as to be in direct contact with the substrate, and that the metal film is not in direct contact with the substrate and is placed through another layer. Including the case where it is arranged. Examples of the substrate material that can be used in the present invention include optical glass such as BK7 (borosilicate glass), which is a kind of general optical glass, or synthetic resin, specifically, polymethylmethacrylate and polyethylene terephthalate. A material made of a material transparent to laser light such as polycarbonate or a cycloolefin polymer can be used. Such a substrate is preferably made of a material that does not exhibit anisotropy with respect to polarized light and has excellent workability.

SPF検出のための基板の好ましい態様としては、ポリメチルメタクリレート(PMMA)に金膜をスパッタ法等で形成した基板などを挙げることができる。 A preferred embodiment of the substrate for SPF detection includes a substrate in which a gold film is formed on polymethylmethacrylate (PMMA) by a sputtering method or the like.

基板は、第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する検出領域を備えている。 The substrate comprises a detection region having a substance that has a binding property to the first binding substance.

第一の結合物質に対して結合性を有する物質を基板に固定化する方法は、例えば、Nunc社の提供するTech Notes Vol. 2-12などに記載されており、一般的なELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay:酵素結合免疫吸着法)試薬を調製する公知の方法がいずれも使用可能である。また、基板上に自己組織化単分子膜(SAM:Self-Assembled Monolayer)などを配することによる表面修飾を施してもよい。第一の結合物質に対して結合性を有する物質を基板に固定化する原理としては、物理吸着及び共有結合による化学結合のいずれの原理も採用可能である。第一の結合物質に対して結合性を有する物質を基板に固定させた後に、第一の結合物質に対して結合性を有する物質が被覆されていない基板表面を覆うブロッキング剤として、公知の物質、例えば、BSAやスキムミルク、カゼイン、大豆由来成分、魚由来成分、ポリエチレングリコールなどや、これらの物質やこれらと性質が同じである物質を含む市販の免疫反応用ブロッキング剤などが使用可能である。これらのブロッキング剤は、必要に応じて熱や酸・アルカリ等により部分変性などの前処理を施すことも可能である。 A method for immobilizing a substance having a binding property to the first binding substance on a substrate is described in, for example, Tech Notes Vol. 2-12 provided by Nunc, and is described in general ELISA (Enzyme-). Linked ImmunoSorbent Assay) Any known method for preparing a reagent can be used. Further, the surface may be modified by arranging a self-assembled monolayer (SAM) or the like on the substrate. As a principle of immobilizing a substance having a binding property to the first binding substance on a substrate, either the principle of physical adsorption or the principle of chemical bonding by covalent bond can be adopted. A substance known as a blocking agent that covers a substrate surface that is not coated with a substance having a binding property to the first binding substance after fixing a substance having a binding property to the first binding substance to the substrate. For example, BSA, skim milk, casein, soybean-derived components, fish-derived components, polyethylene glycol and the like, and commercially available blocking agents for immune reactions containing these substances and substances having the same properties as these can be used. These blocking agents can also be pretreated with heat, acid, alkali or the like, if necessary, such as partial denaturation.

(検出領域<テストエリア>)
本発明においては、基板上に生体試料中のプロゲステロンの有無を検出するテストエリアを設けることができる。このテストエリアでは、抗原に結合した標識のみを結合できないようにし、抗原に結合していない標識のみを捕獲して、抗原の結合した標識の量を算出する方法により、抗原を定量することが可能となる。この検出方法は競合法と呼ばれているが、ここでは、競合法に関する基板について説明する。
(Detection area <test area>)
In the present invention, a test area for detecting the presence or absence of progesterone in a biological sample can be provided on the substrate. In this test area, it is possible to quantify the antigen by a method in which only the antigen-bound label cannot be bound, only the non-antigen-bound label is captured, and the amount of the antigen-bound label is calculated. It becomes. This detection method is called the competition method, but here, the substrate related to the competition method will be described.

基板のテストエリアには、標識粒子上に存在する結合物質(例えば抗体)と反応するサイトを有することが好ましい。本発明の好ましい一態様としては、生体試料中に存在するプロゲステロンを、基板のテストエリア上に有する態様が好ましい。この場合、プロゲステロンとBSAを縮合剤の存在下で反応させて、プロゲステロン・BSA結合体を作製し、この結合体をテストエリア上に吸着させることでテストエリアを作製することが可能となる。測定対象物質であるプロゲステロン−BSA結合体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板上のテストエリアに結合させることが可能である。 The test area of the substrate preferably has sites that react with binding substances (eg, antibodies) present on the labeled particles. As a preferred embodiment of the present invention, it is preferable to have progesterone present in the biological sample on the test area of the substrate. In this case, a test area can be prepared by reacting progesterone and BSA in the presence of a condensing agent to prepare a progesterone / BSA conjugate, and adsorbing this conjugate on the test area. The progesterone-BSA conjugate, which is the substance to be measured, is dissolved in a buffer solution, instilled on the substrate, left for a certain period of time, and then the supernatant is aspirated and dried. It is possible to combine with.

(参照領域<コントロールエリア>)
本発明では、測定環境、特に測定温度の影響を極力抑えるために、基板上にコントロールエリアを有し、テストエリアの情報を、コントロールエリアの情報で規格化することによって、環境依存性を非常に低く抑えることが可能となる。コントロールエリアとしては、使用する生体試料の中に存在するプロゲステロンの量に依存せず、すべての標識と結合することが可能なように設計されていることが好ましい。標識粒子上に存在する抗体すべてに相互作用する抗体を有することが好ましい。このように設計することによって、テストエリアの情報をコントロールエリアの情報で規格化することにより、例えば、低温環境で、生体試料の流れや、反応速度が影響を受けた場合でも、規格化によってその影響をキャンセルして、常に精度よく、測定環境に影響されない結果を得ることが可能になる。
(Reference area <control area>)
In the present invention, in order to suppress the influence of the measurement environment, particularly the measurement temperature as much as possible, the control area is provided on the substrate, and the information of the test area is standardized by the information of the control area. It is possible to keep it low. The control area is preferably designed so that it can bind to all labels, independent of the amount of progesterone present in the biological sample used. It is preferable to have an antibody that interacts with all the antibodies present on the labeled particles. By designing in this way, the information in the test area is standardized by the information in the control area. It is possible to cancel the effect and obtain a result that is always accurate and unaffected by the measurement environment.

コントロールエリアに存在させる好ましい抗体としては、標識粒子上に存在する結合物質(例えば、抗体)を認識する機能をもち、その抗体がマウス由来であれば、抗マウス抗体であることが好ましく、標識粒子上の抗体が、ヤギ由来であれば、抗ヤギ抗体であることが好ましい。これらコントロールエリア上の抗体は、緩衝液に溶解させて、基板上に点着して、一定時間放置した後、上清を吸引し、乾燥させるなどの方法で基板に結合させることが可能である。 The preferable antibody to be present in the control area has a function of recognizing a binding substance (for example, an antibody) existing on the labeled particles, and if the antibody is derived from a mouse, it is preferably an anti-mouse antibody, and the labeled particles. If the above antibody is derived from goat, it is preferably an anti-goat antibody. The antibodies on these control areas can be dissolved in a buffer solution, instilled on the substrate, left for a certain period of time, and then the supernatant can be sucked and dried to bind to the substrate. ..

(ブロッキング剤)
例えば、競合法において、プロゲステロンを含まない陰性となる生体試料だけでなく、プロゲステロンを含む陽性となる生体試料に対しても反応して陰性となる生体試料が存在しており、高値乖離の問題の解決が課題として認識されている。このような擬陰性を示す原因は明確にはなっていないが、抗体に覆われていない標識粒子表面と、検出領域(テストエリア)との非特異的な相互作用により、本来結合してほしくない標識粒子が存在することが原因の一つではないかと考えられている。また、テストエリア上に存在する物質と同じ物質が標識粒子表面上に存在する場合にも、遊離した抗体などが生体試料中に存在する場合には、その抗体が、テストエリア上に存在する物質と、標識粒子表面上の物質のどちらにも結合することで、プロゲステロンを含む陽性となる生体試料を測定した場合においても陰性として検出される場合がある。
一般的に、固相表面(例えば標識粒子表面、基板の金膜表面)への非特異吸着抑制のためにBSAでのブロッキングが用いられている。
(Blocking agent)
For example, in the competitive method, there are biological samples that are negative in response to not only negative biological samples that do not contain progesterone but also positive biological samples that contain progesterone. The solution is recognized as an issue. The cause of such false negatives has not been clarified, but we do not want them to bind to each other due to the non-specific interaction between the surface of the labeled particles not covered by the antibody and the detection area (test area). It is believed that one of the causes is the presence of labeled particles. Further, even when the same substance as the substance existing on the test area is present on the surface of the labeled particle, if a released antibody or the like is present in the biological sample, the antibody is a substance existing on the test area. By binding to either the substance on the surface of the labeled particle, it may be detected as negative even when a positive biological sample containing progesterone is measured.
Generally, blocking with BSA is used to suppress non-specific adsorption on a solid phase surface (for example, a labeled particle surface or a gold film surface of a substrate).

(抗体)
本発明において、抗体は、その動物種やサブクラス等によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可能な抗体は、マウス、ラット、ハムスター、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、ニワトリなど免疫反応が起こり得る生物に由来する抗体、具体的には、マウスIgG、マウスIgM、ラットIgG、ラットIgM、ハムスターIgG、ハムスターIgM、ウサギIgG、ウサギIgM、ヤギIgG、ヤギIgM、ヒツジIgG、ヒツジIgM、ウシIgG、ウシIgM、トリIgY等であり、ポリクローナル又はモノクローナルのどちらも使用可能である。断片化抗体は、少なくとも1つの抗原結合部位を持つ、完全型抗体から導かれた分子であり、具体的にはF(ab’)、Fab、Fab’、又はFv等である。これらの断片化抗体は、酵素あるいは化学的処理によって、もしくは遺伝子工学的手法を用いて得られる分子である。
(antibody)
In the present invention, the antibody can be used regardless of its animal species, subclass, and the like. For example, the antibodies that can be used in the present invention are antibodies derived from organisms such as mice, rats, hamsters, goats, rabbits, sheep, cows, and chickens that can cause an immune reaction, specifically, mouse IgG and mouse IgM. , Rat IgG, Rat IgM, Hamster IgG, Hamster IgM, Rabbit IgG, Rabbit IgM, Goat IgG, Goat IgM, Sheep IgG, Sheep IgM, Bovine IgG, Bovine IgM, Trial IgY, etc. It is possible. A fragmented antibody is a molecule derived from a complete antibody having at least one antigen binding site, specifically F (ab') 2 , Fab, Fab', Fv, or the like. These fragmented antibodies are molecules obtained by enzymatic or chemical treatment, or by genetic engineering techniques.

(キットの他の要素)
本発明のキットは、プロゲステロンを測定する方法に用いられるものである。本発明のキットは、標識を有する第一の粒子と、標識を有しない第二の粒子とを含み、さらに第一の粒子及び第二の粒子を流すための流路と、第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板とを含むセンサチップを含む。本発明のキットにはさらに、表面プラズモン励起装置、及び蛍光測定デバイスなどの、プロゲステロンの測定に使用される各種の器材又は装置を含めてもよい。さらに、キットの要素として、既知量のプロゲステロンを含む試料、取扱説明書などを含めてもよい。
(Other elements of the kit)
The kit of the present invention is used for a method for measuring progesterone. The kit of the present invention includes a first particle having a label, a second particle without a label, a flow path for flowing the first particle and the second particle, and a first binding substance. Includes a sensor chip that includes a substrate with a substance that is binding to. The kit of the present invention may further include various devices or devices used for measuring progesterone, such as surface plasmon excitation devices and fluorescence measurement devices. Further, as an element of the kit, a sample containing a known amount of progesterone, an instruction manual, and the like may be included.

[プロゲステロンの測定方法]
さらに本発明によれば、
(i)(a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
(b)プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
(c)プロゲステロンを含む被検試料と、
を混合して、混合物を得る工程と、
(ii)工程(i)で得た混合物を、基板上に適用する工程と、
(iii)第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する、基板上の反応部位において、第一の結合物質を捕捉する工程と、
(iv)反応部位上に捕捉された第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を検出する工程と、
を含むプロゲステロンの測定方法であって、
標識を有する第一の粒子は、本明細書に記載した式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ第一の粒子の平均粒子径より第二の粒子の平均粒子径が大きい、
プロゲステロンの測定方法が提供される。
[Measurement method of progesterone]
Further, according to the present invention
(I) (a) Labeled first particles modified with a first binding agent having a specific binding property to progesterone.
(B) An unlabeled second particle modified with a second binding agent that does not have specific binding to progesterone.
(C) A test sample containing progesterone and
To obtain a mixture by mixing
(Ii) A step of applying the mixture obtained in step (i) onto a substrate, and
(Iii) A step of capturing the first binding substance at a reaction site on a substrate having a substance having a binding property to the first binding substance.
(Iv) A step of detecting a labeled first particle modified with a first binding agent captured on the reaction site.
A method for measuring progesterone, including
The labeled first particle contains at least one compound represented by the formula (1) described herein and the particle.
The average particle size of the first particle is 50 to 250 nm, the average particle size of the second particle is 70 to 500 nm, and the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of the first particle. ,
A method for measuring progesterone is provided.

本発明においては、反応部位上に捕捉された第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を検出することにより、プロゲステロンを測定する。
本発明における測定は、プロゲステロンの量の測定である限り、最も広い概念として解釈される。測定方法の具体的な実施態様としては、競合法が好ましい。
In the present invention, progesterone is measured by detecting the first labeled particle modified with the first binding agent captured on the reaction site.
The measurement in the present invention is interpreted as the broadest concept as long as it is a measurement of the amount of progesterone. As a specific embodiment of the measurement method, a competitive method is preferable.

プロゲステロンを定量する場合を以下に説明する。
競合法では、先ず、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されているプロゲステロン免疫測定用基板に、プロゲステロンを含む生体試料及び抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を接触させる。その生体試料中にプロゲステロンが存在しない場合には、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン(即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロン)とにより、基板上で抗原抗体反応が起こる。一方、生体試料中にプロゲステロンが存在する場合には、生体試料中のプロゲステロンと抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子との間で抗原抗体反応が起こり、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン(即ち、プロゲステロン・アルブミン結合体中の胆汁酸)との間の抗原抗体反応が阻害される。上記の反応が終了した後、基板上のアルブミンに結合しなかった抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を除去する。次いで基板上の免疫複合体(即ち、抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子と、基板上のプロゲステロン・アルブミン結合体中のプロゲステロンとの複合体)の形成の度合いを蛍光強度として検出することにより、生体試料中のプロゲステロンの濃度などを測定することができる。
The case of quantifying progesterone will be described below.
In the competitive method, first, a biological sample containing progesterone and anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles are brought into contact with a progesterone immunoassay substrate on which a progesterone / albumin conjugate is immobilized. In the absence of progesterone in the biological sample, the anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles and the progesterone on the substrate (ie, the progesterone in the progesterone-albumin conjugate) cause an antigen-antibody reaction on the substrate. On the other hand, when progesterone is present in the biological sample, an antigen-antibody reaction occurs between the progesterone in the biological sample and the anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles, and the anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles and the progesterone on the substrate (that is, that is) , Biliary acid in progesterone-albumin conjugate) is inhibited. After completion of the above reaction, the anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles that did not bind to albumin on the substrate are removed. Then, by detecting the degree of formation of an immune complex on the substrate (that is, a complex of anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles and progesterone in a progesterone-albumin-albumin conjugate on the substrate) as fluorescence intensity, in a biological sample. It is possible to measure the concentration of progesterone and the like.

競合法における蛍光の測定形態は、プレートリーダー測定、あるいはフロー測定のいずれかの測定を採用することが可能であり、例えば、以下の方法により測定することができる。予め、プロゲステロン濃度が異なるプロゲステロン量既知の試料を複数用意し、この試料及び抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を予め混合する。この混合液を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域に接触させる。プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている領域からの蛍光信号を、特定の時間間隔で混合液が結合体に接触している間、複数の蛍光信号として測定する。この複数の蛍光信号から、各プロゲステロン濃度において、蛍光量の時間変化(傾き)を求める。この時間変化をY軸、プロゲステロン濃度をX軸としてプロットし、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて、蛍光量の時間変化に対するプロゲステロン濃度の関係式を取得する。このように取得した関係式に基づき、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を用いて、生体試料に含まれるプロゲステロン量を定量することができる。 As the measurement form of fluorescence in the competitive method, either plate reader measurement or flow measurement can be adopted, and for example, the measurement can be performed by the following method. A plurality of samples having a known amount of progesterone having different progesterone concentrations are prepared in advance, and this sample and anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles are mixed in advance. The mixture is brought into contact with the region where the progesterone / albumin conjugate is immobilized. Fluorescence signals from the region where the progesterone albumin conjugate is immobilized are measured as multiple fluorescence signals while the mixture is in contact with the conjugate at specific time intervals. From these plurality of fluorescence signals, the time change (slope) of the amount of fluorescence is obtained at each progesterone concentration. This time change is plotted on the Y-axis and the progesterone concentration is plotted on the X-axis, and a relational expression of the progesterone concentration with respect to the time change of the fluorescence amount is obtained by using an appropriate fitting method such as the least squares method. Based on the relational expression thus obtained, the amount of progesterone contained in the biological sample can be quantified by using the result of the time change of the fluorescence amount using the biological sample to be inspected.

このプロゲステロン量の定量は、短時間で行うことが好ましい。具体的には、10分以内に行われることが好ましく、8分以内がより好ましく、更には6分以内で行われることが好ましい。この定量時間には、最小二乗法等の適宜ふさわしいフィッティング方法を用いて予め取得した蛍光量の時間変化とプロゲステロン濃度との関係式を利用して、試料及び抗プロゲステロン抗体標識蛍光粒子を、プロゲステロン・アルブミン結合体が固定化されている検出領域に接触させてから、検査目的とする生体試料を用いた蛍光量の時間変化の結果を基に生体試料に含まれるプロゲステロン量を換算する時間が含まれていることが好ましい。 The amount of progesterone is preferably quantified in a short time. Specifically, it is preferably performed within 10 minutes, more preferably within 8 minutes, and further preferably within 6 minutes. For this quantification time, the sample and the anti-progesterone antibody-labeled fluorescent particles were subjected to progesterone by using the relational expression between the time change of the amount of fluorescence and the progesterone concentration obtained in advance by using an appropriate fitting method such as the minimum square method. It includes the time to convert the amount of progesterone contained in the biological sample based on the result of the time change of the amount of fluorescence using the biological sample to be tested after contacting the detection region where the albumin conjugate is immobilized. Is preferable.

(表面プラズモン蛍光測定)
本発明における蛍光などの標識の検出方法としては、特に限定されないが、例えば、蛍光強度を検出することができる機器、具体的には、マイクロプレートリーダー、又は表面プラズモン励起による蛍光検出(SPF)を行うためのバイオセンサーなどを用いて蛍光強度を検出することが好ましい。好ましくは、表面プラズモン共鳴による蛍光検出により、プロゲステロンの量に関連した標識情報を取得することができる。
(Surface plasmon fluorescence measurement)
The method for detecting a label such as fluorescence in the present invention is not particularly limited, but for example, a device capable of detecting fluorescence intensity, specifically, a microplate reader or fluorescence detection (SPF) by surface plasmon excitation is used. It is preferable to detect the fluorescence intensity using a biosensor or the like. Preferably, fluorescence detection by surface plasmon resonance can obtain labeling information related to the amount of progesterone.

なお、蛍光の測定の形態は、プレートリーダー測定でもよいし、フロー測定でもよい。表面プラズモン励起による蛍光検出法(SPF法)は、落射励起による蛍光検出法(落射蛍光法)よりも高感度に測定することができる。 The form of fluorescence measurement may be plate reader measurement or flow measurement. The fluorescence detection method by surface plasmon excitation (SPF method) can measure with higher sensitivity than the fluorescence detection method by epi-emission excitation (epi-radiation fluorescence method).

表面プラズモン蛍光(SPF)バイオセンサーとしては、例えば、特開2008−249361号公報に記載されているような、所定波長の励起光を透過させる材料から形成された光導波路と、この光導波路の一表面に形成された金属膜と、光ビームを発生させる光源と、上記光ビームを光導波路に通し、上記光導波路と金属膜との界面に対して表面プラズモンを発生させる入射角で入射させる光学系と、上記表面プラズモンによって増強されたエバネッセント波によって励起されることによって発生する蛍光を検出する蛍光検出手段とを備えたセンサーを用いることができる。 Examples of the surface plasmon fluorescence (SPF) biosensor include an optical waveguide formed from a material that transmits excitation light having a predetermined wavelength, as described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2008-249361, and one of the optical waveguides. An optical system in which a metal film formed on the surface, a light source that generates a light beam, and the light beam are passed through an optical waveguide and incident on the interface between the optical waveguide and the metal film at an incident angle that generates surface plasmons. And a sensor provided with a fluorescence detecting means for detecting the fluorescence generated by being excited by the evanescent wave enhanced by the surface plasmon can be used.

本発明の蛍光粒子を用いた表面プラズモン励起による蛍光検出(SPF)系は、好ましくは、基板上の金属膜上に固定化されたプロゲステロンの量に依存した蛍光物質からの蛍光を検出するアッセイ方法であり、例えば、溶液中での反応の進行により、光学的な透明度の変化を濁度として検出する、いわゆるラテックス凝集法とは異なる方法である。ラテックス凝集法は、ラテックス試薬中の抗体感作ラテックスと生体試料中の抗原が、抗体反応により結合し凝集する。この凝集塊は時間と共に増大し、この凝集塊に近赤外光を照射して得られた単位時間当たりの吸光度変化から、抗原濃度を定量化する方法である。本発明では、ラテックス凝集法に比べて、非常に簡便なプロゲステロンの検出方法を提供できる。 The fluorescence detection (SPF) system by surface plasmon excitation using fluorescent particles of the present invention is preferably an assay method for detecting fluorescence from a fluorescent substance depending on the amount of progesterone immobilized on a metal film on a substrate. This is a method different from the so-called latex agglomeration method, in which, for example, a change in optical transparency is detected as turbidity due to the progress of the reaction in a solution. In the latex agglutination method, the antibody-sensitized latex in the latex reagent and the antigen in the biological sample are bound and aggregated by an antibody reaction. This agglomerate increases with time, and this is a method of quantifying the antigen concentration from the change in absorbance per unit time obtained by irradiating the agglutinate with near-infrared light. The present invention can provide a very simple method for detecting progesterone as compared with the latex agglutination method.

(規格化)
さらに本発明の方法は、標識粒子の量に関連した標識情報を取得する、標識粒子関連標識情報取得工程;及びプロゲステロンの量に関連した標識情報を取得するプロゲステロン関連標識情報取得工程で取得した標識情報を、標識粒子関連標識情報取得工程で取得した標識情報により規格化する、規格化工程を含む方法でもよい。
(Standardization)
Further, the method of the present invention is a labeling particle-related labeling information acquisition step of acquiring labeling information related to the amount of labeled particles; and a labeling acquired in the progesterone-related labeling information acquisition step of acquiring labeling information related to the amount of progesterone. A method including a standardization step of standardizing the information based on the labeling information acquired in the labeling particle-related labeling information acquisition step may also be used.

ここで、生体試料と、プロゲステロンと結合性を有する第一の結合物質を有する標識粒子とを含む混合液を、検出領域(テストエリア)と参照領域(コントロールエリア)とを有する基板に接触させて検出領域と参照領域上に表面プラズモンを発生させ、放出された蛍光の強度を測定する工程のうち、検出領域上で発生する表面プラズモンによる蛍光の強度を測定する工程が、プロゲステロンの量に関連した標識情報を取得するプロゲステロン関連標識情報取得工程であり、参照領域上で発生する表面プラズモンによる蛍光の強度を測定する工程が、標識粒子関連標識情報取得工程である。この2つの工程で取得した蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値の変化率として求め、検出領域のシグナル値の変化率を参照領域のシグナル値の変化率で除する工程が規格化工程である。 Here, a mixed solution containing a biological sample and labeled particles having a first binding substance having a binding property to progesterone is brought into contact with a substrate having a detection area (test area) and a reference area (control area). Among the steps of generating surface plasmons on the detection region and the reference region and measuring the intensity of emitted fluorescence, the step of measuring the intensity of fluorescence by the surface plasmon generated on the detection region was related to the amount of progesterone. The progesterone-related labeling information acquisition step for acquiring labeling information, and the step of measuring the intensity of fluorescence by surface plasmons generated on the reference region is the labeling particle-related labeling information acquisition step. The standardization step is to obtain the rate of increase of the fluorescence intensity acquired in these two steps in a unit time as the rate of change of the fluorescence signal value, and divide the rate of change of the signal value in the detection region by the rate of change of the signal value in the reference region. Is.

[プロゲステロン測定試薬]
さらに本発明によれば、(a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、(b)プロゲステロンと特異的な結合性を有しない第二の結合物質で修飾された、標識を有しない第二の粒子とを含む、プロゲステロン測定試薬であって、上記の標識を有する第一の粒子は、本明細書に記載した式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、上記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、上記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ上記第一の粒子の平均粒子径より上記第二の粒子の平均粒子径が大きい、プロゲステロン測定試薬が提供される。
上記したプロゲステロン測定試薬を用いて、本発明によるプロゲステロンの測定方法を実施することができる。
[Progesterone measurement reagent]
Further, according to the present invention, (a) the first particle having a label modified with the first binding substance having specific binding property to progesterone, and (b) having specific binding property to progesterone. A progesterone-measuring reagent comprising a second unlabeled particle modified with a second binding agent that does not, and the first particle having the above label is the formula (1) described herein. ), The first particles have an average particle size of 50 to 250 nm, the second particles have an average particle size of 70 to 500 nm, and the first particles have an average particle size of 70 to 500 nm. Provided is a progesterone measuring reagent in which the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of one particle.
The method for measuring progesterone according to the present invention can be carried out by using the above-mentioned reagent for measuring progesterone.

以下に、本発明の実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。なお、以下の実施例に示される材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されるべきものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples of the present invention. The materials, amounts used, proportions, treatment contents, treatment procedures, etc. shown in the following examples can be appropriately changed as long as they do not deviate from the gist of the present invention. Therefore, the scope of the present invention should not be construed as limited by the specific examples shown below.

<1>ラテックス粒子の調製
<1−1>平均粒子径303nmラテックス粒子の調製
スチレン(和光純薬社製)30g(288mmol)とアクリル酸(和光純薬社製)1g(12mmol)を超純水330mLに懸濁させ、85℃に昇温し、過硫酸カリウム(KPS)(和光純薬社製)1gを25mLに溶解させた水溶液を添加し、85℃、250rpmで6時間攪拌した。その後、10,000rpmで6時間遠心分離を3回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が1質量%となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))を用いて、温度25℃で測定したメジアン径(d=50)として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は303nmであった。
<1> Preparation of latex particles <1-1> Preparation of latex particles with an average particle size of 303 nm Ultra-pure water containing 30 g (288 mmol) of styrene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 1 g (12 mmol) of acrylic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) The mixture was suspended in 330 mL, heated to 85 ° C., an aqueous solution prepared by dissolving 1 g of potassium persulfate (KPS) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 25 mL was added, and the mixture was stirred at 85 ° C. and 250 rpm for 6 hours. Then, centrifugation was performed 3 times at 10,000 rpm for 6 hours to obtain latex particles. Finally, the obtained latex particles were redispersed in ultrapure water. Pure water was added to prepare a diluted solution so that the solid content concentration was 1% by mass. When determined as a median diameter (d = 50) measured at a temperature of 25 ° C. using a particle size analyzer FPAR-1000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.), the average particle size of the latex particles was 303 nm.

<1−2>平均粒子径220nmラテックス粒子の調製
スチレン(和光純薬社製)30g(288mmol)とアクリル酸(和光純薬社製)2g(24mmol)を超純水330mLに懸濁させ、85℃に昇温し、過硫酸カリウム(KPS)(和光純薬社製)1gを25mLに溶解させた水溶液を添加し、85℃、250rpmで6時間攪拌した。その後、10,000rpmで6時間遠心分離を3回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が1質量%となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))を用いて、温度25℃で測定したメジアン径(d=50)として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は220nmであった。
<1-2> Preparation of latex particles with an average particle diameter of 220 nm 30 g (288 mmol) of styrene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 2 g (24 mmol) of acrylic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are suspended in 330 mL of ultrapure water, and 85 The temperature was raised to ° C., an aqueous solution prepared by dissolving 1 g of potassium persulfate (KPS) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 25 mL was added, and the mixture was stirred at 85 ° C. and 250 rpm for 6 hours. Then, centrifugation was performed 3 times at 10,000 rpm for 6 hours to obtain latex particles. Finally, the obtained latex particles were redispersed in ultrapure water. Pure water was added to prepare a diluted solution so that the solid content concentration was 1% by mass. When determined as a median diameter (d = 50) measured at a temperature of 25 ° C. using a particle size analyzer FPAR-1000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.), the average particle size of the latex particles was 220 nm.

<1−3>平均粒子径151nmラテックス粒子の調製
スチレン(和光純薬社製)30g(288mmol)とアクリル酸(和光純薬社製)3g(42mmol)を超純水440mLに懸濁させ、95℃に昇温し、過硫酸カリウム(KPS)(和光純薬社製)1gを10mLに溶解させた水溶液を添加し、95℃、250rpmで6時間攪拌した。その後、10,000rpmで6時間遠心分離を3回行い、ラテックス粒子を得た。最後に、得られたラテックス粒子を超純水に再分散させた。固形分濃度が1質量%となるように、純水を添加して希釈液を調製した。粒径アナライザーFPAR−1000(大塚電子(株))を用いて、温度25℃で測定したメジアン径(d=50)として求めたところ、ラテックス粒子の平均粒子径は151nmであった。
<1-3> Preparation of latex particles with an average particle diameter of 151 nm 30 g (288 mmol) of styrene (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 3 g (42 mmol) of acrylic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were suspended in 440 mL of ultrapure water, and 95 The temperature was raised to ° C., an aqueous solution prepared by dissolving 1 g of potassium persulfate (KPS) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 10 mL was added, and the mixture was stirred at 95 ° C. and 250 rpm for 6 hours. Then, centrifugation was performed 3 times at 10,000 rpm for 6 hours to obtain latex particles. Finally, the obtained latex particles were redispersed in ultrapure water. Pure water was added to prepare a diluted solution so that the solid content concentration was 1% by mass. When determined as a median diameter (d = 50) measured at a temperature of 25 ° C. using a particle size analyzer FPAR-1000 (Otsuka Electronics Co., Ltd.), the average particle size of the latex particles was 151 nm.

<1−4>平均粒子径129、100、72nmラテックス粒子の調製
平均粒子径151nmのラテックス粒子の調製において、昇温時の温度を適宜調整することで、平均粒子径129、100、72nmのラテックス粒子を調製した。平均粒子径は<1−1>と同様に測定した。
<1-4> Preparation of Latex Particles with Average Particle Diameters 129, 100, 72 nm In the preparation of latex particles with an average particle diameter of 151 nm, latex having an average particle diameter of 129, 100, 72 nm is prepared by appropriately adjusting the temperature at the time of temperature rise. Particles were prepared. The average particle size was measured in the same manner as in <1-1>.

<2>比較用蛍光ラテックス粒子の調製
上記のように作製したラテックス粒子の固形分濃度2質量%の水分散液100mLにメタノール100mLを加え、10分間、室温で攪拌した。一方、別途用意した蛍光色素(比較化合物:特許3442777号公報記載の化合物5)を60分間かけてゆっくりラテックス溶液に滴下した。滴下完了後、エバポレーターで有機溶媒を減圧留去した後、遠心分離とPBS水溶液への再分散を3回繰り返し、精製を行うことで、平均粒子径が、302nm、218nm、150nm、132nm、98nm、71nmの6種類の比較用蛍光ラテックス粒子を調製した。
<2> Preparation of Fluorescent Latex Particles for Comparison 100 mL of methanol was added to 100 mL of an aqueous dispersion having a solid content concentration of 2% by mass of the latex particles prepared as described above, and the mixture was stirred at room temperature for 10 minutes. On the other hand, a separately prepared fluorescent dye (comparative compound: Compound 5 described in Japanese Patent No. 3442777) was slowly added dropwise to the latex solution over 60 minutes. After the dropping was completed, the organic solvent was distilled off under reduced pressure with an evaporator, and then centrifugation and redispersion in a PBS aqueous solution were repeated three times for purification, so that the average particle size was 302 nm, 218 nm, 150 nm, 132 nm, 98 nm. Six types of comparative fluorescent latex particles having a diameter of 71 nm were prepared.

<3>抗プロゲステロン抗体で修飾した比較用蛍光ラテックス粒子の調製
抗プロゲステロン抗体で修飾した蛍光粒子を、以下の通り調製した。
<2>で調製した平均粒子径150nmの2質量%(固形分濃度)蛍光ラテックス粒子水溶液を375μL準備し、50mmol/LのMES(2−モルホリノエタノスルホン酸、同仁化学研究所社製)緩衝液(pH6.0)を117μL、10mg/mLの水溶性カルボジイミド(water soluble carbodiimide:WSC)水溶液を5μL加え、室温で15分間攪拌した。その後、0.5mg/mLの抗プロゲステロンモノクローナル抗体(GeneTex社製)を182.4μL添加し、室温で1.5時間撹拌した。2mol/LのGlycine(和光純薬社製)水溶液を37.5μL添加し、15分間撹拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、30分)にて、蛍光ラテックス粒子を沈降させた。上清液を取り除き、PBS(Phosphate Buffered Saline リン酸緩衝生理食塩水;和光純薬社製)溶液(pH7.4)を750μL加え、超音波洗浄機により蛍光ラテックス粒子を再分散させた。さらに遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行い、上清液を除いた後、1質量%BSAを含むPBS(pH7.4)溶液750μLを加え、蛍光ラテックス粒子を再分散させることで、抗プロゲステロン抗体結合蛍光ラテックス粒子の1質量%溶液を得た。平均粒子径303nm、220nm、129nm、100nm、72nmの蛍光ラテックス粒子のプロゲステロン抗体修飾も同様に行った。
<3> Preparation of comparative fluorescent latex particles modified with anti-progesterone antibody
Fluorescent particles modified with an anti-progesterone antibody were prepared as follows.
Prepare 375 μL of a 2 mass% (solid content concentration) fluorescent latex particle aqueous solution having an average particle diameter of 150 nm prepared in <2>, and prepare a 50 mmol / L MES (2-morpholinoethanosulfonic acid, manufactured by Dojin Chemical Research Institute) buffer solution. 117 μL of (pH 6.0) was added to 5 μL of a 10 mg / mL water-soluble carbodiimide (WSC) aqueous solution, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes. Then, 182.4 μL of an anti-progesterone monoclonal antibody (manufactured by GeneTex) of 0.5 mg / mL was added, and the mixture was stirred at room temperature for 1.5 hours. 37.5 μL of a 2 mol / L Glycine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) aqueous solution was added, and the mixture was stirred for 15 minutes, and then the fluorescent latex particles were precipitated by centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C., 30 minutes). The supernatant was removed, 750 μL of PBS (Phosphate Buffered Saline; Phosphate Buffered Saline; manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) solution (pH 7.4) was added, and the fluorescent latex particles were redistributed by an ultrasonic cleaner. Further centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C., 15 minutes) is performed, the supernatant is removed, and then 750 μL of a PBS (pH 7.4) solution containing 1% by mass BSA is added to redistribute the fluorescent latex particles. A 1% by mass solution of anti-progesterone antibody-bound fluorescent latex particles was obtained. Progesterone antibody modification of fluorescent latex particles having an average particle size of 303 nm, 220 nm, 129 nm, 100 nm, and 72 nm was also performed in the same manner.

<4>蛍光標識を有しないラテックス粒子の調製
抗T4抗体で修飾したラテックス粒子を、以下の通り調製した。
<1−3>で調製した平均粒子径151nmの2質量%(固形分濃度)ラテックス粒子水溶液250μLに、50mmol/LのMESバッファー(pH6.0)溶液250μLを加え、5mg/mLの抗T4モノクローナル抗体(Medix社Anti−Thyroxineモノクローナル抗体(6901))100μLを添加し、室温で15分間攪拌した。その後、10mg/mLの1−エチル−3−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)水溶液を5μL加え、室温で2時間撹拌した。2mol/LのGlycine(和光純薬社製)水溶液を25μL添加して30分間撹拌した後、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行い、ラテックス粒子を沈降させた。その後上清を取り除き、PBS溶液(pH7.4)を500μL加え、超音波洗浄機によりラテックス粒子を再分散させた。再度、遠心分離(15,000rpm、4℃、15分)を行って上清を除いた後、1質量%BSAを含むPBS(pH7.4)溶液500μLを加えて、ラテックス粒子を再分散させることで、抗T4抗体結合ラテックス粒子の1質量%溶液を調製した。その他の粒子径(302nm、218nm、132nm、98nm、71nm)のラテックス粒子の抗T4抗体修飾も同様に行った。
<4> Preparation of Latex Particles Without Fluorescent Label Latex particles modified with anti-T4 antibody were prepared as follows.
To 250 μL of a 2 mass% (solid content concentration) latex particle aqueous solution having an average particle diameter of 151 nm prepared in <1-3>, 250 μL of a 50 mmol / L MES buffer (pH 6.0) solution was added, and a 5 mg / mL anti-T4 monoclonal antibody was added. 100 μL of an antibody (Medix Anti-Thyroxine Monoclonal Antibody (6901)) was added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes. Then, 5 μL of a 10 mg / mL 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) aqueous solution was added, and the mixture was stirred at room temperature for 2 hours. After adding 25 μL of a 2 mol / L Glycine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) aqueous solution and stirring for 30 minutes, centrifugation (15,000 rpm, 4 ° C., 15 minutes) was performed to settle the latex particles. Then, the supernatant was removed, 500 μL of PBS solution (pH 7.4) was added, and the latex particles were redispersed by an ultrasonic cleaner. Centrifuge again (15,000 rpm, 4 ° C., 15 minutes) to remove the supernatant, and then add 500 μL of PBS (pH 7.4) solution containing 1% by mass BSA to redistribute the latex particles. To prepare a 1% by mass solution of anti-T4 antibody-bound latex particles. Anti-T4 antibody modification of latex particles having other particle sizes (302 nm, 218 nm, 132 nm, 98 nm, 71 nm) was also performed in the same manner.

同様にして、抗hCG抗体(Medix社Anti−hCG betaモノクローナル抗体(5008))を用いて、それぞれの平均粒子径のラテックス粒子に対して抗hCG抗体修飾を行った。
無標識粒子のマウス抗体の種類の表記として、抗T4抗体を1、抗hCG抗体を2とし、下記の表3に記載した。
Similarly, using an anti-hCG antibody (Medix Anti-hCG beta monoclonal antibody (5008)), anti-hCG antibody modification was performed on latex particles having an average particle size.
As the notation of the type of mouse antibody of the unlabeled particles, the anti-T4 antibody was set to 1 and the anti-hCG antibody was set to 2, and they are shown in Table 3 below.

<5>高輝度蛍光ラテックス粒子の作製
<5−1>化合物の合成
用語は以下の意味を示す。
MS:質量分析 (mass spectrometry)
ESI:エレクトロスプレーイオン化(electrospray ionization)
NMR:核磁気共鳴(nuclear magnetic resonance)
rt:室温
Et:エチル基
PL:フォトルミネッセンス
THF:テトラヒドロフラン
<5> Preparation of high-intensity fluorescent latex particles <5-1> Synthesis of compounds The terms have the following meanings.
MS: mass spectrometry
ESI: Electrospray ionization
NMR: nuclear magnetic resonance
rt: Room temperature Et: Ethyl group PL: Photoluminescence THF: tetrahydrofuran

<<化合物(1)の合成>>

Figure 0006936383
<< Synthesis of compound (1) >>
Figure 0006936383

化合物(1−A)の合成
100mL三ツ口フラスコに、窒素雰囲気下、3,5−ビス(トリフルオロメチル)ベンズアルデヒド1.00g及びジクロロメタン20mLを導入し、室温で撹拌した。水冷しながら3−エチル−2,4−ジメチルピロール0.98gを滴下し、続いて、トリフルオロ酢酸を2滴加えた後、室温で30分間撹拌した。水冷しながらクロラニル1.0gを加え、室温で10分間撹拌した後、水冷しながらジイソプロピルエチルアミン(NiPr2Et)3.67gを滴下し、室温で15分間撹拌した。続いて、水冷しながら三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体5.6mLを滴下し、室温で30分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム及びトルエンを滴下し、抽出・分液して得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで予備乾燥した後、減圧濃縮した。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル)で精製した後、メタノールで再結晶することにより、化合物(1−A)を1.28g得た。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 8.03(s,1H),7.83(s,2H),2.54(s,6H),2.31(q,J=7.6Hz,4H),1.21(s,6H),1.00(t,J=7.6Hz,6H).
Synthesis of Compound (1-A) 1.00 g of 3,5-bis (trifluoromethyl) benzaldehyde and 20 mL of dichloromethane were introduced into a 100 mL three-necked flask under a nitrogen atmosphere, and the mixture was stirred at room temperature. While cooling with water, 0.98 g of 3-ethyl-2,4-dimethylpyrrole was added dropwise, followed by the addition of 2 drops of trifluoroacetic acid, followed by stirring at room temperature for 30 minutes. Chloranil 1.0g was added with water-cooling, followed by stirring at room temperature for 10 minutes, cooled and added dropwise diisopropylethylamine (N i Pr 2 Et) 3.67g while and stirred at room temperature for 15 minutes. Subsequently, 5.6 mL of boron trifluoride diethyl ether complex was added dropwise while cooling with water, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. Saturated sodium hydrogen carbonate and toluene were added dropwise, and the organic layer obtained by extraction and liquid separation was pre-dried with anhydrous sodium sulfate and then concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by silica gel column chromatography (developing solvent: hexane / ethyl acetate) and then recrystallized from methanol to obtain 1.28 g of compound (1-A).
1H NMR (CDCl 3,400MHz): δ 8.03 (s, 1H), 7.83 (s, 2H), 2.54 (s, 6H), 2.31 (q, J = 7.6Hz, 4H) , 1.21 (s, 6H), 1.00 (t, J = 7.6Hz, 6H).

化合物(1)の合成
100mL三ツ口フラスコに、化合物(1−A)100mg、2,4,6−トリメチルベンズアルデヒド115mg、及び脱水トルエン5mLを導入し、室温で撹拌した。ピペリジン1mL及びp−トルエンスルホン酸1水和物(和光純薬工業(株)社製、試薬特級)1片を加えて140℃で溶媒を留去しながら1時間撹拌し、放冷後に脱水トルエン5mLを加えて140℃で溶媒を留去しながら1時間撹拌した。反応液を減圧濃縮して得られた粗生成物を分取TLC(展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル)で精製した後、メタノールで再結晶することにより、化合物(1)を71mg得た。化合物の同定は、1H−NMRとESI−MSにより行った。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 8.06(s,1H),7.87(s,2H),7,38(d,J=17.2Hz,2H),7,32(d,J=17.2Hz,2H),6.93(s,4H),2.63(q,J=7.6Hz,4H),2.44(s,12H),2.30(s,6H),1.27(s,6H),1.17(t,J=7.6Hz,6H).
ESI−MS:[M−H]-=775.8
Synthesis of Compound (1) 100 mg of compound (1-A), 115 mg of 2,4,6-trimethylbenzaldehyde and 5 mL of dehydrated toluene were introduced into a 100 mL three-necked flask and stirred at room temperature. Add 1 mL of piperidine and 1 piece of p-toluenesulfonic acid monohydrate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., special grade reagent), stir for 1 hour while distilling off the solvent at 140 ° C., allow to cool, and then dehydrate toluene. 5 mL was added, and the mixture was stirred at 140 ° C. for 1 hour while distilling off the solvent. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, and the obtained crude product was purified by preparative TLC (developing solvent: hexane / ethyl acetate) and then recrystallized from methanol to obtain 71 mg of compound (1). Compounds were identified by 1 1 H-NMR and ESI-MS.
1H NMR (CDCl 3,400MHz): δ 8.06 (s, 1H), 7.87 (s, 2H), 7,38 (d, J = 17.2Hz, 2H), 7,32 (d, J = 17.2Hz, 2H), 6.93 (s, 4H), 2.63 (q, J = 7.6Hz, 4H), 2.44 (s, 12H), 2.30 (s, 6H), 1 .27 (s, 6H), 1.17 (t, J = 7.6Hz, 6H).
ESI-MS: [MH] - = 775.8

<化合物(5)の合成>

Figure 0006936383
<Synthesis of compound (5)>
Figure 0006936383

化合物(5−A)の合成
500mL三ツ口フラスコに、窒素雰囲気下、2,4−ジメチルピロール1.16ml及びジクロロメタン140mLを導入し、室温で撹拌した。2,3,5,6−テトラフルオロベンズアルデヒド1.0g、トリフルオロ酢酸1滴を加えた後、室温で15分間撹拌した。クロラニル(Chloranil)1.38gを加え、室温で15分間撹拌した後、水冷しながらジイソプロピルエチルアミン(NiPr2Et)6.8mLを滴下し、室温で20分間撹拌した。続いて、水冷しながら三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体(BF3・Et2O)7.8mLを滴下し、室温で30分間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム400mLを滴下し、ジクロロメタンで抽出・分液して得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで予備乾燥した後、減圧濃縮した。この粗生成物をシリカゲルカラムクロマグラフィー(展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル)で精製した後、メタノールで再結晶することにより、化合物(5−A)を360mg得た。
Synthesis of Compound (5-A) 1.16 ml of 2,4-dimethylpyrrole and 140 mL of dichloromethane were introduced into a 500 mL three-necked flask under a nitrogen atmosphere, and the mixture was stirred at room temperature. After adding 1.0 g of 2,3,5,6-tetrafluorobenzaldehyde and 1 drop of trifluoroacetic acid, the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes. Chloranil (chloranil) 1.38 g was added and stirred at room temperature for 15 minutes, cooled and added dropwise diisopropylethylamine (N i Pr 2 Et) 6.8mL while and stirred at room temperature for 20 minutes. Subsequently, 7.8 mL of boron trifluoride diethyl ether complex (BF 3 · Et 2 O) was added dropwise while cooling with water, and the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes. 400 mL of saturated sodium hydrogen carbonate was added dropwise, and the organic layer obtained by extracting and separating with dichloromethane was pre-dried with anhydrous sodium sulfate, and then concentrated under reduced pressure. The crude product was purified by silica gel column chromatography (developing solvent: hexane / ethyl acetate) and then recrystallized from methanol to obtain 360 mg of compound (5-A).

化合物(5−B)の合成

Figure 0006936383
Synthesis of compound (5-B)
Figure 0006936383

300mL三ツ口フラスコに、化合物(5−A)を300mg、及び1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール8mLを導入し、室温で撹拌した。N−ヨードスクシンイミド409mgを導入し、室温で1時間半撹拌した。反応液を減圧濃縮した後、塩化メチレン40mLを加え、抽出・分液して得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで予備乾燥した後、ろ過を施し減圧濃縮した。この粗生成物にエタノールを加えて分散洗浄及びろ過を施すことにより、化合物(5−B)を382mg得た。 300 mg of compound (5-A) and 8 mL of 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol were introduced into a 300 mL three-necked flask, and the mixture was stirred at room temperature. 409 mg of N-iodosuccinimide was introduced, and the mixture was stirred at room temperature for one and a half hours. The reaction mixture was concentrated under reduced pressure, 40 mL of methylene chloride was added, and the organic layer obtained by extraction and separation was pre-dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and concentrated under reduced pressure. Ethanol was added to this crude product, and the mixture was washed and filtered to obtain 382 mg of compound (5-B).

化合物(5−C)の合成

Figure 0006936383
Synthesis of compound (5-C)
Figure 0006936383

100mL三ツ口フラスコに、化合物(5−B)を278mg、2,4,6−トリメチルフェニルボロン酸564mg、フッ化セシウム653mg、及びメトキシシクロペンタン43mLを導入し、室温で撹拌しながら、減圧脱気後、窒素雰囲気にした。ここに、SPhos Pd G3(Aldrich製)269mgを加え、1時間加熱還流した。酢酸エチル250mLを加え、抽出・分液して得られた有機層を無水硫酸ナトリウムで予備乾燥した後、減圧濃縮した。この組成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン/酢酸エチル)で精製した後、ジクロロメタン5mlに溶解させ、さらにメタノール15mlを加えた後にジクロロメタンを留去し、再沈殿させた。沈殿物をろ過し、化合物(5−C)206mgを得た。 278 mg of compound (5-B), 564 mg of 2,4,6-trimethylphenylboronic acid, 653 mg of cesium fluoride, and 43 mL of methoxycyclopentane were introduced into a 100 mL three-necked flask, and after degassing under reduced pressure while stirring at room temperature. , Nitrogen atmosphere. To this, 269 mg of SPhos Pd G3 (manufactured by Aldrich) was added, and the mixture was heated under reflux for 1 hour. 250 mL of ethyl acetate was added, and the organic layer obtained by extraction and liquid separation was pre-dried with anhydrous sodium sulfate, and then concentrated under reduced pressure. This composition was purified by silica gel column chromatography (developing solvent: hexane / ethyl acetate), dissolved in 5 ml of dichloromethane, and 15 ml of methanol was further added, and then dichloromethane was distilled off and reprecipitated. The precipitate was filtered to give 206 mg of compound (5-C).

化合物(5)の合成

Figure 0006936383
Synthesis of compound (5)
Figure 0006936383

100mL三ツ口フラスコに、化合物(5−C)を50mg、トルエン5ml、2,4,6−トリメチルベンズアルデヒド46μl、ピペリジン400μl、p−トルエンスルホン酸1片を導入し、窒素下で1時間加熱還流した。2,4,6−トリメチルベンズアルデヒド46μlを追添して1時間加熱還流させた後、ピペリジン200μlを追添してさらに1時間加熱還流させた。反応終了後、減圧濃縮し、この粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒:ヘキサン/トルエン)で精製した後、ジクロロメタン3mlに溶解させ、メタノール15mlを加えた後にジクロロメタンを留去し、再沈殿させることにより、化合物(5)を16mg得た。化合物の同定は、1H−NMRとESI−MSにより行った。
1H NMR(CDCl3,400MHz):δ 7.43(s,1H),7.39(s,1H),7.29−7.21(m,1H),6.94(s,4H),6.80(s,4H),6.69(s,1H),6.65(s,1H),2.29(s,6H),2.23(s,6H),2.08(s,12H),2.03(s,12H),1.33(s,6H).
ESI−MS:[M−H]-=891.4
50 mg of compound (5-C), 5 ml of toluene, 46 μl of 2,4,6-trimethylbenzaldehyde, 400 μl of piperidine, and one piece of p-toluenesulfonic acid were introduced into a 100 mL three-necked flask, and the mixture was heated under reflux for 1 hour under nitrogen. After adding 46 μl of 2,4,6-trimethylbenzaldehyde and heating and refluxing for 1 hour, 200 μl of piperidine was added and heated to reflux for another hour. After completion of the reaction, the mixture was concentrated under reduced pressure, the crude product was purified by silica gel column chromatography (developing solvent: hexane / toluene), dissolved in 3 ml of dichloromethane, 15 ml of methanol was added, and dichloromethane was distilled off, and reprecipitation was performed. To obtain 16 mg of compound (5). Compounds were identified by 1 1 H-NMR and ESI-MS.
1 1 H NMR (CDCl 3 , 400 MHz): δ 7.43 (s, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.29-7.21 (m, 1H), 6.94 (s, 4H) , 6.80 (s, 4H), 6.69 (s, 1H), 6.65 (s, 1H), 2.29 (s, 6H), 2.23 (s, 6H), 2.08 ( s, 12H), 2.03 (s, 12H), 1.33 (s, 6H).
ESI-MS: [MH] - = 891.4

<5−2>高輝度蛍光ラテックス粒子の作製
<1−3>で調製した固形分濃度が2質量%の平均粒子径151nmのラテックス粒子分散液(ラテックス分散液25mL、固形分500mg)に対してTHF(5mL)を滴下して10分攪拌した。そこに、化合物(5)48μmol/gを含むTHF溶液(2.5mL)を15分間かけて滴下した。そこに化合物(1)48μmol/gを含むTHF溶液(2.5mL)を15分間かけて滴下した。化合物の滴下終了後、30分攪拌した後、減圧濃縮してTHFを除去した。その後、遠心分離して粒子を沈殿させた後、超純水を加えて再度分散させることで固形分濃度2質量%の高輝度蛍光ラテックス粒子の分散液を調製した。また、化合物(1)の代わりに化合物(5)を用いて同様の操作を行い、化合物(5)を含む固形分濃度2質量%の高輝度蛍光ラテックス分散液を調製した。
さらに、化合物(1)24μmol/gと化合物(5)12μmol/gを混合したものを用いて同様の操作を行い、化合物(1)と化合物(5)を含む固形分濃度2質量%の高輝度蛍光ラテックス分散液を調製した。
<5-2> Preparation of high-intensity fluorescent latex particles With respect to the latex particle dispersion (latex dispersion 25 mL, solid content 500 mg) having an average particle diameter of 151 nm and a solid content concentration of 2% by mass prepared in <1-3>. THF (5 mL) was added dropwise and the mixture was stirred for 10 minutes. A THF solution (2.5 mL) containing 48 μmol / g of compound (5) was added dropwise thereto over 15 minutes. A THF solution (2.5 mL) containing 48 μmol / g of compound (1) was added dropwise thereto over 15 minutes. After completion of dropping the compound, the mixture was stirred for 30 minutes and then concentrated under reduced pressure to remove THF. Then, after centrifuging to precipitate the particles, ultrapure water was added and dispersed again to prepare a dispersion liquid of high-intensity fluorescent latex particles having a solid content concentration of 2% by mass. Further, the same operation was carried out using compound (5) instead of compound (1) to prepare a high-intensity fluorescent latex dispersion containing compound (5) and having a solid content concentration of 2% by mass.
Further, the same operation was performed using a mixture of compound (1) 24 μmol / g and compound (5) 12 μmol / g, and high brightness with a solid content concentration of 2% by mass containing compound (1) and compound (5) was performed. A fluorescent latex dispersion was prepared.

その他の平均粒子径(303nm、220nm、129nm、100nm、72nm)のラテックス粒子についても同様の操作を行い、化合物(1)のみ、化合物(5)のみ、及び、化合物(1)と化合物(5)を同時に含む固形分濃度2質量%の高輝度蛍光ラテックス分散液をそれぞれ調製した。 The same operation was performed for latex particles having other average particle diameters (303 nm, 220 nm, 129 nm, 100 nm, 72 nm), and the same operation was performed for compound (1) only, compound (5) only, and compound (1) and compound (5). A high-intensity fluorescent latex dispersion having a solid content concentration of 2% by mass was prepared.

<5−3>抗プロゲステロン抗体で修飾した高輝度蛍光ラテックス粒子の調製
<5−2>で調製した固形分濃度が2質量%の高輝度蛍光ラテックス粒子それぞれを用いて<3>と同様の作業を実施し、平均粒子径303nm、220nm、151nm、129nm、100nm、72nmの抗プロゲステロン抗体結合高輝度蛍光ラテックス粒子の1質量%溶液を調製した。
<5-3> Preparation of high-intensity fluorescent latex particles modified with anti-progesterone antibody
The same operation as in <3> was carried out using each of the high-intensity fluorescent latex particles having a solid content concentration of 2% by mass prepared in <5-2>, and the average particle diameters were 303 nm, 220 nm, 151 nm, 129 nm, 100 nm, and 72 nm. A 1% by mass solution of anti-progesterone antibody-bound high-intensity fluorescent latex particles was prepared.

<6>蛍光標識粒子と、蛍光標識をしない粒子の乾燥粒子の作製
超純水280μL、12.5質量%スクロース水溶液427μL、20質量%BSA水溶液133μL、1質量%抗プロゲステロン抗体修飾蛍光ラテックス粒子(平均粒子径150nm)80μL、1質量%抗T4抗体修飾ラテックス粒子(平均粒子径150nm)80μLを混合した。ポリプロピレン(プライムポリマー社製、プライムポリプロ ランダムPPグレード)を基体としたカップを準備し、15μL点着した。その後、スーパードライ乾燥機(TOYOリビング社、ウルトラスーパードライ00シリーズ)を用いて、12時間かけて含水量を25質量%以下となるまで乾燥させ、乾燥粒子を作製した。他の実験水準に使用した乾燥粒子については、ラテックス粒子の平均粒子径、および抗プロゲステロン抗体修飾蛍光ラテックス粒子と、抗T4抗体修飾ラテックス粒子の使用する質量比率を表3に示すように適宜変更して、乾燥粒子を作製した。
<6> Preparation of Fluorescent Labeled Particles and Dry Particles of Non-Fluorescent Labeled Particles 280 μL of ultra-pure water, 427 μL of 12.5 mass% sucrose aqueous solution, 133 μL of 20 mass% BSA aqueous solution, 1 mass% anti-progesterone antibody-modified fluorescent latex particles ( 80 μL of 1% by mass anti-T4 antibody modified latex particles (average particle size 150 nm) (80 μL) were mixed. A cup based on polypropylene (Prime Polypro Random PP Grade, manufactured by Prime Polymer Co., Ltd.) was prepared and spotted at 15 μL. Then, using a super dry dryer (TOYO Living Co., Ltd., Ultra Super Dry 00 series), the particles were dried over 12 hours until the water content became 25% by mass or less to prepare dried particles. For the dry particles used for other experimental levels, the average particle size of the latex particles and the mass ratio of the anti-progesterone antibody-modified fluorescent latex particles to the anti-T4 antibody-modified latex particles were appropriately changed as shown in Table 3. To prepare dry particles.

<7>基板の作製
<7−1>プロゲステロン−BSA結合体のクエン酸緩衝液の溶液の調製
プロゲステロン−BSA結合体(BIO−RAD社製)150μgを、50mmol/L濃度のクエン酸緩衝液1mL(pH5.2、150mmol/L NaCl)に添加して溶解させ、クエン酸緩衝液の溶液を得た。
<7> Preparation of substrate <7-1> Preparation of solution of citrate buffer solution of progesterone-BSA conjugate 150 μg of progesterone-BSA conjugate (manufactured by BIO-RAD), 1 mL of citrate buffer solution having a concentration of 50 mmol / L It was added to (pH 5.2, 150 mmol / L NaCl) and dissolved to obtain a solution of citrate buffer.

<7−2>抗マウス抗体の作製
マウス由来のグロブリン(LAMPIRE Biological Laboratories社製、カタログ番号7404302、Mouse Gamma Globulin Salt Fractionation、500mg)を準備し、完全フロイントアジュバント(CFA)と混合したエマルジョンを初回投与し、2〜4回目の免疫には不完全アジュバント(IFA)と混合したエマルジョンを投与する方法で、ヤギへ免疫感作(皮下免疫)を2週間隔で4回免疫を行った。その後、ELISA測定を行って抗体価の上昇を確認した後に全採血を行い、遠心分離により抗血清を得た。その後、Protein Aカラム(Thermo scientific社製Pierce ProteinA Columns、カタログ番号20356)により精製し、目的の抗マウス抗体を取得した。
<7-2> Preparation of anti-mouse antibody A mouse-derived globulin (LAMPIRE Biologic Laboratories, Catalog No. 7404302, Mouse Gamma Globulin Salt Fractionation, 500 mg) was prepared, and an emulsion mixed with a complete Freund's adjuvant (CFA) was administered for the first time. Then, for the 2nd to 4th immunization, an emulsion mixed with an incomplete adjuvant (IFA) was administered, and the goat was immunized with immunosensitization (subcutaneous immunization) four times at 2-week intervals. Then, after confirming an increase in antibody titer by ELISA measurement, whole blood was collected and antiserum was obtained by centrifugation. Then, it was purified by a Protein A column (Pierce Protein A Colons manufactured by Thermo Scientific, Catalog No. 20356) to obtain the desired anti-mouse antibody.

<7−3>プロゲステロン−BSA結合体固定基板の作製
ポリメチルメタクリレート(PMMA)の基体(三菱レイヨン(株)社製、アクリペットVH)を準備し、マグネトロンスパッタ法により、検出領域と参照領域の2箇所に、それぞれ厚さ45nmの金膜を片面に幅4mm、長さ3mmとなるように作製して基板を構成するためのチップを作製した。このチップの検出領域の金膜面上に、<7−1>で調製したプロゲステロン−BSA結合体のクエン酸緩衝液による溶液を点着して乾燥させ、プロゲステロン−BSA結合体を固定化した基板を作製した。また、それぞれの基板の参照領域には、<7−2>で作製した抗マウス抗体を含む液(濃度:50μg/mL in 50mmol/L MES緩衝液 pH6,150mmol/L NaCl)を点着して、乾燥させた。
<7-3> Preparation of Progesterone-BSA Combined Fixing Substrate A polymethylmethacrylate (PMMA) substrate (Acrypet VH manufactured by Mitsubishi Rayon Co., Ltd.) was prepared, and the detection region and the reference region were separated by the magnetron sputtering method. A gold film having a thickness of 45 nm was prepared at two locations on one side so as to have a width of 4 mm and a length of 3 mm, respectively, to prepare chips for forming a substrate. A substrate on which the progesterone-BSA conjugate was immobilized by instilling a solution of the progesterone-BSA conjugate prepared in <7-1> with a citrate buffer solution on the gold film surface of the detection region of this chip and drying the solution. Was produced. In addition, a solution containing the anti-mouse antibody prepared in <7-2> (concentration: 50 μg / mL in 50 mmol / L MES buffer pH 6,150 mmol / L NaCl) was instilled in the reference region of each substrate. , Dried.

<8>基板の洗浄およびブロッキング
このように調製した基板をセンサチップの流路に取り付ける前に、予め調製した洗浄用溶液(0.05質量%Tween(登録商標)20(ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウラート、和光純薬社製)を含むPBS溶液(pH7.4))を300μL用いて3回繰り返し洗浄した。洗浄終了後、金薄膜上の抗体の未吸着部分のブロッキングを行うため、1質量%カゼイン(Thermo Scientific社製)を含むPBS溶液(pH7.4)を300μL添加し、1時間、室温で静置した。上記の洗浄用溶液で洗浄後、安定化剤としてImmunoassay Stabilizer(ABI社製)300μLを添加し、室温で30分間放置し、溶液を除去して乾燥機を用いて水分を完全に取り除いた。
<8> Cleaning and blocking of the substrate Before attaching the substrate prepared in this manner to the flow path of the sensor chip, a cleaning solution prepared in advance (0.05 mass% Tween® 20 (polyoxyethylene (20)). A PBS solution (pH 7.4) containing sorbitan monolaurate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was washed repeatedly 3 times with 300 μL. After washing, 300 μL of PBS solution (pH 7.4) containing 1% by mass casein (manufactured by Thermo Scientific) was added to block the unadsorbed portion of the antibody on the gold thin film, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 1 hour. bottom. After washing with the above washing solution, 300 μL of Immunoassay Stabilizer (manufactured by ABI) was added as a stabilizer, left at room temperature for 30 minutes, the solution was removed, and water was completely removed using a dryer.

<9>センサチップの作製
特開2010−190880号公報の第2の実施形態の構成となるように、作製した基板を流路に封入し、流路型センサチップを作製した。その概略図を図1および図2に示した。図1は、センサチップ1の概略図であり、図2は、センサチップ1の分解図である。センサチップ1は、上部部材2、中間部材3および基板4から構成されている。上部部材2には、第一の容器5および第二の容器6が設けられている。なお、第一の容器5および第二の容器6を併せて、容器群7と称する。基板4には、流路10が形成されており、流路10の上には、検出領域8および参照領域9が形成されている。
<9> Manufacture of sensor chip
The prepared substrate was enclosed in a flow path to prepare a flow path type sensor chip so as to have the configuration of the second embodiment of Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-190880. The schematic view is shown in FIGS. 1 and 2. FIG. 1 is a schematic view of the sensor chip 1, and FIG. 2 is an exploded view of the sensor chip 1. The sensor chip 1 is composed of an upper member 2, an intermediate member 3, and a substrate 4. The upper member 2 is provided with a first container 5 and a second container 6. The first container 5 and the second container 6 are collectively referred to as a container group 7. A flow path 10 is formed on the substrate 4, and a detection region 8 and a reference region 9 are formed on the flow path 10.

<10>被検試料の準備
検量線評価用に、各種濃度(0.00ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、15.0ng/mL、30.0ng/mL、45.0ng/mL)のプロゲステロンを含む試料を用意した。
また、性能評価用に、イヌ血清として北山ラベスから購入した東洋ビーグル犬の血清を使用し、被検試料(検体)No. 1〜11を用意した。
<10> Preparation of test sample Various concentrations (0.00 ng / mL, 0.5 ng / mL, 2.0 ng / mL, 15.0 ng / mL, 30.0 ng / mL, 45.0 ng) for calibration curve evaluation A sample containing progesterone (/ mL) was prepared.
In addition, for performance evaluation, oriental beagle dog serum purchased from Kitayama Labes was used as dog serum, and test samples (samples) Nos. 1 to 11 were prepared.

<11>蛍光粒子を用いたプロゲステロンの免疫測定
<6>で調製した、カップ内の乾燥粒子を、25℃50%RH(相対湿度)の環境下で15日間保存した後、このカップ内に、<10>で準備した各種濃度のプロゲステロンを含む試料、及び被検試料(検体)それぞれ100μLと、塩化マグネシウム44μmolを充分に混合して調製した混合試料を点着し、10分間攪拌しながら混合して混合液を得た。次に、<9>で作製した、基板を封入した流路型センサチップに、得られた混合液を点着した。点着後、ポンプ吸引を行いながら混合液1を10μL/minの速度で流下させた。プロゲステロン−BSA結合体を固定した金薄膜面上の蛍光強度を1.5分間継続して測定した。得られた蛍光強度の単位時間における増加速度を蛍光シグナル値として求めた。
<11> Immunoassay of progesterone using fluorescent particles
The dry particles in the cup prepared in <6> are stored in an environment of 25 ° C. and 50% RH (relative humidity) for 15 days, and then the cup contains various concentrations of progesterone prepared in <10>. A mixed sample prepared by sufficiently mixing 100 μL of each of the sample and the test sample (sample) and 44 μmol of magnesium chloride was instilled and mixed with stirring for 10 minutes to obtain a mixed solution. Next, the obtained mixed liquid was instilled on the flow path type sensor chip in which the substrate was sealed, which was produced in <9>. After the instillation, the mixed solution 1 was allowed to flow down at a rate of 10 μL / min while sucking with a pump. The fluorescence intensity on the surface of the gold thin film on which the progesterone-BSA conjugate was fixed was continuously measured for 1.5 minutes. The rate of increase of the obtained fluorescence intensity in a unit time was determined as the fluorescence signal value.

<12>検量線の作成
文献「The Immunoassay Handbook Third Edition Edited by David Wild(2005)」に競合法の検量線として、シグモイド関数の4パラメータロジスティック曲線モデルが適用できることが記載されており、この方法に従って、近似線を得る方法として一般的に知られている最小二乗法を用いて、下記の表3に記載された比較例、及び実施例ごとに、<11>で測定したプロゲステロンを含む試料の各種濃度(0.00ng/mL、0.5ng/mL、2.0ng/mL、15.0ng/mL、30.0ng/mL、45.0ng/mL)における蛍光シグナル値の各点の最近傍を通る4パラメータロジスティック曲線を求め、検量線とした。
<12> Preparation of calibration curve It is described in the document "The Immunoassay Handbook Third Edition Edition by David Wild (2005)" that a 4-parameter logistic curve model of a sigmoid function can be applied as a calibration curve of a competitive method. , Various samples containing progesterone measured in <11> for each of the comparative examples and examples shown in Table 3 below, using the least squares method generally known as a method for obtaining an approximate curve. Passes near each point of fluorescence signal value at concentration (0.00 ng / mL, 0.5 ng / mL, 2.0 ng / mL, 15.0 ng / mL, 30.0 ng / mL, 45.0 ng / mL) A 4-parameter logistic curve was obtained and used as a calibration curve.

以上のようにして求めた検量線から、被検試料(検体)No.1〜11の各々のプロゲステロン濃度の測定値を算出した。 From the calibration curve obtained as described above, the test sample (sample) No. The measured values of each progesterone concentration of 1 to 11 were calculated.

性能は検量線の規格を満たすかどうかで判定した。検量線は2箇所で規格を決定した。一つ目はプロゲステロンの低濃度域の検量線の傾きであり、逆数を取って、1.4以内であることを規格とした。二つ目はプロゲステロンの高濃度域の測定点の検量線からの乖離(ズレ)であり、2%以内を規格とした。これらの規格の範囲内では、測定値の変動係数が10%以内を実現でき、且つ、正確度が10%以内であることが実現できるので、低濃度域から高濃度域の全領域にわたって非常に精度の高い測定が可能となる。 Performance was judged by whether or not it met the standard of the calibration curve. The standard for the calibration curve was determined at two points. The first is the slope of the calibration curve in the low concentration range of progesterone, and the reciprocal was taken and the standard was set to be within 1.4. The second is the deviation (deviation) of the measurement point in the high concentration range of progesterone from the calibration curve, and the standard is within 2%. Within the range of these standards, the coefficient of variation of the measured value can be achieved within 10%, and the accuracy can be achieved within 10%. Highly accurate measurement is possible.

規格として決定した低濃度域のプロゲステロンの濃度は、臨床的に意義のあるプロゲステロンの最小濃度である0.5ng/mLにおける検量線の傾きを求めた。また、規格として決定した高濃度域については、プロゲステロン濃度が30.0ng/mLと45.0ng/mLのそれぞれの検量線からの乖離(ズレ)を求め、平均値を算出して評価した。結果を表3にまとめた。 For the concentration of progesterone in the low concentration range determined as a standard, the slope of the calibration curve at 0.5 ng / mL, which is the minimum concentration of clinically significant progesterone, was determined. In addition, for the high concentration range determined as a standard, the deviation (deviation) from the calibration curves of the progesterone concentration of 30.0 ng / mL and 45.0 ng / mL was calculated, and the average value was calculated and evaluated. The results are summarized in Table 3.

<13>対照機による測定
免疫測定で、当業者により広く使用されている大型機であるシーメンス社IMMULYZE1000全自動免疫化学発光測定装置により、取り扱い説明書に従い、被検試料中の被検物質の測定を行った。測定は、<10>で準備した被検試料(検体)No. 1〜11に対して行った。本発明は、対照機で測定した測定値を基準にし、迅速で簡便に測定が可能となる発明であり、対照機の測定値との差が小さいことが必要であり、被検試料(検体)No. 1に対して、大型機から求めたプロゲステロン測定値と、12.で作成した検量線から求めたプロゲステロン測定値(本発明 プロゲステロン測定値)を用いて以下の基準で評価し、結果を表3に示した。
<13> Measurement by control machine Measurement of test substance in test sample by Siemens IMMULYZE1000 fully automatic immunochemiluminescence measuring device, which is a large machine widely used by those skilled in the art, according to the instruction manual. Was done. The measurement was performed on the test samples (samples) Nos. 1 to 11 prepared in <10>. The present invention is an invention that enables quick and easy measurement based on the measured value measured by the control machine, and it is necessary that the difference from the measured value of the control machine is small, and the test sample (specimen). For No. 1, the measured value of progesterone obtained from a large machine and 12. The progesterone measurement value (progesterone measurement value of the present invention) obtained from the calibration curve prepared in 1 was evaluated according to the following criteria, and the results are shown in Table 3.

大型機との乖離幅(%)の計算式

Figure 0006936383
Calculation formula of the deviation width (%) from the large machine
Figure 0006936383

<評価基準>
低濃度域の検量線傾きの逆数は、1.4以内の場合の判定をAとし、1.5より大きい場合の判定をBとし、Aの判定を許容範囲とした。
高濃度域での検量線からのズレは、1.5%未満の場合の判定をA、1.5%以上2%以下の場合の判定をB、2%より大きい場合の判定をCとし、A及びBの判定を許容範囲とした。
大型機との乖離幅(%)は、2.0%未満の判定をA、2.0%以上5.0%未満の判定をB、5.0%以上の判定をCとし、A及びBの判定を許容範囲とした。
<Evaluation criteria>
For the reciprocal of the calibration curve slope in the low concentration range, the judgment when it was within 1.4 was defined as A, the judgment when it was greater than 1.5 was defined as B, and the determination of A was defined as the allowable range.
Regarding the deviation from the calibration curve in the high concentration range, the judgment when it is less than 1.5% is A, the judgment when it is 1.5% or more and 2% or less is B, and the judgment when it is larger than 2% is C. The judgments of A and B were set as the allowable range.
The deviation width (%) from the large machine is A and B, where the judgment of less than 2.0% is A, the judgment of 2.0% or more and less than 5.0% is B, and the judgment of 5.0% or more is C. Was set as the permissible range.

<14>粒子蛍光強度(相対値)の測定
上記で固形分濃度2質量%の蛍光ラテックス分散液を超純水で200倍に希釈し、蛍光分光光度計RF−5300PC(島津製作所製)の励起光を658nmに設定し、測定を行った。蛍光ラテックス分散液の蛍光強度が測定範囲を超えるほど高い場合には、蛍光強度の極大値が測定可能な範囲まで超純水で希釈を行った。<6>で作製した蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値に対する、蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値を粒子蛍光強度(相対値)とした。算出に用いた計算式を以下に示す。
蛍光強度(相対値)=(蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値)/(<6>で作製した蛍光ラテックス分散液の発光スペクトルの蛍光強度の積分値)
<14> Measurement of particle fluorescence intensity (relative value) The fluorescence latex dispersion having a solid content concentration of 2% by mass was diluted 200-fold with ultrapure water, and the fluorescence spectrophotometer RF-5300PC (manufactured by Shimadzu Corporation) was excited. The light was set to 658 nm and the measurement was performed. When the fluorescence intensity of the fluorescent latex dispersion was so high that it exceeded the measurement range, it was diluted with ultrapure water until the maximum value of the fluorescence intensity was measurable. The integral value of the fluorescence intensity of the emission spectrum of the fluorescent latex dispersion with respect to the integral value of the fluorescence intensity of the emission spectrum of the fluorescence latex dispersion prepared in <6> was defined as the particle fluorescence intensity (relative value). The calculation formula used for the calculation is shown below.
Fluorescence intensity (relative value) = (integral value of fluorescence intensity of emission spectrum of fluorescent latex dispersion) / (integral value of fluorescence intensity of emission spectrum of fluorescence latex dispersion prepared in <6>)

結果を表3に示す。 The results are shown in Table 3.

Figure 0006936383
Figure 0006936383
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Figure 0006936383
Figure 0006936383

表3の結果から、本発明の高輝度粒子、および無標識粒子を使用することで、測定範囲全般で高精度に測定できることがわかり、本発明の効果が確認された。 From the results in Table 3, it was found that by using the high-luminance particles of the present invention and the unlabeled particles, it was possible to measure with high accuracy over the entire measurement range, and the effect of the present invention was confirmed.

1 センサチップ
2 上部部材
3 中間部材
4 基板
5 第一の容器
6 第二の容器
7 容器群
8 検出領域
9 参照領域
10 流路
1 Sensor chip 2 Upper member 3 Intermediate member 4 Substrate 5 First container 6 Second container 7 Container group 8 Detection area 9 Reference area 10 Flow path

Claims (20)

プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
プロゲステロン以外の抗原に対する抗体で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
前記第一の粒子及び前記第二の粒子を流すための流路と、
前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する基板と、
を含むプロゲステロン測定キットであって、
前記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
前記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、前記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ前記第一の粒子の平均粒子径より前記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
キット。
Figure 0006936383
式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 0006936383
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
A labeled first particle modified with a first binding agent that has specific binding to progesterone,
An unlabeled second particle modified with an antibody against an antigen other than progesterone,
A flow path for flowing the first particle and the second particle, and
A substrate having a substance having a binding property to the first binding substance,
A progesterone measurement kit that contains
The first particle having the above-mentioned label contains at least one compound represented by the following formula (1) and the particle.
The average particle size of the first particle is 50 to 250 nm, the average particle size of the second particle is 70 to 500 nm, and the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of the first particle. Large particle size,
kit.
Figure 0006936383
In the formula, R 11 to R 15 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group. , Or arylthio groups, which may have substituents, and at least three of R 11 to R 15 represent atoms or groups other than hydrogen atoms. X 1 and X 2 independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, a hydroxy group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an ethenyl group, or an ethynyl group. It may have a substituent and X 1 and X 2 may be linked to each other to form a ring. Ar 1 and Ar 2 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent. L 1 and L 2 independently represent any of the formulas (L-1) to (L-4).
Figure 0006936383
In the formula, R 111 to R 116 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group, respectively. , Or arylthio groups, which may have substituents. A represents -O-, -S-, or -NH-.
前記第一の粒子及び前記第二の粒子がラテックス粒子である、請求項1に記載のキット。 The kit according to claim 1, wherein the first particle and the second particle are latex particles. 前記の標識を有する第一の粒子が、少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する発光性粒子であって、前記エネルギードナー化合物及び前記エネルギーアクセプター化合物の少なくとも一種が、前記式(1)で示される化合物である、請求項1又は2に記載のキット。 The first particle having the label is a luminescent particle containing at least one energy donor compound, at least one energy acceptor compound, and particles, and the energy donor compound and the energy acceptor compound. The kit according to claim 1 or 2, wherein at least one of the above is a compound represented by the formula (1). 前記エネルギードナー化合物として、少なくとも一種の前記式(1)で示される化合物を含有し、前記エネルギーアクセプター化合物として、少なくとも一種の前記式(1)で示される化合物を含有する、請求項3に記載のキット。 The third aspect of the present invention, wherein the energy donor compound contains at least one compound represented by the formula (1), and the energy acceptor compound contains at least one compound represented by the formula (1). Kit. エネルギードナー化合物とエネルギーアクセプター化合物のモル比が1:10〜10:1である、請求項3又は4に記載のキット。 The kit according to claim 3 or 4, wherein the molar ratio of the energy donor compound to the energy acceptor compound is 1:10 to 10: 1. 前記第一の粒子に対する前記第二の粒子の質量比が1〜20である、請求項1から5の何れか一項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 1 to 5, wherein the mass ratio of the second particle to the first particle is 1 to 20. プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、請求項1から6の何れか一項に記載のキット。 The kit according to any one of claims 1 to 6, wherein the first binding substance having specific binding property to progesterone is an antibody. (i)(a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、
(b)プロゲステロン以外の抗原に対する抗体で修飾された、標識を有しない第二の粒子と、
(c)プロゲステロンを含む被検試料と、
を混合して、混合物を得る工程と、
(ii)前記工程(i)で得た混合物を、基板上に適用する工程と、
(iii)前記第一の結合物質に対して結合性を有する物質を有する、前記基板上の反応部位において、前記第一の結合物質を捕捉する工程と、
(iv)前記反応部位上に捕捉された前記第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を検出する工程と、
を含むプロゲステロンの測定方法であって、
前記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
前記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、前記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ前記第一の粒子の平均粒子径より前記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
プロゲステロンの測定方法。
Figure 0006936383
式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 0006936383
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
(I) (a) Labeled first particles modified with a first binding agent having a specific binding property to progesterone.
(B) An unlabeled second particle modified with an antibody against an antigen other than progesterone.
(C) A test sample containing progesterone and
To obtain a mixture by mixing
(Ii) A step of applying the mixture obtained in the above step (i) onto a substrate, and
(Iii) A step of capturing the first binding substance at a reaction site on the substrate having a substance having a binding property to the first binding substance.
(Iv) A step of detecting a labeled first particle modified with the first binding agent captured on the reaction site.
A method for measuring progesterone, including
The first particle having the above-mentioned label contains at least one compound represented by the following formula (1) and the particle.
The average particle size of the first particle is 50 to 250 nm, the average particle size of the second particle is 70 to 500 nm, and the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of the first particle. Large particle size,
How to measure progesterone.
Figure 0006936383
In the formula, R 11 to R 15 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group. , Or arylthio groups, which may have substituents, and at least three of R 11 to R 15 represent atoms or groups other than hydrogen atoms. X 1 and X 2 independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, a hydroxy group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an ethenyl group, or an ethynyl group. It may have a substituent and X 1 and X 2 may be linked to each other to form a ring. Ar 1 and Ar 2 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent. L 1 and L 2 independently represent any of the formulas (L-1) to (L-4).
Figure 0006936383
In the formula, R 111 to R 116 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group, respectively. , Or arylthio groups, which may have substituents. A represents -O-, -S-, or -NH-.
前記第一の粒子及び前記第二の粒子がラテックス粒子である、請求項8に記載の方法。 The method according to claim 8, wherein the first particle and the second particle are latex particles. 前記の標識を有する第一の粒子が、少なくとも一種のエネルギードナー化合物と、少なくとも一種のエネルギーアクセプター化合物と、粒子とを含有する発光性粒子であって、前記エネルギードナー化合物及び前記エネルギーアクセプター化合物の少なくとも一種が、前記式(1)で示される化合物である、請求項8又は9に記載の方法。 The first particle having the label is a luminescent particle containing at least one energy donor compound, at least one energy acceptor compound, and particles, and the energy donor compound and the energy acceptor compound. The method according to claim 8 or 9, wherein at least one of the above is a compound represented by the formula (1). 前記エネルギードナー化合物として、少なくとも一種の前記式(1)で示される化合物を含有し、前記エネルギーアクセプター化合物として、少なくとも一種の前記式(1)で示される化合物を含有する、請求項10に記載の方法。 The tenth aspect of the present invention, wherein the energy donor compound contains at least one compound represented by the formula (1), and the energy acceptor compound contains at least one compound represented by the formula (1). the method of. 前記第一の粒子に対する前記第二の粒子の質量比が1〜20である、請求項8から11の何れか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 8 to 11, wherein the mass ratio of the second particle to the first particle is 1 to 20. 工程(iv)において、前記反応部位上に捕捉された前記第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子を表面プラズモン蛍光法により検出する、請求項8から12の何れか一項に記載の方法。 Any one of claims 8 to 12, wherein in step (iv), the first labeled particle modified with the first binding material captured on the reaction site is detected by surface plasmon fluorescence. The method described in the section. (a)プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質で修飾された、標識を有する第一の粒子と、(b)プロゲステロン以外の抗原に対する抗体で修飾された、標識を有しない第二の粒子とを含む、プロゲステロン測定試薬であって、
前記の標識を有する第一の粒子は、下記式(1)で示される少なくとも一種の化合物と粒子とを含有し、
前記第一の粒子の平均粒子径が50〜250nmであり、前記第二の粒子の平均粒子径が70〜500nmであり、かつ前記第一の粒子の平均粒子径より前記第二の粒子の平均粒子径が大きい、
プロゲステロン測定試薬。
Figure 0006936383
式中、R11〜R15はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R11〜R15のうち少なくとも3つは水素原子以外の原子又は基を表す。X及びXはそれぞれ独立に、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、アリールチオ基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよく、X及びXは互いに連結して環を形成してもよい。Ar及びArはそれぞれ独立に、アリール基又はヘテロ環基を表し、これらは置換基を有していてもよい。L及びLはそれぞれ独立に、式(L−1)〜式(L−4)の何れかを表す。
Figure 0006936383
式中、R111〜R116はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Aは、−O−、−S−、又は−NH−を表す。
(A) a labeled first particle modified with a first binding agent that has specific binding to progesterone, and (b) an unlabeled first particle modified with an antibody against an antigen other than progesterone. A progesterone measurement reagent containing two particles.
The first particle having the above-mentioned label contains at least one compound represented by the following formula (1) and the particle.
The average particle size of the first particle is 50 to 250 nm, the average particle size of the second particle is 70 to 500 nm, and the average particle size of the second particle is larger than the average particle size of the first particle. Large particle size,
Progesterone measurement reagent.
Figure 0006936383
In the formula, R 11 to R 15 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group. , Or arylthio groups, which may have substituents, and at least three of R 11 to R 15 represent atoms or groups other than hydrogen atoms. X 1 and X 2 independently represent a halogen atom, an alkyl group, an aryl group, a heterocyclic group, a hydroxy group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, an arylthio group, an ethenyl group, or an ethynyl group. It may have a substituent and X 1 and X 2 may be linked to each other to form a ring. Ar 1 and Ar 2 each independently represent an aryl group or a heterocyclic group, which may have a substituent. L 1 and L 2 independently represent any of the formulas (L-1) to (L-4).
Figure 0006936383
In the formula, R 111 to R 116 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group and alkylthio group, respectively. , Or arylthio groups, which may have substituents. A represents -O-, -S-, or -NH-.
前記式(1)で示される化合物が、下記式(3)で示される化合物である、請求項14に記載のプロゲステロン測定試薬。
Figure 0006936383
式中、R11、R12、R14、R15、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、但し、R11、R12、R14及びR15の少なくとも2つは水素原子以外の原子又は基である。R31〜R35はそれぞれ独立に、水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、エチニル基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよく、R31、R32、R34及びR35のいずれか一つは2原子以上からなる基である。
The progesterone measuring reagent according to claim 14, wherein the compound represented by the formula (1) is a compound represented by the following formula (3).
Figure 0006936383
In the formula, R 11 , R 12 , R 14 , R 15 , X 1 , X 2 , Ar 1 , Ar 2 , L 1 and L 2 are synonymous with the definitions in formula (1), except that R 11 , At least two of R 12 , R 14 and R 15 are atoms or groups other than hydrogen atoms. R 31 to R 35 are independently hydrogen atom, halogen atom, alkyl group, aryl group, heterocyclic group, ethenyl group, ethynyl group, amino group, acyl group, alkoxy group, aryloxy group, alkylthio group, or arylthio. Representing a group, these may have a substituent , and any one of R 31 , R 32 , R 34 and R 35 is a group consisting of two or more atoms.
前記式(1)で示される化合物が、下記式(4)で示される化合物である、請求項14に記載のプロゲステロン測定試薬。
Figure 0006936383
式中、R12、R13、R14、X、X、Ar、Ar、L及びLは、式(1)における定義と同義であり、但し、R12、R13及びR14の少なくとも1つは水素原子以外の原子又は基である。R41及びR42はそれぞれ独立に、アリール基、ヘテロ環基、エテニル基、又はエチニル基を表し、これらは置換基を有していてもよい。
The progesterone measuring reagent according to claim 14, wherein the compound represented by the formula (1) is a compound represented by the following formula (4).
Figure 0006936383
In the formula, R 12 , R 13 , R 14 , X 1 , X 2 , Ar 1 , Ar 2 , L 1 and L 2 are synonymous with the definitions in formula (1), except that R 12 , R 13 and At least one of R 14 is an atom or group other than a hydrogen atom. R 41 and R 42 each independently represent an aryl group, a heterocyclic group, an ethenyl group, or an ethynyl group, which may have a substituent.
前記式(1)で示される化合物が、下記式(5)で示される化合物である、請求項14に記載のプロゲステロン測定試薬。
Figure 0006936383
式中、R11〜R15、X、X、L及びLは、式(1)における定義と同義である。R51及びR52はそれぞれ独立に、アルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アミノ基、アシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アルキルチオ基、又はアリールチオ基を表し、これらは置換基を有していてもよい。Q及びQはそれぞれ独立に、芳香族炭化水素環又は芳香族ヘテロ環を表し、これらは置換基を有していてもよい。
The progesterone measuring reagent according to claim 14, wherein the compound represented by the formula (1) is a compound represented by the following formula (5).
Figure 0006936383
In the formula, R 11 to R 15 , X 1 , X 2 , L 1 and L 2 are synonymous with the definition in the formula (1). R 51 and R 52 each independently represent an alkyl group, an aryl group, a heteroaryl group, an amino group, an acyl group, an alkoxy group, an aryloxy group, an alkylthio group, or an arylthio group, and these have a substituent. You may. Q 1 and Q 2 each independently represent an aromatic hydrocarbon ring or aromatic hetero ring, which may have a substituent.
前記第一の粒子に対する前記第二の粒子の質量比が1〜20である、請求項14から17の何れか一項に記載のプロゲステロン測定試薬。 The progesterone measuring reagent according to any one of claims 14 to 17, wherein the mass ratio of the second particle to the first particle is 1 to 20. 前記プロゲステロンと特異的な結合性を有する第一の結合物質が抗体である、請求項14から18の何れか一項に記載のプロゲステロン測定試薬。 The progesterone measuring reagent according to any one of claims 14 to 18, wherein the first binding substance having specific binding property to the progesterone is an antibody. 前記標識を有する第一の粒子が、蛍光ラテックス粒子であり、前記第二の粒子がラテックス粒子である、請求項14から19の何れか一項に記載のプロゲステロン測定試薬。 The progesterone measuring reagent according to any one of claims 14 to 19, wherein the first particle having the label is a fluorescent latex particle and the second particle is a latex particle.
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