JP6912903B2 - Cell production method and cell culture kit - Google Patents
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Description
本発明は、細胞培養用基材、細胞の生産方法及び細胞培養用キットに関する。 The present invention relates to a cell culture substrate, a cell production method, and a cell culture kit.
従来、細胞培養は、ガラスの表面上又は種々の処理を施したポリスチレンの表面上で行なわれている。その一例として、例えば、プラズマ処理、コロナ処理等により表面処理されたポリスチレンに、コラーゲン、フィブロネクチン又はポリリジン等の細胞接着性タンパク質をコートしたポリスチレン等から構成される種々の形状の容器が細胞培養用基材として普及している。しかしながら、ポリスチレン等を用いて細胞培養した場合、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で細胞を処理する必要があり、細胞への毒性が高く、さらにその後の使用で有益である細胞外基質をも分解してしまう問題がある。 Traditionally, cell culture has been performed on the surface of glass or on the surface of polystyrene that has been subjected to various treatments. As an example, containers of various shapes composed of polystyrene surface-treated by plasma treatment, corona treatment, etc. coated with cell adhesion proteins such as collagen, fibronectin, or polylysine are used as cell culture groups. It is widely used as a material. However, when cells are cultured using polystyrene or the like, it is necessary to treat the cells with a proteolytic enzyme such as trypsin, which is highly toxic to cells and also decomposes extracellular matrix which is beneficial for subsequent use. There is a problem that it ends up.
これらの問題を解決するため、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)(PNIPAM)を表面グラフトした培養皿(特許文献1及び非特許文献1)、多糖類からなる培養皿(特許文献2〜4)が報告されている。PNIPAMを表面グラフトした培養皿では、細胞を回収するために、20℃で30分程度細胞を処理するが、温度に対してセンシティビティが高い細胞に対して適用できないという問題点がある。
また、多糖類からなる培養皿は、親水性多糖類(アルギン酸等)を用いる方法と、難水溶性の多糖類(セルロース等)を用いる方法とがある。親水性多糖類を用いる方法においては、金属イオン等によりゲル化した親水性多糖類のゲル上で細胞を培養するものであるが、ポリスチレンのようなシャーレと異なり、ゲルの硬さが不十分であり、細胞接着の不良、接着細胞の形状不良を引き起こす問題がある。さらに、キレート剤によりゲルを硬くしたものが知られているが、ゲルを硬くするために用いられるキレート剤が細胞毒性の原因となっている。難水溶性の多糖類を用いる方法においては、糖分解酵素により細胞を剥離する方法及び変性セルロースをアミノ基含有化合物により分解する方法がある。糖分解酵素を用いる方法は難水溶性のため、基材が硬すぎるため、細胞を培養する水溶系では多糖類が分解されにくい問題がある。また、アミノ基含有化合物により分解する方法においては、細胞培養に必須のアミノ酸(アミノ基含有化合物)を培地に添加できない問題がある。
In order to solve these problems, a culture dish (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1) in which poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) is surface-grafted and a culture dish consisting of polysaccharides (Patent Documents 2 to 4) have been reported. Has been done. In a culture dish on which PNIPAM is surface-grafted, cells are treated at 20 ° C. for about 30 minutes in order to collect the cells, but there is a problem that the cells cannot be applied to cells having high sensitivity to temperature.
Further, as a culture dish made of a polysaccharide, there are a method using a hydrophilic polysaccharide (alginic acid and the like) and a method using a poorly water-soluble polysaccharide (cellulose and the like). In the method using hydrophilic polysaccharides, cells are cultured on a gel of hydrophilic polysaccharides gelled by metal ions or the like, but unlike petri dishes such as polystyrene, the hardness of the gel is insufficient. There is a problem of causing poor cell adhesion and poor shape of adherent cells. Further, although it is known that a gel is hardened by a chelating agent, the chelating agent used to harden the gel causes cytotoxicity. In the method using a poorly water-soluble polysaccharide, there are a method of exfoliating cells with a glycolytic enzyme and a method of decomposing modified cellulose with an amino group-containing compound. Since the method using a glycolytic enzyme is poorly water-soluble, the base material is too hard, and there is a problem that polysaccharides are not easily decomposed in a water-based system in which cells are cultured. Further, in the method of decomposing with an amino group-containing compound, there is a problem that an amino acid (amino group-containing compound) essential for cell culture cannot be added to the medium.
本発明は、細胞生存率及び細胞接着率が高く、短時間で細胞を剥離可能な細胞培養用基材及び細胞培養用キット並びに細胞培養用基剤を用いた細胞の生産方法を提供することを目的とする。 The present invention provides a cell culture substrate, a cell culture kit, and a cell production method using a cell culture base, which have high cell viability and cell adhesion rate and can detach cells in a short time. The purpose.
本発明者らは、これらの問題点を解決するべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。
即ち、本発明は、細胞培養用基材を用いて細胞(X)を培養する細胞の生産方法であって、多糖類(A)の架橋剤(B)による架橋物(C)を含有する細胞培養用基材であって、架橋剤(B)が活性水素基と反応し得る官能基(b)を少なくとも2個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の37℃における貯蔵弾性率G’が1000〜1×1010Paであり、細胞の生産方法が、細胞培養用基材上で細胞(X)を培養後、分解剤(E)により細胞培養用基材を分解する工程を含み、分解剤(E)が多糖類分解酵素(E1)である細胞の生産方法;細胞培養用基材及び分解剤(E)を含む細胞培養用キットであって、細胞培養用基材が、多糖類(A)の架橋剤(B)による架橋物(C)を含有し、架橋剤(B)が活性水素基と反応し得る官能基(b)を少なくとも2個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の37℃における貯蔵弾性率G’が1000〜1×10 10 Paであり、分解剤(E)が多糖類分解酵素(E1)である細胞培養用キット。
The present inventors have arrived at the present invention as a result of diligent studies to solve these problems.
That is, the present invention is a method for producing cells in which cells (X) are cultured using a cell culture substrate, and the cells contain a cross-linked product (C) of the polysaccharide (A) by a cross-linking agent (B). A culture substrate, which is an organic compound having at least two functional groups (b) in which the cross-linking agent (B) can react with an active hydrogen group, and has a storage elasticity G'at 37 ° C. of the cell culture substrate. includes but 1000-1 × Ri 10 10 Pa der method of producing cells, after culturing the cells (X) on the cell culture substrate, the step of decomposing the cell culture substrate by decomposing agent (E) , A method for producing cells in which the degrading agent (E) is a polysaccharide-degrading enzyme (E1) ; a cell culture kit containing a cell culture base material and a degrading agent (E), and the cell culture base material is numerous. An organic compound containing a cross-linked product (C) of a saccharide (A) by a cross-linking agent (B) and having at least two functional groups (b) in which the cross-linking agent (B) can react with an active hydrogen group, and is a cell culture. A cell culture kit in which the storage elasticity G'at 37 ° C. of the base material is 1000 to 1 × 10 10 Pa, and the degrading agent (E) is a polysaccharide-degrading enzyme (E1) .
本発明の細胞培養用基材及び細胞培養用キットは、細胞生存率及び細胞接着率が高く、短時間で細胞を剥離できるという効果を奏する。また、本発明の細胞培養用基剤を用いた細胞の生産方法は、細胞の生存率及び細胞接着率が高く、短時間で細胞を剥離できるという効果を奏する。 The cell culture substrate and the cell culture kit of the present invention have high cell viability and cell adhesion rate, and have the effect of being able to detach cells in a short time. In addition, the method for producing cells using the cell culture base of the present invention has a high cell viability and cell adhesion rate, and has an effect that cells can be detached in a short time.
本発明の細胞培養用基材は、多糖類(A)の架橋剤(B)による架橋物(C)を含有する細胞培養用基材であって、架橋剤(B)が活性水素基と反応し得る官能基(b)を少なくとも2個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の37℃における貯蔵弾性率G’が1000〜1×1010Paである細胞培養用基材である。 The base material for cell culture of the present invention is a base material for cell culture containing a crosslinked product (C) of the polysaccharide (A) by the cross-linking agent (B), and the cross-linking agent (B) reacts with the active hydrogen group. It is an organic compound having at least two possible functional groups (b), and is a cell culture base material having a storage elasticity G'at 37 ° C. of the cell culture base material of 1000 to 1 × 10 10 Pa.
多糖類(A)としては、単糖(a)が10個以上グリコシド結合により結合したもの及びこれらの誘導体が含まれる。
単糖(a)としては、炭素数3〜7の単糖(a1)又は前記(a1)が有するヒドロキシル基及び/若しくはヒドロキシメチル基がカルボキシル基、アミノ基、N−アセチルアミノ基、スルホオキシ基、メトキシカルボニル基及びカルボキシメチル基からなる群より選ばれる少なくとも1種の置換基(E)で置換された単糖(a2)が含まれる。
Examples of the polysaccharide (A) include those in which 10 or more monosaccharides (a) are bound by glycosidic bonds and derivatives thereof.
As the monosaccharide (a), the hydroxyl group and / or the hydroxymethyl group of the monosaccharide (a1) having 3 to 7 carbon atoms or the above (a1) is a carboxyl group, an amino group, an N-acetylamino group, a sulfooxy group, and the like. A monosaccharide (a2) substituted with at least one substituent (E) selected from the group consisting of a methoxycarbonyl group and a carboxymethyl group is included.
炭素数3〜7の単糖(a1)としては、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース及びヘプトース等が挙げられる。
トリオースとしては、ジヒドロキシアセトン及びグリセルアルデヒド等が挙げられる。
テトロースとしては、エリトロース、トレオース及びエリトルロース等が挙げられる。
ペントースとしては、アラビノース、キシロース、リボース、キシルロース、リブロース及びデオキシリボース等が挙げられる。
ヘキソースとしては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、ソルボース、タガトース、フコース、フクロース及びラムノース等が挙げられる。
ヘプトースとしては、セドヘプツロース等が挙げられる。
Examples of the monosaccharide (a1) having 3 to 7 carbon atoms include triose, tetrose, pentose, hexose and heptose.
Examples of the triose include dihydroxyacetone and glyceraldehyde.
Examples of tetrose include erythrose, threose, erythrulose and the like.
Examples of the pentose include arabinose, xylose, ribose, xylulose, ribulose and deoxyribose.
Examples of the hexose include glucose, mannose, galactose, fructose, sorbose, tagatose, fucose, fuculose and rhamnose.
Examples of sedoheptulose include sedoheptulose and the like.
単糖(a2)としては、1つ以上のヒドロキシメチル基(−CH2OH)がカルボキシル基(−COOH)で置換された単糖(a2−1)、1つ以上のヒドロキシル基(−OH)がアミノ基(−NH2)で置換された単糖(a2−2)、1つ以上のヒドロキシル基がN−アセチルアミノ基(−NHCOCH3)で置換された単糖(a2−3)、1つ以上のヒドロキシル基がスルホオキシ基(−OSO3H)で置換された単糖(a2−4)、1つ以上のヒドロキシメチル基がメトキシカルボニル基(−COOCH3)で置換された単糖(a2−5)、1つ以上のヒドロキシメチル基がカルボキシメチル基(−CH2COOH)で置換された単糖(a2−6)及び2つ以上のヒドロキシル基及び/又はヒドロキシメチル基が複数種類の置換基(E)で置換された単糖(a2−7)等が挙げられる。 As the monosaccharide (a2), a monosaccharide (a2-1) in which one or more hydroxymethyl groups (-CH 2 OH) are replaced with a carboxyl group (-COOH), or one or more hydroxyl groups (-OH). Monosaccharide (a2-2) in which is substituted with an amino group (-NH 2 ), monosaccharide (a2-3) in which one or more hydroxyl groups are substituted with an N-acetylamino group (-NHCOCH 3 ), 1 A monosaccharide (a2-4) in which one or more hydroxyl groups are substituted with a sulfooxy group (-OSO 3 H), and a monosaccharide (a2) in which one or more hydroxymethyl groups are substituted with a methoxycarbonyl group (-COOCH 3). -5) A monosaccharide (a2-6) in which one or more hydroxymethyl groups are substituted with a carboxymethyl group (-CH 2 COOH) and a plurality of types of substitutions in which two or more hydroxyl groups and / or hydroxymethyl groups are substituted. Examples thereof include a monosaccharide (a2-7) substituted with a group (E).
前記(a2−1)としては、グルクロン酸、イズロン酸、マンヌロン酸及びガラクツロン酸等のウロン酸等が挙げられる。
前記(a2−2)としては、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン及びムラミン酸等のアミノ糖等が挙げられる。
前記(a2−3)としては、N−アセチルグルコサミン、N−アセチルマンノサミン、N−アセチルガラクトサミン及びN−アセチルムラミン酸等が挙げられる。
前記(a2−4)としては、ガラクトース−3−硫酸等が挙げられる。
前記(a2−5)としては、グルコースメチルエステル及び前記(a2−1)中のカルボン酸をメチルエステル化したもの等が挙げられる。
前記(a2−7)としては、N−アセチルグルコサミン−4−硫酸、イズロン酸−2−硫酸、グルクロン酸−2−硫酸、N−アセチルガラクトサミン−4−硫酸、ノイラミン酸及びN−アセチルノイラミン酸等が挙げられる。
Examples of the (a2-1) include uronic acids such as glucuronic acid, iduronic acid, mannuronic acid and galacturonic acid.
Examples of the above (a2-2) include amino sugars such as glucosamine, galactosamine, mannosamine and muramic acid.
Examples of (a2-3) include N-acetylglucosamine, N-acetylmannosamine, N-acetylgalactosamine, N-acetylmuramic acid and the like.
Examples of the (a2-4) include galactose-3-sulfuric acid and the like.
Examples of the (a2-5) include glucose methyl esters and methyl esters of the carboxylic acid in the above (a2-1).
Examples of (a2-7) include N-acetylglucosamine-4-sulfate, iduronic acid-2-sulfate, glucuronic acid-2-sulfate, N-acetylgalactosamine-4-sulfate, neuraminic acid and N-acetylneuraminic acid. And so on.
多糖類(A)として具体的には、セルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコサミノグリカン、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、グリコーゲン、デキストリン、グルカン、フルクタン、キチン、タマリンドシードガム、グァーガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、カラヤガム、ペクチン、キサンタンガム、ジュランガム、アグロバクテリウムスクシノグリカン、ダイユータンガム、マンナン、グルコマンナン、キトサン、タラガム、サイリウムシードガム及びこれらの誘導体(カルボキシメチルセルロース等)等が挙げられる。
多糖類(A)のうち、産業利用性及び分解性の観点から、セルロース、アミロース、アミロペクチン、グリコサミノグリカン、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、グリコーゲン、デキストリン、グルカン、フルクタン、キチン、タマリンドシードガム、グァーガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、カラヤガム、ペクチン、キサンタンガム、ジュランガム、アグロバクテリウムスクシノグリカン、ダイユータンガム、マンナン、グルコマンナン、キトサン、タラガム、サイリウムシードガム及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1種が好ましく、さらに好ましくはセルロース、アルギン酸、カラギーナン、ヒアルロン酸、キサンタン、アミロース、デキストラン及びこれらの誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1種であり、特に好ましくはカルボキシメチルセルロースである。
Specific examples of the polysaccharide (A) include cellulose, amylopectin, amylopectin, glycosaminoglycan, alginic acid, carrageenan, hyaluronic acid, glycogen, dextrin, glucan, fructan, chitin, tamarind seed gum, guar gum, locust bean gum, and arabic. Examples thereof include gum, carrageenan, pectin, xanthan gum, julan gum, agrobacterium succinoglycan, Daiyutan gum, mannan, glucomannan, chitosan, tara gum, psyllium seed gum and derivatives thereof (carboxymethyl cellulose and the like).
Of the polysaccharides (A), from the viewpoint of industrial utility and degradability, cellulose, amylose, amylopectin, glycosaminoglycan, alginic acid, carrageenan, hyaluronic acid, glycogen, dextrin, glucan, fructan, chitin, tamarind seed gum, Selected from the group consisting of guar gum, locust bean gum, arabic gum, karaya gum, pectin, xanthan gum, julan gum, agrobacterium succinoglycan, daiyutan gum, mannan, glucomannan, chitosan, tara gum, psyllium seed gum and derivatives thereof. At least one is preferable, and at least one selected from the group consisting of cellulose, alginic acid, carrageenan, hyaluronic acid, xanthan, amylose, dextran and derivatives thereof, and particularly preferably carboxymethyl cellulose.
カルボキシメチルセルロースにおいて、ヒドロキシル基のカルボキシメチル基による置換率は、水溶性の観点から、0.02〜3が好ましく、さらに好ましくは0.2〜2である。 In carboxymethyl cellulose, the substitution rate of the hydroxyl group with the carboxymethyl group is preferably 0.02 to 3 from the viewpoint of water solubility, and more preferably 0.2 to 2.
本発明において、架橋剤(B)は、活性水素基と反応し得る官能基(b)を少なくとも2個有する有機化合物である。
官能基(b)としては、カルボキシル基、エポキシ基、イソシアネート基、カルボジイミド基、オキサゾリン基及び酸ハライド基等が挙げられる。
これらのうち、反応性及び架橋物(C)の強度の観点から、カルボキシル基、エポキシ基及びイソシアネート基からなる群より選ばれる少なくとも1種が好ましい。
In the present invention, the cross-linking agent (B) is an organic compound having at least two functional groups (b) capable of reacting with an active hydrogen group.
Examples of the functional group (b) include a carboxyl group, an epoxy group, an isocyanate group, a carbodiimide group, an oxazoline group and an acid halide group.
Of these, at least one selected from the group consisting of a carboxyl group, an epoxy group and an isocyanate group is preferable from the viewpoint of reactivity and strength of the crosslinked product (C).
架橋剤(B)は、官能基(b)として1種を有しているものでもよく、2種以上を有しているものでもよい。 The cross-linking agent (B) may have one type as the functional group (b), or may have two or more types.
架橋剤(B)において、カルボキシル基を有しているものとしては、ポリカルボン酸が含まれる。
ポリカルボン酸として、具体的には、2個のカルボキシル基を有しているもの{炭素数2〜50のアルカンジカルボン酸(シュウ酸、マロン酸、コハク酸、アジピン酸、レパルギン酸及びセバシン酸等)及び炭素数8〜36の芳香族ジカルボン酸(フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸及びナフタレンジカルボン酸等)、炭素数4〜50の不飽和ジカルボン酸(マレイン酸、フマル酸及び炭素数12〜46のアルケニル基を有するアルケニルコハク酸等)等}、3個以上のカルボキシル基を有しているもの{炭素数9〜20の芳香族ポリカルボン酸(トリメリット酸及びピロメリット酸等)、炭素数6〜36の脂肪族トリカルボン酸(ヘキサントリカルボン酸等)等が挙げられる。
The cross-linking agent (B) having a carboxyl group includes a polycarboxylic acid.
Specific examples of the polycarboxylic acid include those having two carboxyl groups {alcandicarboxylic acids having 2 to 50 carbon atoms (oxalic acid, malonic acid, succinic acid, adipic acid, lepargic acid, sebacic acid, etc.) ) And aromatic dicarboxylic acids with 8 to 36 carbon atoms (phthalic acid, isophthalic acid, terephthalic acid, naphthalenedicarboxylic acid, etc.), unsaturated dicarboxylic acids with 4 to 50 carbon atoms (maleic acid, fumaric acid and 12 to 46 carbon atoms). (Elkenyl succinic acid having an alkenyl group, etc.)}, etc.}, having 3 or more carboxyl groups {aromatic polycarboxylic acid having 9 to 20 carbon atoms (trimellitic acid, pyromellitic acid, etc.), carbon number Examples thereof include 6 to 36 aliphatic tricarboxylic acids (hexanetricarboxylic acid and the like).
カルボキシル基を有しているものとして、これらのカルボン酸の無水物、低級アルキル(炭素数1〜4)エステル(メチルエステル、エチルエステル及びイソプロピルエステル等)化物を用いてもよく、無水物及び/又は低級アルキルエステル化物と上記カルボキシル基を有しているものと併用してもよい。 Anhydrides of these carboxylic acids, lower alkyl (1 to 4 carbon atoms) esters (methyl esters, ethyl esters, isopropyl esters, etc.) may be used as those having a carboxyl group, and the anhydrides and / Alternatively, a lower alkyl esterified product and a product having the above-mentioned carboxyl group may be used in combination.
また、架橋剤として不飽和モノカルボン酸を用いて、不飽和モノカルボン酸中のカルボキシル基を多糖類(A)の活性水素と反応させて、さらに二重結合を反応させることにより架橋してもよい。
不飽和モノカルボン酸としては、炭素数2〜30の不飽和モノカルボン酸が含まれ、具体的にはアクリル酸、メタクリル酸、プロピオル酸、2−ブチン酸、クロトン酸、イソクロトン酸、3−ブテン酸、アンゲリカ酸、チグリン酸、4−ペンテン酸、2−エチル−2−ブテン酸、10−ウンデセン酸、2,4−ヘキサジエン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、サピエン酸、オレイン酸、エライジン酸、バクセン酸、ガドレイン酸、エイコセン酸、エルカ酸及びネルボン酸等が挙げられる。
Further, even if an unsaturated monocarboxylic acid is used as a cross-linking agent, the carboxyl group in the unsaturated monocarboxylic acid is reacted with the active hydrogen of the polysaccharide (A), and the double bond is further reacted to carry out cross-linking. good.
The unsaturated monocarboxylic acid includes an unsaturated monocarboxylic acid having 2 to 30 carbon atoms, specifically, acrylic acid, methacrylic acid, propiolic acid, 2-butyric acid, crotonic acid, isocrotonic acid, and 3-butene. Acids, angelic acid, tigric acid, 4-pentenoic acid, 2-ethyl-2-butenoic acid, 10-undecenoic acid, 2,4-hexadienoic acid, myristoleic acid, palmitoleic acid, sapienoic acid, oleic acid, ellaidic acid, Examples thereof include baxenoic acid, gadrain acid, eicosenoic acid, erucic acid and nervonic acid.
カルボキシル基を有しているもののうち、反応性及び架橋物(C)の強度の観点から、好ましいものは、アジピン酸、炭素数12〜46のアルケニル基を有するアルケニルコハク酸、テレフタル酸、イソフタル酸、マレイン酸、フマル酸、トリメリット酸、ピロメリット酸及びこれらの併用である。また、これらの酸の無水物や低級アルキルエステルも同様に好ましい。 Among those having a carboxyl group, those preferable from the viewpoint of reactivity and the strength of the crosslinked product (C) are adipic acid, alkenyl succinic acid having an alkenyl group having 12 to 46 carbon atoms, terephthalic acid, and isophthalic acid. , Maleic acid, fumaric acid, trimellitic acid, pyromellitic acid and their combination. Also, anhydrides and lower alkyl esters of these acids are similarly preferred.
エポキシ基を有しているものとしては、具体的には、ポリグリシジルエーテル(エチレングリコールジグリシジルエーテル、テトラメチレングリコールジグリシジルエーテル、ビスフェノールAジグリシジルエーテル、ビスフェノールFジグリシジルエーテル、グリセリントリグリシジルエーテル、ペンタエリスリトールテトラグリシジルエーテル及びフェノールノボラックグリシジルエーテル化物等)等が挙げられる。 Specific examples of the ether having an epoxy group include polyglycidyl ethers (ethylene glycol diglycidyl ether, tetramethylene glycol diglycidyl ether, bisphenol A diglycidyl ether, bisphenol F diglycidyl ether, glycerin triglycidyl ether, etc. Pentaerythritol tetraglycidyl ether, phenol novolac glycidyl ether, etc.) and the like.
イソシアネート基を有しているものとしては、脂肪族ジイソシアネート化合物、脂環族ジイソシアネート及び芳香族ジイソシアネート化合物が含まれる。 Those having an isocyanate group include aliphatic diisocyanate compounds, alicyclic diisocyanates and aromatic diisocyanate compounds.
脂肪族ジイソシアネート化合物としては、例えば、トリメチレンジイソシアネート、テトラメチレンジイソシアネート、ヘキサメチレンジイソシアネート(以下においてHDIと略記する)、ペンタメチレンジイソシアネート,1,2−プロピレンジイソシアネート、1,3−ブチレンジイソシアネート、ドデカメチレンジイソシアネート及び2,4,4−トリメチルヘキサメチレンジイソシアネート等が挙げられる。 Examples of the aliphatic diisocyanate compound include trimethylene diisocyanate, tetramethylene diisocyanate, hexamethylene diisocyanate (hereinafter abbreviated as HDI), pentamethylene diisocyanate, 1,2-propylene diisocyanate, 1,3-butylenediocyanate, and dodecamethylene diisocyanate. And 2,4,4-trimethylhexamethylene diisocyanate and the like.
脂環族ジイソシアネート化合物としては、例えば、1,3−シクロペンテンジイソシアネート,1,3−シクロへキサンジイソシアネート、1,4−シクロヘキサンジイソシアネート、イソホロンジイソシアネート(以下においてIPDIと略記する)、水素添加ジフェニルメタンジイソシアネート(以下において水添MDIと略記する)、水素添加キシリレンジイソシアネート、水素添加トリレンジイソシアネート及び水素添加テトラメチルキシリレンジイソシアネート等が挙げられる。 Examples of the alicyclic diisocyanate compound include 1,3-cyclopentene diisocyanate, 1,3-cyclohexanediisocyanate, 1,4-cyclohexanediisocyanate, isophorone diisocyanate (hereinafter abbreviated as IPDI), and hydrogenated diphenylmethane diisocyanate (hereinafter referred to as IPDI). (Abbreviated as hydrogenated MDI), hydrogenated xylylene diisocyanate, hydrogenated tolylene diisocyanate, hydrogenated tetramethylxylylene diisocyanate and the like.
芳香族ジイソシアネート化合物としては、例えば、フェニレンジイソシアネート、トリレンジイソシアネート(2,4−トリレンジイソシアネート及び2,6−トリレンジイソシアネート、以下においてTDIと略記する)、2,2’一ジフェニルメタンジイソシアネート、4,4’−ジフェニルメタンジイソシアネート(以下においてMDIと略記する)、4,4’−トルイジンジイソシアネート、4,4’−ジフェニルエーテルジイソシアネート、4,4’−ジフェニルジイソシアネート、1,5−ナフタレンジイソシアネート及びキシリレンジイソシアネート等が挙げられる。 Examples of the aromatic diisocyanate compound include phenylenediocyanate, tolylene diisocyanate (2,4-toluene diisocyanate and 2,6-tolylene diisocyanate, hereinafter abbreviated as TDI), 2,2'-diphenylmethane diisocyanate, 4, 4'-diphenylmethane diisocyanate (hereinafter abbreviated as MDI), 4,4'-toluene diisocyanate, 4,4'-diphenyl ether diisocyanate, 4,4'-diphenyl diisocyanate, 1,5-naphthalenediocyanate, xylylene diisocyanate, etc. Can be mentioned.
イソシアネート基を有しているものとして、反応性及び架橋物(C)の強度の観点から、好ましいものは炭素数6〜15の芳香族ジイソシアネート、炭素数4〜12の脂肪族ジイソシアネート及び炭素数4〜15の脂環式ジイソシアネートからなる群より選ばれる少なくとも1種であり、特に好ましいものはTDI、MDI、HDI、水添MDI及びIPDIからなる群より選ばれる少なくとも1種である。 As those having an isocyanate group, from the viewpoint of reactivity and strength of the crosslinked product (C), preferred ones are aromatic diisocyanates having 6 to 15 carbon atoms, aliphatic diisocyanates having 4 to 12 carbon atoms and 4 carbon atoms. It is at least one selected from the group consisting of ~ 15 alicyclic diisocyanates, and particularly preferable is at least one selected from the group consisting of TDI, MDI, HDI, hydrogenated MDI and IPDI.
架橋剤(B)としては、反応性及び架橋物(C)の強度の観点から、エポキシ基を有しているものが好ましく、さらに好ましくはポリグリシジルエーテルである。 As the cross-linking agent (B), those having an epoxy group are preferable, and polyglycidyl ether is more preferable, from the viewpoint of reactivity and the strength of the cross-linked product (C).
本発明の細胞培養用基材は、架橋物(C)を含有するものであれば特に限定はないが、細胞接着性の観点から、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン及び下記最小アミノ酸配列(X)を有する細胞接着性ペプチド(D)からなる群より選ばれる少なくとも1種の細胞接着因子を含有することが好ましい。
最小アミノ酸配列(X):RGD配列、LDV配列、REDV配列(1)、YIGSR配列(2)、PDSGR配列(3)、RYVVLPR配列(4)、LGTIPG配列(5)、RNIAEIIKDI配列(6)、IKVAV配列(7)、LRE配列、DGEA配列(8)、GVKGDKGNPGWPGAP配列(9)、GEFYFDLRLKGDK配列(10)、HAV配列及びYKLNVNDS配列(11)からなる群より選ばれる少なくとも1種。
なお、本発明において、「配列(1)」は「配列表における配列番号(1)」を意味し、配列(1)以外の配列についても同様である。
The cell culture substrate of the present invention is not particularly limited as long as it contains a crosslinked product (C), but has fibronectin, collagen, laminin and the following minimum amino acid sequence (X) from the viewpoint of cell adhesion. It preferably contains at least one cell adhesion molecule selected from the group consisting of the cell adhesion peptide (D).
Minimum amino acid sequence (X): RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence (1), YIGSR sequence (2), PDSGR sequence (3), RYVVLPR sequence (4), LGTIPG sequence (5), RNIAEI IKDI sequence (6), IKEVAV At least one selected from the group consisting of sequence (7), LRE sequence, DGEA sequence (8), GVKGDKGNPGWPGAP sequence (9), GEFYFDLRLKGDK sequence (10), HAV sequence and YKLNVNDS sequence (11).
In the present invention, "sequence (1)" means "SEQ ID NO: (1) in the sequence listing", and the same applies to sequences other than sequence (1).
フィブロネクチン、コラーゲン及びラミニンは、細胞接着分子として一般的に知られているものである。
なお、本発明において、「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する(大阪府立母子医療センター雑誌、第8巻 第1号、58〜66頁、1992年)。
Fibronectin, collagen and laminin are commonly known as cell adhesion molecules.
In the present invention, "cell adhesion" means the property that a specific minimum amino acid sequence is recognized by the integrin receptor of the cell and the cell easily adheres to the substrate (Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center Magazine, No. 1). Volume 8, No. 1, pp. 58-66, 1992).
最小アミノ酸配列(X)としては、「病態生理、第9巻 第7号、527〜535頁、1990年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第8巻 第1号、58〜66頁、1992年」に記載されているもの等が知られており、細胞接着性の観点から、上記配列(1)〜(11)が好ましく、さらに好ましくはRGD配列である。 The minimum amino acid sequence (X) is "Pathological Physiology, Vol. 9, No. 7, pp. 527-535, 1990" and "Osaka Prefectural Maternal and Child Medical Center Magazine, Vol. 8, No. 1, pp. 58-66, 1992". The ones described in "Year" and the like are known, and the above sequences (1) to (11) are preferable, and more preferably RGD sequences, from the viewpoint of cell adhesion.
細胞接着性ペプチド(D)は、最小アミノ酸配列(X)を1分子中に少なくとも1個有すればよいが、細胞接着性の観点等から、1分子中に1〜50個有するものが好ましく、さらに好ましくは2〜50個、つぎに好ましくは3〜30個、特に好ましくは4〜20個、最も好ましくは5〜15個有するものである。なお、2種以上の最小アミノ酸配列(X)が一分子中に含まれてもよい。 The cell adhesion peptide (D) may have at least one minimum amino acid sequence (X) in one molecule, but from the viewpoint of cell adhesion and the like, it is preferable that the cell adhesion peptide (D) has 1 to 50 in one molecule. It is more preferably 2 to 50, then preferably 3 to 30, particularly preferably 4 to 20, and most preferably 5 to 15. In addition, two or more kinds of minimum amino acid sequences (X) may be contained in one molecule.
細胞接着性ペプチド(D)は、最小アミノ酸配列(X)以外に、細胞接着性ペプチド(D)の熱安定性向上の観点等から、補助アミノ酸配列(Y)を有することが好ましい。 The cell adhesion peptide (D) preferably has an auxiliary amino acid sequence (Y) in addition to the minimum amino acid sequence (X) from the viewpoint of improving the thermal stability of the cell adhesion peptide (D).
補助アミノ酸配列(Y)としては、最小アミノ酸配列(X)以外のアミノ酸配列が使用でき、細胞接着性ペプチド(D)の熱安定性の観点から、G(グリシン)及び/又はA(アラニン)を有する配列が好ましい。 As the auxiliary amino acid sequence (Y), an amino acid sequence other than the minimum amino acid sequence (X) can be used, and G (glycine) and / or A (alanine) can be used from the viewpoint of thermal stability of the cell adhesion peptide (D). The sequence having is preferable.
補助アミノ酸配列(Y)としては、(GA)a配列、(GAGAGS)b配列、(GAGAGY)c配列、(GAGVGY)d配列、(GAGYGV)e配列、{DGG(A)fGGA}g配列、(GVPGV)h配列、(G)i配列、(A)j配列、(GGA)k配列、(GVGVP)m配列、(GPP)n配列、(GAQGPAGPG)o配列、(GAPGAPGSQGAPGLQ)p配列及び/又は(GAPGTPGPQGLPGSP)q配列を有する配列等が含まれる。
これらのうち、熱安定性の観点から、(GA)a配列、(GAGAGS)b配列、(GAGAGY)c配列、(GAGVGY)d配列、(GAGYGV)e配列、{DGG(A)fGGA}g配列、(GVPGV)h配列、(GVGVP)m配列及び(GPP)n配列からなる群より選ばれる少なくとも1種を有するものが好ましく、さらに好ましくは(GAGAGS)b配列、(GVPGV)h配列、(GVGVP)m配列及び(GPP)n配列からなる群より選ばれる少なくとも1種を有するものであり、特に好ましくは(GAGAGS)b配列を有するものである。
なお、aは5〜100の整数、bは1〜33の整数、c、d及びeは2〜33の整数、fは1〜194の整数、gは{1}〜{200/(6+f)}の小数点以下を切り捨てした整数、hは2〜40の整数、i及びjは10〜200の整数、kは3〜66の整数、mは2〜40の整数、nは3〜66の整数、oは1〜22の整数、p及びqは1〜13の整数である。
The auxiliary amino acid sequence (Y) includes (GA) a sequence, (GAGAGS) b sequence, (GAGAGY) c sequence, (GAGVGY) d sequence, (GAGYGV) e sequence, {DGG (A) f GGA} g sequence, (GVPVGV) h sequence, (G) i sequence, (A) j sequence, (GGA) k sequence, (GVGVP) m sequence, (GPP) n sequence, (GAQGPAGPG) o sequence, (GAPGAPGSQGAPGLQ) p sequence and / or (GAPGTPGPQGLPGSP) A sequence having a q sequence or the like is included.
Of these, from the viewpoint of thermal stability, (GA) a sequence, (GAGAGS) b sequence, (GAGAGY) c sequence, (GAGVGY) d sequence, (GAGYGV) e sequence, {DGG (A) f GGA} g It preferably has at least one selected from the group consisting of a sequence, a (GVPVGV) h sequence, a (GVGVP) m sequence and a (GPP) n sequence, and more preferably a (GAGAGS) b sequence, a (GVPVGV) h sequence, ( It has at least one selected from the group consisting of the GVGVP) m sequence and the (GPP) n sequence, and particularly preferably has the (GAGAGS) b sequence.
Note that a is an integer of 5 to 100, b is an integer of 1-33, c, d and e are integers of 2-33, f is an integer of 1 to 194, and g is {1} to {200 / (6 + f). } Is an integer rounded down to the nearest whole number, h is an integer of 2 to 40, i and j are integers of 10 to 200, k is an integer of 3 to 66, m is an integer of 2 to 40, and n is an integer of 3 to 66. , O are integers from 1 to 22, and p and q are integers from 1 to 13.
補助アミノ酸配列(Y)は、G(グリシン)及び/又はA(アラニン)を含むことが好ましい。G(グリシン)及びA(アラニン)を含む場合、これらの合計含有割合(%)は、補助アミノ酸配列(Y)の全アミノ酸個数に基づいて、10〜100が好ましく、さらに好ましくは20〜95、特に好ましくは30〜90、最も好ましくは40〜85である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
G(グリシン)及びA(アラニン)の両方を含む場合、これらの含有個数割合(G/A)は、0.03〜40が好ましく、さらに好ましくは0.08〜13、特に好ましくは0.2〜5である。この範囲であると、熱安定性がさらに良好となる。
The auxiliary amino acid sequence (Y) preferably comprises G (glycine) and / or A (alanine). When G (glycine) and A (alanine) are contained, the total content ratio (%) of these is preferably 10 to 100, more preferably 20 to 95, based on the total number of amino acids in the auxiliary amino acid sequence (Y). It is particularly preferably 30 to 90, and most preferably 40 to 85. Within this range, the thermal stability is further improved.
When both G (glycine) and A (alanine) are contained, the content ratio (G / A) of these is preferably 0.03 to 40, more preferably 0.08 to 13, and particularly preferably 0.2. ~ 5. Within this range, the thermal stability is further improved.
補助アミノ酸配列(Y)には、以上の例示の他に、他のアミノ酸{A(アラニン)、G(グリシン)、S(セリン)、T(トレオニン)、V(バリン)、L(ロイシン)、I(イソロイシン)、C(システイン)、M(メチオニン)、F(フェニルアラニン)、Y(チロシン)、P(プロリン)、W(トリプトファン)、N(アスパラギン)、Q(グルタミン)、D(アスパラギン酸)、E(グルタミン酸)、R(アルギニン)、K(リジン)及びH(ヒスチジン)等}を含んでいてもよい。 In addition to the above examples, the auxiliary amino acid sequence (Y) includes other amino acids {A (alanine), G (glycine), S (serine), T (threonine), V (valine), L (leucine), I (isoleucine), C (cysteine), M (methionine), F (phenylalanine), Y (tyrosine), P (proline), W (tryptophan), N (aspartic acid), Q (glutamic acid), D (aspartic acid) , E (glutamic acid), R (arginine), K (lysine), H (histidine), etc.} may be contained.
(GA)a配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(12)〜(14)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GAGAGS)b配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(15)〜(17)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GAGAGY)c配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(18)〜(20)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GAGVGY)d配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(21)〜(23)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GAGYGV)e配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(24)〜(26)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
{DGG(A)fGGA}g配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(27)〜(29)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GVPGV)h配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(30)〜(33)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(G)i配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(34)〜(36)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(A)j配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(37)〜(39)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GGA)k配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(40)〜(42)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GVGVP)m配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(43)〜(45)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GPP)n配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(46)〜(48)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GAQGPAGPG)o配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(49)〜(51)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GAPGAPGSQGAPGLQ)p配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(52)〜(54)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
(GAPGTPGPQGLPGSP)q配列を有する補助アミノ酸配列としては、配列番号(55)〜(57)で表されるアミノ酸配列等が挙げられる。
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GA) a sequence include the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (12) to (14).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GAGAGS) b sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (15) to (17).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GAGAGY) c sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (18) to (20).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GAGVGY) d sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (21) to (23).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GAGYGV) e sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (24) to (26).
{DGG (A) f GGA} Examples of the auxiliary amino acid sequence having a g sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (27) to (29).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GVPVGV) h sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (30) to (33).
(G) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the i sequence include the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (34) to (36).
(A) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the j sequence include the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (37) to (39).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GGA) k sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (40) to (42).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GVGVP) m sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (43) to (45).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GPP) n sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (46) to (48).
Examples of the auxiliary amino acid sequence having the (GAQGPAGPG) o sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (49) to (51).
(GAPGAPGSQGAPGLQ) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the p sequence include amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (52) to (54).
(GAPGTPGPQGLPGSP) Examples of the auxiliary amino acid sequence having the q sequence include the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: (55) to (57).
これらの補助アミノ酸配列のうち、配列番号(12)、(13)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(21)、(22)、(24)、(25)、(27)、(28)、(29)、(30)、(31)、(33)、(34)、(35)、(37)、(38)、(40)、(41)、(43)、(44)、(46)、(47)、(49)、(50)、(52)、(53)、(55)又は(56)で表されるアミノ酸配列が好ましく、さらに好ましくは配列番号(13)、(15)、(16)、(17)、(19)、(22)、(25)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)、(35)、(38)、(41)、(44)、(47)、(50)、(53)又は(56)で表されるアミノ酸配列、特に好ましくは配列番号(15)、(16)又は(33)で表されるアミノ酸配列である。 Among these auxiliary amino acid sequences, SEQ ID NOs: (12), (13), (15), (16), (17), (18), (19), (21), (22), (24), (25), (27), (28), (29), (30), (31), (33), (34), (35), (37), (38), (40), (41) ), (43), (44), (46), (47), (49), (50), (52), (53), (55) or (56) is preferable. More preferably, SEQ ID NOs: (13), (15), (16), (17), (19), (22), (25), (29), (30), (31), (32), ( The amino acid sequence represented by 33), (35), (38), (41), (44), (47), (50), (53) or (56), particularly preferably SEQ ID NO: (15), It is an amino acid sequence represented by (16) or (33).
補助アミノ酸配列(Y)を含む場合、(Y)の含有個数は、熱安定性の観点等から、細胞接着性ペプチド(D)1分子中に、2〜50が好ましく、さらに好ましくは3〜30、特に好ましくは4〜20、最も好ましくは5〜15である。また、細胞接着性ペプチド(D)は、2種以上の補助アミノ酸配列(Y)を含んでもよい。 When the auxiliary amino acid sequence (Y) is contained, the number of (Y) contained is preferably 2 to 50, more preferably 3 to 30 in one molecule of the cell adhesion peptide (D) from the viewpoint of thermal stability and the like. , Particularly preferably 4 to 20, most preferably 5 to 15. Moreover, the cell adhesion peptide (D) may contain two or more kinds of auxiliary amino acid sequences (Y).
細胞接着性ペプチド(D)は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列(X)と補助アミノ酸配列(Y)とが、必要により(X)と(Y)の間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、(X)の両端に介在アミノ酸配列(Z)を含むアミノ酸配列と(Y)とが交互に化学結合してなる構造であることがさらに好ましい。この場合、最小アミノ酸配列(X)と補助アミノ酸配列(Y)との繰り返し単位(X−Y)の数(個)は、細胞接着性の観点等から、1〜50が好ましく、さらに好ましくは2〜40、特に好ましくは3〜30、最も好ましくは4〜20である。 From the viewpoint of cell adhesion and thermal stability, the cell-adhesive peptide (D) has the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y), if necessary, between (X) and (Y). It is preferable that the structure is formed by alternately chemically bonding via the amino acid sequence of (X), and the amino acid sequence containing the intervening amino acid sequence (Z) at both ends of (X) and (Y) are alternately chemically bonded. The structure is more preferable. In this case, the number (pieces) of the repeating unit (XY) of the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) is preferably 1 to 50, more preferably 2 from the viewpoint of cell adhesion and the like. ~ 40, particularly preferably 3-30, most preferably 4-20.
また、介在アミノ酸配列(Z)を有してもよい。
介在アミノ酸配列(Z)としては、最小アミノ酸配列(X)のN末端には、細胞接着性の観点から、GAAVTG配列(58)、GLPGPKGD配列(59)、GPAVTG配列(60)、AGPKGADGSPGPAVTG配列(61)、GAAVCEPG配列(62)、GAALCVSEPG配列(63)、SPASAALCVSEPG配列(64)、SPASAAVCEPG配列(65)、AGPKGADGSPGPAVCEPG配列(66)、AGPKGADGSPGPALCVSEPG配列(67)、GPAVCEPG配列(68)、GPALCVSEPG配列(69)及びGAAPGAS配列(70)からなる群より選ばれる少なくとも1種の介在アミノ酸配列(Z)を結合していることが好ましく、GAAVTG配列(58)、GLPGPKGD配列(59)、GPAVTG配列(60)及びAGPKGADGSPGPAVTG配列(61)からなる群より選ばれる少なくとも1種がさらに好ましく、GAAVTG配列(58)が特に好ましい。
It may also have an intervening amino acid sequence (Z).
As the intervening amino acid sequence (Z), the GAAVTG sequence (58), GLPGPKGD sequence (59), GPAVTG sequence (60), and AGPKGADGSPGPAVTG sequence (61) are located at the N-terminal of the smallest amino acid sequence (X) from the viewpoint of cell adhesion. ), GAAVCEPG sequence (62), GAALCCVSEPG sequence (63), SPASAALCEPG sequence (64), SPASAAVCEPG sequence (65), AGPKGADGSPGPAVCEPG sequence (66), AGPKGADGSPGPALCVSEPG sequence (67), GPAVCEPG sequence (68), GPAVCEPG sequence (68) It is preferable that at least one intervening amino acid sequence (Z) selected from the group consisting of GAAPGAS sequence (70) is bound, and GAAVTG sequence (58), GLPGPKGD sequence (59), GPAVTG sequence (60) and AGPKGADGSPGPAVTG sequence. At least one selected from the group consisting of (61) is more preferable, and the GAAVTG sequence (58) is particularly preferable.
介在アミノ酸配列(Z)としては、最小アミノ酸配列(X)のC末端には、細胞接着性の観点から、SPASAAGY配列(71)、SPASAALCVS配列(72)、SPASAAVC配列(73)、AGPKGADGSPGP配列(74)、AGPKGADGSPGPAVC配列(75)、AGPKGADGSPGPALCVS配列(76)、AGPKGADGSP配列(77)、SPASAAGPVGSP配列(78)、CDAGY配列(79)、CDAGPVGSP配列(80)及びSAGPSAGY配列(81)からなる群より選ばれる少なくとも1種の介在アミノ酸配列(Z)を結合していることが好ましく、SPASAAGY配列(71)、SPASAALCVS配列(72)、SPASAAVC配列(73)、AGPKGADGSPGP配列(74)、AGPKGADGSPGPAVC配列(75)、AGPKGADGSPGPALCVS配列(76)、AGPKGADGSP配列(77)及びSPASAAGPVGSP配列(78)からなる群より選ばれる少なくとも1種がさらに好ましく、SPASAAGY配列(71)が特に好ましい。 As the intervening amino acid sequence (Z), the SPASAAGY sequence (71), the SPASAALCS sequence (72), the SPASAAVC sequence (73), and the AGPKGADGSPGP sequence (74) are located at the C-terminal of the smallest amino acid sequence (X) from the viewpoint of cell adhesion. ), AGPKGADGSPGPAVC sequence (75), AGPKGADGSPGPALCVS sequence (76), AGPKGADGSP sequence (77), SPASAAGPVGSP sequence (78), CDAGY sequence (79), CDAGPVGSP sequence (80) and SAGPSAGY sequence (81). It is preferable that one type of intervening amino acid sequence (Z) is bound, and it is preferable that the SPASAAGY sequence (71), the SPASAALCCVS sequence (72), the SPASAAVC sequence (73), the AGPKGADGSPGGP sequence (74), the AGPKGADGSPGPAVC sequence (75), and the AGPKGADGSPGPALCVS sequence are linked. (76), at least one selected from the group consisting of the AGPKGADGSP sequence (77) and the SPASAAGPVGSP sequence (78) is more preferred, and the SPASAAGY sequence (71) is particularly preferred.
細胞接着性ペプチド(D)は、分岐鎖を含んでいてもよく、一部が架橋されていてもよく、環状構造を含んでいてもよい。しかし、細胞接着性ペプチド(D)は、架橋されていないことが好ましく、さらに好ましくは架橋されていない直鎖構造、特に好ましくは環状構造を持たず架橋されていない直鎖構造である。なお、直鎖構造には、β構造(直鎖状ペプチドが折れ曲がってこの部分同士が平行に並び、その間に水素結合が作られる二次構造)も含まれる。 The cell adhesion peptide (D) may contain a branched chain, may be partially crosslinked, or may contain a cyclic structure. However, the cell adhesion peptide (D) is preferably uncrosslinked, more preferably an uncrosslinked linear structure, and particularly preferably a non-crosslinked linear structure without a cyclic structure. The linear structure also includes a β structure (a secondary structure in which linear peptides are bent and these portions are arranged in parallel, and hydrogen bonds are formed between them).
細胞接着性ペプチド(D)は、細胞接着性及び熱安定性の観点等から、最小アミノ酸配列(X)と補助アミノ酸配列(Y)とが、必要により(X)と(Y)の間に他のアミノ酸配列を介して、交互に化学結合してなる構造であることが好ましく、(X)の両端に介在アミノ酸配列(Z)を含むアミノ酸配列と(Y)とが交互に化学結合してなる構造であることがさらに好ましい。この場合、最小アミノ酸配列(X)と補助アミノ酸配列(Y)との繰り返し単位(X−Y)の数(個)は、細胞接着性の観点等から、1〜50が好ましく、さらに好ましくは2〜40、特に好ましくは3〜30、最も好ましくは4〜20である。 From the viewpoint of cell adhesion and thermal stability, the cell-adhesive peptide (D) has the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y), if necessary, between (X) and (Y). It is preferable that the structure is formed by alternately chemically bonding via the amino acid sequence of (X), and the amino acid sequence containing the intervening amino acid sequence (Z) at both ends of (X) and (Y) are alternately chemically bonded. The structure is more preferable. In this case, the number (pieces) of the repeating unit (XY) of the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) is preferably 1 to 50, more preferably 2 from the viewpoint of cell adhesion and the like. ~ 40, particularly preferably 3-30, most preferably 4-20.
また、最小アミノ酸配列(X)と補助アミノ酸配列(Y)との含有個数は同じでも異なっていてもよい。異なっている場合は、いずれかの含有個数が他方の含有個数より1個少ないことが好ましい{この場合、補助アミノ酸配列(Y)が少ないことが好ましい}。細胞接着性ペプチド(D)中の最小アミノ酸配列(X)と補助アミノ酸配列(Y)との含有個数割合(X/Y)は、0.5〜2が好ましく、さらに好ましくは0.9〜1.4、特に好ましくは1〜1.3である。 Further, the number of the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) may be the same or different. If they are different, it is preferable that the content of either one is one less than the number of the other {in this case, the auxiliary amino acid sequence (Y) is preferably less}. The content ratio (X / Y) of the minimum amino acid sequence (X) and the auxiliary amino acid sequence (Y) in the cell adhesion peptide (D) is preferably 0.5 to 2, more preferably 0.9 to 1. 0.4, particularly preferably 1-1.3.
また、細胞接着性ペプチド(D)の末端部分(最小アミノ酸配列(X)又は補助アミノ酸配列(Y)からペプチド末端まで)に他のアミノ酸を含んでもよい。他のアミノ酸を含む場合、その含有個数は、細胞接着性ペプチド(D)1個当たり、1〜1000個が好ましく、さらに好ましくは3〜300、特に好ましくは10〜100である。 Further, other amino acids may be contained in the terminal portion of the cell adhesion peptide (D) (from the minimum amino acid sequence (X) or the auxiliary amino acid sequence (Y) to the peptide terminal). When other amino acids are contained, the content thereof is preferably 1 to 1000 per cell adhesion peptide (D), more preferably 3 to 300, and particularly preferably 10 to 100.
細胞接着性ペプチド(D)の重量平均分子量(以下、Mw)は、1,000〜1,000,000が好ましく、さらに好ましくは2,000〜700,000、特に好ましくは3,000〜400,000、最も好ましくは4,000〜200,000である。 The weight average molecular weight (hereinafter, Mw) of the cell adhesion peptide (D) is preferably 1,000 to 1,000,000, more preferably 2,000 to 700,000, and particularly preferably 3,000 to 400, 000, most preferably 4,000 to 200,000.
なお、細胞接着性ペプチド(D)のMwは、SDS−PAGE(SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)法により、測定サンプル{ポリペプチド等}を分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法等の公知の方法によって求められる(以下、同じ)。 The Mw of the cell adhesion peptide (D) is known as a method of separating a measurement sample {polypeptide, etc.} by SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) and comparing the migration distance with a standard substance. (The same applies hereinafter).
細胞接着性ペプチド(D)は、化合物(AM)でさらに修飾されていてもよい。化合物(AM)としては、1〜3級のアミノ基を含有する化合物及びその塩並びにアンモニウム塩(AM−1)、カルボキシル基を含有する化合物(AM−2)、スルホ基を含有する化合物(AM−3)並びにヒドロキシル基を含有する化合物(AM−4)が含まれる。(AM)で修飾されていると、細胞増殖性がさらに良好となる。 The cell adhesion peptide (D) may be further modified with compound (AM). As the compound (AM), a compound containing a primary amino group and a salt thereof, an ammonium salt (AM-1), a compound containing a carboxyl group (AM-2), and a compound containing a sulfo group (AM). -3) and a compound containing a hydroxyl group (AM-4) are included. When modified with (AM), cell proliferation is further improved.
1〜3級のアミノ基を含有する化合物及びその塩並びにアンモニウム塩を含有する化合物(AM−1)としては、ポリアミン、アミノアルコール、アミノ基を有するハロゲン化物、アミノ基含有モノマー及びアミノ基含有モノマーを構成単量体とする重合体、並びにこれらのハロゲン化水素塩及び4級化物等が使用できる。
ポリアミンとしては、少なくとも1個の1級アミノ基又は2級アミノ基を有するポリアミン(炭素数2〜56)等が用いられ、脂肪族ポリアミン、脂環式ポリアミン、複素環式ポリアミン及び芳香族ポリアミン等が用いられる。
Examples of the compounds containing 1st to 3rd grade amino groups and their salts and the compounds containing ammonium salts (AM-1) include polyamines, aminoalcohols, halides having amino groups, amino group-containing monomers and amino group-containing monomers. A polymer containing the above as a constituent monomer, and hydrogen halides and quaternized compounds thereof can be used.
As the polyamine, a polyamine having at least one primary amino group or a secondary amino group (2-56 carbon atoms) or the like is used, and an aliphatic polyamine, an alicyclic polyamine, a heterocyclic polyamine, an aromatic polyamine and the like are used. Is used.
脂肪族ポリアミンとしては、アルキレンジアミン(エチレンジアミン、プロピレンジアミン、トリメチレンジアミン、テトラメチレンジアミン及びヘキサメチレンジアミン等)、アルキレン基の炭素数が2〜6であるポリアルキレンポリアミン(ジエチレントリアミン、イミノビスプロピルアミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン及びペンタエチレンヘキサミン等)、並びにこれらのアルキル(炭素数1〜18)置換体(ジメチルアミノプロピルアミン、ジエチルアミノプロピルアミン、ジプロピルアミノプロピルアミン、メチルエチルアミノプロピルアミン、トリメチルヘキサメチレンジアミン、N,N−ジオクタデシルエチレンジアミン、トリオクタデシルエチレンジアミン及びメチルイミノビスプロピルアミン等)等が挙げられる。 Examples of the aliphatic polyamine include alkylenediamine (ethylenediamine, propylenediamine, trimethylenediamine, tetramethylenediamine, hexamethylenediamine, etc.), polyalkylene polyamine having 2 to 6 carbon atoms in the alkylene group (diethylenetriamine, iminobispropylamine, etc.). Triethylenetetramine, tetraethylenepentamine, pentaethylenehexamine, etc.) and their alkyl (1-18 carbon atoms) substitutions (dimethylaminopropylamine, diethylaminopropylamine, dipropylaminopropylamine, methylethylaminopropylamine, etc.) Trimethylhexamethylenediamine, N, N-dioctadecylethylenediamine, trioctadecylethylenediamine, methyliminobispropylamine, etc.) and the like.
脂環式ポリアミンとしては、1,3−ジアミノシクロヘキサン、1,3−ビス(メチルアミノ)シクロヘキサン、1,3−ビス(ジヒドロキシアミノ)シクロヘキサン、イソホロンジアミン、メンタンジアミン及び4,4’−メチレンジシクロヘキサンジアミン等が挙げられる。 Alicyclic polyamines include 1,3-diaminocyclohexane, 1,3-bis (methylamino) cyclohexane, 1,3-bis (dihydroxyamino) cyclohexane, isophoronediamine, mentandiamine and 4,4'-methylenedicyclohexane. Examples include diamine.
複素環式ポリアミンとしては、ピペラジン、N−メチルピペラジン、N−アミノエチルピペラジン及び1,4−ジアミノエチルピペラジン等が挙げられる。 Examples of the heterocyclic polyamine include piperazine, N-methylpiperazine, N-aminoethylpiperazine and 1,4-diaminoethylpiperazine.
芳香族ポリアミンとしては、フェニレンジアミン、N,N’−ジメチルフェニレンジアミン、N,N,N’−トリメチルフェニレンジアミン、ジフェニルメタンジアミン及び2,6−ジアミノピリジン、トリレンジアミン、ジエチルトリレンジアミン、4,4’−ビス(メチルアミノ)ジフェニルメタン及び1−メチル−2−メチルアミノ−4−アミノベンゼン等が挙げられる。 Examples of aromatic polyamines include phenylenediamine, N, N'-dimethylphenylenediamine, N, N, N'-trimethylphenylenediamine, diphenylmethanediamine and 2,6-diaminopyridine, tolylene diamine, diethyl tolylene diamine, 4, Examples thereof include 4'-bis (methylamino) diphenylmethane and 1-methyl-2-methylamino-4-aminobenzene.
アミノアルコールとしては、炭素数2〜58のアミノアルコール等が用いられ、炭素数2〜10のアルカノールアミン[モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、モノブタノールアミン、トリエタノールアミン、トリプロパノールアミン、トリブタノールアミン、N,N−ビス(ヒドロキシエチル)エチレンジアミン及びN,N、N’、N’−テトラキス(ヒドロキシエチル)エチレンジアミン等]、これらのアルキル(炭素数1〜18)置換体[N,N−ジメチルエタノールアミン、N,N−ジエチルエタノールアミン、N−エチルジエタノールアミン、N−オクタデシルジエタノールアミン、N,N−ジエチル−N’,N’−ビス(ヒドロキシエチル)エチレンジアミン、N,N−ジオクタデシル−N’,N’−ビス(ヒドロキシエチル)エチレンジアミン及びN,N,N’−トリオクタデシル−N’−ヒドロキシエチルエチレンジアミン等]等が挙げられる。 As the amino alcohol, an amino alcohol having 2 to 58 carbon atoms or the like is used, and an alkanol amine having 2 to 10 carbon atoms [monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, monoisopropanolamine, monobutanolamine, triethanolamine, tri. Propanolamine, tributanolamine, N, N-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine and N, N, N', N'-tetrakis (hydroxyethyl) ethylenediamine, etc.], alkyl (carbon number 1-18) substitutions thereof [ N, N-Dimethylethanolamine, N, N-diethylethanolamine, N-ethyldiethanolamine, N-octadecyldiethanolamine, N, N-diethyl-N', N'-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine, N, N-di Octadecyl-N', N'-bis (hydroxyethyl) ethylenediamine and N, N, N'-trioctadecyl-N'-hydroxyethylethylenediamine, etc.] and the like can be mentioned.
アミノ基を有するハロゲン化物としては、炭素数2〜17のアルキルアミンのハロゲン(塩素及び臭素等)化物等が用いられ、アミノエチルクロリド、N−メチルアミノプロピルクロリド、N,N−ジメチルアミノエチルクロリド、N,N−ジエチルアミノエチルクロリド、N,N−ジベンジルアミノエチルブロミド、N,N−ジメチルアミノプロピルブロミド、N,N−ジエチルアミノプロピルクロリド及びN,N−ジベンジルアミノプロピルクロリド等が挙げられる。 As the halide having an amino group, a halogen (chlorine, bromine, etc.) compound of an alkylamine having 2 to 17 carbon atoms is used, and aminoethyl chloride, N-methylaminopropyl chloride, N, N-dimethylaminoethyl chloride, etc. , N, N-dibenzylaminoethyl chloride, N, N-dibenzylaminoethyl bromide, N, N-dimethylaminopropyl bromide, N, N-diethylaminopropyl chloride, N, N-dibenzylaminopropyl chloride and the like.
アミノ基含有モノマーとしては、炭素数5〜21のアミノ基含有ビニル化合物、エチレンイミン及び炭素数2〜20のアミノ酸等が用いられる。
アミノ基含有ビニル化合物としては、アミノ基含有(メタ)アクリレート、アミノ基含有(メタ)アクリルアミド、アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素及びアミノ基含有アリルエーテル等が用いられる。
As the amino group-containing monomer, an amino group-containing vinyl compound having 5 to 21 carbon atoms, ethyleneimine, an amino acid having 2 to 20 carbon atoms, and the like are used.
As the amino group-containing vinyl compound, an amino group-containing (meth) acrylate, an amino group-containing (meth) acrylamide, an amino group-containing aromatic vinyl hydrocarbon, an amino group-containing allyl ether and the like are used.
アミノ基含有(メタ)アクリレートとしては、アミノエチル(メタ)アクリレート、N−メチルアミノエチル(メタ)アクリレート、N,N−ジメチルアミノエチル(メタ)アクリレート、N,N−ジエチルアミノプロピル(メタ)アクリレート、N,N−ジプロピルアミノエチル(メタ)アクリレート、N−ベンジル−N−メチルアミノエチル(メタ)アクリレート、N,N−ジベンジルアミノエチル(メタ)アクリレート、N,N−ジベンジルアミノプロピル(メタ)アクリレート、モルホリノエチル(メタ)アクリレート及びN−メチルピペチジノエチル(メタ)アクリレート等が挙げられる。 Examples of the amino group-containing (meth) acrylate include aminoethyl (meth) acrylate, N-methylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dimethylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-diethylaminopropyl (meth) acrylate, and the like. N, N-dipropylaminoethyl (meth) acrylate, N-benzyl-N-methylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dibenzylaminoethyl (meth) acrylate, N, N-dibenzylaminopropyl (meth) ) Acrylate, morpholinoethyl (meth) acrylate, N-methylpipetidinoethyl (meth) acrylate and the like.
アミノ基含有(メタ)アクリルアミドとしては、アミノエチルアクリルアミド、N−メチルアミノプロピルアクリルアミド、N,N−ジメチルアミノエチル(メタ)アクリルアミド、N,N−ジエチルアミノプロピル(メタ)アクリルアミド、N,N−ジプロピルアミノエチル(メタ)アクリルアミド、N−ベンジル−N−メチルアミノエチル(メタ)アクリルアミド、モルホリノエチル(メタ)アクリルアミド及びN−メチルピペチジノエチル(メタ)アクリルアミド等が挙げられる。 Examples of the amino group-containing (meth) acrylamide include aminoethyl acrylamide, N-methylaminopropyl acrylamide, N, N-dimethylaminoethyl (meth) acrylamide, N, N-diethylaminopropyl (meth) acrylamide, and N, N-dipropyl. Examples thereof include aminoethyl (meth) acrylamide, N-benzyl-N-methylaminoethyl (meth) acrylamide, morpholinoethyl (meth) acrylamide, and N-methylpipetidinoethyl (meth) acrylamide.
アミノ基含有芳香族ビニル炭化水素としては、アミノエチルスチレン、N−メチルアミノエチルスチレン、N,N−ジメチルアミノスチレン、N,N−ジプロピルアミノスチレン及びN−ベンジル−N−メチルアミノスチレン等が挙げられる。 Examples of the amino group-containing aromatic vinyl hydrocarbon include aminoethylstyrene, N-methylaminoethylstyrene, N, N-dimethylaminostyrene, N, N-dipropylaminostyrene, N-benzyl-N-methylaminostyrene and the like. Can be mentioned.
アミノ基含有アリルエーテルとしては、アミノエチルアリルエーテル、N−メチルアミノエチルアリルエーテル、N,N−ジメチルアミノエチルアリルエーテル及びN,N−ジエチルアミノエチルアリルエーテル等が挙げられる。 Examples of the amino group-containing allyl ether include aminoethyl allyl ether, N-methylaminoethyl allyl ether, N, N-dimethylaminoethyl allyl ether, N, N-diethylaminoethyl allyl ether and the like.
アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリン、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、プロリン、システイン、リシン、セリン、グリシン、3−アミノプロピオン酸、8−アミノアクタン酸及び20−アミノエイコサン酸等が挙げられる。 Amino acids include arginine, histidine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, alanine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, proline, cysteine, lysine, serine, glycine, 3-aminopropionic acid. , 8-Aminoactanic acid, 20-Aminoeicosanoic acid and the like.
アミノ基含有モノマーの重合体としては、アミノ基含有ビニル化合物からなるビニルポリマー、ポリエチレンイミン及びポリペプチド((B1)は含まない。)等が挙げられる。
アミノ基含有モノマーの重合体の重量平均分子量は、500〜100万が好ましく、さらに好ましくは1,000〜80万、特に好ましくは2,000〜50万である。なお、重量平均分子量は、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー(GPC)で測定することができる{基準物質:分子量420〜20,600,000のポリスチレンスタンダード(東ソー製)等}。
Examples of the polymer of the amino group-containing monomer include a vinyl polymer composed of an amino group-containing vinyl compound, polyethyleneimine, and a polypeptide (not including (B1)).
The weight average molecular weight of the polymer of the amino group-containing monomer is preferably 5 to 1,000,000, more preferably 1,000 to 800,000, and particularly preferably 2,000 to 500,000. The weight average molecular weight can be measured by gel permeation chromatography (GPC) {reference material: polystyrene standard (manufactured by Toso) having a molecular weight of 420 to 20,600,000}.
ハロゲン化水素塩としては、上記アミノ基含有化合物とハロゲン化物(フッ化水素、塩化水素、臭化水素及びヨウ化水素等)との塩が挙げられる。
具体的には、塩酸N,N−ジメチルアミノエチルクロリド及び塩酸N,N−ジエチルアミノエチルクロリド等が挙げられる。
Examples of the hydrohalide salt include salts of the above amino group-containing compound and halides (hydrogen fluoride, hydrogen chloride, hydrogen bromide, hydrogen iodide, etc.).
Specific examples thereof include N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride and N, N-diethylaminoethyl chloride hydrochloride.
これらの4級化物としては、これらのアミノ基を4級化剤(メチルクロリド、エチルクロリド、ベンジルクロリド、ジメチル炭酸、ジメチル硫酸及びエチレンオキシド等)によって4級化したもの等が挙げられる。 Examples of these quaternized products include those obtained by quaternizing these amino groups with a quaternizing agent (methyl chloride, ethyl chloride, benzyl chloride, dimethyl carbonate, dimethyl sulfate, ethylene oxide, etc.).
これらの1〜3級のアミノ基を含有する化合物及びその塩並びにアンモニウム塩(AM−1)のうち、細胞増殖性の観点から、塩酸N,N−ジメチルアミノエチルクロリド及び塩酸N,N−ジエチルアミノエチルクロリドが好ましく、さらに好ましくは塩酸N,N−ジメチルアミノエチルクロリドである。 Among these compounds containing 1st to 3rd class amino groups, salts thereof, and ammonium salts (AM-1), N, N-dimethylaminoethyl chloride and N, N-diethylamino hydrochloride from the viewpoint of cell proliferation. Ethyl chloride is preferable, and N, N-dimethylaminoethyl chloride hydrochloride is more preferable.
カルボキシル基を含有する化合物(AM−2)としては、炭素数2〜30のカルボン酸であり、具体的には、ぎ酸、酢酸、プロピオン酸、こはく酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、りんご酸、酒石酸、くえん酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、サリチル酸、4−ヒドロキシ安息香酸及びフェニル酢酸等が挙げられる。また、これらカルボキシル基を有するハロゲン化物等も使用できる。具体的には、クロロ酢酸及びクロロぎ酸等が挙げられる。これらのカルボキシル基を含有する化合物(AM−2)のうち、細胞増殖性の観点からクロロ酢酸が好ましい。 The carboxyl group-containing compound (AM-2) is a carboxylic acid having 2 to 30 carbon atoms, and specifically, formic acid, acetic acid, propionic acid, benzoic acid, glycolic acid, gluconic acid, lactic acid, and apple. Acids, tartaric acid, sucrose, ascorbic acid, glucuronic acid, maleic acid, fumaric acid, pyruvate, aspartic acid, glutamic acid, benzoic acid, anthranilic acid, mesylic acid, salicylic acid, 4-hydroxybenzoic acid, phenylacetic acid and the like. .. Further, a halide having these carboxyl groups and the like can also be used. Specific examples thereof include chloroacetic acid and chloroformic acid. Among these carboxyl group-containing compounds (AM-2), chloroacetic acid is preferable from the viewpoint of cell proliferation.
スルホ基を含有する化合物(AM−3)としては、炭素数2〜30のスルホン酸であり、具体的には、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、2−ヒドロキシエタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルファニル酸及びシクロヘキシルアミノスルホン酸等が挙げられる。また、これらスルホ基を有するハロゲン化物等も使用できる。具体的には、クロロスルホン酸及びクロロエタンスルホン酸等が挙げられる。これらのスルホン基を含有する化合物(AM−3)のうち、細胞増殖性の観点からクロロエタンスルホン酸が好ましい。 The sulfo group-containing compound (AM-3) is a sulfonic acid having 2 to 30 carbon atoms, and specifically, ethanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, pantothenic acid, 2-hydroxyethanesulfonic acid, and toluenesulfon. Acids, sulfanilic acid, cyclohexylaminosulfonic acid and the like can be mentioned. Further, a halide having these sulfo groups and the like can also be used. Specific examples thereof include chlorosulfonic acid and chloroethanesulfonic acid. Among these sulfone group-containing compounds (AM-3), chloroethanesulfonic acid is preferable from the viewpoint of cell proliferation.
ヒドロキシル基を含有する化合物(AM−4)としては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等が挙げられる。また、これらヒドロキシル基を有するハロゲン化物等も使用できる。具体的には、クロロエタノール及びクロロプロパノール等が挙げられる。これらのヒドロキシル基を含有する化合物(AM−4)のうち、細胞増殖性観点からクロロエタノールが好ましい。 Examples of the compound containing a hydroxyl group (AM-4) include methanol, ethanol, propanol, butanol and the like. Further, a halide having these hydroxyl groups and the like can also be used. Specific examples thereof include chloroethanol and chloropropanol. Among these hydroxyl group-containing compounds (AM-4), chloroethanol is preferable from the viewpoint of cell proliferation.
化合物(AM)で修飾する方法としては、(1)化合物(AM)と、修飾前の細胞接着性ペプチド(D)とを化学結合{共有結合、イオン結合及び/又は水素結合等}させる方法が適用できる。
これらのうち、細胞増殖性の観点等から、(1)の化学結合させる方法が好ましく、さらに好ましくは共有結合である。
As a method of modifying with the compound (AM), (1) a method of chemically bonding the compound (AM) and the cell adhesion peptide (D) before modification {covalent bond, ionic bond and / or hydrogen bond, etc.} is used. Applicable.
Of these, from the viewpoint of cell proliferation and the like, the method of chemical bonding (1) is preferable, and covalent bonding is more preferable.
(1)化合物(AM)と、修飾前の細胞接着性ペプチド(D)とを化学結合{共有結合、イオン結合及び/又は水素結合等}させる方法において、化学結合させるために、細胞接着性ペプチド(D)がアミノ酸残基として反応性基{ヒドロキシル基、カルボキシル基、メルカプト基、及び1級又は2級アミノ基等}をもつアミノ酸を持っていることが好ましい。反応性基のうち、細胞増殖性の観点から、ヒドロキシル基、カルボキシル基及び1級アミノ基が好ましく、さらに好ましくはヒドロキシル基及びカルボキシル基、特に好ましくはヒドロキシル基である。また、細胞接着性ペプチド(D)の1分子中に反応性基を少なくとも1個有すればよいが、細胞増殖性の観点から、1分子中に2〜50個有するものが好ましく、さらに好ましくは1分子中に3〜30個、特に好ましくは1分子中に5〜20個有するものである。 (1) In a method of chemically bonding a compound (AM) and an unmodified cell-adhesive peptide (D) {covalent bond, ionic bond and / or hydrogen bond, etc.}, a cell-adhesive peptide is used to chemically bond the compound (AM). It is preferable that (D) has an amino acid having a reactive group {hydroxyl group, carboxyl group, mercapto group, primary or secondary amino group, etc.} as an amino acid residue. Among the reactive groups, a hydroxyl group, a carboxyl group and a primary amino group are preferable, and a hydroxyl group and a carboxyl group are preferable, and a hydroxyl group is particularly preferable, from the viewpoint of cell proliferation. Further, it is sufficient that one molecule of the cell adhesion peptide (D) has at least one reactive group, but from the viewpoint of cell proliferation, it is preferable that one molecule has 2 to 50 reactive groups, and more preferably. It has 3 to 30 cells in one molecule, particularly preferably 5 to 20 cells in one molecule.
化学結合させる方法としては、公知の方法が適用でき、特開2007−51127号公報等に記載の方法が挙げられる。化学結合形成反応には反応溶媒を使用してもよく、反応溶媒としては公知のものが使用でき、例えば、水、臭化リチウム水溶液、過塩素酸リチウム水溶液、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルフォキシド、ジメチルアセトアミド及びテトラヒドロフランが挙げられる。 As a method for chemically bonding, a known method can be applied, and examples thereof include the methods described in JP-A-2007-51127. A reaction solvent may be used for the chemical bond formation reaction, and known reaction solvents can be used. For example, water, an aqueous solution of lithium bromide, an aqueous solution of lithium perchlorate, methanol, ethanol, isopropanol, acetone, and dimethyl can be used. Examples include sulfoxide, dimethylacetamide and tetrahydrofuran.
化合物(AM)と修飾前の細胞接着性ペプチド(D)とを共有結合させる具体例としては、細胞接着性ペプチド(D)中の側鎖にヒドロキシル基を含有するアミノ酸(例えば、Ser及びTyr)を1〜3級のアミノ基、及び/又はアンモニウム塩、カルボキシル基、スルホン基、ヒドロキシル基を有するアルキルハロゲン化物でアルキルエーテル化する方法、及び側鎖にカルボキシル基を含有するアミノ酸(例えば、Asp及びGlu)をアミノ基、及び/又はアンモニウム塩を有するアルコールでエステル化する方法が挙げられる。 Specific examples of covalently binding the compound (AM) to the unmodified cell-adhesive peptide (D) include amino acids (eg, Ser and Tyr) containing a hydroxyl group in the side chain of the cell-adhesive peptide (D). Is alkyl etherified with an alkyl halide having a primary amino group and / or an ammonium salt, a carboxyl group, a sulfone group, or a hydroxyl group, and an amino acid containing a carboxyl group in the side chain (for example, Asp and Glu) can be esterified with an alcohol having an amino group and / or an ammonium salt.
好ましい細胞接着性ペプチド(D)の一部を以下に例示する。
(1)最小アミノ酸配列(X)がRGD配列(x1)の場合
RGD配列(x1)の13個と(GAGAGS)9配列(16)(y1)の12個とを有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約11万のポリペプチド(配列(82)){「プロネクチンF」、プロネクチンは三洋化成工業(株)の登録商標(日本及び米国)である。三洋化成工業(株)製<以下同じ>};
プロネクチンFを化合物(AM)で修飾したタンパク質であり、具体的には、化合物(AM)として塩酸N,N−ジメチルアミノエチルクロリドを用いて修飾したポリペプチド(「プロネクチンFプラス」);
(x1)の5個と(GAGAGS)3配列(15)(y2)の5個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約2万のポリペプチド(配列(83))(「プロネクチンF2」);(x1)の3個と(GVPGV)2GG(GAGAGS)3配列(33)(y3)の3個とを有しこれらが交互に化学結合してなる構造を有するMw約1万のポリペプチド(配列(84))(「プロネクチンF3」)等。
Some of the preferred cell adhesion peptides (D) are illustrated below.
(1) When the minimum amino acid sequence (X) is the RGD sequence (x1) It has 13 RGD sequences (x1) and 12 (GAGAGS) 9 sequences (16) (y1), and these are alternately chemically chemically. A polypeptide having a Mw of about 110,000 having a bound structure (sequence (82)) {"Pronectin F", Pronectin is a registered trademark of Sanyo Kasei Kogyo Co., Ltd. (Japan and the United States). Made by Sanyo Chemical Industries, Ltd. <Same below>};
A protein obtained by modifying Pronectin F with a compound (AM), specifically, a polypeptide modified with N, N-dimethylaminoethyl chloride as the compound (AM) (“Pronectin F Plus”);
A polypeptide having about 20,000 Mw (sequence (83)) having 5 (x1) and 5 (GAGAGS) 3 sequences (15) and (y2) and having a structure formed by alternately chemically bonding these. ("Pronectin F2"); Mw having a structure consisting of three (x1) and three (GVPVGV) 2 GG (GAGAGS) 3 sequences (33) and (y3), which are chemically bonded alternately. Approximately 10,000 polypeptides (sequence (84)) ("Pronectin F3") and the like.
(2)最小アミノ酸配列(X)がIKVAV配列(x2)の場合
プロネクチンF、プロネクチンF2又はプロネクチンF3のRGD配列(x1)をIKVAV配列(7)(x2)に変更した「プロネクチンL」、「プロネクチンL2」、又は「プロネクチンL3」等。
(2) When the minimum amino acid sequence (X) is the IKVAV sequence (x2) "Pronectin L" and "Pronectin" in which the RGD sequence (x1) of Pronectin F, Pronectin F2 or Pronectin F3 is changed to the IKVAV sequence (7) (x2). "L2", "Pronectin L3", etc.
(3)最小アミノ酸配列(X)がYIGSR配列(x3)の場合
プロネクチンF、プロネクチンF2又はプロネクチンF3のRGD配列(x1)をYIGSR配列(x3)に変更した「プロネクチンY」、「プロネクチンY2」、又は「プロネクチンY3」等。
(3) When the minimum amino acid sequence (X) is the YIGSR sequence (x3) “Pronectin Y”, “Pronectin Y2”, in which the RGD sequence (x1) of Pronectin F, Pronectin F2 or Pronectin F3 is changed to the YIGSR sequence (x3), Or "Pronectin Y3" or the like.
細胞接着性ペプチド(D)は、人工的に合成されるもの(人工ポリペプチド)が含まれ、例えば、有機合成法(固相合成法、液相合成法等)及び生化学的合成法[遺伝子組換え微生物(酵母、細菌、大腸菌等)]等によって製造する。すなわち、細胞接着性ペプチド(D)としては、動物由来のコラーゲンやフィブロネクチン等の細胞接着性蛋白質を含まない。 The cell-adhesive peptide (D) includes an artificially synthesized peptide (artificial polypeptide), for example, an organic synthesis method (solid phase synthesis method, liquid phase synthesis method, etc.) and a biochemical synthesis method [gene]. Recombinant microorganisms (yeast, bacteria, Escherichia coli, etc.)], etc. That is, the cell adhesion peptide (D) does not contain cell adhesion proteins such as collagen and fibronectin derived from animals.
有機合成法に関しては、例えば、日本生化学会編「続生化学実験講座2、タンパク質の化学(下)」第641〜694頁(昭和62年5月20日;株式会社東京化学同人発行)に記載されている方法等が用いられる。生化学的合成法に関しては、例えば、特表平3−502935号公報に記載されている方法等が用いられる。細胞接着性ペプチド(D)を容易に合成できる点で、遺伝子組換え微生物による生化学的合成法が好ましく、特に好ましくは遺伝子組換え大腸菌を用いて合成する方法である。 Regarding the organic synthesis method, for example, it is described in "Sequel Biochemistry Experiment Course 2, Protein Chemistry (2)", pp. 641-694 (May 20, 1987; published by Tokyo Kagaku Dojin Co., Ltd.), edited by The Japanese Biochemical Society. The method used is used. As for the biochemical synthesis method, for example, the method described in JP-A-3-502935 is used. A biochemical synthesis method using a genetically modified microorganism is preferable, and a method for synthesizing using genetically modified Escherichia coli is particularly preferable because the cell adhesion peptide (D) can be easily synthesized.
細胞接着因子としては、細胞接着性の観点から、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、プロネクチンF及びプロネクチンFプラスからなる群より選ばれる少なくとも1種が好ましい。 As the cell adhesion factor, at least one selected from the group consisting of fibronectin, collagen, laminin, pronectin F and pronectin F plus is preferable from the viewpoint of cell adhesion.
本発明の細胞培養用基材において、細胞接着因子の含有量は、細胞接着性の観点から、細胞培養用基材の重量を基準として、0〜10重量%が好ましく、さらに好ましくは0〜5重量%である。 In the cell culture substrate of the present invention, the content of the cell adhesion factor is preferably 0 to 10% by weight, more preferably 0 to 5, based on the weight of the cell culture substrate from the viewpoint of cell adhesion. By weight%.
本発明の細胞培養用基材の形状は、特に制限はなく、例えば、シート状、繊維状、ロッド状及び球状(ビーズ状等)等の形状が挙げられる。これらのうち、細胞培養に用いやすい観点から、シート状及び球状が好ましい。
シートである場合、シートの厚さとしては特に制限はないが、細胞培養のしやすさ及び分解性の観点から、0.5〜500nmのものが好ましく挙げられる。
The shape of the cell culture substrate of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include sheet-like, fibrous, rod-like, and spherical (bead-like, etc.) shapes. Of these, sheet-shaped and spherical are preferable from the viewpoint of being easy to use for cell culture.
In the case of a sheet, the thickness of the sheet is not particularly limited, but from the viewpoint of ease of cell culture and degradability, a sheet having a thickness of 0.5 to 500 nm is preferable.
本発明の細胞培養用基材は、37℃における貯蔵弾性率G’が1000〜1×1010Paであり、好ましくは1×104〜1×108である。貯蔵弾性率G’が1000Pa未満であると、細胞の接着性低下、接着細胞の形状変化が起こる問題がある。また、1×1010Paを超えると、細胞培養用基材の作製が困難であり、また後述する分解剤(E)により分解されにくい問題がある。
貯蔵弾性率G’はレオメータにより測定した値である。
Cell culture substrate of the present invention, the storage modulus G 37 ° C. 'is 1000-1 × 10 10 Pa, preferably a 1 × 10 4 ~1 × 10 8 . If the storage elastic modulus G'is less than 1000 Pa, there is a problem that the adhesion of cells is lowered and the shape of adherent cells is changed. Further, if it exceeds 1 × 10 10 Pa, it is difficult to prepare a base material for cell culture, and there is a problem that it is difficult to be decomposed by the decomposing agent (E) described later.
The storage elastic modulus G'is a value measured by a rheometer.
本発明の細胞培養用基材の細胞培養表面における水(37℃)に対する接触角は、細胞接着性の観点から、20〜60°が好ましく、さらに好ましくは30〜50°である。 The contact angle of the cell culture substrate of the present invention with respect to water (37 ° C.) on the cell culture surface is preferably 20 to 60 °, more preferably 30 to 50 °, from the viewpoint of cell adhesion.
本発明の細胞培養用基材の細胞培養表面における表面粗さ(Ra)は、細胞接着性の観点から、1μm以下であることが好ましく、さらに好ましくは0.5μm以下である。 The surface roughness (Ra) of the cell culture substrate of the present invention on the cell culture surface is preferably 1 μm or less, more preferably 0.5 μm or less, from the viewpoint of cell adhesion.
本発明の細胞培養用基材の製造方法としては、例えば、多糖類(A)がカルボキシメチルセルロースであり、下記(1)〜(5)の工程を含むものが挙げられる。
(1)カルボキシメチルセルロース(以下において、CMCと略記する)を水に溶解させる工程。
(2)前記(1)で得られた基材に架橋剤(B)を添加し、架橋反応を進行させる工程。
(3)前記(2)で得られた基材をシート状、もしくはビーズ状に加工する工程。
(4)前記(3)で得られた基材を乾燥させ、水分を除去する工程。
(5)前記(4)で得られた基材に細胞接着性ペプチド(D)を修飾する工程。
Examples of the method for producing a base material for cell culture of the present invention include those in which the polysaccharide (A) is carboxymethyl cellulose and includes the following steps (1) to (5).
(1) A step of dissolving carboxymethyl cellulose (hereinafter abbreviated as CMC) in water.
(2) A step of adding a cross-linking agent (B) to the base material obtained in (1) above to allow the cross-linking reaction to proceed.
(3) A step of processing the base material obtained in (2) above into a sheet or beads.
(4) A step of drying the base material obtained in (3) above to remove water.
(5) A step of modifying the cell adhesive peptide (D) on the substrate obtained in (4) above.
CMCを水に溶解させる方法としては、例えば攪拌機で水を撹拌しながら、CMCを添加する方法等が挙げられる。溶解液の均一さを確保するため、好ましくはCMCを徐々に添加する方法が含まれる。 Examples of the method of dissolving CMC in water include a method of adding CMC while stirring water with a stirrer. In order to ensure the uniformity of the solution, a method of gradually adding CMC is preferably included.
CMCを水に溶解させる攪拌方法としては、例えば撹拌子をスターラーで回す方法、撹拌羽で撹拌する方法、前記2つの方法にさらに加熱をする方法等が挙げられる。
CMC溶解液の粘度が高いため、撹拌羽で撹拌する方法が好ましく、さらに好ましくは加熱しながら撹拌羽で撹拌する方法である。
Examples of the stirring method for dissolving CMC in water include a method of rotating the stirrer with a stirrer, a method of stirring with a stirring blade, and a method of further heating the above two methods.
Since the viscosity of the CMC solution is high, a method of stirring with a stirring blade is preferable, and a method of stirring with a stirring blade while heating is more preferable.
架橋剤(B)の添加方法としては、例えば攪拌機でCMC溶解液を撹拌しながら、架橋剤(B)を添加する方法等が挙げられる。この場合、架橋剤(B)は一度に全量添加してもよく、ポンプ等を用いて徐々に添加してもよいが、架橋反応を均一に進行させる観点から、ポンプ等を用いて徐々に添加する方法が好ましい。 Examples of the method of adding the cross-linking agent (B) include a method of adding the cross-linking agent (B) while stirring the CMC solution with a stirrer. In this case, the cross-linking agent (B) may be added in its entirety at a time or gradually added using a pump or the like, but from the viewpoint of uniformly proceeding the cross-linking reaction, it is gradually added using a pump or the like. The method of
架橋剤(B)添加後のCMC溶解液をシャーレ上に均一にシート状に加工する方法としては、例えば浸漬塗り、吹付、ローラー塗り及びスピンコート等が挙げられる。
生産性及びハンドリング性の観点から、浸漬塗りは好ましくなく、吹付、ローラー塗り及びスピンコートが好ましい。塗膜の均一性の観点から、より好ましくはローラー塗り、スピンコートである。塗布から乾燥までの効率の観点から、最も好ましくはスピンコートである。
Examples of the method for uniformly processing the CMC solution after the addition of the cross-linking agent (B) into a petri dish into a sheet form include dip coating, spraying, roller coating and spin coating.
From the viewpoint of productivity and handleability, dip coating is not preferable, and spray coating, roller coating and spin coating are preferable. From the viewpoint of coating film uniformity, roller coating and spin coating are more preferable. From the viewpoint of efficiency from application to drying, spin coating is most preferable.
架橋剤(B)添加後のCMC溶解液をビーズ状に加工する方法としては、例えば、CMC溶液を乾燥後に物理的に粉砕して粒子状にする粉砕法及び架橋剤添加後のCMC溶解液を疎水性有機溶剤中に分散させる分散法等が挙げられる。 As a method for processing the CMC solution after adding the cross-linking agent (B) into beads, for example, a pulverization method in which the CMC solution is physically crushed into particles after drying and a CMC solution after adding the cross-linking agent are used. Examples thereof include a dispersion method in which the mixture is dispersed in a hydrophobic organic solvent.
粉砕法としては、まず、乾燥物を粗粉砕し、次いで微粉砕することが好ましい。この際ジェット気流中で衝突板に衝突させて粉砕したり、ジェット気流中で粒子同士を衝突させて粉砕したり、機械的に回転するローターとステーターの狭いギャップで粉砕する方式が好ましく用いられる。 As a pulverization method, it is preferable that the dried product is first roughly pulverized and then finely pulverized. At this time, a method of colliding with a collision plate in a jet stream to pulverize, colliding particles with each other in a jet stream to pulverize, or pulverizing with a narrow gap between a mechanically rotating rotor and a stator is preferably used.
分級工程では、前記粉砕工程にて得られた粉砕物を分級し、所定粒径の粒子に調整する。分級は、例えば、サイクロン、デカンター及び遠心分離等により、微粒子部分を取り除くことにより行うことができる。 In the classification step, the pulverized product obtained in the pulverization step is classified and adjusted to particles having a predetermined particle size. Classification can be performed by removing fine particle portions by, for example, cyclone, decanter, centrifugation or the like.
分散法において、架橋剤(B)添加後のCMC溶解液を有機溶剤中に分散させる方法としては、逆相懸濁法等が挙げられ、粒子径の均一性、粒子の円形度及び粒子表面形状の滑らかさの観点から、逆相懸濁法による分散が好ましい。
疎水性有機溶媒は公知(特許第3363000号、特開2003−147005号公報記載)のものが使用でき、基本的に水に溶け難ければいかなるものも使用できる。その一例を挙げれば、n−ペンタン、n−ヘキサン、n−ヘプタン及びn−オクタン等の脂肪族炭化水素、シクロヘキサン及びメチルシクロヘキサン等の脂環族炭化水素、ベンゼン、トルエン及びキシレン等の芳香族炭化水素等が挙げられる。
分散剤としては、逆相懸濁重合分散剤として公知のものが使用でき、例えば、アニオン分散剤(ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩(特開平6−93008号公報記載)、モノアルキルリン酸塩(特開昭61−209201号公報記載のもの等)等)、ノニオン分散剤(ショ糖脂肪酸エステル、ソルビトール脂肪酸エステル、脂肪族アルコールアルキレンオキサイド付加物及びアルキルフェノールアルキレンオキサイド付加物等)等が挙げられる。
In the dispersion method, examples of the method of dispersing the CMC solution after the addition of the cross-linking agent (B) in the organic solvent include a reverse phase suspension method, and the uniformity of the particle size, the circularity of the particles, and the surface shape of the particles. From the viewpoint of smoothness, dispersion by the reverse phase suspension method is preferable.
As the hydrophobic organic solvent, known ones (Patent No. 3363000, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-147005) can be used, and basically any hydrophobic solvent can be used as long as it is difficult to dissolve in water. For example, aliphatic hydrocarbons such as n-pentane, n-hexane, n-heptane and n-octane, alicyclic hydrocarbons such as cyclohexane and methylcyclohexane, and aromatic hydrocarbons such as benzene, toluene and xylene. Examples include hydrogen.
As the dispersant, known ones as a reverse phase suspension polymerization dispersant can be used. Japanese Patent Application Laid-Open No. 61-209201, etc.), etc.), nonionic dispersants (sucrose fatty acid ester, sorbitol fatty acid ester, aliphatic alcohol alkylene oxide adduct, alkylphenol alkylene oxide adduct, etc.) and the like.
余分な水分を除去する方法としては特に限定されず、乾燥機を用いた乾燥方法があげられる。例えば、ディスクドライヤー、ターボドライヤー及びドラムドライヤー等の乾燥機を使用して乾燥する方法が挙げられる。
乾燥温度は、60〜230℃が好ましく、さらに好ましくは100〜200℃である。乾燥温度が、60℃以上であると、乾燥に長くの時間を必要とせずエネルギー消費量の点で経済的であり、一方、230℃以下であると、副反応や樹脂の分解などが起こらないので好ましい。乾燥雰囲気は常圧下でも減圧下(例えば500mmHg以下)でもよい。
The method for removing excess water is not particularly limited, and examples thereof include a drying method using a dryer. For example, a method of drying using a dryer such as a disc dryer, a turbo dryer and a drum dryer can be mentioned.
The drying temperature is preferably 60 to 230 ° C, more preferably 100 to 200 ° C. When the drying temperature is 60 ° C. or higher, it does not require a long time for drying and is economical in terms of energy consumption. On the other hand, when the drying temperature is 230 ° C. or lower, side reactions and resin decomposition do not occur. Therefore, it is preferable. The dry atmosphere may be under normal pressure or reduced pressure (for example, 500 mmHg or less).
乾燥後の含水率は、貯蔵弾性率G‘が1000〜1×1010Paになる水分量で規定される。貯蔵弾性率G‘が1000Pa未満では、細胞培養用基材の形状がビーズ状の場合、粒子同士が合着する問題がある。また、細胞培養用基材の形状がシート状の場合は他の材料と触れたときに変形又は接着する問題がある。 The moisture content after drying is defined by the amount of water at which the storage elastic modulus G'is 1000 to 1 × 10 10 Pa. When the storage elastic modulus G'is less than 1000 Pa, there is a problem that the particles are coalesced to each other when the cell culture substrate is bead-shaped. Further, when the cell culture substrate is in the form of a sheet, there is a problem that it is deformed or adhered when it comes into contact with another material.
貯蔵弾性率G‘が1000〜1×1010Paになる水分量は、細胞培養用基材の重量を基準として、40重量%以下が好ましく、貯蔵弾性率を向上させる観点から、さらに好ましくは30重量%以下である。一方、水分量が減少しすぎると、体積収縮によって表面粗さRaが大きくなるため、10%重量以上がより好ましい。 The amount of water at which the storage elastic modulus G'is 1000 to 1 × 10 10 Pa is preferably 40% by weight or less based on the weight of the cell culture substrate, and more preferably 30 from the viewpoint of improving the storage elastic modulus. It is less than% by weight. On the other hand, if the amount of water decreases too much, the surface roughness Ra increases due to volume shrinkage, so 10% by weight or more is more preferable.
細胞接着性ペプチド(D)を細胞培養基材へ修飾する方法としては、(1)化学結合{共有結合、イオン結合及び/又は水素結合等}させる方法、(2)細胞接着ペプチド(D)を物理吸着(ファンデルワールス力による吸着)させる方法、並びに、(3)酵素修飾させる方法が挙げられる。 Examples of the method for modifying the cell adhesion peptide (D) into a cell culture substrate include (1) a method of forming a chemical bond {covalent bond, an ionic bond and / or a hydrogen bond}, and (2) a method of modifying the cell adhesion peptide (D). Examples include a method of physical adsorption (adsorption by van der Waals force) and a method of (3) ionic modification.
化学結合する方法(1)としては、細胞接着性ペプチド(D)が有するの反応性基(−OH、−COOH、−NH−、−NH2、−SH等)と多糖類(A)が有する反応性基(−OH、−COOH、−CHO、−C(=O)−、−NH−、−NH2及び−SH等)を架橋することにより行われる方法等が挙げられる。
物理的吸着する方法(2)としては、所定濃度の細胞接着性ペプチド(D)を含有する溶液と細胞培養用基材とを所定時間共存させてることにより物理吸着させる方法等が挙げられる。
酵素修飾する方法(3)としては、グリコシドトランスフェラーゼ等の酵素を用いて細胞接着性ペプチド(D)に多糖類(A)を結合させる方法等が挙げられる。
As a method (1) for chemical bonding, the reactive group (-OH, -COOH, -NH-, -NH 2 , -SH, etc.) of the cell-adhesive peptide (D) and the polysaccharide (A) are contained. Examples thereof include a method performed by cross-linking reactive groups (-OH, -COOH, -CHO, -C (= O)-, -NH-, -NH 2 and -SH, etc.).
Examples of the method (2) of physical adsorption include a method of physically adsorbing a solution containing a cell adhesion peptide (D) having a predetermined concentration and a cell culture substrate in coexistence for a predetermined time.
Examples of the enzyme modification method (3) include a method of binding the polysaccharide (A) to the cell adhesion peptide (D) using an enzyme such as glycosyltransferase.
本発明の細胞の生産方法は、上記細胞培養用基材を用いて細胞(X)を培養する細胞の生産方法である。 The cell production method of the present invention is a cell production method for culturing cells (X) using the cell culture substrate.
細胞(X)としては細胞であれば制限がないが、本発明の細胞培養用基材を用いると細胞増殖性が高いため、医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。 The cell (X) is not limited as long as it is a cell, but since the cell culture substrate of the present invention has high cell proliferation, it is a normal mammalian-derived cell used for the production of useful substances such as pharmaceuticals and treatment. Cells, cell lines derived from mammals and insect cells are suitable.
哺乳動物由来の正常細胞としては、皮膚に関与する細胞(上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等)、血管に関与する細胞(血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等)、筋肉に関与する細胞(筋肉細胞等)、脂肪に関与する細胞(脂肪細胞等)、神経に関与する細胞(神経細胞等)、肝臓に関与する細胞(肝細胞等)、膵臓に関与する細胞(膵ラ島細胞等)、腎臓に関与する細胞(腎臓細胞、腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等)、肺・気管支に関与する細胞(上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等)、目に関与する細胞(視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等)、前立腺に関与する細胞(上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等)、骨に関与する細胞(骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等)、軟骨に関与する細胞(軟骨芽細胞及び軟骨細胞等)、歯に関与する細胞(歯根膜細胞及び骨芽細胞等)、血液に関与する細胞(白血球及び赤血球等)、及び幹細胞{例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞(oval cell、small hepatocyte等)、脂肪組織幹細胞、iPS細胞、胚性幹(ES)細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹(EG)細胞、膵臓幹細胞(膵管上皮幹細胞等)、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞等}、前駆細胞(脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、NK前駆細胞等)等}等が挙げられる。 Examples of normal mammalian-derived cells include cells involved in skin (epithelial cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, etc.), cells involved in blood vessels (vascular endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, etc.). ), Muscle-related cells (muscle cells, etc.), fat-related cells (fat cells, etc.), nerve-related cells (nerve cells, etc.), liver-related cells (hepatic cells, etc.), pancreas Cells (pancreatic La Island cells, etc.), cells involved in the kidney (kidney cells, renal epithelial cells, proximal tubule epithelial cells, mesangium cells, etc.), cells involved in the lungs and bronchi (epithelial cells, fibroblasts, blood vessels, etc.) Involvement in endothelium cells and smooth muscle cells, etc.), cells involved in eyes (photoreceptor cells, corneal epithelial cells, corneal endothelial cells, etc.), cells involved in prostate (epithelial cells, stromal cells, smooth muscle cells, etc.), bone Cells (osteoblasts, bone cells, osteoblasts, etc.), cells involved in cartilage (chondrocytes, chondrocytes, etc.), cells involved in teeth (root membrane cells, osteoblasts, etc.), blood involved Cells (leukocytes, erythrocytes, etc.) and stem cells {for example, undifferentiated mesenchymal stem cells, skeletal muscle stem cells, hematopoietic stem cells, nerve stem cells, hepatic stem cells (oval cell, small hepatocite, etc.), adipose tissue stem cells, iPS cells , Embryonic stem (ES) cells, epidermal stem cells, intestinal stem cells, sperm stem cells, embryonic germ stem (EG) cells, pancreatic stem cells (pancreatic epithelial stem cells, etc.), leukocyte stem cells, lymphoid stem cells, corneal stem cells, etc.}, Precursor cells (adipose progenitor cells, vascular endothelial progenitor cells, cartilage progenitor cells, lymphoid progenitor cells, NK progenitor cells, etc.)} and the like can be mentioned.
哺乳動物由来の株化細胞としては、CRFK細胞、3T3細胞、A549細胞、AH130細胞、B95−8細胞、BHK細胞、BOSC23細胞、BS−C−1細胞、C3H10T1/2細胞、C−6細胞、CHO細胞、COS細胞、CV−1細胞、F9細胞、FL細胞、FL5−1細胞、FM3A細胞、G−361細胞、GP+E−86細胞、GP+envAm12細胞、H4−II−E細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、HEp−2細胞、HL−60細胞、HTC細胞、HUVEC細胞、IMR−32細胞、IMR−90細胞、K562細胞、KB細胞、L細胞、L5178Y細胞、L−929細胞、MA104細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、MIA PaCG−2細胞、N18細胞、Namalwa細胞、NG108−15細胞、NRK細胞、OC10細胞、OTT6050細胞、P388細胞、PA12細胞、PA317細胞、PC−12細胞、PER.C6細胞、PG13細胞、QGH細胞、Raji細胞、RPMI−1788細胞、SGE1細胞、Sp2/O−Ag14細胞、ST2細胞、THP−1細胞、U−937細胞、V79細胞、VERO細胞、WI−38細胞、ψ2細胞、及びψCRE細胞等が挙げられる{細胞培養の技術(日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、1999年)}。 Examples of mammalian-derived cell lines include CRFK cells, 3T3 cells, A549 cells, AH130 cells, B95-8 cells, BHK cells, BOSC23 cells, BS-C-1 cells, C3H10T1 / 2 cells, and C-6 cells. CHO cells, COS cells, CV-1 cells, F9 cells, FL cells, FL5-1 cells, FM3A cells, G-361 cells, GP + E-86 cells, GP + envAm12 cells, H4-II-E cells, HEK293 cells, HeLa cells , HEp-2 cells, HL-60 cells, HTC cells, HUVEC cells, IMR-32 cells, IMR-90 cells, K562 cells, KB cells, L cells, L5178Y cells, L-929 cells, MA104 cells, MDBK cells, MDCK cells, MIA PaCG-2 cells, N18 cells, Namalwa cells, NG108-15 cells, NRK cells, OC10 cells, OTT6050 cells, P388 cells, PA12 cells, PA317 cells, PC-12 cells, PER. C6 cells, PG13 cells, QGH cells, Razi cells, RPMI-1788 cells, SGE1 cells, Sp2 / O-Ag14 cells, ST2 cells, THP-1 cells, U-937 cells, V79 cells, VERO cells, WI-38 cells , Ψ2 cells, ψCRE cells, etc. {Cell culture technology (edited by the Japan Society for Tissue Culture, published by Asakura Shoten Co., Ltd., 1999)}.
昆虫細胞としては、カイコ細胞(BmN細胞及びBoMo細胞等)、クワコ細胞、サクサン細胞、シンジュサン細胞、ヨトウガ細胞(Sf9細胞及びSf21細胞等)、クワゴマダラヒトリ細胞、ハマキムシ細胞、ショウジョウバエ細胞、センチニクバエ細胞、ヒトスジシマカ細胞、アゲハチョウ細胞、ワモンゴキブリ細胞及びイラクサキンウワバ細胞(Tn−5細胞、HIGH FIVE細胞及びMG1細胞等)等が挙げられる{昆虫バイオ工場(木村滋 編著、株式会社工業調査会 発行、2000年)。 Insect cells include silkworm cells (BmN cells, BoMo cells, etc.), quail cells, sakusan cells, Shinjusan cells, yotoga cells (Sf9 cells, Sf21 cells, etc.), mulberry cells, beetle cells, ginger cells, sentinel flies. Examples include cells, human staghorn cells, swallowtail cells, swallowtail cells and Irakusakin uwaba cells (Tn-5 cells, HIGH FIVE cells, MG1 cells, etc.) {Insect Bio Factory (edited by Shigeru Kimura, published by Industrial Research Association, 2000) Year).
これらの細胞(X)のうち、医薬品等の有用物質生産や治療等の観点から、哺乳動物由来の正常細胞及び哺乳動物由来の株化細胞が好ましい。そして、治療に有用な点で、さらに好ましくは腎臓細胞、筋肉細胞、肝細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞、幹細胞及び前駆細胞である。また、医薬品等の有用物質生産に有用な点で、さらに好ましくはCRFK細胞、3T3細胞、BHK細胞、CHO細胞、HEK293細胞、HeLa細胞、L−929細胞、MDCK細胞、PER.C6細胞、VERO細胞及びWI−38細胞、特に好ましくはCRFK細胞、MDCK細胞及びVERO細胞である。 Among these cells (X), normal cells derived from mammals and cell lines derived from mammals are preferable from the viewpoint of production of useful substances such as pharmaceuticals and treatment. And, in terms of usefulness for treatment, more preferably, kidney cells, muscle cells, hepatocytes, osteoblasts, epithelial cells, fibroblasts, vascular endothelial cells, stem cells and progenitor cells. Further, in terms of being useful for the production of useful substances such as pharmaceuticals, more preferably, CRFK cells, 3T3 cells, BHK cells, CHO cells, HEK293 cells, HeLa cells, L-929 cells, MDCK cells, PER. C6 cells, VERO cells and WI-38 cells, particularly preferably CRFK cells, MDCK cells and VERO cells.
本発明の細胞の生産方法に用いられる培地(ME)としては、無血清培地(STEMPRO hESC SFM17、TeSR 2、E8培地、hESF9培地、hESF−FX培地、hESF92ai、StemFit AK02N、S−medium、mTeSRTM、Grace培地、IPL−41培地、Schneider’s培地、Opti−PROTMSFM培地、Opti−MEMTMI培地、VP−SFM培地、CD293培地、293SFMII培地、CD−CHO培地、CHO−S−SFMII培地、FreeStyleTM293培地、CD−CHO ATGTM培地及びこれらの混合培地等);一般の培地(RPMI培地、MEM培地、Eagle’sMEM培地、BME培地、DME培地、αMEM培地、IMEM培地、ES培地、DM−160培地、Fisher培地、F12培地、WE培地、ASF103培地、ASF104培地、ASF301培地、TC−100培地、Sf−900II培地、Ex−cell405培地、Express−Five培地、Drosophila培地及びこれらの混合培地);及びこれらの混合培地等が挙げられる。 The medium (ME) used in the method for producing cells of the present invention includes serum-free medium (STEMPRO hESC SFM17, TeSR 2, E8 medium, hESF9 medium, hESF-FX medium, hESF92ai, StemFit AK02N, S-mediaum, mTeSR TM. , Grace medium, IPL-41 medium, Schneider's medium, Opti-PRO TM SFM medium, Opti-MEM TM I medium, VP-SFM medium, CD293 medium, 293SFMII medium, CD-CHO medium, CHO-S-SFMII medium. , FreeStyle TM 293 medium, CD-CHO ATG TM medium and mixed medium thereof, etc.); General medium (RPMI medium, MEM medium, Eagle's MEM medium, BME medium, DME medium, αMEM medium, IMEM medium, ES medium, etc. DM-160 medium, Fisher medium, F12 medium, WE medium, ASF103 medium, ASF104 medium, ASF301 medium, TC-100 medium, Sf-900II medium, Ex-cell405 medium, Express-Five medium, Drosophila medium and a mixture of these. ); And a mixed medium thereof and the like.
また、これらの培地には、血清を添加することができる。
血清としては、ヒト血清、及び動物血清(ウシ血清、ウマ血清、ヤギ血清、ヒツジ血清、ブタ血清、ウサギ血清、ニワトリ血清、ラット血清、及びマウス血清等)が含まれる。
血清を添加する場合、これらのうち、ヒト血清、ウシ血清、及びウマ血清が好ましい。また、動物血清の由来は、成体由来の血清、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清等が挙げられる。血清を添加する場合、これらのうち、仔由来の血清、新生由来の血清、及び胎児由来の血清が好ましく、さらに好ましくは新生由来の血清、及び胎児由来の血清、特に好ましくは胎児由来の血清である。血清を添加する場合、さらに血清は、非働化処理や、抗体の除去処理等を行ってもよい。
In addition, serum can be added to these media.
Serum includes human serum and animal serum (bovine serum, horse serum, goat serum, sheep serum, pig serum, rabbit serum, chicken serum, rat serum, mouse serum, etc.).
When serum is added, human serum, bovine serum, and horse serum are preferable. In addition, the origin of animal serum includes adult-derived serum, offspring-derived serum, neonatal-derived serum, fetal-derived serum and the like. When sera are added, among these, pup-derived serum, newborn-derived serum, and fetal-derived serum are preferable, and more preferably newborn-derived serum and fetal-derived serum, particularly preferably fetal-derived serum. be. When the serum is added, the serum may be further deactivated, an antibody may be removed, or the like.
血清を使用する場合、血清の使用量(重量%)は、培地の重量に基づいて、0.1〜50が好ましく、さらに好ましくは0.3〜30、特に好ましくは1〜20である。 When serum is used, the amount of serum used (% by weight) is preferably 0.1 to 50, more preferably 0.3 to 30, and particularly preferably 1 to 20, based on the weight of the medium.
培地中には、必要に応じて、細胞増殖因子を含有させることができる。細胞増殖因子を含有させることにより、細胞の増殖速度を高めたり、細胞活性を高めたりすることができる。 Cell growth factors can be contained in the medium, if necessary. By containing a cell growth factor, the cell growth rate can be increased and the cell activity can be increased.
細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、サイトカイン、インターロイキン、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ペプチドが含まれる。これらのうち、適用できる細胞の範囲が広く、治癒期間がより短縮できるという観点から、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子及び骨形成因子が好ましく、さらに好ましくは線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子及びインシュリン様増殖因子である。 Cell growth factors include fibroblast growth factor, transforming growth factor, epithelial cell growth factor, hepatocellular growth factor, platelet-derived growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor, nerve growth factor, stem cell factor, and leukemia. Physiologically active peptides such as inhibitors, bone formation factors, heparin-binding epithelial cell growth factors, neurotrophic factors, binding tissue growth factors, angiopoetin, cytokines, interleukins, adrenamodulin and sodium diuretic peptides are included. Of these, fibroblast growth factor, transforming growth factor, insulin-like growth factor and bone formation factor are preferable, and more preferably fibroblast, from the viewpoint that the range of applicable cells is wide and the healing period can be shortened. Growth factors, transforming growth factors and insulin-like growth factors.
細胞増殖因子を使用する場合、細胞増殖因子の含有量(重量%)は細胞増殖因子の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、10-16〜10-3が好ましく、さらに好ましくは10-14〜10-5、特に好ましくは10-12〜10-7である。 When using the cell growth factor, but the content of the cell growth factor (wt%) depends on the type of cell growth factor, based on the weight of the medium, preferably 10 -16 to 10 -3, more preferably 10 - It is 14 to 10 -5 , particularly preferably 10 -12 to 10 -7 .
これらの培地には、さらに抗菌剤(アンホテリシンB、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等)を含有させることができる。抗菌剤を含有させる場合、この含有量(重量%)は抗菌剤の種類によって異なるが、培地の重量に基づいて、10-6〜10が好ましく、さらに好ましくは10-5〜1、特に好ましくは10-4〜0.1である。 These media can further contain antibacterial agents (amphotericin B, gentamicin, penicillin, streptomycin, etc.). When an antibacterial agent is contained, this content (% by weight) varies depending on the type of antibacterial agent, but is preferably 10-6 to 10, more preferably 10-5 to 1, particularly preferably 10-5 to 1, based on the weight of the medium. 10 -4 to 0.1.
培地に分散させる細胞の濃度(個/mL)としては特に制限はないが、培地1mL当たり、100〜1億が好ましく、さらに好ましくは1000〜1千万、特に好ましくは1万〜100万である。 The concentration (cells / mL) of cells to be dispersed in the medium is not particularly limited, but is preferably 10 to 100 million, more preferably 10 to 10 million, and particularly preferably 10,000 to 1 million per 1 mL of the medium. ..
細胞の個数の計数方法は公知の方法が使用でき、例えば、トリパンブルー又はクリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法で測定することができる{細胞培養の技術(日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、1999年)}。
また、培地に投入する細胞培養用基材の乾燥重量(g)は、培養する細胞の種類等によって適宜決定できるが、培地1L当たり、0.005〜800が好ましく、さらに好ましくは0.02〜200、特に好ましくは0.1〜40である。
A known method can be used for counting the number of cells, and for example, it can be measured by a cell nucleus counting method using trypan blue or crystal violet {Cell culture technology (edited by the Japan Tissue Culture Society, published by Asakura Shoten Co., Ltd.). , 1999)}.
The dry weight (g) of the cell culture substrate to be added to the medium can be appropriately determined depending on the type of cells to be cultured, etc., but is preferably 0.005 to 800, more preferably 0.02 to 0.02 to 1 L of the medium. 200, particularly preferably 0.1 to 40.
培養条件としては、特に制限は無く、二酸化炭素(CO2)濃度1〜20体積%、5〜45℃で1時間〜100日間、必要に応じて1〜10日毎に培地交換しなら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、CO2濃度3〜10体積%、30〜40℃、1〜20日間、1〜3日毎に培地交換しながら培養する条件である。 The culture conditions are not particularly limited, and the culture conditions are such that the carbon dioxide (CO 2 ) concentration is 1 to 20% by volume, the culture medium is changed at 5 to 45 ° C. for 1 hour to 100 days, and if necessary, the medium is changed every 1 to 10 days. Etc. can be applied. Preferred conditions are a CO 2 concentration of 3 to 10% by volume, 30 to 40 ° C., 1 to 20 days, and a condition of culturing while exchanging the medium every 1 to 3 days.
本発明の細胞の生産方法は、上記細胞培養用基材を用いて細胞(X)を培養するものであれば特に制限はないが、産業利用性の観点から、細胞培養用基材上で細胞(X)を培養後、分解剤(E)により細胞培養用基材を分解する工程を含んでいることが好ましい。
分解剤(E)としては、多糖類分解酵素(E1)、有機酸(E2)及び無機酸(E3)等が挙げられる。
これらのうち、多糖類分解酵素(E1)が好ましい。
多糖類分解酵素(E1)としては、多糖を分解する酵素として知られているものを制限なく使用でき、具体的には、セルラーゼ、アミラーゼ、デキストラナーゼ、カラギナーゼ、アルギン酸リアーゼ、ヒアルロニダーゼ、キチナーゼ及びキトサナーゼ等が挙げられる。
細胞培養用基材を分解剤(E)で分解することにより、増殖した細胞の形状を壊さずに細胞を回収することができるので、例えば、シート状、球状及び組織状の細胞を得ることができる。
The method for producing cells of the present invention is not particularly limited as long as cells (X) are cultured using the above-mentioned cell culture substrate, but from the viewpoint of industrial usability, cells are used on the cell culture substrate. After culturing (X), it is preferable to include a step of decomposing the cell culture substrate with the degrading agent (E).
Examples of the decomposing agent (E) include polysaccharide-degrading enzymes (E1), organic acids (E2) and inorganic acids (E3).
Of these, the polysaccharide-degrading enzyme (E1) is preferred.
As the polysaccharide-degrading enzyme (E1), those known as polysaccharide-degrading enzymes can be used without limitation, and specifically, cellulase, amylase, dextranase, carrageinase, alginate lyase, hyaluronidase, chitinase and chitosanase. And so on.
By decomposing the cell culture substrate with the degrading agent (E), the cells can be recovered without destroying the shape of the proliferated cells. Therefore, for example, sheet-like, spherical and tissue-like cells can be obtained. can.
好ましい多糖類分解酵素(E1)としては、細胞培養用基材の分解性の観点から、細胞培養用基材を構成する架橋物(C)に用いられている多糖(A)により適宜選択されるが、具体的には下記の組み合わせが好ましい。
多糖(A){セルロース、カルボキシメチルセルロース及びその他のセルロース誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1種}と分解剤(E){セルラーゼ}との組み合わせ。
多糖(A){デキストリン及びデキストリン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1種}と分解剤(E){デキストラナーゼ}との組み合わせ。
多糖(A){カラギーナン及びカラギーナン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1種}と分解剤(E){カラギナーゼ}との組み合わせ。
多糖(A){アルギン酸及びアルギン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1種}と分解剤(E){アルギン酸リアーゼ}との組み合わせ。
多糖(A){ヒアルロン酸及びヒアルロン酸誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1種}と分解剤(E){ヒアルロニダーゼ}との組み合わせ。
多糖(A){キチン及びキチン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1種}と分解剤(E){キチナーゼ}との組み合わせ。
多糖(A){キトサン及びキトサン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも1種}と分解剤(E){キトサナーゼ}との組み合わせ。
The preferred polysaccharide-degrading enzyme (E1) is appropriately selected from the polysaccharide (A) used in the crosslinked product (C) constituting the cell culture substrate from the viewpoint of degradability of the cell culture substrate. However, specifically, the following combinations are preferable.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of cellulose, carboxymethyl cellulose and other cellulose derivatives} and a degrading agent (E) {cellulase}.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of dextrins and dextrin derivatives} and a degrading agent (E) {dextranase}.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of carrageenan and carrageenan derivatives} and a degrading agent (E) {carrageenase}.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of alginic acid and alginic acid derivatives} and a degrading agent (E) {alginate lyase}.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of hyaluronic acid and hyaluronic acid derivatives} and a degrading agent (E) {hyaluronidase}.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of chitin and chitin derivatives} and a degrading agent (E) {chitinase}.
A combination of a polysaccharide (A) {at least one selected from the group consisting of chitosan and chitosan derivatives} and a degrading agent (E) {chitosanase}.
分解剤(E)は分解剤(E)溶液として用いることができる。
分解剤(E)溶液中の分解剤(E)の濃度は、使用する分解剤(E)の種類及び細胞培養用基材を構成する架橋物(C)に用いられている多糖(A)の種類により適宜選択されるが、細胞毒性及び細胞培養用基材の分解性の観点から、分解剤(E)溶液の重量を基準として、0.1〜5重量%が好ましく、さらに好ましくは0.1〜1重量%である。
The decomposing agent (E) can be used as a decomposing agent (E) solution.
The concentration of the decomposing agent (E) in the degrading agent (E) solution is the type of the decomposing agent (E) used and the polysaccharide (A) used in the crosslinked product (C) constituting the cell culture substrate. It is appropriately selected depending on the type, but from the viewpoint of cytotoxicity and degradability of the cell culture substrate, 0.1 to 5% by weight is preferable, and more preferably 0. 1 to 1% by weight.
細胞の生産方法として、好ましい具体例を以下に示す。
(1)一般的な細胞培養による細胞の生産方法
接着性細胞(X−1)を、上記細胞培養用基材を用いて所定期間培養する。培養後、分解剤(E)を用いて細胞培養基材から細胞を回収する。
(2)細胞シートの培養
接着性細胞(X−1)を、上記細胞培養用基材を用いて所定期間培養する。細胞がコンフルエントになった後、分解剤(E)を用いて細胞培養基材から細胞シートを回収する。
(3)細胞構成物の培養
接着性細胞(X−1)を、望ましい構造に成形した上記細胞培養用基材を用いて所定期間培養する。培養後、分解剤(E)により細胞培養基材を除去し、細胞構成物を得る。
Specific preferred examples of the cell production method are shown below.
(1) Cell production method by general cell culture Adhesive cells (X-1) are cultured for a predetermined period using the above-mentioned cell culture substrate. After culturing, cells are recovered from the cell culture substrate using the degrading agent (E).
(2) Culture of cell sheet Adhesive cells (X-1) are cultured for a predetermined period using the above-mentioned cell culture substrate. After the cells become confluent, the cell sheet is recovered from the cell culture substrate using the degrading agent (E).
(3) Culturing of cell constituents Adhesive cells (X-1) are cultured for a predetermined period of time using the above-mentioned cell culture substrate molded into a desired structure. After culturing, the cell culture substrate is removed with the degrading agent (E) to obtain a cell constituent.
本発明の細胞培養用キットは、上記細胞培養用基材及び上記分解剤(E)を含むものである。
細胞培養用基材及び分解剤(E)として好ましいものは、上記と同様である。
また、分解剤(E)は上記分解剤(E)溶液としてキットに含まれていてもよい。
The cell culture kit of the present invention contains the cell culture substrate and the degrading agent (E).
The preferred base material for cell culture and the decomposing agent (E) are the same as described above.
Further, the decomposing agent (E) may be included in the kit as the above-mentioned decomposing agent (E) solution.
以下に実施例として掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を、%は重量%を意味する。 The present invention will be described in more detail below as examples, but the present invention is not limited to these examples. In the following, unless otherwise specified, parts mean parts by weight and% means% by weight.
<実施例1>
撹拌装置を備えた容器に水800部を入れ、CMC(第一工業製薬(株)、「セロゲン F−SC」)を100部、撹拌(50rpm)しながらダマにならないように徐々に添加し、CMC溶解液を得た。その後、架橋剤(B)としてエポキシ基を有する化合物であるエチレングリコールジグリシジルエーテル(ナガセケムテックス(株)、「デナコールEX−810」)100部を撹拌しながら添加した。
得られた溶液を直径70mmの円形ガラス板上スピンコーター((株)井元製作所製、「スピンコーター7094」)を用いて塗布し、100℃の乾燥機で架橋反応を進行させながら3時間乾燥させ、含水率20重量%のシート状(直径70mm、厚み0.1mm)の細胞培養用基材(1)を得た。得られた基材(1)の貯蔵弾性率G‘は108Paであった。
<Example 1>
Put 800 parts of water in a container equipped with a stirrer, add 100 parts of CMC (Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd., "Cerogen F-SC") gradually while stirring (50 rpm) so as not to get lumpy. A CMC solution was obtained. Then, 100 parts of ethylene glycol diglycidyl ether (Nagase ChemteX Corporation, "Denacol EX-810"), which is a compound having an epoxy group, was added as the cross-linking agent (B) with stirring.
The obtained solution was applied using a spin coater (“Spin Coater 7094” manufactured by Imoto Seisakusho Co., Ltd.) on a circular glass plate having a diameter of 70 mm, and dried for 3 hours while advancing the crosslinking reaction in a dryer at 100 ° C. A sheet-shaped (diameter 70 mm, thickness 0.1 mm) cell culture substrate (1) having a water content of 20% by weight was obtained. Storage modulus G of the resulting substrate (1) 'was 10 8 Pa.
<実施例2>
架橋剤(B)の添加量を「100部」に代えて「67部」とする以外は、実施例1と同様にして、含水率20重量%のシート状(直径70mm、厚み0.1mm)の細胞培養用基材(2)を得た。得られた基材(2)の貯蔵弾性率G‘は106Paであった。
<Example 2>
Sheet-shaped (diameter 70 mm, thickness 0.1 mm) having a water content of 20% by weight in the same manner as in Example 1 except that the amount of the cross-linking agent (B) added is "67 parts" instead of "100 parts". The cell culture substrate (2) was obtained. Storage modulus G of the resulting substrate (2) 'was 10 6 Pa.
<実施例3>
架橋剤(B)の添加量を「100部」に代えて「50部」とする以外は、実施例1と同様にして、含水率20重量%のシート状(直径70mm、厚み0.1mm)の細胞培養用基材(3)を得た。得られた基材(3)の貯蔵弾性率G‘は104Paであった。
<Example 3>
Sheet-shaped (diameter 70 mm, thickness 0.1 mm) having a water content of 20% by weight in the same manner as in Example 1 except that the amount of the cross-linking agent (B) added is "50 parts" instead of "100 parts". The cell culture substrate (3) was obtained. Storage modulus G of the resulting substrate (3) 'was 10 4 Pa.
<実施例4>
実施例2で得られた細胞培養用基材(2)を、細胞接着性ペプチド(D)であるプロネクチンF(配列番号(82)の配列を有するMw約11万のポリペプチド、三洋化成工業(株)製)を0.001重量%含有するPronectinF溶液(37℃)中に2時間浸漬し、物理的吸着によりPronectinFを表面に修飾した細胞培養用基材(4)を得た。
<Example 4>
The cell culture substrate (2) obtained in Example 2 was used as a cell-adhesive peptide (D), Pronectin F (a polypeptide having a sequence of SEQ ID NO: (82), Mw of about 110,000, Sanyo Kasei Kogyo (Sanyo Kasei Kogyo). The cell culture substrate (4) was obtained by immersing it in a PeptideF solution (37 ° C.) containing 0.001% by weight of (manufactured by Co., Ltd.) for 2 hours and modifying the surface of PeptideF by physical adsorption.
<実施例5>
実施例2で得られた細胞培養用基材(2)を、フィブロネクチン(和光純薬工業(株)製、「Fibronectin Solution, from Human Plasma」)を0.001重量%含有するフィブロネクチン溶液(37℃)中に2時間浸漬し、物理的吸着によりフィブロネクチンを表面に修飾した細胞培養用基材(5)を得た。
<Example 5>
The cell culture substrate (2) obtained in Example 2 is a fibronectin solution (37 ° C.) containing 0.001% by weight of fibronectin (“Fibronectin Solution, from Human Plasma” manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). ) Was immersed for 2 hours to obtain a cell culture substrate (5) whose surface was modified with fibronectin by physical adsorption.
<実施例6>
実施例2で得られた細胞培養用基材(2)を、コラーゲン(新田ゼラチン(株)製、「Cell matrix Type I−A」)を0.3重量%含有するコラーゲン溶液(37℃、pH3)中に2時間浸漬し、物理的吸着によりコラーゲンを表面に修飾した細胞培養用基材(6)を得た。
<Example 6>
The cell culture substrate (2) obtained in Example 2 was prepared with a collagen solution (37 ° C., 37 ° C.) containing 0.3% by weight of collagen (“Cell matrix Type I-A” manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.). The cells were immersed in pH 3) for 2 hours to obtain a cell culture substrate (6) whose surface was modified with collagen by physical adsorption.
<比較例1>
架橋剤(B)を加えない以外は、実施例1と同様にして含水率20重量%のシート状(直径70mm、厚み0.1mm)の比較用の細胞培養用基材(1’)を得た。得られた基材(1’)の貯蔵弾性率G‘は800Paであった。
<Comparative example 1>
A sheet-like (diameter 70 mm, thickness 0.1 mm) cell culture substrate (1') having a water content of 20% by weight was obtained in the same manner as in Example 1 except that the cross-linking agent (B) was not added. rice field. The storage elastic modulus G'of the obtained base material (1') was 800 Pa.
<比較例2>
架橋剤(B)の添加量を「100部」に代えて「200部」とする以外は、実施例1と同様にして含水率20重量%の比較用の細胞培養用基材(2’)を得た。得られた基材(2’)の貯蔵弾性率G‘は1×1011Paであった。なお、スピンコーターで成形する前にダマ状になってしまい、シート状に成形することができなかった。
<Comparative example 2>
Comparative cell culture substrate (2') having a water content of 20% by weight in the same manner as in Example 1 except that the amount of the cross-linking agent (B) added was "200 parts" instead of "100 parts". Got The storage elastic modulus G'of the obtained substrate (2') was 1 × 10 11 Pa. In addition, it became a lump shape before being molded by the spin coater, and could not be molded into a sheet shape.
<比較例3>
細胞培養用96ウェルプレート(Nunc社製)を比較用の細胞培養用基材(3’)として用いた。
<Comparative example 3>
A 96-well plate for cell culture (manufactured by Nunc) was used as a base material for cell culture (3') for comparison.
<比較例4>
撹拌装置を備えた容器に、水800部を入れ、アルギン酸(和光純薬工業(株)製、「アルギン酸ナトリウム300〜400」)を2.4部、撹拌(800rpm)しながらダマにならないように徐々に添加し、アルギン酸溶解液を得た。得られた溶液を直径70mmの円形ガラス板上スピンコーター(株式会社 井元製作所製、「スピンコーター7094」)を用いて塗布し、1M塩化カルシウム溶液へ3時間浸漬させアルギン酸を架橋した。1M塩化カルシウム溶液から取り出し、100℃の乾燥機で1時間乾燥し、含水率20重量%のシート状(直径70mm、厚み0.1mm)の細胞培養用基材(4’)を得た。得られた基材(4’)の貯蔵弾性率G‘は900Paであった。
<Comparative example 4>
Put 800 parts of water in a container equipped with a stirrer, and add 2.4 parts of alginic acid ("Sodium alginate 300-400" manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) while stirring (800 rpm) so as not to get lumpy. Gradually added to obtain an alginic acid solution. The obtained solution was applied using a spin coater on a circular glass plate having a diameter of 70 mm (“Spin Coater 7094” manufactured by Imoto Seisakusho Co., Ltd.) and immersed in a 1 M calcium chloride solution for 3 hours to crosslink alginic acid. It was taken out from a 1M calcium chloride solution and dried in a dryer at 100 ° C. for 1 hour to obtain a sheet-shaped (diameter 70 mm, thickness 0.1 mm) cell culture substrate (4') having a water content of 20% by weight. The storage elastic modulus G'of the obtained substrate (4') was 900 Pa.
<比較例5>
特開2001−321157の記載に準じてセルロースフィルム(Whatman社製、「純セルロースペーパー」)にフィブロネクチン(和光純薬工業(株)製、「Fibronectin Solution, from Human Plasma」)を修飾し、比較用の細胞培養用基材(5’)を得た。
<Comparative example 5>
Fibronectin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., "Fibronectin Solution, from Human Plasma") is modified on a cellulose film (manufactured by Whatman, "pure cellulose paper") according to the description of JP-A-2001-321157 for comparison. Cell culture substrate (5') was obtained.
<細胞培養用基材の物性評価>
貯蔵弾性率G’:JIS K7244−10「プラスチック―動的機械特性の試験方法―第10部:平行平板振動レオメータによる複素せん断粘度」に準じて、粘弾性測定装置[機器名「ARES−24A」、レオメトリック(株)製]を用いて、37℃での貯蔵弾性率を測定した。
水(37℃)に対する接触角:JIS R3257に準拠して測定した。
表面粗さ(Ra):市販のカンチレバー及び原子間力顕微鏡[機器名「E−sweep」、エスアイアイ・ナノテクノロジー(株)製]を用いて表面粗さを測定した。測定範囲を4μmとして、一定速度(0.3Hzから1.2Hz)で走査させ、高さ像(立体像)を計測した。JIS B0601に定義された方法に準じて、計測結果より表面粗さ(Ra)を算出した。
<Evaluation of physical properties of cell culture substrate>
Storage elastic modulus G': According to JIS K7244-10 "Plastic-Test method for dynamic mechanical properties-Part 10: Complex shear viscosity by parallel plate vibration rheometer", Viscoelasticity measuring device [Equipment name "ARES-24A" , Rheometric Co., Ltd.] was used to measure the storage elastic modulus at 37 ° C.
Contact angle with water (37 ° C.): Measured according to JIS R3257.
Surface Roughness (Ra): Surface roughness was measured using a commercially available cantilever and an atomic force microscope [equipment name "E-sweep", manufactured by SII Nanotechnology Co., Ltd.]. The height image (three-dimensional image) was measured by scanning at a constant speed (0.3 Hz to 1.2 Hz) with the measurement range set to 4 μm. The surface roughness (Ra) was calculated from the measurement results according to the method defined in JIS B0601.
<細胞毒性の評価:細胞生存率>
細胞培養用基材(1)〜(6)及び(1’)〜(5’)に3×105個/cm2でVERO細胞を播種し、DMEM培地(10重量%FBSを含有)中で37℃、5体積%CO2、湿潤条件(湿度100%RH)で培養した。24時間後、DMEM培地を除去し、分解剤(E)としてセルラーゼ(エンドラーゼ 5000L、ノボザイムズ社製)100倍希釈液を0.1ml添加し2時間、37℃、5体積%CO2、湿潤条件(湿度100%RH)で培養した。2時間後、培養液に生細胞数測定試薬SF(ナカライテスク(株)製)を10μl/100μlとDMEM培地(10重量%FBSを含有)を100μl添加し、1時間後450nm(参照波長600nm)を測定した。細胞生存率は分解剤(E)未添加のもの(ブランク)を細胞生存率100%として算出した。
また、比較例3の細胞培養基材(3)においては、「セルラーゼを0.1ml」に代えて「トリプシン/EDTA(Trypsin/EDTA Solution、Thermo製)を0.1ml」用いる以外は同様にして細胞生存率を評価した。
細胞生存率(%)=[サンプルの吸光度−ブランクの吸光度]/[未添加の吸光度−ブランクの吸光度]×100
<Evaluation of cytotoxicity: Cell viability>
VERO cells were seeded at 3 × 10 5 cells / cm 2 on cell culture substrates (1) to (6) and (1') to (5') in DMEM medium (containing 10 wt% FBS). The cells were cultured at 37 ° C., 5% by volume CO 2 , and under wet conditions (humidity 100% RH). After 24 hours, the DMEM medium was removed, 0.1 ml of a 100-fold diluted solution of cellulase (Endolase 5000 L, manufactured by Novozymes) was added as a degrading agent (E) for 2 hours at 37 ° C., 5% by volume CO 2 , and wet conditions (wet conditions). It was cultured in 100% humidity RH). After 2 hours, 10 μl / 100 μl of the viable cell count reagent SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) and 100 μl of DMEM medium (containing 10 wt% FBS) were added to the culture medium, and after 1 hour, 450 nm (reference wavelength 600 nm). Was measured. The cell viability was calculated assuming that the cell viability was 100% when the degrading agent (E) was not added (blank).
Further, in the cell culture substrate (3) of Comparative Example 3, the same procedure was applied except that "0.1 ml of trypsin / EDTA Solution (manufactured by Thermo)" was used instead of "0.1 ml of cellulase". Cell viability was evaluated.
Cell viability (%) = [sample absorbance-blank absorbance] / [unadded absorbance-blank absorbance] x 100
<細胞培養の評価:接着率>
細胞培養用基材(1)〜(6)及び(1’)〜(5’)に3×105個/cm2でVERO細胞を播種し、DMEM培地(10重量%FBSを含有)中で37℃、5体積%CO2、湿潤条件(湿度100%RH)で培養した。
2時間培養後、非接着の細胞をリン酸緩衝液(PBS)で洗浄して除去した。PBSを除去後、生細胞数測定試薬SF(ナカライテスク(株)製)を10μl/100μlとDMEM培地(10重量%FBSを含有)を100μlを添加し、1時間後450nm(参照波長600nm)を測定した。非接着細胞の除去処理を行わなかったものを100%として細胞接着率を算出した。
<Evaluation of cell culture: Adhesion rate>
VERO cells were seeded at 3 × 10 5 cells / cm 2 on cell culture substrates (1) to (6) and (1') to (5') in DMEM medium (containing 10 wt% FBS). The cells were cultured at 37 ° C., 5% by volume CO 2 , and under wet conditions (humidity 100% RH).
After culturing for 2 hours, non-adherent cells were washed with phosphate buffer (PBS) and removed. After removing PBS, 10 μl / 100 μl of the viable cell count reagent SF (manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) and 100 μl of DMEM medium (containing 10 wt% FBS) were added, and after 1 hour, 450 nm (reference wavelength 600 nm) was added. It was measured. The cell adhesion rate was calculated assuming that the non-adherent cells were not removed.
<細胞培養の評価:剥離時間>
細胞培養用基材(1)〜(6)及び(1’)〜(5’)に3×105個/cm2でVERO細胞を播種し、DMEM(10%FBS)中で37℃、5体積%CO2、湿潤条件(湿度100%RH)で培養した。
24時間後、細胞培養液に分解剤(E)としてセルラーゼ(エンドラーゼ 5000L、ノボザイムズ社製)100倍希釈液を添加し、経時的な細胞の剥離具合を確認し、細胞が完全に剥離した時間(分)を計測した。
<Evaluation of cell culture: peeling time>
VERO cells were seeded at 3 × 10 5 cells / cm 2 on cell culture substrates (1) to (6) and (1') to (5'), and were seeded in DMEM (10% FBS) at 37 ° C., 5 The cells were cultured under volume% CO 2 and wet conditions (humidity 100% RH).
After 24 hours, a 100-fold diluted solution of cellulase (Endolase 5000L, manufactured by Novozymes) was added to the cell culture medium as a degrading agent (E), and the degree of cell detachment over time was confirmed, and the time during which the cells were completely detached ( Minutes) was measured.
表1から、貯蔵弾性率G’が1000〜1×1010Paの範囲内である実施例1〜6の細胞培養用基材は、細胞培養に適した形状に成形しやすいことがわかる。一方、貯蔵弾性率G’が1011である比較例2の細胞培養用基材は、細胞培養に適した形状に成形できなかった。
また、実施例1〜6の細胞培養用基材は、細胞生存率及び細胞接着率が極めて高く、分解剤により分解されやすく、細胞の剥離時間が短いことから、細胞培養に極めて適していることがわかる。特に、実施例4〜6の細胞培養用基材の結果から、細胞接着因子を含有することで、細胞接着率を向上させることができることがわかる。一方、比較例1(架橋していないもの)及び4(金属架橋であるもの)の細胞培養用基材では、細胞生存率及び分解性は高いものの、細胞接着性が低く、細胞培養に適していないことがわかる。また、比較例3の細胞剥離にタンパク質分解酵素を使用する必要がある細胞培養用基材では、細胞毒性が高く、細胞生存率が低いことがわかる。また、比較例5(セルロース)の細胞培養用基材は、貯蔵弾性率が5×1010と高すぎるため、分解剤により分解されにくく、細胞を剥離するのに長時間かかることがわかる。
From Table 1, it can be seen that the cell culture substrates of Examples 1 to 6 having a storage elastic modulus G'in the range of 1000 to 1 × 10 10 Pa are easily formed into a shape suitable for cell culture. On the other hand, the cell culture substrate of Comparative Example 2 having a storage elastic modulus G'of 10 11 could not be formed into a shape suitable for cell culture.
Further, the cell culture substrates of Examples 1 to 6 are extremely suitable for cell culture because they have extremely high cell viability and cell adhesion rate, are easily decomposed by a degrading agent, and have a short cell detachment time. I understand. In particular, from the results of the cell culture substrates of Examples 4 to 6, it can be seen that the cell adhesion rate can be improved by containing the cell adhesion factor. On the other hand, the cell culture substrates of Comparative Examples 1 (non-crosslinked) and 4 (metal crosslinked) have high cell viability and degradability, but low cell adhesion and are suitable for cell culture. It turns out that there is no such thing. Further, it can be seen that the cell culture substrate, which requires the use of a proteolytic enzyme for cell detachment in Comparative Example 3, has high cytotoxicity and low cell viability. Further, it can be seen that the cell culture substrate of Comparative Example 5 (cellulose) has a storage elastic modulus of 5 × 10 10, which is too high, so that it is difficult to be decomposed by a decomposing agent, and it takes a long time to detach the cells.
本発明の細胞培養用基材は、優れた細胞生存率及び細胞接着性を発揮し、短時間で細胞を剥離することがでるので、細胞が関係する、研究開発、有用物質生産及び治療等に極めて有用である。
研究開発用としては、分化機能等の細胞機能評価用細胞の培養、動物実験(毒性試験、刺激性試験及び代謝機能試験等)の代替用細胞の培養、遺伝子や蛋白質導入用細胞の培養等に利用できる。
有用物質生産用としては、サイトカイン、血栓溶解剤、血液凝固因子製剤、ワクチン、ホルモン、抗生物質、抗体及び増殖因子等の生産用細胞の培養に利用できる。これらのうち、ワクチンの生産用細胞の培養に好適である。
治療用としては、皮膚、頭蓋骨、筋肉、皮膚組織、骨、軟骨、血管、神経、腱、靭帯、毛胞組織、粘膜組織、歯周組織、象牙質、骨髄、網膜、漿膜、胃腸管及び脂肪等の組織、並びに肺、肝、膵及び腎等の臓器の細胞培養に利用できる。
The cell culture substrate of the present invention exhibits excellent cell viability and cell adhesion, and can detach cells in a short time, so that it can be used for research and development, production of useful substances, treatment, etc. related to cells. Extremely useful.
For research and development, for culturing cells for evaluating cell function such as differentiation function, culturing alternative cells for animal experiments (toxicity test, stimulus test, metabolic function test, etc.), culturing cells for introducing genes and proteins, etc. Available.
For production of useful substances, it can be used for culturing cells for production of cytokines, thrombolytic agents, blood coagulation factor preparations, vaccines, hormones, antibiotics, antibodies, growth factors and the like. Of these, it is suitable for culturing cells for vaccine production.
For treatment, skin, skull, muscle, skin tissue, bone, cartilage, blood vessel, nerve, tendon, ligament, follicular tissue, mucosal tissue, periodontal tissue, dentin, bone marrow, retina, serosa, gastrointestinal tract and fat It can be used for cell culture of tissues such as lung, liver, pancreas and kidney.
Claims (9)
細胞培養用基材が、多糖類(A)の架橋剤(B)による架橋物(C)を含有し、
架橋剤(B)が活性水素基と反応し得る官能基(b)を少なくとも2個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の37℃における貯蔵弾性率G’が1000〜1×10 10 Paであり、
細胞の生産方法が、細胞培養用基材上で細胞(X)を培養後、分解剤(E)により細胞培養用基材を分解する工程を含み、
分解剤(E)が多糖類分解酵素(E1)である細胞の生産方法。 A cell process for the production of culturing cells (X) using the cell culture substrate for
The cell culture substrate contains the crosslinked product (C) of the polysaccharide (A) with the crosslinking agent (B).
The cross-linking agent (B) is an organic compound having at least two functional groups (b) capable of reacting with an active hydrogen group, and the storage elastic modulus G'at 37 ° C. of the cell culture substrate is 1000 to 1 × 10 10 Pa. And
The method for producing cells includes a step of culturing cells (X) on a cell culture substrate and then degrading the cell culture substrate with a degrading agent (E).
A method for producing cells in which the degrading agent (E) is a polysaccharide-degrading enzyme (E1).
最小アミノ酸配列(X):RGD配列、LDV配列、REDV配列(1)、YIGSR配列(2)、PDSGR配列(3)、RYVVLPR配列(4)、LGTIPG配列(5)、RNIAEIIKDI配列(6)、IKVAV配列(7)、LRE配列、DGEA配列(8)、GVKGDKGNPGWPGAP配列(9)、GEFYFDLRLKGDK配列(10)、HAV配列及びYKLNVNDS配列(11)からなる群より選ばれる少なくとも1種。Minimum amino acid sequence (X): RGD sequence, LDV sequence, REDV sequence (1), YIGSR sequence (2), PDSGR sequence (3), RYVVLPR sequence (4), LGTIPG sequence (5), RNIAEI IKDI sequence (6), IKEVAV At least one selected from the group consisting of sequence (7), LRE sequence, DGEA sequence (8), GVKGDKGNPGWPGAP sequence (9), GEFYFDLRLKGDK sequence (10), HAV sequence and YKLNVNDS sequence (11).
細胞培養用基材が、多糖類(A)の架橋剤(B)による架橋物(C)を含有し、
架橋剤(B)が活性水素基と反応し得る官能基(b)を少なくとも2個有する有機化合物であり、細胞培養用基材の37℃における貯蔵弾性率G’が1000〜1×10 10 Paであり、
分解剤(E)が多糖類分解酵素(E1)である細胞培養用キット。
A kit for cell culture comprising cell culture base material and decomposition agent (E),
The cell culture substrate contains the crosslinked product (C) of the polysaccharide (A) with the crosslinking agent (B).
The cross-linking agent (B) is an organic compound having at least two functional groups (b) capable of reacting with an active hydrogen group, and the storage elastic modulus G'at 37 ° C. of the cell culture substrate is 1000 to 1 × 10 10 Pa. And
A cell culture kit in which the degrading agent (E) is a polysaccharide-degrading enzyme (E1).
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