JP6900217B2 - Method for preparing cultured cell specimens - Google Patents
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Description
本発明は、培養細胞供試体の作製方法に関する。さらに詳述すると、本発明は、例えば平坦な培養基質の表面において任意の平面的なパターンで生体細胞や組織が培養されている供試体の作製に用いて好適な技術に関する。 The present invention relates to a method for producing a cultured cell specimen. More specifically, the present invention relates to techniques suitable for use, for example, in the preparation of specimens in which living cells and tissues are cultured in an arbitrary planar pattern on the surface of a flat culture substrate.
細胞を培養する技術の進歩に伴い、例えば動物の組織や臓器などの細胞が生体外で培養され(例えば、特許文献1)、培養された細胞が種々の試験,研究,検査,計測などに用いられている。 With the progress of cell culturing technology, for example, cells such as animal tissues and organs are cultured in vitro (for example, Patent Document 1), and the cultured cells are used for various tests, studies, tests, measurements, etc. Has been done.
培養された細胞が用いられて行われる試験や計測などの種類・内容によっては、平坦な培養基質の表面に所定のパターン(言い換えると、形状は配列・配向の態様)に従って細胞が培養されていることが望ましかったり必要とされたりする場合がある。 Depending on the type and content of tests and measurements performed using cultured cells, cells are cultured on the surface of a flat culture substrate according to a predetermined pattern (in other words, the shape is an arrangement / orientation mode). May be desired or needed.
生体細胞や組織の培養では、機能的に分化・成熟するために必要となる長期培養(具体的には、数週間乃至数ヶ月程度)において生体細胞や組織を培養環境下に制御することが必要されるものの、細胞増殖や形態変化、細胞分化などを原因として、特に長期培養においては特定の空間に配列された細胞や組織の形状を維持することができないという問題がある。 In the culture of living cells and tissues, it is necessary to control the living cells and tissues in a culture environment in the long-term culture (specifically, about several weeks to several months) required for functional differentiation and maturation. However, due to cell proliferation, morphological changes, cell differentiation, etc., there is a problem that the shape of cells and tissues arranged in a specific space cannot be maintained, especially in long-term culture.
例えば生物検定において、図13に示すように、一つに纏まった細胞集団を用いて実験を行うと、化学物質等の環境因子の閾値が、細胞同士の接合に起因する細胞間の相互作用によって本来の閾値よりも低く見積もられてしまうことがあるという問題がある。 For example, in a biological test, as shown in FIG. 13, when an experiment is performed using a group of cells, the threshold value of environmental factors such as chemical substances is determined by the interaction between cells due to the conjugation between cells. There is a problem that it may be underestimated below the original threshold.
また、培養された細胞や組織が用いられて各種計測等が行われる際には、培養基質上に物理的構造があると、計測等の邪魔になったり計測におけるノイズになって計測等の結果に影響を及ぼしたりしてしまうという問題がある。 In addition, when various measurements are performed using cultured cells and tissues, if there is a physical structure on the culture substrate, it may interfere with the measurement or become noise in the measurement, resulting in the measurement. There is a problem that it affects the culture medium.
そこで、本発明は、各種計測等の支障になる物理的構造を有さず且つ所望のパターンで配列・配向された成熟細胞や組織が培養されている供試体を作製することができる培養細胞供試体の作製方法を提供することを目的とする。具体的には例えば、図14に示すように、細胞を所定のパターンに配列・配向することにより、細胞間の相互作用を排除して化学物質等の環境因子の閾値が本来の閾値通りに正しく把握されるようにすることができる培養細胞供試体の作製方法を提供することを目的とする。 Therefore, the present invention provides a cultured cell that does not have a physical structure that interferes with various measurements and can produce a specimen in which mature cells and tissues arranged and oriented in a desired pattern are cultured. It is an object of the present invention to provide a method for producing a specimen. Specifically, for example, as shown in FIG. 14, by arranging and orienting cells in a predetermined pattern, interaction between cells is eliminated and the threshold value of environmental factors such as chemical substances is correctly set according to the original threshold value. It is an object of the present invention to provide a method for producing a cultured cell specimen that can be grasped.
かかる目的を達成するため、本発明の培養細胞供試体の作製方法は、培養容器の底面に細胞非接着基質の領域が形成され、細胞培養スポットが形成されている鋳型が細胞非接着基質の領域に設置されると共に鋳型の細胞培養スポット内のそれぞれの底部に該当する前記細胞非接着基質の領域の上面に細胞接着基質の領域が形成され、その上で培養容器へと培地並びに細胞と組織とのうちの少なくとも一方が投入されて細胞培養スポット内の細胞接着基質の領域に接着して培養が行われ、細胞や組織の培養が行われた後に鋳型が培養容器の外に取り外されることによって細胞接着基質の上に培養された細胞または組織の集団が残され鋳型の細胞培養スポットの配列パターンに従った集団それぞれの形状及び配列が維持された供試体が作成されるようにしている。 In order to achieve such an object, in the method for producing a cultured cell specimen of the present invention, a region of a cell non-adhesive substrate is formed on the bottom surface of a culture vessel, and a template in which a cell culture spot is formed is a region of the cell non-adhesive substrate. A region of the cell adhesion substrate is formed on the upper surface of the region of the cell non-adhesion substrate corresponding to the bottom of each of the cell culture spots of the template, and then the medium and cells and tissues are placed in the culture vessel. At least one of the cells is charged and adhered to the area of the cell adhesion substrate in the cell culture spot for culturing, and after the cells and tissues are cultivated, the template is removed from the culture vessel to remove the cells. A population of cells or tissues cultured on the adhesion substrate is left, and a specimen is prepared in which the shape and arrangement of each population is maintained according to the sequence pattern of the cell culture spot of the template .
したがって、この培養細胞供試体の作製方法によると、生体細胞や組織の培養の初期段階においては物理的構造(即ち、鋳型)が利用されて細胞非接着基質の領域への細胞侵入と接着分子等の汚染とを防止した状態で長期培養が行われ、その後、物理的構造(鋳型)が取り外された後においても細胞非接着基質の効果により、物理的構造(鋳型)に従う細胞・組織の集団の形状が維持されると共に各集団の配列・配向の態様が維持される。 Therefore, according to this method for producing a cultured cell specimen, a physical structure (that is, a template) is utilized in the initial stage of culturing a living cell or tissue to invade a region of a cell non-adhesive substrate and an adherent molecule or the like. Long-term culture is performed in a state where the cells are contaminated, and even after the physical structure (template) is removed, due to the effect of the cell non-adhesive substrate, the population of cells / tissues that follow the physical structure (template) The shape is maintained and the arrangement and orientation of each group is maintained.
また、本発明の培養細胞供試体の作製方法は、磁性を有する材料が添加された鋳型が用いられるようにしても良い。この場合には、鋳型が、外部力である磁力を利用して引き上げられるので、傾動したり揺動したりすること無く真っ直ぐ上に引き上げられて取り外される。この場合には、また、細胞非接着基質と鋳型との密着性が十分には期待できない場合であっても、磁性を有する鋳型を培養容器下方から磁力を利用して吸引することにより、細胞非接着基質と鋳型とを良好に密着させて固定して鋳型の配置を長期にわたって維持することができる。 Further, in the method for producing a cultured cell specimen of the present invention, a template to which a magnetic material is added may be used. In this case, since the mold is pulled up by using the magnetic force which is an external force, it is pulled up straight up and removed without tilting or swinging. In this case, even if the adhesion between the non-cell adhesive substrate and the template cannot be expected sufficiently, the magnetic template is attracted from below the culture vessel by using magnetic force to cause non-cell cells. The adhesive substrate and the mold can be well adhered and fixed to maintain the placement of the mold for a long period of time.
また、本発明の培養細胞供試体の作製方法は、細胞非接着基質の領域を形成する物質として温度応答性高分子が添加された物質が用いられ、加熱されることによって細胞接着基質の領域が細胞非接着基質から剥離するようにしても良い。この場合には、細胞非接着基質のうちの細胞接着基質の領域(言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲)が加熱されることによって各細胞接着基質の領域が個別に細胞非接着基質から剥離する。 Further, in the method for producing a cultured cell specimen of the present invention, a substance to which a temperature-responsive polymer is added is used as a substance forming a region of a cell non-adhesive substrate, and the region of the cell adhesion substrate is formed by heating. It may be detached from the cell non-adhesive substrate. In this case, the region of the cell adhesion substrate (in other words, the range in which the cell adhesion substrate is formed) of the cell non-adhesion matrix is heated so that the region of each cell adhesion substrate is individually divided into the cell non-adhesion substrates. Peel off from.
また、本発明の培養細胞供試体の作製方法は、細胞接着基質の領域を形成する物質として温度が変化することによって細胞や組織の接着性を有する性質(言い換えると、細胞接着基質として機能する材質)から細胞や組織の接着性を有しない性質(言い換えると、細胞非接着基質として機能する材質)へと変質する物質が用いられ、加熱若しくは冷却されることによって細胞接着基質の領域から細胞や組織が分離して回収されるようにしても良い。この場合には、細胞接着基質の領域(言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲)が加熱若しくは冷却されることによって各細胞群や各組織群が個別に細胞接着基質から分離して回収される。 In addition, the method for producing a cultured cell specimen of the present invention has the property of having cell or tissue adhesion as a substance forming a region of a cell adhesion substrate (in other words, a material that functions as a cell adhesion substrate). ) To non-adhesive properties of cells and tissues (in other words, materials that function as cell non-adhesive substrates), and cells and tissues from the area of cell adhesion substrates when heated or cooled. May be separated and collected. In this case, each cell group or each tissue group is individually separated from the cell adhesion substrate and recovered by heating or cooling the region of the cell adhesion substrate (in other words, the range where the cell adhesion substrate is formed). Will be done.
本発明の培養細胞供試体の作製方法によれば、生体細胞や組織の培養の初期段階においては物理的構造(即ち、鋳型)が利用されて細胞非接着基質の領域への細胞侵入と接着分子等の汚染とを防止した状態で長期培養を行うことができると共に、物理的構造(鋳型)が取り外された後においても細胞非接着基質の効果により、物理的構造(鋳型)に従う細胞・組織の集団の形状を維持することができると共に各集団の配列・配向の態様を維持することができるので、任意の形状や配列・配向の態様(言い換えると、平面的パターン)で成熟した生体細胞や組織が培養されている供試体を作製することが可能になる。 According to the method for producing a cultured cell specimen of the present invention, a physical structure (that is, a template) is utilized in the initial stage of culturing a living cell or tissue to invade a region of a cell non-adhesive substrate and an adherent molecule. It is possible to carry out long-term culture in a state where contamination such as is prevented, and even after the physical structure (template) is removed, due to the effect of the cell non-adhesive substrate, the cells / tissues that follow the physical structure (template) Since the shape of the population can be maintained and the arrangement / orientation of each population can be maintained, mature living cells and tissues in any shape and arrangement / orientation (in other words, a planar pattern) can be maintained. It becomes possible to prepare a specimen in which the cells are cultured.
本発明の培養細胞供試体の作製方法は、磁性を有する材料が添加された鋳型が用いられるようにした場合には、傾動させたり揺動させたりすること無く真っ直ぐ上に引き上げて鋳型を取り外すことができるので、鋳型の取り外し操作における細胞や組織への影響・ダメージを回避することが可能になる。この場合には、また、鋳型を培養容器下方から磁力を利用して吸引することによって細胞非接着基質と鋳型とを良好に密着させて固定して鋳型の配置を長期にわたって維持することができるので、細胞非接着基質の領域への細胞侵入と接着分子等の汚染とを一層確実に防止することが可能になる。 In the method for producing a cultured cell specimen of the present invention, when a mold to which a magnetic material is added is used, the mold is removed by pulling it straight up without tilting or rocking. Therefore, it is possible to avoid the influence / damage on cells and tissues in the operation of removing the mold. In this case, also, by attracting the template from below the culture vessel using magnetic force, the cell non-adhesive substrate and the template can be well adhered and fixed, and the arrangement of the template can be maintained for a long period of time. , It becomes possible to more reliably prevent cell invasion into the region of the cell non-adhesive substrate and contamination of adhesion molecules and the like.
本発明の培養細胞供試体の作製方法は、温度応答性高分子が添加された細胞非接着基質が用いられようにした場合には、細胞非接着基質のうちの細胞接着基質の領域(言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲)を加熱することによって各細胞接着基質の領域を個別に細胞非接着基質から剥離させることができるので、同一条件の環境で培養された複数の細胞・組織の集団を個別に容易に取り分けて回収し、個々の細胞・組織集団毎に分析・評価を行うことが可能になる。 In the method for producing a cultured cell specimen of the present invention, when a cell non-adhesive substrate to which a temperature-responsive polymer is added is used, the region of the cell adhesion substrate among the cell non-adhesive substrates (in other words, in other words). By heating (the range where the cell adhesion matrix is formed), the region of each cell adhesion substrate can be individually detached from the cell non-adhesion substrate, so that a plurality of cells / tissues cultured in the same environment can be used. It becomes possible to easily separate and collect individual populations and analyze and evaluate each individual cell / tissue population.
本発明の培養細胞供試体の作製方法は、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性へと変質する細胞接着基質が用いられるようにした場合には、細胞接着基質の領域(言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲)を加熱若しくは冷却することによって各細胞群や各組織群を個別に細胞接着基質から分離させることができるので、同一条件の環境で培養された複数の細胞・組織の集団を個別に容易に取り分けて回収し、個々の細胞・組織集団毎に分析・評価を行うことが可能になる。 In the method for producing a cultured cell specimen of the present invention, when a cell adhesion substrate that changes from cell adhesion to cell non-adhesion due to a temperature change is used, the region of the cell adhesion substrate (in other words, cells) Since each cell group and each tissue group can be individually separated from the cell adhesion substrate by heating or cooling (the range in which the adhesion substrate is formed), a plurality of cells / tissues cultured in the same environment. It becomes possible to easily separate and collect individual populations and analyze and evaluate each individual cell / tissue population.
以下、本発明の構成を図面に示す実施の形態の一例に基づいて詳細に説明する。 Hereinafter, the configuration of the present invention will be described in detail based on an example of an embodiment shown in the drawings.
図1乃至図8に、本発明の培養細胞供試体の作製方法の実施形態の一例を示す。 1 to 8 show an example of an embodiment of the method for producing a cultured cell specimen of the present invention.
本実施形態の培養細胞供試体の作製方法は、培養容器1内に細胞非接着基質の領域2が形成され(S1)、細胞培養スポット3aが形成されている鋳型3が細胞非接着基質の領域2に設置される(S2)と共に鋳型3の細胞培養スポット3a内に細胞接着基質の領域4が形成され(S3)、その上で培養容器1へと培地5並びに細胞6と組織6とのうちの少なくとも一方が投入され(S4)、細胞6や組織6の培養が行われた(S6)後に鋳型3が取り外される(S7)ようにしている(図1参照)。
In the method for producing a cultured cell specimen of the present embodiment, the
培養容器1(シャーレとも呼ばれる)の大きさは、当該培養容器1と組み合わされて用いられる鋳型3の大きさや当該培養容器1内に投入されて培養される細胞・組織6の量が考慮されるなどした上で、長期培養を可能にする量の培地5(言い換えると、長期培養の間において培地5の交換が不要な量の培地5)が収容可能な容積が少なくとも確保され得るように設定される。なお、培養容器1の深さは、当該培養容器1内に鋳型3が設置されると共に培地5が投入された細胞・組織培養状態において鋳型3が培地5中に没入する寸法以上に設定される。
The size of the culture vessel 1 (also called a petri dish) takes into consideration the size of the
培養細胞供試体の作製方法の実施にあたっては、まず、培養容器1内に細胞非接着基質の領域2が形成される(S1;図2)。
In carrying out the method for producing a cultured cell specimen, first, a
細胞非接着基質の領域2は、生体細胞や組織の接着性を有しない基質によって形成される領域であり、したがって生体細胞の増殖や分化などが誘導されない基質の領域である。
The
細胞非接着基質として用いられる物質は、特定の物質に限定されるものではなく、細胞や組織の接着が抑制される物質や所定の物質に所定の処理が施されたものが適宜選択される。細胞非接着基質としては、具体的には例えば、あくまで一例として挙げると、アガロースゲル,ウシ血清アルブミン(BSA),2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー,ポリエチレングリコール,有機フッ素化合物,及びこれらを末端とするシランカップリング剤などが用いられ得る。 The substance used as the cell non-adhesive substrate is not limited to a specific substance, and a substance that suppresses the adhesion of cells or tissues or a substance that has been subjected to a predetermined treatment is appropriately selected. Specific examples of the cell non-adhesive substrate include agarose gel, bovine serum albumin (BSA), 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer, polyethylene glycol, organic fluorine compound, and these terminals. A silane coupling agent or the like can be used.
細胞非接着基質の領域2は、具体的には例えば、当該領域2の形成にアガロースゲルが用いられる場合には、例えば1〜2%程度に調製されたアガロース溶液を培養容器1に滴下した後に例えば1時間程度風乾することによって形成される。なお、アガロースのタイプは、特定のものに限定されるものではないものの、L(低融点タイプ)やS(スタンダードタイプ)が好ましい。
Specifically, for the
細胞非接着基質の領域2は、或いは、具体的には例えば、当該領域2の形成にウシ血清アルブミン(BSA)が用いられる場合には、例えば0.1〜1%程度に調製されたBSA溶液を培養容器1に滴下し培養容器1をパラフィンフィルムで密封した後に室温で12時間以上インキュベートすることによって形成される。
細胞非接着基質の領域2は、少なくとも鋳型3が設置される部分(言い換えると、範囲)に平坦な皮膜(言い換えると、層)として形成され、培養容器1の底部の全面に亙って平坦な皮膜(層)として形成されることが好ましい。
なお、培養容器1の底部に当該培養容器1とは別体のガラス板(図示していない)が載置され、当該ガラス板の上面に細胞非接着基質の領域2が例えば膜や層として形成されるようにしても良い。
A glass plate (not shown) separate from the culture container 1 is placed on the bottom of the culture container 1, and a
次に、細胞非接着基質の領域2の表面に鋳型3が設置される(S2;図2)。
Next, the
鋳型3は、基質上における細胞・組織6の接着パターンを形成する(言い換えると、特定する、或いは、誘導する)ための部材であり、培養容器1の底部に形成された細胞非接着基質の領域2の上面に接触する下面と上面とがそれぞれ開口している穴3a(即ち、貫通孔)が細胞培養スポットとして板状の部材に形成されたものとして構成される。
The
鋳型3の材質は、特定の種類に限定されるものではなく、例えば培養容器1に投入される培地5によっては変質し得ないことが考慮されるなどした上で、適当なものが適宜選択される。鋳型3の材質としては、具体的には例えば、あくまで一例として挙げると、シリコン樹脂,ポリジメチルシロキサン(Polydimethylsiloxane:「PDMS」とも表記される),アクリル樹脂,ガラス,パリレン,アガロース等のハイドロゲルなどが用いられ得る。
The material of the
鋳型3を形成する材料に磁性を有する材料が添加されるようにしても良い。この場合には、後述するS7の処理において、外部力である磁力を利用して鋳型3が取り外されるようになり、鋳型3を傾動させたり揺動させたりすること無く真っ直ぐ上に引き上げて取り外すことができるので、鋳型3の取り外し操作における細胞・組織6への影響・ダメージを回避することが可能になる。この場合には、また、細胞非接着基質と鋳型3との密着性が十分には期待できない場合であっても、磁性を有する鋳型3を培養容器1の下方から磁力を利用して吸引することにより、細胞非接着基質への鋳型3の吸着力を増強して細胞非接着基質と鋳型3とを良好に密着させて固定して鋳型3の配置を長期にわたって維持することができるので、細胞非接着基質の領域2への細胞侵入と接着分子等の汚染とを一層確実に防止することが可能になる。
A magnetic material may be added to the material forming the
鋳型3を形成する材料へと添加される磁性を有する材料は、特定の種類に限定されるものではなく、例えば細胞・組織6の増殖・分化に与える影響が考慮されるなどした上で、適当なものが適宜選択される。添加される磁性を有する材料としては、例えば、種々の磁性粒子が選択され得る。
The magnetic material added to the material forming the
鋳型3は、特定の大きさや形状に限定されるものではないものの、鋳型3を配置することになる細胞培養容器として一般には円形のものが普及していることを考慮すると、例えば、直径が5〜10 cm 程度の円盤状のものが適合し易いと考えられる。
Although the
細胞培養スポットとして鋳型3に形成される穴3a(貫通孔)は、特定の大きさや形状に限定されるものではなく、例えば、各種計測等の内容に応じて供試体毎に要求される培養細胞・組織の集団としての所望の形状に合わせた大きさや形状に形成される。
The
細胞培養スポットとしての穴3aは、具体的には例えば、最小寸法(内側差渡し)が0.01〜2 mm 程度且つ最大寸法(内側差渡し)が2〜3 mm 程度の貫通する空隙/穴隙として形成されることが考えられる。なお、一つの鋳型3に、細胞培養スポットとして、穴3aが一つのみ形成されるようにしても良く、また、複数の穴3aが形成されるようにしても良い。
Specifically, the
細胞培養スポットとして鋳型3に形成される穴3a(貫通孔)の配列・配向の態様は、特定のパターンに限定されるものではなく、例えば、各種計測等の内容に応じて供試体毎に要求される培養細胞や組織の集団についての所望の配列・配向に合わせた態様に設定される。
The mode of arrangement / orientation of the
細胞培養スポットとしての穴3a(貫通孔)の配列・配向の態様は、具体的には例えば、環境因子ばく露試験の一例としての、時間変動する一様磁界の印加試験に使用される供試体を作製するために図3に示すように同心円状に設定されることが考えられる。
The mode of arrangement / orientation of the
図3に示す鋳型3が設置されて培養されることによって鋳型3の細胞培養スポットとしての穴3aのパターンに従って同心円状の複数の細胞・組織6の集団が配列・配向された供試体が作製され、当該供試体に対して図4に示すように時間変動する一様磁界を印加して試験を行うことが考えられる。
By installing and culturing the
図4に示すように培養容器1(供試体)の上面から垂直方向に一様な時間変動する磁界を入射する方法では、培地5内に誘導される電流密度が以下の数式1に従うため、培養容器1の中心部(即ち、r=0)から径方向距離に比例する、同心円状の誘導電流強度分布が形成される。なお、図3において、破線(符号9)は誘導電流強度分布を表し、誘導電流強度は外側ほど強くなる。
(数式1) J=σπfBr
ここに、J:誘導電流密度[A/m2],σ:培地導電率[S/m],π:円周率,f:周波数[Hz],B:磁束密度[T],r:半径[m]をそれぞれ表す。
As shown in FIG. 4, in the method of injecting a magnetic field that fluctuates in a uniform time in the vertical direction from the upper surface of the culture vessel 1 (specimen), the current density induced in the
(Formula 1) J = σπfBr
Here, J: induced current density [A / m 2 ], σ: medium conductivity [S / m], π: pi, f: frequency [Hz], B: magnetic flux density [T], r: radius. Represents [m] respectively.
図3に示す鋳型3を用いた細胞培養によって作製された、同心円状の複数の細胞・組織6の集団が配列・配向された供試体への図4に示すような時間変動する一様磁界の印加により、細胞・組織6の集団に印加される誘導電流強度のばらつきを低減する(尚、穴3aの大きさが小さいほど誘導電流強度のばらつきが小さくなる)と共に異なる誘導電界強度に対する細胞応答を同時に評価することができ、刺激方向や強度の差違と細胞への影響の差違との間の関係の分析が効率的に容易に且つ適切に行われるようになる。また、鋳型3に形成された細胞培養スポットとしての穴3aのそれぞれに単一種の細胞を播種するか或いは複数種の細胞を播種するかにより、単一種の細胞での評価を行うことと複数種の細胞のネットワークでの評価を行うこととの両方ができるようになる。
A time-varying uniform magnetic field as shown in FIG. 4 to a specimen in which a plurality of concentric cell /
鋳型3の下面が細胞非接着基質の領域2の上面へと吸着した状態とされることが好ましい。具体的には例えば、鋳型3がポリジメチルシロキサン(PDMS)によって形成される場合には、鋳型3を細胞非接着基質の領域2へと接触させると、PDMSと細胞非接着基質とに作用する分子間力により、PDMSが吸着固定される。
It is preferable that the lower surface of the
なお、鋳型3の表面に、細胞や組織の接着性を有しない物質によって皮膜が形成されるようにしても良い。
A film may be formed on the surface of the
また、一つの培養容器1内に複数の鋳型3が設置されるようにしても良い。
Further, a plurality of
次に、鋳型3の細胞培養スポットとしての穴3a内に細胞接着基質の領域4が形成される(S3;図5)。
Next, a
細胞接着基質の領域4は、生体細胞や組織の接着性を有する基質の領域であり、したがって生体細胞の増殖や分化などが誘導される基質の領域である。
The
細胞接着基質として用いられる物質は、特定の物質に限定されるものではなく、例えば培養対象の細胞・組織6の種類やタイプが考慮されるなどした上で、細胞や組織の接着が誘導される物質や所定の物質に所定の処理が施されたものが適宜選択される。細胞接着基質としては、具体的には例えば、あくまで一例として挙げると、ラミニン,コラーゲン,フィブロネクチン,ポリエチレンイミン(PEI),ポリリジン,Puramatrix,抗体などが用いられ得る。
The substance used as the cell adhesion substrate is not limited to a specific substance, and the cell or tissue adhesion is induced after considering, for example, the type and type of the cell /
細胞接着基質の領域4は、具体的には例えば、当該領域4の形成にポリエチレンイミン(PEI)が用いられる場合には、例えば0.1%程度に調製されたPEI溶液を滴下して冷蔵(例えば4℃程度)にて一晩保存した後に滅菌水で洗浄(尚、毒性が強いため、4回以上洗浄することが好ましい)することによって形成される。
Specifically, for example, when polyethyleneimine (PEI) is used for forming the
細胞接着基質の領域4は、或いは、具体的には例えば、当該領域4の形成にポリ−L−リジン(PLL)が用いられる場合には、例えば0.1%程度に調製されたPLL溶液を滴下して冷蔵(例えば4℃程度)にて一晩保存した後に滅菌水で洗浄(例えば1回程度)することによって形成される。
細胞接着基質の領域4は、鋳型3が細胞非接着基質の領域2の上面に設置(言い換えると、吸着)された状態において当該鋳型3に細胞培養スポットとして形成されている穴3aそれぞれの底部に該当する細胞非接着基質の領域2の上面に平坦な皮膜(言い換えると、層)として形成される。
The cell
細胞接着基質の領域4は、穴3aの底部に該当する部分に於いて、細胞非接着基質の領域2の上面に積層するものとして形成されるようにしても良く、また、細胞非接着基質の領域2の少なくとも上面側部分(言い換えると、少なくとも表層部分)が改質されたり細胞非接着基質の領域2の少なくとも上面側部分と交換されたりすることによって形成されるようにしても良い。
The
ここで、細胞培養スポットとしての穴3a内に形成される細胞接着基質の領域4について、穴3a毎に種類が異なる細胞接着基質の領域4を形成した上で同一種類の細胞・組織6を播種して培養した後に環境因子にばく露することにより、異なる接着環境を有する細胞・組織6に対して同一条件の環境因子を印加することができる。これにより、細胞・組織6と細胞接着基質との間の接着様式(例えば、共有結合,抗原抗体反応,その他の結合反応など)や接着強度の差異に依存した応答の違いを観察することが可能になり、その上、評価実験の効率化を図ることができると共にサンプル間の誤差を低減させることが可能になる。
Here, regarding the
次に、培養容器1へと培地5及び細胞・組織6が投入される(S4;図6)。
Next, the
培地5(尚、液体培地や培養液とも呼ばれる)は、特定の種類に限定されるものではなく、例えば培養対象の細胞・組織6の種類・性質や流動性を有して鋳型3の穴3aへと進入し得ることが考慮されるなどした上で、適当なものが適宜選択される。
The medium 5 (also referred to as a liquid medium or a culture medium) is not limited to a specific type, and has, for example, the type, properties, and fluidity of the cells /
培地5は、細胞・組織6を機能的に成熟させるために必要とされる培養期間が考慮されるなどした上で、当該培養期間に亙る培養を可能にするだけの量が少なくとも投入される。なお、培養容器1の底部に設置された鋳型3が培地5中に没入するように調整される。
The
ここで、培地5へと環境因子や薬剤が添加されるようにしても良い。これにより、同一培養条件下での異なる細胞・組織6の集団の応答を一度に評価することが可能になる。
Here, an environmental factor or a drug may be added to the
細胞・組織6は、各々が分離した単体の状態で若しくは凝集塊の状態で、例えばピペット7が用いられて投入される。
The cells /
細胞・組織6は、特定の種類に限定されるものではなく、各種計測等の内容に応じて供試体毎に指定・特定されるものが適宜選択される。
The cells /
細胞・組織6は、例えば各種計測等の内容に応じ、鋳型3に形成されている細胞培養スポットとしての穴3aのそれぞれに初期状態として接着させる所望の量(個数)が考慮されるなどした上で、例えば前記所望の量の接着を可能にするだけの量が投入される。
For the cells /
なお、培地5と細胞・組織6との投入について、培養容器1へと培地5が投入されてから当該培地5へと細胞・組織6が投入されるようにしても良く、或いは、細胞培養スポットとしての穴3aへと細胞・組織6が(個別に)投入されてから培養容器1へと培地5が投入されるようにしても良い。
Regarding the charging of the
培養容器1内へと投入された細胞・組織6は、鋳型3に細胞培養スポットとして形成されている穴3a内の細胞接着基質の領域4へと接着する。
The cell /
続いて、培地5が交換される(S5)。
Subsequently, the
細胞・組織6が投入された後、これら細胞・組織6が細胞培養スポットとしての穴3a内の細胞接着基質の領域4へと接着する時機を待って培地5が交換される。
After the cells /
培地5の交換は、例えば培養対象の細胞・組織6の種類が考慮されるなどした上で、細胞・組織6が投入されてから適当な時間が経過した時に行われる。
The
なお、培養容器1へと培地5が投入される前に細胞培養スポットとしての穴3aへと細胞・組織6が直接投入・播種されてから培養容器1へと培地5が投入されるようにした場合には、培地5が交換されないようにしても良い。
Before the
そして、所定の培養期間に亙って細胞・組織6の培養が行われる(S6;図7)。
Then, the cells /
培養期間は、例えば培養対象の細胞・組織6の種類や各種計測等の内容に応じて供試体毎に要求される条件が考慮されるなどした上で、適当な長さに適宜設定される。
The culturing period is appropriately set to an appropriate length, for example, considering the conditions required for each specimen according to the type of cells /
ここで、本発明では、細胞・組織6を機能的に成熟させ得る程度の長期間に亙る培養も可能であることを特徴の一つとする。
Here, one of the features of the present invention is that it is possible to culture the cells /
細胞・組織6の培養期間は、具体的には例えば、3週間から3ヶ月程度の範囲で設定されることが考えられる。本発明では、概ね3週間程度以上の期間に及ぶ培養のことを「長期培養」と呼ぶ。
Specifically, the culture period of the cell /
培養期間中、鋳型3の周囲の細胞非接着基質の領域2の上面や鋳型3の下面が接着している細胞非接着基質の領域2の上面に対しては、細胞・組織6の侵入が防止されたり培地5を介した細胞接着分子が除去されたりするため、細胞・組織6が接着することが無い。
During the culture period, the invasion of cells /
一方で、鋳型3に細胞培養スポットとして形成されている穴3a内の細胞接着基質の領域4には細胞・組織6が接着して増殖・分化が行われる。
On the other hand, cells /
ここで、鋳型3に細胞培養スポットとして形成されている穴3aの上面は開口して培地5に対して開放されているので、穴3a内の細胞接着基質の領域4に接着している細胞・組織6には培地5から栄養が継続的且つ十分に供給される。
Here, since the upper surface of the
所定の培養期間が経過した後に、鋳型3が取り外される(S7;図8)。
After the predetermined culture period has elapsed, the
鋳型3が取り外される(言い換えると、剥離される)ことにより、細胞接着基質上に所望の態様でパターニングされた細胞・組織6の集団が形成されている供試体が得られる。
By removing the template 3 (in other words, peeling it off), a specimen in which a population of cells /
上述の工程によれば、培養容器1内の細胞非接着基質が剥き出しになっている部分や細胞非接着基質の上面と鋳型3の下面とが接触している部分には細胞・組織6が接着せず、鋳型3の穴3a内の細胞接着基質の領域4のみに細胞・組織6が接着するので、細胞・組織6の集団のそれぞれは独立して隣接部での結合が無く、且つ、各細胞・組織6の集団は長期培養された結果として機能的に十分に成熟している。
According to the above step, the cells /
また、鋳型3を取り外した後においても、細胞非接着基質の働きにより、機能的に成熟している細胞・組織6の集団それぞれの形状及び配列が維持される。
Further, even after the
そして、鋳型3を取り外した状態で各種計測等を行うことにより、細胞・組織6(具体的には、培養された細胞・組織6が付着している供試体)へとばく露などされる環境因子の空間分布を阻害することが無い状態で、即ち環境因子に関して意図した所望の空間分布のままで正確な計測等を行うことが可能になる。
Then, by performing various measurements with the
培養された細胞・組織6が用いられて種々の実験や計測等が行われる際には、細胞・組織6を収容している培養容器1全体が供試体として使用されるようにしても良く、また、細胞・組織6が接着している細胞非接着基質の領域2が培養容器1の底部から剥がされて供試体として使用されるようにしても良く、或いは、培養容器1の底部に載置されたガラス板の上面に細胞非接着基質の領域2が形成されるようにした場合には細胞非接着基質の領域2が貼り付いているガラス板ごと供試体として使用されるようにしても良い。
When various experiments, measurements, etc. are performed using the cultured cells /
ここで、温度応答性高分子が細胞非接着基質の領域2の形成に用いられる物質に添加され、加熱されることによって分子構造が変化して(具体的には例えば、細胞非接着基質が融解して)細胞接着基質の領域4が細胞非接着基質から剥離するようにしても良い。この場合には、細胞接着基質の領域4(言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲)のそれぞれが局所的に加熱されることによって各細胞接着基質の領域4が個別に細胞非接着基質から剥離するようになり、同一条件の環境で培養された複数の細胞・組織6の集団を個別に容易に取り分けて回収し、個々の細胞・組織6の集団毎に分析・評価を行うことが可能になる。
Here, the temperature-responsive polymer is added to the substance used for forming the
細胞非接着基質の領域2の形成に用いられる物質へと添加される温度応答性高分子は、特定の種類に限定されるものではなく、例えば細胞非接着基質の領域2の形成に用いられる物質の性質への影響や細胞・組織6の増殖・分化に与える影響が考慮されるなどした上で、適当なものが適宜選択される。添加される温度応答性高分子としては、具体的には例えば、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)が選択され得る。
The temperature-responsive polymer added to the substance used for the formation of
温度応答性高分子が添加された物質が用いられて形成された細胞非接着基質の領域2から細胞接着基質の領域4を剥離させる際の加熱の方法としては、あくまで一例としては、レーザー照射が挙げられる。
As a heating method for peeling the cell
また、細胞接着基質の領域4を形成する物質として温度が変化することによって細胞や組織の接着性を有する性質(言い換えると、細胞接着基質として機能する材質)から細胞や組織の接着性を有しない性質(言い換えると、細胞非接着基質として機能する材質)へと変質する物質が用いられ、加熱若しくは冷却されることによって細胞接着基質の領域4から細胞・組織6が分離して回収されるようにしても良い。この場合には、細胞接着基質の領域4(言い換えると、細胞接着基質が形成されている範囲)のそれぞれが局所的に加熱若しくは冷却されることによって各細胞・組織6が個別に細胞接着基質から分離するようになり、同一条件の環境で培養された複数の細胞・組織6の集団を個別に容易に取り分けて回収し、個々の細胞・組織6の集団毎に分析・評価を行うことが可能になる。
In addition, it does not have cell or tissue adhesion due to its property of having cell or tissue adhesion (in other words, a material that functions as a cell adhesion substrate) due to changes in temperature as a
細胞接着基質の領域4の形成に用いられる、温度変化によって細胞接着性から細胞非接着性へと変質する物質は、特定の種類に限定されるものではなく、例えば細胞・組織6の増殖・分化に与える影響が考慮されるなどした上で、適当なものが適宜選択される。温度変化によって細胞接着性が変化する物質としては、具体的には例えば、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)が選択され得る。
The substance used for forming the
温度変化によって細胞接着性が変化する物質が用いられて形成された細胞接着基質の領域4から細胞・組織6を分離させるために温度変化を与える方法としては、あくまで一例としては、加熱する場合にはレーザー照射が挙げられ、冷却する場合にはペルチェ素子を用いることが挙げられる。
As a method of giving a temperature change in order to separate cells /
以上のように構成された培養細胞供試体の作製方法によれば、生体細胞や組織の培養の初期段階においては物理的構造(即ち、鋳型3)が利用されて細胞非接着基質の領域2への細胞侵入と接着分子等の汚染とを防止した状態で長期培養が行われ、その後、物理的構造(鋳型3)が取り外された後においても細胞非接着基質の効果により、物理的構造(鋳型3)に従う細胞・組織6の集団の形状が維持されると共に各集団の配列・配向の態様が維持される。このため、任意の形状や配列・配向の態様(言い換えると、平面的パターン)で成熟した生体細胞や組織が培養されている供試体を作製することができる。
According to the method for producing a cultured cell specimen constructed as described above, the physical structure (that is, template 3) is utilized in the initial stage of culturing living cells and tissues to the
以上のように構成された培養細胞供試体の作製方法によれば、また、例えば化学物質や放射線,電磁界などの様々な環境因子のばく露強度分布に対応するように細胞・組織6の集団を配列・配向させることができ、このため、用量反応や時間反応を各ばく露強度と対応させて複数サンプルで同時評価することができる。
According to the method for producing a cultured cell specimen constructed as described above, and a population of cells /
以上のように構成された培養細胞供試体の作製方法によれば、また、長期培養に対応する培地5(液体培地,培養液)を収容し得る容量を有する培養容器1内で細胞・組織6を培養することによって培地交換の操作を不要とし、これにより、培地交換に伴う細胞・組織6への影響・ダメージを与えない状態での長期培養を行うことが可能になる。なお、発明者らの知見によると、長期培養に対応する量の培地5を培養容器1内に貯留させることにより、細胞・組織6から排出される老廃物によって引き起こされる細胞・組織6の増殖・分化の阻害が十分に低減する程度まで前記老廃物が培地5内に分散するようになり、この点からも培地5の交換は不要になる。
According to the method for producing a cultured cell specimen configured as described above, the cells /
なお、上述の実施形態は本発明を実施する際の好適な形態の一例ではあるものの本発明の実施の形態が上述のものに限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において本発明は種々変形実施可能である。 Although the above-described embodiment is an example of a suitable mode for carrying out the present invention, the embodiment of the present invention is not limited to the above-mentioned one, and the present invention is not limited to the above-mentioned embodiment and does not deviate from the gist of the present invention. The invention can be modified in various ways.
本発明の培養細胞供試体の作製方法の作用効果を検証した実施例を図9乃至図12を用いて説明する。 Examples of verifying the action and effect of the method for producing a cultured cell specimen of the present invention will be described with reference to FIGS. 9 to 12.
本発明の実施例として、培養容器の底部に形成された細胞非接着基質の領域の上面に鋳型を設置すると共に当該鋳型の細胞培養スポットとしての穴内に細胞接着基質の領域を形成し、その上で培養容器へと培地及び細胞を投入して培養した後に鋳型を取り外して供試体(試料)を作製した。 As an example of the present invention, a template is placed on the upper surface of a region of the non-cell adhesive substrate formed at the bottom of the culture vessel, and a region of the cell adhesive substrate is formed in a hole as a cell culture spot of the template, and the region is formed on the template. After putting the medium and cells into the culture vessel and culturing, the template was removed to prepare a specimen (sample).
本実施例の条件は以下の通りであった。
細胞非接着基質:アガロースゲル
細胞接着基質 :ポリエチレンイミン(PEI)
鋳型の材質 :ポリジメチルシロキサン(PDMS)
培地 :Neurobasal medium(+2% B−27 supplement,1% Glutamax supplement,1% Pen−Strep)(20 ml で培養,2乃至3日に一度半量の培地交換を実施)
細胞 :ラット大脳皮質から採取された神経細胞
培養条件<1> :鋳型を付けた状態で7日間培養し、
その後に鋳型を取り外した状態で39日間培養
培養条件<2> :鋳型を付けた状態で21日間培養し、
その後に鋳型を取り外した状態で25日間培養
The conditions of this example were as follows.
Non-cell adhesion substrate: Agarose gel Cell adhesion substrate: Polyethylenimine (PEI)
Mold material: Polydimethylsiloxane (PDMS)
Medium: Neurobasal medium (+ 2% B-27 supplement, 1% Glutamax supplement, 1% Pen-Strep) (cultured in 20 ml, half volume exchanged once every 2 to 3 days)
Cells: Nerve cells collected from rat cerebral cortex Culturing conditions <1>: Incubate for 7 days with a template attached.
After that, culture for 39 days with the mold removed. Culture condition <2>: Incubate for 21 days with the mold attached.
After that, culture for 25 days with the mold removed.
本実施例では、鋳型の穴の平面視形状及び前記穴内の細胞接着基質の領域の形状によって特定された所望の細胞形状の維持性能を検証するため、培養条件<1>で作製した試料と培養条件<2>で作製した試料とのそれぞれについて、細胞接着基質の領域内の神経細胞から伸張する神経繊維が細胞非接着基質の領域へと侵入する様子を観察した。 In this example, in order to verify the maintenance performance of the desired cell shape specified by the plan view shape of the hole of the template and the shape of the region of the cell adhesion substrate in the hole, the sample and culture prepared under the culture condition <1> are used. For each of the samples prepared under the condition <2>, it was observed that the nerve fibers extending from the nerve cells in the region of the cell adhesion substrate invaded the region of the cell non-adhesion substrate.
観察の結果として、鋳型を取り外した直後(即ち、培養条件<1>の試料については培養開始から7日目,培養条件<2>の試料については培養開始から21日目)の状態について図9に示す結果が得られ、また、鋳型を取り外してから7日目(即ち、培養条件<1>の試料については培養開始から14日目,培養条件<2>の試料については培養開始から28日目)の状態について図10(培養条件<1>)及び図11(培養条件<2>)に示す結果が得られ、さらに、培養開始から46日目の状態について図12に示す結果が得られた。 As a result of observation, FIG. 9 shows the state immediately after the template was removed (that is, 7 days from the start of culture for the sample under culture condition <1>, and 21 days from the start of culture for the sample under culture condition <2>). 7 days after removing the template (that is, 14 days from the start of culture for the sample under culture condition <1>, 28 days from the start of culture for the sample under culture condition <2>. The results shown in FIGS. 10 (culture conditions <1>) and 11 (culture conditions <2>) were obtained for the state of (eyes), and the results shown in FIG. 12 were obtained for the state 46 days after the start of culture. It was.
図9に示す結果から、鋳型取り外し直後においては、培養条件<1>でも培養条件<2>でも、細胞接着基質の領域と細胞非接着基質の領域との境界が明確であって細胞非接着基質の領域への細胞の接着や侵入は看取されないことが確認された。 From the results shown in FIG. 9, immediately after the mold was removed, the boundary between the cell adhesion substrate region and the cell non-adhesion substrate region was clear under both the culture conditions <1> and the culture conditions <2>, and the cell non-adhesion substrate It was confirmed that no cell adhesion or invasion into the area was observed.
図10に示す結果から、培養条件<1>では、鋳型を取り外してから7日後には細胞接着基質の領域から細胞非接着基質の領域へと神経繊維が侵入している状況が看取されることが確認された。
From the results shown in FIG. 10, under the culture condition <1>, it can be seen that the nerve fibers invaded from the cell adhesion substrate region to the cell
一方、図11に示す結果から、培養条件<2>では、鋳型を取り外してから7日経過時においても細胞接着基質の領域と細胞非接着基質の領域との境界が明確であって細胞非接着基質の領域への細胞(神経繊維)の侵入は看取されないことが確認された。 On the other hand, from the results shown in FIG. 11, under the culture condition <2>, the boundary between the cell adhesion substrate region and the cell non-adhesion substrate region was clear even 7 days after the template was removed, and the cells were non-adherent. It was confirmed that the invasion of cells (nerve fibers) into the area of the substrate was not observed.
図12に示す結果から、培養開始から46日経過時において、培養条件<1>では細胞非接着基質の領域への神経突起の侵入が継続して更に進行している状況が看取される(同図(A))一方で、培養条件<2>では細胞接着基質の領域と細胞非接着基質の領域との境界が明確であって細胞非接着基質の領域への細胞(神経繊維)の侵入は看取されず細胞群は鋳型の穴形状と同様の形状を保持していることが確認された。 From the results shown in FIG. 12, it can be seen that 46 days after the start of culture, under the culture condition <1>, the invasion of the nerve protrusions into the region of the cell non-adherent substrate continues and further progresses ( On the other hand, in the culture condition <2>, the boundary between the cell adhesion substrate region and the cell non-adhesion substrate region is clear, and cells (nerve fibers) invade the cell non-adhesion substrate region. It was confirmed that the cell group retained the same shape as the hole shape of the template.
図9乃至図12に示す結果から、神経細胞が回路網構造を形成する培養初期段階での神経線維の伸長を鋳型によって物理的に遮断することより、細胞非接着基質の領域へと侵入してしまうような活発な神経線維の伸長を抑制すると共に鋳型内部での神経回路網の形成・成熟を促し得ることが確認された。これにより、鋳型内において長期培養(21日間)を行った試料(培養条件<2>)については、鋳型取り外し後の長期培養(25日間)においても細胞非接着基質の領域への神経線維の侵入を抑制することができたものと考えられた。 From the results shown in FIGS. 9 to 12, the elongation of nerve fibers in the early stage of culture in which nerve cells form a network structure is physically blocked by a template to invade the region of the cell non-adhesive substrate. It was confirmed that it can suppress the elongation of active nerve fibers and promote the formation and maturation of the neural network inside the template. As a result, for the sample (culture condition <2>) that was subjected to long-term culture (21 days) in the template, nerve fibers invaded the region of the cell non-adhesive substrate even in the long-term culture (25 days) after removal of the template. It was considered that this could be suppressed.
以上の結果から、本発明によると、生体細胞の培養の初期段階においては鋳型が利用されて細胞非接着基質の領域への細胞侵入と接着分子等の汚染が防止された状態で長期培養が行われ、その後、鋳型は取り外されるものの細胞非接着基質の効果により、任意の形状で成熟し且つ形状の境界が明確なままで維持された状態の生体細胞の集団を作製可能であることが確認された。 From the above results, according to the present invention, in the initial stage of culturing living cells, long-term culturing is performed in a state where a template is used to prevent cell invasion into the region of non-adhesive matrix of cells and contamination of adherent molecules and the like. After that, it was confirmed that although the template was removed, the effect of the cell non-adhesive substrate made it possible to generate a population of living cells that matured in any shape and that the boundary of the shape was maintained with a clear boundary. It was.
1 培養容器
2 細胞非接着基質の領域
3 鋳型
3a 細胞培養スポット,穴
4 細胞接着基質の領域
5 培地
6 細胞,組織
7 ピペット
1
Claims (4)
細胞培養スポットが形成されている鋳型が前記細胞非接着基質の領域に設置されると共に前記鋳型の前記細胞培養スポット内のそれぞれの底部に該当する前記細胞非接着基質の領域の上面に細胞接着基質の領域が形成され、
その上で前記培養容器へと培地並びに細胞と組織とのうちの少なくとも一方が投入されて前記細胞培養スポット内の前記細胞接着基質の領域に接着して培養が行われ、
前記細胞や前記組織の培養が行われた後に前記鋳型が前記培養容器の外に取り外されることによって前記細胞接着基質の上に培養された前記細胞または組織の集団が残され前記鋳型の前記細胞培養スポットの配列パターンに従った集団それぞれの形状及び配列が維持された供試体が作成される
ことを特徴とする培養細胞供試体の作製方法。 A region of cell non-adhesive substrate is formed on the bottom surface of the culture vessel,
The template on which the cell culture spot is formed is placed in the region of the cell non-adhesive substrate, and the cell adhesion substrate is placed on the upper surface of the region of the cell non-adhesive substrate corresponding to the bottom of each of the template in the cell culture spot. Region is formed,
Then, at least one of the medium and cells and tissues is put into the culture vessel and adhered to the region of the cell adhesion substrate in the cell culture spot for culturing.
After the cells and tissues have been cultured, the template is removed from the culture vessel to leave a population of the cells or tissues cultured on the cell adhesion substrate, and the cell culture of the template remains. A method for producing a cultured cell specimen, which comprises producing a specimen in which the shape and arrangement of each group are maintained according to a spot arrangement pattern.
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