JP6884450B2

JP6884450B2 - Ｔ細胞ワクチン

Info

Publication number: JP6884450B2
Application number: JP2020536906A
Authority: JP
Inventors: 健二郎松野; 祐司上田; 祐介北沢
Original assignee: DOKKYO MEDICAL UNIVERSITY
Current assignee: DOKKYO MEDICAL UNIVERSITY
Priority date: 2019-02-14
Filing date: 2020-02-14
Publication date: 2021-06-09
Anticipated expiration: 2040-02-14
Also published as: WO2020166729A1; JPWO2020166729A1

Description

本発明は、リンパ器官で多所性に中和抗体を誘導するＴ細胞ワクチンに関する。

ＤＳＴ（ｄｏｎｏｒｓｐｅｃｉｆｉｃｂｌｏｏｄｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ／ドナー特異的輸血）とは、臓器移植前にドナー（アロ）血液を宿主に投与し、免疫寛容を誘導する治療法である（非特許文献１：ＣｌｉｎＴｒａｎｓｐｌａｎｔ２５：３１７，２０１１）。１９７０年代から腎移植の前にＤＳＴを行うと、拒絶反応がドナー特異的に抑制されることドナー組織適合抗原（ＭＨＣ抗原）に対する抗体が一回の輸血だけでも簡単に作られることが臨床現場から報告されたが、副作用が起こることもあるため、拒絶反応を容易に治療できる免疫抑制剤の登場によりほとんど行われなくなっている。そのため、アロ抗体産生応答（ＡＦＣ応答）が血液中の何の成分により、どこで、どのようにおこるのか、作られた抗体が免疫抑制を含めどのような作用を持つかについては未だに解明されていない。

本発明者は、これまでｉｎｖｉｖｏ免疫学の観点からラットの移植免疫応答における免疫担当細胞の動態と機能を臓器レベルで免疫組織学的に解析してきた（非特許文献２：ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ２１：５８１，２０１２；非特許文献３：ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ１９：７６５，２０１０；非特許文献４：ＡｒｃｈＨｉｓｔｏｌＣｙｔｏｌ７３：１，２０１０；非特許文献５：Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ５６：１５３２，２０１２）。近年では、免疫応答のメカニズムの解明のために、近親交配系でのＧｖＨ病ラットモデルを用い、チミジンアナログであるＥｄＵ（Ｅｔｈｙｎｙｌｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）を用いた多重蛍光免疫染色法による免疫組織学とフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を並行しておこなう定性定量解析法を確立した（非特許文献６：ＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌ１４４：１９５，２０１５）。

この手法により抗原貪食の提示の細胞間相互作用や免疫性増殖応答が、どこで、どの程度起こるかの定性定量解析が可能となり、免疫応答のメカニズムが解析できるようになった。そこで、本研究の予備実験としてＤＳＴ後に宿主の免疫応答を解析したところ、主に脾臓でアロＡＦＣ応答が起こること、抗体はドナーＩ型ＭＨＣ抗原（ＭＨＣＩと省略）に対するものであることが明らかになり（非特許文献７：ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ３０：５３，２０１８）、ドナー血液成分中、白血球、特にＴ細胞分画が有効で、赤血球などのそれ以外の成分は無効であることがわかった。

アロ免疫応答は、ドナー抗原提示樹状細胞（ＤＣ）が宿主Ｔ細胞と直接会合してドナーＭＨＣ抗原を提示する直接感作と、ドナー細胞由来のＭＨＣ抗原が宿主のＤＣに取り込まれて提示される間接感作により起こるとされる（非特許文献８：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１４：３５７，２００１）。ＡＦＣ応答（液性免疫）については、Ｔｈ２ヘルパーＴ細胞や濾胞ヘルパーＴ細胞（ＦｏｌｌｉｃｕｌａｒｈｅｌｐｅｒＴｃｅｌｌｓ／Ｔｆｈ）により誘導され、ＩＬ−４，ＩＬ−１０などのサイトカインや転写因子であるＧＡＴＡ−３遺伝子の発現が優位になることが報告されている（非特許文献９：Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３０：３２４，２００９）。

血液中にＤＣはほとんど存在しないので、ＤＳＴによる抗体産生応答は、主に脾臓内での間接感作による免疫応答が関与していることが予測される。ここで、脾臓での免疫応答は白脾髄内の動脈周囲リンパ球鞘（ＰＡＬＳ／Ｔ細胞領域）で起こり、そこにＤＣが局在している事、Ｔ及びＢ細胞は免疫監視のために多くが全身を再循環しており、常に血液からＰＡＬＳ内に遊走してＰＡＬＳにしばらく留まる事、Ｔ細胞はさらにＰＡＬＳのＤＣと会合し抗原情報を確認する事がわかっている（非特許文献１０：ＡｒｃｈＨｉｓｔｏｌＣｙｔｏｌ７３：１，２０１０）。

ところで、病原病原体に対するワクチンは、通常、筋肉内又は皮下投与して、主に脾臓で中和抗体の産生を誘導するものである。そのため、脾臓機能が低い場合や摘脾した場合は通常のワクチン効果があまり期待できない。

ＣｌｉｎＴｒａｎｓｐｌａｎｔ２５：３１７，２０１１ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ２１：５８１，２０１２ＣｅｌｌＴｒａｎｓｐｌａｎｔ１９：７６５，２０１０ＡｒｃｈＨｉｓｔｏｌＣｙｔｏｌ７３：１，２０１０Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ５６：１５３２，２０１２ＨｉｓｔｏｃｈｅｍＣｅｌｌＢｉｏｌ１４４：１９５，２０１５ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｌ３０：５３，２０１８Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１４：３５７，２００１Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３０：３２４，２００９ＡｒｃｈＨｉｓｔｏｌＣｙｔｏｌ７３：１，２０１０

上記の状況下、多所性に中和抗体を誘導するワクチンの開発が望まれていた。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、アロＴ細胞に病原体抗原を標識し、これを個体に接種することにより、脾臓のみならず全身のリンパ節で多所性に中和抗体を誘導することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）組織適合抗原の発現抑制処理、活性化抑制処理、及び病原体抗原の標識処理がされたドナー由来Ｔ細胞を含む、同種異型レシピエント個体における前記病原体抗原に対するワクチン。
（２）組織適合抗原の発現抑制処理が、組織適合抗原遺伝子に対するＲＮＡ干渉処理又は当該遺伝子のノックアウト処理である（１）に記載のワクチン。
（３）活性化抑制処理が、代謝拮抗剤若しくはＤＮＡ合成阻害剤処理又は放射線照射処理である（１）又は（２）に記載のワクチン。
（４）病原体がウイルス又は細菌である（１）〜（３）のいずれか１項に記載のワクチン。
（５）ウイルスがインフルエンザウイルスである（４）に記載のワクチン。
（６）リンパ器官で多所性に中和抗体を誘導する、（１）〜（５）のいずれか１項に記載のワクチン。

（７）組織適合抗原の発現抑制処理、活性化抑制処理、及び病原体抗原の標識処理がされたドナー由来Ｔ細胞を含む、同種異型レシピエント個体における中和抗体誘導剤。
（８）組織適合抗原の発現抑制処理が、組織適合抗原遺伝子に対するＲＮＡ干渉処理又は当該遺伝子のノックアウト処理である（７）に記載の中和抗体誘導剤。
（９）活性化抑制処理が、代謝拮抗剤若しくはＤＮＡ合成阻害剤又は放射線照射処理である（７）又は（８）に記載の中和抗体誘導剤。
（１０）病原体がウイルス又は細菌である（７）〜（９）のいずれか１項に記載の中和抗体誘導剤。
（１１）ウイルスがインフルエンザウイルスである（１０）に記載の中和抗体誘導剤。
（１２）リンパ器官で多所性に中和抗体を誘導する、（７）〜（１１）のいずれか１項に記載の中和抗体誘導剤。

本発明により、Ｔ細胞ワクチン及び中和抗体誘導剤が提供される。本発明のＴ細胞ワクチンは、多所性に中和抗体を誘導することが可能である。

実施例の実験方法を示す図である。実施例の特異的抗体産生細胞の染色法の模式図である。実施例１の実験結果を示す図である。セミアロＴ細胞投与（親のＴ細胞を一代雑種Ｆ１レシピエントに投与する系）により、標識抗原のｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＥ）に対する特異抗体が血清中に検出され（左グラフ、赤矢印）、頚部リンパ節切片上に抗体産生細胞（青、右図）が出現したが、アロ抗体は出なかった（黒矢印）。一方、アロＴ細胞ではアロ抗体が大量に出るが、ＰＥ抗体価は低かった。

本発明者は、ドナーＴ細胞が輸血後に脾臓ＰＡＬＳに遊走し、宿主のＤＣと会合した後にドナーＭＨＣＩ抗原を何らかの形で受け渡し、そこで最も効率よく間接感作を起こし、その結果、Ｔｈ２やＴｆｈが誘導され、効率的に抗原特異的な抗体が産生されるという仮説を着想した。

本発明は、組織適合抗原の発現抑制処理、活性化抑制処理及び病原体抗原の標識処理がされたドナー由来Ｔ細胞を含む、同種異型レシピエント個体における前記病原体に対するワクチン及び中和抗体誘導剤に関する。
同種異系（アロ）Ｔ細胞は、自己Ｔ細胞と同様に全身のリンパ器官に再循環し血行性遊走する能力を持っているが、Ｔ細胞受容体を介して組織在住の樹状細胞を効率よく刺激すると、当該Ｔ細胞自身のＩ型組織適合抗原（ＭＨＣ）に対するアロ抗体が容易に誘導されることを見出した。この知見は、自己Ｔ細胞とは異なるものである。

本発明者は上記知見を利用して、アロＴ細胞（ドナー由来のＴ細胞）にインフルエンザなどの病原体抗原を標識し、これを自己（ドナー）以外のレシピエントに投与することにより、脾臓のみならずリンパ節で多所性に中和抗体を誘導することを見出した。リンパ節はヒトで数百個あるので、全身のリンパ節で中和抗体を誘導できる本発明のワクチンは効率が高く、新しい概念のワクチンとして利用できる。
ここで、本発明において使用されるＴ細胞は、一の個体から採取される。このＴ細胞に上記処理を施した後、当該一の個体とは同種であるが他の個体（つまり同種異系の個体）に投与する。従って、使用するＴ細胞を本明細書では「アロＴ細胞」という。

本発明においては、ドナー血液から採取されたＴ細胞（アロＴ細胞）に対し、組織適合抗原の発現抑制処理、活性化抑制処理、及び病原体抗原の標識処理を行う。このような処理がされたアロＴ細胞を、当該ドナーとは異なる同種異系個体（レシピエント）に投与する。

組織適合抗原の発現抑制処理とは、アロ抗原性の抑制処理を意味し、組織適合抗原の発現を抑制するための処理としては、例えば組織適合抗原遺伝子に対するＲＮＡ干渉処理又は当該遺伝子のノックアウト処理が挙げられる。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）により遺伝子発現を抑制し得る合成核酸分子としては、例えばｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及びｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）が挙げられる。

ｓｉＲＮＡは、当分野において周知の基準に基づいて設計できる。例えば、標的となる組織適合抗原遺伝子のｍＲＮＡの標的セグメントは、好ましくはＡＡ、ＴＡ、ＧＡ又はＣＡで始まる連続する１５〜３０塩基、好ましくは１９〜２５塩基のセグメントを選択することができる。ｓｉＲＮＡのＧＣ比は、３０〜７０％、好ましくは３５〜５５％である。
ｓｉＲＮＡは、二本鎖部分を生成するために自身の核酸上で折り畳む一本鎖ヘアピンＲＮＡ分子として生成される。

ｓｉＲＮＡ分子は、通常の化学合成により得ることができるが、センス及びアンチセンスｓｉＲＮＡ配列を含有する発現ベクターを用いて生物学的に生成することも可能である。
ｓｉＲＮＡを細胞に導入するには、ｉｎｖｉｔｒｏで合成したｓｉＲＮＡをプラスミドＤＮＡに連結してこれを細胞に導入する方法、２本鎖ＲＮＡをアニールする方法などを採用することができる。

ｓｈＲＮＡは、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成されたステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。従って、ｓｈＲＮＡは、その一部がステムループ構造を形成するように設計する。例えば、ある領域の配列を配列Ａとし、配列Ａに対する相補鎖を配列Ｂとすると、配列Ａ、スペーサー、配列Ｂの順でこれらの配列が一本のＲＮＡ鎖に存在するように連結し、全体で４５〜６０塩基の長さとなるように設計する。配列Ａは、標的となる組織適合抗原遺伝子の一部の領域の配列であり、標的領域は特に限定されるものではなく、任意の領域を候補にすることが可能である。そして配列Ａの長さは１９〜２５塩基、好ましくは１９〜２１塩基である。

さらに、本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を用いて上記遺伝子の発現を抑制することができる。ｍｉＲＮＡとは、細胞内に存在する長さ２０〜２５塩基ほどの１本鎖ＲＮＡであり、他の遺伝子の発現を調節する機能を有すると考えられているｎｃＲＮＡ（ｎｏｎｃｏｄｉｎｇＲＮＡ）の一種である。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡに転写された際にプロセシングを受けて生じ、標的配列の発現を抑制するヘアピン構造を形成する核酸として存在する。
ｍｉＲＮＡも、ＲＮＡｉに基づく阻害性核酸であるため、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡに準じて設計し合成することができる。

また、本発明においては、組織適合抗原遺伝子をノックアウトすることもできる。ノックアウトする方法としては、例えばＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるノックアウトなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ｓｉＲＮＡ処理又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔ処理などは、公知文献に記載の方法（ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌＩｎｔ．１３：１１２，２０１３；ＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ２３：２２５５，２０１７）により行うことができる。

Ｔ細胞の活性化抑制処理とは、Ｔ細胞のＧｖＨ病発症などのリスクを除去する処理を意味し、活性化抑制処理としては、代謝拮抗剤若しくはＤＮＡ合成阻害剤処理、又は放射線照射処理が挙げられる。本発明において使用可能な代謝拮抗剤及びＤＮＡ合成阻害剤、並びに放射線照射を以下に例示する。

＜代謝拮抗剤又はＤＮＡ合成阻害剤＞
葉酸類似体：メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート等
プリン類似体：メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、フルダラビン等
ピリミジン類似体：シタラビン、フルオロウラシル、テガフール、ゲムシタビン等
抗生物質：マイトマイシンＣ、アクチノマイシン、ドキソルビシン、エピルビシン等
アルキル化剤：シクロフォスファミド、メルファラン、チオテパ、ブスルファン等
白金製剤：シスプラチン、イプロプラチン、カルボプラチン等
トポイソメラーゼ阻害薬：イリノテカン、ノギテカン、エトポシド、アントラサイクリン系薬剤等

代謝拮抗剤又はＤＮＡ合成阻害剤の使用量は、マイトマイシンＣならば２０μｇ／５ｘ１０^７／ｍｌで３７℃３０分間処理、他は適正量を用いる。この処理は、公知文献に記載の方法（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ５６：１５３２，２０１２）により行うことができる。

＜放射線照射処理＞
Ｘ線、ガンマ線等
放射線照射量は、１０^８個の細胞あたり１０〜５０Ｇｙ、好ましくは１５Ｇｙである。こらの処理は、公知文献に記載の方法（ＡｒｃｈＰａｔｈｏｌＬａｂＭｅｄ１４２：６６２，２０１８）により行うことができる。

本発明において、抗原として使用する病原体は特に限定されるものではなく、ウイルス、細菌、原虫などが挙げられる。抗原標識には、標的抗原の遺伝子ベクターを作製し、Ｔ細胞への遺伝子導入技術を用いて行う。

ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、肝炎ウイルス、帯状疱疹、麻疹・風疹、パピローマ（ＨＰＶ）、ヒト免疫不全（ＨＩＶ）ウイルスなどが挙げられる。
細菌としては、肺炎球菌、髄膜炎菌、ジフテリア菌、破傷風菌、百日咳菌、結核などが挙げられる。
原虫としては、マラリアなどが挙げられる。

アロＴ細胞ワクチンは、ドナー由来Ｔ細胞を、（ａ）組織適合抗原の発現抑制処理、（ｂ）活性化抑制処理及び（ｃ）病原体抗原の標識処理することにより調製されるが、その順序は特に限定されるものではない。上記処理を（ａ）、（ｂ）、（ｃ）の順序で行ってもよく、別の順序でもよい。また（ｃ）については、抗ＣＤ４抗体などＴ細胞を特異的に認識する抗体に、病原体抗原を結合させて当該抗体と病原体抗原との複合体を作製し、これをドナーＴ細胞に結合させることもできる。

このような処理により、ドナーＴ細胞（アロＴ細胞）のレシピエントにＧｖＨ病やアロ抗体産生誘導などを起こすアロ免疫能という本来の機能が失われるが、抗原輸送能という新しい機能を獲得することとなる。これにより、アロ免疫応答を起こさずに病原体抗原を全身のリンパ器官のレシピエント樹状細胞に届けることができる抗原輸送専門の細胞を作製したことになる。本細胞はＭＨＣの異なるどのレシピエントにも投与可能であり、その意味で「標準化」したアロＴ細胞と位置づけることができる。この標準化アロＴ細胞は、比較的安全で汎用性が高い全く新しいタイプのワクチンとして使用することが可能である。

上記処理が行われたアロＴ細胞は、レシピエントである同種異系の対象個体に投与する。これにより、同種異系個体では、リンパ器官で多所性に標識抗原に対する中和抗体を誘導することが可能となる。
本発明のワクチンは、使用する抗原に応じて、当該抗原に関連する疾患に対する医薬組成物として使用することもできる。本発明の医薬組成物は、注射剤等の非経口投与剤などの形態に応じて投与することができる。好ましくは、静脈注射のほか、腹腔等への局部注射等が例示される。

投与方法としては、静脈投与、腹腔内投与などが挙げられる。
投与量は、投与経路、投与対象、患者の年齢、体重、性別、症状その他の条件により適宜選択される。ワクチンとして使用されるアロＴ細胞の一日投与量としては、静脈投与の場合は１０^７個／ｍｌ〜１０^９個／ｍｌ、好ましくは５ｘ１０^７個／ｍｌ〜５ｘ１０^８個／ｍｌ程度であり、１日１回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。
本発明のワクチンは、脾臓機能が正常なヒトだけでなく、低下または脾摘したヒトであっても全身性・多所性に中和抗体を誘導できる。
従って、本発明のアロＴ細胞は、中和抗体誘導剤として使用することができる。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
［実施例１］

方法
親ラットのＴ細胞に、抗原としてＦＩＴＣそのもの、または抗ＣＤ４抗体に結合させたｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎを標識後、マイトマイシンＣ処理の後、脾摘した一代雑種Ｆ１ラットに静脈内投与し、７日後に種々のリンパ節と血清を採取した。
リンパ節は切片上に特異的な抗体産生細胞を可視化し、血清はフローサイトメーターで特異抗体の定量をおこなった（図１）。
すなわち、凍結切片上で、まずｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎやＦＩＴＣを標識したノーマルマウスＩｇＧを、抗原特異的ＡＦＣの抗体存在部位に結合させた。次に酵素（アルカリホスファターゼ）標識した抗マウスＩｇＧを反応させた後、酵素発色させて可視化した（図２）。

その結果、特異的抗体産生細胞が複数のリンパ節で検出され、血清には特異抗体を認めたが、ドナー細胞の増殖性応答もアロＭＨＣ抗体も検出されなかった。一方、抗原標識自己Ｔ細胞は抗体応答を誘導しなかった（図３）。

父親（Ａ系）のＴ細胞をＦ１ラットに投与したセミアロの組み合わせの場合、Ｆ１（Ｂ系ｘＡ系）は両親のＭＨＣＩを共発現するため、ドナーＴ細胞のＭＨＣ（Ａ系）を認識できない。そのため、ＭＨＣＩに対する反応が起こらないが、ドナーＴ細胞はＴ細胞受容体を介して組織在住の樹状細胞上に発現する母親のＭＨＣ（Ｂ系）を認識し、相互作用を起こして樹状細胞を活性化できるため、結果として標識抗原に対する抗体産生を誘導できたものと考えられる。
ｓｉＲＮＡなどでＭＨＣＩ発現を抑制したドナーＴ細胞はＭＨＣＩに対する反応を理論的に起こさないはずなので、Ｆ１ラットの系はｓｉＲＮＡを用いる系と類似なモデルといえる。一方、自己Ｔ細胞は抗体応答を誘導できないため、アロＴ細胞を用いることが本発明における必要条件である。

Claims

組織適合抗原の発現抑制処理、活性化抑制処理、及び病原体抗原の標識処理がされたドナー由来Ｔ細胞を含む、同種異型レシピエント個体における前記病原体抗原に対するワクチン。
組織適合抗原の発現抑制処理が、組織適合抗原遺伝子に対するＲＮＡ干渉処理又は当該遺伝子のノックアウト処理である請求項１に記載のワクチン。
活性化抑制処理が、代謝拮抗剤若しくはＤＮＡ合成阻害剤処理又は放射線照射処理である請求項１又は２に記載のワクチン。
病原体がウイルス又は細菌である請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン。
ウイルスがインフルエンザウイルスである請求項４に記載のワクチン。
リンパ器官で多所性に中和抗体を誘導する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のワクチン。
組織適合抗原の発現抑制処理、活性化抑制処理、及び病原体抗原の標識処理がされたドナー由来Ｔ細胞を含む、同種異型レシピエント個体における中和抗体誘導剤。
組織適合抗原の発現抑制処理が、組織適合抗原遺伝子に対するＲＮＡ干渉処理又は当該遺伝子のノックアウト処理である請求項７に記載の中和抗体誘導剤。
活性化抑制処理が、代謝拮抗剤若しくはＤＮＡ合成阻害剤又は放射線照射処理である請求項７又は８に記載の中和抗体誘導剤。
病原体がウイルス又は細菌である請求項７〜９のいずれか１項に記載の中和抗体誘導剤。
ウイルスがインフルエンザウイルスである請求項１０に記載の中和抗体誘導剤。
リンパ器官で多所性に中和抗体を誘導する、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の中和抗体誘導剤。