JP6883826B2 - Diagnosis method of myelodysplastic syndrome - Google Patents
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Description
［関連出願］
本出願は、日本特許出願２０１６−１４１９９６（２０１６年７月２０日出願）に基づく優先権を主張しており、この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
［技術分野］
本発明は、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比を指標とした骨髄異形成症候群の診断方法、前記診断方法のためのキット等に関する。[Related application]
This application claims priority based on Japanese Patent Application 2016-141996 (filed July 20, 2016), the contents of which are incorporated herein by reference.
[Technical field]
The present invention relates to a method for diagnosing myelodysplastic syndrome using the CD33 expression level ratio of granulocytes and CD34-positive cells as an index, a kit for the diagnostic method, and the like.
骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｙｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ［ＭＤＳ］）は、高齢者に多発する造血細胞の悪性腫瘍である。その特徴として、１）血球減少（好中球が減少することによる白血球減少、貧血、血小板減少）を起こし、２）顕微鏡検査を行うと、末梢血や骨髄の細胞に形の異常（形態異常＝異形成）があり、３）しばしば、特に病後期に、芽球と呼ばれる未熟な細胞が骨髄中で２０％以上に増加し、検査上では急性骨髄性白血病と区別できない状態となる（これを「白血病化」と言う）。 Myelodysplastic syndrome (MDS) is a malignant tumor of hematopoietic cells that frequently occurs in the elderly. Its characteristics are 1) blood cell depletion (leukemia decrease due to neutrophil depletion, anemia, thrombocytopenia), and 2) morphological abnormality in peripheral blood and bone marrow cells (morphological abnormality =) when microscopic examination is performed. There is dysplasia), and 3) often, especially in the late stages of the disease, immature cells called blasts increase by more than 20% in the bone marrow, making it indistinguishable from acute myeloid leukemia on examination (this is called "dysplasia"). Leukemia ").
ＭＤＳを診断するためには、血球減少を示す患者に骨髄検査（骨髄細胞の採取）を行い、骨髄細胞における異形成を証明した上で、他の異形成を起こしうる疾患（ビタミンＢ１２欠乏やアルコール性造血障害など）を除外する必要がある。しかしながら、異形成の証明は観察者の主観に左右され、再現性に乏しいという欠点がある。また、正常高齢者にも一定の異形成を認めることがあり、診断に苦慮することが多い。 To diagnose MDS, a bone marrow examination (collection of bone marrow cells) is performed on patients with cytopenia to prove dysplasia in bone marrow cells, and then other diseases that can cause dysplasia (vitamin B12 deficiency and alcohol). Sexual hematopoietic disorders, etc.) need to be excluded. However, the proof of dysplasia depends on the subjectivity of the observer and has the drawback of poor reproducibility. In addition, normal elderly people may also have certain dysplasias, which often makes diagnosis difficult.
ＭＤＳの検査所見は多様である。骨髄で芽球が５％を超えている場合や、環状鉄芽球と呼ばれる特徴的な細胞が骨髄で証明できる場合は、診断は容易である。しかしＭＤＳの半数前後は、芽球が５％未満（以下、「低グレードＭＤＳ」と言う）であり、さらに環状鉄芽球も認めない。また、Ｇ分染法による骨髄細胞の染色体分析（以下、「染色体分析」と言う）で、ＭＤＳに特徴的な異常を認める場合も診断は容易であるが、こうした異常は低グレードＭＤＳの３０％前後の患者に見られるにすぎない。 Laboratory findings of MDS are diverse. Diagnosis is easy if the bone marrow has more than 5% blasts or if characteristic cells called cyclic sideroblasts can be demonstrated in the bone marrow. However, about half of MDS has less than 5% blasts (hereinafter referred to as "low grade MDS"), and no cyclic sideroblasts are also observed. In addition, it is easy to diagnose when abnormalities characteristic of MDS are found by chromosomal analysis of bone marrow cells by G banding (hereinafter referred to as "chromosomal analysis"), but these abnormalities are 30% of low-grade MDS. It is only seen in patients before and after.
フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ＦＣＭ）は、細胞の表面蛋白の発現などの特徴を解析する方法であり、急性白血病や悪性リンパ腫などの診断に用いられている。本発明者を含むいくつかのグループが、ＦＣＭをＭＤＳの診断に用いる試みを行っている（特許文献１及び２、非特許文献１及び２）。しかしＦＣＭを用いる場合でも、芽球が多いＭＤＳであれば診断は容易であるが、低グレードＭＤＳの場合は確度の高い診断は難しい。既知のＦＣＭパラメーターでは、単独では診断感度が低く、一方、数多くのＦＣＭパラメーターを併用すると特異度が低下するという欠点がある。
Flow cytometry (FCM) is a method for analyzing features such as expression of surface proteins in cells, and is used for diagnosis of acute leukemia and malignant lymphoma. Several groups, including the present inventor, have attempted to use FCM for the diagnosis of MDS (
本発明は、診断感度と特異度に優れ、かつ簡便なＭＤＳの新規な診断方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a new diagnostic method for MDS, which is excellent in diagnostic sensitivity and specificity and is simple.
上記課題を解決するために鋭意検討し、発明者らは、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がＭＤＳ診断の新規なパラメーターとして有用であることを見出した。さらに、このパラメーターを既知のパラメーターと組み合わせることで、より感度の高い診断が可能となることを見出した。 After diligent studies to solve the above problems, the inventors have found that the CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells is useful as a novel parameter for MDS diagnosis. Furthermore, it was found that by combining this parameter with a known parameter, more sensitive diagnosis becomes possible.
すなわち、本発明は以下の（１）〜（８）に関する。
（１）被験者から単離された骨髄液における、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比を指標として、前記被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する方法。
（２）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満である場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、（１）に記載の方法であって、前記カットオフ値が１．５〜３．５である方法。
（３）さらに、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現から選ばれるいずれか１又は２以上を指標として、骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価することを特徴とする、（１）に記載の方法。
（４）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満であり、かつ、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現のうち２つ以上の指標に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とし、前記カットオフ値が１．５〜３．５である、（１）に記載の方法。
（５）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比がカットオフ値未満であり、かつ、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率及び／又は顆粒球のＳＳＣの指標に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とし、前記カットオフ値が１．５〜３．５である、（１）に記載の方法。
（６）顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率、顆粒球のＳＳＣ、及びＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現をそれぞれ点数化し、その合計値によって被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する（１）に記載の方法：例えば、
１）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は１．５〜３．５である；
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」がカットオフ値以上である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は２〜３である；
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が第１のカットオフ値未満である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は１〜３であり、前記第２のカットオフ値は４〜８である；
４）「顆粒球のＳＳＣ」がカットオフ値未満である場合に２ポイント、但し前記カットオフ値は６〜７である；
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が第１のカットオフ値以上である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は６〜８であり、前記第２のカットオフ値は４〜６である；
とした場合に、その総計が７ポイント以上か、総計が５〜６ポイントでＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常が認められるか、あるいは総計が４ポイント以下で顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、（１）に記載の方法。
（７）フローサイトメトリー又はイメージングサイトメトリーを用いて各指標の測定が行われる、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）抗ＣＤ３４抗体、抗ＣＤ３３抗体、及び抗ＣＤ４５抗体を含む、骨髄異形成症候群の診断用キット。That is, the present invention relates to the following (1) to (8).
(1) A method for evaluating the susceptibility to myelodysplastic syndrome of the subject using the CD33 expression level ratio of granulocytes and CD34-positive cells in the bone marrow fluid isolated from the subject as an index.
(2) When the CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells is less than the cutoff value, the subject is evaluated as having a high possibility of suffering from myelodysplastic syndrome (1). ), The method in which the cutoff value is 1.5 to 3.5.
(3) Further, myelodysplastic syndrome is indexed by any one or more selected from the CD34-positive myeloblast ratio, the CD34-positive immature B cell ratio, the granulocyte SSC, and the CD45 expression of the CD34-positive myeloblast. The method according to (1), which comprises evaluating the susceptibility to morbidity.
(4) The CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells is less than the cut-off value, and the ratio of CD34-positive myeloblasts, the ratio of CD34-positive immature B cells, the SSC of granulocytes, and CD34-positive myeloblasts. When two or more indicators of CD45 expression are abnormal, the subject is evaluated as having a high possibility of suffering from myelodysplastic syndrome, and the cutoff value is 1.5 to 3. The method according to (1), which is 5.5.
(5) When the CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells is less than the cutoff value, and abnormalities are observed in the CD34-positive myeloblast ratio and / or the SSC index of granulocytes, the subject is bone marrow. The method according to (1), wherein the cutoff value is 1.5 to 3.5, which comprises evaluating that the possibility of suffering from dysplasia syndrome is high.
(6) The CD33 expression level ratio of granulocytes and CD34-positive cells, the CD34-positive myeloblast ratio, the CD34-positive immature B cell ratio, the SSC of granulocytes, and the CD45 expression of CD34-positive myeloblasts were scored and totaled. The method according to (1) for assessing a subject's likelihood of myelodysplastic syndrome by value: eg,
1) 3 points when the "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" is less than the cutoff value, except that the cutoff value is 1.5 to 3.5;
2) 3 points when the "CD34-positive myeloblast ratio" is greater than or equal to the cutoff value, except that the cutoff value is 2-3;
3) 2 points when the "CD34-positive immature B cell ratio" is less than the first cutoff value, 1 point when it is less than the second cutoff value, except that the first cutoff value is 1 to 3 and the second cutoff value is 4-8;
4) 2 points when "SSC of granulocytes" is less than the cutoff value, except that the cutoff value is 6-7;
5) 2 points when "CD45 expression of CD34-positive myeloblasts" is greater than or equal to the first cutoff value, 1 point when it is less than the second cutoff value, except that the first cutoff value is 6 to 8 and the second cutoff value is 4 to 6;
If the total is 7 points or more, or the total is 5 to 6 points, abnormalities are observed in the CD34-positive myeloblast ratio or the SSC of granulocytes, or the total is 4 points or less and the granulocytes and CD34 are positive. The method according to (1), wherein the subject is evaluated as having a high possibility of suffering from myelodysplastic syndrome when an abnormality is observed in the CD33 expression level ratio of the cells.
(7) The method according to any one of (1) to (6), wherein each index is measured using flow cytometry or imaging cytometry.
(8) A diagnostic kit for myelodysplastic syndrome, which comprises an anti-CD34 antibody, an anti-CD33 antibody, and an anti-CD45 antibody.
本発明の方法は、診断感度と特異度に優れ、４つのパラメーターを用いた従来の診断方法よりも簡便にＭＤＳを鑑別診断することができる。また、本発明の方法は、従来のパラメーターと組合せることで、より高い特異度でＭＤＳを鑑別診断することができ、それゆえ従来診断が困難であった低グレードのＭＤＳの診断にも適用できる。 The method of the present invention is excellent in diagnostic sensitivity and specificity, and can make a differential diagnosis of MDS more easily than a conventional diagnostic method using four parameters. In addition, the method of the present invention can be applied to the diagnosis of low-grade MDS, which has been difficult to diagnose in the past, because MDS can be differentially diagnosed with higher specificity by combining with the conventional parameters. ..
１．骨髄異形成症候群
本発明の診断対象となる「骨髄異形成症候群」とは、腫瘍化した造血細胞が骨髄中で増殖する、造血器悪性腫瘍の一つであり、血球形成の異常（異形成）と血球減少を認めることからこの名称が用いられる。ＭＤＳはしばしば急性骨髄性白血病に移行する（骨髄芽球が２０％を超えると急性骨髄性白血病と診断されることが提案されている）ため、前白血病状態と呼ばれることもある。1. 1. Myelodysplastic Syndrome The "myelodysplastic syndrome" to be diagnosed in the present invention is one of the hematopoietic malignant tumors in which tumorized hematopoietic cells proliferate in the bone marrow, and abnormal blood cell formation (dysplasia). This name is used because of the decrease in blood cells. MDS often progresses to acute myeloid leukemia (it has been proposed that a diagnosis of acute myeloid leukemia occurs when myeloblasts exceed 20%), so it is sometimes referred to as a pre-leukemic state.
ＭＤＳは、骨髄と芽球の割合等により、不応性貧血、鉄芽球性不応性貧血、多血球系異形成を伴う不応性血球減少症、多血球異形成を伴う鉄芽球性不応性貧血、芽球増加型不応性貧血、５ｑ−症候群、分類不能型骨髄異形成症候群に分類することができる。特記しない限り、本発明においてＭＤＳと言う場合にはこれらのすべてが含まれる。 MDS is classified into refractory anemia, iron blast refractory anemia, refractory anemia with polycytic dysplasia, and iron blast refractory anemia with polycytic dysplasia, depending on the ratio of bone marrow to blast. , Precursor-increasing refractory anemia, 5q-syndrome, and unclassifiable myelodysplastic syndrome. Unless otherwise specified, the term MDS in the present invention includes all of these.
骨髄異形症候群の診断には、末梢血と骨髄の芽球比率、骨髄細胞の異形成のほか、遺伝子異常、ゲノム解析、フローサイトメトリーによる診断が利用されているが、従来の方法では、ＭＤＳ、とくに芽球が５％未満の低グレードＭＤＳを、良性血球減少等と高い感度と特異性で鑑別診断することは困難である。 For the diagnosis of myelodysplastic syndrome, in addition to peripheral blood and bone marrow precursor cell ratio and bone marrow cell dysplasia, diagnosis by genetic abnormality, genome analysis, and flow cytometry is used. In particular, it is difficult to differentially diagnose low-grade MDS with less than 5% precursor cells with high sensitivity and specificity, such as benign blood cell depletion.
２ 検体・試料（骨髄液、骨髄細胞）
本発明で使用される検体（試料）は、被験者、すなわち骨髄異形成症候群の罹患可能性がある対象の骨髄液である。骨髄液は、常法にしたがい骨髄穿刺により採取し、必要であれば適当量の抗凝固剤を加え、緩衝液あるいは培地で希釈する。１回の測定に必要な骨髄液は、少なくとも０．５〜１ｍｌ、好ましくは１ｍｌ〜２ｍｌである。採取した骨髄液は、有核細胞の数をカウントし、好ましくは１試験管あたり１０〜５０万個となるように測定用サンプルを調製する。2 Specimens / samples (bone marrow fluid, bone marrow cells)
The sample used in the present invention is a subject, that is, the bone marrow fluid of a subject who may be affected by myelodysplastic syndrome. Bone marrow fluid is collected by bone marrow aspiration according to a conventional method, and if necessary, an appropriate amount of anticoagulant is added and diluted with a buffer solution or a medium. The amount of bone marrow fluid required for one measurement is at least 0.5 to 1 ml, preferably 1 ml to 2 ml. For the collected bone marrow fluid, the number of nucleated cells is counted, and a measurement sample is prepared so that the number is preferably 100,000 to 500,000 per test tube.
３ 測定対象・測定方法
３．１ 新規パラメーター
本発明では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を指標（パラメーター）とすることで、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）を診断する。3 Measurement target / Measurement method 3.1 New parameters In the present invention, myelodysplastic syndrome (MDS) is diagnosed by using the “CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells” as an index (parameter).
「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」は、たとえば、以下の手順で測定することができる（図１）。
１）骨髄液サンプルから細胞の破片を除いた全有核細胞をＦＳＣとＳＳＣで展開し、この細胞全体をゲーティングする（Ｇａｔｅ １）。ここで、ＦＳＣ（前方散乱：Ｆｏｒｗａｒｄ Ｓｃａｔｔｅｒ）は細胞の大きさを、ＳＳＣ（側方散乱：Ｓｉｄｅ Ｓｃａｔｔｅｒ）は細胞内の複雑さを示す。
２）（Ｇａｔｅ １）の細胞のうち、ＳＳＣ低値の細胞群をゲーティングする（Ｇａｔｅ ２）。
３）（Ｇａｔｅ ２）の細胞をＣＤ４５とＣＤ３４で展開し、ＣＤ３４陽性細胞画分をゲーティングする（Ｇａｔｅ ３）。ＣＤ３４陽性細胞は、コントロール染色を用いるなどして、特定することができる。
４）（Ｇａｔｅ ３）の細胞のＣＤ３３発現を解析し、ＣＤ３３発現が０未満のもの（細胞ではない小粒子）を除外し、細胞のみをゲーティングする（Ｇａｔｅ ４）。
５）（Ｇａｔｅ ４）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性細胞をゲーティングする（Ｇａｔｅ ５）。
６）（Ｇａｔｅ ４）の細胞（赤）と（Ｇａｔｅ ５）の細胞（青）を重ねて表示し、ＳＳＣ低値かつＣＤ４５比較的低値の細胞集団をゲーティングする（Ｇａｔｅ ６）。
７）（Ｇａｔｅ ４）の細胞から（Ｇａｔｅ ６）の細胞を除いた細胞集団をゲーティングする（Ｇａｔｅ ７）。
８）（Ｇａｔｅ １）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、リンパ球集団をゲーティングする（Ｇａｔｅ ８）。
９）（Ｇａｔｅ ８）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性の集団をケーティングする（Ｇａｔｅ ９）。
１０）（Ｇａｔｅ １）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ ４）をバックゲートし、これを参考にしながら、未熟細胞が混入しないように、成熟顆粒球をゲーティングする（Ｇａｔｅ １０）。
１１）（Ｇａｔｅ １０）の細胞のＳＳＣのＭｏｄｅ値を求め、このＭｏｄｅ値以下のＳＳＣを示す顆粒球をゲーティングする（Ｇａｔｅ １１）。なお、Ｍｏｄｅ値とは、データの中でもっとも多く存在する値で、通常のＦＣＭ解析プログラムを用いて求めることができる。フローサイトメトリーの場合、Ｍｏｄｅ値はピーク値を示し、平均値より異常データの影響を受けない。The "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" can be measured, for example, by the following procedure (FIG. 1).
1) All nucleated cells from which cell debris has been removed from the bone marrow fluid sample are developed by FSC and SSC, and the entire cells are gated (Gate 1). Here, FSC (forward scatter: Forward Scatter) indicates the size of the cell, and SSC (side scatter: Side Scatter) indicates the complexity inside the cell.
2) Among the cells of (Gate 1), the cell group having a low SSC value is gated (Gate 2).
3) The cells of (Gate 2) are developed on CD45 and CD34, and the CD34-positive cell fraction is gated (Gate 3). CD34-positive cells can be identified, such as by using control staining.
4) The CD33 expression of the cells of (Gate 3) is analyzed, those having a CD33 expression of less than 0 (small particles that are not cells) are excluded, and only the cells are gated (Gate 4).
5) The cells of (Gate 4) are developed with CD33 expression and SSC, and the CD33 negative cells are gated (Gate 5).
6) The cells (red) of (Gate 4) and the cells (blue) of (Gate 5) are displayed in an overlapping manner, and a cell population having a low SSC value and a relatively low CD45 value is gated (Gate 6).
7) The cell population obtained by removing the cells of (Gate 6) from the cells of (Gate 4) is gated (Gate 7).
8) The cells of (Gate 1) are developed with CD45 expression and SSC to gate the lymphocyte population (Gate 8).
9) The cells of (Gate 8) are developed with CD33 expression and SSC and the CD33 negative population is categorized (Gate 9).
10) Expand cells of (Gate 1) with CD45 expression and SSC, backgate CD34-positive cells (Gate 4), and gate mature granulocytes so that immature cells are not contaminated with reference to this. (Gate 10).
11) The Mode value of the SSC of the cells of (Gate 10) is obtained, and granulocytes showing an SSC equal to or lower than this Mode value are gated (Gate 11). The Mode value is the most abundant value in the data and can be obtained by using a normal FCM analysis program. In the case of flow cytometry, the Mode value shows a peak value and is less affected by abnormal data than the average value.
「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」は、たとえば、上記のようにゲーティングされた細胞から、「（Ｇａｔｅ １１）細胞のＣＤ３３発現量÷（Ｇａｔｅ ４）細胞のＣＤ３３発現量」として求めることができる（発現量は幾何平均）。 The "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" is, for example, "CD33 expression level of (Gate 11) cells ÷ CD33 expression level of (Gate 4) cells" from the cells gated as described above. It can be determined (expression level is geometric mean).
３．２ 従来のパラメーター
従来のＭＤＳの診断方法では、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」、「顆粒球のＳＳＣ」、及び「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」を指標（パラメーター）として診断を行う。本発明はこれらのパラメーターに、新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を組み合せて用いることで、さらにその感度と特異性を向上させることができる。3.2 Conventional parameters In the conventional diagnostic method of MDS, "CD34-positive myeloblast ratio", "CD34-positive immature B cell ratio", "granulocyte SSC", and "CD34-positive myeloblast CD45 expression" Is used as an index (parameter) for diagnosis. The present invention can further improve its sensitivity and specificity by using these parameters in combination with the novel parameter "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells".
上記各パラメーターは、たとえば、上述のようにゲーティングされた細胞から、次のようにして求めることができる。
「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」は、「（Ｇａｔｅ ７）細胞数／（Ｇａｔｅ １）細胞数」として求めることができる。
「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」は、「（Ｇａｔｅ ６）細胞数／（Ｇａｔｅ ４）細胞」として求めることができる。
「顆粒球のＳＳＣ」は、「（Ｇａｔｅ １０）の細胞のＭｏｄｅ値／（Ｇａｔｅ ９）細胞のＭｏｄｅ値」として求めることができる。
「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」は、「（Ｇａｔｅ ９）細胞のＣＤ４５発現量／（Ｇａｔｅ ７）細胞のＣＤ４５発現量」として求めることができる（発現量は幾何平均）。Each of the above parameters can be obtained, for example, from the cells gated as described above as follows.
The "CD34-positive myeloblast ratio" can be determined as "(Gate 7) number of cells / (Gate 1) number of cells".
The "CD34-positive immature B cell ratio" can be determined as "(Gate 6) number of cells / (Gate 4) cells".
The "SSC of granulocytes" can be obtained as "the Mode value of (Gate 10) cells / the Mode value of (Gate 9) cells".
"CD45 expression of CD34-positive myeloblasts" can be determined as "CD45 expression level of (Gate 9) cells / CD45 expression level of (Gate 7) cells" (expression level is geometric mean).
３．３ 測定手段
本発明において、各種パラメーターの測定は、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ３３抗原に特異的な抗体を使用して、フローサイトメトリーにより測定することができる。フローサイトメトリーは、流体に懸濁させた細胞を１個ずつセンシングゾーンに導き、その単一の流れにおいて、蛍光や散乱光を測定することで、多量の細胞を短時間に１個ずつ定量解析できる細胞測定法である。3.3 Measuring means In the present invention, various parameters can be measured by flow cytometry using an antibody specific for the CD34, CD45, and CD33 antigens. Flow cytometry guides cells suspended in a fluid to the sensing zone one by one, and measures fluorescence and scattered light in that single flow to quantitatively analyze a large number of cells one by one in a short time. It is a possible cell measurement method.
フローサイトメトリーに代えて、イメージングサイトメトリーを用いて測定することもできる。イメージングサイトメトリーは、マルチウェルプレートやスライドグラス上の細胞を、レーザー走査して、その蛍光イメージや散乱光・透過光イメージを取得し、画像処理することにより、多量の細胞を短時間に１個ずつ定量解析できる細胞測定法である。 Instead of flow cytometry, imaging cytometry can be used for measurement. Imaging cytometry scans cells on a multi-well plate or slide glass with a laser, acquires the fluorescence image, scattered light / transmitted light image, and performs image processing to produce one large number of cells in a short time. It is a cell measurement method that can be quantitatively analyzed one by one.
４．診断方法（罹患可能性の評価方法）
本発明では、新規パラメーターを用いた４つの診断方法（ＭＤＳの罹患可能性の評価方法）を提供する。
（１）方法１：新規パラメーターによる診断
方法１では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を指標として被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。
例えば、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」の値がカットオフ値未満である場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。カットオフ値は、目的とする感度と特異度によって設定できるが、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」の場合、通常１．５〜３．５の範囲にある（すなわち１．５〜３．５以上を正常と判断する）。後述する実施例では、前記カットオフ値を２．２として評価を行った。4. Diagnostic method (evaluation method of morbidity)
The present invention provides four diagnostic methods (methods for evaluating the susceptibility to MDS) using novel parameters.
(1) Method 1: Diagnosis using new parameters In
For example, if the value of "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" is less than the cutoff value, the subject is evaluated to be highly likely to have myelodysplastic syndrome. The cutoff value can be set according to the desired sensitivity and specificity, but in the case of "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells", it is usually in the range of 1.5 to 3.5 (that is, 1.5). ~ 3.5 or more is judged to be normal). In the examples described later, the evaluation was performed with the cutoff value set to 2.2.
（２）方法２：新規パラメーターと従来のパラメーターの併用による診断（１）
方法２では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」、「顆粒球のＳＳＣ」、及び「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」から選ばれるいずれか１又は２以上と組み合わせて被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。これにより、感度、診断特異度を向上させることができる。(2) Method 2: Diagnosis by using new parameters and conventional parameters together (1)
In
たとえば、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満であり、かつ、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」、「顆粒球のＳＳＣ」、及び「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」の２つ以上に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。 For example, the "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" is less than the cutoff value, and the "CD34-positive myeloblast ratio", "CD34-positive immature B cell ratio", "Granulocyte SSC", And, if two or more abnormalities of "CD45 expression of CD34-positive myeloblasts" are observed, the subject is evaluated to be highly likely to have myelodysplastic syndrome.
ここで、「異常が認められる」とは、各パラメーターがカットオフ値を逸脱した値を示すことを意味する（Ｏｇａｔａ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９４（８），１０６６−１０７４，２００９参照）。カットオフ値は、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」の場合、通常２〜３の範囲にあり（２〜３未満を正常とする）、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」の場合は通常５〜８の範囲にある（５〜８以上を正常とする）。後者の場合、さらに厳しいカットオフ値は通常１〜３であり、この厳しいカットオフ値は、骨髄異形成症候群の罹患可能性の評価をする上で、より特異性が高いが、逆に感度は低くなる。「顆粒球のＳＳＣ」の場合、通常６〜７の範囲にあり（６〜７以上を正常とする）、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」の場合、通常４〜８の範囲にある（このパラメーターについては、この範囲内を正常とする）。 Here, "abnormality is observed" means that each parameter indicates a value that deviates from the cutoff value (see Ogata K. et al., Haematologica. 94 (8), 1066-1074, 2009). .. The cutoff value is usually in the range of 2-3 for the "CD34-positive myeloblast ratio" (less than 2-3 is normal) and usually 5-8 for the "CD34-positive immature B cell ratio". It is in the range of (5 to 8 or more is normal). In the latter case, the more stringent cutoff value is usually 1-3, which is more specific in assessing the likelihood of myelodysplastic syndrome, but conversely the sensitivity. It gets lower. In the case of "SSC of granulocytes", it is usually in the range of 6 to 7 (6 to 7 or more is normal), and in the case of "CD45 expression of CD34-positive myeloblasts", it is usually in the range of 4 to 8 (usually in the range of 4 to 8). For this parameter, this range is normal).
たとえば、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」であれば、２．３以上を示す場合、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」であれば、５未満を示す場合、「顆粒球のＳＳＣ」であれば、７未満を示す場合、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」であれば、７．７以上あるいは５未満を示す場合には、「異常が認められる」と判断できる。 For example, if the "CD34-positive myeloblast ratio" indicates 2.3 or more, the "CD34-positive immature B cell ratio" indicates less than 5, and the "granulocyte SSC" indicates. If it indicates less than 7, it can be judged that "abnormality is observed" if it indicates "CD45 expression of CD34-positive myeloblasts" and if it indicates 7.7 or more or less than 5.
（３）方法３：新規パラメーターと従来のパラメーターの併用による診断（２）
方法３では、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」及び／又は「顆粒球のＳＳＣ」と組み合わせて被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。
例えば、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満であり、かつ、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」及び／又は「顆粒球のＳＳＣ」に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。なお、「異常が認められる」とは、上記（２）に記載したとおりの意味である。(3) Method 3: Diagnosis by using new parameters and conventional parameters together (2)
In
For example, when the "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" is less than the cutoff value, and abnormalities are observed in the "CD34-positive myeloblast ratio" and / or "SSC of granulocytes". Subjects are assessed as likely to have myelodysplastic syndrome. In addition, "abnormality is recognized" has the meaning as described in (2) above.
（４）方法４：新規パラメーターと従来のパラメーターの併用による診断（３）
方法４では、新規パラメーターと従来のパラメーターをそれぞれ測定し、その結果を点数化したうえで、被験者の骨髄異形成症候群の罹患可能性を評価する。(4) Method 4: Diagnosis by using new parameters and conventional parameters together (3)
In
点数化は、前記カットオフ値からの逸脱と骨髄異形成症候群との相関を加味して、たとえば次のように決定される。したがって、骨髄異形成症候群との相関による重みづけとの関係で、下記のカットオフ値は前述した正常値を示すカットオフ値とは完全に一致してはいない。
１）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」がカットオフ値未満である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は１．５〜３．５である；
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」がカットオフ値以上である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は２〜３である；
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が第１のカットオフ値未満である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は１〜３であり、前記第２のカットオフ値は４〜８である；
４）「顆粒球のＳＳＣ」がカットオフ値未満である場合に２ポイント、但し前記カットオフ値は６〜７である；
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が第１のカットオフ値以上である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は６〜８であり、前記第２のカットオフ値は４〜６である。The scoring is determined, for example, as follows, taking into account the correlation between the deviation from the cutoff value and myelodysplastic syndrome. Therefore, in relation to the weighting by correlation with myelodysplastic syndrome, the following cutoff values do not completely match the above-mentioned cutoff values indicating normal values.
1) 3 points when the "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" is less than the cutoff value, except that the cutoff value is 1.5 to 3.5;
2) 3 points when the "CD34-positive myeloblast ratio" is greater than or equal to the cutoff value, except that the cutoff value is 2-3;
3) 2 points when the "CD34-positive immature B cell ratio" is less than the first cutoff value, 1 point when it is less than the second cutoff value, except that the first cutoff value is 1 to 3 and the second cutoff value is 4-8;
4) 2 points when "SSC of granulocytes" is less than the cutoff value, except that the cutoff value is 6-7;
5) 2 points when "CD45 expression of CD34-positive myeloblasts" is greater than or equal to the first cutoff value, 1 point when it is less than the second cutoff value, except that the first cutoff value is It is 6 to 8, and the second cutoff value is 4 to 6.
一例として、後述する実施例で使用した点数化を以下に示す。
１）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」が２．２未満である場合に３ポイント、
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」が２．３以上である場合に３ポイント、
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が２未満である場合に２ポイント、５未満である場合に１ポイント、
４）「顆粒球のＳＳＣ」が７未満である場合に２ポイント、
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が７．７以上である場合に２ポイント、５未満である場合に１ポイント。As an example, the scoring used in the examples described later is shown below.
1) 3 points when the "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" is less than 2.2,
2) 3 points when the "CD34-positive myeloblast ratio" is 2.3 or more,
3) 2 points when the "CD34-positive immature B cell ratio" is less than 2, 1 point when it is less than 5.
4) 2 points when "SSC of granulocytes" is less than 7.
5) 2 points when "CD45 expression of CD34-positive myeloblasts" is 7.7 or more, and 1 point when it is less than 5.
骨髄異形成症候群の罹患可能性は、たとえば、上記点数の総計が７ポイント以上か、総計が５〜６ポイントでＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常が認められるか、あるいは総計が４ポイント以下で顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価する。 The possibility of developing myelodysplastic syndrome is, for example, whether the total of the above scores is 7 points or more, the total is 5 to 6 points, and the CD34-positive myeloblast ratio or the SSC of granulocytes is abnormal, or the total is If the CD33 expression level ratio of granulocytes and CD34-positive cells is abnormal at 4 points or less, the subject is evaluated to be highly likely to have myelodysplastic syndrome.
５．診断用試薬・キット
本発明は、上記した骨髄異形成症候群の診断用キットも提供する。本発明のキットは、（ｉ）抗ＣＤ４５抗体、（ｉｉ）抗ＣＤ３３抗体、及び（ｉｉｉ）ＣＤ３４抗体を必須の構成要素とする。これらの抗体は適当な蛍光色素等で標識されていてもよい。5. Diagnostic Reagents / Kits The present invention also provides the above-mentioned diagnostic kits for myelodysplastic syndrome. The kit of the present invention comprises (i) anti-CD45 antibody, (ii) anti-CD33 antibody, and (iii) CD34 antibody as essential components. These antibodies may be labeled with a suitable fluorescent dye or the like.
また、本発明のキットは、上記した構成要素のほか、測定に必要な各種試薬、二次抗体、基質溶液、説明書等を含んでいてもよい。 In addition to the above-mentioned components, the kit of the present invention may include various reagents, secondary antibodies, substrate solutions, instructions, and the like necessary for measurement.
６．診断システム、解析ソフト
本発明の診断方法は、その全部または一部を自動化することが可能であり、本発明は、そのような骨髄異形成症候群の診断システム、前記システムのための診断解析ソフトも提供する。6. Diagnostic system, analysis software The diagnostic method of the present invention can be automated in whole or in part, and the present invention also includes a diagnostic system for such myelodysplastic syndrome, diagnostic analysis software for the system. provide.
本発明の診断システムは、骨髄異形成症候群の診断用システムであって、フローサイトメトリー及びコンピュータを含み、下記の１）〜１２）の手段、あるいは所望によりさらに１３）の手段を実行する。
１）骨髄液サンプルから細胞の破片を除いた全有核細胞をＦＳＣとＳＳＣで展開し、この細胞全体をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ １）。
２）（Ｇａｔｅ １）の細胞のうち、ＳＳＣ低値の細胞群をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ ２）。
３）（Ｇａｔｅ ２）の細胞をＣＤ４５とＣＤ３４で展開し、ＣＤ３４陽性細胞画分をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ ３）。
４）（Ｇａｔｅ ３）の細胞のＣＤ３３発現を解析し、ＣＤ３３発現が０未満のもの（細胞ではない小粒子）を除外し、細胞のみをゲーティングする手段（Ｇａｔｅ ４）。
５）（Ｇａｔｅ ４）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性細胞をケーティングする手段（Ｇａｔｅ ５）。
６）（Ｇａｔｅ ４）の細胞（赤）と（Ｇａｔｅ ５）の細胞（青）から、ＳＳＣ低値かつＣＤ４５比較的低値の細胞集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ ６）。
７）（Ｇａｔｅ ４）の細胞から（Ｇａｔｅ ６）の細胞を除いた細胞集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ ７）。
８）（Ｇａｔｅ １）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、リンパ球集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ ８）。
９）（Ｇａｔｅ ８）の細胞をＣＤ３３発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３３陰性の集団をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ ９）。
１０）（Ｇａｔｅ １）の細胞をＣＤ４５発現とＳＳＣで展開し、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ ４）をバックゲートし、これを参考にしながら、未熟細胞が混入しないように、成熟顆粒球をケーティングする手段（Ｇａｔｅ １０）。
１１）（Ｇａｔｅ １０）の細胞のＳＳＣのＭｏｄｅ値を求め、このＭｏｄｅ値以下のＳＳＣを示す顆粒球をゲーティングする手段（Ｇａｔｅ １１）。
１２）「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を「（Ｇａｔｅ １１）細胞のＣＤ３３発現量／（Ｇａｔｅ ４）細胞のＣＤ３３発現量」として計算する手段。
１３）所望により、さらに「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」＝「（Ｇａｔｅ ７）細胞数／（Ｇａｔｅ １）細胞数」、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」＝「（Ｇａｔｅ ６）細胞数／（Ｇａｔｅ ４）細胞数」、「顆粒球のＳＳＣ」＝「（Ｇａｔｅ １０）の細胞のＭｏｄｅ値／（Ｇａｔｅ ９）細胞のＭｏｄｅ値」、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」＝「（Ｇａｔｅ ９）細胞のＣＤ４５発現量／（Ｇａｔｅ ７）細胞のＣＤ４５発現量」のうち１又は２以上を計算する手段（発現量は幾何平均）。The diagnostic system of the present invention is a diagnostic system for myelodysplastic syndrome, which includes flow cytometry and a computer, and carries out the means 1) to 12) below, or 13) more if desired.
1) A means for developing all nucleated cells obtained by removing cell debris from a bone marrow fluid sample with FSC and SSC and gating the entire cells (Gate 1).
2) A means for gating a cell group having a low SSC value among the cells of (Gate 1) (Gate 2).
3) A means (Gate 3) in which the cells of (Gate 2) are expanded on CD45 and CD34 and the CD34-positive cell fraction is gated.
4) A means for analyzing the CD33 expression of cells of (Gate 3), excluding those having a CD33 expression of less than 0 (small particles that are not cells), and gating only the cells (Gate 4).
5) A means for developing cells of (Gate 4) with CD33 expression and SSC and categorizing CD33-negative cells (Gate 5).
6) A means for gating a cell population having a low SSC value and a relatively low CD45 value from the cells (red) of (Gate 4) and the cells (blue) of (Gate 5) (Gate 6).
7) A means for gating a cell population obtained by removing the cells of (Gate 6) from the cells of (Gate 4) (Gate 7).
8) A means for developing cells of (Gate 1) with CD45 expression and SSC to gate a lymphocyte population (Gate 8).
9) A means for developing cells of (Gate 8) with CD33 expression and SSC and gating a CD33-negative population (Gate 9).
10) Develop cells of (Gate 1) with CD45 expression and SSC, backgate CD34-positive cells (Gate 4), and categorize mature granulocytes so that immature cells are not contaminated with reference to this. Means (Gate 10).
11) A means for obtaining a Mode value of SSC of cells of (Gate 10) and gating granulocytes showing SSC equal to or lower than this Mode value (Gate 11).
12) A means for calculating the "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" as "CD33 expression level of (Gate 11) cells / CD33 expression level of (Gate 4) cells".
13) If desired, further "CD34-positive myeloblast ratio" = "(Gate 7) number of cells / (Gate 1) cell number", "CD34-positive immature B cell ratio" = "(Gate 6) number of cells / (Gate 6)" 4) Number of cells ”,“ SSC of granulocytes ”=“ Mode value of (Gate 10) cells / Mode value of (Gate 9) cells ”,“ CD45 expression of CD34-positive myeloblasts ”=“ (Gate 9) A means for calculating 1 or 2 or more of "CD45 expression level of cells / (Gate 7) cell CD45 expression level" (expression level is geometric average).
本発明の解析ソフトウェアは、本発明のシステム（フローサイトメトリー及びコンピュータ）に、上記１）〜１２）の手段、あるいは所望によりさらに１３）の手段を実行させるためのプログラムを含む。 The analysis software of the present invention includes a program for causing the system (flow cytometry and computer) of the present invention to execute the means of 1) to 12) above, or 13) if desired.
７．骨髄異形成症候群の治療戦略
本発明は、ＭＤＳの診断、とくに低グレードのＭＤＳと良性血球減少等との鑑別診断を可能とする。本発明は、ＭＤＳの診断に加えて、ＭＤＳの予後予測、治療の効果予測、治療効果の判定等にも利用できる。7. Therapeutic Strategy for Myelodysplastic Syndrome The present invention enables the diagnosis of MDS, especially the differential diagnosis between low-grade MDS and benign cytopenia. The present invention can be used not only for diagnosing MDS, but also for predicting the prognosis of MDS, predicting the effect of treatment, determining the effect of treatment, and the like.
本発明の方法（診断方法）、キット、あるいはシステム（解析ソフト）を使用することで、被験者のＭＤＳの罹患可能性を評価し、被験者がＭＤＳである可能性が高いと判定された被験者には、適切な治療方法を決定し、その治療効果や予後を判定・予測することができるという一連の治療戦略が提供される。そのような、診断を含むＭＤＳの治療方法も、本発明の対象である。 By using the method (diagnosis method), kit, or system (analysis software) of the present invention, the subject's likelihood of MDS is evaluated, and the subject is determined to have a high possibility of having MDS. , A series of treatment strategies are provided in which an appropriate treatment method can be determined and the treatment effect and prognosis can be determined and predicted. Such methods of treating MDS, including diagnosis, are also the subject of the present invention.
ＭＤＳの治療方法としては、エリスロポイエチン、アザシチジン（ビターザ）、レナリドミド（レブラリド）の投与のほか、シタラビンなどの抗がん剤投与、シクロスポリンなどの免疫抑制剤投与、あるいは造血幹細胞移植が挙げられる。 Examples of the therapeutic method for MDS include administration of erythropoietin, azacitidine (bitaza), and lenalidomide (levralide), administration of an anticancer drug such as cytarabine, administration of an immunosuppressive drug such as cyclosporine, and hematopoietic stem cell transplantation.
以下、実施例により本発明について具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
１．方法と材料
（Ｉ）細胞の準備
１）骨髄穿刺で、ヘパリン入りのシリンジに骨髄液を吸引する。
２）有核細胞をカウントし、試験管あたり１０−５０万個の細胞を、２本の試験管に分注する。
３）ＣＤ４５−ＰｅｒＣＰ，ＣＤ３３−ＰＥ，ＣＤ３４−ＡＰＣ（それぞれ、蛍光標識されたヒトＣＤ４５、ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ３４に対するモノクローナル抗体）で１５−３０分間染色する。
４）溶血剤を作用させ、赤血球を溶血させる。
５）リン酸緩衝液に浮遊させる。
６）フローサイトメトリー（ＦＣＭ）で解析する。1. 1. Method and material (I) Preparation of cells 1) By bone marrow aspiration, aspirate bone marrow fluid into a syringe containing heparin.
2) Count nucleated cells and dispense 100-500,000 cells per tube into two tubes.
3) Stain with CD45-PerCP, CD33-PE, CD34-APC (monoclonal antibodies against fluorescently labeled human CD45, human CD33, and human CD34, respectively) for 15-30 minutes.
4) The hemolytic agent is allowed to act to hemolyze the red blood cells.
5) Float in phosphate buffer.
6) Analyze by flow cytometry (FCM).
（ＩＩ）ＦＣＭ解析
１）細胞集団のゲーティング
ＦＣＭ解析では、細胞集団をゲーティングして抗原発現などのパラメーターを解析する。本実施例では、図１に示した方法で１１種類の細胞集団をゲーティングした。また解析の再現性を確保するため、ゲーティングにも特別な工夫を行った。(II) FCM analysis 1) Gating of cell population In FCM analysis, the cell population is gated and parameters such as antigen expression are analyzed. In this example, 11 types of cell populations were gated by the method shown in FIG. In addition, special measures were taken for gating to ensure the reproducibility of the analysis.
本発明のパラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」では、顆粒球を確実にゲーティングする必要がある。このゲーティングには、ＳＳＣとＣＤ４５発現で展開した細胞プロットを用いるが、ＳＳＣを対数目盛でプロットすると、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞などの未熟細胞との分離が困難となるため、等分目盛でプロットする。一方、等分目盛でプロットした場合、ＳＳＣ高値の顆粒球に、ＳＳＣ高値の非細胞成分が混入し、ＣＤ３３発現量の平均値は不正確となる。これを回避するため、ＳＳＣ低値顆粒球（Ｇａｔｅ １１）に限定したゲーティングを行った。そして、ＳＳＣ低値を「ＳＳＣ ｍｏｄｅ値以下」と定義することで、ゲーティングの再現性を担保した。 In the parameter "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" of the present invention, it is necessary to reliably gate the granulocytes. For this gating, a cell plot developed with SSC and CD45 expression is used, but when SSC is plotted on a logarithmic scale, it becomes difficult to separate granulocytes from immature cells such as CD34-positive cells. Plot. On the other hand, when plotted on an evenly divided scale, granulocytes with a high SSC value are mixed with a non-cellular component having a high SSC value, and the average value of the CD33 expression level becomes inaccurate. In order to avoid this, gating limited to SSC low-value granulocytes (Gate 11) was performed. Then, the reproducibility of gating was ensured by defining the low SSC value as "less than or equal to the SSC mode value".
また、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ ３）のＣＤ３３発現を表示した場合、ＣＤ３３発現が０以下の粒子が認められる。ＣＤ３４陽性細胞にこれらの粒子が混在したままでは、ＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量の平均値は誤って低値となる。そこで、この粒子を除外したＧａｔｅ ４を設定することで、ＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量を正確に定量した。
Further, when the CD33 expression of the CD34-positive cell (Gate 3) is displayed, particles having a CD33 expression of 0 or less are observed. If these particles remain mixed in the CD34-positive cells, the average value of the CD33 expression level of the CD34-positive cells will be erroneously low. Therefore, by setting
ゲーティングした１１種類の細胞集団の中で、パラメーターの計算に用いるものは、全有核細胞（Ｇａｔｅ １）、ＣＤ３４陽性細胞（Ｇａｔｅ ４）、ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞（Ｇａｔｅ ６）、ＣＤ３４陽性骨髄系未熟細胞（（Ｇａｔｅ ７）骨髄芽球が主な構成成分であり、便宜上ＣＤ３４陽性骨髄芽球と呼ぶ）、リンパ球（Ｇａｔｅ ９）、顆粒球（Ｇａｔｅ １０）、ＳＳＣ低値顆粒球（Ｇａｔｅ １１）、である。 Among the 11 types of gated cell populations, those used for parameter calculation are total nucleated cells (Gate 1), CD34-positive cells (Gate 4), CD34-positive immature B cells (Gate 6), and CD34-positive myeloblasts. Lineage immature cells ((Gate 7) myeloblasts are the main constituents and are called CD34-positive myeloblasts for convenience), lymphocytes (Gate 9), granulocytes (Gate 10), SSC low-value granulocytes (Gate 10). 11) ,.
２）パラメーターの算出
今回発明したパラメーター
パラメーター名：顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比
算出法：Ｇａｔｅ １１細胞のＣＤ３３発現量＊÷Ｇａｔｅ ４細胞のＣＤ３３発現量＊
＊発現量は幾何平均［ＧｅｏＭｅａｎ］を用いる
併用する既知のパラメーター例
パラメーター名：ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率
算出法：Ｇａｔｅ ７細胞数÷Ｇａｔｅ １細胞数
パラメーター名：ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率
算出法：Ｇａｔｅ ６細胞数÷Ｇａｔｅ ４細胞数
パラメーター名：顆粒球のＳＳＣ
算出法：Ｇａｔｅ １０細胞のｍｏｄｅ値÷Ｇａｔｅ ９細胞のｍｏｄｅ値
パラメーター名：ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現
算出法：Ｇａｔｅ ９細胞のＣＤ４５発現量＊÷Ｇａｔｅ ７細胞のＣＤ４５発現量＊
＊発現量は幾何平均［ＧｅｏＭｅａｎ］を用いる2) Parameter calculation Parameter name of the present invention: CD33 expression level ratio of granulocytes and CD34-positive cells Calculation method: CD33 expression level of Gate 11 cells * ÷ CD33 expression level of
* Expression level uses geometric mean [GeoMean] Example of known parameters to be used in combination Parameter name: CD34-positive myeloid blast ratio Calculation method: Gate 7 cell number ÷
Calculation method: Mode value of
* Use the geometric mean [GeoMean] for the expression level.
（ＩＩＩ）被験者
１）低グレードＭＤＳ患者３４例（ＲＡＲＳ、ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ＭＤＳは除いた）
２）臨床現場でＭＤＳと鑑別が必要である、血球減少を来す良性疾患の患者（以降、良性血球減少と表記）３７例(III) Subject 1) 34 low-grade MDS patients (excluding RARS and high-grade MDS)
2) 37 patients with benign diseases that cause cytopenia (hereinafter referred to as benign cytopenia) that need to be differentiated from MDS in clinical practice
２．結果と考察
（Ｉ）新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」の値について、２．２未満をカットオフポイントにすることで、ＭＤＳと良性血球減少の鑑別が可能であった。このパラメーターを用いた場合、２６例が陽性（２．２未満）で、その内訳はＭＤＳ２２例、良性血球減少４例であった。すなわち診断感度は６４．７％、診断特異度は８４．６％であった（図２）。
（ＩＩ）既知の方法（４つのパラメーターを用い、２つ以上が陽性であった場合ＭＤＳと判断する方法、所謂Ｏｇａｔａ ｓｃｏｒｅ）を用いた場合、３３例が陽性で、その内訳はＭＤＳ ２６例、良性血球減少７例であった。すなわち診断感度は７６．５％，診断特異度は７８．８％であった（図３）。2. Results and discussion (I) Regarding the value of the new parameter "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells", it was possible to distinguish MDS from benign cytopenia by setting a cutoff point of less than 2.2. .. When this parameter was used, 26 cases were positive (less than 2.2 cases), of which 22 cases were MDS and 4 cases were benign cytopenia. That is, the diagnostic sensitivity was 64.7% and the diagnostic specificity was 84.6% (Fig. 2).
(II) When a known method (a method of determining MDS when two or more are positive using four parameters, so-called Ogata score) is used, 33 cases are positive, and the breakdown is 26 cases of MDS. There were 7 cases of benign cytopenia. That is, the diagnostic sensitivity was 76.5% and the diagnostic specificity was 78.8% (Fig. 3).
以上から、新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」は単独で、従来の方法（Ｏｇａｔａ ｓｃｏｒｅ）と同等の診断価値があると考えられる。 From the above, it is considered that the new parameter "ratio of CD33 expression level between granulocytes and CD34-positive cells" alone has the same diagnostic value as the conventional method (Ogata score).
考察１：
上記（Ｉ）（ＩＩ）の方法では、診断特異度８０％前後であるため、これをさらに向上させるため、特異性の高いパラメーターに限定して再度診断価値を検討した。Consideration 1:
In the above methods (I) and (II), the diagnostic specificity is around 80%, and in order to further improve this, the diagnostic value is examined again by limiting the parameters to those with high specificity.
（ＩＩＩ）上記（ＩＩ）の４つのパラメーターの中で、特異度の高いパラメーターは「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」と「顆粒球のＳＳＣ」である。この２つが陽性を示したのは８例で、その内訳はＭＤＳ８例、良性血球減少０例であった。すなわち診断感度は２３．５％，診断特異度は１００％であった（図４）。 (III) Among the four parameters of (II) above, the parameters with high specificity are "CD34-positive myeloblast ratio" and "sSC of granulocytes". These two were positive in 8 cases, of which 8 cases were MDS and 0 cases were benign cytopenia. That is, the diagnostic sensitivity was 23.5% and the diagnostic specificity was 100% (Fig. 4).
（ＩＶ）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」と「顆粒球のＳＳＣ」に新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を加えた場合、いずれか２つが陽性を示したのは２０例で、その内訳はＭＤＳ ２０例、良性血球減少０例であった。すなわち診断感度は５８．８％，診断特異度は１００％であった（図５）。 (IV) When the new parameter "CD33 expression level ratio of granulocytes and CD34-positive cells" was added to "CD34-positive myeloblast ratio" and "SSC of granulocytes", 20 of them were positive. For example, the breakdown was 20 cases of MDS and 0 cases of benign cytopenia. That is, the diagnostic sensitivity was 58.8% and the diagnostic specificity was 100% (Fig. 5).
考察２
新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を従来のパラメーターと併用することで、従来の方法より診断的価値の高いＦＣＭ診断検査を構築することが可能である。
By using the new parameter "ratio of CD33 expression level of granulocytes to CD34-positive cells" in combination with the conventional parameter, it is possible to construct an FCM diagnostic test having higher diagnostic value than the conventional method.
（Ｖ）新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を従来のパラメーターと併用する上で、（ＩＶ）とは異なった方法の例を示す。
各パラメーターが異常値を示した場合、以下の様にポイントを付与し、各患者ｄａｔａのスコアを計算する。「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」が２．３以上に３ポイント、「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が２未満に２ポイント、５未満に１ポイント、「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が７．７以上に２ポイント、５未満に１ポイント、「顆粒球のＳＳＣ」が７未満に２ポイント、「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」が２．２未満に３ポイント。(V) An example of a method different from that of (IV) in using the new parameter "ratio of CD33 expression level of granulocytes to CD34-positive cells" in combination with the conventional parameter is shown.
When each parameter shows an abnormal value, points are given as follows and the score of each patient data is calculated. "CD34-positive myeloblast ratio" is 2.3 or more and 3 points, "CD34-positive immature B cell ratio" is less than 2 and 1 point, and "CD34-positive myeloblasts are expressed in CD45" is 7 .2 points for 7 or more, 1 point for less than 5, "SSC of granulocytes" is 2 points for less than 7, and "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" is 3 points for less than 2.2.
図６にこのスコアを用いた診断手順と鑑別結果を記載した。１４例が７ポイント以上を示し、その全てがＭＤＳであった。１８例が５−６ポイントを示し、うち１０例が「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」あるいは「顆粒球のＳＳＣ」に異常があり、その全てがＭＤＳであった。３９例が４ポイント以下であり、うち５例が「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」に異常があり、その内訳はＭＤＳ４例、良性血球減少１例であった。 FIG. 6 shows the diagnostic procedure and the discrimination result using this score. 14 cases showed 7 points or more, all of which were MDS. Eighteen cases showed 5-6 points, of which 10 had abnormalities in "CD34-positive myeloblast ratio" or "sSC of granulocytes", all of which were MDS. 39 cases had 4 points or less, and 5 cases had an abnormality in the "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells", of which 4 cases were MDS and 1 case was benign cytopenia.
すなわち、「７ポイント以上」、「５−６ポイントを示し、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常がある」、あるいは「４ポイント以下で、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常がある」を用いた場合、診断感度は８２．４％，診断特異度は９６．６％であった。 That is, "7 points or more", "5-6 points, and there is an abnormality in the CD34-positive myeloblast ratio or the SSC of granulocytes", or "4 points or less, the expression level of CD33 in granulocytes and CD34-positive cells". When "abnormal ratio" was used, the diagnostic sensitivity was 82.4% and the diagnostic specificity was 96.6%.
さらに、異なった被験者群を用いて、（Ｖ）の方法でＭＤＳの診断を行った。図７に異なった被験者群を用いた診断手順と鑑別結果をまとめて示す。被験者は低グレードＭＤＳ患者２３例（ＲＡＲＳ、ｈｉｇｈ−ｇｒａｄｅ ＭＤＳは除いた）、良性血球減少２３例である。これらの被験者の中で９例が７ポイント以上を示し、その全てがＭＤＳであった。また、８例が５−６ポイントを示し、その全例が「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」あるいは「顆粒球のＳＳＣ」に異常があり、その全てがＭＤＳであった。２９例が４ポイント以下であり、うち３例が「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」に異常があり、その内訳はＭＤＳ３例、良性血球減少０例であった。 Furthermore, MDS was diagnosed by the method (V) using different subject groups. FIG. 7 summarizes the diagnostic procedure and the discrimination result using different subject groups. The subjects were 23 low-grade MDS patients (excluding RARS and high-grade MDS) and 23 benign cytopenia. Of these subjects, 9 showed 7 points or higher, all of which were MDS. In addition, 8 cases showed 5-6 points, and all of them had abnormalities in "CD34-positive myeloblast ratio" or "SSC of granulocytes", and all of them were MDS. Twenty-nine cases had 4 points or less, and 3 cases had an abnormality in the "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells", of which 3 cases were MDS and 0 cases were benign cytopenia.
すなわち、この異なった被験者群を用いた解析では、「７ポイント以上」、「５−６ポイントを示し、ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常がある」、あるいは「４ポイント以下で、顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常がある」を用いた場合、診断感度は８７．０％、診断特異度は１００％であった。 That is, in the analysis using this different subject group, "7 points or more", "5-6 points, and there is an abnormality in the CD34-positive myeloblast ratio or the SSC of granulocytes", or "4 points or less". , There is an abnormality in the CD33 expression level ratio of granulocytes and CD34-positive cells ”, the diagnostic sensitivity was 87.0%, and the diagnostic specificity was 100%.
考察３：
新規パラメーター「顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比」を従来のＦＣＭパラメーターと併用することで、ＭＤＳを診断する上で、従来以上に実用的なレベルの感度、特異度を持つ検査を構築することができる。Consideration 3:
By using the new parameter "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" in combination with the conventional FCM parameter, we have constructed a test with a more practical level of sensitivity and specificity in diagnosing MDS. can do.
本発明は、ＭＤＳの診断、とくに低グレードのＭＤＳと良性血球減少とを鑑別診断することができる。それゆえ本発明は、ＭＤＳの診断及び治療に有用である。 The present invention can make a diagnosis of MDS, particularly a differential diagnosis between low grade MDS and benign cytopenia. Therefore, the present invention is useful for the diagnosis and treatment of MDS.
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。 All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.
Claims (7)
２）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球比率」がカットオフ値以上である場合に３ポイント、但し前記カットオフ値は２〜３である；
３）「ＣＤ３４陽性未熟Ｂ細胞比率」が第１のカットオフ値未満である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は１〜３であり、前記第２のカットオフ値は４〜８である；
４）「顆粒球のＳＳＣ」がカットオフ値未満である場合に２ポイント、但し前記カットオフ値は６〜７である；
５）「ＣＤ３４陽性骨髄芽球のＣＤ４５発現」が第１のカットオフ値以上である場合に２ポイント、第２のカットオフ値未満である場合に１ポイント、但し前記第１のカットオフ値は６〜８であり、前記第２のカットオフ値は４〜６である；
とした場合に、上記１）ないし５）のそれぞれのポイントの総計が７ポイント以上か、前記総計が５〜６ポイントでＣＤ３４陽性骨髄芽球比率あるいは顆粒球のＳＳＣに異常が認められるか、あるいは前記総計が４ポイント以下で顆粒球とＣＤ３４陽性細胞のＣＤ３３発現量比に異常が認められる場合に、被験者は骨髄異形成症候群に罹患している可能性が高いと評価することを特徴とする、請求項１に記載の方法。 1) 3 points when the "CD33 expression level ratio of granulocytes to CD34-positive cells" is less than the cutoff value, except that the cutoff value is 1.5 to 3.5;
2) 3 points when the "CD34-positive myeloblast ratio" is greater than or equal to the cutoff value, except that the cutoff value is 2-3;
3) 2 points when the "CD34-positive immature B cell ratio" is less than the first cutoff value, 1 point when it is less than the second cutoff value, except that the first cutoff value is 1 to 3 and the second cutoff value is 4-8;
4) 2 points when "SSC of granulocytes" is less than the cutoff value, except that the cutoff value is 6-7;
5) 2 points when "CD45 expression of CD34-positive myeloblasts" is greater than or equal to the first cutoff value, 1 point when it is less than the second cutoff value, except that the first cutoff value is It is 6-8, and the second cutoff value is 4-6;
When the above 1) to 5) if the sum of the respective points 7 points or more, the or total abnormality is found in SSC of CD34-positive myeloblast ratio or granulocytes 5-6 points, or When the total is 4 points or less and an abnormality is observed in the CD33 expression level ratio of granulocytes and CD34-positive cells, the subject is evaluated as having a high possibility of suffering from myelodysplastic syndrome. The method according to claim 1.
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