JP6877479B2 - Compounds of activated AMPK and their use - Google Patents
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Description
本発明は、ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−活性化プロテインキナーゼ）の活性化に適用される化合物であるアデニンに関し、さらに、当該化合物を使用して生理的状況または疾患を予防または治療することに関する。 The present invention relates to adenine, which is a compound applied to the activation of AMPK (AMP-activated protein kinase), and further relates to the prevention or treatment of physiological conditions or diseases using the compound.
ＡＭＰＫは、確実に、細胞エネルギーのセンサー、及びエネルギー要求を応答するものである。ＡＭＰＫは、触媒性αサブユニット、調節性β、γサブユニットから構成されるヘテロ三量体であり、全てのサブユニットが真核生物において高度な保存性を有する。ＡＭＰＫの活性化は、その上流キナーゼ、例えば、ＬＫＢ１、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ（Ｃａ２＋／Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ）及びＴＡＫ１により、αサブユニットの保存性を有する１７２スレオニン残基をリン酸化し、生理的または病理的ストレスによってＡＭＰ／ＡＴＰ比が高くなり、ＡＭＰＫを活性化する。ＡＭＰＫを活性化した後は、分解代謝の経路を促進して合成代謝を抑制し、ＡＴＰ消耗の減少及びＡＴＰ生成の促進により、細胞のエネルギーのバランスを回復する。 AMPK reliably responds to cellular energy sensors and energy demands. AMPK is a heterotrimer composed of catalytic α subunits, regulatory β, and γ subunits, all of which have a high degree of conservation in eukaryotes. Activation of AMPK phosphorylates 172 threonine residues with storage of α-subunits by its upstream kinases such as LKB1, calcium / calmodulin-dependent protein kinase (Ca2 + / Calmodulin dependent kinase) and TAK1. Targeted or pathological stress increases the AMP / ATP ratio and activates AMPK. After activating AMPK, it promotes the pathway of catabolism and metabolism to suppress synthetic metabolism, and restores the energy balance of cells by reducing ATP depletion and promoting ATP production.
ＡＭＰＫは、エネルギー代謝のバランスを調節するものとして、ＩＩ型糖尿病、心血管疾患、脂肪肝等を含むメタボリックシンドロームに対しては、潜在力を有する薬物標的であると認識されている。多くのメタボリックシンドロームは、インスリン抵抗性と関わる。インスリン抵抗性は、病理的状態であり、この状態では細胞がインスリンに応答できないため、血液中の過量のグルコースが骨格筋または脂肪組織に取り込まれなくなる。筋細胞において、ＡＭＰＫの活性化は、インスリン非依存性の方式で、転写の制御により、グルコース輸送体（ＧＬＵＴ４）の発現量を増加させ、ＧＬＵＴ４の細胞膜上への移行を誘導し、細胞のグルコース摂取速度を増加させる。ＡＭＰＫの活性化は、それぞれ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｅｔｙｌ−ＣｏＡ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）及びヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を抑制することによって、脂肪酸及びコレステロールの合成を抑制する。また、ＡＭＰＫの活性化によって、ＳＲＥＢＰ−１ｃ、ＣｈＲＥＢＰ、ＨＮＦ−４ａを含む複数の転写因子を抑制し、脂肪酸合成の調節及び糖新生作用に関する酵素のタンパク質の発現を低下させる。上記の研究はいずれも、ＡＭＰＫが、メタボリックシンドローム、特に、糖尿病の治療の標的であることを支持する。 AMPK is recognized as a potential drug target for metabolic syndrome, including type II diabetes, cardiovascular disease, fatty liver, etc., as it regulates the balance of energy metabolism. Many metabolic syndromes are associated with insulin resistance. Insulin resistance is a pathological condition in which cells are unable to respond to insulin, preventing excess glucose in the blood from being taken up by skeletal muscle or adipose tissue. In muscle cells, AMPK activation is an insulin-independent method that regulates transcription to increase the expression level of glucose transporter (GLUT4), induce the translocation of GLUT4 onto the cell membrane, and glucose in the cells. Increase the rate of intake. Activation of AMPK suppresses the synthesis of fatty acids and cholesterol by suppressing acetyl-CoA carboxylase and hydroxymethylglutaryl CoA reductase, respectively. In addition, activation of AMPK suppresses multiple transcription factors including SREBP-1c, ChREBP, and HNF-4a, and reduces the expression of proteins of enzymes involved in the regulation of fatty acid synthesis and gluconeogenic action. All of the above studies support that AMPK is a target for the treatment of metabolic syndrome, especially diabetes.
ＡＭＰＫは、エネルギー代謝のバランスの調節の他、炎症反応、細胞成長（cell growth）、アポトーシス、オートファジー、老化及び分化を含む複数の細胞メカニズムの調節にも参与する。多くの研究では、ＡＭＰＫが炎症反応を抑制するものであることが示される。ＡＭＰＫの活性化は、細胞核の転写因子（ＮＦ−κＢ）のシグナル伝達を抑制することにより、炎症反応を抑制する。細胞核の転写因子のシグナル伝達は、先天性免疫及び後天性免疫を活性化する主要な経路であり、ＡＭＰＫが活性化した後は、ＳＩＲＴ１、フォークヘッドボックスＯ（ＦｏｘＯ）またはペルオキシソーム増殖剤活性化受容体コアクチベーター１α（ＰＧＣ１α）を刺激することにより、細胞核の転写因子の転写活性を抑制して、炎症反応を抑制する効果を達成する。また、複数の研究室では、ＡＭＰＫの活性化が、シクロオキシゲナーゼ−２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２、ＣＯＸ−２）のタンパク質の発現を抑制することが証明されている。シクロオキシゲナーゼ−２は、炎症性サイトカイン及び成長因子により制御される誘導型酵素であり、その機能としては、アラキドン酸をプロスタグランジンに転化することにより、炎症反応及び疼痛を発生させるので、シクロオキシゲナーゼの活性または発現を抑制し、抗炎症作用を有することが証明されている。 In addition to regulating the balance of energy metabolism, AMPK also participates in the regulation of multiple cellular mechanisms including inflammatory response, cell growth, apoptosis, autophagy, aging and differentiation. Many studies have shown that AMPK suppresses the inflammatory response. Activation of AMPK suppresses the inflammatory response by suppressing signal transduction of transcription factors (NF-κB) in the cell nucleus. Transcription factor signaling in the cell nucleus is the major pathway that activates congenital and acquired immunity, and after AMPK activation, SIRT1, forkheadbox O (FoxO) or peroxysome proliferator activation acceptance By stimulating the body coactivator 1α (PGC1α), the transcriptional activity of transcription factors in the cell nucleus is suppressed, and the effect of suppressing the inflammatory reaction is achieved. In addition, several laboratories have demonstrated that activation of AMPK suppresses the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) proteins. Cyclooxygenase-2 is an inducible enzyme regulated by inflammatory cytokines and growth factors, and its function is to convert arachidonic acid to prostaglandins to cause an inflammatory reaction and pain, and thus the activity of cyclooxygenase. Alternatively, it suppresses its expression and has been proven to have an anti-inflammatory effect.
複数のＡＭＰＫ活性化剤は、ｉｎ ｖｉｖｏ実験において抗炎症機能を有することが証明されている。例えば、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオシド（ＡＩＣＡＲ）は、マウスモデルにおいて、トリニトロベンゼンスルホン酸またはデキストラン硫酸ナトリウムによる再発性急性結腸炎を緩和することができ、ＡＩＣＡＲによる治療で、疾患マウスの体重減少を著しく低下させ、炎症反応を軽減することが証明されている。また、ＡＩＣＡＲは、ヒト多発性硬化症の動物モデル（ＥＡＥ）に明らかな治療効果を有し、リポ多糖誘発性マウス肺損傷の重篤程度を低下させる。 Multiple AMPK activators have been shown to have anti-inflammatory function in in vivo experiments. For example, 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR) can alleviate recurrent acute colitis with trinitrobenzene sulfonic acid or sodium dextran sulfate in a mouse model and can be treated with AICAR in diseased mice. It has been shown to significantly reduce weight loss and reduce the inflammatory response. AICAAR also has a clear therapeutic effect on animal models of human multiple sclerosis (EAE) and reduces the severity of lipopolysaccharide-induced mouse lung injury.
細胞シグナル伝達経路の異常は、細胞の異常増殖を引き起こす可能性があり、最終的には癌を引き起こすことになる。哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）は、細胞成長及びオートファジー作用を制御するセリン／スレオニンキナーゼである。哺乳類ラパマイシン標的タンパク質のシグナル伝達経路の活性化異常は、様々な癌において見出されるため、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質の抑制剤は、癌治療の潜在的な薬物であると考えられる。多くの研究では、ＡＭＰＫで結節性硬化症複合体２（ＴＳＣ２）及びラプター（Ｒａｐｔｏｒ）をリン酸化することにより、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質の経路の抑制を達成することが証明されている。ＡＩＣＡＲ、メトホルミン、フェンホルミンを含む各種類のＡＭＰＫ活性化剤は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質シグナルの経路を抑制し、癌細胞の成長を抑制することが証明されている。また、ＡＭＰＫの活性化は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質複合体−１を抑制することにより、オートファジー作用を誘発させる。ＡＭＰＫが、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質複合体−１を抑制するため、Ｕｌｋ１上の７５７セリンのリン酸化が減少し、その後、３１７及び７７７セリンはＡＭＰＫによりリン酸化され、Ｕｌｋ１はＡＭＰＫによりリン酸化された後、オートファジー作用が開始される。 Abnormalities in cell signaling pathways can cause cell overgrowth and ultimately cancer. Mammalian rapamycin target protein (mTOR) is a serine / threonine kinase that regulates cell growth and autophagy. Since abnormal activation of signaling pathways of mammalian rapamycin target proteins is found in various cancers, inhibitors of mammalian rapamycin target proteins are considered to be potential drugs for cancer treatment. Many studies have demonstrated that phosphorylation of tuberous sclerosis complex 2 (TSC2) and raptor with AMPK achieves inhibition of the mammalian rapamycin target protein pathway. Each type of AMPK activator, including AICAR, metformin, and phenformin, has been shown to suppress the pathway of mammalian rapamycin target protein signaling and suppress the growth of cancer cells. In addition, activation of AMPK induces autophagy by suppressing the mammalian target protein complex-1. Since AMPK suppresses mammalian rapamycin target protein complex-1, phosphorylation of 757 serine on Ulk1 is reduced, after which 317 and 777 serine are phosphorylated by AMPK and Ulk1 is phosphorylated by AMPK. , The autophagy action is started.
以上のように、ＡＭＰＫは、炎症性疾患、創傷治癒、神経変性、癌、酸化ストレス、及び心血管疾患を含む多くの人類疾患または病理的状況に対して、良好な治療標的であると考えられる。実際、ＡＭＰＫ活性化剤は、細菌及び真菌による疾患、行動及び心理障害、血液及びリンパ疾患、癌、腫瘍、消化器疾患、耳鼻咽喉疾患、眼疾、腺及びホルモンに関連する疾患、心血管疾患、免疫系疾患、口及び歯疾患、筋肉・骨格・軟骨疾患、神経系疾患、栄養及び代謝性疾患、呼吸器疾患、皮膚及び結合組織疾患、創傷治癒等を含む少なくとも２４種類の疾患の臨床試験に適用されている。 As described above, AMPK is considered to be a good therapeutic target for many human diseases or pathological conditions including inflammatory diseases, wound healing, neurodegeneration, cancer, oxidative stress, and cardiovascular diseases. .. In fact, AMPK activators are bacterial and fungal disorders, behavioral and psychological disorders, blood and lymph disorders, cancers, tumors, digestive disorders, otolaryngology disorders, eye diseases, glandular and hormone-related disorders, cardiovascular disorders, etc. For clinical trials of at least 24 diseases including immune system diseases, mouth and tooth diseases, muscle / skeletal / cartilage diseases, nervous system diseases, nutritional and metabolic diseases, respiratory diseases, skin and connective tissue diseases, wound healing, etc. It has been applied.
本発明は、新規なＡＭＰＫ活性化剤であるアデニン、及び当該化合物の疾患を予防または治療するための使用を提供する。 The present invention provides a novel AMPK activator, adenine, and its use for the prevention or treatment of diseases of the compound.
本発明は、ＡＭＰＫを活性化するための化合物であって、アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩である化合物を提供する。 The present invention provides compounds for activating AMPK that are adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
上記化合物は、ＡＭＰＫ活性化剤で改善できる疾患または生理的状況を治療するものである。その中、上記アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩を、この治療を必要とする哺乳動物に与える。 The above compounds treat diseases or physiological conditions that can be ameliorated by AMPK activators. Among them, the above-mentioned adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is given to a mammal in need of this treatment.
上記化合物は、細胞における炎症性サイトカインの分泌及びシクロオキシゲナーゼ−２の発現を低下させることにより、炎症性生理的状況または疾患を治療するものである。その中、上記アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩を、この治療を必要とする哺乳動物に与える。 The compounds treat inflammatory physiological conditions or diseases by reducing the secretion of inflammatory cytokines and the expression of cyclooxygenase-2 in cells. Among them, the above-mentioned adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is given to a mammal in need of this treatment.
上記化合物は、細胞にグルコースの摂取を増加させることにより、糖尿病前症、ＩＩ型糖尿病及びメタボリックシンドロームからなる群から選ばれる生理的状況または疾患を予防または治療するものである。その中、上記アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩を、この治療を必要とする哺乳動物に与える。 The compounds prevent or treat a physiological condition or disease selected from the group consisting of prediabetes, type II diabetes and metabolic syndrome by increasing glucose uptake in cells. Among them, the above-mentioned adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is given to a mammal in need of this treatment.
上記化合物は、哺乳動物の血漿トリグリセリド及び体重を減少させることにより、肥満状態を予防または治療するものである。その中、上記アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩を、この治療を必要とする哺乳動物に与える。 The compounds prevent or treat obesity by reducing plasma triglycerides and body weight in mammals. Among them, the above-mentioned adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is given to a mammal in need of this treatment.
上記化合物は、細胞におけるアミロイドβペプチドの累積を抑制することにより、アルツハイマー病を予防または治療するものである。その中、上記アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩を、この治療を必要とする哺乳動物に与える。 The above compounds prevent or treat Alzheimer's disease by suppressing the accumulation of amyloid β peptide in cells. Among them, the above-mentioned adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is given to a mammal in need of this treatment.
上記化合物は、細胞のオートファジーの活性を強化することにより、オートファジー作用で改善できる疾患または生理的状況を治療するものである。その中、上記アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩を、この治療を必要とする哺乳動物に与える。 The above compounds treat diseases or physiological conditions that can be ameliorated by autophagy by enhancing the activity of autophagy in cells. Among them, the above-mentioned adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is given to a mammal in need of this treatment.
上記化合物は、繊維芽細胞の成長を抑制することにより、創傷治癒の過程において瘢痕形成を抑制するものである。その中、上記アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩を、この治療を必要とする哺乳上化合物に与える。 The compound suppresses scar formation in the process of wound healing by suppressing the growth of fibroblasts. Among them, the above-mentioned adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is given to a lactating compound in need of this treatment.
上記化合物は、創傷治癒を強化するものである。その中、上記アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩を、この治療を必要とする哺乳動物に与える。 The above compounds enhance wound healing. Among them, the above-mentioned adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is given to a mammal in need of this treatment.
上記化合物は、細胞の活性酸素種の生成を抑制することにより、哺乳動物において、活性酸素種に傷つけられる細胞を保護及び治療するものである。その中、上記アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩を、この治療を必要とする哺乳動物に与える。 The above compound protects and treats cells damaged by reactive oxygen species in mammals by suppressing the production of reactive oxygen species in the cells. Among them, the above-mentioned adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is given to a mammal in need of this treatment.
上記化合物は、癌細胞の成長を抑制することにより、癌を予防または治療するものである。その中、上記アデニン及び／またはその医薬学的に許容できる塩を、この治療を必要とする哺乳動物に与える。 The above compounds prevent or treat cancer by suppressing the growth of cancer cells. Among them, the above-mentioned adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof is given to a mammal in need of this treatment.
本発明は、ＡＭＰＫ活性化剤で改善できる疾患または生理的状況を治療する薬物を調製するための、上記化合物の使用を提供する。 The present invention provides the use of the above compounds to prepare drugs for treating diseases or physiological conditions that can be ameliorated by AMPK activators.
本発明は、炎症性生理的状況または疾患を治療する薬物を調製するための、上記化合物の使用を提供する。 The present invention provides the use of the above compounds for preparing drugs for treating inflammatory physiological conditions or diseases.
本発明は、糖尿病前症、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドロームの一つまたはその組み合わせである生理的状況または疾患を予防または治療する薬物を調製するための、上記化合物の使用を提供する。 The present invention provides the use of the above compounds for preparing a drug that prevents or treats a physiological condition or disease that is one or a combination of prediabetes, type II diabetes, and metabolic syndrome.
本発明は、アルツハイマー病を予防または治療する薬物を調製するための、上記化合物の使用を提供する。 The present invention provides the use of the above compounds for the preparation of drugs that prevent or treat Alzheimer's disease.
本発明は、オートファジー作用で改善できる疾患または生理的状況を治療する薬物を調製するための、上記化合物の使用を提供する。 The present invention provides the use of the above compounds for preparing a drug for treating a disease or physiological condition that can be ameliorated by autophagy.
本発明は、創傷治癒の過程において瘢痕形成を抑制する薬物を調製するための、上記化合物の使用を提供する。 The present invention provides the use of the above compounds for preparing drugs that suppress scar formation during the process of wound healing.
本発明は、創傷治癒を強化する薬物を調製するための、上記化合物の使用を提供する。 The present invention provides the use of the above compounds for preparing drugs that enhance wound healing.
本発明は、哺乳動物において、活性酸素種に傷つけられる細胞を保護及び治療する薬物を調製するための、上記化合物の使用を提供する。 The present invention provides the use of the above compounds in mammals to prepare drugs that protect and treat cells damaged by reactive oxygen species.
本発明は、癌を予防または治療する薬物を調製するための、上記化合物の使用を提供する。 The present invention provides the use of the above compounds for the preparation of drugs that prevent or treat cancer.
上記の内容をまとめると、本発明の実施形態によれば、新規なＡＭＰＫ活性化剤であるアデニンを提供することで、細胞内でＡＭＰＫを活性化することができるため、哺乳動物において、ＡＭＰＫで改善できる生理的状況または疾患を予防または治療することができる。 Summarizing the above contents, according to the embodiment of the present invention, AMPK can be activated intracellularly by providing adenine, which is a novel AMPK activator. Therefore, in mammals, AMPK can be used. It is possible to prevent or treat a physiological condition or disease that can be improved.
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰＫを活性化することにより血糖を低下させる方法を提供することで、メタボリックシンドローム、糖尿病前症、ＩＩ型糖尿病、インスリン抵抗性を含む疾患を予防または治療する。その中、治療を必要とする哺乳動物に、有効量のアデニン及び／または医薬学的に許容できる塩を与える。 According to embodiments of the present invention, by providing a method of lowering blood glucose by activating AMPK, a disease including metabolic syndrome, prediabetes mellitus, type II diabetes mellitus, and insulin resistance is prevented or treated. Among them, mammals in need of treatment are given an effective amount of adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt.
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰＫを活性化することにより抗炎症的方法を提供することで、炎症性状況または疾患を予防または治療する。その中、治療を必要とする哺乳動物に、有効量のアデニン及び／または医薬学的に許容できる塩を与える。 According to embodiments of the present invention, an anti-inflammatory method is provided by activating AMPK to prevent or treat an inflammatory condition or disease. Among them, mammals in need of treatment are given an effective amount of adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt.
本発明の実施形態によれば、ＡＭＰＫを活性化することにより繊維芽細胞の成長を抑制する方法を提供することで、創傷治癒の期間で瘢痕組織の生成を予防する。 According to an embodiment of the present invention, the formation of scar tissue is prevented during the period of wound healing by providing a method of suppressing the growth of fibroblasts by activating AMPK.
本発明の実施形態によれば、創傷治癒を強化する方法を提供する。その中、治療を必要とする哺乳動物に、有効量のアデニン及び／または医薬学的に許容できる塩を与える。 According to embodiments of the present invention, there is provided a method of enhancing wound healing. Among them, mammals in need of treatment are given an effective amount of adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt.
本発明の実施形態によれば、活性酸素種（ＲＯＳ）の生成を抑制する方法を提供することで、活性酸素種の傷害から哺乳動物の細胞を保護または治療する。その中、治療を必要とする哺乳動物に、有効量のアデニン及び／または医薬学的に許容できる塩を与える。 According to an embodiment of the present invention, to provide a method of inhibiting the production of active oxygen species (ROS), to protect or treat a mammal cell from active oxygen species injury. Among them, mammals in need of treatment are given an effective amount of adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt.
本発明の実施形態によれば、癌細胞の成長を抑制する方法を提供することで、癌を予防または治療する。その中、治療を必要とする哺乳動物に、有効量のアデニン及び／または医薬学的に許容できる塩を与える According to an embodiment of the present invention, cancer is prevented or treated by providing a method for suppressing the growth of cancer cells. Among them, mammals in need of treatment are given an effective amount of adenine and / or a pharmaceutically acceptable salt.
本発明は、ＡＭＰＫの活性化に適用される化合物であるアデニンに関し、また、糖尿病前症、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満症、炎症、創傷治癒、アルツハイマー病、癌、酸化ストレス及び心血管疾患を含む生理的状況または疾患を予防または治療するためのアデニンの使用に関する。 The present invention relates to adenin, a compound applied to the activation of AMPK, and also prediabetes, insulin resistance, type II diabetes, metabolic syndrome, obesity, inflammation, wound healing, Alzheimer's disease, cancer, oxidative stress. And the use of adenin to prevent or treat physiological conditions or diseases, including cardiovascular disease.
本発明では、アデニンが、新規なＡＭＰＫ活性化剤であり、様々な生物性機能を有することを見出す。近年、ＡＭＰＫの活性化は、疾患、例えば糖尿病前症、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、肥満症、炎症、創傷治癒、アルツハイマー病、癌症、酸化ストレス、心血管疾患の予防及び治療、並びに創傷治癒の促進に寄与することが証明されている。本発明では、この効果は、ＡＭＰＫの活性化による、シクロオキシゲナーゼ−２発現量の低下、活性酸素種（ＲＯＳ）生産の抑制、及びグルコース摂取活性の増加に起因すると考えられるが、これらに限定されない。 In the present invention, we find that adenine is a novel AMPK activator and has various biological functions. In recent years, activation of AMPK has been involved in the prevention and treatment of diseases such as prediabetes, insulin resistance, type II diabetes, metabolic syndrome, obesity, inflammation, wound healing, Alzheimer's disease, cancer, oxidative stress, cardiovascular disease. It has also been shown to contribute to the promotion of wound healing. In the present invention, this effect is due to the activation of AMPK, reduction of cyclooxygenase-2 expression levels, activity of oxygen species (ROS) inhibition of the production, and is believed to be due to an increase in glucose uptake activity, but are not limited to ..
＜予期する適応症＞
本発明の研究成果（実施例をご参照）に基づき、アデニンは、ＡＭＰＫを活性化することにより、様々な生理的状況または疾患の治療剤として使用できる。以下、予期する適応症の例示及び証拠を提供する。
<Expected indications>
Based on the research results of the present invention (see Examples), adenine can be used as a therapeutic agent for various physiological situations or diseases by activating AMPK. The following is an example and evidence of an expected indication.
（アデニンの高血糖、糖尿病前症、インスリン抵抗性、ＩＩ型糖尿病に対する治療）
近来、メトホルミン、Ａ７６９６６２、ＡＩＣＡＲを含むＡＭＰＫ活性化剤は、糖尿病または肥満症のマウスモデルにおいて、血漿グルコース濃度を低下させることが報告されている。本発明において、１μＭ〜６００μＭのアデニンは、筋細胞Ｃ２Ｃ１２のグルコース摂取を著しく増加させる（表２）。さらに、高脂肪飼料をマウスに与えてＩＩ型糖尿病動物モデルとして、アデニンの血漿グルコース濃度に対する調節効果を評価する。コントロール群である高脂肪飼料給餌マウスに比べて、アデニンを与えることにより、高脂肪飼料給餌マウスの血漿グルコースを３０％以上著しく減少させ、血漿トリグリセリドを３５％以上減少させ、体重を１５％以上減少させる（実施例３）。ここで使用する用語「高血糖」とは、血糖が１２６ｍｇ／ｄＬより高いことを特徴とする生理的状況である。ここで使用する用語「糖尿病前症」とは、空腹時血糖が１００ｍｇ／ｄＬより高く、１４０ｍｇ／ｄＬより低いことを特徴とする生理的状況である。ここで使用する用語「インスリン抵抗性」とは、全身または肝臓、骨格筋、脂肪組織を含む組織がインスリンに反応しない生理的状況である。ここで使用する用語「ＩＩ型糖尿病」とは、インスリン非依存型糖尿病または成人発症型糖尿病をも意味し、代謝異常によるインスリン生産不足またはインスリン抵抗性であり、通常、空腹時血糖が１４０ｍｇ／ｄＬより高いことを特徴とする。この実施例に基づき、アデニンは、グルコースの摂取を加速させることが証明されているため、高血糖に関連する生理的状況または疾患の有効な治療方法としてもよい。
(Treatment for adenine hyperglycemia, prediabetes, insulin resistance, type II diabetes)
Recently, AMPK activators, including metformin, A769662, and AICAAR, have been reported to reduce plasma glucose levels in mouse models of diabetes or obesity. In the present invention, 1 μM to 600 μM adenine significantly increases glucose uptake in muscle cells C2C12 (Table 2). Furthermore, a high-fat diet is given to mice to evaluate the regulatory effect of adenine on plasma glucose concentration as a type II diabetic animal model. By giving adenine, plasma glucose of high-fat feed-fed mice was significantly reduced by 30% or more, plasma triglyceride was reduced by 35% or more, and body weight was reduced by 15% or more as compared with the control group of high-fat feed-fed mice. (Example 3). The term "hyperglycemia" as used herein is a physiological condition characterized in that blood glucose is higher than 126 mg / dL. The term "prediabetes" as used herein is a physiological condition characterized in that fasting blood glucose is higher than 100 mg / dL and lower than 140 mg / dL. As used herein, the term "insulin resistance" is a physiological condition in which the whole body or tissues including liver, skeletal muscle, and adipose tissue do not respond to insulin. The term "type II diabetes" as used herein also means non-insulin-dependent diabetes mellitus or adult-onset diabetes mellitus, which is insulin production deficiency or insulin resistance due to metabolic disorders, and usually has a fasting blood glucose of 140 mg / dL. It is characterized by being higher. Based on this example, adenine has been shown to accelerate glucose intake and may be an effective therapeutic method for hyperglycemic-related physiological conditions or disorders.
（アデニンの炎症性疾患に対する治療）
様々なＡＭＰＫ活性化剤は、生体内において抗炎症機能を有することが証明されている。例えば、５−アミノイミダゾール−４−カルボキサミドリボヌクレオシド（ＡＩＣＡＲ）は、マウスモデルにおいて、トリニトロベンゼンスルホン酸またはデキストラン硫酸ナトリウムによる再発性急性結腸炎を緩和することができ、ＡＩＣＡＲによる治療で、疾患マウスの体重減少を著しく低下させ、炎症反応を軽減することが証明されている。また、ＡＩＣＡＲは、ヒト多発性硬化症の動物モデル（ＥＡＥ） に明らかな治療効果を有し、リポ多糖誘発性マウス肺損傷の重篤程度を低下させる。本発明において、アデニンは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で、リポ多糖誘発性炎症反応を抑制する。即ち、リポ多糖の刺激下で、アデニンで処理されたマクロファージにおける腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）を含む炎症性サイトカインの分泌量は、コントロール群に比べて、有意的に減少する。アデニンは、ヒトのマクロファージのリポ多糖誘発により発現するシクロオキシゲナーゼ−２発現量をも減少させる（実施例４）。トリニトロベンゼンスルホン酸誘発の炎症性腸疾患（ＩＢＤ）のマウスモデルにおいて、アデニン投与治療群の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンγ（ＩＮＦγ）及びインターロイキン（ＩＬ−１７）を含む結腸炎症性サイトカインは、いずれもコントロール群マウスより著しく減少し、かつ、体重損失が改善される（実施例５）。
(Treatment for inflammatory diseases of adenine)
Various AMPK activators have been shown to have anti-inflammatory function in vivo. For example, 5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside (AICAR) can alleviate recurrent acute colitis with trinitrobenzene sulfonic acid or sodium dextran sulfate in a mouse model and can be treated with AICAR in diseased mice. It has been shown to significantly reduce weight loss and reduce the inflammatory response. AICAAR also has a clear therapeutic effect on animal models of human multiple sclerosis (EAE) and reduces the severity of lipopolysaccharide-induced mouse lung injury. In the present invention, adenine suppresses the lipopolysaccharide-induced inflammatory response in in vitro tests. That is, inflammatory cytokines containing tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) in adenin-treated macrophages under the stimulation of lipopolysaccharide. The amount of secretion of is significantly reduced as compared with the control group. Adenine also reduces the expression level of cyclooxygenase-2 expressed by lipopolysaccharide induction in human macrophages (Example 4). In a mouse model of trinitrobenzene sulfonic acid-induced inflammatory bowel disease (IBD), colonic inflammatory cytokines, including tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma (INFγ) and interleukin (IL-17), in the adenine-treated treatment group , Both are significantly reduced as compared with the control group mice, and the weight loss is improved (Example 5).
ここで使用する用語「炎症性サイトカイン」とは、全身性炎症反応を促進するサイトカインである。ここで使用する用語「炎症性疾患」とは、炎症に関連する疾患であり、強直性脊椎炎、関節炎（骨関節炎、関節リウマチ、乾癬性関節炎）、喘息、アテローム性動脈硬化、クローン病、結腸炎、皮膚炎、大腸憩室症、線維筋痛症、肝炎、過敏性腸症候群、全身性エリテマトーデス、腎炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、潰瘍性大腸炎等を含むが、これらに限定されない。近年、多くの報告では、ＡＭＰＫは、シクロオキシゲナーゼ−２の上流調節因子であり、シクロオキシゲナーゼ−２のタンパク質発現を抑制することができる。先行研究と符合しており、本発明者は、新規なＡＭＰＫ活性化剤であるアデニンが、シクロオキシゲナーゼ−２のタンパク質発現を有効に抑制することができることを見出し、これにより、アデニンは、シクロオキシゲナーゼ−２の参与する炎症を抑制することができることが分かる。本発明によれば、アデニンは、炎症を抑制することができることが見出されるため、炎症に関連する生理的状況または疾患を治療することができる。 The term "inflammatory cytokine" used here is a cytokine that promotes a systemic inflammatory response. The term "inflammatory disease" used herein is a disease related to inflammation, such as tonic spondylitis, arthritis (osteoarthritis, rheumatoid arthritis, psoriatic arthritis), asthma, atherosclerosis, Crohn's disease, colon. It includes, but is not limited to, inflammation, dermatitis, colitis, fibromyalgia, hepatitis, irritable bowel syndrome, systemic erythematosus, nephritis, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, ulcerative colitis, etc. In recent years, in many reports, AMPK is an upstream regulator of cyclooxygenase-2 and can suppress protein expression of cyclooxygenase-2. Consistent with previous studies, the inventor has found that a novel AMPK activator, adenine, can effectively suppress the protein expression of cyclooxygenase-2, which causes adenine to be cyclooxygenase-2. It can be seen that the inflammation that participates in the disease can be suppressed. According to the present invention, adenine is found to be capable of suppressing inflammation and thus can treat physiological conditions or diseases associated with inflammation.
（創傷治癒及び瘢痕形成においてのアデニン）
ＡＭＰＫは、細胞の運動性を促進し、創傷治癒を強化することができると考えられる。ＡＭＰＫ活性化剤であるレスベラトロールは、手術傷口の治癒を強化することができることが証明されている。創傷治癒のほか、治癒の過程において瘢痕形成の減少は常に現代医学の一番の目標である。新生児の創傷治癒は、成人の創傷治癒と異なり、瘢痕形成を伴わず、その差異は、シクロオキシゲナーゼ−２の活性化によるものである。成人の創傷治癒の過程において、シクロオキシゲナーゼ−２の活性はＴＧＦ−ｂｅｔａにより上昇するため、傷口でのプロスタグランジンの生産を増加させる。プロスタグランジンは、繊維芽細胞の増殖及びコラーゲンの形成を促進することができることが証明されており、この二つの要素は瘢痕形成を引き起こす。そのため、シクロオキシゲナーゼ−２の活性の抑制は、瘢痕形成を有効に予防することができると考えられる。本発明において、アデニンは、繊維芽細胞の成長を抑制し（実施例８）、シクロオキシゲナーゼ−２のタンパク質発現を低下させる。動物モデルにおいて、傷口にアデニンを直接に施用することにより、創傷治癒を強化することができるだけでなく、瘢痕生成を減少することもできる（実施例９）。上記の資料によれば、局部にアデニンを施用することにより、有効に創傷治癒を強化し、瘢痕形成を防止することができる。
(Adenine in wound healing and scar formation)
AMPK is thought to be able to promote cell motility and enhance wound healing. Resveratrol, an AMPK activator, has been shown to be able to enhance healing of surgical wounds. In addition to wound healing, reducing scar formation during the healing process has always been the primary goal of modern medicine. Wound healing in newborns, unlike wound healing in adults, does not involve scar formation, the difference being due to the activation of cyclooxygenase-2. During the process of wound healing in adults, the activity of cyclooxygenase-2 is increased by TGF-beta, thus increasing the production of prostaglandins in the wound. Prostaglandins have been shown to be able to promote fibroblast proliferation and collagen formation, and these two factors cause scar formation. Therefore, it is considered that suppression of the activity of cyclooxygenase-2 can effectively prevent scar formation. In the present invention, adenine suppresses the growth of fibroblasts (Example 8) and reduces the protein expression of cyclooxygenase-2. In animal models, direct application of adenine to the wound can not only enhance wound healing, but also reduce scarring (Example 9). According to the above materials, local application of adenine can effectively enhance wound healing and prevent scar formation.
（神経変性）
炎症、細胞内輸送、オートファジー等を含む多くの細胞メカニズムの欠陥は、神経変性疾患と関連することが証明されている。オートファジーの機能は、細胞内の機能喪失したオルガネラまたはタンパク質集団を除去し、細胞内のバランスに重要な役割を担う。多くの神経変性疾患の発症メカニズムは、細胞内または細胞外のタンパク質集団の沈着と関わり、そのタンパク質集団の除去は、これらの疾患の進行を改善できることが示されている。また、オートファジーの経路が損なうこと、またはオートファジー担当のタンパク質が除去されることにより、神経変性を引き起こすことが証明されている。ＡＭＰＫの活性化は、オートファジーの経路を促進することができることが証明されている。そのため、ＡＭＰＫを活性化することによりオートファジーの経路を促進することは、神経変性疾患を予防または制御するための有効な手段とされている。ＡＭＰＫ活性化剤は、オートファジーの経路により、アミロイドの沈着を減少させることができることが証明されている。毎日、ＡＭＰＫ活性化剤であるレスベラトロールを与えることにより、アルツハイマー病マウスの寿命を増加させることができる。もう一つのＡＭＰＫ活性化剤であるクルクミンは、アルツハイマー病治療の潜在的な薬物として使用できることが証明されている。本発明において、本発明者は、アデニンが神経細胞Ｎｅｕｒｏ−２Ａにおいてオートファジー活性を著しく強化し、Ａの累積を低下させ、また、アデニンがアルツハイマー病マウスの認知機能を改善すること（実施例６、７）を見出す。上記の発見によれば、アデニンは、神経変性疾患の治療に用いられる。
(Neurodegeneration)
Defects in many cellular mechanisms, including inflammation, intracellular transport, autophagy, etc., have been shown to be associated with neurodegenerative diseases. The function of autophagy removes intracellular organelles or protein populations and plays an important role in intracellular balance. The pathogenic mechanism of many neurodegenerative diseases is associated with the deposition of intracellular or extracellular protein populations, and removal of those protein populations has been shown to improve the progression of these diseases. It has also been shown to cause neurodegeneration by impairing the autophagy pathway or by removing the protein responsible for autophagy. Activation of AMPK has been shown to be able to promote the autophagy pathway. Therefore, promoting the autophagy pathway by activating AMPK has been regarded as an effective means for preventing or controlling neurodegenerative diseases. AMPK activators have been shown to be able to reduce amyloid deposition by the autophagy pathway. Daily feeding of resveratrol, an AMPK activator, can increase the lifespan of Alzheimer's disease mice. Another AMPK activator, curcumin, has proven to be a potential drug in the treatment of Alzheimer's disease. In the present invention, the present inventor states that adenine significantly enhances autophagy activity in nerve cell Neuro-2A, reduces the accumulation of A, and adenine improves cognitive function in Alzheimer's disease mice (Example 6). , 7). According to the above findings, adenine is used in the treatment of neurodegenerative diseases.
ここで使用する用語「神経変性」とは、ニューロンの構造または機能が徐々に喪失する状態である。神経変性疾患は、神経変性の結果であり、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳萎縮症、脊髄性筋萎縮症等を含むが、これらに限定されない。 The term "neurodegeneration" as used herein is a condition in which the structure or function of a neuron is gradually lost. Neurodegenerative diseases are the result of neurodegeneration and include, but are not limited to, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's chorea, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar atrophy, spinal muscular atrophy, and the like.
（活性酸素種に関連する疾患）
生物組織において、スーパーオキシドラジカル、ヒドロキシルラジカル及び過酸化水素を含む活性酸素種は、次々と生成されており、また、過量の活性酸素種は、神経障害性運動失調症網膜色素変性症症候群（ＮＡＲＰ）、ＭＥＬＡＳ症候群、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群（ＭＥＲＲＦ）、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）、ＫＳＳ症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症、フリードライヒ失調症（ＦＡ）及び老化を含む多くの疾患と関連するが、これらに限定されない。多くの研究報告では、ＡＭＰＫ活性化剤、例えば、ＡＩＣＡＲは、高いグルコース、パルミチン酸またはアルブミンで誘発された状態で、活性酸素種の生成を減少させることができることが証明されている。本発明において、アデニンは、ＨＵＶＥＣ細胞における活性酸素種の生産を低下させるため（表６）、アデニンは、活性酸素種に関連する生理的状況または疾患の治療に用いられる。
(Diseases associated with active oxygen species)
In biological tissues, superoxide radicals, active oxygen species including hydroxyl radicals and hydrogen peroxide is sequentially generated, and overdose of the active oxygen species, neuropathic ataxia retinitis pigmentosa syndrome (NARP), MELAS syndrome, red rag fiber / myokronus epilepsy syndrome (MERRF), Leber's hereditary optic nerve atrophy (LHON), KSS syndrome, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington chorea, muscle atrophic lateral sclerosis, Friedreich's disease It is associated with, but is not limited to, many diseases including, but not limited to, Reich's ataxia (FA) and aging. Many research reports, AMPK activators, e.g., AICAR is higher glucose, while being induced by palmitic acid or albumin, it has been proven that it is possible to reduce the generation of active oxygen species. In the present invention, adenine, to reduce the production of active oxygen species in HUVEC cells (Table 6), adenine is used for the treatment of a physiological condition or disease associated with active oxygen species.
（癌）
ＡＭＰＫの活性化は、シクロオキシゲナーゼ−２および哺乳類ラパマイシン標的タンパク質の経路を抑制する。この二つの経路は、癌細胞成長の重要なメカニズムである。シクロオキシゲナーゼ−２および哺乳類ラパマイシン標的タンパク質の癌に対する重要性に基づいて、ＡＭＰＫを活性化することによりシクロオキシゲナーゼ−２および哺乳類ラパマイシン標的タンパク質の経路を抑制することは、合理的な癌の治療手段であると考えられる。実際、多くの研究報告では、ＡＭＰＫ活性化剤により癌の進行を中断することが証明されており、例えば、フェンホルミン及びメトホルミンは、同種移植の癌マウスモデルにおいて、乳癌腫瘍の進行及び成長を抑制することが見出される。本発明において、アデニンは、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ７及び結腸癌細胞ＨＴ２９の細胞成長を抑制する（実施例１１）。アデニンのＨｅｐ Ｇ２、ＭＣＦ７、ＨＴ２９に対する５０％成長抑制濃度は、それぞれ、５４４．１、５３７．５、５３１．９μＭである。Ｈｅｐ Ｇ２移植マウスモデルにおいて、長期間にわたってアデニンを与えることにより、腫瘍の成長を著しく遅延させる。本発明によれば、アデニンでＡＭＰＫを活性化する治療方法は、癌症の形成または進行を予防または制御することができる。
(cancer)
Activation of AMPK suppresses the pathways of cyclooxygenase-2 and mammalian rapamycin target proteins. These two pathways are important mechanisms of cancer cell growth. Based on the importance of cyclooxygenase-2 and mammalian rapamycin target proteins to cancer, suppressing the pathways of cyclooxygenase-2 and mammalian rapamycin target proteins by activating AMPK is a rational therapeutic tool for cancer. Conceivable. In fact, many research reports have shown that AMPK activators disrupt the progression of cancer, for example, phenformin and metformin suppress the progression and growth of breast cancer tumors in allogeneic cancer mouse models. It is found to do. In the present invention, adenine suppresses cell growth of human hepatocellular carcinoma cell Hep G2, human breast cancer cell MCF7 and colon cancer cell HT29 (Example 11). The 50% growth inhibitory concentrations of adenine with respect to Hep G2, MCF7 and HT29 are 544.1, 537.5 and 531.9 μM, respectively. In a Hep G2-transplanted mouse model, long-term adenine feeding significantly slows tumor growth. According to the present invention, a therapeutic method of activating AMPK with adenine can prevent or control the formation or progression of cancer disease.
以下、本発明を具体的な実施例に基づいてさらに説明することにより、当業者が本発明をより理解、かつ、実施することができるが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be further described based on specific examples so that those skilled in the art can better understand and implement the present invention, but the present invention is not limited to these examples. Absent.
実施例１
（ＡＭＰＫ活性の分析）
マウス筋細胞Ｃ２Ｃ１２、マウス繊維芽細胞３Ｔ３、ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ７、ヒト結腸癌細胞ＨＴ２９、ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣ、ヒト急性単球白血病細胞株ＴＨＰ１、ヒトマクロファージＵ９３７、マウス小膠細胞ＢＶ−２、神経芽細胞腫細胞Ｎｅｕｒｏ２Ａ及び毛乳頭細胞Ｄｅｒｍａｌ Ｐａｐｉｌｌａについて、アデニンのＡＭＰＫリン酸化に対する影響の分析を行った。細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ‐グルタミン、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ２の環境下でインキュベートされた。３×１０５個の細胞を６−ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間後、細胞を所定の化合物で３０分間処理し、次に、細胞を溶解してウエスタンブロットで分析を行った。等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、続いて、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。転写されたポリフッ化ビニリデン膜を、３％のウシ血清アルブミンを溶解したＰＢＳ緩衝液に６０分間浸漬した後、それぞれ、抗リン酸化ＡＭＰＫ（Ｔｈｒ１７２）抗体（１：２０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗ＡＭＰＫ抗体（１：２０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を加え、４℃で作用させた。１６時間後、対応する二次抗体を加え、室温で１時間反応させた。免疫反応を有するバンドを冷光基質で検出し、ネガフィルムで信号を記録した。得られた信号をスキャンした後、ＴｏｔａｌＬａｂ Ｑｕａｎｔソフトウェア（ＴｏｔａｌＬａｂ）で分析を行った。
Example 1
(Analysis of AMPK activity)
Mouse muscle cells C2C12, mouse fibroblast 3T3, human hepatoma cells Hep G2, human breast cancer cells MCF7, human colon cancer cells HT29, human umbilical vein endothelial cells HUVEC, human acute monocytic leukemia cell line THP1, human macrophage U937, The effects of adenin on AMPK phosphorylation were analyzed for mouse spore cell BV-2, neuroblastoma cell Neuro2A and hair papilla cell Dermal Papilla. Cells are Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 4 mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate and 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA). Incubated in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2. 3 × 10 5 cells were seeded on a 6-well plate, 24 hours later, the cells were treated with a given compound for 30 minutes, then the cells were lysed and analyzed by Western blot. Equal amounts of protein were separated by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and subsequently transferred to a polyvinylidene fluoride membrane. The transcribed polyvinylidene fluoride membrane was immersed in PBS buffer in which 3% bovine serum albumin was dissolved for 60 minutes, and then anti-phosphorylated AMPK (Thr172) antibody (1: 2000, Cell signaling) and anti-AMPK antibody, respectively. (1: 2000, Cell signaling) was added and allowed to act at 4 ° C. After 16 hours, the corresponding secondary antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. Bands with an immune response were detected on cold light substrates and signals were recorded on negative film. After scanning the obtained signal, analysis was performed with the TotalLab Quant software (TotalLab).
アデニンのＡＭＰＫ活性化に対する影響を表１にまとめた。全ての被検細胞において、アデニンは活性化ＡＭＰＫを示した：。 The effects of adenine on AMPK activation are summarized in Table 1. In all test cells, adenine showed activated AMPK :.
実施例２
（グルコース摂取のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析）
蛍光グルコース類似体（２−ＮＢＤＧ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、筋細胞Ｃ２Ｃ１２において、アデニンのグルコース摂取に対する影響を分析した。Ｃ２Ｃ１２細胞を、各濃度のアデニンで、３７℃で３０分間処理した後、５００μＭの蛍光グルコース類似体を加え、室温で５分間インキュベートし、その後、細胞をＫｒｅｂ−Ｈｅｐｅｓ緩衝液で三回洗浄し、７０％のエタノールで固定した。細胞内におけるグルコース類似体の蛍光を蛍光光度計で検出した。
Example 2
(In vitro analysis of glucose intake)
Fluorescent glucose analogs (2-NBDG, Molecular Probes) were used to analyze the effect of adenine on glucose intake in muscle cells C2C12. C2C12 cells were treated with each concentration of adenine at 37 ° C. for 30 minutes, then 500 μM fluorescent glucose analog was added and incubated at room temperature for 5 minutes, after which the cells were washed 3 times with Kreb-Hepes buffer. It was fixed with 70% ethanol. Intracellular fluorescence of glucose analogs was detected with a fluorometer.
アデニンのグルコース摂取に対する影響を表２にまとめた。アデニンは、Ｃ２Ｃ１２細胞のグルコース摂取を著しく促進し、また、濃度依存性を有する。データは、三つの独立した実験の平均値±標準偏差で示される。 The effects of adenine on glucose intake are summarized in Table 2. Adenine significantly promotes glucose uptake in C2C12 cells and is concentration dependent. The data are shown as the mean ± standard deviation of the three independent experiments.
実施例３
（アデニンの抗糖尿病効果）
アデニンの血漿グルコースレベル調節に対する影響をさらに評価するために、高脂肪飼料給餌マウスをＩＩ型糖尿病動物モデルとして試験を行った。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、２２℃、１２時間の明暗サイクルで飼育し、飲食としては無制限に高脂肪飼料（６０％ｋｃａｌ％ｆａｔ）または正常飼料で給餌した。２４週齢のマウスに０．１〜５０ｍｇ／ｋｇのアデニンを腹腔注射で与え、注射後１時間と３時間で血糖値を測定した。高脂肪飼料給餌マウスを一日２回、６日連続に腹腔注射し、最後の一回の投与の１時間後、血漿を収集して、血漿グルコース及びトリグリセリドの含有量を測定した。
Example 3
(Anti-diabetic effect of adenine)
To further evaluate the effect of adenine on plasma glucose level regulation, high-fat diet-fed mice were tested as a type II diabetic animal model. C57BL / 6J mice were bred at 22 ° C. for a 12-hour light-dark cycle and fed with an unlimited amount of high-fat feed (60% kcal% fat) or normal feed. 24-week-old mice were given 0.1 to 50 mg / kg of adenine by intraperitoneal injection, and blood glucose levels were measured 1 hour and 3 hours after the injection. High-fat feed-fed mice were intraperitoneally injected twice daily for 6 consecutive days, and plasma was collected 1 hour after the last dose to measure plasma glucose and triglyceride content.
生理食塩水が投与された高脂肪飼料給餌マウスに比べて、アデニンは、血漿グルコース量を３０％より多く減少させ、トリグリセリド量を３５％より多く減少させ、体重を１５％以上減少させた。 Compared to saline-fed mice, adenine reduced plasma glucose levels by more than 30%, triglyceride levels by more than 35%, and body weight by more than 15%.
実施例４
（アデニンのリポ多糖誘発性炎症反応に対する抑制）
ヒトマクロファージにおいて、シクロオキシゲナーゼ−２タンパク質の量及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の分泌量を検出することにより、アデニンの炎症反応に対する影響を評価した。５０ｎＭ ＰＭＡで２４時間処理することにより、ヒト急性単球白血病細胞株ＴＨＰ１をマクロファージに分化誘導させた。ＴＨＰ１マクロファージを、さらに１０〜６００μＭのアデニンまたは担体を含有する５０ｎｇのリポ多糖で６時間刺激し、次に、細胞を溶解してウエスタンブロットで分析を行った。等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、続いて、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。転写されたポリフッ化ビニリデン膜を、３％ウシ血清アルブミンを溶解したＰＢＳ緩衝液に６０分間浸漬した後、それぞれ、抗シクロオキシゲナーゼ−２抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗アクチン抗体（１：５０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を加え、４℃で作用させた。１６時間後、対応する二次抗体を加え、室温で１時間反応させた。免疫反応を有するバンドを冷光基質で検出し、ネガフィルムで信号を記録した。得られた信号をスキャンした後、ＴｏｔａｌＬａｂ Ｑｕａｎｔソフトウェア（ＴｏｔａｌＬａｂ）で分析を行った。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の分泌量を、酵素結合免疫吸着法で分析した。
Example 4
(Inhibition of adenine against lipopolysaccharide-induced inflammatory response)
Adenin by detecting the amount of cyclooxygenase-2 protein and the amount of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) secreted in human macrophages. The effect on the inflammatory response of By 24 hours at 50 nM PMA, and the human acute monocytic leukemia cell line THP1 induced to differentiate into macrophages. THP1 macrophages were further stimulated with 50 ng of lipopolysaccharide containing 10-600 μM adenine or carrier for 6 hours, then the cells were lysed and analyzed by Western blot. Equal amounts of protein were separated by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and subsequently transferred to a polyvinylidene fluoride membrane. The transcribed polyvinylidene fluoride membrane was immersed in PBS buffer in which 3% bovine serum albumin was dissolved for 60 minutes, and then anti-cyclooxygenase-2 antibody (1: 1000, Cell signaling) and anti-actin antibody (1: 5000), respectively. , Cell signaling) and allowed to act at 4 ° C. After 16 hours, the corresponding secondary antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. Bands with an immune response were detected on cold light substrates and signals were recorded on negative film. After scanning the obtained signal, analysis was performed with the TotalLab Quant software (TotalLab). The amount of tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) secreted was analyzed by enzyme-binding immunoadsorption.
アデニンの免疫反応に対する影響を表３にまとめた。コントロール群に比べて、アデニンで処理されたマクロファージは、シクロオキシゲナーゼ−２タンパク質の発現量及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）及びインターロイキン−６（ＩＬ−６）の分泌量がいずれも著しく低下した。 The effects of adenine on the immune response are summarized in Table 3. Compared to the control group , macrophages treated with adenin showed cyclooxygenase-2 protein expression levels and tumor necrosis factor α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6). ) Was significantly reduced.
実施例５
（アデニンの生体におけるトリニトロベンゼンスルホン酸誘発性炎症反応に対する抑制）
さらに、トリニトロベンゼンスルホン酸誘発性炎症性腸疾患（ＩＢＤ）マウスモデルで、アデニンの炎症反応に対する影響を評価した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、２２℃、１２時間の明暗サイクルで飼育した。０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．２５ｍｇおよび１．５ｍｇという五段階で上昇させた量のトリニトロベンゼンスルホン酸を、それぞれ、５０％のエタノールに溶解させ、毎週マウスに０．１ｍＬ与えて、再発性結腸炎を誘発した。３回目でトリニトロベンゼンスルホン酸を与えた後、毎日腹腔注射でマウスにアデニン（０．０１、０．１、５または３０ｍｇ／ｋｇ体重）及び生理食塩水を与えた。五回目でトリニトロベンゼンスルホン酸を与えた後、その二日後、マウスを犠牲にした。結腸組織溶解液の炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンγ（ＩＮＦγ）、及びインターロイキン（ＩＬ−１７）を酵素結合免疫吸着法で分析した。
Example 5
(Inhibition of adenine against trinitrobenzene sulfonic acid-induced inflammatory reaction in vivo)
In addition, the effect of adenine on the inflammatory response was evaluated in a mouse model of trinitrobenzene sulfonic acid-induced inflammatory bowel disease (IBD). C57BL / 6J mice were bred at 22 ° C. for a 12 hour light-dark cycle. The amount of trinitrobenzene sulfonic acid increased in five steps of 0.5 mg, 0.75 mg, 1.0 mg, 1.25 mg and 1.5 mg was dissolved in 50% ethanol, respectively, and 0.1 mL was added to mice every week. Giving induced recurrent colitis. After the third dose of trinitrobenzene sulfonic acid, mice were given adenine (0.01, 0.1, 5 or 30 mg / kg body weight) and saline by intraperitoneal injection daily. Mice were sacrificed two days after the fifth dose of trinitrobenzene sulfonic acid. Tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma (INFγ), and interleukin (IL-17), which are inflammatory cytokines in colon tissue lysate, were analyzed by enzyme-binding immunoadsorption.
コントロール群マウスに比べて、アデニン投与治療群の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンγ（ＩＮＦγ）及びインターロイキン（ＩＬ−１７）を含む結腸炎症性サイトカインはいずれも著しく減少し、体重損失を改善した。 Compared with control group mice, colon inflammatory cytokines including tumor necrosis factor (TNF), interferon gamma (INFγ) and interleukin (IL-17) in the adenine treatment group were all significantly reduced and weight loss was improved. ..
実施例６
（アミロイドβペプチド及びオートファジー活性の分析）
神経芽細胞腫細胞Ｎｅｕｒｏ２Ａで、アデニンのアミロイドβペプチドに対する影響を分析した。
Example 6
( Analysis of amyloid β peptide and autophagy activity)
The effect of adenine on amyloid β peptide was analyzed in neuroblastoma cells Neuro2A.
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ‐グルタミン、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ２の環境下でインキュベートされた。３×１０５個の細胞を６−ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間後、細胞をＡＰＰ６９５でトランスフェクトし、細胞をアデニンで２４時間処理し、次に、細胞を溶解してウエスタンブロットで分析を行った。等量のタンパク質をドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、続いて、ポリフッ化ビニリデン膜に転写した。転写されたポリフッ化ビニリデン膜を、３％のウシ血清アルブミンを溶解したＰＢＳ緩衝液に６０分間浸漬した後、それぞれ、抗アミロイドβペプチド抗体（１：１０００、Ａｂｅａｍ）、抗ＬＣ３抗体（１：１０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗アクチン抗体（１：５０００、Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を加え、４℃で作用させた。１６時間後、対応する二次抗体を加え、室温で１時間反応させた。免疫反応を有するバンドを冷光基質で検出し、ネガフィルムで信号を記録した。得られた信号をスキャンした後、ＴｏｔａｌＬａｂ Ｑｕａｎｔソフトウェア（ＴｏｔａｌＬａｂ）で分析を行った。 Neuro2A cells are Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 4 mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate and 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA). ), Incubated in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2. 3 × 10 5 cells were seeded on a 6-well plate, 24 hours later, the cells were transfected with APP695, the cells were treated with adenine for 24 hours, then the cells were lysed and analyzed by Western blot. went. Equal amounts of protein were separated by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and subsequently transferred to a polyvinylidene fluoride membrane. The transcribed polyvinylidene fluoride membrane was immersed in PBS buffer in which 3% bovine serum albumin was dissolved for 60 minutes, and then anti-amyloid β peptide antibody (1: 1000, Abeam) and anti-LC3 antibody (1: 1000), respectively. , Cell signaling) and anti-actin antibody (1: 5000, Cell signaling) were added and allowed to act at 4 ° C. After 16 hours, the corresponding secondary antibody was added and reacted at room temperature for 1 hour. Bands with an immune response were detected on cold light substrates and signals were recorded on negative film. After scanning the obtained signal, analysis was performed with the TotalLab Quant software (TotalLab).
アデニンのアミロイドβペプチド及びＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの割合に対する影響を表４にまとめた。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞において、アデニンは、有意にアミロイドβペプチド量を減少させ、ＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの割合を増加させた。ＬＣ３−ＩからＬＣ３−ＩＩへの変換は、オートファジーの活性を示すため、コントロール群細胞に比べて、アデニンで処理された細胞においてより高いＬＣ３−ＩＩ／ＬＣ３−Ｉの割合は、アデニンのオートファジー作用を活性化する機能を表した。 The effects of adenine on the proportions of amyloid β peptide and LC3-II / LC3-I are summarized in Table 4. In Neuro2A cells, adenine significantly reduced the amount of amyloid β peptide and increased the proportion of LC3-II / LC3-I. Because the conversion of LC3-I to LC3-II exhibits autophagy activity, higher proportions of LC3-II / LC3-I in adenine-treated cells compared to control group cells are associated with adenine autophagy. It shows the function of activating the fuzzy action.
実施例７
（アルツハイマー病実験マウスモデルにおいて、アミロイドβペプチドで誘発された神経変性を、アデニンで救助する）
アミロイドβペプチド２５−３５は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）から購入された。ペプチドを無菌生理食塩水に溶解させ、注射する前は、３７℃で７日インキュベートした。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを、２２℃、１２時間の明暗サイクルで飼育した。成体マウスを、ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ、５００ｍｇ／ｋｇ）及びｘｙｌａｚｉｎｅ（１００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、定位注射装置に置いた。５ｎｍｏｌのアミロイドβペプチド２５−３５を１０μｌ注射器で側脳室に注射した。側脳とは、大泉門に対して、座標が−０．５ｍｍ（前後方向）、±１ｍｍ（内外側方向）、−２．５ｍｍ（背腹方向）であるものである。アミロイドβペプチド注射マウスに、毎日腹腔注射でアデニンまたは生理食塩水を与え、アデニンの注射量が０．０１、０．１、５または３０ｍｇ／ｋｇ体重であり、４週間連続で注射した。４週間後、マウスの認知機能を、モリス水迷路で分析した。水迷路は円形プールで行われ、プラットフォームを目標象限の水面下に設置して、隠されたプラットフォーム試験を行った。５日間の隠されたプラットフォーム試験の期間において、毎回の試験では、マウスをプール内にランダムに置いて起点とし、毎日６回試験を行った。５日間の隠されたプラットフォーム試験後の１日は、探索性試験を行った。探索性試験を行った際、隠されたプラットフォームを除去し、目標象限に相対する象限を起点とした。ビデオカメラで、マウスの迷路において泳ぐ状態を６０秒間記録し、ソフトウェアで、マウスのプラットフォームを探した時間及び泳ぐ経路を分析した。
Example 7
(Adenine rescues amyloid β peptide-induced neurodegeneration in an experimental mouse model of Alzheimer's disease)
Amyloid β peptide 25-35 was purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri). Peptides were dissolved in sterile saline and incubated at 37 ° C. for 7 days prior to injection. C57BL / 6J mice were bred at 22 ° C. for a 12 hour light-dark cycle. Adult mice were anesthetized with ketamine (500 mg / kg) and xylazine (100 mg / kg) and placed in a stereotactic injection device. 5 nmol of amyloid β peptide 25-35 was injected into the lateral ventricle with a 10 μl syringe. The lateral brain has coordinates of −0.5 mm (anterior-posterior direction), ± 1 mm (medial-lateral direction), and −2.5 mm (dorsoventral direction) with respect to the anterior fontanelle. Amyloid β peptide-injected mice were given daily intraperitoneal injection of adenine or saline, with adenine injections of 0.01, 0.1, 5 or 30 mg / kg body weight and injected for 4 consecutive weeks. After 4 weeks, the cognitive function of the mice was analyzed in the Morris water maze. The water maze was conducted in a circular pool, with the platform placed below the surface of the target quadrant for hidden platform testing. During the 5-day hidden platform study period, each study was conducted 6 times daily, starting from mice randomly placed in the pool. An exploratory test was conducted one day after the five-day hidden platform test. When the exploratory test was performed, the hidden platform was removed and the starting point was the quadrant opposite the target quadrant. A video camera recorded the state of swimming in the mouse labyrinth for 60 seconds, and the software analyzed the time spent searching for the mouse platform and the swimming path.
隠されたプラットフォーム試験において、コントロール群マウスに比べて、アデニンで治療されたマウスは、プラットフォームを探すのにかかる時間が有意に減少した。この試験結果では、アデニンがアルツハイマー病実験マウスの損傷した学習及び記憶機能を救助することができることを証明した。また、アデニンで治療されたマウスは、探索性試験において、目標象限に停留した時間がコントロール群マウスより長いことから、アデニンが記憶保存を促進させることを証明した。 In a hidden platform trial, mice treated with adenine had a significantly reduced time to search for a platform compared to control group mice. The results of this study demonstrated that adenine can rescue impaired learning and memory function in Alzheimer's disease experimental mice. In addition, mice treated with adenine showed that adenine promoted memory preservation in exploratory studies, as the time spent in the target quadrant was longer than that of the control group mice.
実施例８
（アデニンの繊維芽細胞成長に対する抑制）
ヒト繊維芽細胞株３Ｔ３は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ‐グルタミン、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ２の環境下でインキュベートされた。細胞成長試験において、１×１０５個の細胞を６−ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間後、所定の濃度のアデニンで細胞を７２時間処理し、生存細胞数を計算した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで分離し、トリパンブルーで染色し、血球計数器で生存細胞数を計算した。
Example 8
(Inhibition of adenine on fibroblast growth)
Human fibroblast cell line 3T3 is a dalbecco modification containing 10% fetal bovine serum (FBS), 4 mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate and 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA). It was incubated in Eagle's Medium (DMEM) at 37 ° C. in an environment of 5% CO 2. In the cell growth test, 1 × 10 5 cells were seeded on a 6-well plate, and after 24 hours, the cells were treated with a predetermined concentration of adenine for 72 hours to calculate the number of surviving cells. Cells were separated with trypsin-EDTA, stained with trypan blue, and the number of viable cells was calculated with a hemocytometer.
アデニンの３Ｔ３細胞成長に対する影響を表５にまとめた。表５の結果から、アデニンは、３Ｔ３細胞の成長を著しく抑制し、また、使用量依存性を有することが分かった。データは、三つの独立した実験の平均値±標準偏差で示される。 The effects of adenine on 3T3 cell growth are summarized in Table 5. From the results in Table 5, it was found that adenine significantly suppressed the growth of 3T3 cells and was dose-dependent. The data are shown as the mean ± standard deviation of the three independent experiments.
実施例９
（アデニンが、創傷治癒を強化し、瘢痕形成を抑制する）
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスを２２℃、１２時間の明暗サイクルで飼育した。１２週齢成体マウスをケタミン（５００ｍｇ／ｋｇ）及びｘｙｌａｚｉｎｅ（１００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、マウスの背部に６−ｍｍ皮膚サンプラーで傷口を作った。傷口を形成した後、傷口に１０〜１２００μＭのアデニンまたは食塩水を施用した。皮膚傷口を接着させ、半透性透明シートで傷口の被覆材を固定した。マウスをアデニンまたは生理食塩水で１４日処理した後、犠牲にした。瘢痕形成は、マッソン三色染色で分析された（組織を４％のパラホルムアルデヒドで固定した）。
Example 9
(Adenine enhances wound healing and suppresses scar formation)
C57BL / 6J mice were bred at 22 ° C. for a 12-hour light-dark cycle. 12-week-old adult mice were anesthetized with ketamine (500 mg / kg) and xylazine (100 mg / kg), and wounds were made on the back of the mice with a 6-mm skin sampler. After forming the wound, 10-1200 μM adenine or saline solution was applied to the wound. The skin wound was adhered and the wound dressing was fixed with a semipermeable transparent sheet. Mice were sacrificed after treatment with adenine or saline for 14 days. Scar formation was analyzed by Masson trichrome stain (tissue fixed with 4% paraformaldehyde).
１４日間の処理後、アデニンで処理された傷口の治癒速度は、コントロール群より速く、また、組織染色分析によると、アデニンで処理された傷口の再生組織の瘢痕は、コントロール群の傷口に比べて、著しく小さかった。 After 14 days of treatment, the healing rate of adenine-treated wounds was faster than in the control group, and tissue staining analysis showed that scars in regenerated tissue of adenine-treated wounds were compared to wounds in the control group. , Was significantly smaller.
実施例１０
（アデニンは、活性酸素種の生成を低下させる）
ヒト臍帯静脈内皮細胞ＨＵＶＥＣは、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ‐グルタミン、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ２の環境下でインキュベートされた。２×１０４個の細胞を９６−ｗｅｌｌ黒プレートに播種し、２４時間後、インキュベート培地を５．６または３０ｍＭのグルコースを含むＤＭＥＭインキュベート培地に置換し、所定の濃度のアデニンを加えた。２４時間処理した後、細胞内の活性酸素種をＨ２ＤＣＦ−ＤＡで検出した。細胞をＰＢＳ緩衝液で１回洗浄した後、１００μＭのＤＣＦに、３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＣＦ蛍光をプレート型蛍光分析装置で分析した（励起波長：４８５ｎｍ、散乱波長：５３０ｎｍ）。
Example 10
(Adenine, it reduces the generation of the active oxygen species)
Human umbilical vein endothelial cell HUVEC contains Dalveco modifications containing 10% fetal bovine serum (FBS), 4 mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate and 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA). It was incubated in Eagle's medium (DMEM) at 37 ° C. in an environment of 5% CO 2. 2 × 10 4 cells were seeded on a 96-well black plate, and after 24 hours, the incubation medium was replaced with DMEM incubation medium containing 5.6 or 30 mM glucose, and adenine at a predetermined concentration was added. After 24 hours, it was detected active oxygen species in the cells H2DCF-DA. The cells were washed once with PBS buffer and then incubated in 100 μM DCF for 30 minutes at 37 ° C. DCF fluorescence was analyzed with a plate-type fluorescence analyzer (excitation wavelength: 485 nm, scattering wavelength: 530 nm).
アデニンの活性酸素種生成に対する影響を表６にまとめた。アデニンは、高グルコースで誘発された活性酸素種の生成を有意に減少させ、また、使用量依存性を有する。 The impact to the active oxygen species generation of adenine are summarized in Table 6. Adenine, significantly reduced the generation of induced activity oxygen species in high glucose, also has a usage dependent.
実施例１１
（癌細胞成長抑制試験）
ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ７及びヒト結腸癌細胞ＨＴ２９で、アデニンの癌細胞成長に対する影響の評価を行った。細胞は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ‐グルタミン、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ２の環境下でインキュベートされた。１×１０５個の細胞を６−ｗｅｌｌプレートに播種し、２４時間後、所定の濃度のアデニンで細胞を７２時間処理し、生存細胞数を計算した。細胞をトリプシン−ＥＤＴＡで分離し、トリパンブルーで染色し、血球計数器で生存細胞数を計算した。
Example 11
(Cancer cell growth suppression test)
The effects of adenine on cancer cell growth were evaluated in human hepatocellular carcinoma cell Hep G2, human breast cancer cell MCF7, and human colon cancer cell HT29. Cells are Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum (FBS), 4 mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate and 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA). Incubated in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2. 1 × 10 5 cells were seeded on a 6-well plate, and after 24 hours, the cells were treated with a predetermined concentration of adenine for 72 hours to calculate the number of viable cells. Cells were separated with trypsin-EDTA, stained with trypan blue, and the number of viable cells was calculated with a hemocytometer.
アデニンのＨｅｐ Ｇ２、ＭＣＦ７、ＨＴ２９に対する５０％成長抑制濃度は、それぞれ、５４４．１、５３７．５、５３１．９μＭである。 The 50% growth inhibitory concentrations of adenine with respect to Hep G2, MCF7 and HT29 are 544.1, 537.5 and 531.9 μM, respectively.
実施例１２
（腫瘍成長試験）
ヒト肝癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２は、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、４ｍＭのＬ‐グルタミン、２ｍＭのピルビン酸ナトリウム及び１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で、３７℃、５％ＣＯ２の環境下でインキュベートされた。５×１０６個の細胞を皮下注射で８週齢ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに注射した。移植後、毎日腹腔注射でマウスに５、２０、５０ｍｇ／ｋｇ体重のアデニンを与え、３日ごとに腫瘍の大きさを測定した。移植後の１４日、コントロール群マウスに比べて、アデニンを与えることにより、腫瘍の成長を著しく遅延させた。
Example 12
(Tumor growth test)
Human hepatoma cell Hep G2 is Dalbeco modified Eagle containing 10% fetal bovine serum (FBS), 4 mM L-glutamine, 2 mM sodium pyruvate and 1% penicillin / streptomycin (Invitrogen GibcoBRL, Carlsbad, CA, USA). Incubated in medium (DMEM) in an environment of 37 ° C. and 5% CO 2. 5 × 10 6 cells were injected subcutaneously into 8-week-old NOD-SCID mice. After transplantation, mice were given 5, 20, 50 mg / kg body weight of adenine by intraperitoneal injection daily, and tumor size was measured every 3 days. On the 14th day after transplantation, the tumor growth was significantly delayed by giving adenine as compared with the control group mice.
上記の実施例は、本発明を十分に説明するために挙げられた好ましい実施例に過ぎず、本発明の保護範囲は、これらに限定されない。本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が本発明の内容に基づいて行った同等の置換または変化は、本発明の保護範囲内である。本発明の保護範囲は、特許請求の範囲に基づいている。 The above examples are merely preferable examples given to fully explain the present invention, and the scope of protection of the present invention is not limited thereto. Equivalent substitutions or alterations made on the basis of the content of the invention by a person having ordinary knowledge in the art of the invention are within the scope of the invention. The scope of protection of the present invention is based on the claims.
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