JP6860919B2 - Mesenchymal KRAS mutant cancer therapeutic agent - Google Patents

Mesenchymal KRAS mutant cancer therapeutic agent Download PDF

Info

Publication number
JP6860919B2
JP6860919B2 JP2017551900A JP2017551900A JP6860919B2 JP 6860919 B2 JP6860919 B2 JP 6860919B2 JP 2017551900 A JP2017551900 A JP 2017551900A JP 2017551900 A JP2017551900 A JP 2017551900A JP 6860919 B2 JP6860919 B2 JP 6860919B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
fgfr1
mesenchymal
inhibitor
expression
kras mutant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017551900A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPWO2017086332A1 (en
Inventor
寛倫 衣斐
寛倫 衣斐
聖二 矢野
聖二 矢野
秀典 北井
秀典 北井
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kanazawa University NUC
Original Assignee
Kanazawa University NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kanazawa University NUC filed Critical Kanazawa University NUC
Publication of JPWO2017086332A1 publication Critical patent/JPWO2017086332A1/en
Application granted granted Critical
Publication of JP6860919B2 publication Critical patent/JP6860919B2/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Description

本発明は、間葉系KRAS変異型がんを標的とする治療剤及び医薬組成物に関する。本発明はまた、間葉系KRAS変異型がんのための検出試薬、及び該検出試薬を用いた、がんの診断及びがん治療の有効性予測のためのデータを取得する方法に関する。 The present invention relates to therapeutic agents and pharmaceutical compositions targeting mesenchymal KRAS mutant cancer. The present invention also relates to a detection reagent for mesenchymal KRAS mutant cancer and a method for obtaining data for diagnosing cancer and predicting the effectiveness of cancer treatment using the detection reagent.

肺がんは年間7万人の死亡者数を認め、部位別がん死亡の第一位であり、全ステージにわたる5年生存率は15％未満である。本邦においては、組織型では腺がんが50%を占め、このうちKRAS（K-RAS又はK-rasともいう）遺伝子変異が10%で認められる。KRAS遺伝子変異は肺がんのみならず、大腸がん、膵臓がんにも高頻度に認められ、がんにおいて最も多い遺伝子変異である。 Lung cancer has 70,000 deaths annually and is the number one site-specific cancer death, with a 5-year survival rate of less than 15% across all stages. In Japan, adenocarcinoma accounts for 50% of histological types, of which 10% have KRAS (also called K-RAS or K-ras) gene mutations. KRAS gene mutations are frequently found not only in lung cancer but also in colorectal cancer and pancreatic cancer, and are the most common gene mutations in cancer.

正常細胞において、KRASはMAPK（マイトジェン活性化プロテインキナーゼ）シグナル伝達経路の主要構成タンパク質である一方、KRASの変異は細胞のがん化につながり、変異したKRASはこの経路の多くの下流シグナルタンパク質を活性化し、腫瘍細胞の生存・増殖を維持している。しかしながらKRASタンパク質の活性を直接阻害する薬剤の開発は困難とされ、現在のところ有効な治療法が同定されていない。このため、KRAS変異腫瘍において生存に重要なタンパク質を阻害し、治療に結びつける試みがなされている。 In normal cells, KRAS is a major constituent protein of the MAPK (mitogen-activated protein kinase) signaling pathway, while mutations in KRAS lead to cell carcinogenesis, and mutated KRAS can produce many downstream signaling proteins in this pathway. It is activated and maintains the survival and proliferation of tumor cells. However, it is difficult to develop a drug that directly inhibits the activity of KRAS protein, and no effective therapeutic method has been identified at present. For this reason, attempts have been made to inhibit proteins important for survival in KRAS mutant tumors and link them to treatment.

近年、KRASエフェクター経路の標的化が代替治療として注目されている。本発明者等のグループは、これまでMAPKシグナル伝達経路を構成するKRAS又はRAFに変異を有する大腸がんに対して、これらのがん遺伝子に制御される下流のシグナルを遮断することが有効であることを示してきた(非特許文献１及び２)。特に、KRAS変異大腸がんについては、MAPKシグナルの抑制が重要であること、一方でMAPKシグナルの抑制のみでは腫瘍の縮小が得られず、別の下流シグナルであるPI3Kの抑制を同時に行うことで腫瘍の縮小が得られることを明らかにしてきた。これらの検討の結果により、現在KRAS変異、RAF変異大腸がんを対象として複数の臨床試験が進行中である(NCT01562899, NCT01750918, NCT01791309)。 In recent years, targeting the KRAS effector pathway has attracted attention as an alternative treatment. It is effective for the group of the present inventors to block downstream signals controlled by these oncogenes for colorectal cancers having mutations in KRAS or RAF that constitute the MAPK signal transduction pathway. It has been shown that there is (Non-Patent Documents 1 and 2). In particular, for KRAS mutant colorectal cancer, suppression of MAPK signal is important, while suppression of MAPK signal alone does not result in tumor shrinkage, and suppression of another downstream signal, PI3K, is performed at the same time. It has been clarified that tumor shrinkage can be obtained. Based on the results of these studies, multiple clinical trials are currently underway for KRAS and RAF mutant colorectal cancers (NCT01562899, NCT01750918, NCT01791309).

一方、オランダのグループより、MAPK/ERKキナーゼ（MEK）阻害剤と、細胞表面受容体であるERBB3（ErbB3ともいう）の阻害の組合せがKRAS変異肺がんにおいて有効であることが示され（非特許文献３)、臨床試験が進行中である(NCT02039336)。 On the other hand, a Dutch group showed that a combination of a MAPK / ERK kinase (MEK) inhibitor and inhibition of the cell surface receptor ERBB3 (also called ErbB3) is effective in KRAS mutant lung cancer (non-patent literature). 3) Clinical trials are underway (NCT02039336).

また、昨今の科学技術の進歩に伴い、個々の患者の遺伝子やタンパク質等の情報からその患者に適した治療方法を選択する個別化医療が進展している。特定の標的分子の発現等を前提とした分子標的薬等の開発に伴い、治療薬の選択に用いられる診断薬等の重要性が認識されるようになってきている。 In addition, with the recent advances in science and technology, personalized medicine that selects a treatment method suitable for each patient from information such as genes and proteins of each patient is advancing. With the development of molecular-targeted drugs and the like premised on the expression of specific target molecules, the importance of diagnostic agents and the like used for selecting therapeutic drugs has come to be recognized.

J Clin Invest. 121:4311-21, 2011J Clin Invest. 121: 431-12-11, 2011 Cancer Discovery 2:227-35,2012Cancer Discovery 2: 227-35,2012 Sun C et al. Cell Reports 7:86-93, 2014Sun C et al. Cell Reports 7: 86-93, 2014

MAPKはKRASの周知のエフェクター経路である一方、臨床的に入手可能なMAPK阻害剤でこの経路を遮断することで得られる効果は限定的なものである。これは、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）-AKT及びNF-κB経路等のKRASによる他の複数のエフェクターの活性化と関連し得る。また、本発明者等は、KRAS変異型肺がんに対してMEK阻害剤処理を行うことでMAPK経路のフィードバック活性化が起こることを確認した。上皮系のKRAS変異型肺がんにおいて、このフィードバックは、ERBB3が介在するMEKの再活性化に関わっていた。 While MAPK is a well-known effector pathway for KRAS, blocking this pathway with clinically available MAPK inhibitors has limited effect. This may be associated with activation of multiple other effectors by KRAS, such as the phosphoinositide 3-kinase (PI3K) -AKT and NF-κB pathways. In addition, the present inventors have confirmed that feedback activation of the MAPK pathway occurs by treating KRAS mutant lung cancer with a MEK inhibitor. In epithelial KRAS mutant lung cancer, this feedback was involved in ERBB3-mediated reactivation of MEK.

しかし、KRAS変異型腫瘍の中にはERBB3を発現しないものも多く、上記の非特許文献３で示された併用療法は、このような腫瘍に対しては無効であると考えられる。従って、ERBB3を発現していないKRAS変異がんにおいてMEK阻害剤と併用効果を示す薬剤を同定することが急務と考えられる。 However, many KRAS mutant tumors do not express ERBB3, and the combination therapy shown in Non-Patent Document 3 above is considered to be ineffective for such tumors. Therefore, it is urgent to identify a drug that has a combined effect with a MEK inhibitor in KRAS mutant cancer that does not express ERBB3.

上皮間葉移行（epithelial-mesenchymal transition, EMT）は、発達プロセス及び組織修復における必須のメカニズムである。EMTはまた、細胞骨格動態のシフトにつながる細胞間接着の喪失を促進することによってがんの進行に関わる。EMTの特徴として、E-カドヘリン発現の喪失と、付随する間葉系マーカー、例えばビメンチンの上昇が挙げられる。 Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is an essential mechanism in developmental processes and tissue repair. EMT is also involved in cancer progression by promoting loss of cell-cell adhesion that leads to a shift in cytoskeletal dynamics. EMT is characterized by loss of E-cadherin expression and an increase in associated mesenchymal markers such as vimentin.

本発明者等は、KRAS変異型がんが上皮系であるか間葉系であるかによって、MEKの阻害によって引き起こされる受容体チロシンキナーゼ（RTK）の活性化が相違することを見出した。上皮系KRAS変異型がん細胞では、MEKの阻害はERBB3を上方制御し、その結果、MAPKシグナル伝達が再活性化される。これに対して、間葉系KRAS変異型がん細胞は、ERBB3発現を欠損しており、その代わりに線維芽細胞増殖因子受容体1（FGFR1）が高い発現を示すことが判明した。そして、このような細胞では、MEK阻害はFGFR1シグナル伝達のフィードバック活性化を誘導することが明らかになった。 The present inventors have found that the activation of receptor tyrosine kinase (RTK) caused by inhibition of MEK differs depending on whether the KRAS mutant cancer is epithelial or mesenchymal. In epithelial KRAS mutant cancer cells, inhibition of MEK upregulates ERBB3, resulting in reactivation of MAPK signaling. In contrast, mesenchymal KRAS mutant cancer cells were found to be deficient in ERBB3 expression and instead show high expression of fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1). Then, in such cells, MEK inhibition was found to induce feedback activation of FGFR1 signaling.

更に本発明者等は、間葉系KRAS変異型がんにおいて、FGFR1とMEKとを併せて阻害することで、in vitroで強力なアポトーシスが生じると共に、in vivoにおいても腫瘍の退縮が生じることを確認した。これらのデータから、FGFR1シグナル伝達のフィードバック活性化によって間葉系KRAS変異型肺がんにおけるMEK阻害剤の効果が減弱されることが示され、FGFR1阻害剤とMEK阻害剤の組合せによってこれらのがんを効果的に治療するという治療的アプローチが確立される。 Furthermore, the present inventors have stated that in mesenchymal KRAS mutant cancer, inhibition of FGFR1 and MEK together causes strong apoptosis in vitro and tumor regression in vivo. confirmed. These data indicate that feedback activation of FGFR1 signaling diminishes the effectiveness of MEK inhibitors in mesenchymal KRAS mutant lung cancer, and the combination of FGFR1 and MEK inhibitors can be used to treat these cancers. A therapeutic approach of effective treatment is established.

本発明者等はこれらの知見に基づいて、本発明を完成するに到った。すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．線維芽細胞増殖因子受容体1（FGFR1）阻害剤を含む、間葉系KRAS変異型がん治療剤。
２．MAPK/ERKキナーゼ（MEK）阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、上記１記載の治療剤。
３．FGFR1阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、MEK阻害剤を含む間葉系KRAS変異型がん治療剤。
４．上記１もしくは２記載の治療剤、又は上記３記載の治療剤を有効成分として含有する、医薬組成物。
５．FGFR1タンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子の検出を可能とする、間葉系がん細胞検出試薬。
６．上記５記載の間葉系がん細胞検出試薬と、KRAS遺伝子変異検出試薬を含む、細胞型判定試薬セット。
７．上記５記載の間葉系がん細胞検出試薬と、上皮系がん細胞検出試薬の組合せを含む、細胞型判定試薬セット。
８．更なる間葉系がん細胞検出試薬としてビメンチンの検出を可能とする検出試薬を含む、上記６又は７記載の細胞型判定試薬セット。
９．上皮系がん細胞検出試薬としてE-カドヘリン及び／又はERBB3の検出を可能とする検出試薬を含む、上記７又は８記載の細胞型判定試薬セット。
１０．がんと診断された患者由来のサンプルを、上記５記載の間葉系がん細胞検出試薬又は上記６〜９のいずれか記載の細胞型判定試薬セットと接触させ、FGFR1の発現を指標として間葉系KRAS変異型がんの存在又は不存在を検出することを含む、患者に対するがん治療の有効性予測のためのデータを取得する方法。The present inventors have completed the present invention based on these findings. That is, the present invention provides the following.
1. 1. A therapeutic agent for mesenchymal KRAS mutant cancer, which comprises a fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) inhibitor.
2. The therapeutic agent according to 1 above, which is administered in combination with a MAPK / ERK kinase (MEK) inhibitor.
3. 3. A mesenchymal KRAS mutant cancer therapeutic agent containing a MEK inhibitor, which is characterized by being administered in combination with an FGFR1 inhibitor.
4. A pharmaceutical composition containing the therapeutic agent according to 1 or 2 above or the therapeutic agent according to 3 above as an active ingredient.
5. A mesenchymal cancer cell detection reagent that enables detection of the FGFR1 protein or a gene encoding the protein.
6. A cell type determination reagent set containing the mesenchymal cancer cell detection reagent described in 5 above and the KRAS gene mutation detection reagent.
7. A cell type determination reagent set containing a combination of the mesenchymal cancer cell detection reagent described in 5 above and the epithelial cancer cell detection reagent.
8. The cell type determination reagent set according to 6 or 7 above, which comprises a detection reagent that enables detection of vimentin as a further mesenchymal cancer cell detection reagent.
9. The cell type determination reagent set according to 7 or 8 above, which comprises a detection reagent capable of detecting E-cadherin and / or ERBB3 as an epithelial cancer cell detection reagent.
10. A sample derived from a patient diagnosed with cancer is brought into contact with the mesenchymal cancer cell detection reagent described in 5 above or the cell type determination reagent set described in any of 6 to 9 above, and the expression of FGFR1 is used as an index. A method for obtaining data for predicting the efficacy of cancer treatment for a patient, including detecting the presence or absence of foliar KRAS mutant cancer.

本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-227015号の開示内容を包含する。 This specification includes the disclosure of Japanese Patent Application No. 2015-227015, which is the basis of the priority of the present application.

FGFR1は、間葉系KRAS変異型がんの新たなマーカーとなり得る。本発明により、がんが疑われる被験者、又はがんと診断された患者に対して、間葉系KRAS変異型がんの存在又は不存在をより高精度で検出することが可能となると共に、間葉系KRAS変異型がんに対して有効な治療剤を提供することができる。 FGFR1 may be a new marker for mesenchymal KRAS mutant cancer. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, the presence or absence of mesenchymal KRAS mutant cancer can be detected with higher accuracy in a subject suspected of having cancer or a patient diagnosed with cancer. It is possible to provide an effective therapeutic agent for mesenchymal KRAS mutant cancer.

ERBB3発現細胞株においてERBB3がトラメチニブ処理後にリン酸化ERKのフィードバック活性化を仲介することを示す。(a)ERBB3を発現するNCI-H358及びNCI-H1573細胞を、1μMのpan-EGFR阻害剤アファチニブ、50nMのトラメチニブ、又はこれら2つの薬剤の組合せで48時間処理し、溶解液を抗体でプローブした。これらの薬剤処理により誘導されるアポトーシスをcleaved PARP (cl-PARP)により評価した。(b)ERBB3を発現しないNCI-H1792及びLU99細胞を、(a)と同じ薬剤で処理した。NCI-H358の溶解液をERBB3発現の陽性対照として使用した。We show that ERBB3 mediates feedback activation of phosphorylated ERK after trametinib treatment in ERBB3-expressing cell lines. (a) NCI-H358 and NCI-H1573 cells expressing ERBB3 were treated with 1 μM pan-EGFR inhibitor afatinib, 50 nM trametinib, or a combination of these two agents for 48 hours, and the lysate was probed with an antibody. .. Apoptosis induced by these drug treatments was evaluated by cleaved PARP (cl-PARP). (b) NCI-H1792 and LU99 cells that do not express ERBB3 were treated with the same drug as in (a). A lysate of NCI-H358 was used as a positive control for ERBB3 expression. 間葉系KRAS変異型肺がん細胞株においてFGFR1が優位に発現していることを示す。(a)ERBB3、E-カドヘリン及びビメンチンの発現を、上皮系及び間葉系の複数のKRAS変異型肺がん細胞株の溶解液のウエスタンブロッティングによって解析した。アクチンはローティング対照である。独立した実験を3回ずつ実施し、代表的な結果を示す。(b)上皮系KRAS変異型肺がん細胞株NCI-H358を、EMTを誘導するためTGFβ1（4ng/mL）又はPBSで14日間処理した後、細胞からRNAを抽出し、遺伝子発現プロファイルを比較した。TGFβ1処理後に最も発現上昇した30個の遺伝子リストを示す。(c)TGFβ1又はPBSで処理したNCI-H358細胞から溶解液を抽出し、ERBB3、FGFR1及びEMTマーカーに対する抗体を用いてイムノブロットした。アクチンはローディング対照として用いた。独立した実験を3回ずつ実施し、代表的な結果を示す。It is shown that FGFR1 is predominantly expressed in the mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell line. (a) Expression of ERBB3, E-cadherin and vimentin was analyzed by western blotting of lysates of multiple KRAS mutant lung cancer cell lines of epithelial and mesenchymal lines. Actin is a rotating control. Independent experiments were performed 3 times each and representative results are shown. (b) The epithelial KRAS mutant lung cancer cell line NCI-H358 was treated with TGFβ1 (4 ng / mL) or PBS for 14 days to induce EMT, then RNA was extracted from the cells and the gene expression profiles were compared. The list of 30 genes with the highest expression after TGFβ1 treatment is shown. (c) The lysate was extracted from NCI-H358 cells treated with TGFβ1 or PBS and immunoblotted with antibodies against ERBB3, FGFR1 and EMT markers. Actin was used as a loading control. Independent experiments were performed 3 times each and representative results are shown. 間葉系KRAS変異型肺がん細胞株においてFGFR1が優位に発現していることを示す。(d)Cancer Cell Line Encyclopedia（CCLE）データベースから入手した39種のKRAS変異型非小細胞肺がん細胞株の教師なし階層的クラスタリング（Unsupervised hierarchical clustering）を示す。合計2635種の遺伝子のうち、6以上の平均発現値を有する細胞株間で5倍以上の変化を示す遺伝子を解析した。(e)ERBB3とE-カドヘリンの発現の正の相関を示す。線形回帰分析によりp<0.001。(f)FGFR1とE-カドヘリンの発現の負の相関を示す。線形回帰分析によりp<0.001。It is shown that FGFR1 is predominantly expressed in the mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell line. (d) Unsupervised hierarchical clustering of 39 KRAS mutant non-small cell lung cancer cell lines obtained from the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) database is shown. Out of a total of 2635 genes, genes showing a 5-fold or more change between cell lines having an average expression value of 6 or more were analyzed. (e) Shows a positive correlation between ERBB3 and E-cadherin expression. P <0.001 by linear regression analysis. (f) Shows a negative correlation between FGFR1 and E-cadherin expression. P <0.001 by linear regression analysis. トラメチニブがFGFR1を介してFRS2のリン酸化のフィードバック活性化を誘導することを示す。(a)上皮系及び間葉系の複数のKRAS変異型肺がん細胞株の溶解液のウェスタンブロッティングによってFGFR1タンパク質の発現を解析した。アクチンはローディング対照である。独立した実験を3回実施し、代表的な結果を示す。(b)長時間のMEK阻害は、FGFR1が下流シグナルを活性化する際に必要なアダプタータンパクであるFRS2の強い活性上昇をもたらした。ERBB3を発現しないNCI-H1792及びLU99細胞を50nMのトラメチニブで所定の時間処理し、溶解液を抗体でプローブした。(c)FGFR1はトラメチニブ処理後のFRS2リン酸化を仲介する。FGFR1を標的とする2種のsiRNA又はスクランブルsiRNA（Scr、対照）をNCI-H1792細胞に導入し、48時間培養した。次いで、培地を50nMのトラメチニブを含有するもしくは含有しない培地と交換し、更に48時間細胞を処理した。溶解液を抗体でプローブした。独立した実験を3回実施し、代表的な結果を示す。We show that trametinib induces feedback activation of FRS2 phosphorylation via FGFR1. (a) Expression of FGFR1 protein was analyzed by Western blotting of lysates of multiple KRAS mutant lung cancer cell lines of epithelial and mesenchymal lines. Actin is a loading control. Independent experiments were performed 3 times and representative results are shown. (b) Prolonged MEK inhibition resulted in a strong increase in the activity of FRS2, an adapter protein required for FGFR1 to activate downstream signals. NCI-H1792 and LU99 cells that did not express ERBB3 were treated with 50 nM trametinib for a predetermined time, and the lysate was probed with an antibody. (c) FGFR1 mediates FRS2 phosphorylation after trametinib treatment. Two siRNAs targeting FGFR1 or scrambled siRNAs (Scr, control) were introduced into NCI-H1792 cells and cultured for 48 hours. The medium was then replaced with medium containing or not containing 50 nM trametinib and the cells were treated for an additional 48 hours. The lysate was probed with antibody. Independent experiments were performed 3 times and representative results are shown. MEK阻害剤とFGFR阻害剤との組合せが間葉系KRAS変異型肺がんにおいて細胞死を効果的に誘導することを示す。(a)間葉系KRAS変異型肺がん細胞株NCI-H1792及びLU99を、1μMのpan-FGFR阻害剤NVP-BGJ398、50nMのトラメチニブ、又はこれらの薬剤の組合せで48時間処理し、溶解液を抗体でプローブした。(b)NCI-H1792及びLU99を、1μMのpan-FGFR阻害剤NVP-BGJ398、1μMのセルメチニブ、又はこれらの薬剤の組合せで48時間処理し、溶解液を抗体でプローブした。(c)NCI-H1792及びLU99を、1μMのpan-FGFR阻害剤NVP-BGJ398、50nMのPD0325901、又はこれらの薬剤の組合せで48時間処理し、溶解液を抗体でプローブした。(d)NCI-H1792を、DMSO、1μMのアファチニブ（Afa）、及び1μMのNVP-BGJ398（BGJ）各単剤、または50nMのトラメチニブとの併用で処理し、72時間毎に培地を交換しながら6日間培養した。次いで、細胞培養プレートをクリスタルバイオレットで染色した。代表的なプレートを示す。(e)LU99細胞を用いて(d)と同様の実験を行った結果を示す。We show that the combination of MEK inhibitor and FGFR inhibitor effectively induces cell death in mesenchymal KRAS mutant lung cancer. (a) Mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines NCI-H1792 and LU99 are treated with 1 μM pan-FGFR inhibitor NVP-BGJ398, 50 nM trametinib, or a combination of these agents for 48 hours, and the lysate is antibody. Probed in. (b) NCI-H1792 and LU99 were treated with 1 μM pan-FGFR inhibitor NVP-BGJ398, 1 μM selmethinib, or a combination of these agents for 48 hours, and the lysate was probed with an antibody. (c) NCI-H1792 and LU99 were treated with 1 μM pan-FGFR inhibitor NVP-BGJ398, 50 nM PD0325901, or a combination of these agents for 48 hours, and the lysate was probed with an antibody. (d) NCI-H1792 was treated with DMSO, 1 μM afatinib (Afa), and 1 μM NVP-BGJ398 (BGJ) alone, or in combination with 50 nM trametinib, with medium changes every 72 hours. Incubated for 6 days. Cell culture plates were then stained with crystal violet. A typical plate is shown. (e) The results of the same experiment as in (d) using LU99 cells are shown. トラメチニブ（Tram）とFGFR阻害剤との組合せが間葉系KRAS変異型肺がんにおいて細胞死を効果的に誘導することを示す。(f)NCI-H1792細胞を、図４−１(a)と同様の薬剤及び薬剤の組合せで72時間処理し、フローサイトメトリー（FACS）で解析してアネキシン陽性細胞を定量した。3回の独立した実験の平均±SDを示す（Student t検定によりp<0.05）。(g)LU99細胞を用いて(f)と同様の実験を行った結果を示す。(h)上皮系KRAS変異型肺がん細胞株NCI-H358及びNCI-H1573を、図４−１(a)と同様に処理した。トラメチニブ処理後のリン酸化FRS2の誘導の陽性対照として、LU99細胞の溶解液を使用した。(i)トラメチニブ、又はトラメチニブ＋NVP-BGJ398で処理後のERKのリン酸化レベルを、7種の間葉系KRAS変異型がん細胞株で定量した結果を示す。比較のために対応のあるStudent t検定を使用した。(j)トラメチニブ、又はトラメチニブとNVP-BGJ398の組み合わせによる、7種の間葉系KRAS変異型肺がん細胞株におけるアポトーシスの誘導を示す。比較のために対応のあるStudent t検定を使用した。We show that the combination of trametinib (Tram) and an FGFR inhibitor effectively induces cell death in mesenchymal KRAS mutant lung cancer. (f) NCI-H1792 cells were treated with the same drug and drug combination as in FIG. 4-1 (a) for 72 hours and analyzed by flow cytometry (FACS) to quantify annexin-positive cells. It shows the mean ± SD of 3 independent experiments (p <0.05 by Student's t-test). (g) The results of the same experiment as in (f) using LU99 cells are shown. (h) Epithelial KRAS mutant lung cancer cell lines NCI-H358 and NCI-H1573 were treated in the same manner as in FIG. 4-1 (a). A lysate of LU99 cells was used as a positive control for the induction of phosphorylated FRS2 after trametinib treatment. (i) The results of quantifying the phosphorylation level of ERK after treatment with trametinib or trametinib + NVP-BGJ398 in 7 mesenchymal KRAS mutant cancer cell lines are shown. A paired Student's t-test was used for comparison. (j) Induction of apoptosis in 7 mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines by trametinib or a combination of trametinib and NVP-BGJ398 is shown. A paired Student's t-test was used for comparison. 上皮系KRAS変異型細胞であるNCI-H358にEMTを誘導した細胞におけるMAPKシグナル伝達のフィードバック活性化にFGFR1-FRS2経路が関与することを示す。(a)EMT誘導のために、NCI-H358細胞をTGFβ1（4ng/mL）で14日間処理した。次いで、得られたEMT誘導細胞（NCI-H358-TGFβと示す）を、1μMのpan-FGFR阻害剤NVP-BGJ398、50nMトラメチニブ、又はこれらの薬剤の組合せで48時間処理し、溶解液を抗体でプローブした。(b)NCI-H358又はNCI-H358-TGFβを1μMのpan-FGFR阻害剤NVP-BGJ398、50nMトラメチニブ、又はこれらの薬剤の組合せで72時間処理し、FACSで解析してアネキシン陽性細胞を定量した。3回の独立した実験の平均±SDを示す。(c)NCI-H358-TGFβ細胞に、FGFR1を標的とする2種のsiRNA又はスクランブルsiRNA（対照）をトランスフェクトし、48時間培養した。次いで、培地を50nMのトラメチニブを含有するか含有しない培地と交換し、更に48時間細胞を処理した。FACS解析でアポトーシスを起こした細胞のパーセンテージをアネキシンV陽性率により測定し、対照のsiRNAをトランスフェクトした細胞と比較して示す。3回の独立した実験の平均±SDを示す。We show that the FGFR1-FRS2 pathway is involved in the feedback activation of MAPK signaling in cells in which EMT is induced in NCI-H358, an epithelial KRAS mutant cell. (a) NCI-H358 cells were treated with TGFβ1 (4 ng / mL) for 14 days for EMT induction. The resulting EMT-induced cells (denoted as NCI-H358-TGFβ) were then treated with 1 μM pan-FGFR inhibitor NVP-BGJ398, 50 nM trametinib, or a combination of these agents for 48 hours and the lysate with antibody. Probed. (b) NCI-H358 or NCI-H358-TGFβ was treated with 1 μM pan-FGFR inhibitor NVP-BGJ398, 50 nM trametinib, or a combination of these agents for 72 hours and analyzed by FACS to quantify annexin-positive cells. .. The mean ± SD of 3 independent experiments is shown. (c) NCI-H358-TGFβ cells were transfected with two siRNAs targeting FGFR1 or scrambled siRNA (control) and cultured for 48 hours. The medium was then replaced with medium containing or not containing 50 nM trametinib and the cells were treated for an additional 48 hours. The percentage of cells that have undergone apoptosis by FACS analysis is measured by the annexin V positive rate and shown in comparison with cells transfected with control siRNA. The mean ± SD of 3 independent experiments is shown. FGFR阻害剤とMEK阻害剤との組合せによって間葉系KRAS変異型肺がんのin vivoでの腫瘍が退縮することを示す。(a)生理食塩水（対照）、NVP-BGJ398 15mg/kg、トラメチニブ 0.6mg/kg、及びNVP-BGJ398とトラメチニブとの併用によって、LU99異種移植片を処理した。薬剤は、1日1回マウスに経口投与した。腫瘍体積を処理開始時点から経時的にプロットした（平均±SEM）。★Student t検定によりp<0.05。(b)25日間の処理後の個々のLU99腫瘍について、初期体積に対する腫瘍体積のパーセント変化を示すウォーターフォールプロットを示す。対照群のデータは11日目に取得した。We show that the combination of FGFR inhibitor and MEK inhibitor causes in vivo tumor regression of mesenchymal KRAS mutant lung cancer. (a) LU99 xenografts were treated with saline (control), NVP-BGJ398 15 mg / kg, trametinib 0.6 mg / kg, and NVP-BGJ398 in combination with trametinib. The drug was orally administered to mice once daily. Tumor volume was plotted over time from the start of treatment (mean ± SEM). ★ Student's t-test shows p <0.05. (b) For individual LU99 tumors after 25 days of treatment, a waterfall plot showing the percentage change in tumor volume relative to initial volume is shown. Control group data were obtained on day 11. FGFR阻害剤とMEK阻害剤との組合せによって間葉系KRAS変異型肺がんのin vivoでの腫瘍が退縮することを示す。(c)薬剤処理したマウスにおけるLU99由来異種移植腫瘍を溶解し、抗体を用いてイムノブロットした。(d)NCI-H23異種移植片を図６−１(a)と同様に処理した。腫瘍体積を処理開始時点から経時的にプロットした（平均±SEM）。★Student t検定によりp<0.05。We show that the combination of FGFR inhibitor and MEK inhibitor causes in vivo tumor regression of mesenchymal KRAS mutant lung cancer. (c) LU99-derived xenograft tumors in drug-treated mice were lysed and immunoblotted with antibodies. (d) NCI-H23 xenografts were treated in the same manner as in FIG. 6-1 (a). Tumor volume was plotted over time from the start of treatment (mean ± SEM). ★ Student's t-test shows p <0.05. KRAS変異型肺腺がん患者において、間葉系マーカーの発現がFGFR1発現と関連していることを示す。がんゲノムアトラス（The Cancer Genome Atlas、TCGA）のデータセットから抽出したKRAS変異型腺がん75症例の教師なし階層型クラスタリングを、Kalluri及びWeinberg（J. Clin. Invest. 119, 1420-1428 (2009)）によるEMT関連遺伝子として挙げられた28個の遺伝子を用いて示した。それぞれの腫瘍におけるFGFR1及びERBB3発現も下部に示す。FGFR1発現は、上皮系腫瘍と比較して、間葉系腫瘍において有意に高かった（Student t検定によりp<0.001）。We show that expression of mesenchymal markers is associated with FGFR1 expression in patients with KRAS mutant lung adenocarcinoma. Unsupervised hierarchical clustering of 75 KRAS mutant adenocarcinoma cases extracted from the Cancer Genome Atlas (TCGA) dataset, Kalluri and Weinberg (J. Clin. Invest. 119, 1420-1428) ( It is shown using 28 genes listed as EMT-related genes according to 2009)). FGFR1 and ERBB3 expression in each tumor is also shown below. FGFR1 expression was significantly higher in mesenchymal tumors compared to epithelial tumors (Student's t-test p <0.001). (a)上皮系KRAS変異型肺がん細胞株HCI-H358、間葉系KRAS変異型肺がん細胞株LU99、及び患者由来の異種移植片（Patient Derived Xenograft、PDX）の溶解液のウェスタンブロッティングによって、FGFR1、ビメンチン、E-カドヘリン及びアクチンの発現を解析した結果を示す。患者由来の腫瘍細胞は間葉系KRAS変異型であることが示される。アクチンはローディング対照である。(b)aで示した間葉系KRAS変異型の性質を示すPDXを移植したマウスに対し、生理食塩水（対照）、FGFR阻害剤NVP-BGJ39815mg/kg、MEK阻害剤トラメチニブ0.6mg/kg、または両剤の併用によって処置した効果を観察した結果を示す。薬剤は、1日1回マウスに経口投与した。腫瘍体積を処理開始時点から経時的にプロットした（平均±SEM）。(a) FGFR1, by Western blotting of epithelial KRAS mutant lung cancer cell line HCI-H358, mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell line LU99, and patient-derived xenograft (PDX) lysate. The results of analyzing the expression of vimentin, E-cadherin and actin are shown. Patient-derived tumor cells have been shown to be mesenchymal KRAS variants. Actin is a loading control. (b) Saline (control), FGFR inhibitor NVP-BGJ39815 mg / kg, MEK inhibitor trametinib 0.6 mg / kg, for mice transplanted with PDX showing the properties of the mesenchymal KRAS mutant shown in a. Alternatively, the results of observing the effect of treatment by the combined use of both agents are shown. The drug was orally administered to mice once daily. Tumor volume was plotted over time from the start of treatment (mean ± SEM). MEK阻害剤トラメチニブとFGFR阻害剤との組合せが間葉系KRAS変異型肺がんにおいて細胞死を効果的に誘導することを示す。(a)間葉系KRAS変異型肺がん細胞株NCI-H1792及びLU99を、1μMのpan-FGFR阻害剤AZD4547、50nMのトラメチニブ、又はこれらの薬剤の組合せで48時間処理し、溶解液を抗体でプローブした。(b)NCI-H1792を、DMSO若しくは1μMのAZD4547で処理するか、またはこれらと50nMのトラメチニブとの併用で処理し、72時間毎に培地を交換しながら6日間培養した。次いで、細胞培養プレートをクリスタルバイオレットで染色した。代表的なプレートを示す。(c)LU99細胞を用いて(b)と同様の実験を行った結果を示す。We show that the combination of the MEK inhibitor trametinib and the FGFR inhibitor effectively induces cell death in mesenchymal KRAS mutant lung cancer. (a) Mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines NCI-H1792 and LU99 are treated with 1 μM pan-FGFR inhibitor AZD4547, 50 nM trametinib, or a combination of these agents for 48 hours, and the lysate is probed with an antibody. did. (b) NCI-H1792 was treated with DMSO or 1 μM AZD4547, or in combination with 50 nM trametinib, and cultured for 6 days with medium changes every 72 hours. Cell culture plates were then stained with crystal violet. A typical plate is shown. (c) The results of the same experiment as in (b) using LU99 cells are shown.

ERBB3を発現しないKRAS変異型がん細胞に対して有効なMEK阻害剤に基づく標的化治療を開発するために、本発明者等はまず、MAPK経路の再活性化につながるシグナル伝達経路を見出すことを試みた。これまでの報告では、ERBB3の喪失が肺がん等のがんでの間葉系表現型と関連していることが実証されている（Cancer Res. 65, 9455-9462 (2005); Cancer Res. 68, 2391-2399 (2008); Cancer Discov. 4, 186-199 (2014)）。従って、間葉系KRAS変異型肺がんでは、ERBB3とは無関係に、MEK阻害後のMAPK経路の再活性化が生じているとの仮説を立てた。 In order to develop a MEK inhibitor-based targeted therapy that is effective against KRAS mutant cancer cells that do not express ERBB3, we first find a signal transduction pathway that leads to reactivation of the MAPK pathway. I tried. Previous reports have demonstrated that loss of ERBB3 is associated with the mesenchymal phenotype of cancers such as lung cancer (Cancer Res. 65, 9455-9462 (2005); Cancer Res. 68, 2391-2399 (2008); Cancer Discov. 4, 186-199 (2014)). Therefore, we hypothesized that in mesenchymal KRAS mutant lung cancer, reactivation of the MAPK pathway after MEK inhibition occurs regardless of ERBB3.

Cancer Cell Line Encyclopedia（CCLE）（Nature 483, 603-607 (2012)）から入手した39種のKRAS変異肺がん細胞株について、バイオインフォマティクスの手法を用い発現解析を行ったところ、ERBB3の発現が上皮間葉移行(epithelial-mesenchymal transition : EMT)と関係しており、ERBB3は上皮系腫瘍で発現している結果を得た(図２−２ｄ)。間葉系腫瘍は一般に抗がん薬抵抗性であることが知られているが、この発現解析により、間葉系腫瘍ではERBB3の発現が消失しているのに対し、FGFR1が高発現しているという結果が得られた。 Expression analysis of 39 KRAS mutant lung cancer cell lines obtained from Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (Nature 483, 603-607 (2012)) using bioinformatics was performed, and the expression of ERBB3 was interepithelial. It is associated with epithelial-mesenchymal transition (EMT), and ERBB3 was expressed in epithelial tumors (Fig. 2-2d). Mesenchymal tumors are generally known to be resistant to anticancer drugs. According to this expression analysis, ERBB3 expression disappeared in mesenchymal tumors, whereas FGFR1 was highly expressed. The result was that there was.

上皮系マーカーであるE-カドヘリン発現陽性のKRAS変異肺がん細胞株に上皮間葉移行を誘導したところ、間葉系マーカーであるビメンチンの発現誘導に加え、ERBB3の発現低下及びFGFR1の発現誘導が認められ、上記の発現解析の結果と一致していた（図２−１ｃ）。 Inducing epithelial-mesenchymal transition into a KRAS mutant lung cancer cell line positive for E-cadherin expression, which is an epithelial marker, showed decreased expression of ERBB3 and induction of FGFR1 expression in addition to induction of vimentin, which is a mesenchymal marker. It was consistent with the result of the above expression analysis (Fig. 2-1c).

これらの結果から、ERBB3を発現していない腫瘍、すなわち間葉系腫瘍においてはFGFR1が重要な働きを担っていることが考えられた。そして、間葉系マーカー陽性KRAS変異細胞株において、MEK阻害剤とFGFR阻害剤の併用は、細胞増殖を著明に抑制した（図４−１ｄ及びｅ、図９ｂ及びｃ）。この組合せによる相乗的阻害効果は、in vitroのみでなく、in vivoにおいても認められ、マウスにおいて間葉系KRAS変異型腫瘍の増殖を劇的に抑制した（図６−１、図６−２及び図８）。 From these results, it was considered that FGFR1 plays an important role in tumors that do not express ERBB3, that is, mesenchymal tumors. Then, in the mesenchymal marker-positive KRAS mutant cell line, the combined use of the MEK inhibitor and the FGFR inhibitor markedly suppressed cell proliferation (FIGS. 4-1d and e, FIGS. 9b and c). The synergistic inhibitory effect of this combination was observed not only in vitro but also in vivo, and dramatically suppressed the growth of mesenchymal KRAS mutant tumors in mice (FIGS. 6-1 and 6-2 and). FIG. 8).

＜間葉系KRAS変異型がん治療剤＞
従って本発明は、一実施形態において、線維芽細胞増殖因子受容体1（FGFR1）阻害剤を含む、間葉系KRAS変異型がん治療剤を提供する。<Mesenchymal KRAS mutant cancer therapeutic agent>
Accordingly, the present invention provides, in one embodiment, a mesenchymal KRAS mutant cancer therapeutic agent comprising a fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) inhibitor.

本発明において使用可能なFGFR1阻害剤としては、特に限定するものではないが、例えばFGFR1タンパク質に特異的に結合可能な物質、例えば抗体及びその抗原結合性断片を挙げることができる。抗体は、当分野において通常使用されている方法によって、FGFR1タンパク質を抗原として作製することができる。 The FGFR1 inhibitor that can be used in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include substances that can specifically bind to the FGFR1 protein, such as an antibody and an antigen-binding fragment thereof. Antibodies can be prepared using the FGFR1 protein as an antigen by a method commonly used in the art.

また、FGFR特異的阻害剤として知られる薬剤、例えばNVP-BGJ398（3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチル-尿素、CAS:872511-34-7）、AZD4547 (N-(5-(3,5-ジメソキシフェネチル)-1H-ピラゾル-3-イル)-4-((3S,5R)-3,5-ジメチルピペラジン-1-イル)ベンザミド、CAS:1035270-39-3）、LY2874455 ((R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)エトキシ)-1H-インダゾール-3イル)ビニル)-1H-ピラゾール-1-イル)エタノール)、TAS-120等を挙げることができる。 Also, agents known as FGFR-specific inhibitors, such as NVP-BGJ398 (3- (2,6-dichloro-3,5-dimethoxy-phenyl) -1- {6- [4- (4-ethyl-piperazine-) 1-yl) -phenylamino] -pyrimidine-4-yl} -1-methyl-urea, CAS: 872511-34-7), AZD4547 (N- (5- (3,5-dimesoxyphenethyl) -1H-) Pyrazole-3-yl) -4-((3S, 5R) -3,5-dimethylpiperazine-1-yl) benzamide, CAS: 1035270-39-3), LY2874455 ((R)-(E) -2- (4- (2- (5- (1- (3,5-dichloropyridin-4-yl) ethoxy) -1H-indazole-3yl) vinyl) -1H-pyrazol-1-yl) ethanol), TAS- 120 etc. can be mentioned.

また、FGFR1阻害剤として、FGFR1の発現を阻害することが可能な物質、例えばsiRNA及びshRNAを挙げることができる。 In addition, examples of the FGFR1 inhibitor include substances capable of inhibiting the expression of FGFR1, such as siRNA and shRNA.

siRNA及びshRNAは、RNA干渉と呼ばれるメカニズムにより、特定のmRNAを標的として、その翻訳を阻止することが知られている。標的配列の塩基数は特に限定されず、15〜500塩基の範囲で選択され得る。siRNAは、短鎖二本鎖RNA分子であり、shRNAは、生体内でダイサーによってプロセシングされてsiRNAを生成することができるヘアピン型RNAである。siRNA及びshRNAは、例えばリポフェクタミン等のトランスフェクション試薬と共に、in vitro又はin vivoで細胞内に導入することができる。あるいはまた、siRNA及びshRNAは、細胞内でこれらを生成することができるようにDNAの形態でベクターに組み込んで細胞内に導入することができる。当業者であれば、siRNA及びshRNAの設計及び選択は、標的配列の情報等に基づいて容易に得ることができる。 siRNA and shRNA are known to target specific mRNAs and block their translation by a mechanism called RNA interference. The number of bases in the target sequence is not particularly limited and can be selected in the range of 15 to 500 bases. SiRNA is a short double-stranded RNA molecule, and shRNA is a hairpin-type RNA that can be processed by a dicer in vivo to produce siRNA. siRNA and shRNA can be introduced into cells in vitro or in vivo with transfection reagents such as lipofectamine. Alternatively, siRNA and shRNA can be incorporated into a vector in the form of DNA and introduced into the cell so that they can be produced intracellularly. Those skilled in the art can easily obtain the design and selection of siRNA and shRNA based on the information of the target sequence and the like.

上記したFGFR1阻害剤は、臨床的に使用可能なものも既に知られている。
上記のFGFR1阻害剤は、MAPK/ERKキナーゼ（MEK）阻害剤と組み合わせて投与されることで、間葉系KRAS変異型がん細胞に対して阻害効果を有する。従って、本発明は、MEK阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とするFGFR1阻害剤を含む間葉系KRAS変異型がん治療剤を提供する。The above-mentioned FGFR1 inhibitors are already known to be clinically usable.
The above-mentioned FGFR1 inhibitor has an inhibitory effect on mesenchymal KRAS mutant cancer cells when administered in combination with a MAPK / ERK kinase (MEK) inhibitor. Therefore, the present invention provides a mesenchymal KRAS mutant cancer therapeutic agent containing an FGFR1 inhibitor, which is characterized by being administered in combination with a MEK inhibitor.

上記の組み合わせが、特定のがんである間葉系KRAS変異型がんに対して非常に有効であることは、本発明によって初めて見出された知見である。 It is the first finding by the present invention that the above combination is very effective against a specific cancer, mesenchymal KRAS mutant cancer.

従って本発明は、FGFR1阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、MEK阻害剤を含む間葉系KRAS変異型がん治療剤をも提供する。 Therefore, the present invention also provides a mesenchymal KRAS mutant cancer therapeutic agent containing a MEK inhibitor, which is characterized by being administered in combination with an FGFR1 inhibitor.

本発明において使用可能なMEK阻害剤としては、特に限定するものではないが、例えばMEKタンパク質に特異的に結合可能なアロステリック阻害剤がある。例えばトラメチニブ、セルメチニブ、pd98059、ピマセルチブ、MEK162、PD0325901等を挙げることができる。 The MEK inhibitor that can be used in the present invention is not particularly limited, and includes, for example, an allosteric inhibitor that can specifically bind to the MEK protein. For example, trametinib, selmethinib, pd98059, pimacertib, MEK162, PD0325901 and the like can be mentioned.

また、MEK阻害剤として、MEKの発現を阻害することが可能な物質、例えばsiRNA及びshRNAを挙げることができる。 In addition, examples of MEK inhibitors include substances capable of inhibiting MEK expression, such as siRNA and shRNA.

上記したMEK阻害剤は、臨床的に使用可能なものも既に知られており、市販されているものを適宜使用することもできる。 The above-mentioned MEK inhibitors are already known to be clinically usable, and commercially available ones can be appropriately used.

本発明の治療剤による治療の対象は、間葉系KRAS変異型がんであり、例えば間葉系KRAS変異型肺がん、すい臓がん、大腸がん等が挙げられる。本発明の治療剤は特に、間葉系KRAS変異型肺腺がんの治療に好適である。 The target of treatment with the therapeutic agent of the present invention is mesenchymal KRAS mutant cancer, and examples thereof include mesenchymal KRAS mutant lung cancer, pancreatic cancer, and colorectal cancer. The therapeutic agent of the present invention is particularly suitable for the treatment of mesenchymal KRAS mutant lung adenocarcinoma.

上記の本発明の治療剤は、単独で使用することもできるが、異なるメカニズムの抗がん剤及び抗がん治療と組み合わせて使用することもできる。 The above-mentioned therapeutic agent of the present invention can be used alone, or can be used in combination with an anticancer agent having a different mechanism and an anticancer treatment.

また、本発明の抗がん剤は、単独又は他の有効成分と組み合わせて、医薬組成物の形態とすることができる。本発明の治療剤又は医薬組成物は、限定するものではないが、例えば患部若しくは患部の近辺に注射又は注入により投与する局所投与又は全身投与することができる。医薬組成物には、本発明の治療剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野で通常使用される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤等を含めることができる。本発明の治療剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば0.0001〜1mg/kg体重の範囲で１日１回〜数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎に投与することが可能である。 In addition, the anticancer agent of the present invention can be in the form of a pharmaceutical composition alone or in combination with other active ingredients. The therapeutic agent or pharmaceutical composition of the present invention can be administered locally or systemically, for example, by injection or injection into the affected area or the vicinity of the affected area, without limitation. In addition to the therapeutic agent and other active ingredients of the present invention, the pharmaceutical composition may contain carriers, excipients, buffers, stabilizers and the like commonly used in the art, depending on the dosage form. it can. The dose of the therapeutic agent of the present invention varies depending on the body weight, age, severity of the disease, etc. of the patient, and is not particularly limited, but is, for example, 1 in the range of 0.0001 to 1 mg / kg body weight. It can be administered once to several times daily, every two days, every three days, every week, every two weeks.

＜間葉系がん細胞検出試薬及び方法＞
本発明の検出試薬は、がんの診断が確定した患者に対して治療方法を選択する段階で使用する、いわゆるコンパニオン診断薬として使用することができる。上記の通り、間葉系KRAS変異型がん細胞においては、FGFR1タンパク質の発現が大きく上昇する。すなわち、FGFR1は、間葉系KRAS変異型がんを同定するための新たなマーカーとなり得る。<Mesenchymal cancer cell detection reagents and methods>
The detection reagent of the present invention can be used as a so-called companion diagnostic agent used at the stage of selecting a treatment method for a patient whose cancer diagnosis has been confirmed. As described above, the expression of FGFR1 protein is significantly increased in mesenchymal KRAS mutant cancer cells. That is, FGFR1 can be a new marker for identifying mesenchymal KRAS mutant cancer.

従って本発明は、別の実施形態において、FGFR1タンパク質または該タンパク質をコードする遺伝子の検出を可能とする間葉系がん細胞検出試薬として使用し得る。FGFR1タンパク質の検出を可能とする検出試薬は、例えばFGFR1タンパク質と特異的に結合し得る抗体等である。この場合、当分野で通常使用される免疫染色等の手法によってFGFR1タンパク質を検出することができる。 Therefore, in another embodiment, the present invention can be used as a mesenchymal cancer cell detection reagent that enables detection of the FGFR1 protein or a gene encoding the protein. The detection reagent that enables the detection of the FGFR1 protein is, for example, an antibody that can specifically bind to the FGFR1 protein. In this case, the FGFR1 protein can be detected by a method such as immunostaining commonly used in the art.

あるいはまた、FGFR1タンパク質をコードする遺伝子の検出を可能とする検出試薬として、FGFR1遺伝子、より具体的にはmRNAもしくはcDNAが存在する場合に増幅させることができるプライマー、又はFGFR1をコードするmRNAもしくはcDNAに結合することができるプローブを挙げることができる。 Alternatively, as a detection reagent that enables detection of a gene encoding the FGFR1 protein, a primer that can be amplified in the presence of the FGFR1 gene, more specifically mRNA or cDNA, or mRNA or cDNA encoding FGFR1 Examples include probes that can bind to.

検出試薬は、必要に応じて、蛍光標識、放射性標識等の標識やタグをつけることができる。当業者であれば、目的物質の検出のためのこうした手法について容易に理解し、実施することができる。 The detection reagent can be labeled or tagged with a fluorescent label, a radioactive label, or the like, if necessary. One of ordinary skill in the art can easily understand and implement such a method for detecting a target substance.

また、間葉系KRAS変異型がんの同定に際しては、FGFR1の検出のみを単独で行うことも可能であるが、実際には他のマーカーについても同時に検査することが考えられる。従って、本発明の検出試薬は、他の検出試薬と組み合わせて使用することが臨床的には好ましい。 In addition, when identifying mesenchymal KRAS mutant cancer, it is possible to detect FGFR1 alone, but in reality, it is conceivable to test other markers at the same time. Therefore, it is clinically preferable to use the detection reagent of the present invention in combination with other detection reagents.

従って、本発明は、上記のFGFR1の検出を可能とする間葉系がん細胞検出試薬と、上皮系がん細胞検出試薬の組合せを含む、細胞型判定試薬セットを提供する。上皮系がん細胞検出試薬としては、特に限定するものではないが、例えばE-カドヘリン及び／又はERBB3の検出を可能とする検出試薬が挙げられる。 Therefore, the present invention provides a cell type determination reagent set containing a combination of a mesenchymal cancer cell detection reagent capable of detecting the above-mentioned FGFR1 and an epithelial cancer cell detection reagent. The epithelial cancer cell detection reagent is not particularly limited, and examples thereof include a detection reagent capable of detecting E-cadherin and / or ERBB3.

本発明はまた、更なる間葉系がん細胞検出試薬と組み合わせた細胞型判定試薬セットを提供する。更なる間葉系がん細胞検出試薬としては、特に限定するものではないが、例えばビメンチンの検出を可能とする検出試薬が挙げられる。 The present invention also provides a set of cell typing reagents in combination with additional mesenchymal cancer cell detection reagents. Further, the mesenchymal cancer cell detection reagent is not particularly limited, and examples thereof include a detection reagent capable of detecting vimentin.

上記のFGFR1及びビメンチンは間葉系がん細胞を検出するための、E-カドヘリン及びERBB3は上皮系がん細胞を検出するための、細胞型判定用試薬である。本発明の知見によって、被験者のがんが間葉系もしくは上皮系いずれの性質を有するかをより高精度に判定し、それぞれの症例に対して有効な治療方法を選択することが可能となる。 The above-mentioned FGFR1 and vimentin are reagents for detecting mesenchymal cancer cells, and E-cadherin and ERBB3 are reagents for cell type determination for detecting epithelial cancer cells. Based on the findings of the present invention, it is possible to more accurately determine whether the subject's cancer has mesenchymal or epithelial properties, and to select an effective treatment method for each case.

上記の細胞型判定試薬セットは、更に種々のバイオマーカーの検出のための試薬を含めることもできる。 The cell typing reagent set described above may further include reagents for the detection of various biomarkers.

本発明の細胞型判定試薬セットは、例えば各検出試薬が抗体である、抗FGFR1抗体を含む複数の抗体のセットである。あるいはまた、本発明の細胞型判定試薬セットは、各検出試薬がプライマーである、FGFR1をコードするmRNAもしくはcDNAを増幅させることができるプライマーを含む複数のプライマーのセットである。あるいはまた、本発明の細胞型判定試薬セットは、各検出試薬がプローブである、FGFR1をコードするmRNAもしくはcDNAに結合することができるプローブを含む複数のプローブのセットである。 The cell type determination reagent set of the present invention is, for example, a set of a plurality of antibodies including an anti-FGFR1 antibody in which each detection reagent is an antibody. Alternatively, the cell type determination reagent set of the present invention is a set of a plurality of primers including a primer capable of amplifying mRNA or cDNA encoding FGFR1 in which each detection reagent is a primer. Alternatively, the cell type determination reagent set of the present invention is a set of a plurality of probes including a probe capable of binding to mRNA or cDNA encoding FGFR1 in which each detection reagent is a probe.

本発明の細胞型判定試薬セットの一例として、例えばFGFR1、ERBB3、E-カドヘリン及びビメンチンを含む遺伝子パネルが挙げられる。このような遺伝子パネルを用いることで、被験者又は患者由来のサンプルから抽出したDNA又はRNAと反応させて、次世代シーケンサーによってこれら4種の遺伝子の発現解析を行うことも可能である。 An example of the cell type determination reagent set of the present invention is a gene panel containing, for example, FGFR1, ERBB3, E-cadherin and vimentin. By using such a gene panel, it is also possible to react with DNA or RNA extracted from a sample derived from a subject or a patient and analyze the expression of these four kinds of genes by a next-generation sequencer.

上記の検出試薬及び試薬セットは、単独で、またはKRAS遺伝子変異検査と組み合わせて行うことも可能であり、抗がん治療の選択のためのコンパニオン診断薬として使用することができる。例えば、腫瘍よりmRNAを抽出し、次世代シーケンサーによってKRASの遺伝子変異およびFGFR1 mRNAの発現、場合によって更にERBB3、E-カドヘリン、ビメンチン、更なるバイオマーカーのmRNAを同時に測定することが可能である。従って、本発明の細胞型判定試薬セットは、FGFR1の検出を可能とする間葉系がん細胞検出試薬と、KRAS遺伝子変異検出試薬、場合によって更なる検出試薬とを含み得る。この細胞型判定試薬セットは、被験者のがんが間葉系もしくは上皮系いずれの性質を有するものであるか、及びがんがKRAS変異型であるかどうかを同時に判定することを可能とする。 The above-mentioned detection reagents and reagent sets can be performed alone or in combination with the KRAS gene mutation test, and can be used as a companion diagnostic agent for the selection of anticancer treatment. For example, it is possible to extract mRNA from a tumor and simultaneously measure KRAS gene mutations and FGFR1 mRNA expression, and in some cases ERBB3, E-cadherin, vimentin, and further biomarker mRNAs with a next-generation sequencer. Therefore, the cell type determination reagent set of the present invention may include a mesenchymal cancer cell detection reagent that enables detection of FGFR1, a KRAS gene mutation detection reagent, and optionally a further detection reagent. This cell type determination reagent set makes it possible to simultaneously determine whether the subject's cancer has mesenchymal or epithelial properties, and whether the cancer is a KRAS mutant.

複数の検出試薬を組合せることで、被験者又は患者におけるKRAS変異型のがんが上皮系であるか間葉系であるかの判定をより高い精度で行うことができる。更に、上記のように、KRAS遺伝子の変異を同時に検出することもできる。複数の検出試薬は、具体的にはがん診断キットの形態で提供することができる。キットには、検出試薬の他、必要に応じて検出のために必要な他の試薬、例えばPCR反応のための酵素及びプライマー、緩衝剤、容器、説明書等を含めることができる。 By combining a plurality of detection reagents, it is possible to determine with higher accuracy whether the KRAS mutant cancer in the subject or patient is epithelial or mesenchymal. Furthermore, as described above, mutations in the KRAS gene can be detected at the same time. The plurality of detection reagents can be specifically provided in the form of a cancer diagnostic kit. In addition to the detection reagents, the kit can include other reagents necessary for detection, such as enzymes and primers for PCR reaction, buffers, containers, instructions, etc., if necessary.

下記の表１には、EMTのプロセスに関与するとされる28種の遺伝子を記載する（J. Clin. Invest. 119, 1420-1428 (2009)）。本発明は、これらのマーカー遺伝子に加え、間葉系マーカーとしてFGFR1、上皮系マーカーとしてERBB3を加えることを提案するものであるが、例えばFGFR1及びERBB3に加えてE-カドヘリン（CDH1）及び／又はビメンチン（VIM）、更に下記の表１から選択される1種、2種、3種、4種、5種以上、10種以上、15種以上、20種以上のマーカーについて同時に検出することもできる。本発明の特定の態様は、FGFR1及びERBB3、及び表１に記載する28種のマーカーの全てについて検出することを含む。 Table 1 below lists 28 genes allegedly involved in the EMT process (J. Clin. Invest. 119, 1420-1428 (2009)). The present invention proposes the addition of FGFR1 as a mesenchymal marker and ERBB3 as an epithelial marker in addition to these marker genes. For example, E-cadherin (CDH1) and / or in addition to FGFR1 and ERBB3. Vimentin (VIM) and 1 type, 2 types, 3 types, 4 types, 5 types or more, 10 types or more, 15 types or more, and 20 or more types of markers selected from Table 1 below can be detected at the same time. .. A particular aspect of the invention comprises detecting FGFR1 and ERBB3, and all 28 markers listed in Table 1.

Figure 0006860919
Figure 0006860919

本発明はまた、がんと診断された患者由来のサンプルを、上記の本発明の検出試薬又は細胞型判定試薬セットと接触させ、FGFR1の発現を指標として間葉系KRAS変異型がん細胞の存在又は不存在を検出することを含む、患者に対するがん治療の有効性予測のためのデータを取得する方法を提供する。 The present invention also contacts a sample derived from a patient diagnosed with cancer with the above-mentioned detection reagent or cell type determination reagent set of the present invention, and uses the expression of FGFR1 as an index to obtain a mesenchymal KRAS mutant cancer cell. Provided is a method for obtaining data for predicting the effectiveness of cancer treatment for a patient, including detecting the presence or absence.

サンプルとしては、特に限定するものではないが、被験者由来の血液、胸水等の体液、組織生検サンプル、手術標本等を挙げることができる。 The sample is not particularly limited, and examples thereof include blood derived from the subject, body fluid such as pleural effusion, a tissue biopsy sample, and a surgical specimen.

上記の方法においてFGFR1の発現が検出された場合、被験者は間葉系KRAS変異型がんを有する高い可能性が示される。その場合、間葉系KRAS変異型がんに対して有効であることが判明した本発明の治療薬を投与することが有効である可能性が示される。 If FGFR1 expression is detected by the above method, it indicates that the subject is likely to have mesenchymal KRAS mutant cancer. In that case, it is shown that it may be effective to administer the therapeutic agent of the present invention, which has been found to be effective against mesenchymal KRAS mutant cancer.

本発明の方法は、間葉系KRAS変異型肺がん、すい臓がん、大腸がん等、特に、間葉系KRAS変異型肺腺がんの検出及びそれらに対するがん治療の有効性予測のために使用することができる。 The method of the present invention is for detecting mesenchymal KRAS mutant lung cancer, pancreatic cancer, colorectal cancer, etc., in particular, for detecting mesenchymal KRAS mutant lung adenocarcinoma and predicting the effectiveness of cancer treatment for them. Can be used.

以下に、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例全体を通して使用した試薬及び手法の一部については以下の通りである。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
Some of the reagents and techniques used throughout the Examples are as follows.

＜細胞株及び薬剤＞
肺がん細胞株NCI-H358、NCI-H1792、NCI-H23、SW1573は、ATCC（American Type Culture Collection）から購入した。SK-LU-1、Calu-6及びNCI-H460は名古屋大学の高橋隆教授からご供与頂いた。LU-99は国立研究開発法人 医薬基盤・健康・栄養研究所 JCRB細胞バンクから入手した。NCI-H1573はマサチューセッツ総合病院がんセンターから入手した。細胞は10％FBSを含むRPMI1640（Invitrogen）中で培養した。NVP-BGJ398、GDC-0941、セルメチニブ、アファチニブ、トラメチニブ、及びAZD4547はActive Biochem社から入手した。化合物はDMSO中に10mmol/lの最終濃度となるように溶解し、-20℃で保存した。<Cell line and drug>
Lung cancer cell lines NCI-H358, NCI-H1792, NCI-H23, SW1573 were purchased from ATCC (American Type Culture Collection). SK-LU-1, Calu-6 and NCI-H460 were donated by Professor Takahashi Takahashi of Nagoya University. LU-99 was obtained from the JCRB Cell Bank, National Institutes of Biomedical Innovation, Health and Nutrition. NCI-H1573 was obtained from the Massachusetts General Hospital Cancer Center. Cells were cultured in RPMI1640 (Invitrogen) containing 10% FBS. NVP-BGJ398, GDC-0941, selmethinib, afatinib, trametinib, and AZD4547 were obtained from Active Biochem. Compounds were dissolved in DMSO to a final concentration of 10 mmol / l and stored at -20 ° C.

＜siRNAノックダウン＞
細胞を1-2×105個／ウェルの密度で6ウェルプレートに播種した。24時間後、Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）を用い、FGFR1（Dharmacon）、ERBB3（Invitrogen）又はStealth RNAi-陰性対照のlow GC Duplex#3（Invitrogen）に対するsiRNAで細胞をトランスフェクトした。<SiRNA knockdown>
Cells were seeded in 6-well plates at a density of 1-2 x 10 5 cells / well. Twenty-four hours later, cells were transfected with Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) with siRNA against FGFR1 (Dharmacon), ERBB3 (Invitrogen) or Stealth RNAi-negative control low GC Duplex # 3 (Invitrogen).

＜アポトーシスの分析＞
細胞を6ウェルプレートにおよそ30％−40％コンフルエンスで播種した。一晩インキュベーションした後、培地をDMSO又は薬剤を含む培地と交換した。72時間後、培地中の細胞及びトリプシン処理した細胞を試験管に回収した。細胞をペレット化し、PBSで1回洗浄した。アポトーシスした細胞をAnnexin V:PE Apoptosis Detection Kit Iを用いてアネキシンVで染色し、BD Accuri C6フローサイトメーター（BD）でアッセイした。全ての実験を3重に行った。<Apoptosis analysis>
Cells were seeded in 6-well plates with approximately 30% -40% confluence. After overnight incubation, the medium was replaced with medium containing DMSO or drug. After 72 hours, the cells in the medium and the trypsin-treated cells were collected in vitro. The cells were pelleted and washed once with PBS. Apoptotic cells were stained with Annexin V using Annexin V: PE Apoptosis Detection Kit I and assayed on a BD Accuri C6 flow cytometer (BD). All experiments were performed in triplicate.

＜異種移植マウス試験＞
6〜8週齢の雄のヌードマウス（Clea, Tokyo, Japan）の脇腹に5×106個のがん細胞を含む懸濁液を皮下注射した。実験動物の管理及び処置は施設のガイドラインに従った。平均腫瘍体積がLU99異種移植でほぼ300mm3、NCI-H23異種移植でほぼ230mm3に達した時点でマウスを無作為化した（LU99異種移植にn=8及びNCI-H23異種移植にn=5）。薬剤は経口投与によって1日1回投与した。NVP-BGJ398は酢酸バッファー pH4.6／PEG300 1:1に溶解した。トラメチニブは、7％ DMSO、13％ Tween 80、4％ グルコース、及びトラメチニブと等モル濃度のHCl中に溶解した。マウスの体重及び全身状態を毎日モニタリングした。キャリパーを用いて週に2回腫瘍径を測定し、以下の式を用いて体積を計算した：長さ×幅2×0.52。施設のガイドラインに従って、LU99異種移植の対照群で腫瘍体積が1,000mm3に達した時点でマウスを犠牲にした。<Xenograft mouse test>
A suspension containing 5 × 10 6 cancer cells was subcutaneously injected into the flank of a 6-8 week old male nude mouse (Clea, Tokyo, Japan). Laboratory animal management and treatment followed institutional guidelines. N = 5 substantially Mice Upon reaching 230 mm 3 in randomized (LU99 xenografted n = 8 and NCI-H23 xenografts almost 300mm 3, NCI-H23 xenograft in mean tumor volume LU99 xenograft ). The drug was administered orally once daily. NVP-BGJ398 was dissolved in acetate buffer pH 4.6 / PEG300 1: 1. Trametinib was dissolved in 7% DMSO, 13% Tween 80, 4% glucose, and HCl in equimolar concentrations with trametinib. Mice weight and general condition were monitored daily. Tumor diameter was measured twice a week using calipers and volume was calculated using the following formula: length x width 2 x 0.52. Mice were sacrificed when tumor volume reached 1,000 mm 3 in the LU99 xenograft control group according to institutional guidelines.

＜Agilentマイクロアレイ解析＞
RNeasyキット（QIAGEN）を用いてRNAを単離した。マイクロアレイ解析は、SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K v2 Microarray Kit（Agilent technology）を用いて実施した。<Agilent microarray analysis>
RNA was isolated using the RNeasy kit (QIAGEN). Microarray analysis was performed using the SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K v2 Microarray Kit (Agilent technology).

＜KRAS変異を有する39種の非小細胞肺がん細胞株の遺伝子発現解析＞
肺がん細胞株の遺伝子発現データはCancer Cell Line Encyclopedia（CCLE）（Nature 483, 603-607 (2012)）から取得した。CCLEから得られた情報（CCLE_sample_info_file）に基づき、187種の肺がん細胞株の中で、KRAS変異を有する39種の非小細胞肺がん細胞株を更なる解析のために抽出した。Cluster 3.0プログラム（Bioinformatics 20, 1453-1454 (2004)）を使用して39種のKRAS変異型非小細胞肺がん細胞株において教師なし階層クラスタリングを実施し、JAVA TreeViewプログラム（Bioinformatics 20, 3246-3248 (2004)）によって結果を視覚化した。6以上の中間発現値を有し、細胞株間で5倍以上の変化を示した合計2635種の遺伝子を解析に用いた。マーカー遺伝子のERBB3、CDH1、FGFR1及びVIMを含め、3つの異なるサブクラスターが抽出された。<Gene expression analysis of 39 non-small cell lung cancer cell lines with KRAS mutation>
Gene expression data for lung cancer cell lines were obtained from Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) (Nature 483, 603-607 (2012)). Based on the information obtained from CCLE (CCLE_sample_info_file), 39 non-small cell lung cancer cell lines with KRAS mutations were extracted from 187 lung cancer cell lines for further analysis. Unsupervised hierarchical clustering was performed in 39 KRAS mutant non-small cell lung cancer cell lines using the Cluster 3.0 program (Bioinformatics 20, 1453-1454 (2004)) and the JAVA TreeView program (Bioinformatics 20, 3246-3248 (Bioinformatics 20, 3246-3248) (Bioinformatics 20, 3246-3248). The results were visualized by 2004)). A total of 2635 genes with an intermediate expression value of 6 or more and a 5-fold or more change between cell lines were used for the analysis. Three different subclusters were extracted, including the marker genes ERBB3, CDH1, FGFR1 and VIM.

＜KRAS変異型肺腺がん患者の遺伝子発現解析＞
切除された230症例の肺腺がんのメッセンジャーRNAプロファイリングをTCGAから取得した（Nature 511, 543-550 (2014)）。臨床情報に基づいて、230症例の腺がんサンプルから、KRAS変異を有する75症例のサンプルを更なる解析のために抽出した。KRAS変異を有する75症例の腺がんサンプルの教師なし階層的クラスタリングを、Kalluri及びWeinberg（J. Clin. Invest. 119, 1420-1428 (2009)）によってEMT関連遺伝子として挙げられた28種の遺伝子について実施した。更に2つの遺伝子発現データ（FGFR1及びERBB3）を抽出し、階層的クラスタリングの順序に基づいて並べた。<Gene expression analysis of KRAS mutant lung adenocarcinoma patients>
Messenger RNA profiling of 230 resected lung adenocarcinomas was obtained from TCGA (Nature 511, 543-550 (2014)). Based on clinical information, 75 samples with KRAS mutations were extracted from 230 adenocarcinoma samples for further analysis. Unsupervised hierarchical clustering of 75 adenocarcinoma samples with KRAS mutations, 28 genes listed as EMT-related genes by Kalluri and Weinberg (J. Clin. Invest. 119, 1420-1428 (2009)) Was carried out. Two more gene expression data (FGFR1 and ERBB3) were extracted and arranged according to the order of hierarchical clustering.

［実施例１ KRAS変異型肺がんにおけるMEK阻害によるERKシグナル伝達のフィードバック活性化］
ERBB3を発現する上皮系KRAS変異型肺がん細胞株NCI-H358及びNCI-H1573を2つのアロステリックMEK阻害剤、トラメチニブ又はセルメチニブで48時間以上処理すると、ERKが再活性化しリン酸化ERBB3の明白な上昇を示した。トラメチニブを用いて得られた結果の一部を図１ａに示す。更に、ERBB3のsiRNAによるノックダウン、またはpan-ERBB阻害剤のアファチニブによるERBB3の薬理学的阻害によって、トラメチニブによって誘導されるERKの再活性化が無効になり、cl-PARPで示される通りアポトーシスが誘導された。これらの結果から、ERBB3によって誘導されるフィードバックによるERK経路の活性化が、これらの細胞株に対するMEK阻害剤の効果を減弱することが確認された。[Example 1 Feedback activation of ERK signal transduction by MEK inhibition in KRAS mutant lung cancer]
Treatment of ERBB3-expressing epithelial KRAS mutant lung cancer cell lines NCI-H358 and NCI-H1573 with two allosteric MEK inhibitors, trametinib or selmethinib, for more than 48 hours reactivates ERK and produces a clear increase in phosphorylated ERBB3. Indicated. Some of the results obtained with trametinib are shown in FIG. 1a. In addition, knockdown of ERBB3 with siRNA or pharmacological inhibition of ERBB3 with the pan-ERBB inhibitor afatinib abolished trametinib-induced reactivation of ERK, resulting in apoptosis as shown by cl-PARP. I was induced. These results confirm that activation of the ERK pathway by feedback induced by ERBB3 attenuates the effect of MEK inhibitors on these cell lines.

一方、ERBB3を発現しないKRAS変異型細胞株NCI-H1792及びLU99においてもMAPK経路が再活性化されるか否かを検討したところ、トラメチニブ処理の48時間処理によりERKの再活性化を認めたが、この再活性化はアファチニブ処理による影響を受けなかった（図１ｂ）。 On the other hand, when it was examined whether the MAPK pathway was reactivated in the KRAS mutant cell lines NCI-H1792 and LU99 that did not express ERBB3, reactivation of ERK was observed by treatment with trametinib for 48 hours. , This reactivation was unaffected by afatinib treatment (Fig. 1b).

［実施例２ 間葉系KRAS変異型肺がんにおけるFGFR1の発現上昇］
複数種のKRAS変異型肺がん細胞株のウェスタンブロット解析を実施し、ERBB3を発現する細胞は上皮系細胞マーカーのE-カドヘリンを発現し、一方ERBB3を発現しない細胞は間葉系マーカーのビメンチンを発現していることを見出した（図２−１ａ）。[Example 2 Increased expression of FGFR1 in mesenchymal KRAS mutant lung cancer]
Western blot analysis of multiple KRAS mutant lung cancer cell lines was performed, and cells expressing ERBB3 expressed the epithelial cell marker E-cadherin, while cells not expressing ERBB3 expressed the mesenchymal marker vimentin. It was found that this was done (Fig. 2-1a).

この相関性を更に調べるために、上皮系細胞株であるNCI-H358にTGF-β1処理によってEMTを誘導し、発現の変化した遺伝子を解析した（図２−１ｂ）。予想された通り、EMTの誘導後、ERBB3及びE-カドヘリン（CDH1）の発現は強く抑制された。一方、EMT誘導されたNCI-H358で最も高い発現上昇を来した遺伝子の一つとして、線維芽細胞受容体チロシンキナーゼFGFR1が見出された。さらに、ウェスタンブロット解析から、EMT誘導後にFGFR1の発現が顕著に上昇し、ERBB3の発現が低下していることが確認された（図２−１ｃ）。 To further investigate this correlation, EMT was induced in the epithelial cell line NCI-H358 by TGF-β1 treatment, and genes with altered expression were analyzed (Fig. 2-1b). As expected, the expression of ERBB3 and E-cadherin (CDH1) was strongly suppressed after the induction of EMT. On the other hand, fibroblast receptor tyrosine kinase FGFR1 was found as one of the genes with the highest upregulation of EMT-induced NCI-H358. Furthermore, Western blot analysis confirmed that the expression of FGFR1 was significantly increased and the expression of ERBB3 was decreased after EMT induction (Fig. 2-1c).

次に、CCLEから入手した39種のKRAS変異型非小細胞肺がん細胞株について、教師なし階層的クラスタリングを実施した。平均発現値が6以上の細胞株で5倍以上の変化倍率を示す2635種の遺伝子を分析した。分析の結果、KRAS変異型がん細胞株の2つの明確なサブタイプが特定された（図２−２ｄ）。NCI-H358及びNCI-H1573細胞を含む一方のサブタイプは、典型的にはERBB3及びE-カドヘリンを発現し、上皮系の表現型と一致していた。他方のサブタイプは、E-カドヘリンの低発現、ビメンチンの高発現、及びERBB3の低発現を有する間葉系の表現型を有していた。 Next, unsupervised hierarchical clustering was performed on 39 KRAS mutant non-small cell lung cancer cell lines obtained from CCLE. We analyzed 2635 genes that showed a change rate of 5 times or more in cell lines with an average expression value of 6 or more. Analysis identified two distinct subtypes of KRAS mutant cancer cell lines (Fig. 2-2d). One subtype, including NCI-H358 and NCI-H1573 cells, typically expressed ERBB3 and E-cadherin and was consistent with the epithelial phenotype. The other subtype had a mesenchymal phenotype with low E-cadherin expression, high vimentin expression, and low ERBB3 expression.

間葉系の表現型を有する細胞株は、上皮系の細胞株と比較して有意により高いFGFR1発現を有していた。線形回帰分析から、ERBB3とE-カドヘリンとの正の相関性、並びにFGFR1とE-カドヘリンとの負の相関性とが実証された（図２−２ｅ及び２−２ｆ）。これらの結果からFGFR1が間葉系KRAS変異型のがんにおいて優性に発現していると結論付けた。 Cell lines with a mesenchymal phenotype had significantly higher FGFR1 expression compared to epithelial cell lines. Linear regression analysis demonstrated a positive correlation between ERBB3 and E-cadherin and a negative correlation between FGFR1 and E-cadherin (FIGS. 2-2e and 2-2f). From these results, it was concluded that FGFR1 is predominantly expressed in mesenchymal KRAS mutant cancer.

［実施例３ 間葉系KRAS変異型肺がん細胞株におけるFGFR1-FRS2経路のフィードバック活性化］
次に、間葉系KRAS変異型のがんにおいて、FGFR1がMEK阻害剤処理後のERKシグナル伝達のフィードバック活性化と関連するか否かを検討した。その結果、CCLEからの遺伝子発現データと一致して、KRAS変異型がん細胞パネルのウェスタンブロット分析によって、間葉系細胞がより高いFGFR1発現を有することが確認された（図３ａ）。また、間葉系KRAS変異型肺がん細胞株NCI-H1792及びLU99において、MEK阻害剤処理はERKのリン酸化を強く抑制したが、長期間のMEK阻害はFGFRのアダプタータンパク質であるFRS2の活性化をもたらした（図３ｂ）。[Example 3 Feedback activation of FGFR1-FRS2 pathway in mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell line]
Next, we investigated whether FGFR1 is associated with feedback activation of ERK signaling after MEK inhibitor treatment in mesenchymal KRAS mutant cancers. As a result, in agreement with the gene expression data from CCLE, Western blot analysis of the KRAS mutant cancer cell panel confirmed that mesenchymal cells had higher FGFR1 expression (Fig. 3a). In the mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines NCI-H1792 and LU99, MEK inhibitor treatment strongly suppressed ERK phosphorylation, but long-term MEK inhibition activated FRS2, an adapter protein of FGFR. Brought about (Fig. 3b).

トラメチニブ処理後に認められるFRS2の活性化がFGFR1によって仲介されているか否かを決定するために、NCI-H1792細胞においてFGFR1の発現をノックダウンにより低下させた後トラメチニブで処理した。その結果、FGFR1ノックダウンにより、トラメチニブ処理後のFRS2の活性化およびERKシグナル伝達のフィードバック活性化が完全に抑制された（図３ｃ）。 To determine whether the activation of FRS2 observed after trametinib treatment was mediated by FGFR1, NCI-H1792 cells were treated with trametinib after knockdown reduction of FGFR1 expression. As a result, FGFR1 knockdown completely suppressed FRS2 activation and feedback activation of ERK signaling after trametinib treatment (Fig. 3c).

［実施例４ FGFR阻害剤及びMEK阻害剤の併用によるERKのフィードバック活性化抑制及び間葉系KRAS変異型肺がん細胞株の細胞死の誘導］
EMT及びFGFR1を介したERK再活性化の関連を更に調べるために、上皮系及び間葉系KRAS変異型肺がん細胞株をトラメチニブ及びNVP-BGJ398の組み合わせで処理した。間葉系KRAS変異型肺がん細胞株NCI-H1792及びLU99において、NVP-BGJ398及びトラメチニブの組合せによりERKリン酸化のより完全な抑制が示され、MEK阻害剤で誘導されるフィードバックにおけるFGFR1の重要な役割と一致した（図４−１ａ）。別のMEK阻害剤であるセルメチニブ、PD0325901とNVP-BGJ398の組み合わせで処理した場合にも同様の結果が得られた(図４−１ｂ及びｃ)。[Example 4 Suppression of ERK feedback activation and induction of cell death of mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell line by combined use of FGFR inhibitor and MEK inhibitor]
To further investigate the association between EMT and FGFR1-mediated ERK reactivation, epithelial and mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines were treated with a combination of trametinib and NVP-BGJ398. In the mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines NCI-H1792 and LU99, the combination of NVP-BGJ398 and trametinib showed a more complete suppression of ERK phosphorylation and the important role of FGFR1 in MEK inhibitor-induced feedback. Consistent with (Fig. 4-1a). Similar results were obtained when treated with a combination of another MEK inhibitor, selmethinib, PD0325901 and NVP-BGJ398 (FIGS. 4-1b and c).

FGFR阻害剤及びMEK阻害剤の組合せは、pan-ERBB阻害剤、FGFR阻害剤、及びMEK阻害剤の単剤処理、並びにpan-ERBB阻害剤及びMEK阻害剤の組合せと比較して、細胞増殖を高度に阻害した（図４−１ｄ及びｅ）。また、FGFR阻害剤及びMEK阻害剤の組合せにより、アポトーシスの誘導も有意に上昇していた（図４−２ｆ及びｇ）。 The combination of FGFR inhibitor and MEK inhibitor increased cell proliferation compared to the single agent treatment of pan-ERBB inhibitor, FGFR inhibitor, and MEK inhibitor, and the combination of pan-ERBB inhibitor and MEK inhibitor. Highly inhibited (FIGS. 4-1d and e). In addition, the combination of the FGFR inhibitor and the MEK inhibitor also significantly increased the induction of apoptosis (Fig. 4-2f and g).

一方、同様のFGFR阻害剤及びMEK阻害剤の組合せは、上皮系KRAS変異型細胞における下流のシグナル伝達には影響を与えなかった（図４−２ｈ）。従って、上皮系細胞株のNCI-H358及びNCI-H1573においてFGFR阻害剤とMEK阻害剤トラメチニブとの組合せは、トラメチニブ単剤療法以上のアポトーシスを誘導しなかった（図４−２ｈ）。 On the other hand, a similar combination of FGFR inhibitor and MEK inhibitor did not affect downstream signal transduction in epithelial KRAS mutant cells (Fig. 4-2h). Therefore, in the epithelial cell lines NCI-H358 and NCI-H1573, the combination of the FGFR inhibitor and the MEK inhibitor trametinib did not induce apoptosis beyond trametinib monotherapy (Fig. 4-2h).

次いで、種々の間葉系KRAS変異型肺がん細胞株について、トラメチニブとNVP-BGJ398との同時処理の効果を更に検討した。イムノブロット解析から、FGFR阻害剤が、トラメチニブ48時間又は72時間処理後に認められるERKのフィードバック活性化を抑制することが確認された（図４−１ａ及び図４−２ｉ）。7種の間葉系KRAS変異型肺がん細胞株のうち5つの細胞株において、MEK阻害剤とFGFR阻害剤の併用はアポトーシスを誘導した（図４−２ｊ）。 Next, the effects of simultaneous treatment of trametinib and NVP-BGJ398 were further investigated for various mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines. Immunoblot analysis confirmed that the FGFR inhibitor suppressed the feedback activation of ERK observed after treatment with trametinib for 48 hours or 72 hours (FIGS. 4-1a and 4-2i). In 5 of the 7 mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines, the combination of MEK inhibitor and FGFR inhibitor induced apoptosis (Fig. 4-2j).

上皮系細胞株であるNCI-H358にEMT誘導を行った細胞（NCI-H358-TGFβ）においては、NVP-BGJ398の添加は、トラメチニブ単剤療法と比較して、リン酸化ERKの更なる抑制をもたらし（図５ａ）、トラメチニブ＋NVP-BGJ398又はFGFR1ノックダウンの組合せによって、高度なアポトーシスが誘導された（図５ｂ及び５ｃ）。 In cells in which EMT induction was performed on the epithelial cell line NCI-H358 (NCI-H358-TGFβ), the addition of NVP-BGJ398 further suppressed phosphorylated ERK as compared with trametinib monotherapy. The resulting combination of trametinib + NVP-BGJ398 or FGFR1 knockdown induced a high degree of apoptosis (FIGS. 5b and 5c).

まとめると、これらのデータから、MEK阻害はEMT状態に依存して異なるRTKの活性化を誘導し、FGFR1-FRS2経路の活性化は、間葉系KRAS変異型肺がん細胞において優先的に誘導されることが示された。 Taken together, from these data, MEK inhibition induces activation of different RTKs depending on EMT status, and activation of the FGFR1-FRS2 pathway is preferentially induced in mesenchymal KRAS mutant lung cancer cells. Was shown.

［実施例５ FGFR阻害剤及びMEK阻害剤の組合せによるin vivoにおける腫瘍退縮の誘導］
FGFR阻害剤とMEK阻害剤の組み合わせの効果をin vivoにおいて実証した。NVP-BGJ398又はトラメチニブの単剤治療は、いずれもLU99腫瘍異種移植モデルマウスにおいて腫瘍の増殖を軽度抑制するのみであるが、FGFR阻害剤とMEK阻害剤の組み合わせで処置すると腫瘍が劇的に退縮した（図６−１ａ及び６−１ｂ）。この薬剤の組み合わせは、4週間の治療期間の間、許容された（データは示さない）。薬剤処理した腫瘍の薬物動態試験の結果はin vitroの結果と同様であり、トラメチニブはリン酸化ERKを部分的に抑制したが、同時にFRS2リン酸化を誘導した。このFRS2のフィードバック活性化はFGFR阻害剤の添加によって抑制され、ERKのリン酸化もより大きく抑制された（図６−２ｃ）。FGFR阻害剤とMEK阻害剤との組合せの効果は、NCI-H23異種移植モデルでも確認された（図６−２ｄ）。[Example 5 Induction of tumor regression in vivo by a combination of an FGFR inhibitor and a MEK inhibitor]
The effect of the combination of FGFR inhibitor and MEK inhibitor was demonstrated in vivo. Monotherapy with NVP-BGJ398 or trametinib only mildly suppresses tumor growth in LU99 tumor xenograft model mice, but treatment with a combination of FGFR and MEK inhibitors dramatically reduces tumors. (Figs. 6-1a and 6-1b). This combination of drugs was tolerated during the 4-week treatment period (data not shown). The results of pharmacokinetic studies of drug-treated tumors were similar to those in vitro, with trametinib partially suppressing phosphorylated ERK but at the same time inducing FRS2 phosphorylation. This feedback activation of FRS2 was suppressed by the addition of an FGFR inhibitor, and ERK phosphorylation was also suppressed more significantly (Fig. 6-2c). The effect of the combination of the FGFR inhibitor and the MEK inhibitor was also confirmed in the NCI-H23 xenograft model (Fig. 6-2d).

［実施例６ 間葉系マーカーの発現とFGFR1発現との関連性］
FGFR1発現が原発性KRAS変異型肺がんの間葉系表現型と関連しているか否かを決定するために、TCGAから入手したKRAS変異型肺腺がん75症例のRNA配列発現データを解析した。Kalluri及びWeinberg（J. Clin. Invest. 119, 1420-1428 (2009)）によって報告されたEMTプロセスと高い相関性を有した28個の遺伝子のセットを使用して階層的クラスタリング解析を行った結果、KRAS変異型のがんを上皮系マーカー及び間葉系マーカーに基づいて2つの群に分類することができた（図７）。重要なことに、間葉系KRAS変異型腫瘍は、上皮系KRAS変異型腫瘍と比較して、より高いFGFR1発現及びより低いERBB3発現を示した（FGFR1についてp<0.001、ERBB3についてp=0.03）。これらのデータから、間葉系KRAS変異型のがんにおいてFGFR1発現が優位であることが確認された。[Example 6 Relationship between mesenchymal marker expression and FGFR1 expression]
To determine whether FGFR1 expression was associated with the mesenchymal phenotype of primary KRAS mutant lung cancer, RNA sequence expression data from 75 cases of KRAS mutant lung adenocarcinoma obtained from TCGA were analyzed. Results of a hierarchical clustering analysis using a set of 28 genes highly correlated with the EMT process reported by Kalluri and Weinberg (J. Clin. Invest. 119, 1420-1428 (2009)) , KRAS mutant cancers could be classified into two groups based on epithelial and mesenchymal markers (Fig. 7). Importantly, mesenchymal KRAS mutant tumors showed higher and lower FGFR1 expression and lower ERBB3 expression compared to epithelial KRAS mutant tumors (p <0.001 for FGFR1 and p = 0.03 for ERBB3). .. From these data, it was confirmed that FGFR1 expression is predominant in mesenchymal KRAS mutant cancer.

［実施例７ ヒト患者検体移植ゼノグラフトモデルにおける治療効果］
KRAS G12D遺伝子異常を有する53歳女性の肺がん検体を雌のNOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスに移植したヒト患者検体由来ゼノグラフトモデルマウスを米国ジャクソン研究所より入手した。マウスより摘出した腫瘍について、上皮系及び間葉系のKRAS変異型肺がん細胞株と共に、ウェスタンブロッティング法によってFGFR1、ビメンチン及びE-カドヘリンの発現を解析した。図８ａに示すように、患者由来のがん組織は、LU99細胞株と同様にFGFR1及びビメンチンの高発現が認められ、一方E-カドヘリンの発現は認められなかったことから、間葉系KRAS変異型がん細胞であると判定された。[Example 7 Therapeutic effect in human patient specimen transplantation Xenograft model]
A human patient sample-derived xenograft model mouse obtained by transplanting a lung cancer sample of a 53-year-old woman having a KRAS G12D gene abnormality into a female NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) mouse was obtained from the Jackson Laboratory in the United States. For tumors resected from mice, the expression of FGFR1, vimentin and E-cadherin was analyzed by Western blotting together with epithelial and mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines. As shown in FIG. 8a, the cancer tissue derived from the patient showed high expression of FGFR1 and vimentin as in the LU99 cell line, while no expression of E-cadherin was observed. Therefore, the mesenchymal KRAS mutation was observed. It was determined to be a type cancer cell.

次に、腫瘍の平均が約300mm3に達したところで各群３匹として、生理食塩水を投与する対照群、NVP-BGJ398投与群及びトラメチニブ投与群に分け、治療効果を15日間観察した。薬剤の投与法は実施例５記載の異種移植マウス実験と同様に行った。
対照群及びNVP-BGJ398投与群では観察開始から5日後に腫瘍体積が増大したため、試験を終了した。トラメチニブ投与群では観察開始から14日後に腫瘍体積が増大した時点でNVP-BGJ398との組合せ投与に切り替えた。
その結果、NVP-BGJ398とトラメチニブとを組合せて投与することにより、腫瘍体積が顕著に減少し、その後、28日間の観察終了まで腫瘍増大の抑制効果が維持された。Next, when the average tumor reached about 300 mm 3 , the three animals in each group were divided into a control group to which physiological saline was administered, an NVP-BGJ398 administration group, and a trametinib administration group, and the therapeutic effect was observed for 15 days. The drug administration method was the same as in the xenograft mouse experiment described in Example 5.
The study was terminated because the tumor volume increased 5 days after the start of observation in the control group and the NVP-BGJ398 administration group. In the trametinib-administered group, when the tumor volume increased 14 days after the start of observation, the administration was switched to the combination administration with NVP-BGJ398.
As a result, the combined administration of NVP-BGJ398 and trametinib significantly reduced the tumor volume, and then the effect of suppressing tumor growth was maintained until the end of 28 days of observation.

［実施例８ FGFR阻害剤及びMEK阻害剤の併用によるERKのフィードバック活性化抑制及び間葉系KRAS変異型肺がん細胞株の細胞死の誘導］
上皮系及び間葉系KRAS変異型肺がん細胞株をトラメチニブ及びFGFR阻害剤AZD4547の組み合わせで処理した。間葉系KRAS変異型肺がん細胞株NCI-H1792及びLU99において、AZD4547及びトラメチニブの組合せによりERKリン酸化のより完全な抑制が示され、MEK阻害剤で誘導されるフィードバックにおけるFGFR1の重要な役割と一致した（図９ａ）。
また、AZD4547及びトラメチニブの組合せは、それぞれの単剤処理と比較して、細胞増殖を顕著に阻害した（図９ｂ及びｃ）。[Example 8 Suppression of ERK feedback activation and induction of cell death of mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell line by combined use of FGFR inhibitor and MEK inhibitor]
Epithelial and mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines were treated with a combination of trametinib and the FGFR inhibitor AZD4547. A combination of AZD4547 and trametinib showed a more complete suppression of ERK phosphorylation in the mesenchymal KRAS mutant lung cancer cell lines NCI-H1792 and LU99, consistent with the important role of FGFR1 in MEK inhibitor-induced feedback. (Fig. 9a).
In addition, the combination of AZD4547 and trametinib markedly inhibited cell proliferation as compared with each single agent treatment (FIGS. 9b and c).

本発明は、FGFR1を介した経路が、間葉系KRAS変異型肺がんにおいてMEK阻害後のMAPKのフィードバック活性化を仲介することを見出した。この知見は、EMT状態に基づいて患者を分類し、間葉系の腫瘍を標的とする有効な治療につなげることを可能とする。本発明は、患者に対してより小さな負担でより効果的な治療を提供することを可能とするものである。 The present invention has found that the FGFR1-mediated pathway mediates feedback activation of MAPK after MEK inhibition in mesenchymal KRAS mutant lung cancer. This finding makes it possible to classify patients based on their EMT status and lead to effective treatments targeting mesenchymal tumors. The present invention makes it possible to provide a more effective treatment to a patient with a smaller burden.

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。 All publications, patents and patent applications cited herein are incorporated herein by reference in their entirety.

Claims (9)

MAPK/ERKキナーゼ（MEK）阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、線維芽細胞増殖因子受容体1（FGFR1）阻害剤を含む、間葉系KRAS変異型がん治療剤であって、該FGFR1阻害剤が、NVP-BGJ398（3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチル-尿素、CAS:872511-34-7）、AZD4547 (N-(5-(3,5-ジメソキシフェネチル)-1H-ピラゾル-3-イル)-4-((3S,5R)-3,5-ジメチルピペラジン-1-イル)ベンザミド、CAS:1035270-39-3）、LY2874455 ((R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)エトキシ)-1H-インダゾール-3イル)ビニル)-1H-ピラゾール-1-イル)エタノール)、TAS-120、FGFR1タンパク質に特異的な抗体及びその抗原結合性断片、及びFGFR1の発現を阻害するsiRNA及びshRNAからなる群から選択され、該MEK阻害剤が、トラメチニブ、セルメチニブ、pd98059、ピマセルチブ、MEK162、PD0325901、及びMEKの発現を阻害するsiRNA及びshRNAからなる群から選択される、上記治療剤。 A therapeutic agent for mesenchymal KRAS mutant cancer, which comprises a fibroblast growth factor receptor 1 (FGFR1) inhibitor, which is characterized by being administered in combination with a MAPK / ERK kinase (MEK) inhibitor. , The FGFR1 inhibitor is NVP-BGJ398 (3- (2,6-dichloro-3,5-dimethoxy-phenyl) -1- {6- [4- (4-ethyl-piperazin-1-yl) -phenyl). Amino] -pyrimidine-4-yl} -1-methyl-urea, CAS: 872511-34-7), AZD4547 (N-(5- (3,5-dimesoxyphenethyl) -1H-pyrazol-3-yl) -4-((3S, 5R) -3,5-dimethylpiperazin-1-yl) benzamide, CAS: 1035270-39-3), LY2874455 ((R)-(E) -2- (4- (2-) (5- (1- (3,5-dichloropyridine-4-yl) ethoxy) -1H-indazole-3yl) vinyl) -1H-pyrazol-1-yl) ethanol), TAS-120, FGFR1 protein specific The MEK inhibitor is selected from the group consisting of a typical antibody and its antigen-binding fragment, and siRNA and shRNA that inhibit the expression of FGFR1, and the MEK inhibitor exhibits the expression of tramethinib, selmethinib, pd98059, pimacertib, MEK162, PD0325901, and MEK. The therapeutic agent selected from the group consisting of inhibitory siRNA and shRNA . FGFR1阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、MEK阻害剤を含む間葉系KRAS変異型がん治療剤であって、該FGFR1阻害剤が、NVP-BGJ398（3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチル-尿素、CAS:872511-34-7）、AZD4547 (N-(5-(3,5-ジメソキシフェネチル)-1H-ピラゾル-3-イル)-4-((3S,5R)-3,5-ジメチルピペラジン-1-イル)ベンザミド、CAS:1035270-39-3）、LY2874455 ((R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)エトキシ)-1H-インダゾール-3イル)ビニル)-1H-ピラゾール-1-イル)エタノール)、TAS-120、FGFR1タンパク質に特異的な抗体及びその抗原結合性断片、及びFGFR1の発現を阻害するsiRNA及びshRNAからなる群から選択され、該MEK阻害剤が、トラメチニブ、セルメチニブ、pd98059、ピマセルチブ、MEK162、PD0325901、及びMEKの発現を阻害するsiRNA及びshRNAからなる群から選択される、上記治療剤。 It is a mesenchymal KRAS mutant cancer therapeutic agent containing a MEK inhibitor, which is characterized by being administered in combination with an FGFR1 inhibitor, and the FGFR1 inhibitor is NVP-BGJ398 (3- (2,6). -Dichloro-3,5-dimethoxy-phenyl) -1- {6- [4- (4-ethyl-piperazin-1-yl) -phenylamino] -pyrimidine-4-yl} -1-methyl-urea, CAS : 872511-34-7), AZD4547 (N- (5- (3,5-dimesoxyphenethyl) -1H-pyrazol-3-yl) -4-((3S, 5R) -3,5-dimethylpiperazin- 1-yl) benzamide, CAS: 1035270-39-3), LY2874455 ((R)-(E) -2- (4- (2- (5- (1- (3,5-dichloropyridine-4-yl)) ) Ethoxy) -1H-indazole-3yl) vinyl) -1H-pyrazol-1-yl) ethanol), TAS-120, FGFR1 protein-specific antibody and its antigen-binding fragment, and inhibits the expression of FGFR1 The therapeutic agent selected from the group consisting of siRNA and shRNA, wherein the MEK inhibitor is selected from the group consisting of tramethinib, selmethinib, pd98059, pimacertib, MEK162, PD0325901, and siRNA and shRNA that inhibit the expression of MEK . 請求項１記載の治療剤、又は請求項２記載の治療剤を有効成分として含有する、間葉系KRAS変異型がん治療用医薬組成物。 A pharmaceutical composition for treating mesenchymal KRAS mutant cancer, which comprises the therapeutic agent according to claim 1 or the therapeutic agent according to claim 2 as an active ingredient. FGFR1阻害剤及びMAPK/ERKキナーゼ（MEK）阻害剤を有効成分として含有する、間葉系KRAS変異型がん治療用医薬組成物であって、該FGFR1阻害剤が、NVP-BGJ398（3-(2,6-ジクロロ-3,5-ジメトキシ-フェニル)-1-{6-[4-(4-エチル-ピペラジン-1-イル)-フェニルアミノ]-ピリミジン-4-イル}-1-メチル-尿素、CAS:872511-34-7）、AZD4547 (N-(5-(3,5-ジメソキシフェネチル)-1H-ピラゾル-3-イル)-4-((3S,5R)-3,5-ジメチルピペラジン-1-イル)ベンザミド、CAS:1035270-39-3）、LY2874455 ((R)-(E)-2-(4-(2-(5-(1-(3,5-ジクロロピリジン-4-イル)エトキシ)-1H-インダゾール-3イル)ビニル)-1H-ピラゾール-1-イル)エタノール)、TAS-120、FGFR1タンパク質に特異的な抗体及びその抗原結合性断片、及びFGFR1の発現を阻害するsiRNA及びshRNAからなる群から選択され、該MEK阻害剤が、トラメチニブ、セルメチニブ、pd98059、ピマセルチブ、MEK162、PD0325901、及びMEKの発現を阻害するsiRNA及びshRNAからなる群から選択される、上記組成物。 A pharmaceutical composition for treating mesenchymal KRAS mutant cancer containing an FGFR1 inhibitor and a MAPK / ERK kinase (MEK) inhibitor as active ingredients , wherein the FGFR1 inhibitor is NVP-BGJ398 (3-( 2,6-dichloro-3,5-dimethoxy-phenyl) -1- {6- [4- (4-ethyl-piperazin-1-yl) -phenylamino] -pyrimidine-4-yl} -1-methyl- Urea, CAS: 872511-34-7), AZD4547 (N-(5- (3,5-dimesoxyphenetyl) -1H-pyrazol-3-yl) -4-((3S, 5R) -3,5- Dimethylpiperazin-1-yl) benzamide, CAS: 1035270-39-3), LY2874455 ((R)-(E) -2- (4- (2- (5- (1- (3,5-dichloropyridine-) 4-yl) ethoxy) -1H-indazole-3 yl) vinyl) -1H-pyrazol-1-yl) ethanol), TAS-120, FGFR1 protein-specific antibody and its antigen-binding fragment, and expression of FGFR1 The MEK inhibitor is selected from the group consisting of tramethinib, selmethinib, pd98059, pimacertib, MEK162, PD0325901, and the group consisting of siRNA and shRNA that inhibits the expression of MEK. Composition . 請求項１若しくは２記載の治療剤、又は請求項３若しくは４記載の組成物の患者への投与の有効性を予測するためのデータを取得する方法であって、がんと診断された患者由来のサンプルを、FGFR1タンパク質若しくは該タンパク質をコードする遺伝子の検出を可能とする間葉系がん細胞検出試薬、又は該試薬を含む細胞型判定試薬セットと接触させ、FGFR1の発現を指標として間葉系KRAS変異型がん細胞の存在又は不存在を検出することを含む、上記方法。 A method for obtaining data for predicting the efficacy of administration of the therapeutic agent according to claim 1 or 2 or the composition according to claim 3 or 4 to a patient, which is derived from a patient diagnosed with cancer. Is contacted with a mesenchymal cancer cell detection reagent that enables detection of the FGFR1 protein or a gene encoding the protein, or a cell type determination reagent set containing the reagent, and the mesenchymal is expressed using the expression of FGFR1 as an index. The method described above comprising detecting the presence or absence of strain KRAS mutant cancer cells. 細胞型判定試薬セットが、KRAS遺伝子変異検出試薬を含む、請求項５記載の方法。 The method of claim 5 , wherein the cell type determination reagent set comprises a KRAS gene mutation detection reagent. 細胞型判定試薬セットが、上記間葉系がん細胞検出試薬と上皮系がん細胞検出試薬の組合せを含む、請求項５又は６記載の方法。 The method according to claim 5 or 6 , wherein the cell type determination reagent set comprises a combination of the mesenchymal cancer cell detection reagent and the epithelial cancer cell detection reagent. 細胞型判定試薬セットが、更なる間葉系がん細胞検出試薬としてビメンチンの検出を可能とする検出試薬を含む、請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。 The method according to any one of claims 5 to 7 , wherein the cell type determination reagent set comprises a detection reagent that enables detection of vimentin as a further mesenchymal cancer cell detection reagent. 細胞型判定試薬セットが、上皮系がん細胞検出試薬としてE-カドヘリン及び／又はERBB3の検出を可能とする検出試薬を含む、請求項５〜８のいずれか１項記載の方法。 The method according to any one of claims 5 to 8 , wherein the cell type determination reagent set contains a detection reagent capable of detecting E-cadherin and / or ERBB3 as an epithelial cancer cell detection reagent.
JP2017551900A 2015-11-19 2016-11-16 Mesenchymal KRAS mutant cancer therapeutic agent Active JP6860919B2 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015227015 2015-11-19
JP2015227015 2015-11-19
PCT/JP2016/083921 WO2017086332A1 (en) 2015-11-19 2016-11-16 Therapeutic agent for mesenchymal kras mutation–type cancers

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2017086332A1 JPWO2017086332A1 (en) 2018-09-27
JP6860919B2 true JP6860919B2 (en) 2021-04-21

Family

ID=58719030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017551900A Active JP6860919B2 (en) 2015-11-19 2016-11-16 Mesenchymal KRAS mutant cancer therapeutic agent

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JP6860919B2 (en)
WO (1) WO2017086332A1 (en)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11883404B2 (en) 2016-03-04 2024-01-30 Taiho Pharmaceuticals Co., Ltd. Preparation and composition for treatment of malignant tumors
EP3665302A4 (en) * 2017-08-11 2021-04-28 Curematch, Inc. Drug combinations for targeting multiple mutations in cancer
CA3094431C (en) 2018-03-19 2023-06-27 Taiho Pharmaceutical Co., Ltd. Pharmaceutical composition including sodium alkyl sulfate

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010111388A2 (en) * 2009-03-24 2010-09-30 Biocept, Inc. Devices and methods of cell capture and analysis
SG11201400543TA (en) * 2011-10-28 2014-08-28 Novartis Ag Method of treating gastrointestinal stromal tumors
JP6198717B2 (en) * 2012-03-28 2017-09-20 株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ Method for detecting malignancy of peripheral circulating tumor cell unit and kit thereof
JP2014033626A (en) * 2012-08-08 2014-02-24 Juntendo Method for creating model mouse for distant metastasis of human cancer epithelial cell

Also Published As

Publication number Publication date
WO2017086332A1 (en) 2017-05-26
JPWO2017086332A1 (en) 2018-09-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Rader et al. Dual CDK4/CDK6 inhibition induces cell-cycle arrest and senescence in neuroblastoma
Corcoran et al. TORC1 suppression predicts responsiveness to RAF and MEK inhibition in BRAF-mutant melanoma
Okada et al. Integrin-α10 dependency identifies RAC and RICTOR as therapeutic targets in high-grade myxofibrosarcoma
Mueller et al. Targeting Wee1 for the treatment of pediatric high-grade gliomas
Kim et al. Ibrutinib inhibits pre-BCR+ B-cell acute lymphoblastic leukemia progression by targeting BTK and BLK
Hiemer et al. A YAP/TAZ-regulated molecular signature is associated with oral squamous cell carcinoma
Engelman et al. Allelic dilution obscures detection of a biologically significant resistance mutation in EGFR-amplified lung cancer
Yamaguchi et al. Phosphoinositide 3-kinase signaling pathway mediated by p110α regulates invadopodia formation
Momota et al. Perifosine inhibits multiple signaling pathways in glial progenitors and cooperates with temozolomide to arrest cell proliferation in gliomas in vivo
Smoot et al. Platelet‐derived growth factor regulates YAP transcriptional activity via Src family kinase dependent tyrosine phosphorylation
Roberts et al. Essential requirement for PP2A inhibition by the oncogenic receptor c-KIT suggests PP2A reactivation as a strategy to treat c-KIT+ cancers
Wagner et al. KDM2A promotes lung tumorigenesis by epigenetically enhancing ERK1/2 signaling
Vivanco et al. Differential sensitivity of glioma-versus lung cancer–specific EGFR mutations to EGFR kinase inhibitors
Kobayashi et al. Transcriptional profiling identifies cyclin D1 as a critical downstream effector of mutant epidermal growth factor receptor signaling
Seedhouse et al. DNA repair contributes to the drug-resistant phenotype of primary acute myeloid leukaemia cells with FLT3 internal tandem duplications and is reversed by the FLT3 inhibitor PKC412
Jarboe et al. MARCKS regulates growth and radiation sensitivity and is a novel prognostic factor for glioma
Cummings et al. Small molecule inhibition of MERTK is efficacious in non–small cell lung cancer models independent of driver oncogene status
Berglund et al. Functional role of the Ca2+-activated Cl− channel DOG1/TMEM16A in gastrointestinal stromal tumor cells
Xie et al. RBPJ maintains brain tumor–initiating cells through CDK9-mediated transcriptional elongation
Balakumaran et al. MYC activity mitigates response to rapamycin in prostate cancer through eukaryotic initiation factor 4E–binding protein 1–mediated inhibition of autophagy
Guo et al. miR-656 inhibits glioma tumorigenesis through repression of BMPR1A
Male et al. Inhibition of RalA signaling pathway in treatment of non-small cell lung cancer
Galimberti et al. Targeting the cyclin E-Cdk-2 complex represses lung cancer growth by triggering anaphase catastrophe
Chen et al. Dual targeting of insulin receptor and KIT in imatinib-resistant gastrointestinal stromal tumors
Guo et al. Nicotine promotes mammary tumor migration via a signaling cascade involving protein kinase C and CDC42

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180515

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20190926

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200818

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20201012

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20210224

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20210322

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6860919

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150