JP6843599B2 - Preservative solution of live cells or compositions containing live cells - Google Patents
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Description
本発明は、特定の成分、例えばビタミン、とくにビタミンＣおよび／もしくはビタミンＥまたはエダラボン、を含む生細胞または生細胞を含む組成物、例えば移植片、の保存液、当該保存液を用いて生細胞または生細胞を含む組成物を保存する方法、および当該保存液を用いてシート状細胞培養物を保存する工程を含む、シート状細胞培養物を製造する方法などに関する。 The present invention is a preservation solution of a living cell or a composition containing a living cell containing a specific component, for example a vitamin, particularly vitamin C and / or vitamin E or edaravon, such as a transplant, a living cell using the preservation solution. Alternatively, the present invention relates to a method for preserving a composition containing living cells, a method for producing a sheet-shaped cell culture, and the like, which comprises a step of preserving the sheet-shaped cell culture using the preservation solution.
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患や拡張型心筋症などにより損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１〜２）。 In recent years, attempts have been made to transplant various cells for repairing damaged tissues and the like. For example, fetal myocardial cells, skeletal myocardial cells, mesenchymal stem cells, cardiac stem cells, ES cells for repair of myocardial tissue damaged by ischemic heart disease such as angina and myocardial infarction or dilated myocardial disease. Etc. have been attempted (Non-Patent Documents 1 and 2).
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（特許文献１、非特許文献２）。
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。
As a part of such an attempt, a cell structure formed by using a scaffold and a sheet-shaped cell culture in which cells are formed in a sheet shape have been developed (Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
Regarding the therapeutic application of sheet-shaped cell culture, use of cultured epidermis sheet for skin damage caused by burns, use of corneal epithelial sheet-shaped cell culture for corneal damage, oral mucosal sheet-like for endoscopic resection of esophageal cancer Studies on the use of cell cultures are underway, and some of them are in the stage of clinical application.
移植による処置において、品質の低下を可能な限り抑えつつ移植片を保存することは、処置の成功に大きく影響する。例えばＵＷ液、Euro-Collins液、ET-Kyoto液など、かかる目的で、保存する移植片の損傷を抑え、品質を保つための保存液が知られている。特許文献２には、特定の組成を有する、低温保存のための細胞非含有溶液が開示されている。また特許文献３には、有効成分としてポリフェノールを含む細胞または臓器の保存剤、および従来の保存剤にポリフェノールを添加することにより、従来の保存剤の効果を改良することが開示されている。 In transplantation procedures, preserving the graft while minimizing quality degradation has a significant impact on the success of the procedure. For this purpose, preservative solutions such as UW solution, Euro-Collins solution, and ET-Kyoto solution are known to suppress damage to the graft to be preserved and maintain the quality. Patent Document 2 discloses a cell-free solution for cryopreservation having a specific composition. Further, Patent Document 3 discloses that a cell or organ preservative containing polyphenol as an active ingredient and an effect of the conventional preservative are improved by adding polyphenol to the conventional preservative.
本発明の目的は、簡便に調製でき、とくに低温保存時において高い細胞保護作用を示す、生細胞または生細胞を含む組成物の保存液を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a preservation solution of living cells or a composition containing living cells, which can be easily prepared and exhibits a high cytoprotective effect particularly at low temperature storage.
本発明者らは、シート状細胞培養物を鋭意研究する中で、低栄養液に総合ビタミン剤やエダラボンなどの特定の成分を添加した場合に、シート状細胞培養物の保存性が格段に上昇するという知見を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を続けた結果、本発明を完成するに至った。 In the diligent research of sheet-shaped cell cultures, the present inventors have significantly improved the storage stability of sheet-shaped cell cultures when specific components such as multivitamins and edaravon are added to malnutrition solutions. As a result of finding the finding that the substance is to be used and continuing further research based on the finding, the present invention has been completed.
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
［１］生理的等張液およびビタミンＣを含む、移植片保存液。
［２］生理的等張液にビタミンＣを添加してなる、［１］の移植片保存液。
［３］生理的等張液が、低栄養等張液である、［１］または［２］の保存液。
［４］生理的等張液が、ハンクス平衡塩液である、［１］〜［３］の保存液。
［５］移植片が、シート状細胞培養物である、［１］〜［４］の保存液。
［６］移植片が、骨格筋芽細胞を含む移植片である、［１］〜［５］の保存液。
［７］［１］〜［６］の保存液に、シート状細胞培養物を浸漬することを含む、シート状細胞培養物の保存方法。
［８］保存時の温度が、２〜８℃である、［７］の保存方法。
［９］保存が、２４〜１２０時間の間行われる、［７］または［８］の保存方法。
［１０］（ａ）細胞を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種すること、
（ｂ）播種した細胞をシート化培養してシート状細胞培養物を形成すること、
（ｃ）形成したシート状細胞培養物を剥離すること、および
（ｄ）剥離したシート状細胞培養物を、請求項１〜６のいずれか一項に記載の保存液に浸漬すること
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
That is, the present invention relates to the following:
[1] A graft preservation solution containing a physiological isotonic solution and vitamin C.
[2] The graft preservation solution of [1], which is obtained by adding vitamin C to a physiological isotonic solution.
[3] The preservative solution of [1] or [2], wherein the physiological isotonic solution is a hyponutrition isotonic solution.
[4] Preservative solutions of [1] to [3], wherein the physiological isotonic solution is a Hanks equilibrium salt solution.
[5] Preservative solutions of [1] to [4], wherein the implant is a sheet-like cell culture.
[6] Preservative solutions of [1] to [5], wherein the implant is a implant containing skeletal myoblasts.
[7] A method for preserving a sheet-shaped cell culture, which comprises immersing the sheet-shaped cell culture in the preservative solution of [1] to [6].
[8] The storage method according to [7], wherein the storage temperature is 2 to 8 ° C.
[9] The storage method of [7] or [8], wherein the storage is performed for 24 to 120 hours.
[10] (a) Seeding the cells on a culture medium at a density capable of forming a sheet-like cell culture without substantially proliferating.
(B) Forming a sheet-like cell culture by culturing the seeded cells in a sheet.
(C) The formed sheet-like cell culture is exfoliated, and (d) the exfoliated sheet-like cell culture is immersed in the preservation solution according to any one of claims 1 to 6. A method for producing a sheet-shaped cell culture.
［１１］生理的等張液およびビタミンＥを含む、移植片保存液。
［１２］生理的等張液にビタミンＥを添加してなる、［１１］の移植片保存液。
［１３］生理的等張液が、低栄養等張液である、［１１］または［１２］の保存液。
［１４］生理的等張液が、ハンクス平衡塩液である、［１１］〜［１３］の保存液。
［１５］移植片が、シート状細胞培養物である、［１１］〜［１４］の保存液。
［１６］移植片が、骨格筋芽細胞を含む移植片である、［１１］〜［１５］の保存液。
［１７］［１１］〜［１６］の保存液に、シート状細胞培養物を浸漬することを含む、シート状細胞培養物の保存方法。
［１８］保存時の温度が、２〜８℃である、［１７］の保存方法。
［１９］保存が、２４〜１２０時間の間行われる、［１７］または［１８］の保存方法。
［２０］（ａ）細胞を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種すること、
（ｂ）播種した細胞をシート化培養してシート状細胞培養物を形成すること、
（ｃ）形成したシート状細胞培養物を剥離すること、および
（ｄ）剥離したシート状細胞培養物を、［１１］〜［１６］の保存液に浸漬すること
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
[11] A graft preservation solution containing a physiological isotonic solution and vitamin E.
[12] The graft preservation solution of [11], which is obtained by adding vitamin E to a physiological isotonic solution.
[13] The preservative solution of [11] or [12], wherein the physiological isotonic solution is a hyponutrition isotonic solution.
[14] Preservative solutions of [11] to [13], wherein the physiological isotonic solution is a Hanks equilibrium salt solution.
[15] Preservative solutions of [11] to [14], wherein the implant is a sheet-like cell culture.
[16] Preservative solutions of [11] to [15], wherein the implant is a implant containing skeletal myoblasts.
[17] A method for preserving a sheet-shaped cell culture, which comprises immersing the sheet-shaped cell culture in the preservative solution of [11] to [16].
[18] The storage method according to [17], wherein the storage temperature is 2 to 8 ° C.
[19] The storage method of [17] or [18], wherein the storage is performed for 24 to 120 hours.
[20] (a) Seeding cells into a culture medium at a density capable of forming a sheet-like cell culture without substantially proliferating.
(B) Forming a sheet-like cell culture by culturing the seeded cells in a sheet.
A sheet-like cell culture comprising (c) exfoliating the formed sheet-like cell culture and (d) immersing the exfoliated sheet-like cell culture in the preservation solutions of [11] to [16]. Manufacturing method.
［２１］生理的等張液、ビタミンＣおよびビタミンＥを含む、移植片保存液。
［２２］生理的等張液にビタミンＣおよびビタミンＥを添加してなる、［２１］の移植片保存液。
［２３］生理的等張液が、低栄養等張液である、［２１］または［２２］の保存液。
［２４］生理的等張液が、ハンクス平衡塩液である、［２１］〜［２３］の保存液。
［２５］移植片が、シート状細胞培養物である、［２１］〜［２４］の保存液。
［２６］移植片が、骨格筋芽細胞を含む移植片である、［２１］〜［２５］の保存液。
［２７］［２１］〜［２６］の保存液に、シート状細胞培養物を浸漬することを含む、シート状細胞培養物の保存方法。
［２８］保存時の温度が、２〜８℃である、［２７］の保存方法。
［２９］保存が、２４〜１２０時間の間行われる、［２７］または［２８］の保存方法。
［３０］（ａ）細胞を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種すること、
（ｂ）播種した細胞をシート化培養してシート状細胞培養物を形成すること、
（ｃ）形成したシート状細胞培養物を剥離すること、および
（ｄ）剥離したシート状細胞培養物を、［２１］〜［２６］のいずれか一項に記載の保存液に浸漬すること
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
[21] A graft preservation solution containing a physiological isotonic solution, vitamin C and vitamin E.
[22] The graft preservation solution of [21], which is obtained by adding vitamin C and vitamin E to a physiological isotonic solution.
[23] The preservative solution of [21] or [22], wherein the physiological isotonic solution is a hyponutrition isotonic solution.
[24] Preservative solutions of [21] to [23], wherein the physiological isotonic solution is a Hanks equilibrium salt solution.
[25] Preservative solutions of [21] to [24], wherein the implant is a sheet-like cell culture.
[26] Preservative solutions of [21] to [25], wherein the implant is a implant containing skeletal myoblasts.
[27] A method for preserving a sheet-shaped cell culture, which comprises immersing the sheet-shaped cell culture in the preservative solution of [21] to [26].
[28] The storage method according to [27], wherein the storage temperature is 2 to 8 ° C.
[29] The storage method of [27] or [28], wherein the storage is performed for 24 to 120 hours.
[30] (a) Seeding cells into a culture medium at a density capable of forming a sheet-like cell culture without substantially proliferating.
(B) Forming a sheet-like cell culture by culturing the seeded cells in a sheet.
(C) Peeling the formed sheet-shaped cell culture, and (d) Immersing the peeled sheet-shaped cell culture in the preservation solution according to any one of [21] to [26]. A method for producing a sheet-like cell culture, which comprises.
［３１］生理的等張液に総合ビタミン剤を含む、移植片保存液。
［３２］生理的等張液に総合ビタミン剤を添加してなる、［３１］の移植片保存液。
［３３］生理的等張液が、低栄養等張液である、［３１］または［３２］の保存液。
［３４］生理的等張液が、ハンクス平衡塩液である、［３１］〜［３３］の保存液。
［３５］移植片が、シート状細胞培養物である、［３１］〜［３４］の保存液。
［３６］移植片が、骨格筋芽細胞を含む移植片である、［３１］〜［３５］の保存液。
［３７］［３１］〜［３６］の保存液に、シート状細胞培養物を浸漬することを含む、シート状細胞培養物の保存方法。
［３８］保存時の温度が、２〜８℃である、［３７］の保存方法。
［３９］保存が、２４〜１２０時間の間行われる、［３７］または［３８］の保存方法。
［４０］（ａ）細胞を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種すること、
（ｂ）播種した細胞をシート化培養してシート状細胞培養物を形成すること、
（ｃ）形成したシート状細胞培養物を剥離すること、および
（ｄ）剥離したシート状細胞培養物を、［３１］〜［３６］の保存液に浸漬すること
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。
[31] A graft preservation solution containing a multivitamin preparation in a physiological isotonic solution.
[32] The graft preservation solution of [31], which is obtained by adding a multivitamin agent to a physiological isotonic solution.
[33] The preservative solution of [31] or [32], wherein the physiological isotonic solution is a hyponutrition isotonic solution.
[34] Preservative solutions of [31] to [33], wherein the physiological isotonic solution is a Hanks equilibrium salt solution.
[35] Preservative solutions of [31] to [34], wherein the implant is a sheet-like cell culture.
[36] Preservative solutions of [31] to [35], wherein the implant is a implant containing skeletal myoblasts.
[37] A method for preserving a sheet-shaped cell culture, which comprises immersing the sheet-shaped cell culture in the preservative solution of [31] to [36].
[38] The storage method according to [37], wherein the storage temperature is 2 to 8 ° C.
[39] The storage method of [37] or [38], wherein the storage is performed for 24 to 120 hours.
[40] (a) Seeding cells into a culture medium at a density capable of forming a sheet-like cell culture without substantially proliferating.
(B) Forming a sheet-like cell culture by culturing the seeded cells in a sheet.
A sheet-like cell culture comprising (c) exfoliating the formed sheet-like cell culture and (d) immersing the exfoliated sheet-like cell culture in the preservation solutions of [31] to [36]. Manufacturing method.
［４１］生細胞または生細胞を含む組成物を保存する保存液であって、エダラボンを含有する、前記保存液。
［４２］保存液が、生細胞を実質的に増殖させない程度に低栄養である、［４１］の保存液。
［４３］［４１］または［４２］の保存液であって、生細胞または生細胞を含む組成物をさらに含む、前記保存液。
［４４］生細胞または生細胞を含む組成物が、生体への移植用である、［４１］〜［４３］の保存液。
［４５］生細胞または生細胞を含む組成物が、骨格筋芽細胞を含む、［４１］〜［４４］の保存液。
［４６］生細胞を含む組成物が、シート状細胞培養物である、［４１］〜［４５］の保存液。
［４７］シート状細胞培養物が、６ｃｍ２以上の面積を有する、［４６］の保存液。
［４８］生細胞または生細胞を含む組成物を保存する方法であって、エダラボンを含有する保存液を用いる、前記方法。
［４９］保存液中で生細胞または生細胞を含む組成物を凍結させることなく保存する、［４８］の方法。
［５０］生細胞または生細胞を含む組成物を製造する方法であって、エダラボンを含有する保存液に、生細胞または生細胞を含む組成物を浸漬することを含む、前記方法。
[41] A preservative solution for preserving live cells or a composition containing live cells, the preservative solution containing edaravone.
[42] The preservation solution of [41], wherein the preservation solution is undernourished to the extent that the living cells are not substantially proliferated.
[43] The preservation solution according to [41] or [42], further comprising a living cell or a composition containing living cells.
[44] Preservative solutions of [41] to [43], wherein the living cells or the composition containing the living cells are for transplantation into a living body.
[45] Preservative solutions of [41] to [44], wherein the living cells or the composition containing the living cells contains skeletal myoblasts.
[46] Preservative solutions of [41] to [45], wherein the composition containing live cells is a sheet-like cell culture.
[47] The preservation solution of [46], wherein the sheet-shaped cell culture has an area of 6 cm 2 or more.
[48] A method for preserving live cells or a composition containing live cells, wherein a preservative solution containing edaravone is used.
[49] The method of [48], wherein the living cells or the composition containing the living cells are stored in a preservation solution without freezing.
[50] A method for producing a living cell or a composition containing a living cell, which comprises immersing the living cell or the composition containing the living cell in a preservation solution containing edaravone.
本発明により、シート状細胞培養物を形成した後、簡便な組成によりシート状細胞培養物を長期間、品質を保ったまま保存することが可能となる。また、従来用いられていた移植片の保存液は、組成が複雑であったり、安定性が低かったりするという欠点があったが、本発明の保存液であれば、簡便に用時調製可能であるため、保存液そのものの安定性などはあまり考慮する必要がない。また、従来の保存液は、様々な成分を含むため、移植に用いる際に洗浄などにより保存液を洗い流す必要があるが、本発明の保存液であれば、医薬的な使用にも堪え得るグレードの成分で調製可能であるため、施術前の洗浄等、余計な手間を必要としない。 According to the present invention, after forming a sheet-shaped cell culture, the sheet-shaped cell culture can be stored for a long period of time while maintaining its quality with a simple composition. Further, the conventionally used preservation solution for implants has a drawback that the composition is complicated and the stability is low, but the preservation solution of the present invention can be easily prepared at the time of use. Therefore, it is not necessary to consider the stability of the preservation solution itself. In addition, since the conventional preservation solution contains various components, it is necessary to wash away the preservation solution by washing or the like when using it for transplantation, but the preservation solution of the present invention is a grade that can withstand pharmaceutical use. Since it can be prepared with the above ingredients, no extra work such as cleaning before the treatment is required.
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
Unless defined otherwise herein, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as those commonly understood by one of ordinary skill in the art. All patents, applications, published applications and other publications referenced herein are hereby incorporated by reference in their entirety. In the event of a conflict between the publications referred to herein and the description herein, the description herein shall prevail.
本発明において、「生細胞または生細胞を含む組成物」とは、生きている細胞またはそれを含む細胞集団、懸濁液、細胞混合物、構造物、組織などを意味し、生細胞は、好ましくは生体由来の細胞、より好ましくは生物個体から得られた初代細胞である。生細胞は初代細胞を一世代または複数世代培養して増殖させた細胞でもよい。生細胞は複数世代培養して増殖させた細胞がある生物学的または物理学的条件により増殖を止めた細胞でもよい。生細胞としては、これに限定するものではないが、例えば体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、血液細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などが挙げられる。また、幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）から分化させて得られた体細胞（上述の体細胞を含む）などが挙げられる。 In the present invention, the "living cell or a composition containing a living cell" means a living cell or a cell population containing the living cell, a suspension, a cell mixture, a structure, a tissue, or the like, and the living cell is preferable. Is a cell derived from a living body, more preferably a primary cell obtained from an individual organism. The living cell may be a cell obtained by culturing a primary cell for one generation or multiple generations and proliferating it. The living cells may be cells that have been cultured for multiple generations and proliferated, and the cells have stopped growing due to biological or physical conditions. Living cells include, but are not limited to, somatic cells (eg, myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocellular cells, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingiva). Pluripotency such as cells, bone membrane cells, skin cells, synovial cells, chondrocytes, blood cells, etc. and stem cells (eg, tissue stem cells such as myoblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, iPS (induced pluripotent stem) cells) Sexual stem cells, mesenchymal stem cells, etc.) and the like. In addition, somatic cells obtained by differentiating from stem cells (for example, tissue stem cells such as myoblasts and heart stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, mesenchymal stem cells, etc.) (Including the above-mentioned somatic cells) and the like.
「生細胞を含む組成物」は、好ましくは生体から得られた、血液、骨髄液、リンパ液などを含む生体液体、心臓、肝臓、腎臓などを含む臓器、および／または角膜、軟骨、皮膚などを含む組織などを含み得る。 The "composition containing living cells" preferably refers to biological fluids such as blood, bone marrow fluid, lymph fluid, organs including heart, liver, kidneys, etc., and / or corneal membrane, cartilage, skin, etc. obtained from living organisms. It may include tissues including.
また、生細胞を含む組成物には、細胞の培養物も含まれ得る。細胞の培養物としては、これに限定するものではないが、例えば細胞ゲル混合物、シート状細胞培養物（単層シートまたはシート積層体）、スフェアなどを含む細胞塊、細胞懸濁液などが挙げられる。
また、生細胞を含む組成物には、細胞の懸濁液も含まれ得る。細胞の懸濁液としては、培養細胞を懸濁した懸濁液のほか、生体から採取した細胞を懸濁した懸濁液なども含まれる。細胞の懸濁液の態様で用い得る細胞としては、これに限定するものではないが、例えば筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等のほか、ｉＰＳ細胞から分化させた幹細胞や体細胞、例えばｉＰＳ細胞から分化させた心筋細胞、ｉＰＳ細胞から分化させた間葉系幹細胞なども包含される。
In addition, the composition containing living cells may also include a culture of cells. Examples of cell cultures include, but are not limited to, cell gel mixtures, sheet-like cell cultures (single-layer sheets or sheet laminates), cell clusters containing spheres, cell suspensions, and the like. Be done.
Compositions containing living cells may also include suspensions of cells. The cell suspension includes a suspension in which cultured cells are suspended, a suspension in which cells collected from a living body are suspended, and the like. The cells that can be used in the form of a cell suspension are not limited to, for example, myoblasts (eg, skeletal myoblasts, etc.), mesenchymal stem cells (eg, bone marrow, adipose tissue, peripheral). Blood, skin, hair roots, muscle tissue, endometrial membrane, placenta, umbilical cord blood, etc.), myocardial cells, fibroblasts, heart stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, chondrocytes, epithelial cells ( For example, oral mucosal epithelial cells, retinal pigment epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, etc.), endothelial cells (eg, vascular endothelial cells, etc.), hepatocytes (eg, hepatic parenchymal cells, etc.), pancreatic cells (eg, pancreatic islet cells, etc.) , Renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, bone membrane cells, skin cells, etc., as well as stem cells and somatic cells differentiated from iPS cells, for example, myocardial cells differentiated from iPS cells, iPS cells differentiated. Membranous stem cells and the like are also included.
本発明において、「移植片」とは、生体に移植されるための細胞組成物であって、細胞同士が連結して構造物を構成しているものを意味する。したがって移植片としては、臓器などの生体組織のほか、シート状細胞培養物、生体組織様の三次元構造体（例えば心筋シートなど）などの移植用の細胞構造物も含まれ得る。 In the present invention, the "graft" means a cell composition for being transplanted into a living body, in which cells are connected to each other to form a structure. Therefore, the graft may include a living tissue such as an organ, a sheet-like cell culture, and a cell structure for transplantation such as a living tissue-like three-dimensional structure (for example, a myocardial sheet).
本発明において「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。 In the present invention, the "sheet-like cell culture" refers to cells connected to each other to form a sheet. The cells may be linked to each other directly (including those via cell elements such as adhesion molecules) and / or via intervening substances. The intervening substance is not particularly limited as long as it is a substance capable of at least physically (mechanically) connecting cells to each other, and examples thereof include an extracellular matrix. The mediator is preferably derived from cells, particularly from the cells that make up the cell culture. The cells are at least physically (mechanically) connected, but may be more functionally, for example, chemically or electrically connected. The sheet-like cell culture may be composed of one cell layer (single layer) or two or more cell layers (laminated (multilayer), for example, two layers, three layers, four layers. Layers, 5 layers, 6 layers, etc.) may be used.
シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。本発明の一態様において、シート状細胞培養物は、実質的にスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本発明におけるシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができるものであってもよい。また、シート状細胞培養物は、好ましくは、細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。 Sheet cell cultures preferably do not contain scaffolds. In one aspect of the invention, the sheet cell culture is substantially free of scaffolds. Scaffolds may be used in the art to attach cells to and / or inside the surface and maintain the physical integrity of sheet cell cultures, such as polyvinylidene difluoride (polyvinylidene difluoride). Although a membrane made of PVDF) or the like is known, the sheet-shaped cell culture in the present invention may be one that can maintain its physical integrity even without such a scaffold. In addition, the sheet-shaped cell culture preferably consists only of cell-derived substances constituting the cell culture, and does not contain any other substances.
シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等から分化させた体細胞であってもよい。特に、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞から分化させた体細胞が好ましい。ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞から分化させた体細胞として、心筋細胞が挙げられる。シート状細胞培養物を構成する細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。 The cells constituting the sheet-like cell culture are not particularly limited as long as they can form the sheet-like cell culture, and include, for example, adherent cells (adherent cells). Adhesive cells include, for example, adherent somatic cells (eg, myocardial cells, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, renal cells, adrenal cells, root membrane cells, gingival cells, bone membrane cells, skin. Cells, synovial cells, chondrocytes, etc.) and stem cells (eg, tissue stem cells such as myoblasts, heart stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, mesenchymal stem cells, etc.) And so on. Somatic cells are somatic cells differentiated from stem cells, for example, tissue stem cells such as myoblasts and heart stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, and mesenchymal stem cells. You may. In particular, somatic cells differentiated from iPS (induced pluripotent stem) cells are preferable. Cardiomyocytes are examples of somatic cells differentiated from iPS (induced pluripotent stem) cells. Non-limiting examples of cells constituting the sheet-like cell culture include, for example, myoblasts (eg, skeletal myoblasts), mesenchymal stem cells (eg, bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair roots, etc.). Muscle tissue, endometrial membrane, placenta, umbilical cord blood, etc.), myocardial cells, fibroblasts, heart stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, chondrocytes, epithelial cells (eg, oral mucosal epithelial cells) , Retinal pigment epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, etc.), endothelial cells (eg, vascular endothelial cells, etc.), hepatocytes (eg, hepatic parenchymal cells, etc.), pancreatic cells (eg, pancreatic islet cells, etc.), renal cells, adrenal cells , Dental membrane cells, gingival cells, epithelial cells, skin cells and the like.
シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。また、シート状細胞培養物を構成する細胞の種類の数は特に限定されず、通常は１種類のみであってもよいが、２種類以上の細胞を用いたものであってもよい。シート状細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、シート状細胞培養物の形成終了時において、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。 The cells that make up the sheet cell culture can be derived from any organism that can be treated with the sheet cell culture. Such organisms include, but are not limited to, for example, humans, non-human primates, dogs, cats, pigs, horses, goats, ovis aries, rodents (eg, mice, rats, hamsters, guinea pigs, etc.), rabbits, etc. Is included. The number of types of cells constituting the sheet-shaped cell culture is not particularly limited, and usually only one type may be used, but two or more types of cells may be used. When there are two or more types of cells forming the sheet-shaped cell culture, the content ratio (purity) of the most abundant cells is 50% or more, preferably 60% or more, more preferably at the end of the formation of the sheet-shaped cell culture. Is 70% or more, more preferably 75% or more.
シート状細胞培養物を形成する細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、特に移植に用いる場合には好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本発明の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本発明の一態様において、細胞は自家細胞である。本発明の別の態様において、細胞は他家細胞である。シート状細胞培養物を形成する細胞は自家細胞または他家細胞を免疫抑制処置なしで使用することができる。 The cells forming the sheet-like cell culture may be heterologous cells or allogeneic cells. Here, "heterologous cell" means a cell derived from an organism of a species different from the recipient when the sheet-shaped cell culture is used for transplantation. For example, when the recipient is a human, cells derived from monkeys or pigs correspond to heterologous cells. In addition, "homogeneous cell" means a cell derived from an organism of the same species as the recipient. For example, when the recipient is a human, the human cell corresponds to an allogeneic cell. Allogeneic cells include autologous cells (also referred to as autologous cells or autologous cells), ie, recipient-derived cells and allogeneic non-autologous cells (also referred to as allogeneic cells). Autologous cells are particularly preferable when used for transplantation because they do not cause rejection even when transplanted. However, it is also possible to utilize heterologous cells and allogeneic non-autologous cells. When using heterologous cells or allogeneic non-autologous cells, immunosuppressive treatment may be required to suppress rejection. In the present specification, cells other than autologous cells, that is, allogeneic non-self-derived cells and allogeneic non-self-derived cells may be collectively referred to as non-autologous cells. In one aspect of the invention, the cell is an autologous cell or an allogeneic cell. In one aspect of the invention, the cell is an autologous cell. In another aspect of the invention, the cell is an allogeneic cell. The cells forming the sheet-like cell culture can use autologous cells or allogeneic cells without immunosuppressive treatment.
シート状細胞培養物は、既知の任意の方法（例えば、特許文献１、特開２０１０−２２６９９１、特開２０１０−０８１８２９、特開２０１１−１１０３６８など参照）で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、細胞を培養基材上に播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップ、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離するステップを含むが、これに限定されない。細胞を培養基材上に播種するステップの前に、細胞を凍結するステップおよび細胞を解凍するステップを行ってもよい。さらに、細胞を解凍するステップの後に細胞を洗浄するステップを行ってもよい。これら各ステップは、シート状細胞培養物の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。本発明の製造方法は、シート状細胞培養物を製造するステップを含んでもよく、その場合、シート状細胞培養物を製造するステップは、サブステップとして上記シート状細胞培養物の製造方法に係るステップの１または２以上を含んでもよい。ある一態様において、細胞を解凍するステップの後、細胞を培養基材上に播種するステップの前に細胞を増殖させるステップを含まない。 The sheet-shaped cell culture can be produced by any known method (see, for example, Patent Document 1, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-226991, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-081829, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-110368, etc.). The method for producing a sheet-shaped cell culture is typically a step of seeding cells on a culture substrate, a step of sheeting the seeded cells, and peeling the formed sheet-shaped cell culture from the culture substrate. Includes, but is not limited to, steps. Prior to the step of seeding the cells on the culture medium, a step of freezing the cells and a step of thawing the cells may be performed. In addition, a step of washing the cells may be performed after the step of thawing the cells. Each of these steps can be performed by any known technique suitable for the production of sheet cell cultures. The production method of the present invention may include a step of producing a sheet-shaped cell culture, in which case the step of producing the sheet-shaped cell culture is a step related to the above-mentioned method for producing a sheet-shaped cell culture as a sub-step. It may contain 1 or 2 or more of. In one embodiment, it does not include the step of growing the cells after the step of thawing the cells and before the step of seeding the cells on the culture medium.
本発明の一態様によれば、シート状細胞培養物を低栄養状態で培養することにより、培養基材（例えば、培養皿、好ましくは温度応答性培養皿）から剥離されたシート状細胞培養物の培養基材に付着していた面（培養基材からから剥離された面であり、培養基材に付着していた面）を保存（保護）することができる。同様に、シート状細胞培養物の付着面の反対側の面（非付着面）を保存（保護）することができる。培養基材から剥離されたシート状細胞培養物は表面積が低減するように収縮するが、シート状細胞培養物を低栄養状態で培養することにより、シート状細胞培養物の収縮した付着面を保存（保護）することができる。同様に、シート状細胞培養物の付着面の収縮した反対側の面（収縮した非付着面）を保存（保護）することができる。シート状細胞培養物の各々の面を保存（保護）することにより、シート化の目的とする細胞の細胞生存率を向上させることができる。シート状細胞培養物を培養する低栄養状態はこの後に述べる等張な状態で提供することができる。このようにして得られたシート状細胞培養物の付着面または非付着面を臓器に接触するようにして生体に移植することができる。好ましくは、付着面を臓器に接触するようにして生体に移植することができる。 According to one aspect of the present invention, a sheet-like cell culture is exfoliated from a culture medium (for example, a culture medium, preferably a temperature-responsive culture dish) by culturing the sheet-like cell culture in a low nutritional state. The surface attached to the culture substrate (the surface peeled from the culture substrate and attached to the culture substrate) can be preserved (protected). Similarly, the surface (non-adhesive surface) opposite to the adherent surface of the sheet-shaped cell culture can be preserved (protected). The sheet-like cell culture exfoliated from the culture substrate shrinks so as to reduce the surface area, but by culturing the sheet-like cell culture in a low nutritional state, the contracted attachment surface of the sheet-like cell culture is preserved. Can be (protected). Similarly, the contracted opposite surface (contracted non-adherent surface) of the adherent surface of the sheet-like cell culture can be preserved (protected). By preserving (protecting) each surface of the sheet-shaped cell culture, the cell viability of the cells to be sheeted can be improved. The undernutrition state in which the sheet-shaped cell culture is cultured can be provided in an isotonic state described later. The sheet-shaped cell culture obtained in this manner can be transplanted into a living body so that the adherent or non-adherent surface is in contact with the organ. Preferably, it can be transplanted into a living body so that the attachment surface is in contact with the organ.
「等張」という語は、二種の液体の浸透圧が同等である状態を意味するが、本発明においては別段の記載のない限り「生理的等張」を意味し、細胞内液や血液などの生理的液体と同等の浸透圧を有することをいう。したがって本発明において、「等張液」は別段の記載のない限り「生理的等張液」と同義であり、細胞内液や血液などの生理的液体と同等の浸透圧を有する液体を意味する。等張液としては、これに限定するものではないが、例えばハンクス平衡塩液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、基礎培地などが挙げられる。 The term "isotonic" means a state in which the osmotic pressures of the two liquids are equivalent, but in the present invention, unless otherwise specified, it means "physiological isotonic", and intracellular fluid or blood. It means having the same osmotic pressure as the physiological liquid such as. Therefore, in the present invention, "isotonic liquid" is synonymous with "physiological isotonic liquid" unless otherwise specified, and means a liquid having an osmotic pressure equivalent to that of physiological liquid such as intracellular fluid and blood. .. Examples of the isotonic solution include, but are not limited to, Hanks equilibrium saline solution, physiological saline solution, phosphate buffered physiological saline solution, Ringer solution, basal medium and the like.
本発明において、「低栄養」または「低栄養状態」とは、その条件下におかれた細胞集団の細胞数が、所定の期間増殖も死滅もせず維持される条件であること、すなわち所定の期間細胞数が実質的に変化しない条件であることを意味する。「細胞数が実質的に変化しない」とは、ある時点における細胞数Ａと、所定の期間経過後の別の時点における細胞数Ｂに実質的な差がないことを意味し、具体的には、例えば細胞数Ａが細胞数Ｂの約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約１００％、約１０５％、約１１０％、約１２０％、約１３０％などである場合が挙げられる。２つの時点は任意に選択されてよいが、通常の培養条件下で培養した場合には細胞の増殖が確認できる程度の間隔が空いていることが好ましい。かかる間隔としては、例えば３日、４日、５日、６日、７日などである。 In the present invention, "undernutrition" or "undernutrition" is a condition in which the number of cells in a cell population under the condition is maintained without proliferation or death for a predetermined period, that is, a predetermined condition. It means that the number of cells during the period does not change substantially. "The number of cells does not change substantially" means that there is no substantial difference between the number of cells A at a certain time point and the number of cells B at another time point after a lapse of a predetermined period. For example, the number of cells A may be about 70%, about 80%, about 90%, about 95%, about 100%, about 105%, about 110%, about 120%, about 130%, etc. of the number B. Can be mentioned. The two time points may be arbitrarily selected, but it is preferable that the two time points are spaced apart from each other so that cell proliferation can be confirmed when cultured under normal culture conditions. Such intervals are, for example, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days and the like.
低栄養状態は、様々な条件により達成でき、当業者であれば対象の細胞に合わせて適宜低栄養状態を作り出すことができる。低栄養状態の要件としては、典型的には例えば、細胞の生命維持に必要なエネルギーは供給可能であること、および／または細胞の分裂に必要な要素に欠けていること、などが挙げられる。具体的には例えば、代謝に必要な糖分などのエネルギーが供給可能である環境、および／または細胞分裂に必要な必須アミノ酸が供給不可能である環境などが挙げられる。低栄養状態は栄養状態を調整することにより、上述の等張液（例えばハンクス平衡塩液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、基礎培地）において実現することができる。 Undernutrition can be achieved under various conditions, and those skilled in the art can appropriately create undernutrition according to the target cells. Requirements for undernutrition typically include, for example, the availability of energy required for cell life support and / or lack of the elements required for cell division. Specific examples thereof include an environment in which energy such as sugar required for metabolism can be supplied, and / or an environment in which essential amino acids required for cell division cannot be supplied. Undernutrition can be achieved with the above-mentioned isotonic solutions (eg, Hanks equilibrium saline, saline, phosphate buffered saline, Ringer's solution, basal medium) by adjusting the nutritional status.
本発明において「低栄養等張液」とは、等張液のうち低栄養のものを意味する。典型的には例えば、所定量の炭水化物を含む等張液および／または必須アミノ酸を供給できない等張液であり、具体的には例えば、所定量の糖を含むがアミノ酸（とくに必須アミノ酸）を含まない等張液、所定量の糖および必須アミノ酸の合成阻害剤を含む等張液などが挙げられる。低栄養等張液に含まれ得る炭水化物は、典型的には糖であり、これに限定するものではないが、例えばグルコース、ショ糖、マルトース、フルクトース、ガラクトースなどが挙げられ、対象の細胞種などに応じて適宜選択することができる。糖の所定含有量は、含まれる糖の種類や細胞の必要維持期間（浸漬時間）により異なり得る。例えばグルコースの場合、細胞の生命維持の必要量という観点から、例えば約１００ｍｇ／Ｌ以上、約５００ｍｇ／Ｌ以上、約１０００ｍｇ／Ｌ以上、約１５００ｍｇ／Ｌ以上、約２０００ｍｇ／Ｌ以上などが挙げられる。また、等張性の維持という観点から、例えば約５００００ｍｇ／Ｌ以下、約４００００ｍｇ／Ｌ以下、約３００００ｍｇ／Ｌ以下、約２５０００ｍｇ／Ｌ以下、約２００００ｍｇ／Ｌ以下、約１５０００ｍｇ／Ｌ以下、約１００００ｍｇ／Ｌ以下、約５０００ｍｇ／Ｌ以下、約４５００ｍｇ／Ｌ以下などが挙げられる。したがってグルコースの含有量の範囲としては、これら上限値および下限値の任意の組み合わせであってよく、これに限定するものではないが、例えば約１００〜５０００００ｍｇ／Ｌ、約５００〜２５０００ｍｇ／Ｌ、約５００〜４５００ｍｇ／Ｌ、約１５００〜４５００ｍｇ／Ｌ、約５００〜１５００ｍｇ／Ｌの範囲などが挙げられる。当業者であれば、含まれる糖の種類に従って所定の含有量を算出可能である。 In the present invention, the "undernutrition isotonic solution" means an isotonic solution having low nutrition. Typically, for example, an isotonic solution containing a predetermined amount of carbohydrates and / or an isotonic solution that cannot supply essential amino acids, specifically, for example, containing a predetermined amount of sugar but containing amino acids (particularly essential amino acids). Examples include non-isotonic solutions, isotonic solutions containing a predetermined amount of sugar and an inhibitor of the synthesis of essential amino acids. Carbohydrates that can be contained in the hyponutrition isotonic solution are typically sugars, but are not limited to, for example, glucose, sucrose, maltose, fructose, galactose, etc. It can be appropriately selected according to the above. The predetermined sugar content may vary depending on the type of sugar contained and the required maintenance period (immersion time) of the cells. For example, in the case of glucose, from the viewpoint of the necessary amount for maintaining the life of cells, for example, about 100 mg / L or more, about 500 mg / L or more, about 1000 mg / L or more, about 1500 mg / L or more, about 2000 mg / L or more, and the like can be mentioned. .. From the viewpoint of maintaining isotonicity, for example, about 50,000 mg / L or less, about 40,000 mg / L or less, about 30,000 mg / L or less, about 25,000 mg / L or less, about 20,000 mg / L or less, about 15,000 mg / L or less, about 10,000 mg. / L or less, about 5000 mg / L or less, about 4500 mg / L or less, and the like. Therefore, the range of glucose content may be any combination of these upper and lower limits, and is not limited to, for example, about 100 to 500,000 mg / L, about 500 to 25,000 mg / L, and about. Examples thereof include a range of 500 to 4500 mg / L, about 1500 to 4500 mg / L, and about 500 to 1500 mg / L. A person skilled in the art can calculate a predetermined content according to the type of sugar contained.
低栄養等張液としては、例えばハンクス平衡塩液、アール平衡塩液、ブドウ糖等張液など、所定量の糖を含み、かつアミノ酸を含まない組成として知られる等張液の他、例えば生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液などの、炭水化物およびアミノ酸を含まない組成として知られる等張液に、所定量の炭水化物を添加したものであってもよい。一態様において、低栄養等張液には、ＵＷ液、Euro-Collins液、ET-Kyoto液、Hypothermosol（登録商標）など、従来臓器の冷蔵保存用溶液として知られた保存液は含まない。 Hypotrophic isotonic solutions include, for example, Hanks equilibrium salt solution, Earl equilibrium salt solution, glucose isotonic solution, and other isotonic solutions known to contain a predetermined amount of sugar and do not contain amino acids, for example, physiological saline. A predetermined amount of carbohydrate may be added to an isotonic solution known as a composition free of carbohydrates and amino acids, such as water, phosphate buffered saline, and Ringer's solution. In one aspect, the hyponutrition isotonic solution does not include preservatives, such as UW, Euro-Collins, ET-Kyoto, Hypothermosol®, which are conventionally known as refrigerated storage solutions for organs.
「ビタミン」という語は、一般的には生物の生存、生育に必要な微量栄養素のうち、炭水化物、タンパク質、脂質以外の有機化合物を意味するが、本発明における「ビタミン」という語には、それらの誘導体およびビタミン様物質も包含される。ビタミンの誘導体は、元の物質の生物学的活性を維持したまま、置換基の修飾などにより、例えば脂溶性と水溶性を変化させるなど、特性を変化させたものを意味する。例えば脂溶性ビタミンであるビタミンＥは、トコフェロールとしても知られているが、これを水溶性に変化させたトロロックスもまた、ビタミンＥの誘導体として、本発明のビタミンＥに包含される。 The term "vitamin" generally means organic compounds other than carbohydrates, proteins, and lipids among the micronutrients necessary for the survival and growth of living organisms, but the term "vitamin" in the present invention refers to them. Derivatives and vitamin-like substances are also included. Vitamin derivatives are those whose properties have been changed by modifying substituents, for example, by changing their lipophilicity and water solubility, while maintaining the biological activity of the original substance. For example, vitamin E, which is a fat-soluble vitamin, is also known as tocopherol, but Trolox, which is a water-soluble version of vitamin E, is also included in vitamin E of the present invention as a derivative of vitamin E.
本発明におけるビタミンとしては、これに限定するものではないが例えば以下のものが挙げられる：
・ビタミンＡ：レチノール、レチナール、レチノイン酸および／またはその誘導体
・ビタミンＢ１：チアミンおよび／またはその誘導体
・ビタミンＢ２：リボフラビンおよび／またはその誘導体
・ビタミンＢ３：ナイアシンおよび／またはその誘導体
・ビタミンＢ５：パントテン酸および／またはその誘導体
・ビタミンＢ６：ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミンおよび／またはその誘導体
・ビタミンＢ７：ビオチンおよび／またはその誘導体
・ビタミンＢ９：葉酸および／またはその誘導体
・ビタミンＢ１２：シアノコバラミンおよび／またはその誘導体
・ビタミンＣ：アスコルビン酸および／またはその誘導体
・ビタミンＤ：エルゴカルシフェロール、コレカルシフェロールおよび／またはその誘導体
・ビタミンＥ：トコフェロールおよび／またはその誘導体
・ビタミンＫ：フィロキノン、メナキノンおよび／またはその誘導体。
The vitamins in the present invention include, but are not limited to, the following, for example:
-Vitamin A: retinol, retinal, retinoic acid and / or its derivatives-Vitamin B1: thiamine and / or its derivatives-Vitamin B2: riboflavin and / or its derivatives-Vitamin B3: niacin and / or its derivatives-Vitamin B5: pantoten Acids and / or derivatives thereof ・ Vitamin B6: pyridoxin, pyridoxal, pyridoxamine and / or derivatives thereof ・ Vitamin B7: biotin and / or derivatives thereof ・ Vitamin B9: folic acid and / or derivatives thereof ・ Vitamin B12: cyanocobalamine and / or derivatives thereof -Vitamin C: ascorbic acid and / or a derivative thereof-Vitamin D: ergocalciferol, cholecalciferol and / or a derivative thereof-Vitamin E: tocopherol and / or a derivative thereof-Vitamin K: phylloquinone, menaquinone and / or a derivative thereof.
本発明において、「保存する」とは、対象物である生細胞または生細胞を含む組成物の所望の機能および効果を損なわない程度に、その対象物に含まれる生細胞の生存を維持し、および／または生細胞が有する機能を維持することを意味する。したがって本発明において「保存液」とは、保存の用に供する液体、すなわち生細胞または生細胞を含む組成物を浸漬した場合に、上記の保存の効果を有する液体を意味する。「保存液」には、保存対象の生細胞または組成物を含む態様も、保存対象を含まない態様も包含される。生細胞からなるシート状細胞培養物をその機能と効果を損なわない程度に含まれている生細胞の生存を維持し、および／または生細胞が有する機能を維持することを含む。生細胞の生存の維持および／または生細胞が有する機能の維持はシート状細胞培養物の場合、付着面および／または非付着面において発揮される。シート状細胞培養物の付着面および／または非付着面の細胞生存率を向上させることができ、細胞生存率の向上によってシート状細胞培養物の保護（保存）の期間を長くすることができる。また、シート状細胞培養物の保護（保存）期間におけるシート状細胞培養物の治療効果の低減を防止することができる。 In the present invention, "preserving" means maintaining the survival of living cells contained in the object to the extent that the desired function and effect of the living cells or the composition containing the living cells are not impaired. And / or means to maintain the function of living cells. Therefore, in the present invention, the "preservative solution" means a liquid to be used for preservation, that is, a living cell or a liquid having the above-mentioned preservation effect when a composition containing living cells is immersed. The "preservation solution" includes both a mode containing a living cell or composition to be stored and a mode not including a storage target. It comprises maintaining the viability of a living cell and / or maintaining the function of the living cell, which comprises a sheet-like cell culture consisting of the living cell to the extent that its function and effect are not impaired. The maintenance of viability and / or the function of living cells is exerted on the adherent and / or non-adherent surfaces of sheet-like cell cultures. The cell viability of the adherent and / or non-adherent surfaces of the sheet-shaped cell culture can be improved, and the period of protection (preservation) of the sheet-shaped cell culture can be extended by improving the cell viability. In addition, it is possible to prevent a decrease in the therapeutic effect of the sheet-shaped cell culture during the protection (preservation) period of the sheet-shaped cell culture.
＜１＞ビタミン含有保存液
本発明は、一側面において、生理的等張液、好ましくは低栄養等張液にビタミンＣおよび／またはＥを含む、移植片を保存するための保存液に関する。
本発明の保存液は、生理的等張液に特定のビタミン、特にビタミンＣおよび／またはビタミンＥを含むものであり、当該液に生細胞または生細胞を含む組成物、例えば移植片を浸漬した状態で保存すると、移植片中の生細胞の残存量を大幅に向上させ、長期に亘り移植片を高品質に保つことが可能となる。
<1> Vitamin-containing Preservative Solution The present invention relates to a preservative solution for storing a graft, which contains vitamins C and / or E in a physiological isotonic solution, preferably a hyponutrition isotonic solution, in one aspect.
The preservation solution of the present invention contains a specific vitamin, particularly vitamin C and / or vitamin E, in a physiological isotonic solution, and a composition containing living cells or living cells, for example, a graft, is immersed in the solution. When stored in a state, the residual amount of living cells in the graft can be significantly improved, and the graft can be maintained in high quality for a long period of time.
本発明の保存液に含まれ得るビタミンとしては、これに限定するものではないが、例えばビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫなどが挙げられる。したがって一態様において、本発明の保存液は、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫからなる群から選択される１または２以上のビタミンを含む。 The vitamins that can be contained in the preservation solution of the present invention are not limited to, for example, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12, and the like. Examples include Vitamin C, Vitamin D, Vitamin E, and Vitamin K. Therefore, in one embodiment, the preservative solution of the present invention comprises vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12, vitamin C, vitamin D, vitamin E and vitamin K. Contains one or more vitamins selected from the group consisting of.
本発明の保存液には、特に含まれるビタミンとして脂溶性ビタミンを含む場合などにおいて、さらに可溶化剤などの追加の成分を含んでよい。本発明の保存液に含まれ得る可溶化剤としては、脂溶性ビタミンを水に溶解し得るものであればいかなるものを用いてもよく、典型的には両親媒性の可溶化剤、例えば界面活性剤、プロピレングリコールなどの両親媒性化合物、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などの両親媒性ポリマーなどが挙げられる。 The preservation solution of the present invention may further contain an additional component such as a solubilizer, especially when a fat-soluble vitamin is contained as the vitamin to be contained. As the solubilizer that can be contained in the preservation solution of the present invention, any solubilizer that can dissolve fat-soluble vitamins in water may be used, and typically an amphipathic solubilizer, for example, a surfactant. Examples thereof include an activator, an amphipathic compound such as propylene glycol, and an amphipathic polymer such as polysorbate 20 and polysorbate 80.
本発明の保存液は、保存液の保存効果を阻害しない限り、さらに任意の追加成分を含んでよい。追加の成分としては、本発明の保存液の効果を増強し得る成分が好ましい。かかる成分としては、例えばエダラボンなどのラジカルスカベンジャーなどが挙げられる。好ましい一態様において、本発明の保存液は、生理的等張液（好ましくは低栄養等張液）、ビタミンおよび任意に可溶化剤以外の成分を含まない。 The preservation solution of the present invention may further contain any additional components as long as the preservation effect of the preservation solution is not impaired. As the additional component, a component capable of enhancing the effect of the preservation solution of the present invention is preferable. Examples of such a component include a radical scavenger such as edaravone. In a preferred embodiment, the preservation solution of the present invention is free of components other than physiological isotonic solutions (preferably undernutrition isotonic solutions), vitamins and optionally solubilizers.
好ましい一態様において、本発明の保存液は、ビタミンとしてビタミンＣおよび／またはＥを含む。以下本明細書において、ビタミンＣおよび／またはビタミンＥを「必須ビタミン」と称する。かかる態様において、必須ビタミン以外のビタミン（以下「任意ビタミン」と称する）は、含んでも含まなくてもよい。したがってある態様において、本発明の保存液は、必須ビタミンのみを含み、例えばビタミンＣのみ、ビタミンＥのみまたはビタミンＣおよびビタミンＥのみを含む。 In a preferred embodiment, the preservation solution of the present invention comprises vitamins C and / or E as vitamins. Hereinafter, in the present specification, vitamin C and / or vitamin E will be referred to as "essential vitamins". In such an embodiment, vitamins other than essential vitamins (hereinafter referred to as “arbitrary vitamins”) may or may not be contained. Thus, in some embodiments, the preservative solution of the invention contains only essential vitamins, eg, vitamin C only, vitamin E only or vitamin C and vitamin E only.
本発明は、ビタミン、特に必須ビタミンを生理的等張液に加えた液を保存液として用いると、生細胞の生存を好適に維持することができるという知見に基づくものである。必須ビタミンを含む生理的等張液が高い保存効果を発揮する理由としては、これらに拘束されるものではないが、必須ビタミンが抗酸化剤またはラジカルスカベンジャーとして機能することにより、細胞を傷害する成分を除去しているため、などが考えられる。また、ビタミンＣおよびビタミンＥの併用により、さらに高い保存効果を発揮することが可能であることも見出された。これはビタミンＣおよびビタミンＥが保存効果を発揮する作用が異なる可能性を示唆する。 The present invention is based on the finding that the survival of living cells can be suitably maintained by using a solution obtained by adding vitamins, particularly essential vitamins, to a physiological isotonic solution as a preservation solution. The reason why physiological isotonic solutions containing essential vitamins exert a high preservative effect is not limited to these, but components that damage cells by the essential vitamins functioning as antioxidants or radical scavengers. It is possible that this is because the is removed. It was also found that the combined use of vitamin C and vitamin E can exert a higher preservation effect. This suggests that vitamin C and vitamin E may have different preservative effects.
任意ビタミンとしては、これに限定するものではないが、例えばビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫなどが挙げられる。ある態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫからなる群から選択される１または２以上のビタミンのみを含む。 Examples of optional vitamins include, but are not limited to, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12, vitamin D and vitamin K. Be done. In some embodiments, the preservative solution of the present invention comprises, as optional vitamins, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12, vitamin D and vitamin K. Contains only one or more vitamins selected from.
例えばある態様においては、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤまたはビタミンＫのいずれか１種のみを含む。別の一態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫから選択されるいずれか２種のみを含む。 For example, in some embodiments, the preservation solution of the present invention comprises, as optional vitamins, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12, vitamin D or vitamin K. Includes only one of them. In another embodiment, the preservative solution of the present invention comprises optional vitamins from Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B5, Vitamin B6, Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K. Includes only any two selected.
別の一態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫから選択されるいずれか３種のみを含む。別の一態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫから選択されるいずれか４種のみを含む。 In another embodiment, the preservative solution of the present invention comprises optional vitamins from Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B5, Vitamin B6, Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K. Includes only any three selected. In another embodiment, the preservative solution of the present invention comprises optional vitamins from Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B5, Vitamin B6, Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K. Includes only any four selected.
別の一態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫから選択されるいずれか５種のみを含む。別の一態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫから選択されるいずれか６種のみを含む。 In another embodiment, the preservative solution of the present invention comprises optional vitamins from Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B5, Vitamin B6, Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K. Includes only any 5 selected. In another embodiment, the preservative solution of the present invention comprises optional vitamins from Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B5, Vitamin B6, Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K. Includes only any 6 selected.
別の一態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫから選択されるいずれか７種のみを含む。別の一態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫから選択されるいずれか８種のみを含む。 In another embodiment, the preservative solution of the present invention comprises optional vitamins from Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B5, Vitamin B6, Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K. Includes only any 7 selected. In another embodiment, the preservative solution of the present invention comprises optional vitamins from Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B5, Vitamin B6, Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K. Includes only any 8 selected.
別の一態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫから選択されるいずれか９種のみを含む。別の一態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫから選択されるいずれか１０種のみを含む。 In another embodiment, the preservative solution of the present invention comprises optional vitamins from Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B5, Vitamin B6, Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K. Includes only any 9 selected. In another embodiment, the preservative solution of the present invention comprises optional vitamins from Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B5, Vitamin B6, Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K. Includes only any 10 selected.
別の一態様において、本発明の保存液は、任意ビタミンとして、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫのみを含む。
したがって一態様において、本発明の保存液は、必須ビタミンとしてビタミンＣのみ、ビタミンＥのみまたはビタミンＣおよびＥのみと、任意ビタミンとしてビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫから選択される１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種または１１種のビタミンとの任意の組み合わせのみを含む。
In another embodiment, the preservative solution of the present invention contains only vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12, vitamin D and vitamin K as optional vitamins. including.
Therefore, in one embodiment, the preservative solution of the present invention contains only vitamin C as essential vitamins, only vitamin E or only vitamins C and E, and vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6 as optional vitamins. , Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K 1 type, 2 types, 3 types, 4 types, 5 types, 6 types, 7 types, 8 types, 9 types, 10 types or 11 Contains only any combination with seed vitamins.
具体的には、例えば本発明の保存液に必須ビタミンとしてビタミンＣのみを含む場合、任意ビタミンの組み合わせとしては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫのみを含む場合のほか、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＤおよびビタミンＫのうち、ビタミンＡのみ、ビタミンＢ１のみ、ビタミンＢ２のみ、ビタミンＢ３のみ、ビタミンＢ５のみ、ビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ１２のみ、ビタミンＤのみ、ビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ３のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Specifically, for example, when the preservation solution of the present invention contains only vitamin C as an essential vitamin, the combination of optional vitamins includes vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, and vitamin B7. In addition to containing only Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K, Vitamin A, Vitamin B1, Vitamin B2, Vitamin B3, Vitamin B5, Vitamin B6, Vitamin B7, Vitamin B9, Vitamin B12, Vitamin D and Vitamin K Of these, Vitamin A only, Vitamin B1 only, Vitamin B2 only, Vitamin B3 only, Vitamin B5 only, Vitamin B6 only, Vitamin B7 only, Vitamin B9 only, Vitamin B12 only, Vitamin D only, Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 only, Vitamin A and Vitamin B2 only, Vitamin A and Vitamin B3 only, Vitamin A and Vitamin B5 only, Vitamin A and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B2 only, Vitamin B1 and Vitamin B3 only, Vitamin B1 and Vitamin B5 only, Vitamin B1 and Vitamin B6 only, Vitamin B1 and Vitamin B7 Only, Vitamin B1 and Vitamin B9 only, Vitamin B1 and Vitamin B12 only, Vitamin B1 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B3 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 only, Vitamin B2 and Vitamin B6 only , Vitamin B2 and Vitamin B7 only, Vitamin B2 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B5 only, Vitamin B3 and Vitamin B6 only, Vitamin B3 and Vitamin B7 only, Vitamin B3 and Vitamin B9 only, Vitamin B3 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B6 only, Vitamin B5 and Vitamin B7 only, Vitamin B5 and B9 only, Vitamin B5 and B12 only, Vitamin B5 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin K only, Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B12 and Vitamin D Only, Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ２およびビタミンＢ３のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ２およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ２およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ２およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ２およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ２およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ２およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ２およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B2 and Vitamin B3 only, Vitamin A and Vitamin B2 and Vitamin B5 only, Vitamin A and Vitamin B2 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B2 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B2 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B2 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B2 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B2 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B5 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B7 and And Vitamin D Only, Vitamin A and Vitamin B7 and Vitamin K Only, Vitamin A and Vitamin B9 and Vitamin B12 Only, Vitamin A and Vitamin B9 and Vitamin D Only, Vitamin A and Vitamin B9 and Vitamin K Only, Vitamin A and Vitamin B12 And Vitamin D Only, Vitamin A and Vitamin B12 and Vitamin K Only, Vitamin A and Vitamin D and Vitamin K Only,
ビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ３のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B3 only, Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B5 only, Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B6 only, Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B7 only, Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B9 only, Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B12 only, Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B5 only, Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B6 only, Vitamin B1, Vitamin B3 and Vitamin B7 only, Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B9 only, Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B12 only, Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B6 only, Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B7 only, Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B9 only, Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B12 only, Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B1 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Only B1 and D and K,
ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B5 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B6 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B7 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B6 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B7 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B7 only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B9 only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin D Only, Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin K Only, Vitamin B5 and Vitamin B12 and Vitamin D Only, Vitamin B5 and Vitamin B12 and Vitamin K Only, Vitamin B5 and Vitamin D and Vitamin K Only
ビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B6 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ７およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B7 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ３のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B3 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B5 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B7 Only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B5 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 And Vitamin B5 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only , Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B7 And Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin D and Vitamin K only,
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ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ３およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B12 Only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B3 And Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B3 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ５およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin D Only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B5 and Vitamin D and Vitamin K only,
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ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin K Only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ７およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ１およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D Only, Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B7 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B1 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B1 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B7 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B12 Only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B3 And Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin D Only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin K Only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B12 and Vitamin D Only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B12 and Vitamin K Only, Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin D and Vitamin K Only,
ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin K Only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D Only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
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ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin K Only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D Only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin K Only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D Only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
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ビタミン７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin 7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K Only, Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ３およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ５およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B5 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B7 only, Vitamin A And Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B3 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B5 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 And Vitamin B5 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin K Only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B9 and Bi Tamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B12 and Vitamin D Only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B2 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ３およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B9 only, Vitamin A And Vitamin B1, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 And Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B9 and B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B3 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ５およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B12 only, Vitamin A And Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 And Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B5 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＡおよびビタミンＢ１およびビタミンＢ６およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin A And Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin A and Vitamin B1 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin A and Vitamin B1 and Only B6 and D and K,
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ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B2 And Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ２およびビタミン７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ２およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B2 and Vitamin 7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B2 And Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B2 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin D only, Vitamin B3 And Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ５およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B3 And Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D Only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin K Only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin D and Vitamin K Only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B5 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B3 And Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ３およびビタミン７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ３およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B3 and Vitamin 7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B3 And Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B3 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２のみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ６およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin K only, Vitamin B5 And Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B6 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ５およびビタミン７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ５およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、 Vitamin B5 and Vitamin 7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B5 And Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B5 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only,
ビタミンＢ６およびビタミン７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＫのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ７およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみ、ビタミンＢ６およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみまたはビタミンＢ７およびビタミンＢ９およびビタミンＢ１２およびビタミンＤおよびビタミンＫのみを含むあるいは含まない場合が挙げられる。 Vitamin B6 and Vitamin 7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D only, Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin K only, Vitamin B6 and Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B6 And Vitamin B7 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only, Vitamin B6 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only or Vitamin B7 and Vitamin B9 and Vitamin B12 and Vitamin D and Vitamin K only There are cases.
本発明の保存液に必須ビタミンとしてビタミンＥのみを含む場合、ならびにビタミンＣおよびビタミンＥを含む場合においても、含まれ得る任意ビタミンの組み合わせとしては、必須ビタミンとしてビタミンＣのみを含む場合について上記した任意ビタミンの組み合わせと同一の組み合わせがそれぞれ挙げられる。 The above is the case where the preservation solution of the present invention contains only vitamin E as an essential vitamin, and even when vitamin C and vitamin E are contained, the combination of optional vitamins that can be contained includes only vitamin C as an essential vitamin. The same combination as the combination of arbitrary vitamins can be mentioned respectively.
上記必須ビタミンおよび任意ビタミンの組み合わせとして、総合ビタミン剤を用いてもよい。本発明において「総合ビタミン剤」とは、日本標準商品分類番号の中分類８７「医薬品及び関連製品」中の分類８７３１７９「混合ビタミン剤（ビタミンＡ・Ｄ混合製剤を除く）」に分類されるものを意味し、医薬品グレードとして市販されるものを含む。総合ビタミン剤は液剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤など様々な剤型で市販されているが、混合の容易さの観点から、好ましくは液剤である。 A multivitamin preparation may be used as a combination of the above essential vitamins and optional vitamins. In the present invention, the "multivitamin preparation" is classified into the classification 873179 "mixed vitamin preparation (excluding vitamin A / D mixed preparation)" in the middle classification 87 "pharmaceutical products and related products" of the Japanese standard product classification number. Means, including those marketed as pharmaceutical grades. Multivitamin preparations are commercially available in various dosage forms such as liquid preparations, granules, tablets, and capsules, but from the viewpoint of ease of mixing, liquid preparations are preferable.
総合ビタミン剤に含まれ得るビタミンとしては、例えばビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫなどが挙げられ、これらのビタミンを任意に組み合わせて配合される。配合されるビタミンの例としては、例えばビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫのみからなる１３種、ビタミンＡ、ビタミンＢ５、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫのみからなる９種、ビタミンＢ１、ビタミンＢ２、ビタミンＢ３、ビタミンＢ５、ビタミンＢ６、ビタミンＢ７、ビタミンＢ９、ビタミンＢ１２およびビタミンＣのみからなる９種、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥおよびビタミンＫのみからなる４種、ビタミンＢ５およびビタミンＣのみからなる２種などが挙げられる。 Examples of vitamins that can be contained in multivitamin preparations include vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12, vitamin C, vitamin D, vitamin E and vitamin K. Etc., and these vitamins are mixed in any combination. Examples of vitamins to be blended include, for example, vitamin A, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6, vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12, vitamin C, vitamin D, vitamin E and vitamin K only. 13 kinds of vitamin A, vitamin B5, vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12, vitamin C, vitamin D, vitamin E and vitamin K only, vitamin B1, vitamin B2, vitamin B3, vitamin B5, vitamin B6 , 9 kinds of vitamin B7, vitamin B9, vitamin B12 and vitamin C only, 4 kinds of vitamin A, vitamin D, vitamin E and vitamin K only, 2 kinds of vitamin B5 and vitamin C only.
本発明に用いられる総合ビタミン剤としては、好ましくは必須ビタミン、すなわちビタミンＣ、ビタミンＥまたはビタミンＣおよびＥを含むものである。かかる総合ビタミン剤の例としては、これに限定するものではないが、例えばビタジェクト（登録商標）注（テルモ）、オーツカＭＶ注（大塚製薬工場）、シナール（登録商標）配合顆粒（塩野義製薬）、シーピー配合顆粒（東和薬品）、ダイメジン・マルチ注（日医工）、デラキシー（登録商標）配合顆粒（丸石製薬）、ネオラミン・マルチＶ（登録商標）注射用（日本化薬）、マルタミン（登録商標）注射用（エイワイファーマ）などが挙げられる。ビタジェクト注（テルモ）に含まれるビタミンは、Ａ液として、レチノールパルミチン酸エステル（ビタミンＡ）、エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ）、トコフェロール酢酸エステル（ビタミンＥ）、フィトナジオン（ビタミンＫ）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、葉酸（ビタミンＢ９）、ビオチン（ビタミンＢ７）、パンテノール（パントテン酸として、ビタミンＢ５）およびアスコルビン酸（ビタミンＣ）であり、Ｂ液として、チアミン塩化物塩酸塩（ビタミンＢ１）、リボフラビンリン酸エステルナトリウム（リボフラビンリン酸として、ビタミンＢ２）、ピリドキシン塩酸塩（ビタミンＢ６）およびニコチン酸アミド（ビタミンＢ３）である。本発明の総合ビタミン剤としてビタジェクト注を用いる態様には、ビタジェクト注Ａ液とＢ液とを組み合わせて用いる態様、およびビタジェクト注のＡ液のみ用いＢ液を用いない態様が含まれる。 The multivitamin preparation used in the present invention preferably contains essential vitamins, namely vitamin C, vitamin E or vitamins C and E. Examples of such multivitamin preparations are not limited to this, but for example, Vitaject (registered trademark) injection (Termo), Otsuka MV injection (Otsuka Pharmaceutical Factory), Cinal (registered trademark) compound granules (Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd.) , CP combination granules (Towa Pharmaceutical Co., Ltd.), Daimedin Multi Injection (Nichi-Iko), Deluxy (registered trademark) combination granules (Maruishi Pharmaceutical), Neoramine Multi V (registered trademark) for injection (Nippon Kayaku), Maltamin (registered trademark) ) For injection (Awai Pharma) and the like. The vitamins contained in Vitaject Injection (Termo) are retinol palmitate (vitamin A), ergocalciferol (vitamin D), tocopherol acetate (vitamin E), phytonadion (vitamin K), and cyanocobalamine (vitamin B12) as solution A. ), Folic acid (vitamin B9), biotin (vitamin B7), pantenol (vitamin B5 as pantothenic acid) and ascorbic acid (vitamin C), and as liquid B, thiamine chloride hydrochloride (vitamin B1), riboflavin phosphorus. Sodium acid ester (vitamin B2 as riboflavin phosphate), pyridoxin hydrochloride (vitamin B6) and nicotinic acid amide (vitamin B3). Examples of using Vitaject Injection as the multivitamin preparation of the present invention include a mode in which Vitaject Injection A solution and B solution are used in combination, and a mode in which only Vitaject Injection A solution is used and B solution is not used.
本発明の保存液に含まれる必須ビタミンの量は、保存する生細胞または生細胞を含む組成物の生存を維持し、悪影響を与えない程度の量であれば特に限定されない。したがって一態様において、本発明の保存液は、生細胞または生細胞を含む組成物、好ましくは移植片、より好ましくはシート状細胞培養物を保存するのに有効な量の必須ビタミンを含む。上述のとおり、本発明の保存液において必須ビタミンはラジカルスカベンジャーとして機能していると推測される。したがって一態様において、本発明の保存液は、ラジカルスカベンジャーとして有効な量の必須ビタミンを含む。 The amount of the essential vitamin contained in the preservation solution of the present invention is not particularly limited as long as it maintains the survival of the living cells to be preserved or the composition containing the living cells and does not adversely affect the preservation solution. Thus, in one aspect, the preservation solution of the invention comprises a viable cell or a composition comprising viable cells, preferably a graft, more preferably an amount of essential vitamin effective for preserving a sheet-like cell culture. As described above, it is presumed that the essential vitamin functions as a radical scavenger in the preservation solution of the present invention. Therefore, in one embodiment, the preservation solution of the present invention contains an amount of essential vitamin effective as a radical scavenger.
必須ビタミンの具体的な配合量としては、例えば必須ビタミンがビタミンＣの場合、下限値として例えば０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭなどであってよく、上限値として２ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭなどであってよい。したがってビタミンＣの含有量の範囲としては、これらの数値の任意の組み合わせであってよく、これに限定するものではないが、例えば０．１ｍＭ〜２ｍＭ、０．２ｍＭ〜２ｍＭ、０．５ｍＭ〜２ｍＭ、１ｍＭ〜２ｍＭ、０．２ｍＭ〜５ｍＭ、１ｍＭ〜５ｍＭ、２ｍＭ〜５ｍＭ、０．２ｍＭ〜１０ｍＭ、２ｍＭ〜１０ｍＭなどが挙げられる。 As a specific amount of the essential vitamin, for example, when the essential vitamin is vitamin C, the lower limit may be, for example, 0.1 mM, 0.2 mM, 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, and the upper limit. The values may be 2 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 30 mM, 50 mM, 100 mM and the like. Therefore, the range of the vitamin C content may be any combination of these values, and is not limited to, for example, 0.1 mM to 2 mM, 0.2 mM to 2 mM, 0.5 mM to 2 mM. , 1 mM to 2 mM, 0.2 mM to 5 mM, 1 mM to 5 mM, 2 mM to 5 mM, 0.2 mM to 10 mM, 2 mM to 10 mM and the like.
必須ビタミンがビタミンＥの場合、配合量の下限値として例えば５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、５００μＭなどであってよく、上限値として１００μＭ、２００μＭ、５００μＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭなどであってよい。したがってビタミンＥの含有量の範囲としては、これらの数値の任意の組み合わせであってよく、これに限定するものではないが、例えば０．５μＭ〜１００μＭ、１０μＭ〜１００μＭ、２０μＭ〜１００μＭ、５０μＭ〜１００μＭ、１００μＭ〜２００μＭ、５μＭ〜２００μＭ、１０μＭ〜２００μＭ、１０μＭ〜５００μＭ、１００μＭ〜５ｍＭなどが挙げられる。 When the essential vitamin is vitamin E, the lower limit of the blending amount may be, for example, 5 μM, 10 μM, 20 μM, 50 μM, 100 μM, 200 μM, 500 μM, and the upper limit is 100 μM, 200 μM, 500 μM, 1 mM, 2 mM, 5 mM, etc. It may be there. Therefore, the range of the content of vitamin E may be any combination of these numerical values, and is not limited to, for example, 0.5 μM to 100 μM, 10 μM to 100 μM, 20 μM to 100 μM, and 50 μM to 100 μM. , 100 μM to 200 μM, 5 μM to 200 μM, 10 μM to 200 μM, 10 μM to 500 μM, 100 μM to 5 mM, and the like.
必須ビタミンがビタミンＣおよびビタミンＥの場合、それぞれのビタミンの配合量は、上記ビタミンＣおよびビタミンＥにおけるそれぞれの下限値および上限値の任意の組み合わせであってよい。上述のとおり、ビタミンＣとビタミンＥは併用することで、より高い保存効果を発揮することができ、その効果は互いの効果を阻害しないと考えられるため、併用する場合であってもそれぞれの含有量は独立して設定することができる。 When the essential vitamins are vitamin C and vitamin E, the blending amount of each vitamin may be any combination of the lower limit value and the upper limit value of the vitamin C and vitamin E, respectively. As described above, by using vitamin C and vitamin E in combination, a higher preservation effect can be exhibited, and it is considered that the effect does not interfere with each other's effects. The amount can be set independently.
本発明の一態様において、生理的等張液に必須ビタミンを添加することにより、本発明の保存液を調製することができる。したがって、生細胞または生細胞を含む組成物、例えばシート状細胞培養物などの移植片、が浸漬された状態の生理的等張液に、必須ビタミンを添加することによって、本発明の保存液に生細胞または生細胞を含む組成物を浸漬した状態とすることができる。添加するビタミンとしては必須ビタミンさえ添加されればよく、必須ビタミンのみを添加してもよいし、必須ビタミンに加えて任意ビタミンを添加してもよい。また、必須ビタミンに加えてさらに他のラジカルスカベンジャー、例えばエダラボンなど、を添加してもよい。
必須ビタミンの添加量は、本発明の保存液について上記した必須ビタミンの含有量に準ずる。すなわち、上記含有量となるように、必須ビタミンを添加する。ビタミンの組み合わせとして総合ビタミン剤を用いる態様においても、用いる総合ビタミン剤に含まれる必須ビタミンの量を基準として総合ビタミン剤の添加量を計算する。
In one aspect of the present invention, the preservative solution of the present invention can be prepared by adding essential vitamins to the physiological isotonic solution. Therefore, by adding an essential vitamin to a physiological isotonic solution in which living cells or a composition containing living cells, for example, a graft such as a sheet-like cell culture, is immersed, the preservation solution of the present invention can be obtained. It can be in a state of being immersed in living cells or a composition containing living cells. As the vitamin to be added, only essential vitamins need to be added, and only essential vitamins may be added, or arbitrary vitamins may be added in addition to essential vitamins. In addition to the essential vitamins, other radical scavengers such as edaravone may be added.
The amount of essential vitamin added is the same as the content of essential vitamin described above for the preservation solution of the present invention. That is, essential vitamins are added so as to have the above content. Even in the embodiment in which a multivitamin preparation is used as a combination of vitamins, the amount of the multivitamin preparation added is calculated based on the amount of essential vitamins contained in the multivitamin preparation used.
本態様の生理的等張液は、ビタミンを含んでいても含んでいなくてもよい。好ましい一態様において、本態様の生理的等張液は、ビタミンを含まない。また、本発明の一態様において、生理的等張液として低栄養等張液を用いる。低栄養等張液とすることにより、生理食塩水やリンゲル液など糖を含まない等張液や、基礎培地などの高栄養な等張液を用いる場合よりも高い保存性を発揮することができる。低栄養等張液の中でも、調製の簡便さなどの観点から、特にハンクス平衡塩液（ＨＢＳＳ）が好ましい。ハンクス平衡塩液は、グルコースを１０００ｍｇ／Ｌの濃度で含む等張液として、その組成が当該技術分野において公知である。ハンクス平衡塩液には、マグネシウムやカルシウムなどの２価のカチオンを含むＨＢＳＳ（＋）およびそれらを含まないＨＢＳＳ（−）があるが、本発明においてより好ましくはＨＢＳＳ（＋）である。 The physiological isotonic solution of this embodiment may or may not contain vitamins. In a preferred embodiment, the physiological isotonic solution of this embodiment is vitamin free. Further, in one aspect of the present invention, a hyponutrition isotonic solution is used as the physiological isotonic solution. By using a hyponutrition isotonic solution, it is possible to exhibit higher storage stability than when a sugar-free isotonic solution such as physiological saline or Ringer's solution or a highly nutritious isotonic solution such as a basal medium is used. Among the hypotonic isotonic solutions, Hanks Equilibrium Salt Solution (HBSS) is particularly preferable from the viewpoint of ease of preparation. The Hanks equilibrium salt solution is an isotonic solution containing glucose at a concentration of 1000 mg / L, and its composition is known in the art. The Hanks equilibrium salt solution includes HBSS (+) containing divalent cations such as magnesium and calcium and HBSS (−) not containing them, but HBSS (+) is more preferable in the present invention.
本発明の保存液は、上述のとおり、医薬品グレードの剤を組み合わせて調製することができるため、移植片を保存液から取り出した後、洗浄することなく移植の用に供することができるという利点を有する。すなわち本発明は、物理的に洗浄が困難な移植片、例えば脆弱なシート状細胞培養物などにおいて特に好適に用いることができる。したがって本発明の一態様において、本発明の保存液は、シート状細胞培養物の保存に用いられる。 As described above, the preservation solution of the present invention can be prepared by combining pharmaceutical grade agents, and thus has an advantage that the graft can be used for transplantation without washing after being taken out from the preservation solution. Have. That is, the present invention can be particularly preferably used for implants that are physically difficult to wash, such as fragile sheet cell cultures. Therefore, in one aspect of the present invention, the preservation solution of the present invention is used for preservation of sheet-shaped cell culture.
シート状細胞培養物は、種々の疾患、特に組織の異常に関連する疾患の処置に有用である。したがって、一態様において、シート状細胞培養物は、組織の異常に関連する疾患の処置に用いるためのものである。処置の対象となる組織としては、限定されずに、例えば、心筋、角膜、網膜、食道、皮膚、関節、軟骨、肝臓、膵臓、歯肉、腎臓、甲状腺、骨格筋、中耳、骨髄などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷）、心筋症（拡張型心筋症など）、心筋虚血など）、角膜疾患（例えば、角膜上皮幹細胞疲弊症、角膜損傷（熱・化学腐食）、角膜潰瘍、角膜混濁、角膜穿孔、角膜瘢痕、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼類天疱瘡など）、網膜疾患（例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、関節疾患（例えば、変形性関節炎など）、軟骨疾患（例えば、軟骨の損傷など）、肝疾患（例えば、慢性肝疾患など）、膵臓疾患（例えば、糖尿病など）、歯科疾患（例えば、歯周病など）、腎臓疾患（例えば、腎不全、腎性貧血、腎性骨異栄養症など）、甲状腺疾患（例えば、甲状腺機能低下症など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）、中耳疾患（例えば、中耳炎など）、骨髄疾患（例えば、白血病、再生不良性貧血、免疫不全疾患など）が挙げられる。 Sheet cell cultures are useful in the treatment of various diseases, especially those associated with tissue abnormalities. Therefore, in one embodiment, the sheet cell culture is for use in the treatment of diseases associated with tissue abnormalities. Tissues to be treated include, but are not limited to, for example, myocardium, cornea, retina, esophagus, skin, articular cartilage, liver, pancreas, gingiva, kidney, thyroid gland, skeletal muscle, middle ear, bone marrow, etc. Be done. In addition, the diseases to be treated are not limited, for example, heart diseases (for example, myocardial injury (myocardial infarction, cardiac trauma), myocardial disease (dilated myocardial disease, etc.), myocardial ischemia, etc.), corneal membrane. Diseases (eg, corneal epithelial stem cell exhaustion, corneal damage (heat / chemical corrosion), corneal ulcer, corneal opacity, corneal perforation, corneal scar, Stevens Johnson syndrome, ocular herbitis, etc.), retinal disease (eg, retina) Pigment degeneration, age-related yellow spot degeneration, etc.), esophageal disease (eg, prevention of esophageal inflammation / stenosis after esophageal surgery (removal of esophageal cancer)), skin disease (eg, skin injury (trauma, burn), etc.) , Joint disease (eg, osteoarthritis), cartilage disease (eg, cartilage damage), liver disease (eg, chronic liver disease), pancreatic disease (eg, diabetes), dental disease (eg, periodontal) Diseases (eg, renal failure, renal anemia, renal osteodystrophy, etc.), thyroid diseases (eg, hypothyroidism), muscle diseases (eg, muscle damage, myitis, etc.), medium Ear diseases (eg, middle ear inflammation, etc.), bone marrow diseases (eg, leukemia, poor regeneration anemia, immunodeficiency diseases, etc.) can be mentioned.
シート状細胞培養物は、処置の対象となる組織に適用し、これを修復、再生するために使用することもできるが、ホルモンなどの生理活性物質の給源として、処置の対象となる組織以外の部位（例えば、皮下組織など）に移植することもできる。
シート状細胞培養物は、細胞培養物を含む医薬組成物の製造に使用することができる。かかる医薬組成物は、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、医薬組成物は、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。
Sheet cell cultures can be applied to the tissue to be treated and used to repair and regenerate it, but as a source of bioactive substances such as hormones, other than the tissue to be treated. It can also be transplanted to a site (eg, subcutaneous tissue).
The sheet-shaped cell culture can be used for producing a pharmaceutical composition containing the cell culture. Such pharmaceutical compositions may include various additional ingredients, such as pharmaceutically acceptable carriers, ingredients that enhance the viability, engraftment and / or function of cell cultures, and other ingredients useful in the treatment of a disease of interest. It may contain an active ingredient or the like. Any known additional ingredient can be used, and those skilled in the art are familiar with these additional ingredients. In addition, the pharmaceutical composition can be used in combination with an ingredient that enhances the viability, engraftment and / or function of the sheet-shaped cell culture, and other active ingredients that are useful for treating a target disease.
本発明の一態様において、シート状細胞培養物は、心疾患の処置のために用いられるシート状細胞培養物である。心疾患の処置のために用いられるシート状細胞培養物としては、これに限定するものではないが、例えば骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物、心筋細胞を含むシート状細胞培養物、血管内皮細胞を含むシート状細胞培養物、間葉系幹細胞を含むシート状細胞培養物などが挙げられる。好ましくは、骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物、心筋細胞を含むシート状細胞培養物および血管内皮細胞を含むシート状細胞培養物である。 In one aspect of the invention, the sheet cell culture is a sheet cell culture used for the treatment of heart disease. The sheet-shaped cell culture used for the treatment of heart disease is not limited to, for example, a sheet-shaped cell culture containing skeletal myoblasts, a sheet-shaped cell culture containing myocardial cells, and blood vessels. Sheet-like cell cultures containing endothelial cells, sheet-like cell cultures containing mesenchymal stem cells, and the like can be mentioned. Preferably, it is a sheet-like cell culture containing skeletal myoblasts, a sheet-like cell culture containing cardiomyocytes, and a sheet-like cell culture containing vascular endothelial cells.
骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物に含まれ得る他の構成細胞としては、例えば線維芽細胞、血管内皮細胞、および／またはそれらに分化し得る細胞（例えば幹細胞、前駆細胞）などが挙げられる。心筋細胞を含むシート状細胞培養物に含まれ得る他の構成細胞としては、例えば血管内皮細胞、平滑筋細胞、および／またはそれらに分化し得る細胞（例えば幹細胞、前駆細胞）などが挙げられる。血管内皮細胞を含むシート状細胞培養物に含まれ得る他の構成細胞としては、例えば骨格筋芽細胞、線維芽細胞、心筋細胞および／またはそれらに分化し得る細胞（例えば幹細胞、前駆細胞）などが挙げられる。間葉系幹細胞を含むシート状細胞培養物に含まれ得る他の構成細胞としては、例えば脂肪細胞、骨格筋芽細胞、線維芽細胞、心筋細胞および／またはそれらに分化し得る細胞（例えば幹細胞、前駆細胞）などが挙げられる。 Other constituent cells that can be included in sheet cell cultures containing skeletal myoblasts include, for example, fibroblasts, vascular endothelial cells, and / or cells that can differentiate into them (eg, stem cells, progenitor cells). Be done. Other constituent cells that can be included in sheet cell cultures containing myocardial cells include, for example, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, and / or cells that can differentiate into them (eg, stem cells, progenitor cells). Other constituent cells that can be included in sheet cell cultures containing vascular endothelial cells include, for example, skeletal myoblasts, fibroblasts, myocardial cells and / or cells capable of differentiating into them (eg, stem cells, progenitor cells). Can be mentioned. Other constituent cells that can be included in sheet cell cultures containing mesenchymal stem cells include, for example, fat cells, skeletal myoblasts, fibroblasts, myocardial cells and / or cells capable of differentiating into them (eg, stem cells, etc.). (Progenitor cells) and the like.
本発明の好ましい一態様において、シート状細胞培養物は、骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含む。さらに好ましい一態様において、シート状細胞培養物は、骨格筋芽細胞および線維芽細胞ならびに骨格筋芽細胞または線維芽細胞から分化した細胞以外の細胞を含まない。本発明の別の好ましい一態様において、シート状細胞培養物は、心筋細胞および血管内皮細胞を含む。さらに好ましい一態様において、シート状細胞培養物は、心筋細胞および血管内皮細胞ならびに血管内皮細胞から分化した細胞以外の細胞を含まない。本発明の別の好ましい一態様において、シート状細胞培養物は、骨格筋芽細胞、線維芽細胞および血管内皮細胞を含む。さらに好ましい一態様において、シート状細胞培養物は、骨格筋芽細胞、線維芽細胞および血管内皮細胞ならびに骨格筋芽細胞、線維芽細胞または血管内皮細胞から分化した細胞以外の細胞を含まない。本発明の別の好ましい一態様において、シート状細胞培養物は、間葉系幹細胞を含む。さらに好ましい一態様において、シート状細胞培養物は、間葉系幹細胞および間葉系幹細胞から分化した細胞以外の細胞を含まない。本発明の別の好ましい一態様において、シート状細胞培養物は、間葉系幹細胞および骨格筋芽細胞を含む。さらに好ましい一態様において、シート状細胞培養物は、間葉系幹細胞および骨格筋芽細胞ならびに間葉系幹細胞または骨格筋芽細胞から分化した細胞以外の細胞を含まない。 In a preferred embodiment of the invention, the sheet cell culture comprises skeletal myoblasts and fibroblasts. In a more preferred embodiment, the sheet cell culture contains no cells other than skeletal myoblasts and fibroblasts and cells differentiated from skeletal myoblasts or fibroblasts. In another preferred embodiment of the invention, the sheet cell culture comprises cardiomyocytes and vascular endothelial cells. In a more preferred embodiment, the sheet cell culture contains no cells other than cardiomyocytes and vascular endothelial cells and cells differentiated from vascular endothelial cells. In another preferred embodiment of the invention, the sheet cell culture comprises skeletal myoblasts, fibroblasts and vascular endothelial cells. In a more preferred embodiment, the sheet cell culture contains no cells other than skeletal myoblasts, fibroblasts and vascular endothelial cells and cells differentiated from skeletal myoblasts, fibroblasts or vascular endothelial cells. In another preferred embodiment of the invention, the sheet cell culture comprises mesenchymal stem cells. In a more preferred embodiment, the sheet cell culture contains no cells other than mesenchymal stem cells and cells differentiated from mesenchymal stem cells. In another preferred embodiment of the invention, the sheet cell culture comprises mesenchymal stem cells and skeletal myoblasts. In a more preferred embodiment, the sheet cell culture contains no cells other than mesenchymal stem cells and skeletal myoblasts and cells differentiated from mesenchymal stem cells or skeletal myoblasts.
移植片を保存する際の温度、すなわち本発明の保存液を使用する際の温度は、移植片に損傷を与えない範囲で、適宜選択することができる。一態様において、保存は凍結させずに行われる。一態様において、保存は室温で行われる。また別の一態様において、保存は冷蔵条件、例えば約２℃〜８℃で行われる。したがって保存時の温度条件の非限定例としては、約２〜４０℃、約２〜３５℃、約２〜３０℃、約２〜２５℃、約２〜２０℃、約２〜１５℃、約２〜１０℃、約２〜８℃、約２〜４℃、約８〜４０℃、約１０〜４０℃、約１５〜４０℃、約２０〜４０℃、約２５〜４０℃、約３０〜４０℃、約３５〜４０℃、約８〜３５℃、約８〜３０℃、約８〜２５℃、約１５〜４０℃などが挙げられる。保存時間が長くなる場合、移植片への損傷を低減できるという観点から、冷蔵条件が好ましい。 The temperature at which the implant is stored, that is, the temperature at which the preservation solution of the present invention is used can be appropriately selected as long as the implant is not damaged. In one embodiment, storage is performed without freezing. In one embodiment, storage is carried out at room temperature. In yet another embodiment, storage is carried out under refrigerated conditions, such as about 2 ° C to 8 ° C. Therefore, non-limiting examples of temperature conditions during storage include about 2 to 40 ° C, about 2 to 35 ° C, about 2 to 30 ° C, about 2 to 25 ° C, about 2 to 20 ° C, about 2 to 15 ° C, and about. 2-10 ° C, about 2-8 ° C, about 2-4 ° C, about 8-40 ° C, about 10-40 ° C, about 15-40 ° C, about 20-40 ° C, about 25-40 ° C, about 30- Examples thereof include 40 ° C., about 35 to 40 ° C., about 8 to 35 ° C., about 8 to 30 ° C., about 8 to 25 ° C., and about 15 to 40 ° C. When the storage time is long, refrigeration conditions are preferable from the viewpoint of reducing damage to the implant.
移植片の保存時間、すなわち本発明の保存液で保存可能な時間は、移植片に損傷を与えない範囲であれば特に限定されないが、保存液に低栄養等張液を用いる態様においては、あまり長時間の浸漬は好ましくない。保存時間の上限としては、これに限定するものではないが、例えば２日（４８時間）以下、３日（７２時間）以下、１００時間以下、５日（１２０時間）以下、１５０時間以下、１週間（１６８時間）以下、２００時間以下などが挙げられる。また、保存時間の下限としては、これに限定するものではないが、例えば２４時間以上、１２時間以上、１０時間以上、８時間以上、６時間以上、４時間以上などが挙げられる。したがってシート状細胞培養物の浸漬時間の範囲としては、これら上限値および下限値の任意の組み合わせであってよく、これに限定するものではないが、例えば４〜２００時間、６〜２００時間、８〜２００時間、１０〜２００時間、１２〜２００時間、２４〜２００時間、４〜１６８時間、６〜１６８時間、８〜１６８時間、１０〜１６８時間、１２〜１６８時間、２４〜１６８時間、４〜１５０時間、６〜１５０時間、８〜１５０時間、１０〜１５０時間、１２〜１５０時間、２４〜１５０時間、４〜１２０時間、６〜１２０時間、８〜１２０時間、１０〜１２０時間、１２〜１２０時間、２４〜１２０時間、４〜１００時間、６〜１００時間、８〜１００時間、１０〜１００時間、１２〜１００時間、２４〜１００時間、４〜７２時間、６〜７２時間、８〜７２時間、１０〜７２時間、１２〜７２時間、２４〜７２時間、４〜４８時間、６〜４８時間、８〜４８時間、１０〜４８時間、１２〜４８時間、２４〜４８時間などが挙げられる。 The storage time of the implant, that is, the time that can be stored in the preservation solution of the present invention is not particularly limited as long as it does not damage the implant, but it is not so much in the embodiment in which the hypotonic isotonic solution is used as the preservation solution. Prolonged immersion is not preferred. The upper limit of the storage time is not limited to this, but for example, 2 days (48 hours) or less, 3 days (72 hours) or less, 100 hours or less, 5 days (120 hours) or less, 150 hours or less, 1 Weekly (168 hours) or less, 200 hours or less, and the like. The lower limit of the storage time is not limited to this, and examples thereof include 24 hours or more, 12 hours or more, 10 hours or more, 8 hours or more, 6 hours or more, and 4 hours or more. Therefore, the range of the immersion time of the sheet-shaped cell culture may be any combination of these upper limit values and lower limit values, and is not limited to, for example, 4 to 200 hours, 6 to 200 hours, 8 ~ 200 hours, 10-200 hours, 12-200 hours, 24-200 hours, 4-168 hours, 6-168 hours, 8-168 hours, 10-168 hours, 12-168 hours, 24-168 hours, 4 ~ 150 hours, 6 ~ 150 hours, 8 ~ 150 hours, 10 ~ 150 hours, 12 ~ 150 hours, 24 ~ 150 hours, 4 ~ 120 hours, 6 ~ 120 hours, 8 ~ 120 hours, 10 ~ 120 hours, 12 ~ 120 hours, 24 ~ 120 hours, 4 ~ 100 hours, 6 ~ 100 hours, 8 ~ 100 hours, 10-100 hours, 12 ~ 100 hours, 24 ~ 100 hours, 4 ~ 72 hours, 6 ~ 72 hours, 8 ~ 72 hours, 10-72 hours, 12-72 hours, 24-72 hours, 4-48 hours, 6-48 hours, 8-48 hours, 10-48 hours, 12-48 hours, 24-48 hours, etc. Can be mentioned.
本発明の保存液は、上述のとおり、保存対象である生細胞または生細胞を含む組成物、好ましくは移植片、より好ましくはシート状細胞培養物を包含していてもよい。すなわち、保存対象を浸漬させた状態の保存液も本発明の保存液に包含される。したがって、一態様において本発明の保存液は、保存液中に生細胞または生細胞を含む組成物、好ましくは移植片、より好ましくはシート状細胞培養物を含む。 As described above, the preservation solution of the present invention may contain a living cell to be preserved or a composition containing living cells, preferably a graft, and more preferably a sheet-like cell culture. That is, the preservation solution in which the preservation object is immersed is also included in the preservation solution of the present invention. Therefore, in one embodiment, the preservation solution of the present invention contains a composition containing living cells or living cells in the preservation solution, preferably a graft, and more preferably a sheet-like cell culture.
＜２＞エダラボン含有保存液
本発明は一側面において、エダラボンを含有する、生細胞または生細胞を含む組成物を保存する保存液に関する。
本発明の保存液は、例えば生理的等張液など、細胞を傷害しない液体にエダラボンを含むものであり、当該液に生細胞または生細胞を含む組成物、例えば移植片を浸漬した状態で保存すると、移植片中の生細胞の残存量を大幅に向上させ、長期に亘り移植片を高品質に保つことが可能となる。
<2> Edaravone-containing preservation solution In one aspect, the present invention relates to a preservation solution containing edaravone and containing living cells or a composition containing living cells.
The preservation solution of the present invention contains edaravon in a liquid that does not damage cells, such as a physiological isotonic solution, and is stored in a state in which living cells or a composition containing living cells, for example, a graft, is immersed in the solution. Then, the residual amount of living cells in the graft can be significantly improved, and the graft can be maintained in high quality for a long period of time.
エダラボンは、以下の一般式：
本発明者らにより、例えば生理的等張液など、細胞を傷害しない液体にエダラボンを添加した液体中に、生細胞を含む組成物、例えばシート状細胞培養物を浸漬して保存すると、エダラボンを添加していないものに浸漬して保存した場合と比較して、該組成物中の生細胞数の減少を大幅に抑えることができることが見出された。 When edaravone is stored by immersing a composition containing live cells, for example, a sheet-like cell culture, in a liquid obtained by adding edaravone to a liquid that does not damage cells, such as a physiological isotonic solution, the present inventors obtain edaravone. It was found that the decrease in the number of viable cells in the composition can be significantly suppressed as compared with the case where the cells are immersed in the non-added material and stored.
本発明の保存液は、エダラボンを含有せしめるという簡潔な構成により、生細胞等の保存において従来公知の保存液に代替可能な程度の効果を生じさせ、しかも数日間という比較的長期の保存を可能とするものである。本発明の保存液がかかる効果を奏することができる理由の一つとしては、エダラボンの有する上記フリーラジカル除去能が関係していると考えられる。本発明の保存液は、エダラボンを有効成分として用いることによって、従来公知の保存液のような複雑な組成を要さず、また、安定性が高く取り回しが容易な、簡単な組成の保存液を実現せしめたものである。 The preservative solution of the present invention has a simple structure containing edaravone, so that it has an effect that can be replaced with a conventionally known preservative solution in the preservation of living cells and the like, and can be stored for a relatively long period of several days. Is to be. It is considered that one of the reasons why the preservation solution of the present invention can exert such an effect is related to the above-mentioned free radical removing ability of edaravone. By using edaravone as an active ingredient, the preservative solution of the present invention does not require a complicated composition like a conventionally known preservative solution, and is highly stable and easy to handle, and has a simple composition. It was realized.
本発明の一態様において、エダラボンとしては、エダラボンを有効成分とする市販の製剤、例えば、エダラボン含有水性製剤「ラジカット（登録商標）注」（田辺三菱製薬）、「エダラボン点滴静注３０ｍｇ「ＮＰ」」（ニプロ）などが用いられる。
本発明の一態様において、エダラボンを生体や細胞に対して悪影響を及ぼさない液体に添加することにより、本発明の保存液を調製することができる。生体や細胞に対して悪影響を及ぼさない液体としては、例えば生理的等張液などが挙げられる。好ましい一態様において、本発明の保存液は、例えばハンクス平衡塩液、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、基礎培地などの生理的等張液に、エダラボンを含有せしめたものである。
In one aspect of the present invention, as edaravone, commercially available preparations containing edaravone as an active ingredient, for example, edaravone-containing aqueous preparation "Radicut (registered trademark) Note" (Mitsubishi Tanabe Pharma), "edaravone intravenous drip infusion 30 mg" NP """(Nipro) etc. are used.
In one aspect of the present invention, the preservation solution of the present invention can be prepared by adding edaravone to a liquid that does not adversely affect living organisms or cells. Examples of the liquid that does not adversely affect the living body and cells include a physiological isotonic liquid. In a preferred embodiment, the preservation solution of the present invention is, for example, a physiological isotonic solution such as Hanks equilibrium saline solution, physiological saline solution, phosphate buffered physiological saline solution, Ringer solution, basal medium, etc., containing edaravone. ..
好ましい一態様において、保存液は、医薬品としての使用に堪え得る等張液、例えばハンクス平衡塩液および生理食塩水などをベースとして、該等張液にエダラボンを添加することによって調製することができる。かかる態様においては、医薬品としての使用に堪え得る等張液に、医薬品グレードのエダラボンを添加することによって保存液を調製することができるため、医薬品グレードの保存液を実現することが可能である。その場合、保存液の成分が保存対象中に残存した場合であっても生体への適用において問題がなく、例えばその保存対象を移植や実験、医薬組成物への加工などに使用する際に、保存液から取り出した後洗浄によって保存液の残存成分を除去する必要がなくなる。 In a preferred embodiment, the preservation solution can be prepared by adding edaravone to the isotonic solution based on an isotonic solution that can be used as a pharmaceutical product, such as Hanks equilibrium salt solution and physiological saline. .. In such an embodiment, a preservative solution can be prepared by adding pharmaceutical grade edaravone to an isotonic solution that can be used as a pharmaceutical product, so that a pharmaceutical grade preservative solution can be realized. In that case, even if the components of the preservation solution remain in the preservation object, there is no problem in application to the living body. For example, when the preservation object is used for transplantation, experiment, processing into a pharmaceutical composition, etc. It is not necessary to remove the residual components of the preservation solution by washing after removing from the preservation solution.
かかる態様の保存液は、生細胞を含む組成物の中でも洗浄が困難なものにも使用することができるという利点がある。例えば、シート状細胞培養物は、臓器などと異なり機械的に脆弱であり、洗浄時の水流などにより容易に破壊される可能性があるため、洗浄により保存液の成分を完全に除去することは困難であるが、本態様の保存液を用いることにより、そのような問題を解決することができる。したがって臨床への適用に用いられる生細胞または組成物の保存に用いる場合に安全性上の利点がある。 The preservation solution of such an embodiment has an advantage that it can be used even in a composition containing living cells, which is difficult to wash. For example, unlike organs, sheet-shaped cell cultures are mechanically fragile and can be easily destroyed by water flow during washing. Therefore, it is not possible to completely remove the components of the preservation solution by washing. Although difficult, such a problem can be solved by using the preservative solution of this embodiment. Therefore, there is a safety advantage when used for the preservation of living cells or compositions used for clinical application.
本発明の一態様において、保存液は、生細胞を実質的に増殖させない程度に低栄養、すなわち保存液のベースとして低栄養等張液を用いる。本態様の保存液のベースとして用い得る低栄養等張液としては、これに限定するものではないが、例えばハンクス平衡塩液、アール平衡塩液、ブドウ糖等張液などが挙げられる。 In one aspect of the present invention, the preservation solution is undernourished to the extent that living cells are not substantially proliferated, that is, a hyponutrition isotonic solution is used as the base of the preservation solution. The hyponutrition isotonic solution that can be used as the base of the preservation solution of this embodiment is not limited to this, and examples thereof include Hanks equilibrium salt solution, Earl equilibrium salt solution, and glucose isotonic solution.
上述のとおり、本発明の保存液には、保存対象の生細胞または生細胞を含む組成物を含む態様が包含される。したがって本発明の一態様において、保存液は、保存対象の生細胞または生細胞を含む組成物を含む。かかる態様において、本発明の保存液は、液中に保存対象である生細胞または生細胞を含む組成物を浸漬した状態の保存液である。すなわち、エダラボンを含有する保存液と、該保存液に保存された状態の生細胞または組成物との組合せもまた、本発明に包含される。 As described above, the preservation solution of the present invention includes an embodiment containing living cells to be preserved or a composition containing living cells. Therefore, in one aspect of the present invention, the preservation solution contains living cells to be preserved or a composition containing living cells. In such an embodiment, the preservation solution of the present invention is a preservation solution in a state in which a living cell to be preserved or a composition containing a living cell is immersed in the solution. That is, a combination of a preservation solution containing edaravone and a living cell or composition in a state of being preserved in the preservation solution is also included in the present invention.
本発明の好ましい一態様において、保存対象の生細胞または生細胞を含む組成物は、生体への移植用である。ここで「移植用」とは、生体内に導入することを目的としたものであることを意味する。移植の方法は限定されない。生体への移植用の生細胞またはそれを含む組成物としては、例えばシート状細胞培養物、細胞塊などの生細胞を含む移植片、生細胞を含む医薬組成物などが挙げられる。一態様において本発明の生細胞を含む組成物は、実質的に生細胞のみからなる組成物である。ここで、「実質的に生細胞のみからなる」とは、生細胞および当該生細胞に由来する細胞または物質（例えば、生細胞から分化した細胞、生細胞から分泌された細胞外マトリクスなど）のみから構成されることを意味する。 In a preferred embodiment of the present invention, the living cells to be preserved or the composition containing the living cells are for transplantation into a living body. Here, "for transplantation" means that it is intended to be introduced into a living body. The method of transplantation is not limited. Examples of the living cells for transplantation into a living body or a composition containing the same include a sheet-like cell culture, a graft containing living cells such as a cell mass, and a pharmaceutical composition containing living cells. In one aspect, the composition comprising living cells of the present invention is a composition consisting substantially only of living cells. Here, "substantially composed of only living cells" means only living cells and cells or substances derived from the living cells (for example, cells differentiated from living cells, extracellular matrix secreted from living cells, etc.). It means that it is composed of.
本発明の好ましい一態様において、保存対象の生細胞または生細胞を含む組成物は、骨格筋芽細胞を含む。かかる保存対象は、例えば、骨格筋芽細胞を含む細胞集団や、骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物などの組成物であり得る。かかる態様において、生細胞または生細胞を含む組成物は、実質的に骨格筋芽細胞のみを含むものであっても、骨格筋芽細胞とそれ以外の細胞とを含むものであってもよい。骨格筋芽細胞とともに生細胞の細胞集団または組成物に含まれ得る他の構成細胞は、＜１＞において、骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物について上記したとおりである。別の一態様において、保存対象の生細胞または生細胞を含む組成物は、心筋細胞、血管内皮細胞、および間葉系幹細胞から選択される１種または２種以上を含む。かかる保存対象としては、例えば、心筋細胞、血管内皮細胞、および間葉系幹細胞から選択される１種または２種以上を含む細胞集団や、心筋細胞、血管内皮細胞および間葉系幹細胞から選択される１種または２種以上を含むシート状細胞培養物などの組成物であり得る。かかる態様において、生細胞または生細胞を含む組成物は、実質的に心筋細胞および／または血管内皮細胞のみを含むものであっても、実質的に間葉系幹細胞のみを含むものであっても、心筋細胞、血管内皮細胞、および間葉系幹細胞から選択される１種または２種以上とそれ以外の細胞とを含むものであってもよい。心筋細胞、血管内皮細胞および／または間葉系幹細胞とともに生細胞の細胞集団または組成物に含まれ得る他の構成細胞は、＜１＞において、心筋細胞、血管内皮細胞または間葉系幹細胞を含むシート状細胞培養物について上記したとおりである。 In a preferred embodiment of the present invention, the living cells to be preserved or the composition containing the living cells include skeletal myoblasts. Such a preservation target may be, for example, a composition such as a cell population containing skeletal myoblasts or a sheet-like cell culture containing skeletal myoblasts. In such an embodiment, the living cell or the composition containing the living cell may contain substantially only skeletal myoblasts, or may contain skeletal myoblasts and other cells. Other constituent cells that can be included in the cell population or composition of living cells together with skeletal myoblasts are as described above for sheet cell cultures containing skeletal myoblasts in <1>. In another embodiment, the viable cell or the composition comprising the viable cell to be preserved comprises one or more selected from cardiomyocytes, vascular endothelial cells, and mesenchymal stem cells. Such a preservation target is selected from, for example, a cell population containing one or more selected from cardiomyocytes, vascular endothelial cells, and mesenchymal stem cells, and cardiomyocytes, vascular endothelial cells, and mesenchymal stem cells. It can be a composition such as a sheet-shaped cell culture containing one or more of them. In such an embodiment, the viable cell or the composition containing the viable cell may contain substantially only myocardial cells and / or vascular endothelial cells, or substantially only mesenchymal stem cells. , Myocardial cells, vascular endothelial cells, and one or more selected from mesenchymal stem cells and other cells. Other constituent cells that may be included in the cell population or composition of living cells along with myocardial cells, vascular endothelial cells and / or mesenchymal stem cells include myocardial cells, vascular endothelial cells or mesenchymal stem cells in <1>. The sheet-like cell culture is as described above.
一態様において、保存対象の生細胞または生細胞を含む組成物は、シート状細胞培養物などの構造物を形成したものであってもよい。かかる構造物は、生細胞により構成された構造物か、または、生細胞を少なくとも一部に含有する構造物である。生細胞により構成された構造物は、生細胞が互いに連結して、例えば、シート状、層状、その他生体内の組織に近い三次元形状などの特定の形状および／または機械的構造を有するものである。生細胞により構成された構造物の例としては、シート状細胞培養物が挙げられる。生細胞を少なくとも一部に含有する構造物の例としては、スキャフォールド（支持体）を有する細胞シート、培養基材に定着した状態の細胞などが挙げられる。好ましい一態様において、保存対象の生細胞または生細胞を含む組成物は、シート状細胞培養物である。かかる態様におけるシート状細胞培養物は、＜１＞において上記したとおりである。 In one aspect, the viable cells to be preserved or the composition containing the viable cells may form a structure such as a sheet-like cell culture. Such a structure is a structure composed of living cells or a structure containing at least a part of living cells. A structure composed of living cells is one in which living cells are connected to each other and have a specific shape and / or mechanical structure such as a sheet shape, a layered shape, or a three-dimensional shape close to a tissue in a living body. is there. An example of a structure composed of living cells is a sheet-like cell culture. Examples of the structure containing at least a part of living cells include a cell sheet having a scaffold (support), cells in a state of being fixed on a culture medium, and the like. In a preferred embodiment, the viable cell to be preserved or the composition comprising the viable cell is a sheet-like cell culture. The sheet-shaped cell culture in such an embodiment is as described above in <1>.
本発明の一態様において、保存対象のシート状細胞培養物は、下記＜３＞において詳述するとおり、培養基材上で形成された後、剥離されずに、本発明の保存液または本発明の保存液のベースとなる生理的等張液、例えば生理食塩水またはハンクス平衡塩液などに浸漬される。この場合、剥離時に用いる媒体として本発明の保存液または本発明の保存液のベースとなる生理的等張液を用いることができる。かかる態様の具体例としては、例えば培養基材上で形成されたシート状細胞培養物に低栄養等張液を加えて浸漬させてそのまま冷却されるか、または冷却した低栄養等張液を加え、剥離した後エダラボンを添加し、そのまま浸漬された後、回収されて使用に供される。
別の一態様において、シート状細胞培養物は、培養基材上で形成された後、培養基材から剥離され、剥離後に本発明の保存液に浸漬される。シート状細胞培養物は、培養基材から剥離されるとある程度収縮することが知られている。かかる収縮の程度は、シート状細胞培養物を構成する細胞種や含有比率、形成条件などにより異なる。例えば骨格筋芽細胞を含む細胞集団を、シート形成培養により形成した場合、その収縮割合としては、例えばシートの径が約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％程度となる。本発明の一態様において、剥離された（すなわち収縮した）シート状細胞培養物は、その面積が約１ｃｍ２以上、約３ｃｍ２以上、好ましくは約６ｃｍ２以上、さらに好ましくは約１０ｃｍ２以上であり得る。一態様において、本発明の保存液に含まれるシート状細胞培養物の面積は、約６ｃｍ２以上である。
In one aspect of the present invention, the sheet-shaped cell culture to be preserved is formed on the culture substrate and then not peeled off as described in detail in <3> below, and is the preservation solution of the present invention or the present invention. Immerse in a physiological isotonic solution that is the base of the preservation solution, for example, physiological saline or Hanks equilibrium salt solution. In this case, the preservation solution of the present invention or the physiological isotonic solution as the base of the preservation solution of the present invention can be used as the medium used for peeling. As a specific example of such an embodiment, for example, a hyponutrition isotonic solution is added to a sheet-like cell culture formed on a culture substrate and immersed in the culture medium to be cooled as it is, or a cooled hyponutrition isotonic solution is added. After peeling, edarabon is added, and after being immersed as it is, it is recovered and used.
In another embodiment, the sheet-shaped cell culture is formed on the culture substrate, then exfoliated from the culture substrate, and after the exfoliation, is immersed in the preservation solution of the present invention. It is known that the sheet-shaped cell culture shrinks to some extent when it is peeled off from the culture substrate. The degree of such contraction varies depending on the cell type constituting the sheet-shaped cell culture, the content ratio, the formation conditions, and the like. For example, when a cell population containing skeletal myoblasts is formed by sheet formation culture, the contraction rate thereof is, for example, sheet diameters of about 30%, about 40%, about 50%, about 60%, about 70%. It will be about 80%. In one embodiment of the present invention, the stripped (ie, contracted) sheet-like cell culture has an area of about 1 cm 2 or more, about 3 cm 2 or more, preferably about 6 cm 2 or more, and more preferably about 10 cm 2 or more. possible. In one aspect, the area of the sheet-like cell culture contained in the preservation solution of the present invention is about 6 cm 2 or more.
本側面の保存液についての他の態様、例えば本側面の保存液を用いる際の保存条件や、他の含有成分など、上記＜２＞において明示されていない構成については、上記＜１＞に準ずる。したがって、例えば本側面の保存液は、さらにビタミン、好ましくは必須ビタミンを含んでよい。 Other aspects of the preservative solution of this side surface, for example, storage conditions when using the preservative solution of this side surface, other contained components, and other configurations not specified in <2> above are based on the above <1>. .. Thus, for example, the preservative solution of this aspect may further contain vitamins, preferably essential vitamins.
＜３＞生細胞または生細胞を含む組成物の保存方法
本発明は一側面において、上記＜１＞または＜２＞の保存液を用いて、生細胞または生細胞を含む組成物を保存する方法に関する。
本発明の保存方法は、本発明の保存液に保存対象である生細胞または生細胞を含む組成物、好ましくは移植片、より好ましくはシート状細胞培養物、を浸漬する工程を含む。
本発明の保存方法において用いられる保存液については、上記＜１＞または＜２＞において記載したとおりである。また、浸漬する工程における浸漬条件、すなわち浸漬する際の温度および浸漬時間についても、上述の保存温度および保存時間についての記載のとおりである。
<3> Method for Preserving Live Cells or Composition Containing Live Cells In one aspect, the present invention is a method for preserving live cells or compositions containing live cells using the preservation solution of <1> or <2>. Regarding.
The preservation method of the present invention includes a step of immersing a living cell or a composition containing living cells to be preserved, preferably a graft, more preferably a sheet-like cell culture, in the preservation solution of the present invention.
The preservation solution used in the preservation method of the present invention is as described in <1> or <2> above. Further, the dipping conditions in the dipping step, that is, the temperature and the dipping time at the time of dipping are also as described above for the storage temperature and the storage time.
生細胞または生細胞を含む組成物、好ましくは移植片、より好ましくはシート状細胞培養物の本発明の保存液への浸漬において、上述の浸漬における条件の任意の組み合わせであってよい。生細胞または生細胞を含む組成物、好ましくは移植片、より好ましくはシート状細胞培養物を本発明の保存液に浸漬する際の条件は、浸漬する生細胞または生細胞を含む組成物および保存液の種類により変化し得、当業者であれば至適な条件を適宜選択することができる。例えば骨格筋芽細胞を含むシート状細胞培養物を低栄養等張液ベースとした本発明の保存液に浸漬する場合の非限定例としては、約２〜８℃で、ハンクス平衡塩液ベースの保存液に約４〜２００時間程度、約２〜８℃で、ハンクス平衡塩液ベースの保存液に約８〜１５０時間程度、約２〜８℃で、ハンクス平衡塩液ベースの保存液に約１２〜１２０時間程度、約２〜８℃で、ハンクス平衡塩液ベースの保存液に約２４〜７２時間程度、約１５〜３０℃で、ハンクス平衡塩液ベースの保存液に約４〜２００時間程度、約１５〜３０℃で、ハンクス平衡塩液ベースの保存液に約８〜１５０時間程度、約１５〜３０℃で、ハンクス平衡塩液ベースの保存液に約１２〜１２０時間程度、約１５〜３０℃で、ハンクス平衡塩液ベースの保存液に約２４〜７２時間程度、約２〜８℃で、グルコース濃度４５００ｍｇ／Ｌの低栄養等張液ベースの保存液に約４〜２００時間程度、約２〜８℃で、グルコース濃度４５００ｍｇ／Ｌの低栄養等張液ベースの保存液に約８〜１５０時間程度、約２〜８℃で、グルコース濃度４５００ｍｇ／Ｌの低栄養等張液ベースの保存液に約１２〜１２０時間程度、約２〜８℃で、グルコース濃度４５００ｍｇ／Ｌの低栄養等張液ベースの保存液に約２４〜７２時間程度、約１５〜３０℃で、グルコース濃度４５００ｍｇ／Ｌの低栄養等張液ベースの保存液に約４〜２００時間程度、約１５〜３０℃で、グルコース濃度４５００ｍｇ／Ｌの低栄養等張液ベースの保存液に約８〜１５０時間程度、約１５〜３０℃で、グルコース濃度４５００ｍｇ／Ｌの低栄養等張液ベースの保存液に約１２〜１２０時間程度、約１５〜３０℃で、グルコース濃度４５００ｍｇ／Ｌの低栄養等張液ベースの保存液に約２４〜７２時間程度などが挙げられる。 In the immersion of living cells or a composition containing living cells, preferably a graft, more preferably a sheet-like cell culture in the preservation solution of the present invention, any combination of the above-mentioned immersion conditions may be used. The conditions for immersing a living cell or a composition containing living cells, preferably a graft, more preferably a sheet-like cell culture in the preservation solution of the present invention, are a composition containing living cells or living cells to be immersed and storage. It can vary depending on the type of liquid, and a person skilled in the art can appropriately select the optimum conditions. For example, when a sheet-shaped cell culture containing skeletal myoblasts is immersed in the preservation solution of the present invention based on a hypotonic isotonic solution, a non-limiting example is a Hanks equilibrium salt solution-based solution at about 2 to 8 ° C. About 4 to 200 hours in a preservation solution, about 2-8 ° C, about 8 to 150 hours in a Hanks equilibrium salt solution-based preservation solution, about 2-8 ° C, about a Hanks equilibrium salt solution-based preservation solution. About 12 to 120 hours, about 2 to 8 ° C., about 24 to 72 hours in a Hanks equilibrium salt solution-based storage solution, about 15 to 30 ° C., about 4 to 200 hours in a Hanks equilibrium salt solution-based storage solution. About 8 to 150 hours in a Hanks equilibrium salt solution-based storage solution at about 15 to 30 ° C., about 12 to 120 hours in a Hanks equilibrium salt solution-based storage solution at about 15 to 30 ° C., about 15 About 24 to 72 hours in a Hanks equilibrium salt solution-based storage solution at ~ 30 ° C., and about 4 to 200 hours in a low-nutrient isotonic solution-based storage solution with a glucose concentration of 4500 mg / L at about 2-8 ° C. , About 8 to 150 hours in a hypotrophic isotonic solution-based storage solution with a glucose concentration of 4500 mg / L at about 2-8 ° C. Glucose concentration in a hypotrophic isotonic solution-based storage solution with a glucose concentration of 4500 mg / L for about 12 to 120 hours at about 2 to 8 ° C. for about 24 to 72 hours and at about 15 to 30 ° C. About 4 to 200 hours in a 4500 mg / L hyponutrient isotonic solution-based storage solution, about 8 to 150 hours in a low glucose isotonic solution-based preservation solution with a glucose concentration of 4500 mg / L at about 15 to 30 ° C. , In a hypotrophic isotonic solution-based storage solution with a glucose concentration of 4500 mg / L at about 15 to 30 ° C. for about 12 to 120 hours, and at a glucose concentration of 4500 mg / L at about 15 to 30 ° C. The storage solution of the above may be about 24 to 72 hours.
本発明の保存方法における浸漬する工程には、保存対象である生細胞または生細胞を含む組成物、好ましくは移植片、より好ましくはシート状細胞培養物に本発明の保存液を加えることにより浸漬する態様、本発明の保存液に保存対象である生細胞または生細胞を含む組成物、好ましくは移植片、より好ましくはシート状細胞培養物を入れることにより浸漬する態様の他、保存対象である生細胞または生細胞を含む組成物、好ましくは移植片、より好ましくはシート状細胞培養物、を浸漬させた生理的等張液、好ましくは低栄養等張液、にエダラボンおよび／またはビタミンを添加して本発明の保存液を調製する態様も含まれる。これらにはエダラボンおよびビタミンを含む態様、エダラボンのみ含みビタミンを含まない態様、およびエダラボンを含まずビタミンのみ含む態様がある。 In the dipping step in the preservative method of the present invention, the preservative solution of the present invention is added to a viable cell or a composition containing viable cells, preferably a transplant, more preferably a sheet-shaped cell culture to be preserved. In addition to the mode of immersing the cells in the preservation solution of the present invention by putting the living cells or the composition containing the living cells, preferably a transplant, more preferably a sheet-like cell culture, the preservation target. Edarabon and / or vitamins are added to a physiological isotonic solution, preferably a hypotrophic isotonic solution, in which living cells or a composition containing living cells, preferably a transplant, more preferably a sheet-like cell culture, is immersed. The embodiment of preparing the preservation solution of the present invention is also included. These include an embodiment containing edaravone and vitamins, an embodiment containing only edaravone and no vitamins, and an embodiment containing only edaravone and containing only vitamins.
保存対象がシート状細胞培養物である一態様において、シート状細胞培養物は、培養基材上で形成された後、剥離されずに本発明の保存液または本発明の保存液のベースとなる生理的等張液に浸漬され、その後剥離される。この場合、剥離時に用いる媒体として本発明の保存液または本発明の保存液のベースとなる生理的等張液を用いてもよい。本発明の保存液を剥離時に用いる媒体として用いる場合は、本発明の保存液を直接加えてシート状細胞培養物を浸漬してもよいし、低栄養等張液を加えて浸漬させた後、剥離前にエダラボンおよび／またはビタミンを添加することにより本発明の保存液を調製し、その後剥離してもよい。かかる態様の具体例としては、例えば培養基材上で形成されたシート状細胞培養物に低栄養等張液を加えて浸漬させてそのまま冷却されるか、または冷却した低栄養等張液を加え、剥離した後エダラボンおよび／またはビタミンを添加し、そのまま浸漬された後、回収されて使用に供される。 In one embodiment in which the storage target is a sheet-shaped cell culture, the sheet-shaped cell culture is formed on the culture substrate and then becomes the base of the preservation solution of the present invention or the preservation solution of the present invention without being exfoliated. Immerse in physiological isotonic solution and then exfoliate. In this case, the preservation solution of the present invention or the physiological isotonic solution as the base of the preservation solution of the present invention may be used as the medium used for peeling. When the preservation solution of the present invention is used as a medium to be used for exfoliation, the preservation solution of the present invention may be directly added to immerse the sheet-shaped cell culture, or a hyponutrition isotonic solution may be added and immersed. The preservation solution of the present invention may be prepared by adding edaravone and / or vitamins before exfoliation, and then exfoliated. As a specific example of such an embodiment, for example, a hyponutrition isotonic solution is added to a sheet-like cell culture formed on a culture substrate and immersed in the culture medium to be cooled as it is, or a cooled hyponutrition isotonic solution is added. After peeling, edaravon and / or vitamins are added, soaked as it is, and then recovered and used.
別の一態様において、シート状細胞培養物は、培養基材上で形成された後、培養基材から剥離され、剥離後に本発明の保存液に浸漬される。シート状細胞培養物は、培養基材から剥離されるとある程度収縮することが知られている。かかる収縮の程度は、シート状細胞培養物を構成する細胞種や含有比率、形成条件などにより異なる。例えば骨格筋芽細胞を含む細胞集団を、本願発明のシート形成培養を用いて形成した場合、その収縮割合としては、例えばシートの径が約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％程度となる。本発明の一態様において、剥離された（すなわち収縮した）シート状細胞培養物は、その面積が約１ｃｍ２以上、約３ｃｍ２以上、好ましくは約６ｃｍ２以上、さらに好ましくは約１０ｃｍ２以上であり得る。 In another embodiment, the sheet-shaped cell culture is formed on the culture substrate, then exfoliated from the culture substrate, and after the exfoliation, is immersed in the preservation solution of the present invention. It is known that the sheet-shaped cell culture shrinks to some extent when it is peeled off from the culture substrate. The degree of such contraction varies depending on the cell type constituting the sheet-shaped cell culture, the content ratio, the formation conditions, and the like. For example, when a cell population containing skeletal myoblasts is formed using the sheet-forming culture of the present invention, the contraction ratio thereof is, for example, sheet diameters of about 30%, about 40%, about 50%, and about 60%. , About 70% and about 80%. In one embodiment of the present invention, the stripped (ie, contracted) sheet-like cell culture has an area of about 1 cm 2 or more, about 3 cm 2 or more, preferably about 6 cm 2 or more, and more preferably about 10 cm 2 or more. possible.
＜４＞シート状細胞培養物の製造方法
本発明の一側面において、シート状細胞培養物を製造する方法が提供される。
本発明のシート状細胞培養物の製造方法は、以下の工程（ａ）〜（ｄ）を含む：
（ａ）細胞を、実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度で培養基材に播種する工程、
（ｂ）播種した細胞をシート化培養してシート状細胞培養物を形成する工程、
（ｃ）形成したシート状細胞培養物を剥離する工程、および
（ｄ）剥離したシート状細胞培養物を、本発明の保存液に浸漬する工程。
<4> Method for Producing Sheet Cell Culture A method for producing a sheet cell culture is provided in one aspect of the present invention.
The method for producing a sheet-shaped cell culture of the present invention includes the following steps (a) to (d):
(A) A step of seeding cells on a culture substrate at a density capable of forming a sheet-like cell culture without substantially proliferating.
(B) A step of forming a sheet-like cell culture by culturing the seeded cells in a sheet.
(C) A step of exfoliating the formed sheet-like cell culture, and (d) a step of immersing the exfoliated sheet-like cell culture in the preservation solution of the present invention.
工程（ａ）において、播種される細胞には、上記シート状細胞培養物を構成する細胞から選択される１種または２種以上の細胞が含まれる。２種以上の細胞が含まれる場合、シート状細胞培養物を形成する２種類以上の細胞のうち、最も多い細胞の含有比率（純度）は、シート状細胞培養物の形成終了時において、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。一態様において、本発明の製造方法は、細胞を播種する前に、細胞を凍結する工程および該凍結細胞を解凍する工程を含む。前記態様において、解凍して得られた細胞は、その後細胞を増殖させたうえで播種してもよいが、好ましい一態様において、凍結細胞を解凍する工程と工程（ａ）との間に細胞を増殖させる工程を含まない。かかる態様で製造されたシート状細胞培養物は、凍結細胞を解凍する工程と工程（ａ）との間に細胞を増殖させる工程を含む態様で製造されたシート状細胞培養物より、例えば、サイトカイン産生能、生着能、血管誘導能および組織再生能などの活性が高い。ここで、活性が高いとは、比較対象のシート状細胞培養物の活性を基準として、限定されずに、例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上または１００％以上、活性が高いことを意味する。 In the step (a), the seeded cells include one or more cells selected from the cells constituting the sheet-shaped cell culture. When two or more types of cells are contained, the content ratio (purity) of the most abundant cells among the two or more types of cells forming the sheet-shaped cell culture is 50% at the end of the formation of the sheet-shaped cell culture. As mentioned above, it is preferably 60% or more, more preferably 70% or more, and further preferably 75% or more. In one aspect, the production method of the present invention comprises a step of freezing the cells and a step of thawing the frozen cells before seeding the cells. In the above embodiment, the cells obtained by thawing may be subsequently seeded after the cells are proliferated, but in a preferred embodiment, the cells are mixed between the steps of thawing the frozen cells and the step (a). Does not include the step of growing. The sheet-shaped cell culture produced in such an embodiment is, for example, a cytokine, as compared with the sheet-shaped cell culture produced in a mode including a step of proliferating cells between the step of thawing frozen cells and the step (a). High activity such as production ability, engraftment ability, blood vessel inducing ability and tissue regeneration ability. Here, the term “high activity” is not limited to the activity of the sheet-shaped cell culture to be compared, and is not limited to, for example, 5% or more, 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more. It means that the activity is high at 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more or 100% or more.
本発明の製造方法により製造されるシート状細胞培養物は、好ましくは心疾患の処置のために用いられるシート状細胞培養物である。したがって、本発明の好ましい一態様において、播種される細胞集団は、骨格筋芽細胞を含む。本発明の別の好ましい一態様において、播種される細胞集団は、心筋細胞を含む。本発明の別の好ましい一態様において、播種される細胞集団は、血管内皮細胞を含む。本発明の別の好ましい一態様において、播種される細胞集団は、骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含む。さらに好ましい一態様において、播種される細胞集団は、実質的に骨格筋芽細胞および線維芽細胞のみからなる。本発明の別の好ましい一態様において、播種される細胞集団は、心筋細胞および血管内皮細胞を含む。さらに好ましい一態様において、播種される細胞集団は、実質的に心筋細胞および血管内皮細胞のみからなる。本発明の別の好ましい一態様において、播種される細胞集団は、骨格筋芽細胞、線維芽細胞および血管内皮細胞を含む。さらに好ましい一態様において、播種される細胞集団は、実質的に骨格筋芽細胞、線維芽細胞および血管内皮細胞のみからなる。本発明の別の好ましい一態様において、播種される細胞集団は間葉系幹細胞を含む。さらに好ましい一態様において、播種される細胞集団は、実質的に間葉系幹細胞のみからなる。 The sheet-shaped cell culture produced by the production method of the present invention is preferably a sheet-shaped cell culture used for the treatment of heart disease. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the cell population seeded comprises skeletal myoblasts. In another preferred embodiment of the invention, the cell population seeded comprises cardiomyocytes. In another preferred embodiment of the invention, the cell population seeded comprises vascular endothelial cells. In another preferred embodiment of the invention, the cell population seeded comprises skeletal myoblasts and fibroblasts. In a more preferred embodiment, the cell population seeded consists substantially only of skeletal myoblasts and fibroblasts. In another preferred embodiment of the invention, the cell population seeded comprises cardiomyocytes and vascular endothelial cells. In a more preferred embodiment, the cell population seeded consists substantially only of cardiomyocytes and vascular endothelial cells. In another preferred embodiment of the invention, the cell population seeded comprises skeletal myoblasts, fibroblasts and vascular endothelial cells. In a more preferred embodiment, the cell population seeded consists substantially only of skeletal myoblasts, fibroblasts and vascular endothelial cells. In another preferred embodiment of the invention, the cell population seeded comprises mesenchymal stem cells. In a more preferred embodiment, the cell population seeded consists substantially exclusively of mesenchymal stem cells.
「実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」とは、成長因子を実質的に含まない非増殖系の培養液で培養した場合に、シート状細胞培養物を形成することができる細胞密度を意味する。この播種密度は、成長因子を含む培養液を用いる手法におけるものよりも高いものであり、細胞がコンフルエントに達する密度以上であってもよい。かかる密度としては、これに限定するものではないが、例えば、１．０×１０５個／ｃｍ２以上である。播種密度の上限は、細胞培養物の形成が損なわれず、細胞が分化に移行しなければ特に制限されないが、例えば、３．４×１０６個／ｃｍ２未満であってもよい。一態様において、「細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」は、細胞がコンフルエントに達する密度もしくはそれ以上、または、コンフルエント密度以上である。この密度を生物学的または物理学的条件に含む。 "Density capable of forming a sheet-like cell culture without substantially growing" means that a sheet-like cell culture is formed when cultured in a non-proliferative culture medium containing substantially no growth factor. Means the cell density that can be. This seeding density is higher than that in the method using the culture medium containing the growth factor, and may be higher than the density at which the cells reach the confluence. Such density, but not limited to, for example, is 1.0 × 10 5 / cm 2 or more. The upper limit of the seeding density is not particularly limited as long as the formation of the cell culture is not impaired and the cells do not undergo differentiation, but may be, for example, less than 3.4 × 10 6 cells / cm 2. In one aspect, the "density at which cells can form a sheet-like cell culture without substantial proliferation" is at or above the density at which the cells reach confluence, or greater than or equal to the confluence density. Include this density in biological or physical conditions.
「細胞が実質的に増殖することなくシート状細胞培養物を形成し得る密度」は、ある態様では１．０×１０５〜３．４×１０６個／ｃｍ２、別の態様では３．０×１０５〜３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では３．５×１０５〜３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では１．０×１０６〜３．４×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では３．０×１０５〜１．７×１０６個／ｃｍ２、別の態様では３．５×１０５〜１．７×１０６個／ｃｍ２、さらに別の態様では１．０×１０６〜１．７×１０６個／ｃｍ２である。上記範囲は、上限が３．４×１０６個／ｃｍ２未満である限り、上限および下限の両方、または、そのいずれか一方を含んでもよい。したがって、上記密度は、例えば、３．０×１０５個／ｃｍ２以上３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、３．５×１０５個／ｃｍ２以上３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、１．０×１０６個／ｃｍ２以上３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限を含み、上限は含まない）、１．０×１０６個／ｃｍ２超３．４×１０６個／ｃｍ２未満（下限も上限も含まない）、１．０×１０６個／ｃｍ２超１．７×１０６個／ｃｍ２以下（下限は含まないが、上限は含む）であってもよい。 The “density at which cells can form a sheet-like cell culture without substantially proliferating” is 1.0 × 10 5 to 3.4 × 10 6 cells / cm 2 in one embodiment, and 3. In another embodiment. 0 × 10 5 to 3.4 × 10 6 pieces / cm 2 , 3.5 × 10 5 to 3.4 × 10 6 pieces / cm 2 in yet another aspect, 1.0 × 10 6 in yet another aspect. ~ 3.4 × 10 6 pieces / cm 2 , in yet another aspect 3.0 × 10 5 to 1.7 × 10 6 pieces / cm 2 , in another aspect 3.5 × 10 5 to 1.7 × 10 6 pieces / cm 2 , and in yet another aspect, 1.0 × 10 6 to 1.7 × 10 6 pieces / cm 2 . The above range may include both the upper limit and / or the lower limit as long as the upper limit is less than 3.4 × 10 6 pieces / cm 2. Therefore, the above densities are, for example, 3.0 × 10 5 pieces / cm 2 or more and 3.4 × 10 6 pieces / cm less than 2 (including the lower limit and not including the upper limit), 3.5 × 10 5 pieces / cm. 2 or more 3.4 x 10 6 pieces / cm less than 2 (including lower limit, not including upper limit), 1.0 x 10 6 pieces / cm 2 or more and less than 3.4 x 10 6 pieces / cm 2 (including lower limit) , Upper limit not included), 1.0 x 10 6 pieces / cm 2 or more 3.4 x 10 6 pieces / cm less than 2 (not including lower limit or upper limit), 1.0 x 10 6 pieces / cm 2 or more 1 .7 × 10 6 pieces / cm 2 or less (the lower limit is not included, but the upper limit is included).
培養基材は、細胞がその上でシート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、当該技術分野において通常用いられるものを用い得る。かかる基材としては、これに限定するものではないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。培養基材には、培養容器の一面（例えば容器の底面）の他、細胞培養用スキャフォールドの表面などが含まれ得る。 The culture substrate is not particularly limited as long as the cells can form a sheet-like cell culture on the cells, and those usually used in the art can be used. Such base materials include, but are not limited to, polyethylene, polypropylene, Teflon (registered trademark), polyethylene terephthalate, polymethylmethacrylate, nylon 6,6, polyvinyl alcohol, cellulose, silicon, polystyrene, glass, and the like. Examples include polyacrylamide, polydimethylacrylamide, metals (eg, iron, stainless steel, aluminum, copper, brass) and the like. The culture substrate may include one surface of the culture vessel (for example, the bottom surface of the vessel), the surface of a scaffold for cell culture, and the like.
培養基材の表面は、細胞接着性を高めるための加工、剥離を容易にするための加工などを含む、シート状細胞培養物の製造において有利となるような加工が施されていてもよい。このような加工としては、これに限定するものではないが、例えばコロナ放電処理、紫外線照射処理、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物によるコーティング、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などによるコーティング、例えば温度や光などの刺激に応答して物性が変化する材料によるコーティングなどが挙げられる。 The surface of the culture substrate may be subjected to processing that is advantageous in the production of sheet-like cell culture, including processing for enhancing cell adhesion and processing for facilitating peeling. Such processing is not limited to this, for example, corona discharge treatment, ultraviolet irradiation treatment, coating with a hydrophilic compound such as collagen gel or hydrophilic polymer, collagen, fibronectin, laminin, vitronectin, proteoglycan, glycos. Examples include coating with extracellular matrix such as saminoglycan and cell adhesion factors such as cadoherin family, selectin family, and integrin family, for example, coating with a material whose physical properties change in response to stimuli such as temperature and light.
温度や光などの刺激に応答して物性が変化する材料としては、これに限定するものではないが、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平２−２１１８６５、特開２００３−３３１７７参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えばUpCell(R)、セルシード）、これらを本発明の製造方法に使用することができる。 The material whose physical properties change in response to a stimulus such as temperature or light is not limited to this, and is, for example, a (meth) acrylamide compound or an N-alkyl-substituted (meth) acrylamide derivative (for example, N-ethyl). Acrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propyl Acrylamide, N-Isopropyl Acrylamide, N-Isopropyl Acrylamide, N-Cyclopropyl Acrylamide, N-Cyclopropyl Acrylamide, N-ethoxyethyl acrylamide, N-ethoxy Ethylmethacrylamide, N-tetrahydrofurfurylacrylamide, N-tetrahydrofurfurylmethacrylicamide, etc.), N, N-dialkyl-substituted (meth) acrylamide derivatives (eg, N, N-dimethyl (meth) acrylamide, N, N-ethyl Methylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, etc.), (meth) acrylamide derivatives with cyclic groups (eg, 1- (1-oxo-2-propenyl) -pyrrolidin, 1- (1-oxo-2-propenyl)- Piperidine, 4- (1-oxo-2-propenyl) -morpholin, 1- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -pyrrolidin, 1- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl)- A temperature-responsive material consisting of a homopolymer or copolymer of piperidine, 4- (1-oxo-2-methyl-2-propenyl) -morpholin, etc.) or a vinyl ether derivative (eg, methylvinyl ether), photoabsorbable with an azobenzene group. Use known polymers, copolymers of vinyl derivatives of triphenylmethane leucohydrooxide and acrylamide-based monomers, and photoresponsive materials such as N-isopropylacrylamide gel containing spirobenzopyran. (For example, see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-211865 and Japanese Patent Laid-Open No. 2003-33177). By giving a predetermined stimulus to these materials, their physical characteristics, for example, hydrophilicity and hydrophobicity can be changed, and the exfoliation of the cell culture adhering on the material can be promoted. Culture dishes coated with a temperature-responsive material are commercially available (eg, UpCell (R) , CellSeed) and can be used in the production methods of the present invention.
上記培養基材は、種々の形状であってもよく、任意の大きさおよび形状の容器で行うことができるが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、典型的には、約１ｃｍ２〜約２００ｃｍ２、好ましくは約２ｃｍ２〜約１００ｃｍ２、より好ましくは約３ｃｍ２〜約５０ｃｍ２である。 The culture medium may have various shapes and can be carried out in a container of any size and shape, but is preferably flat. The area thereof is not particularly limited, but is typically about 1 cm 2 to about 200 cm 2 , preferably about 2 cm 2 to about 100 cm 2 , and more preferably about 3 cm 2 to about 50 cm 2 .
工程（ｂ）において、播種した細胞をシート化培養することでシート状細胞培養物を形成する。「シート化培養」は、培養基材に播種した細胞を、シート状細胞培養物を形成する（すなわち、シート化する）ように培養することを意味する。シート化培養は、典型的には、培養基材にシート状細胞培養物を形成し得る細胞を播種し、所定の期間（例えば、８〜４８時間、１０〜３６時間、１１〜３０時間、１２〜２６時間など）、細胞間接着を形成する条件下で培養して細胞同士を相互作用させ、細胞同士を連結させることにより行う。培養される期間は、シート状細胞培養物が形成されるのに十分な期間であれば特に限定されない。播種される細胞集団に未分化細胞が含まれる場合、所定の期間は、好ましくは細胞が分化に移行しない期間内である。したがって、この態様において、細胞は、培養期間中、未分化の状態に維持される。細胞の分化への移行は、当業者に知られた任意の方法で評価することができる。例えば、骨格筋芽細胞の場合は、ＭＨＣの発現や、細胞の多核化を分化の指標とすることができる。 In step (b), a sheet-like cell culture is formed by culturing the seeded cells in a sheet. "Sheet culture" means culturing the cells seeded on the culture medium so as to form a sheet-like cell culture (that is, to form a sheet). In sheet culture, cells that can form a sheet-like cell culture are typically seeded on a culture medium and for a predetermined period (for example, 8-48 hours, 10-36 hours, 11-30 hours, 12). (~ 26 hours, etc.), the cells are cultured under conditions that form cell-cell adhesion, the cells interact with each other, and the cells are connected to each other. The period of culturing is not particularly limited as long as it is a period sufficient for forming a sheet-like cell culture. When the seeded cell population contains undifferentiated cells, the predetermined period is preferably within the period during which the cells do not undergo differentiation. Therefore, in this embodiment, the cells are maintained in an undifferentiated state during the culture period. The transition to cell differentiation can be assessed by any method known to those of skill in the art. For example, in the case of skeletal myoblasts, MHC expression and cell multinucleation can be used as indicators of differentiation.
細胞間接着を形成する条件は、細胞間接着を形成することができる任意の条件を含み、これには、限定されずに、例えば、一般的な細胞培養条件が含まれる。かかる条件としては、例えば、３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養期間は、細胞間接着を形成するのに十分な期間という観点から、これに限定するものではないが、例えば８時間以上、９時間以上、１０時間以上、１１時間以上、１２時間以上であり、細胞分化防止の観点から、これに限定するものではないが、例えば４８時間以内、４０時間以内、３６時間以内、３０時間以内、２６時間以内、２４時間以内である。したがって培養期間としては、これら上限および下限の任意の組み合わせを例示することができ、これに限定するものではないが、例えば８〜４８時間、９〜４８時間、１０〜４８時間、１１〜４８時間、１２〜４８時間、８〜４０時間、９〜４０時間、１０〜４０時間、１１〜４０時間、１２〜４０時間、８〜３６時間、９〜３６時間、１０〜３６時間、１１〜３６時間、１２〜３６時間、８〜３０時間、９〜３０時間、１０〜３０時間、１１〜３０時間、１２〜３０時間、８〜２６時間、９〜２６時間、１０〜２６時間、１１〜２６時間、１２〜２６時間、８〜２４時間、９〜２４時間、１０〜２４時間、１１〜２４時間、１２〜２４時間などである。当業者であれば、播種する細胞の種類に応じて最適な条件を選択することができる。シート化培養の非限定例は、例えば、特許文献１、特開２０１０−０８１８２９、特開２０１０−２２６９９１、特開２０１１−１１０３６８、特開２０１１−１７２９２５、ＷＯ２０１４／１８５５１７などに記載されている。 The conditions for forming cell-cell adhesion include, but are not limited to, any conditions that can form cell-cell adhesion, including, for example, general cell culture conditions. Such conditions include, for example, culturing at 37 ° C. and 5% CO 2. The culture period is not limited to this from the viewpoint of a period sufficient to form cell-cell adhesion, but is, for example, 8 hours or more, 9 hours or more, 10 hours or more, 11 hours or more, 12 hours or more. From the viewpoint of preventing cell differentiation, the present invention is not limited to this, but is, for example, 48 hours or less, 40 hours or less, 36 hours or less, 30 hours or less, 26 hours or less, and 24 hours or less. Therefore, as the culture period, any combination of these upper and lower limits can be exemplified, and the culture period is not limited to, for example, 8 to 48 hours, 9 to 48 hours, 10 to 48 hours, and 11 to 48 hours. , 12-48 hours, 8-40 hours, 9-40 hours, 10-40 hours, 11-40 hours, 12-40 hours, 8-36 hours, 9-36 hours, 10-36 hours, 11-36 hours , 12-36 hours, 8-30 hours, 9-30 hours, 10-30 hours, 11-30 hours, 12-30 hours, 8-26 hours, 9-26 hours, 10-26 hours, 11-26 hours , 12 to 26 hours, 8 to 24 hours, 9 to 24 hours, 10 to 24 hours, 11 to 24 hours, 12 to 24 hours, and the like. Those skilled in the art can select the optimum conditions according to the type of cells to be seeded. Non-limiting examples of sheeted culture are described in, for example, Patent Document 1, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-081829, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2010-226991, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-110368, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-172925, WO2014 / 185517 and the like.
シート化に用いるシート化媒体としては、細胞のシート化を誘導し得るものであれば特に限定されず、例えば、生理食塩水、種々の生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）、種々の細胞培養用の基礎培地をベースにしたものなどを使用することができる。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や培養条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。シート化媒体は、血清（例えば、ウシ胎仔血清などのウシ血清、ウマ血清、ヒト血清等）、種々の成長因子（例えば、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等）などの添加物を含んでもよい。 The sheeting medium used for sheeting is not particularly limited as long as it can induce cell sheeting, and includes, for example, physiological saline, various physiological buffers (for example, PBS, HBSS, etc.), and various cells. Those based on the basal medium for culture can be used. Such basal medium is not limited to, for example, DMEM, MEM, F12, DME, RPMI1640, MCDB (MCDB102, 104, 107, 120, 131, 153, 199, etc.), L15, SkBM, RITC80-7, DMEM. / F12 and the like are included. Many of these basal media are commercially available, and their compositions are also known. The basal medium may be used as it has a standard composition (for example, as it is on the market), or the composition may be appropriately changed depending on the cell type and culture conditions. Therefore, the basal medium is not limited to those having a known composition, and includes those in which one or more components are added, removed, increased or decreased. The sheeting medium may contain additives such as serum (eg, bovine serum such as bovine fetal serum, horse serum, human serum, etc.) and various growth factors (eg, FGF, EGF, VEGF, HGF, etc.).
また、上述のとおり、細胞は実質的に増殖しない密度で播種されるため、従来の方法のように細胞培養物が所望の大きさに成長するのを待つことなく、所望の大きさおよび形状のシート状細胞培養物を短期間で得ることが可能である。シート状細胞培養物の大きさや形状は、培養基材の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。 Also, as mentioned above, the cells are seeded at a density that does not substantially proliferate, so that the cell culture of the desired size and shape does not have to wait for the cell culture to grow to the desired size as in conventional methods. It is possible to obtain a sheet-like cell culture in a short period of time. For the size and shape of the sheet-shaped cell culture, adjust the size and shape of the cell attachment surface of the culture substrate, or install a mold of the desired size and shape on the cell attachment surface of the culture vessel. , It can be arbitrarily adjusted by culturing cells inside the cell.
工程（ｃ）において、形成したシート状細胞培養物を剥離する。剥離には、シート状細胞培養物の構造を保ったまま培養基材から剥離できれば特に限定されず、当該技術分野において知られた方法を用いることができる。具体的には例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理、ピペッティングなどの機械的処理、支持体を用いた物理的な剥離などによって行うことができる。また、培養基材に温度や光などの刺激に応答して物性が変化する材料で表面を被覆した培養基材を用いた場合には、所定の刺激を加えることで、非酵素的に遊離することもできる。例えば低温で接着性が低下する温度応答性の材料で表面を被覆した培養基材を用いた場合、剥離用の媒体（上記シート化媒体と同じであってもよいし、生理的等張液や本発明の保存液であってもよい）を加えて冷却し、または冷却した剥離用媒体を加えることで接着性を低下させ、剥離することができる。 In step (c), the formed sheet-shaped cell culture is exfoliated. The exfoliation is not particularly limited as long as it can be exfoliated from the culture substrate while maintaining the structure of the sheet-shaped cell culture, and a method known in the art can be used. Specifically, for example, it can be carried out by enzyme treatment with a proteolytic enzyme (for example, trypsin), mechanical treatment such as pipetting, physical exfoliation using a support, or the like. In addition, when a culture substrate whose surface is coated with a material whose physical properties change in response to a stimulus such as temperature or light is used as the culture substrate, it is released non-enzymatically by applying a predetermined stimulus. You can also do it. For example, when a culture substrate whose surface is coated with a temperature-responsive material whose adhesiveness decreases at a low temperature is used, a medium for peeling (the same as the above-mentioned sheeting medium, a physiological isotonic solution, or a physiological isotonic solution) is used. By adding a preservative solution of the present invention) and cooling, or by adding a cooled peeling medium, the adhesiveness can be lowered and peeling can be performed.
シート状細胞培養物は、培養基材から剥離されるとある程度収縮することが知られている。かかる収縮の程度は、シート状細胞培養物を構成する細胞種や含有比率、形成条件などにより異なる。例えば骨格筋芽細胞および線維芽細胞を含む細胞集団を、本願発明のシート形成培養を用いて形成した場合、その収縮割合としては、例えばシートの径が約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％程度となる。本発明の一態様において、剥離された（すなわち収縮した）シート状細胞培養物は、その面積が約１ｃｍ２以上、約３ｃｍ２以上、好ましくは約６ｃｍ２以上、さらに好ましくは約１０ｃｍ２以上であり得る。
かかる剥離工程の詳細は、上記＜３＞において、保存対象がシート状細胞培養物である態様について記載したとおりである。
It is known that the sheet-shaped cell culture shrinks to some extent when it is peeled off from the culture substrate. The degree of such contraction varies depending on the cell type constituting the sheet-shaped cell culture, the content ratio, the formation conditions, and the like. For example, when a cell population containing skeletal myoblasts and fibroblasts is formed using the sheet-forming culture of the present invention, the contraction ratio thereof is, for example, sheet diameters of about 30%, about 40%, and about 50%. , About 60%, about 70%, and about 80%. In one embodiment of the present invention, the stripped (ie, contracted) sheet-like cell culture has an area of about 1 cm 2 or more, about 3 cm 2 or more, preferably about 6 cm 2 or more, and more preferably about 10 cm 2 or more. possible.
The details of the peeling step are as described in the above <3> regarding the mode in which the storage target is a sheet-shaped cell culture.
工程（ｄ）において、剥離したシート状細胞培養物を、上記＜１＞または＜２＞に記載の保存液に浸漬する。したがって、シート状細胞培養物は、収縮した状態で本発明の保存液に浸漬される。かかる浸漬工程の詳細は、上記＜３＞において、保存対象がシート状細胞培養物である態様について記載したとおりである。また、剥離用媒体として本発明の保存液を用いる場合、工程（ｃ）にて剥離した後、そのまま剥離用媒体（すなわち本発明の保存液）に浸漬させることで工程（ｄ）としてもよい。また、剥離媒体として生理的等張液、好ましくは低栄養等張液を用いる場合、工程（ｃ）にて剥離した後、エダラボンおよび／またはビタミンを添加することで剥離媒体を本発明の保存液とし、そのまま浸漬させることで工程（ｄ）としてもよい。 In step (d), the exfoliated sheet-shaped cell culture is immersed in the preservation solution according to <1> or <2> above. Therefore, the sheet-shaped cell culture is immersed in the preservation solution of the present invention in a contracted state. The details of such a dipping step are as described in the above <3> regarding the embodiment in which the storage target is a sheet-shaped cell culture. When the preservative solution of the present invention is used as the peeling medium, the process (d) may be performed by immersing the preservative solution of the present invention in the peeling medium (that is, the preservative solution of the present invention) as it is after peeling in the step (c). When a physiological isotonic solution, preferably a hyponutrition isotonic solution, is used as the peeling medium, the peeling medium is used as the preservation solution of the present invention by adding edarabon and / or vitamin after peeling in step (c). Then, the step (d) may be performed by immersing the product as it is.
本発明において、適切に温度等の浸漬条件をコントロールすることができる限り、シート状細胞培養物を低栄養等張液に浸漬した状態で輸送することができる。また、本発明の方法により改変されたシート状細胞培養物は、低栄養等張液から取り出した後すぐに移植に使用することができる。したがって本発明の一態様において、シート状細胞培養物を製造し、低栄養等張液に浸漬し、その状態で輸送および保存した後、取り出して使用してもよい。 In the present invention, the sheet-shaped cell culture can be transported in a state of being immersed in a hyponutrition isotonic solution as long as the immersion conditions such as temperature can be appropriately controlled. In addition, the sheet-shaped cell culture modified by the method of the present invention can be used for transplantation immediately after being taken out from the hyponutrition isotonic solution. Therefore, in one aspect of the present invention, a sheet-shaped cell culture may be produced, immersed in a hyponutrition isotonic solution, transported and stored in that state, and then taken out and used.
本発明のシート状細胞培養物は、上述のとおり、医薬組成物の製造のために用いることができる。したがって本発明には、本発明のシート状細胞培養物を含む医薬組成物および本発明のシート状細胞培養物またはそれを含む医薬組成物を用いて上記各種疾患を処置する方法も包含される。
本発明の処置方法は、シート状細胞培養物またはそれを含む医薬組成物の有効量を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。処置方法の対象となる組織や疾患は、シート状細胞培養物について上記したとおりである。また、かかる処置方法においては、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、細胞培養物と併用することができる。
As described above, the sheet-shaped cell culture of the present invention can be used for producing a pharmaceutical composition. Therefore, the present invention also includes a pharmaceutical composition containing the sheet-shaped cell culture of the present invention and a method for treating the above-mentioned various diseases using the sheet-shaped cell culture of the present invention or the pharmaceutical composition containing the same.
The treatment method of the present invention comprises the step of administering an effective amount of a sheet cell culture or a pharmaceutical composition containing the same to a subject in need thereof. The tissues and diseases to be treated are as described above for sheet-shaped cell cultures. Further, in such a treatment method, a component that enhances the viability, engraftment and / or function of the sheet-shaped cell culture, other active ingredients useful for treating the target disease, and the like are used in combination with the cell culture. be able to.
本明細書に記載された種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本発明の範囲内である。また、当業者は、本発明の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本発明の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。 The various features described herein can be combined in various ways, and the embodiments obtained by such combinations are all within the scope of the present invention, including combinations not specifically described herein. is there. Those skilled in the art also understand that a number of various modifications that do not deviate from the spirit of the present invention are possible, and equivalents containing such modifications are also included in the scope of the present invention. Therefore, it should be understood that the embodiments described herein are merely exemplary and are not intended to limit the scope of the invention. Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but the present invention is not limited to these Examples.
例１．細胞生存率確認試験
（１）シート状細胞培養物の調製
ヒト骨格筋から定法により調製した骨格筋芽細胞（線維芽細胞を含む）を用いてシート状細胞培養物を調製した。温度応答性培養皿（UpCell(R)１２穴マルチウェル、セルシード）に、２０％ヒト血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（Thermo Fisher Scientific Inc.）に懸濁したヒト骨格筋芽細胞およびヒト線維芽細胞の細胞混合物を、３．７×１０６個／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で１２〜２６時間シート化培養を行った。シート化培養後、培地を除去し、７００μＬの４℃に冷却したＨＢＳＳ（＋）（Thermo Fisher Scientific Inc.）を加えて１０分静置し、その後静かにピペッティングしてシート状細胞培養物を完全に剥離させた。剥離したシート状細胞培養物は自然に収縮した。
Example 1. Cell viability confirmation test (1) Preparation of sheet-shaped cell culture A sheet-shaped cell culture was prepared using skeletal myoblasts (including fibroblasts) prepared by a conventional method from human skeletal muscle. Human skeletal myoblasts and human fibroblasts suspended in DMEM / F12 medium (Thermo Fisher Scientific Inc.) containing 20% human serum in a temperature-responsive culture dish (UpCell (R) 12-well multiwell, CellSeed). The cell mixture was seeded at 3.7 × 10 6 cells / well and sheeted and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 12 to 26 hours. After sheet-forming culture, the medium is removed, 700 μL of HBSS (+) (Thermo Fisher Scientific Inc.) cooled to 4 ° C. is added, and the mixture is allowed to stand for 10 minutes, and then gently pipetted to prepare a sheet-like cell culture. It was completely peeled off. The exfoliated sheet cell culture shrank spontaneously.
シート状細胞培養物を完全に剥離した後、ＨＢＳＳ（＋）を除去し、新たに常温のＨＢＳＳ（＋）を加えてリンスした。かかる洗浄工程を４回行った。ＨＢＳＳ（＋）を除去した後、シート状細胞培養物を含むウエル中にエダラボンまたはビタミンを含有する各保存液を１．５５ｍＬ加え、２〜８℃の冷蔵条件で７２〜１６８時間静置した。 After the sheet-shaped cell culture was completely exfoliated, HBSS (+) was removed, and HBSS (+) at room temperature was newly added and rinsed. This cleaning step was performed four times. After removing HBSS (+), 1.55 mL of each preservation solution containing edaravone or vitamin was added to a well containing a sheet-shaped cell culture, and the cells were allowed to stand for 72 to 168 hours under a refrigerated condition of 2 to 8 ° C.
（２）細胞生存率評価
（１）において冷蔵条件で静置したシート状細胞培養物について、細胞生存率を測定した。保存液中で所定の期間静置したシート状細胞培養物をトリプシン様蛋白分解酵素で解離させた後、ＦＡＣＳチューブに３．０×１０５個となるように細胞を分注し、遠心処理を行い、上清を廃棄した。これに０．５％ＢＳＡ含ＰＢＳ液を３ｍｌ加え、ボルテックスして細胞をリンスした後遠心処理して上清を取り除き、０．５％ＢＳＡ含ＰＢＳ液で最終濃度０．６μｇ／ｍＬに調製したヨウ化プロピジウム（ＰＩ、ベクトンディッキンソン）溶液を５００μＬ添加し混和した。混和後、直ちに遮光下にて室温で約５分間反応させ、反応後０．５％ＢＳＡ含ＰＢＳ液を加え、ボルテックスして細胞をリンスした後遠心処理して上清を取り除き、０．５％ＢＳＡ含ＰＢＳ液を５００μＬ加え解析に供した。解析はフローサイトメーター（ベクトン・ディッキンソン）を用い、ＰＩを混和した全細胞に含まれるＰＩ未染色細胞の割合を計測した。
(2) Evaluation of cell viability The cell viability was measured for sheet-shaped cell cultures that had been allowed to stand under refrigerated conditions in (1). After the sheet cell culture was allowed to stand predetermined period preservation solution were dissociated by trypsin-like proteolytic enzymes, aliquoted cells so that 3.0 × 10 5 cells in FACS tubes, centrifuged And the supernatant was discarded. 3 ml of 0.5% BSA-containing PBS solution was added thereto, and the cells were vortexed to rinse the cells and then centrifuged to remove the supernatant. The final concentration was adjusted to 0.6 μg / mL with 0.5% BSA-containing PBS solution. 500 μL of a propidium iodide (PI, Becton Dickinson) solution was added and mixed. Immediately after mixing, the cells were reacted at room temperature for about 5 minutes under shading, and after the reaction, 0.5% BSA-containing PBS solution was added, vortexed to rinse the cells, and centrifugation was performed to remove the supernatant, resulting in 0.5%. 500 μL of BSA-containing PBS solution was added and subjected to analysis. For the analysis, a flow cytometer (Becton Dickinson) was used to measure the proportion of unstained PI cells contained in all cells mixed with PI.
例２．生理食塩水ベースの保存液による試験
（１）ビタミン添加保存液
例１（１）において、保存液として生理食塩水をベースに、ビタミン無添加、０．２ｍＭまたは２ｍＭのビタミンＣ（武田薬品工業）、１０μＭまたは１００μＭのビタミンＥ（和光純薬）、０．２ｍＭのビタミンＣおよび１０μＭのビタミンＥ、２ｍＭのビタミンＣおよび１００μＭのビタミンＥならびに１．５％のビタジェクト注をそれぞれ添加した保存液を作製し、シート状細胞培養物を含むウエル中に加え、２℃から８℃の冷蔵条件で静置期間を３日間として試験した。ビタジェクト注の組成は下表のとおりである。
結果を図１に示す。いずれの場合もビタミン無添加の場合と比較して細胞生存率は上昇していた。ビタミン無添加の場合と比較してビタミンＣは添加量に依存して細胞生存率が向上（０．２ｍＭの場合は約６３％であったのに対し、２ｍＭの場合は約８５％）していた。ビタミンＥは添加量と細胞生存率向上に相関を示さずにビタミン無添加の場合と比較して細胞生存率が上昇した（いずれの場合も約６５％）。ビタミンＣとビタミンＥを併用した場合、０．２ｍＭのビタミンＣおよび１０μＭのビタミンＥを加えた保存液はそれぞれビタミンＣまたはビタミンＥ単独で使用した場合と同様の効果を示した（併用では約６４％）。２ｍＭのビタミンＣおよび１００μＭのビタミンＥを添加した場合は、それぞれビタミンＣまたはビタミンＥを単独で使用した場合と比較してさらに細胞生存率が向上（併用では約９３％）していた。また、１．５％のビタジェクト（必須ビタミン量は、２ｍＭのビタミンＣおよび１００μＭのビタミンＥに相当）を用いた場合はさらに細胞生存率が向上（約９５％）していた。 The results are shown in FIG. In each case, the cell viability was increased as compared with the case where no vitamin was added. Compared with the case where vitamin C was not added, the cell viability of vitamin C improved depending on the amount added (about 63% in the case of 0.2 mM, but about 85% in the case of 2 mM). It was. Vitamin E did not show a correlation between the amount added and the improvement in cell viability, and the cell viability was increased as compared with the case where no vitamin was added (about 65% in each case). When Vitamin C and Vitamin E were used in combination, the preservation solution containing 0.2 mM Vitamin C and 10 μM Vitamin E showed the same effect as when Vitamin C or Vitamin E was used alone (about 64 in combination). %). When 2 mM vitamin C and 100 μM vitamin E were added, the cell viability was further improved (about 93% when used in combination) as compared with the case where vitamin C or vitamin E was used alone. In addition, the cell viability was further improved (about 95%) when 1.5% of Vitaject (the amount of essential vitamins corresponds to 2 mM vitamin C and 100 μM vitamin E) was used.
（２）エダラボン添加保存液
例１（１）において、保存液として生理食塩水をベースに、エダラボン無添加、１μＭまたは１０μＭのエダラボン（ニプロ）をそれぞれ添加した保存液を作製し、静置期間を５日間として２℃〜８℃の冷蔵条件で試験した。
結果を図２に示す。いずれの場合もエダラボン無添加の場合と比較して細胞生存率は上昇（１μＭの場合は約９５％、１０μＭの場合は約９７％）していた。
(2) Edaravone-added preservative solution In Example 1 (1), a preservative solution containing no edaravone and 1 μM or 10 μM edaravone (nipro) was prepared based on physiological saline as a preservative solution, and the standing period was set. The test was carried out under refrigerated conditions of 2 ° C to 8 ° C for 5 days.
The results are shown in FIG. In each case, the cell viability was increased (about 95% in the case of 1 μM and about 97% in the case of 10 μM) as compared with the case where edaravone was not added.
例３．ハンクス平衡塩液ベースの保存液
（１）ビタミン添加保存液
例１（１）において、保存液としてＨＢＳＳ（＋）をベースに、０．７５％のビタジェクト注（テルモ）Ａ液または０．７５％のビタジェクト注Ａ液および０．７５％のビタジェクト注Ｂ液をそれぞれ添加した保存液を作製し、静置期間を３日間として２℃〜８℃の冷蔵条件で試験した。比較対象として、ＤＭＥＭ培地（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いた。
結果を図３に示す。いずれのビタミン添加保存液も、ＤＭＥＭ培地と比較して高い細胞生存率を示した。
Example 3. Hanks Equilibrium Salt Solution-based Preservative Solution (1) Vitamin-Added Preservative Solution In Example 1 (1), 0.75% Vitaject Injection (Terumo) A solution or 0.75% based on HBSS (+) as the preservation solution. A storage solution was prepared by adding each of Vitaject Injection A solution and 0.75% Vitaject Injection B solution, and the test was carried out under refrigerating conditions of 2 ° C. to 8 ° C. with a standing period of 3 days. As a comparison target, DMEM medium (Thermo Fisher Scientific Inc.) was used.
The results are shown in FIG. Both vitamin-added preservatives showed high cell viability as compared with DMEM medium.
（２）エダラボン添加保存液
例１（１）において、保存液としてＨＢＳＳ（＋）をベースに、１００μＭのエダラボンを添加した保存液を作製し、静置期間を３日間および７日間として２℃〜８℃の冷蔵条件で試験した。
結果を図４に示す。エダラボンを添加した場合、無添加のＨＢＳＳ（＋）と比較して、３〜７日において高い細胞生存率を示した。
(2) Edaravone-added preservation solution In Example 1 (1), a preservation solution to which 100 μM edaravone was added was prepared based on HBSS (+) as a preservation solution, and the standing period was 3 days and 7 days, and the temperature was 2 ° C. to 2 ° C. The test was carried out under refrigerated conditions at 8 ° C.
The results are shown in FIG. When edaravone was added, the cell viability was higher at 3 to 7 days as compared with HBSS (+) without addition.
Claims (10)
（ｂ）播種した細胞をシート化培養してシート状細胞培養物を形成すること、
（ｃ）形成したシート状細胞培養物を剥離すること、および
（ｄ）剥離したシート状細胞培養物を、請求項１〜６のいずれか一項に記載の保存液に浸漬すること
を含む、シート状細胞培養物の製造方法。 (A) Seeding the cells on a culture substrate at a density capable of forming a sheet-like cell culture without substantially proliferating.
(B) Forming a sheet-like cell culture by culturing the seeded cells in a sheet.
(C) The formed sheet-like cell culture is exfoliated, and (d) the exfoliated sheet-like cell culture is immersed in the preservation solution according to any one of claims 1 to 6. A method for producing a sheet-shaped cell culture.
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