JP6842168B2 - Micro-water droplet immunoassay - Google Patents
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Description
本発明は、液滴中の標的分子を濃縮するための方法及びキットに関する。 The present invention relates to methods and kits for concentrating target molecules in droplets.
近年、例えば単一細胞中の特定のタンパク質等の微量の生体分子を高収量に回収し、かつ高感度で測定できる微量の生体分子測定法が必要とされている。一つのアプローチとして、マイクロ水滴内に試料を閉じ込めて試料の拡散及び希釈を防ぎ、個々の水滴について該水滴中の試料を既存の生学分析法により測定する手法が多く開発されている。 In recent years, there has been a need for a method for measuring a small amount of biomolecules, for example, which can recover a small amount of biomolecules such as a specific protein in a single cell with high yield and can measure with high sensitivity. As one approach, many methods have been developed in which a sample is confined in a micro-water droplet to prevent diffusion and dilution of the sample, and the sample in the water droplet is measured by an existing bioanalytical method for each water droplet.
例えば、非特許文献１には、マイクロ水滴内に抗原と蛍光標識抗体を加え、マイクロ水滴内に抗体を表面に被覆したマイクロ粒子を一つ入れ、マイクロ粒子表面へ濃縮した抗原と蛍光標識抗体との複合体を蛍光測定する手法が記載されている。本手法では、単一のマイクロ粒子を水滴内に入れる必要があるため、複数個の粒子が水滴内に入ることを防ぐために、粒子数に対して過剰量（約十倍）の水滴を生成しなければならない。このため、作製したマイクロ水滴のうちごく一部（10%程度）の水滴でしかイムノアッセイを行うことができず、試料のロスが多い。 For example, in Non-Patent Document 1, an antigen and a fluorescently labeled antibody are added to a microwater droplet, one microparticle whose surface is coated with the antibody is placed in the microwater droplet, and the antigen and fluorescently labeled antibody concentrated on the surface of the microparticle. A method for measuring fluorescence of the complex of the above is described. In this method, since it is necessary to put a single microparticle in a water droplet, an excess amount (about 10 times) of the number of particles is generated in order to prevent multiple particles from entering the water droplet. There must be. Therefore, the immunoassay can be performed only with a small part (about 10%) of the prepared micro-droplets, resulting in a large sample loss.
非特許文献２には、マイクロ水滴内に抗原と抗体を表面に被覆した磁性粒子を入れ、磁気粒子をmagnetic tweezerで捕捉して洗浄したのち、 ELISA法にて測定する方法が記載されている。本手法では、水滴から磁性粒子を分離したのちに、磁性粒子表面に結合した抗原の濃度を測定する。そのため、測定結果と対応するサンプルの特定／回収ができない。 Non-Patent Document 2 describes a method in which magnetic particles whose surface is coated with an antigen and an antibody are placed in micro-water droplets, the magnetic particles are captured by a magnetic tweezer, washed, and then measured by an ELISA method. In this method, after separating the magnetic particles from the water droplets, the concentration of the antigen bound to the surface of the magnetic particles is measured. Therefore, it is not possible to identify / collect the sample corresponding to the measurement result.
非特許文献３には、マイクロ水滴をゲル化させてイムノアッセイを行う方法が記載されている。本手法では、マイクロ水滴をゲル化するため、定量性がない。 Non-Patent Document 3 describes a method for performing an immunoassay by gelling microwater droplets. In this method, micro-water droplets are gelled, so there is no quantitativeness.
非特許文献４では、本発明者らが、アビジンを結合させたナノ粒子と蛍光標識したビオチンとを用いて、マイクロ水滴内にナノ粒子に結合した蛍光標識ビオチンを維持しつつ、遊離型の蛍光標識ビオチンを自己乳化によりマイクロ水滴の外に追い出して、蛍光標識ビオチンから遊離型の蛍光標識ビオチンを分離し、かつ濃縮する方法について報告している。しかしながら、この手法ではアビジン−ビオチン結合を利用しているため特定のタンパク質しか測定できない。また、この手法では、界面活性剤Span80を含む有機相をマイクロ水滴の周囲に導入することにより、マイクロ水滴の界面にマイクロ水滴よりも小径のナノ水滴を形成することで遊離型の蛍光標識ビオチンをナノ水滴に移動させているが、タンパク質のような親水性高分子をナノ水滴へと追い出す方法は確立されていない。 In Non-Patent Document 4, the present inventors use avidin-bound nanoparticles and fluorescently labeled biotin to maintain the fluorescently labeled biotin bound to the nanoparticles in microwater droplets while free-form fluorescence. We report a method for separating and concentrating free fluorescently labeled biotin from fluorescently labeled biotin by expelling the labeled biotin out of micro-water droplets by self-emulsification. However, since this method utilizes an avidin-biotin bond, only a specific protein can be measured. In addition, in this method, a free fluorescently labeled biotin is produced by introducing an organic phase containing the surfactant Span80 around the microdroplets to form nanodroplets with a diameter smaller than that of the microdroplets at the interface of the microdroplets. Although it has been moved to nano-droplets, a method for expelling hydrophilic polymers such as proteins into nano-droplets has not been established.
上記の従来技術のマイクロ水滴内での標的分子の測定方法では、試料のロスが多い、測定結果と試料の対応が取れないといった問題点があるが、これらの点を克服する方法が望まれている。 The above-mentioned conventional method for measuring a target molecule in a micro-water droplet has problems such as a large amount of sample loss and the inability to match the measurement result with the sample. A method for overcoming these problems is desired. There is.
本発明の課題は、高感度かつ定量的測定が可能な、液滴中の標的分子の濃縮方法及びキットを提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method and a kit for concentrating a target molecule in a droplet, which can be measured with high sensitivity and quantitatively.
本発明者らは、上記の目的を達成すべく、標的分子に特異的に結合する抗体が結合されたナノ粒子及び界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相を用いた逆ミセル抽出を用いることで、マイクロメートルサイズの油中水滴（マイクロ水滴）内で、特異的かつ高感度に微量の生体分子の定量を行えることを見出し、本発明を完成するに至った。 In order to achieve the above object, the present inventors extract reverse micelles using an organic phase containing nanoparticles in which an antibody that specifically binds to a target molecule is bound and an organic solvent in which a surfactant is dissolved. We have found that a small amount of biomolecules can be quantified specifically and with high sensitivity in micrometer-sized water droplets in oil (microwater droplets), and have completed the present invention.
すなわち本発明は、以下の項に記載の主題を包含する。
項１．液滴中の標的分子を濃縮するための方法であって、
基材に、ナノ粒子が結合されると共に標的分子に特異的に結合可能な第１の抗体を入れる工程と、
基材に、蛍光標識されると共に標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体と標的分子とを含有する水溶液を入れる工程と、
前記第１の抗体を入れる工程と前記第２の抗体と標的分子とを含有する水溶液を入れる工程とにより、前記第１の抗体、前記第２の抗体、及び前記標的分子を含有する液滴が形成されることと、
前記基材内において前記液滴の周囲に、界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相を入れ、液滴中の標的分子を濃縮する工程と
を含む方法。
項２．液滴中の標的分子を検出するための方法であって、
基材に、ナノ粒子が結合されると共に標的分子に特異的に結合可能な第１の抗体を入れる工程と、
基材に、蛍光標識されると共に標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体と標的分子とを含有する水溶液を入れる工程と、
前記第１の抗体を入れる工程と前記第２の抗体と標的分子とを含有する水溶液を入れる工程とにより、前記第１の抗体、前記第２の抗体、及び前記標的分子を含有する液滴が形成されることと、
前記基材内において前記液滴の周囲に、界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相を入れ、液滴中の標的分子を濃縮する工程と
前記濃縮された液滴の蛍光強度を測定する工程と
を含む方法。
項３．前記標的分子が細胞、細菌、又はウイルス内の標的分子であり、前記液滴は標的分子を含有する細胞を含む項１又は２に記載の方法。
項４．前記基材が、各ウェルが幅1〜1000μｍ、高さ1〜1000μｍである複数のウェルを備えたプレートである項１〜３のいずれかに記載の方法。
項５．前記プレートが、前記複数のウェルの下方又は上方に、前記複数のウェルの各々と連通する通路をさらに備えている項４に記載の方法。
項６．前記蛍光標識が、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、及びＴＭＲ（テトラメチルローダミン）からなる群から選択される少なくとも一つである項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７．液滴中の標的分子を検出するためのキットであって、
ナノ粒子が結合されると共に前記標的分子に特異的に結合可能な第１の抗体と、
蛍光標識されると共に前記標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体と、
前記第１の抗体及び前記第２の抗体を収容するための基材と、
界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相と、
を備えたキット。
項８．前記基材が、各々が幅1〜1000μｍ、高さ1〜1000μｍである複数のウェルを備えたプレートである項７に記載のキット。
項９．前記蛍光標識が、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、及びＴＭＲ（テトラメチルローダミン）からなる群から選択される少なくとも一つである項７又は８に記載のキット。
That is, the present invention includes the subjects described in the following sections.
Item 1. A method for concentrating target molecules in droplets
A step of inserting a first antibody into which the nanoparticles are bound and which can be specifically bound to the target molecule, and
A step of adding an aqueous solution containing a second antibody and a target molecule that are fluorescently labeled and capable of specifically binding to the target molecule to the base material.
By the step of adding the first antibody and the step of adding an aqueous solution containing the second antibody and the target molecule, the first antibody, the second antibody, and the droplet containing the target molecule are produced. To be formed and
A method including a step of putting an organic phase containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved around the droplet in the substrate and concentrating the target molecule in the droplet.
Item 2. A method for detecting target molecules in droplets,
A step of inserting a first antibody into which the nanoparticles are bound and which can be specifically bound to the target molecule, and
A step of adding an aqueous solution containing a second antibody and a target molecule that are fluorescently labeled and capable of specifically binding to the target molecule to the base material.
By the step of adding the first antibody and the step of adding an aqueous solution containing the second antibody and the target molecule, the first antibody, the second antibody, and the droplet containing the target molecule are produced. To be formed and
In the substrate, an organic phase containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved is placed around the droplet to concentrate the target molecule in the droplet, and the fluorescence intensity of the concentrated droplet is adjusted. A method including a step of measuring.
Item 3. Item 2. The method according to Item 1 or 2, wherein the target molecule is a target molecule in a cell, a bacterium, or a virus, and the droplet contains a cell containing the target molecule.
Item 4. Item 3. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the base material is a plate having a plurality of wells, each of which has a width of 1 to 1000 μm and a height of 1 to 1000 μm.
Item 5. Item 4. The method according to Item 4, wherein the plate further includes a passage communicating with each of the plurality of wells below or above the plurality of wells.
Item 6. Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the fluorescent label is at least one selected from the group consisting of FITC (fluorescein isothiocyanate), fluorescein, and TMR (tetramethylrhodamine).
Item 7. A kit for detecting target molecules in droplets
A first antibody to which nanoparticles can be bound and can specifically bind to the target molecule,
A second antibody that is fluorescently labeled and capable of specifically binding to the target molecule,
A base material for accommodating the first antibody and the second antibody, and
An organic phase containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved,
Kit with.
Item 8. Item 7. The kit according to Item 7, wherein the base material is a plate having a plurality of wells each having a width of 1 to 1000 μm and a height of 1 to 1000 μm.
Item 9. Item 7. The kit according to Item 7 or 8, wherein the fluorescent label is at least one selected from the group consisting of FITC (fluorescein isothiocyanate), fluorescein, and TMR (tetramethylrhodamine).
本発明によれば、作製したすべての水滴において、標的分子が水滴内に閉じ込められたまま、一水滴内でイムノアッセイ測定を行うことができる。このため、試料のロスが少なく、特異的かつ高感度に微量の生体分子の定量を行うことができる。 According to the present invention, in all the prepared water droplets, the immunoassay measurement can be performed in one water droplet while the target molecule is confined in the water droplet. Therefore, the loss of the sample is small, and a small amount of biomolecule can be quantified specifically and with high sensitivity.
また、本発明をさらにセルソーターと本発明を組み合わせることで、がん幹細胞等の希少な試料についても一つの細胞レベルでの測定が可能となる。 Further, by further combining the present invention with a cell sorter, it is possible to measure a rare sample such as a cancer stem cell at a single cell level.
以下、本発明の実施の形態を図面を参照しながら説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
本発明は、液滴中の標的分子を濃縮するための方法であって、基材に、ナノ粒子が結合されると共に標的分子に特異的に結合可能な第１の抗体を入れる工程と、基材に、蛍光標識されると共に標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体と標的分子とを含有する水溶液を入れる工程と、第１の抗体を入れる工程及び第２の抗体を入れる工程により、基材内に第１の抗体、第２の抗体、及び標的分子を含有する液滴が形成されることと、基材内において液滴の周囲に、界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相を入れ、液滴中の標的分子を濃縮する工程とを含む方法を包含する。 The present invention is a method for concentrating a target molecule in a droplet, which comprises a step of adding a first antibody to which the nanoparticles are bound and which can be specifically bound to the target molecule. By a step of adding an aqueous solution containing a second antibody and a target molecule that are fluorescently labeled and capable of specifically binding to the target molecule, a step of adding the first antibody, and a step of adding the second antibody. , A droplet containing the first antibody, the second antibody, and the target molecule is formed in the base material, and an organic solvent in which a surfactant is dissolved is formed around the droplet in the base material. It includes a method including adding an organic phase to be contained and concentrating a target molecule in a droplet.
第１の工程は、基材に、ナノ粒子が結合されると共に標的分子に特異的に結合可能な第１の抗体を入れる工程からなる。 The first step comprises a step of adding a first antibody to which the nanoparticles are bound and which can be specifically bound to the target molecule.
基材としては、ウェルを有するプレート、チップ、スライド、ポリマー膜等が挙げられるがこれらに限定されない。基材の材料としてはガラス、合成樹脂、金属等が挙げられるがこれらに限定されない。ガラス及び透明な合成樹脂が、エッチング又は射出成形等により標的分子を含有する水溶液の試料又は液滴を収容するためのウェルの製造が容易であり、かつ蛍光標識により発せられた蛍光の観察が容易であるため好ましい。 Examples of the base material include, but are not limited to, plates having wells, chips, slides, polymer films, and the like. Examples of the material of the base material include, but are not limited to, glass, synthetic resin, metal and the like. It is easy to produce wells for glass and transparent synthetic resin to contain samples or droplets of aqueous solution containing target molecules by etching or injection molding, and it is easy to observe the fluorescence emitted by the fluorescent label. Therefore, it is preferable.
標的分子は、抗体により特異的に結合される分子であり、好ましくはタンパク質又はペプチドである。本明細書において「抗体」とは、任意の抗体断片又は誘導体を含む意味で用いられ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'2、ＣＤＲ、ヒト化抗体、多機能抗体、単鎖抗体（ＳｃＦｖ）などの各種抗体を含む。また、本明細書において「タンパク質」とは、５１個以上のアミノ酸が結合された分子を指し、「ペプチド」とは、２個以上５０個以下のアミノ酸が結合して形成された分子を指す。タンパク質及びペプチドとしては疾患マーカー（例えば腫瘍マーカー）、シグナル伝達物質、ホルモン、サイトカイン等が挙げられるが、これらに限定されない。 The target molecule is a molecule that is specifically bound by an antibody, preferably a protein or peptide. As used herein, the term "antibody" is used to include any antibody fragment or derivative, and refers to various antibodies such as Fab, Fab '2 , CDR, humanized antibody, multifunctional antibody, and single chain antibody (ScFv). Including. Further, in the present specification, the “protein” refers to a molecule to which 51 or more amino acids are bound, and the “peptide” refers to a molecule formed by binding 2 to 50 amino acids. Examples of proteins and peptides include, but are not limited to, disease markers (eg, tumor markers), signal transduction substances, hormones, cytokines and the like.
例えば、標的分子及び抗体として、細胞表面に存在するタンパク質であるＨＥＲ２及びこれに特異的に結合する抗ＨＥＲ２抗体、細胞核に存在するエストロゲン受容体（ＥＲ）及びこれに特異的に結合する抗ＥＲ抗体等とすれば、測定結果を乳がんの指標として使用することができる。 For example, as target molecules and antibodies, HER2, which is a protein present on the cell surface, and an anti-HER2 antibody that specifically binds to the protein, an estrogen receptor (ER) present in the cell nucleus, and an anti-ER antibody that specifically binds to the protein. If so, the measurement result can be used as an index of breast cancer.
ナノ粒子は直径ナノオーダーの粒子であり、平均粒径は特に限定されないが、50〜800ｎｍ程度のものを用いることができる。ナノ粒子を構成する材料は特に限定されるものではなく、ポリスチレン樹脂、メラミン樹脂、及びポリ乳酸樹脂等の有機重合体樹脂、並びにシリカ等の無機材料等を挙げることができる。平均粒径とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めたものである。本願においては、20個の粒子の粒径の平均を平均粒径とする。 The nanoparticles are particles having a diameter of nano-order, and the average particle size is not particularly limited, but particles having a diameter of about 50 to 800 nm can be used. The material constituting the nanoparticles is not particularly limited, and examples thereof include organic polymer resins such as polystyrene resin, melamine resin, and polylactic acid resin, and inorganic materials such as silica. The average particle size is the diameter when an electron micrograph is taken using a scanning electron microscope (SEM), the cross-sectional area is measured for a sufficient number of particles, and the measured value is the area of the corresponding circle. It is calculated as the diameter. In the present application, the average particle size of 20 particles is taken as the average particle size.
標的分子に特異的に結合可能な第１の抗体は、標的分子の第１の部分と結合するように構成される。第１の抗体は、抗原エピトープとしての標的分子のアミノ酸配列の一部に基づき、周知の免疫学的手法により作製することができるし、標的分子に特異的な抗体が市販されている場合には、市販の抗体を使用してもよい。抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。 The first antibody that can specifically bind to the target molecule is configured to bind to the first portion of the target molecule. The first antibody can be prepared by a well-known immunological method based on a part of the amino acid sequence of the target molecule as an antigen epitope, and when an antibody specific to the target molecule is commercially available. , Commercially available antibodies may be used. The antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
ナノ粒子への第１の抗体の結合は、公知の方法を用いて行うことができる。例えば、米国特許第4326008号及び米国特許第5326692等を参照されたい。 Binding of the first antibody to the nanoparticles can be done using known methods. See, for example, U.S. Pat. No. 4,326,008 and U.S. Pat. No. 5,326,692.
第２の工程は、基材に、蛍光標識されると共に標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体と標的分子とを含有する水溶液を入れる工程からなる。 The second step comprises a step of putting an aqueous solution containing the second antibody and the target molecule, which are fluorescently labeled and capable of specifically binding to the target molecule, into the substrate.
蛍光標識されると共に標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体は、上記の標的分子の第１の部分とは異なる、標的分子の第２の部分と結合するように構成される。第２の抗体も、抗原エピトープとしての標的分子のアミノ酸配列の一部に基づき、周知の免疫学的手法により作製することができるし、標的分子に特異的な抗体が市販されている場合には、市販の抗体を使用してもよい。抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれであってもよい。抗体を蛍光物質で蛍光標識する方法は周知であり、また、市販の蛍光標識された抗体を使用してもよい。 The second antibody, which is fluorescently labeled and capable of specifically binding to the target molecule, is configured to bind to a second portion of the target molecule, which is different from the first portion of the target molecule described above. The second antibody can also be prepared by a well-known immunological method based on a part of the amino acid sequence of the target molecule as an antigen epitope, and when an antibody specific to the target molecule is commercially available. , Commercially available antibodies may be used. The antibody may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. Methods for fluorescently labeling an antibody with a fluorescent substance are well known, and a commercially available fluorescently labeled antibody may be used.
蛍光標識に用いられる蛍光物質としては、特に限定されるものでなく、タンパク質又はペプチドの標識に通常用いられている蛍光物質から適宜選択して用いることができる。 The fluorescent substance used for the fluorescent labeling is not particularly limited, and can be appropriately selected and used from the fluorescent substances usually used for labeling proteins or peptides.
蛍光物質としては、例えば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子、等の中から選択することができる。あるいはＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素分子、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素分子、ＤＹ系色素分子（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素分子、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素分子、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素分子、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素分子等の中から１つ又は複数を選択することができる。このような色素分子の総称は、化合物中の主要な構造又は登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光物質の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できる。 The fluorescent substance should be selected from, for example, a rhodamine dye molecule, a squarylium dye molecule, a cyanine dye molecule, an aromatic ring dye molecule, an oxazine dye molecule, a carbopyronine dye molecule, a pyromesene dye molecule, and the like. Can be done. Alternatively, Alexa Fluor (registered trademark, Invigen) dye molecule, BODIPY (registered trademark, Invigen) dye molecule, Cy (registered trademark, GE Healthcare) dye molecule, DY dye molecule (registered trademark). , DYOMICS), HiLite (registered trademark, Anaspec) dye molecule, DyLight (registered trademark, Thermoscientific) dye molecule, ATTO (registered trademark, ATTO-TEC) dye molecule , MFP (registered trademark, manufactured by Mobitec) and the like, one or more can be selected. Such dye molecules are generically named based on the main structure or registered trademark in the compound, and the range of fluorescent substances belonging to each can be appropriately grasped by those skilled in the art without undue trial and error. ..
好ましい蛍光物質としては、例えばＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアナート）、フルオレセイン、及びＴＭＲ（テトラメチルローダミン）からなる群から選択される少なくとも一つが挙げられるが、これらに限定されない。 Preferred fluorescent substances include, but are not limited to, at least one selected from the group consisting of, for example, FITC (fluorescein isothiocyanate), fluorescein, and TMR (tetramethylrhodamine).
水溶液は、溶媒としての水以外に、緩衝剤等の任意の物質を含有してもよい。例えば水溶液が緩衝液である場合、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸−クエン酸緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。 The aqueous solution may contain any substance such as a buffer, in addition to water as a solvent. For example, when the aqueous solution is a buffer solution, acetic acid buffer solution, phosphate buffer solution, citrate buffer solution, phosphate-citrate buffer solution, Tris buffer solution and the like can be mentioned.
蛍光標識されると共に標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体と標的分子とを同じ一つの水溶液に溶解し、予め第２の抗体と標的分子とを結合させてから、かかる水溶液を基材に入れる。このようにすることで、標的分子と第２の抗体とが予め結合しているため、後の蛍光強度の測定時に、蛍光標識の蛍光強度と標的分子の量が対応し、より正確に標的分子を定量することができる。 A second antibody and a target molecule that are fluorescently labeled and capable of specifically binding to a target molecule are dissolved in the same aqueous solution, the second antibody and the target molecule are previously bound to each other, and then the aqueous solution is used as a base. Put in the wood. By doing so, since the target molecule and the second antibody are bound in advance, the fluorescence intensity of the fluorescent label and the amount of the target molecule correspond to each other when the fluorescence intensity is measured later, and the target molecule becomes more accurate. Can be quantified.
標的分子（抗原）及び蛍光標識された第２の抗体の水溶液中の濃度は特に限定されないが、好ましくは標的分子の濃度が1ｐＭ〜100ｎＭ、蛍光標識された第２の抗体の濃度が標的分子濃度の1〜100倍、好ましくは数〜数十倍程度である。 The concentration of the target molecule (antigen) and the fluorescently labeled second antibody in the aqueous solution is not particularly limited, but preferably the concentration of the target molecule is 1 pM to 100 nM, and the concentration of the fluorescently labeled second antibody is the target molecule concentration. It is 1 to 100 times, preferably several to several tens of times.
なお、第１の工程と第２の工程は、第１の工程が第２の工程が先であってもよいし、後であってもよいし、同時であってもよい。第１の工程及び第２の工程により、第１の抗体、第２の抗体、及び標的分子は同一水溶液中に混合されて、基材内で液滴を形成する。 In the first step and the second step, the first step may be preceded by the second step, may be later, or may be simultaneous. By the first step and the second step, the first antibody, the second antibody, and the target molecule are mixed in the same aqueous solution to form droplets in the substrate.
第３の工程は、基材内において液滴の周囲に、界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相を入れ、液滴中の標的分子を濃縮する工程からなる。 The third step comprises a step of putting an organic phase containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved around the droplet in the substrate and concentrating the target molecule in the droplet.
本明細書において「液滴」（マイクロ水滴と称することもある）とは、界面を有する水溶液の滴を指す。本発明の方法では、一つの液滴毎の標的分子が検出される。液滴のサイズは通常、直径がマイクロオーダーであり、例えば1〜1000μｍ程度である。一つの液滴の形状は基材内の収容部の形状にもよるが、断面略円形状、断面略矩形状等であることができる。 As used herein, the term "droplet" (sometimes referred to as a microdroplet) refers to a drop of an aqueous solution having an interface. In the method of the present invention, the target molecule for each droplet is detected. The size of the droplet is usually on the micro order in diameter, for example, about 1 to 1000 μm. The shape of one droplet depends on the shape of the accommodating portion in the base material, but may have a substantially circular cross section, a substantially rectangular cross section, or the like.
有機溶媒に溶解される界面活性剤としては、イオン性界面活性剤及び非イオン性界面活性剤が挙げられ、イオン性界面活性剤としては、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤が挙げられる。 Examples of the surfactant dissolved in the organic solvent include an ionic surfactant and a nonionic surfactant, and examples of the ionic surfactant include an anionic surfactant, a cationic surfactant, and an amphoteric surfactant. Surfactants can be mentioned.
アニオン性界面活性剤としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、アルキル硫酸塩脂肪酸塩、脂肪酸塩、リン酸エステル塩、スルホコハク酸系活性剤、スルホサクシナメート系活性剤、ポリオキシアルキレンアルキルアミドエーテル硫酸塩、モノグリセライド硫酸塩、オレフィンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、アシル化イセチオン酸塩、アシル化アミノ酸塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルリン酸塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル酢酸塩等が挙げられる。 Examples of anionic surfactants include polyoxyethylene alkyl ether sulfate, alkyl sulfate fatty acid salt, fatty acid salt, phosphate ester salt, sulfosuccinic acid-based activator, sulfosuccinate-based activator, and polyoxyalkylene alkylamide ether. Examples thereof include sulfate, monoglyceride sulfate, olefin sulfonate, alkane sulfonate, acylated acetylate, acylated amino acid salt, polyoxyalkylene alkyl ether phosphate, polyoxyalkylene alkyl ether acetate and the like.
カチオン性界面活性剤としては、第４級アンモニウム塩が挙げられる。 Examples of the cationic surfactant include a quaternary ammonium salt.
両性界面活性剤としては、アミドベタイン系界面活性剤、アミドアミノ酸系界面活性剤、カルボベタイン系界面活性剤、スルホベタイン系界面活性剤、アミドスルホベタイン系界面活性剤、イミダゾリニウムベタイン系界面活性剤、ホスホベタイン系界面活性剤等が挙げられる。 Amphoteric surfactants include amide betaine-based surfactants, amide amino acid-based surfactants, carbobetaine-based surfactants, sulfobetaine-based surfactants, amide sulfobetaine-based surfactants, and imidazolinium betaine-based surfactants. Agents, phosphobetaine-based surfactants and the like can be mentioned.
非イオン性界面活性剤としては、アルキルポリグルコシド、ショ糖脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル、脂肪酸アルカノールアミド、アルキルアミンオキサイド、脂肪酸多価アルコールエステル等が挙げられる。
非イオン性界面活性剤の例としては、モノオレイン酸ソルビタンが挙げられるが、これらに限定されない。
Examples of the nonionic surfactant include alkyl polyglucosides, sucrose fatty acid esters, polyglycerin fatty acid esters, polyoxyalkylene alkyl ethers, fatty acid alkanolamides, alkylamine oxides, fatty acid polyhydric alcohol esters and the like.
Examples of nonionic surfactants include, but are not limited to, sorbitan monooleate.
有機溶媒としては、ケロシン、ハロゲン化炭素、常温（20℃）で液体の炭化水素等が挙げられるが、これらに限定されない。常温（20℃）で液体の炭化水素としては、シクロヘキサン、デカン、ヘキサデカン等が挙げられる。 Examples of the organic solvent include, but are not limited to, kerosene, carbon halide, and hydrocarbons that are liquid at room temperature (20 ° C.). Examples of hydrocarbons that are liquid at room temperature (20 ° C.) include cyclohexane, decane, and hexadecane.
第１の抗体、第２の抗体、及び標的分子を含有する液滴の周囲を、界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相で満たすと、該有機相中でかつ液滴の界面に複数の膨潤ミセル（ナノ液滴と称することもある）が生じる。膨潤ミセルのサイズは通常、直径がナノメートルオーダーであり、例えば1〜1000ｎｍ程度である。 When the periphery of the droplet containing the first antibody, the second antibody, and the target molecule is filled with an organic phase containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved, the interface of the droplet is in the organic phase. Multiple swollen micelles (sometimes referred to as nanodroplets) occur. The size of swollen micelles is usually on the order of nanometers in diameter, for example on the order of 1 to 1000 nm.
ここで、図１に示すように、基材内の液滴１（又はマイクロ水滴）には、標的分子２と、ナノ粒子４が結合されると共に標的分子２に特異的に結合可能な第１の抗体５（まとめてナノ粒子が結合された第１抗体３）と、蛍光物質７により蛍光標識されると共に標的分子２に特異的に結合可能な第２の抗体８（まとめて蛍光標識された第２の抗体６）とが液滴１中に含まれており、一部の蛍光標識された第２の抗体６は標的分子２に結合し、一部の蛍光標識された第２の抗体６は遊離の状態である。 Here, as shown in FIG. 1, the target molecule 2 and the nanoparticles 4 are bound to the droplet 1 (or micro-water droplet) in the substrate, and the first one capable of specifically binding to the target molecule 2. Antibody 5 (first antibody 3 to which nanoparticles are bound together) and second antibody 8 (collectively fluorescently labeled) which is fluorescently labeled with the fluorescent substance 7 and can specifically bind to the target molecule 2. A second antibody 6) is contained in the droplet 1, and a part of the fluorescently labeled second antibody 6 binds to the target molecule 2 and a part of the fluorescently labeled second antibody 6). Is in a free state.
本発明の液滴中の標的分子を濃縮するための方法によれば、標的分子２と結合した蛍光標識された第２の抗体６は、標的分子２が結合しているナノ粒子４のサイズが大きいために液滴１内に留まり図１Ａ）、標的分子２と結合していない、遊離すなわちフリーの蛍光標識された第２の抗体６は、界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相９で液滴１の周囲を覆うことにより、サイズが小さいために膨潤ミセル１０中に追い出される（図１Ｂ）。抗ＩｇＧ抗体のような分子量の大きなタンパク質を含む物質である遊離すなわちフリーの蛍光標識された第２の抗体６を液滴１から追い出せることは驚くべき知見である。 According to the method for concentrating the target molecule in the droplet of the present invention, the fluorescently labeled second antibody 6 bound to the target molecule 2 has the size of the nanoparticles 4 to which the target molecule 2 is bound. The free or free fluorescently labeled second antibody 6 that remains in the droplet 1 due to its size and is not bound to the target molecule 2 is an organic containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved. By covering the periphery of the droplet 1 with phase 9, it is expelled into the swollen micelle 10 due to its small size (FIG. 1B). It is a surprising finding that a free or free fluorescently labeled second antibody 6, which is a substance containing a large molecular weight protein such as an anti-IgG antibody, can be expelled from the droplet 1.
このように、本発明の方法によれば、抗体、逆ミセル抽出、及びナノ粒子を用いて、本発明の方法によれば、作製したすべてのマイクロ水滴で、標的分子がマイクロ水滴内に存在する条件でイムノアッセイができる。そのため、試料のロスがないか有意に少ない。また測定結果と試料の対応を取ることができる。さらに、濃縮された形で標的分子の試料を調製することができるため、従来よりも高感度な検出が可能である。このため、細胞、細菌、又はウイルスをマイクロ水滴に入れて、これらの内部で代謝分泌される標的分子を測定することが可能である。例えば、がん幹細胞等の希少な試料についても、一つの細胞レベルで、該細胞内の標的分子の測定が可能になると考えられる。 Thus, according to the method of the present invention, the target molecule is present in the micro-water droplet in all the micro-water droplets produced according to the method of the present invention using antibodies, reverse micelle extraction, and nanoparticles. Immunoassay can be performed under the conditions. Therefore, there is no or significantly less sample loss. Moreover, the correspondence between the measurement result and the sample can be taken. Furthermore, since a sample of the target molecule can be prepared in a concentrated form, detection with higher sensitivity than before is possible. Therefore, it is possible to put cells, bacteria, or viruses into micro-water droplets and measure the target molecules that are metabolized and secreted inside them. For example, even for a rare sample such as a cancer stem cell, it is considered that the target molecule in the cell can be measured at one cell level.
本発明は、液滴中の標的分子を検出するための方法であって、上記の液滴中の標的分子を濃縮するための方法において、濃縮された液滴の蛍光強度を測定する工程をさらに含む方法を包含する。 The present invention is a method for detecting a target molecule in a droplet, and in the above method for concentrating a target molecule in a droplet, a step of measuring the fluorescence intensity of the concentrated droplet is further added. Including methods to include.
液滴の蛍光強度は、蛍光顕微鏡等の市販の蛍光分析装置を用いることにより、液滴内に細胞が存在する場合はフローサイトメーターと市販の蛍光分析装置とを組み合わせることにより、測定することができる。 The fluorescence intensity of a droplet can be measured by using a commercially available fluorescence analyzer such as a fluorescence microscope, and when cells are present in the droplet, by combining a flow cytometer and a commercially available fluorescence analyzer. it can.
ここで、本発明の液滴中の標的分子を濃縮又は検出するための方法を実施するために使用される基材を備えたマイクロ流体デバイスの例を示す。図２に示すように、マイクロ流体デバイス１１は、基材としての平板状のプレート１２を備えている。プレート１２には、液滴１６を収容するための複数のウェル１３が設けられている。 Here are examples of microfluidic devices with substrates used to carry out methods for concentrating or detecting target molecules in droplets of the invention. As shown in FIG. 2, the microfluidic device 11 includes a flat plate 12 as a base material. The plate 12 is provided with a plurality of wells 13 for accommodating the droplet 16.
図３を参照すると、プレート１２の複数のウェル１３の下方には通路１５が設けられ、各ウェル１３の内部の収容空間１４は通路１５と連通している。ウェル１３の幅Ｗ1は好ましくは1〜1000μｍ、より好ましくは10〜1000μｍであり、高さＨ1は好ましくは1〜1000μｍ、より好ましくは10〜1000μｍである。複数のウェル１３の下方に設けられた通路１５の高さＨ2は好ましくは1〜1000μｍ、より好ましくは10〜1000μｍである。なお、図３ではウェル１３の下方に通路１５が設けられているが、通路１５はウェルの上方に設けられてもよい。 Referring to FIG. 3, a passage 15 is provided below the plurality of wells 13 of the plate 12, and the accommodation space 14 inside each well 13 communicates with the passage 15. The width W 1 of the well 13 is preferably 1 to 1000 μm, more preferably 10 to 1000 μm, and the height H 1 is preferably 1 to 1000 μm, more preferably 10 to 1000 μm. The height H 2 of the passage 15 provided below the plurality of wells 13 is preferably 1 to 1000 μm, more preferably 10 to 1000 μm. Although the passage 15 is provided below the well 13 in FIG. 3, the passage 15 may be provided above the well.
本発明の液滴中の標的分子を濃縮又は検出するための方法において、プレート１２の複数のウェル１３内の各々に、ナノ粒子、第２の抗体、及び標的分子を含有する液滴１６が形成された後、界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相１８を収容する注射器１７からチューブ１９を介して有機相１８をプレート１２に送り、プレート内の通路１５を満たすことにより、液滴１６の周囲が有機相１８で覆われ、液滴１６中の標的分子が濃縮される。有機相１８はチューブ１９が接続されている通路１５の端部とは反対側の端部に接続されたチューブ２０を介して流出される。 In the method for concentrating or detecting a target molecule in a droplet of the present invention, a droplet 16 containing a nanoparticle, a second antibody, and a target molecule is formed in each of the plurality of wells 13 of the plate 12. After that, the liquid is sent from the injector 17 containing the organic phase 18 containing the organic solvent in which the surfactant is dissolved to the plate 12 via the tube 19 to fill the passage 15 in the plate. The periphery of the droplet 16 is covered with the organic phase 18, and the target molecule in the droplet 16 is concentrated. The organic phase 18 flows out through the tube 20 connected to the end opposite to the end of the passage 15 to which the tube 19 is connected.
本発明は、液滴中の標的分子を検出するためのキットであって、ナノ粒子されると共に標的分子と結合可能な第１の抗体と、蛍光標識されると共に標的分子と結合可能な第２の抗体と、第１の抗体及び第２の抗体を収容するための基材と、界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相とを備えたキットを包含する。第１の抗体、第２の抗体、基材、及び有機相については、上記の本発明の液滴中の標的分子を濃縮するための方法に関して上述した通りである。 The present invention is a kit for detecting a target molecule in a droplet, wherein the first antibody is nanoparticulate and can bind to the target molecule, and the second antibody is fluorescently labeled and can bind to the target molecule. Includes a kit comprising the antibody of the above, a substrate for accommodating the first antibody and the second antibody, and an organic phase containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved. The first antibody, the second antibody, the substrate, and the organic phase are as described above with respect to the above method for concentrating the target molecule in the droplet of the present invention.
このような構成のキットを用いることにより、液滴中の標的分子を基材に入れて、液滴中で特異的かつ高感度に標的分子を測定することができる。測定は、定性的測定のみならず、定量的測定も行うことができる。 By using the kit having such a structure, the target molecule in the droplet can be put into the base material, and the target molecule can be measured specifically and with high sensitivity in the droplet. The measurement can be performed not only as a qualitative measurement but also as a quantitative measurement.
本発明の方法及びキットは、貴重な微量サンプル（薬剤候補）を用いたスクリーニング及び解析を行ったり、ライフサイエンス分野において不均一性の高い細胞群（例：がん組織）の一つ一つの細胞の個性を調べたり（例：ガン幹細胞が分泌する特徴的なタンパク質の有無等）、微生物群（例；腸内フローラ、土壌の難培養性微生物等）の解析を行う等の種々の用途に使用することができる。 The method and kit of the present invention perform screening and analysis using a valuable trace sample (drug candidate), and each cell of a cell group (eg, cancer tissue) having high heterogeneity in the field of life science. Used for various purposes such as investigating the individuality of (eg, presence or absence of characteristic proteins secreted by cancer stem cells, etc.) and analyzing microbial groups (eg, intestinal flora, difficult-to-culture microorganisms in soil, etc.) can do.
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.
実施例１ 無細胞系におけるタンパク質の定量
（１）マイクロデバイスの作製
１．鋳型作製
フォトレジスト（KMPR-1035）を用いて、シリコンウェハ上に幅3mm高さ20μmの流路と、幅100μm高さ15μmのウェルを作成するための鋳型を作製した。
Example 1 Quantification of proteins in a cell-free system (1) Preparation of microdevices 1. Mold Preparation Using a photoresist (KMPR-1035), a mold was prepared on a silicon wafer to prepare a flow path with a width of 3 mm and a height of 20 μm and a well with a width of 100 μm and a height of 15 μm.
２．デバイス作製
2-1.ポリジメチルシロキサン（PDMS）と硬化剤（商品名：Silpot 184）を7:1の比率で混合し、鋳型に流し込み、75℃で1時間加熱しPDMSを硬化させ、その後、鋳型からPDMSを剥離した。
2-2.スライドガラスにPDMSと硬化剤を7:1で混合したものを塗布し、75℃で1時間加熱しPDMSを硬化させた。
2-3.2-1と2-2のPDMS面をプラズマ処理し、接合した。これにより、幅3 mm 高さ15μm の直線流路の上面に、幅100μm、高さ15μm のマイクロウェルが216個あるマイクロ流体デバイスを作製した。
2. Device fabrication
2-1. Polydimethylsiloxane (PDMS) and curing agent (trade name: Silpot 184) are mixed at a ratio of 7: 1, poured into a mold, heated at 75 ° C. for 1 hour to cure PDMS, and then from the mold. PDMS was peeled off.
2-2. A mixture of PDMS and a curing agent at a ratio of 7: 1 was applied to a slide glass, and the PDMS was cured by heating at 75 ° C. for 1 hour.
The PDMS surfaces of 2-3.2-1 and 2-2 were plasma treated and joined. As a result, a microfluidic device having 216 microwells with a width of 100 μm and a height of 15 μm was prepared on the upper surface of a linear flow path with a width of 3 mm and a height of 15 μm.
（２）試料調製
１．抗体付きナノ粒子の調製
アビジンで修飾した50nmのポリスチレン粒子（micromod社にて特注）に、ビオチン修飾した抗ウサギIgG抗体（ヤギ、ポリクローナル）を粒子表面とのアビジン量の4倍量混合した。粒子濃度が5mg/mLとなるようにリン酸バッファーを加え、1時間以上静置した。
(2) Sample preparation 1. Preparation of Nanoparticles with Antibody Biotin-modified anti-rabbit IgG antibody (goat, polyclonal) was mixed with avidin-modified 50 nm polystyrene particles (custom-made by micromod) in an amount four times the amount of avidin on the particle surface. Phosphate buffer was added so that the particle concentration became 5 mg / mL, and the mixture was allowed to stand for 1 hour or longer.
２．抗原入り試料の調製
抗原としてウサギIgGを、蛍光標識として40μg/mLテトラメチルローダミン標識抗ウサギIgG抗体（ヤギ、ポリクローナル、以下TR-IgG）を用いた。抗原及び蛍光標識抗ウサギIgG抗体を溶解させる溶液として、Abcam社のCell Lysis buffer(ab152163)を用いた。溶液のpHはリン酸バッファーを用いてpH7.6とした。以下の表１の割合で成分を混合し、1時間以上室温で静置し、試料溶液を得た。
2. Preparation of Antigen-Containing Sample Rabbit IgG was used as an antigen, and 40 μg / mL tetramethylrhodamine-labeled anti-rabbit IgG antibody (goat, polyclonal, hereinafter TR-IgG) was used as a fluorescent label. Abcam's Cell Lysis buffer (ab152163) was used as a solution for dissolving the antigen and fluorescently labeled anti-rabbit IgG antibody. The pH of the solution was adjusted to pH 7.6 using phosphate buffer. The components were mixed at the ratios shown in Table 1 below and allowed to stand at room temperature for 1 hour or longer to obtain a sample solution.
（３）有機相の調製
Span80 133mM、ビスエチルヘキシルホスフェート（BEHP、アニオン性のリン酸系界面活性剤）67mMのヘキサデカン溶液を調製した。
(3) Preparation of organic phase
A hexadecane solution of Span80 133 mM and bisethylhexyl phosphate (BEHP, anionic phosphate-based surfactant) 67 mM was prepared.
（４）実験操作
1.アセトンをデバイスに満たし、75℃で加熱し、水を入れた。
2.上記（２）の試料溶液をデバイスに入れた。
3.ヘキサデカンをデバイスに入れた。
4.上記（３）で調製した有機相をシリンジポンプを用いて0.2μL/minで流すことで、各マイクロウェルに一つずつマイクロ水滴を作成した。その後2μL/minで流した。
5.4でマイクロ水滴を30分間蛍光顕微観察し、マイクロ水滴1つの蛍光強度の面積分をImage Jにて計測した。
6.蛍光強度の面積分が時間変化しなくなったところで、その値を抗原濃度についてプロットし、検量線を得た（図４（Ａ），（Ｂ））。
（結果）
マイクロ水滴周囲にSpan80とBEHPとを含む有機相を流すことで、自然乳化によりナノメートルサイズの水滴（ナノ水滴）がマイクロ水滴界面で生成し、マイクロ水滴が縮小した。 その際、TR-IgG は 97%がナノ水滴へと出て行くことが明らかとなった。界面活性剤として Span 80 又は BEHP のどちらか一方のみを入れた場合はTR-IgGはマイクロ水滴内 に留まり、濃縮されることがわかった（データ非図示）。BEHP による TR-IgG 表面の疎水化と、Span 80によるナノ水滴生成が、TR-IgG のナノ水滴への分配挙動に寄与していると考えられる。
(4) Experimental operation
1. The device was filled with acetone, heated at 75 ° C and filled with water.
2. The sample solution of (2) above was placed in the device.
3. Hexadecane was placed in the device.
4. The organic phase prepared in (3) above was flowed at 0.2 μL / min using a syringe pump to prepare one micro water droplet in each micro well. Then, it was flowed at 2 μL / min.
In 5.4, microscopic water droplets were observed by fluorescence microscopic observation for 30 minutes, and the surface integral of the fluorescence intensity of one microwater droplet was measured by Image J.
6. When the surface integral of the fluorescence intensity did not change with time, the value was plotted for the antigen concentration to obtain a calibration curve (FIGS. 4 (A) and 4 (B)).
(result)
By flowing an organic phase containing Span80 and BEHP around the micro-water droplets, nanometer-sized water droplets (nano-water droplets) were generated at the micro-water droplet interface by natural emulsification, and the micro-water droplets shrank. At that time, it became clear that 97% of TR-IgG goes out to nano-water droplets. It was found that when only Span 80 or BEHP was added as a surfactant, TR-IgG remained in the micro-water droplets and was concentrated (data not shown). It is considered that the hydrophobization of the TR-IgG surface by BEHP and the generation of nano-droplets by Span 80 contribute to the distribution behavior of TR-IgG into nano-droplets.
１，１６…液滴、２…標的分子、３…ナノ粒子が結合されると共に標的分子に特異的に結合可能な第１の抗体、４…ナノ粒子、５…第１の抗体、６…蛍光標識されると共に標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体、８…第２の抗体、９…界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相、１０…膨潤ミセル、１２…基材としてのプレート、１３…ウェル、１４…通路。 1,16 ... Droplets, 2 ... Target molecules, 3 ... Nanoparticles are bound and a first antibody that can specifically bind to the target molecule, 4 ... Nanoparticles, 5 ... First antibody, 6 ... Fluorescent A second antibody that is labeled and capable of specifically binding to the target molecule, 8 ... second antibody, 9 ... organic phase containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved, 10 ... swollen micelles, 12 ... groups. Plates as materials, 13 ... wells, 14 ... passages.
Claims (9)
基材に、ナノ粒子が結合されると共に標的分子に特異的に結合可能な第１の抗体を入れる工程と、
基材に、蛍光標識されると共に標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体と標的分子とを含有する水溶液を入れる工程と、
前記第１の抗体を入れる工程と前記第２の抗体と標的分子とを含有する水溶液を入れる工程とにより、前記第１の抗体、前記第２の抗体、及び前記標的分子を含有する液滴が形成されることと、
前記基材内において前記液滴の周囲に、界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相を入れ、液滴中の標的分子を濃縮する工程と
を含む方法。 A method for concentrating target molecules in droplets
A step of inserting a first antibody into which the nanoparticles are bound and which can be specifically bound to the target molecule, and
A step of adding an aqueous solution containing a second antibody and a target molecule that are fluorescently labeled and capable of specifically binding to the target molecule to the base material.
By the step of adding the first antibody and the step of adding an aqueous solution containing the second antibody and the target molecule, the first antibody, the second antibody, and the droplet containing the target molecule are produced. To be formed and
A method including a step of putting an organic phase containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved around the droplet in the substrate and concentrating the target molecule in the droplet.
基材に、ナノ粒子が結合されると共に標的分子に特異的に結合可能な第１の抗体を入れる工程と、
基材に、蛍光標識されると共に標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体と標的分子とを含有する水溶液を入れる工程と、
前記第１の抗体を入れる工程と前記第２の抗体と標的分子とを含有する水溶液を入れる工程とにより、前記第１の抗体、前記第２の抗体、及び前記標的分子を含有する液滴が形成されることと、
前記基材内において前記液滴の周囲に、界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相を入れ、液滴中の標的分子を濃縮する工程と
前記濃縮された液滴の蛍光強度を測定する工程と
を含む方法。 A method for detecting target molecules in droplets,
A step of inserting a first antibody into which the nanoparticles are bound and which can be specifically bound to the target molecule, and
A step of adding an aqueous solution containing a second antibody and a target molecule that are fluorescently labeled and capable of specifically binding to the target molecule to the base material.
By the step of adding the first antibody and the step of adding an aqueous solution containing the second antibody and the target molecule, the first antibody, the second antibody, and the droplet containing the target molecule are produced. To be formed and
In the substrate, an organic phase containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved is placed around the droplet to concentrate the target molecule in the droplet, and the fluorescence intensity of the concentrated droplet is adjusted. A method including a step of measuring.
ナノ粒子が結合されると共に前記標的分子に特異的に結合可能な第１の抗体と、
蛍光標識されると共に前記標的分子に特異的に結合可能な第２の抗体と、
前記第１の抗体及び前記第２の抗体を収容するための基材と、
界面活性剤を溶解させた有機溶媒を含有する有機相と、
を備えたキット。 A kit for detecting target molecules in droplets
A first antibody to which nanoparticles can be bound and can specifically bind to the target molecule,
A second antibody that is fluorescently labeled and capable of specifically binding to the target molecule,
A base material for accommodating the first antibody and the second antibody, and
An organic phase containing an organic solvent in which a surfactant is dissolved,
Kit with.
The kit according to claim 7 or 8, wherein the fluorescent label is at least one selected from the group consisting of FITC (fluorescein isothiocyanate), fluorescein, and TMR (tetramethylrhodamine).
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