JP6841409B2 - 整腸剤、抗アレルギー剤、免疫増強剤、乳酸菌の腸管接着性向上剤 - Google Patents
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Description
人の免疫システムは複数種のT細胞が司令塔の役割を果たしている。T細胞としては、主としてIgA抗体産生を促し細胞性免疫を活性化させるTh1細胞と、I型アレルギーを引き起こすIgE抗体産生を促進させて液性免疫を活性化させるTh2細胞とが知られている。このTh1細胞とTh2細胞とはお互いに抑制しあい、Th1細胞よりTh2細胞が優位に働くとアレルギー症状がおこりやすい。
腸管には体内の免疫細胞の7割が集中して存在しているとされ、体の免疫システムの主要な役割を果たしている。この腸管免疫に乳酸菌が重要な働きをすることが解明されてきている。例えば乳酸菌の菌体成分は、腸管においてマクロファージや樹状細胞のサイトカイン分泌を促進し、これによりTh1細胞の働きを活発化することや、IgA抗体産生を促すことが知られている。これによりTh2細胞の働きが抑制されてIgE抗体産生が抑制され、アレルギーが改善されると考えられている。乳酸菌(及びその菌体成分)の腸管への接着は、このような腸管免疫刺激作用やそれに伴う抗アレルギー作用を高めるためにも非常に重要と考えられている。
本発明は、ミソハギ科(Lythraceae)、キク科(Asteraceae)、マメ科(Fabaceae)、バラ科(Rosaceae)又はアヤメ科(Iridaceae)の花を用いることにより乳酸菌の腸管接着性を効果的に高めることができる。
またキクは、キク科キク属(Chrysanthemum)の植物である。キクとしては、キク科キク属のキク(学名:Chrysanthemum morifolium Ramatulle)又はシマカンギク(学名:Chrysanthemum indicum Linne)が好ましく挙げられる。
サクラは、バラ科サクラ属の植物のうち、ウメ、モモ、アンズなどを除いた総称であり、一般にはサクラ亜属 (Subgen. Cerasus) に属する植物を言う。
モモはバラ科モモ属に属し、学名はPrunus persica BatschまたはPrunus persica Batsch var. davidiana Maximowiczという。モモの品種としては、例えば、ハクトウ(白桃)、オウトウ(黄桃)、ネクタリンなどが挙げられる。
バラは、バラ科バラ属(Rosa)の植物を言う。
Bifidobacterium属としては、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium infantis、Bifidobacterium lactis、Bifidobacterium longum、Bifidobacterium adolescentis、Bifidobacterium mongolienseが挙げられる。
Lactbacillus属としては、Lactbacillus brevis、Lactbacillus gasseri、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus bulgaricus、Lactobacillus delburvecki、Lactobacillus casei、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus halivaticus、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacilus paracasei、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sporogenes、Lactobacillus sakei、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus fermentumが挙げられる。
Enterococcusとしては、Enterococcus faecalis(Streptococcus faecalis と称されることもある)、Enterococcus faesium(Streptococcus faesiumと称されることもある)、Streptococcus thermophilus、Lactococcus lactis(Streptococcus lactisと称されることもある) が挙げられる。
Leuconostoc属としては、Leuconostoc mesenteroides、Leuconostoc oenos が挙げられる。
Pediococcus属としては、Pediococcus acidilactici、Pediococcus pentosaceusが挙げられる。
Staphylococcus属としては、Staphylococcus carnosus、Staphylococcus xylosusが挙げられる。
Tetragenococcus属としては、Tetragenococcus halophilusが挙げられる。Bacillus属としては、Bacillus coagulans、及びBacillus mesentericusなどが挙げられる。
とりわけ、Bacillus coagulans、Enterococcus faecalis、Bifidobacterium bifidum、Enterococcus faesium、Lactobacillus acidophilusが好ましい。これらは、1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
このため、本発明の剤はこれを経口摂取することで、腸管における乳酸菌の作用を高めることができ、例えば整腸剤として用いることができる。本発明において、整腸作用とは、有益腸内細菌(乳酸菌を含む)の増殖を促進する作用及び/又は有害腸内細菌の増殖を抑制する作用を意味する。例えば、特許文献1に記載された、モモの花による瀉下作用及びこれを用いた抗便秘作用は、本発明でいう整腸作用に含まれない。また例えば、PPAR活性化によりもたらされる抗炎症作用は本発明でいう整腸作用に含まれない。
(被験物質)
特定の花の抽出物として、以下の粉末を用いた。
・ベニバナ:ベニバナの花を水で抽出して得られた、市販の抽出物の粉末
・クズ:クズの花を熱水で抽出して得られた、市販の抽出物粉末
・バラ:バラの花びらを熱水で抽出して得られた、市販の抽出物粉末
・ザクロ:ザクロの花を含水エタノールで抽出して得られた、市販の抽出物粉末
・サクラ:サクラの花を含水エタノールで抽出して得られた、市販の抽出物粉末
・キク:キクの花を水で抽出して得られた、市販の抽出物粉末
・サフラン:サフランのめしべを含水エタノールで抽出して得られた、市販の抽出物の粉末
・モモ:白桃の花を熱水で抽出して得られた、市販の抽出物粉末
(1)ヒト結腸癌由来細胞Caco-2の培養および播種
(1−1)Passage 20の腸管上皮細胞株Caco-2細胞を用いた。
(1−2)トリプシン処理により浮遊させたCaco-2細胞を、75cm2フラスコから96 well plateに4.0×104/wellの細胞密度で播種した。
(1−3)培養培地を用い、37℃、5体積%CO2インキュベーター内で4日間培養した。この通常培地は、DMEMを10% FBS (Fatal Bovin Serum)、1%ペニシリン−ストレプトマイシン、1% NEAA(Non-Essential Amino Acids、SIGMA社)になるように調製した。この培養によりwell内でcaco-2の単層膜(腸管モデル)を作成した。
(1−4)(5)の試験の数時間前に試験培地に置換した。試験培地は、DMEMを2% FBS、1% NEAAになるように調製した。
(2−1)粉体状の乳酸菌Bacillus coagulansをMRS液体培地にて72時間、37℃で培養した。
(2−2)培養液を採取し、グリセロールが30%になるように培養液を混ぜ、試験を行うまで-80℃で保存した(グリセロールストック)。
(2−3)B.coagulansのグリセロールストックを室温に戻し、37℃で温めたMRS液体培地へ播種し、同温で24時間培養後に下記(3)の蛍光標識及び(4)の検量線用サンプルの作製に用いた。
(3−1)B. coagulans菌を(2)で前培養した後の菌液100μL採取し、900mLのリン酸緩衝生理食塩液(PBS)へ懸濁、1000g×3分間遠心分離した。得られたペレットを1000μL PBSへ懸濁し、15μL carboxyfluorescein diacetate(CFDA、同仁化学研究所社製)を加え、30分間遮光、室温でインキュベートした。
(3−2)1000g×3分間遠心分離し、ペレットを1mL PBSで懸濁し、再度1000gx3分間遠心分離した。この操作を2回行った。
(3−3)ペレットを試験培地で懸濁し、得られた懸濁物を下記(5)の試験に用いた。
(4−1)上記(3−1)で蛍光標識した乳酸菌の一部をホルマリン固定した。
(4−2)同じ前培養したサンプルをBCP培地にて37℃、3日間培養し、BCP培地上のコロニー数を測定した(plate count)。
(4−3)plate countから細菌数を計算し、(4−1)でホルマリン固定したサンプルを既知数サンプルとして検量線用サンプルとした。
(5−1)下記表1の被験物質である 花抽出物粉末10mg量り取り、50mLファルコンチューブに入れ、1mg/mLになるように試験培地を加えた。ボルテックス後、各被験物質の最終濃度が下記表1の濃度となるように試験培地で希釈した。
(5−2)(5−1)において被験物質含有又は非含有の試験培地へ菌数を1x108/mLに調整した菌懸濁液を加え、B. coagulans濃度1x106/mLとした。(1−4)の細胞に1well当たり100μLとなる量で添加し(B. coagulans最終濃度1x105/well)、2時間37℃で培養した。なお比較例1では、被験物質非含有の試験培地を同量添加した。
(5−3) 培養終了後、各wellに150μL ホルマリン液を加え、4℃で30分以上固定した。
(5−4) PBSでwellを2回洗浄し、varioskanにて蛍光強度(励起光495nm、蛍光515nm)を測定した。
(5−5) (4−3)の検量線用サンプルをvarioskanにて蛍光強度を測定することで検量線を作成した。得られた検量線に基づき、(5−4)で測定した蛍光強度からCaco-2単層膜へ接着したB. coagulansの菌数を計算した。
(5−6)
得られた菌数の比較例1に対する相対値(%)を図1及び図2に示す。
Claims (2)
- ザクロの花の抽出物を含有する整腸剤(ただし、潰瘍性大腸炎の炎症の減少のために用いる整腸剤を除く)。
- ザクロの花の抽出物を含有する乳酸菌の腸管接着促進剤。
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JP2016200019A JP6841409B2 (ja) | 2016-10-11 | 2016-10-11 | 整腸剤、抗アレルギー剤、免疫増強剤、乳酸菌の腸管接着性向上剤 |
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