JP6834164B2 - How to maintain the detection sensitivity of PCR reaction solution - Google Patents
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Description
本発明は、核酸増幅の分野に関する。さらに詳しくは、PCR反応溶液中のオリゴヌクレオチドプライマー(プライマー)の分解を抑制することで、標的核酸の検出感度を維持しながら保存時間をのばす方法に関する。 The present invention relates to the field of nucleic acid amplification. More specifically, the present invention relates to a method of extending the storage time while maintaining the detection sensitivity of the target nucleic acid by suppressing the decomposition of the oligonucleotide primer (primer) in the PCR reaction solution.
DNAポリメラーゼを用いた鋳型核酸からのDNAの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。 The synthesis of DNA from a template nucleic acid using DNA polymerase is used and applied to various methods such as sequencing method and nucleic acid amplification method in the field of molecular biology. Among them, the nucleic acid amplification method has already been put into practical use not only in the research field but also in the forensic field such as genetic diagnosis and paternity testing, or in the microbiological examination in foods and the environment.
中でも、DNAの特異的配列の増幅に用いられるPCR法は、研究分野から応用分野に至るまで極めて幅広く普及している技術である。現在、PCR法は更なる開発が行われており、複数のプライマーを同時に増幅するMultiplexPCR法や、蛍光色素を用いて、PCRの増幅産物をリアルタイムで検出するリアルタイムPCR法など、様々な技術が存在する。これらの技術も、研究分野のみならず、法医学分野や食品、環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。 Among them, the PCR method used for amplifying a specific sequence of DNA is an extremely widespread technique from research fields to application fields. Currently, the PCR method is being further developed, and there are various technologies such as the Multiplex PCR method that simultaneously amplifies multiple primers and the real-time PCR method that detects the amplification product of PCR in real time using a fluorescent dye. To do. These technologies have already been put into practical use not only in research fields but also in forensic fields, foods, and microbial tests in the environment.
PCR法による遺伝子増幅方法は、標的核酸、4種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、少なくとも一対のプライマーセット及びDNAポリメラーゼの存在下で、変性、アニーリング、伸長からなるサイクルを20〜50サイクル繰り返すことにより、上記一対のプライマーセットで挟まれる標的核酸の領域を指数関数的に増幅させる方法である。 The gene amplification method by the PCR method is performed by repeating a cycle consisting of denaturation, annealing, and elongation in the presence of a target nucleic acid, four types of deoxynucleoside triphosphates, at least a pair of primer sets, and a DNA polymerase for 20 to 50 cycles. This is a method of exponentially amplifying the region of the target nucleic acid sandwiched between the pair of primer sets.
PCR法には、一対のプライマーで挟まれる標的核酸の領域を増幅することで、目的とする遺伝子配列を増幅できる特徴がある反面、プライマーが目的としない誤った配列にハイブリダイズしてしまった場合(プライマーのミスマッチアニーリング)においても、目的としない配列の増幅が起こり、非特異的増幅が生じるという欠点がある。また、PCR中にプライマー同士が会合することで、プライマーダイマーが生じ、これが鋳型DNAとして働いて、非特異的増幅産物が作られてしまうという欠点がある。そのため、PCRにおける課題は、非特異的増幅がなく目的産物のみを増幅させることにある。 The PCR method has the characteristic that the target gene sequence can be amplified by amplifying the region of the target nucleic acid sandwiched between the pair of primers, but when the primer hybridizes to an incorrect sequence that is not the target. (Primer mismatch annealing) also has a drawback that unintended sequence amplification occurs and non-specific amplification occurs. In addition, the association of primers with each other during PCR causes a primer dimer, which acts as a template DNA to produce a non-specific amplification product. Therefore, the problem in PCR is to amplify only the target product without non-specific amplification.
非特異的増幅を低減させる代表的な方法として、抗体を利用したホットスタート法が挙げられる。ホットスタート法では中和抗体によりDNAポリメラーゼのポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性を阻害することで、サイクル前のミスマッチアニーリングやプライマーダイマ―に起因する非特異的増幅を低減する手法である。しかし、係る方法は、非特異的増幅の抑制に効果が十分でないことや、特異的な増幅までも抑制してしまったりすることが多い。 A typical method for reducing non-specific amplification is a hot start method using an antibody. The hot start method is a method of reducing non-specific amplification caused by pre-cycle mismatch annealing and primer dimer by inhibiting the polymerase activity and exonuclease activity of DNA polymerase with a neutralizing antibody. However, such a method is often not sufficiently effective in suppressing non-specific amplification, or even suppresses specific amplification.
さらに、プライマーとDNAポリメラーゼおよびマグネシウムイオンを同一溶液中に含むと、DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によりプライマーの分解が発生する。そのような場合、プライマーの特異性が下がり、プライマーダイマ―に起因する非特異的増幅が発生し、結果として標的核酸の検出感度を下げる原因となる。そのため、DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を抑制するため、PCR反応溶液の調製は常に氷上にて行う必要があり、PCR反応溶液調製後はすみやかにPCR反応を行わなければならないという課題が存在していた。臨床検査の現場などからは、こうした課題を解消し、PCR反応溶液を室温で一定時間静置させたいという強いニーズが存在している。 Furthermore, when the primer, DNA polymerase, and magnesium ion are contained in the same solution, degradation of the primer occurs due to the exonuclease activity of the DNA polymerase. In such a case, the specificity of the primer is lowered, non-specific amplification due to the primer dimer occurs, and as a result, the detection sensitivity of the target nucleic acid is lowered. Therefore, in order to suppress the exonuclease activity of DNA polymerase, it is necessary to always prepare the PCR reaction solution on ice, and there is a problem that the PCR reaction must be carried out promptly after the preparation of the PCR reaction solution. .. From the field of clinical examination, there is a strong need to solve these problems and allow the PCR reaction solution to stand at room temperature for a certain period of time.
このように、室温(本発明においては、20℃から30℃までの温度をいう。)で、プライマーとDNAポリメラーゼおよびマグネシウムイオンを含むPCR反応溶液の調製が可能であり、また、調製したPCR反応溶液を室温にて一定時間以上静置後にも、標的核酸を感度よく検出する方法が求められていた。 As described above, it is possible to prepare a PCR reaction solution containing a primer, DNA polymerase and magnesium ion at room temperature (in the present invention, it means a temperature from 20 ° C. to 30 ° C.), and the prepared PCR reaction. There has been a demand for a method for sensitively detecting a target nucleic acid even after the solution has been allowed to stand at room temperature for a certain period of time or longer.
上記のような事情を背景として、プライマーとDNAポリメラーゼおよびマグネシウムイオンを含む溶液にて、プライマーの分解を抑制することで室温でPCR反応溶液を調製することができ、さらに、調製したPCR反応溶液を室温にて一定時間以上静置後にも、標的核酸を特異性高く検出する方法を提供することを課題とする。 Against the background of the above circumstances, a PCR reaction solution can be prepared at room temperature by suppressing the decomposition of the primer with a solution containing the primer, DNA polymerase and magnesium ion, and further, the prepared PCR reaction solution can be prepared. An object of the present invention is to provide a method for detecting a target nucleic acid with high specificity even after standing at room temperature for a certain period of time or longer.
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究の結果、エキソヌクレアーゼ活性を有しないDNAポリメラーゼを使用することで、非特異増的幅産物の発生を抑制できること、そして、さらに、該DNAポリメラーゼを用いることでマグネシウムイオンとプライマー共存下でも、プライマーダイマ―の形成を抑制できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 In view of the above circumstances, as a result of diligent research, the present inventors can suppress the generation of non-specific increasing width products by using a DNA polymerase having no exonuclease activity, and further, the DNA polymerase can be used. We have found that by using it, the formation of a primer dimer can be suppressed even in the coexistence of magnesium ion and a primer, and have completed the present invention.
すなわち、本発明は以下のような構成からなる。
項1.以下の(a)〜(d)の工程を含むことを特徴とする2種類以上の標的核酸を増幅することにより検出する方法。
(a) 核酸中の標的領域を増幅するための2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を持たないDNAポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを含むPCR反応溶液を調製する工程、
(b) 該PCR反応溶液に試料を混合する工程、
(c) 該PCR反応により増幅する工程、及び、
(d) 標的領域の増幅産物を示すシグナルを検出する工程
項2.前記(a)のPCR反応溶液が2mM以上のマグネシウムイオンを含むことを特徴とする項1に記載の方法。
項3.前記(a)のPCR反応溶中液に、さらにインターカレーターを含むことを特徴とする項1又は2に記載の方法。
項4.前記(a)のPCR反応溶液の調製工程を20℃から30℃の温度条件下にて行うことを特徴とする項1から3のいずれかに記載の方法。
項5.調製後の前記(a)のPCR反応溶液を20℃から30℃の温度条件下にて4時間静置後に、前記(b)〜(d)の工程を実施した際に得られる標的核酸由来のシグナルが、前記(a)の調製後10分以内のPCR反応溶液を使用し、前記(b)〜(d)の工程を実施した際に得られる標的核酸由来のシグナルと比較して30%以上残存していることを特徴とする項1から4のいずれかに記載の方法。
項6.試料に含まれる標的核酸を増幅し、検出するための核酸増幅用キットであって、該核酸の標的領域を増幅するための少なくとも2種類以上のオリゴヌクレオチドプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を有しないDNAポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを同一溶液中に含むことを特徴とする核酸増幅用キット。
That is, the present invention has the following configuration.
Item 1. A method for detecting by amplifying two or more types of target nucleic acids, which comprises the following steps (a) to (d).
(A) A step of preparing a PCR reaction solution containing two or more kinds of oligonucleotide primer sets for amplifying a target region in a nucleic acid, a DNA polymerase having no exonuclease activity, and magnesium ions.
(B) Step of mixing the sample with the PCR reaction solution,
(C) Amplification by the PCR reaction and
(D) Step 2. Detecting a signal indicating an amplification product in the target region. Item 2. The method according to Item 1, wherein the PCR reaction solution of (a) contains magnesium ions of 2 mM or more.
Item 3. Item 2. The method according to Item 1 or 2, wherein the PCR reaction solution according to (a) further contains an intercalator.
Item 4. Item 2. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the step of preparing the PCR reaction solution of (a) is carried out under a temperature condition of 20 ° C. to 30 ° C.
Item 5. The PCR reaction solution of (a) after preparation is allowed to stand for 4 hours under a temperature condition of 20 ° C. to 30 ° C., and is derived from the target nucleic acid obtained when the steps (b) to (d) are carried out. The signal is 30% or more as compared with the signal derived from the target nucleic acid obtained when the PCR reaction solution within 10 minutes after the preparation of (a) is used and the steps (b) to (d) are carried out. Item 4. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the method remains.
Item 6. A nucleic acid amplification kit for amplifying and detecting a target nucleic acid contained in a sample, at least two kinds of oligonucleotide primer sets for amplifying a target region of the nucleic acid, and a DNA polymerase having no exonuclease activity. And a kit for nucleic acid amplification, which comprises magnesium ions in the same solution.
本発明の方法により、PCR反応溶液を20℃から30℃で調製することが可能となる、さらに、調製後のPCR反応溶液を20℃から30℃で一定時間以上保存後も、非特異的増幅産物が発生せず、標的核酸を高い特異性をもって検出することが可能となる。 According to the method of the present invention, a PCR reaction solution can be prepared at 20 ° C. to 30 ° C., and further, non-specific amplification even after the prepared PCR reaction solution is stored at 20 ° C. to 30 ° C. for a certain period of time or longer. No product is generated, and the target nucleic acid can be detected with high specificity.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の実施形態において、PCR反応液はオリゴヌクレオチドプライマーセット(プライマーセット)、エキソヌクレアーゼ活性を有しないDNAポリメラーゼ、マグネシウムイオンを含む。その他の構成は特に限定されないが、鋳型となる核酸、1種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸(dATP,dCTP,dTTP,dGTP)又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩などを含有することが好ましい。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the embodiment of the present invention, the PCR reaction solution contains an oligonucleotide primer set (primer set), a DNA polymerase having no exonuclease activity, and magnesium ions. Other configurations are not particularly limited, but contain a template nucleic acid, one or more kinds of deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dTTP, dGTP), derivatives of deoxynucleotide triphosphates, buffers, salts, and the like. It is preferable to do so.
ここで緩衝剤としては、例えばトリス(TRIS)、トリシン(TRICINE)、ビスートリシン(BIS−TRICINE)、ヘペス(HEPES)、モプス(MOPS)、テス(TES)、タプス(TAPS)、ピペス(PIPES)、及びキャプス(CAPS)などが挙げられるが、特に限定されない。 Here, as the buffer, for example, Tris (TRIS), Tricine (TRICINE), Bisutricin (BIS-TRICINE), HEPES, MOPS (MOPS), TES (TES), Taps (TAPS), Pipes (PIPES), And caps (CAPS) and the like, but are not particularly limited.
反応緩衝液としてはトリス−塩酸緩衝液、トリス−硫酸緩衝液、トリシン緩衝液などが挙げられる。緩衝液の濃度としては10mMから200mM程度が好ましく、20mMから100mM程度がより好ましい。pHとしては7.0から9.5程度の範囲が好ましく、7.5から9.0程度の範囲がより好ましい。 Examples of the reaction buffer include Tris-hydrochloric acid buffer, Tris-sulfate buffer, and tricine buffer. The concentration of the buffer solution is preferably about 10 mM to 200 mM, more preferably about 20 mM to 100 mM. The pH is preferably in the range of 7.0 to 9.5, more preferably in the range of 7.5 to 9.0.
本発明の反応組成には、1mMから10mMのマグネシウムイオンを含むことが好ましい。より好ましくは2mMから7mM、さらに好ましくは3mMから5mMのマグネシウムイオンを含む。マグネシウムイオンの添加する形態は特に限定されないが、硫酸マグネシウムや塩化マグネシウムなどのマグネシウム塩を用いることが好ましい。 The reaction composition of the present invention preferably contains 1 mM to 10 mM magnesium ions. More preferably it contains 2 mM to 7 mM, more preferably 3 mM to 5 mM magnesium ions. The form in which magnesium ions are added is not particularly limited, but it is preferable to use magnesium salts such as magnesium sulfate and magnesium chloride.
本発明において使用されるプライマーは、目的の領域を増幅するように設計されていれば特に限定されない。本発明では複数のDNA領域を同時かつ迅速に検出するために、2種類以上、または3種類以上、あるいは4種類以上のプライマーセットを含み、各プライマーが標的とするDNAを増幅する。また、フォワード側又はリバース側のいずれかのプライマーを共通とすることもできる。PCR反応溶液には、PCR反応が進行しているかを確認する目的で、内部標準遺伝子とその増幅のためのプライマーをさらに含んでいてもよい。 The primers used in the present invention are not particularly limited as long as they are designed to amplify the region of interest. In the present invention, in order to detect a plurality of DNA regions simultaneously and rapidly, two or more kinds, three or more kinds, or four or more kinds of primer sets are included, and each primer amplifies the target DNA. Further, either the forward side or the reverse side primer can be shared. The PCR reaction solution may further contain an internal standard gene and primers for amplification thereof for the purpose of confirming whether the PCR reaction is proceeding.
本発明に使用する耐熱性DNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を示さないDNAポリメラーゼであれば特に限定されない。エキソヌクレアーゼ活性には3‘→5’エキソヌクレアーゼ活性と5‘→3’エキソヌクレアーゼ活性が知られているが、本発明の実施形態では3‘→5’エキソヌクレアーゼ活性と5‘→3’エキソヌクレアーゼ活性を共に示さないDNAポリメラーゼを使用する。エキソヌクレアーゼ活性を示さないDNAポリメラーゼであれば特に限定されず、エキソヌクレアーゼ活性を示さない野生型のDNAポリメラーゼや、変異によってエキソヌクレアーゼ活性を欠失させたDNAポリメラーゼなどが使用できる。 The heat-resistant DNA polymerase used in the present invention is not particularly limited as long as it is a DNA polymerase that does not exhibit exonuclease activity. 3'→ 5'exonuclease activity and 5'→ 3'exonuclease activity are known as exonuclease activities, but in the embodiment of the present invention, 3'→ 5'exonuclease activity and 5'→ 3'exonuclease are known. Use a DNA polymerase that does not show any nuclease activity. The DNA polymerase is not particularly limited as long as it does not show exonuclease activity, and wild-type DNA polymerase that does not show exonuclease activity, DNA polymerase that lacks exonuclease activity by mutation, and the like can be used.
本発明において使用される、変異によってエキソヌクレアーゼ活性を欠失させたDNAポリメラーゼは、特に限定されないが、例えば、特許文献1に開示されている変異型Taq DNAポリメラーゼが挙げられる。前記Taq DNAポリメラーゼは5‘→3’エキソヌクレアーゼ活性を低下もしくは欠失させるために、N末端側のアミノ酸を欠失させた改変Taq DNAポリメラーゼである。
なお、本発明において使用されるDNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を示さないDNAポリメラーゼであれば、その起源、製造方法、変異箇所は特に限定されない。
The DNA polymerase used in the present invention in which the exonuclease activity is deleted by mutation is not particularly limited, and examples thereof include the mutant Taq DNA polymerase disclosed in Patent Document 1. The Taq DNA polymerase is a modified Taq DNA polymerase in which the amino acid on the N-terminal side is deleted in order to reduce or delete the 5'→ 3'exonuclease activity.
The DNA polymerase used in the present invention is not particularly limited as long as it is a DNA polymerase that does not exhibit exonuclease activity, and its origin, production method, and mutation site are not particularly limited.
本発明における標的領域の増幅産物を示すシグナルを検出する工程における検出手段としては、特に限定されるものではないが、融解曲線解析又は電気泳動等が挙げられる。特に、融解曲線解析が好ましい The detection means in the step of detecting the signal indicating the amplification product of the target region in the present invention is not particularly limited, and examples thereof include melting curve analysis and electrophoresis. Especially, melting curve analysis is preferable.
本発明において、融解曲線解析により、蛍光物質を用いて増幅産物を検出する方法としてはSYBR(登録商標)Greenなどのインターカレーターを用いた、二本鎖DNAに結合する蛍光色素を添加するインターカレーター法が挙げられる。インターカレーターとは、二本鎖DNAに挿入(インターカレート)することによって、可逆的な、非共有結合的な様式で核酸と結合し、それによって核酸の存在および量を示す任意の分子を指す。一般に、インターカレーターとは、二本鎖DNAに挿入して蛍光を発する色素をいうものである。 In the present invention, as a method for detecting an amplification product using a fluorescent substance by melting curve analysis, an intercalator to which a fluorescent dye that binds to double-stranded DNA is added using an intercalator such as SYBR (registered trademark) Green. The law can be mentioned. An intercalator is any molecule that binds to a nucleic acid in a reversible, non-covalent manner by inserting (intercalating) into double-stranded DNA, thereby indicating the presence and amount of nucleic acid. .. In general, an intercalator is a dye that is inserted into double-stranded DNA and emits fluorescence.
本発明においては、多種類のインターカレーターを用いることが可能である。例えば、Ethidium bromide、シアニン色素(例えば、TOTO(登録商標)、YOYO(登録商標)、BOBOおよびPOPO)、SYBR(登録商標) Green I、SYBR(登録商標) Green ER、SYBR(登録商標) Green Gold、SYBR(登録商標) DX、PicoGreen(登録商標)、LCGeen(登録商標)、EvaGreen(登録商標)、SYTOX(登録商標) Green、ResoLight、ヨウ化プロピジウム、Acridine orange、7−アミノ−アクチノマイシン D、CyQUANT(登録商標) GR、SYTO(登録商標)9, SYTO(登録商標)10、SYTO(登録商標)13、SYTO(登録商標)14、SYTO(登録商標)82、FUN−1などが挙げられるが、特に限定されるものではない。 In the present invention, it is possible to use many types of intercalators. For example, Ethidium bromede, cyanine dyes (eg, TOTO®, YOYO®, BOBO and POPO), SYBR® Green I, SYBR® Green ER, SYBR® Green Gold. , SYBR® DX, PicoGreen®, LCGeen®, EvaGreen®, SYSTEMX® Green, ResoLight, Propidium iodide, Acidine orange, 7-amino-actinomycin D, CyQUANT (registered trademark) GR, SYTO (registered trademark) 9, SYTO (registered trademark) 10, SYTO (registered trademark) 13, SYTO (registered trademark) 14, SYTO (registered trademark) 82, FUN-1 and the like. , Not particularly limited.
本発明における標的核酸由来のシグナルとは、融解曲線解析におけるインターカレーターに由来する蛍光の一次微分値の負の値(−dF/dT)を指す。また、該微分値のピーク(Tm値)が前後1℃以内の温度範囲にあるとき、同一検体由来のシグナルであると判断するものとする。 The signal derived from the target nucleic acid in the present invention refers to a negative value (-dF / dT) of the first derivative of fluorescence derived from the intercalator in the melting curve analysis. Further, when the peak (Tm value) of the differential value is in the temperature range within 1 ° C. before and after, it is determined that the signal is derived from the same sample.
本発明においては、同一検体由来のシグナルを比較した際に、調製後10分以内にPCR反応溶液を用いて検出したシグナルと比較して、25℃にて4時間静置したPCR反応溶液をもちいて検出した蛍光の、同一Tm値における一次微分値の負の値(−dF/dT)が30%以上、好ましくは40%以上、より好ましくは50%残存していることを特徴とする。 In the present invention, when comparing signals derived from the same sample, a PCR reaction solution that has been allowed to stand at 25 ° C. for 4 hours is used as compared with the signal detected using the PCR reaction solution within 10 minutes after preparation. The negative value (−dF / dT) of the first derivative value of the detected fluorescence at the same Tm value remains 30% or more, preferably 40% or more, more preferably 50%.
本発明により、25℃で4時間静置した場合にあっても、シグナルの低下を抑えることができることで、一旦調製した試薬をそのまま使用することが可能であり、その結果として、臨床検査などの現場における作業性を格段に高めることができるようになる。なお、室温ではなく、冷蔵条件下に静置することにより、4時間よりもさらに長時間使用することが可能であることは言うまでもない。 According to the present invention, even when the mixture is allowed to stand at 25 ° C. for 4 hours, the decrease in signal can be suppressed, so that the reagent once prepared can be used as it is, and as a result, clinical tests and the like can be used. It will be possible to significantly improve workability in the field. Needless to say, it can be used for a longer time than 4 hours by allowing it to stand under refrigerated conditions instead of at room temperature.
本発明の核酸増幅法において用いられる反応液には、上記のほかに、キャリーオーバー汚染を防止するための組成として、ウラシルグリコシダーゼ、dUTPが含まれていてもよい。ウラシルグリコシダーゼはDNA配列中に存在するウラシルを特異的に切り出し、DNAの分解を起こす酵素である。反応液にdUTPが含まれる組成でPCRを行い得られるDNA断片はウラシルを含んでおり、ウラシルグリコシダーゼで分解される。一方、天然のDNAはウラシルを含まないため、分解されない。これを利用したキャリーオーバー汚染を防止する方法が知られている。 In addition to the above, the reaction solution used in the nucleic acid amplification method of the present invention may contain uracil glycosidase and dUTP as a composition for preventing carryover contamination. Uracil glycosidase is an enzyme that specifically excises uracil present in a DNA sequence and causes DNA degradation. The DNA fragment obtained by PCR with a composition containing dUTP in the reaction solution contains uracil and is degraded by uracil glycosidase. On the other hand, natural DNA does not contain uracil and is not degraded. A method of preventing carryover contamination using this is known.
本発明のキットは、本発明の検出する方法に用いるためのキットである。すなわち、本発明のキットは、核酸中の標的領域を増幅するための2種類以上、または3種類以上、あるいは4種類以上のプライマーセット、エキソヌクレアーゼ活性を有しないDNAポリメラーゼ及びマグネシウムイオンを含む、試料に含まれる核酸を増幅し、融解曲線解析にて検出するためのキットであることを特徴とする。 The kit of the present invention is a kit for use in the detection method of the present invention. That is, the kit of the present invention contains a sample containing two or more, three or more, or four or more primer sets for amplifying a target region in a nucleic acid, a DNA polymerase having no exonuclease activity, and magnesium ions. It is a kit for amplifying the nucleic acid contained in and detecting it by melting curve analysis.
本発明に用いられるプライマー、DNAポリメラーゼ及びマグネシウムイオンは、上記に説明した通りである。また、本発明のキットは、核酸増幅および融解曲線解析を行うのに必要とされる試薬類をさらに含んでいてもよい。具体的には、1種以上のデオキシヌクレオチド三リン酸(dATP,dCTP,dTTP,dGTP)又は、デオキシヌクレオチド三リン酸の誘導体、緩衝剤、及び塩並びに上述のdUTPを含んでいてもよい。
本キットはプライマー、DNAポリメラーゼ、マグネシウムイオンが混合物として収容されていることを特徴とするが、そのほかの試薬類は、別個に収容されていてもよいし、それらの一部が混合されていてもよい。
The primers, DNA polymerase and magnesium ion used in the present invention are as described above. The kit of the present invention may also further include reagents required for nucleic acid amplification and melting curve analysis. Specifically, it may contain one or more kinds of deoxynucleotide triphosphates (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) or derivatives, buffers, and salts of deoxynucleotide triphosphates, and the above-mentioned dUTP.
The kit is characterized by containing primers, DNA polymerase, and magnesium ions as a mixture, but other reagents may be contained separately or some of them may be mixed. Good.
以下、実施例に基づき本発明をより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail based on Examples. However, the present invention is not limited to the following examples.
実施例1.DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性がPCR反応液性に与える影響
サルモネラ遺伝子、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌のゲノムDNA各10コピーを試料として用い、マルチプレックスPCR反応および融解曲線解析を実施した。内部標準遺伝子のピークが71℃に、サルモネラ菌のピークが76℃に、腸管出血性大腸菌のピークが80℃に、赤痢菌のピークが85℃に、それぞれTm値を与える。
Example 1. Effect of exonuclease activity of DNA polymerase on PCR reaction fluidity Multiplex PCR reaction using 10 copies each of salmonella gene, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and diarrhea bacterium genomic DNA as samples And melting curve analysis was performed. The peak of the internal standard gene is given at 71 ° C, the peak of Salmonella is given at 76 ° C, the peak of enterohemorrhagic Escherichia coli is given at 80 ° C, and the peak of Shigella is given at 85 ° C.
本実施例では、マルチプレックスPCR用のプライマーセットとして、腸内細菌遺伝子検出キットー高速蛍光検出―(TOYOBO)に含まれる10×プライマーミックスを使用した。本実施例のDNAポリメラーゼは、エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼとして、rTaq DNA polymerase(TOYOBO)を使用した。その他の反応溶液組成は表1に示す。 In this example, as a primer set for multiplex PCR, a 10 × primer mix contained in an intestinal bacterial gene detection kit-fast fluorescence detection- (TOYOBO) was used. As the DNA polymerase of this example, rTaq DNA polymerase (TOYOBO) was used as a DNA polymerase having exonuclease activity. Other reaction solution compositions are shown in Table 1.
解析の結果、エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼを使用したPCR反応溶液では、調製後10分以内のPCR反応溶液と比較して、調整後4時間静置したPCR反応溶液では部標準遺伝子、サルモネラ菌、赤痢菌の標的遺伝子を示すシグナルが消失していた。腸管出血性大腸菌の標的遺伝子を示すシグナルは残存していたが、残存率は30%程度であった。 As a result of the analysis, in the PCR reaction solution using DNA polymerase having exonuclease activity, compared with the PCR reaction solution within 10 minutes after preparation, in the PCR reaction solution left to stand for 4 hours after preparation, the part standard gene, Salmonella, The signal indicating the target gene of the diarrhea was lost. The signal indicating the target gene of enterohemorrhagic Escherichia coli remained, but the survival rate was about 30%.
実施例2.DNAポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性がPCR反応液性に与える影響
サルモネラ遺伝子、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌のゲノムDNA各10コピーを試料として用い、マルチプレックスPCR反応及び融解曲線解析を実施した。内部標準遺伝子のピークが71℃に、サルモネラ菌のピークが76℃に、腸管出血性大腸菌のピークが80℃に、赤痢菌のピークが85℃に、それぞれTm値を与える。
Example 2. Effect of exonuclease activity of DNA polymerase on PCR reaction humorality Multiplex PCR reaction and melting curve analysis using 10 copies each of salmonella gene, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella genomic DNA as samples Was carried out. The peak of the internal standard gene is given at 71 ° C, the peak of Salmonella is given at 76 ° C, the peak of enterohemorrhagic Escherichia coli is given at 80 ° C, and the peak of Shigella is given at 85 ° C.
本実施例ではエキソヌクレアーゼ活性を有しないDNAポリメラーゼとしてTitanium Taq DNA Polymerase(CLONTECH LABORATORIE)を使用した。その他の反応溶液組成は表1に示す。 In this example, Titanium Taq DNA Polymerase (CLONTECH LABORATORIE) was used as a DNA polymerase having no exonuclease activity. Other reaction solution compositions are shown in Table 1.
25℃にて調製後10分以内のPCR反応溶液、および25℃にて調製後、同一温度にて4時間静置したPCR反応溶液を使用した。これらPCR反応溶液に精製ゲノムDNA各10コピーを添加し、PCR反応及び融解曲線解析を実施した。融解曲線解析は表2に示すサイクル条件にてPCRを実施し、標的核酸由来のシグナルを検出した。解析には、リアルタイムPCR装置Light Cycler(登録商標)96(Roche)を使用した。 A PCR reaction solution prepared at 25 ° C. within 10 minutes and a PCR reaction solution prepared at 25 ° C. and allowed to stand at the same temperature for 4 hours were used. Ten copies of each purified genomic DNA were added to these PCR reaction solutions, and PCR reaction and melting curve analysis were performed. For melting curve analysis, PCR was performed under the cycle conditions shown in Table 2 to detect signals derived from the target nucleic acid. A real-time PCR device, Light Cycler® 96 (Roche), was used for the analysis.
解析の結果、エキソヌクレアーゼ活性を有しないDNAポリメラーゼを使用したPCR反応溶液では、内部標準のシグナルは内部標準を含む4つの標的遺伝子由来のシグナルが全て観察された。調製後10分以内のPCR反応溶液と比較して、調整後4時間静置したPCR反応溶液では、内部標準遺伝子、サルモネラ菌、赤痢菌を示すシグナルは100%残存しており、腸管出血大腸菌の標的遺伝子を示すシグナルは65%程度残存していた。 As a result of the analysis, in the PCR reaction solution using DNA polymerase having no exonuclease activity, all the signals derived from the four target genes including the internal standard were observed as the signals of the internal standard. Compared with the PCR reaction solution within 10 minutes after preparation, in the PCR reaction solution left to stand for 4 hours after preparation, 100% of the signals indicating the internal standard gene, Salmonella, and Shigella remain, and the target of enterohemorrhagic Escherichia coli About 65% of the signal indicating the gene remained.
実施例3.マグネシウムイオンがPCR反応液性に与える影響
サルモネラ遺伝子、腸管出血性大腸菌(EHEC)、赤痢菌のゲノムDNA各10コピーを試料として用い、マルチプレックスPCR反応および融解曲線解析を実施した。25℃にて表3に示す反応溶液を調製し、25℃にて4時間静置した。本反応溶液にはエキソヌクレアーゼ活性を有するrTaq DNA polymerase(TOYOBO)を使用した。静置後の反応溶液に終濃度3mMとなるよう硫酸マグネシウムを添加した。本PCR反応溶液に精製ゲノムDNA各10コピーを添加し、PCR反応及び融解曲線解析を実施した。融解曲線解析は表2に示すサイクル条件にてPCRを実施し、標的核酸由来のシグナルを検出した。解析には、リアルタイムPCR装置Light Cycler(登録商標)96(Roche)を使用した。
Example 3. Effect of Magnesium Ion on PCR Reaction Liquidity Multiplex PCR reaction and melting curve analysis were performed using 10 copies each of Salmonella gene, enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), and Shigella genomic DNA as samples. The reaction solution shown in Table 3 was prepared at 25 ° C. and allowed to stand at 25 ° C. for 4 hours. As this reaction solution, rTaq DNA polymerase (TOYOBO) having exonuclease activity was used. Magnesium sulfate was added to the reaction solution after standing so that the final concentration was 3 mM. Ten copies of each purified genomic DNA were added to this PCR reaction solution, and PCR reaction and melting curve analysis were performed. For melting curve analysis, PCR was performed under the cycle conditions shown in Table 2 to detect signals derived from the target nucleic acid. A real-time PCR device, Light Cycler® 96 (Roche), was used for the analysis.
解析の結果、内部標準のシグナルは、内部標準を含む4つの標的遺伝子由来のシグナルが観察された。残存率は各4つのシグナルともに90%以上であった。 As a result of the analysis, signals derived from four target genes including the internal standard were observed as the signals of the internal standard. The survival rate was 90% or more for each of the four signals.
本発明によれば、エキソヌクレアーゼ活性を有しないDNAポリメラーゼを使用することで、マグネシウムイオン、オリゴヌクレオチドプライマーを同一溶液中に含むPCR反応溶液組成でも、室温での安定性を高めることが可能となる。また、従来は安定性を高めるためにマグネシウムイオン、又はオリゴヌクレオチドプライマーを別容器に含むキットが用いられてきたが、本発明の方法を使用することで、DNAポリメラーゼ、マグネシウムイオン及びオリゴヌクレオチドプライマーを同一溶液中に含むキットを作成することが可能となる。したがって、試薬の調製がより簡便となるため、特に核酸増幅技術に専門的な知識を有しない者により行われることの多い臨床診断などの場でも容易に核酸増幅検出を利用した遺伝子検査が可能となり、産業界に大きく寄与することが期待される。 According to the present invention, by using a DNA polymerase having no exonuclease activity, it is possible to improve the stability at room temperature even in a PCR reaction solution composition containing magnesium ions and oligonucleotide primers in the same solution. .. In addition, conventionally, a kit containing a magnesium ion or an oligonucleotide primer in a separate container has been used in order to improve stability, but by using the method of the present invention, a DNA polymerase, a magnesium ion and an oligonucleotide primer can be obtained. It is possible to create a kit to be contained in the same solution. Therefore, since the preparation of reagents becomes simpler, it becomes possible to easily perform genetic testing using nucleic acid amplification detection even in clinical diagnosis, which is often performed by a person who does not have specialized knowledge in nucleic acid amplification technology. , Is expected to contribute significantly to the industrial world.
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