JP6831643B2 - Methods and kits for detecting bacteria - Google Patents
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Description
本発明は、検体に含まれる細菌を、細胞内抗原を利用して免疫測定法で検出する方法及びキットに関する。 The present invention relates to a method and a kit for detecting bacteria contained in a sample by an immunoassay method using an intracellular antigen.
微生物感染症は、通常、感染部位等における原因菌の検出、又は血液もしくは体液中の原因菌に対する抗体の検出結果に基づいて診断される。特に、この診断のためには、原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。 Microbial infections are usually diagnosed based on the detection of the causative organism at the site of infection or the like, or the detection result of an antibody against the causative organism in blood or body fluid. In particular, for this diagnosis, detection of the causative organism is important in the sense that it enables rapid treatment of the patient.
感染症原因菌の検出には、原因菌の分離培養を経てその生化学的性状をもとに該原因菌の同定を行う培養法、原因菌に特異的な遺伝子をもとにＰＣＲ法などにより増幅し検出する遺伝子法、原因菌の表面抗原マーカー等と抗体との特異的反応を利用して原因菌検出を行う免疫法に大別できる。しかしながら、培養法及び遺伝子法は検出結果を得るまでに時間がかかるので、短時間にしかも高感度に原因菌を検出できる免疫法が、迅速かつ適切な患者への治療につながる点で利用価値が高い。従来の免疫法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。 To detect the causative organism of an infectious disease, a culture method is used in which the causative organism is isolated and cultured to identify the causative organism based on its biochemical properties, or a PCR method is used based on a gene specific to the causative organism. It can be roughly divided into a gene method for amplifying and detecting, and an immunological method for detecting the causative bacterium by utilizing a specific reaction between an antibody and a surface antigen marker of the causative bacterium. However, since it takes time to obtain the detection results in the culture method and the gene method, an immunological method capable of detecting the causative bacteria in a short time and with high sensitivity is useful in that it leads to prompt and appropriate treatment for patients. high. Various combinations of marker antigens and antibodies are used depending on the bacterial species for the detection of infectious disease-causing bacteria by the conventional immunological method.
特許文献１は、種特異的であり、かつ同一種内のすべての血清型を検出できる微生物検出用抗体とその作製法、微生物検出方法及び微生物検出用試薬装置を提案する。この中では、各種の微生物について細胞内のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原に対する抗体を作製し、対象微生物に特異的に反応する抗体を選択する。この抗体を用いて微生物を検出している。特許文献２は、呼吸器感染症の原因菌のひとつであるクラミジア・ニューモニエに属する細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と反応する抗体を用いて、クラミジア・ニューモニエに属する細菌を他の属の細菌と識別する方法を提供する。特許文献３は、細菌の一種であるマイコプラズマ・ニューモニアをリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いて検出する方法について述べており、この中でリボソーム蛋白質Ｌ７／Ｌ１２のような菌体内（細菌の細胞内）に存在する抗原の検出にはマイコプラズマ・ニューモニア自体に前処理を施し破砕することが必須であるとされている。またこの文献の中で引例として参照されている特許文献４は、多剤耐性ブドウ球菌の抗原を作成する方法について述べており、この中でブドウ球菌をｐＨ１１以上の抽出液に晒すことで抗原が得られるとしている。また特許文献５は、ミュータンス連鎖球菌の同定・定量をするための唾液の前処理キットとして、水酸化ナトリウムを含有する水溶液(Ａ)と、酒石酸及び／又はクエン酸を含有するトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液(Ｂ)と、非イオン性界面活性剤及び／又は両性界面活性剤(Ｃ)とから構成され、界面活性剤(Ｃ)が、水溶液(Ａ)及び／又は緩衝液(Ｂ)に予め混合されているか、又は水溶液(Ａ)及び緩衝液(Ｂ)とは別になっていることを特徴とする唾液の前処理用キットを提案する。 Patent Document 1 proposes a microorganism detection antibody that is species-specific and capable of detecting all serotypes in the same species, a method for producing the same, a method for detecting microorganisms, and a reagent device for detecting microorganisms. Among these, antibodies against intracellular ribosomal protein L7 / L12 antigens are prepared for various microorganisms, and antibodies that specifically react with the target microorganisms are selected. Microorganisms are detected using this antibody. Patent Document 2 distinguishes a bacterium belonging to Chlamydia pneumoniae from a bacterium belonging to another genus by using an antibody that reacts with the ribosome protein L7 / L12 of a bacterium belonging to Chlamydia pneumoniae, which is one of the causative bacteria of respiratory infections. Provide a way to do it. Patent Document 3 describes a method for detecting Mycoplasma pneumoniae, which is a type of bacterium, using an antibody against the ribosomal protein L7 / L12, in which intracellular cells (intracellular bacteria) such as the ribosomal protein L7 / L12 are described. In order to detect the antigen present in), it is essential that Mycoplasma pneumoniae itself be pretreated and crushed. Further, Patent Document 4, which is referred to as a reference in this document, describes a method for producing an antigen of multidrug-resistant staphylococci, in which the antigen is released by exposing the staphylococcus to an extract having a pH of 11 or higher. It is supposed to be obtained. Further, Patent Document 5 describes an aqueous solution (A) containing sodium hydroxide and tris (hydroxymethyl) containing tartaric acid and / or citric acid as a saliva pretreatment kit for identifying and quantifying mutans streptococci. ) Aminomethane buffer (B) and a nonionic surfactant and / or an amphoteric surfactant (C), and the surfactant (C) is an aqueous solution (A) and / or a buffer (B). ), Or a kit for pretreatment of saliva, which is separate from the aqueous solution (A) and the buffer solution (B).
本発明は、検体に含まれる細菌を検出する方法であって、細菌の細胞内抗原を免疫測定に供するものであり、様々な細菌において簡易に、精度よく実施可能な方法を提供することを目的とする。 The present invention is a method for detecting a bacterium contained in a sample, which uses an intracellular antigen of the bacterium for immunoassay, and an object of the present invention is to provide a method which can be easily and accurately carried out in various bacteria. And.
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のような細胞内抗原は、細菌の細胞内に存在するため、測定に利用するためには検体に含まれる細菌の細胞内からタンパク質を抽出する処理が必要となる。その方法の一つとして、特許文献４ではアルカリ性の抽出液に細菌を晒す方法が挙げられている。この方法で得た抽出液を免疫測定法に供する際には、抽出液のｐＨを中性（抗原抗体反応が働く範囲）に調整する必要がある。一方、本発明者らの検討によると、検体をアルカリ性の抽出液に晒すと、その際に生じた成分がその後につづく抗体を用いた免疫測定法において偽陽性反応を引き起こすことが新たにわかった。そこで本発明者らは、アルカリ溶液を抽出に用いる場合には、偽陽性反応を抑制するために有効な手段を講じることにより、細菌を精度よく検出できることを見出し、本発明を完成した。 Since intracellular antigens such as ribosomal proteins L7 / L12 are present in bacterial cells, a process for extracting the protein from the bacterial cells contained in the sample is required for use in measurement. As one of the methods, Patent Document 4 describes a method of exposing bacteria to an alkaline extract. When the extract obtained by this method is used for immunoassay, it is necessary to adjust the pH of the extract to neutral (the range in which the antigen-antibody reaction works). On the other hand, according to the study by the present inventors, it was newly found that when the sample is exposed to an alkaline extract, the component generated at that time causes a false positive reaction in the subsequent immunoassay using an antibody. .. Therefore, the present inventors have found that when an alkaline solution is used for extraction, bacteria can be detected accurately by taking effective measures for suppressing false positive reactions, and have completed the present invention.
即ち、本発明は以下を提供する。
［１］検体に含まれる細菌を検出する方法であって、
該検体とアルカリ溶液を接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原をアルカリ溶液中に抽出し、検体抽出物を得る抽出工程と、
該検体抽出物と中和液を接触させ中和物を得る中和工程と、
該中和物を細菌の細胞内抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該細胞内抗原を検出する検出工程と、
を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む、
方法。
［２］前記免疫測定法が免疫クロマトグラフィー法である、１に記載の方法。
［３］前記細胞内抗原がリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２である、１又は２に記載の方法。
［４］前記検体が上気道検体である、１から３のいずれか１項に記載の方法。
［５］前記上気道検体が咽頭ぬぐい液、鼻咽腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、唾液、喀痰のいずれかである、４に記載の方法。
［６］前記細菌がクラミジア・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、ヘモフィルス・インフルエンザからなる群より選ばれるいずれかである、１から５のいずれか１項に記載の方法。
［７］前記アルカリ溶液が陰イオン性界面活性剤を含む、１から６のいずれか１項に記載の方法。
［８］前記陰イオン性界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウム及び／又はコール酸ナトリウムである、７に記載の方法。
［９］前記中和液が非イオン性界面活性剤を含む、１から９のいずれか１項に記載の方法。
［１０］前記非イオン性界面活性剤が
ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、及び
ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレートからなる群より選ばれる少なくとも１種である、９に記載の方法。
［１１］前記中和物のｐＨが１０．０以下である、１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
［１２］前記中和液が、該偽陽性反応の抑制上有効な手段として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液及び／又はリン酸緩衝液を含む、１から１１のいずれか１項に記載の方法。
［１３］検体に含まれる細菌を検出するキットであって、
該キットが、
該検体と接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原を抽出し、検体抽出物を得るためのアルカリ溶液と、該検体抽出物と接触させ、中和物を得るための中和液と、中和物が供され、細胞内抗原を検出するための免疫測定装置を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含み、
該免疫測定装置が、細菌の細胞内抗原に対する抗体を含む、
検出キット。
［１４］前記免疫測定装置が免疫クロマトグラフィー装置である、１３に記載の検出キット。
［１５］前記細胞内抗原がリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２である、１３又は１４に記載の検出方法。
［１６］前記検体が上気道検体であって、前記検体を採取するための用具をさらに含む、１３から１５のいずれか１項に記載の検出キット。
［１７］前記細菌がクラミジア・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、ヘモフィルス・インフルエンザからなる群より選ばれるいずれかである、１３から１６のいずれか１項に記載の検出キット。
［１８］前記アルカリ溶液が陰イオン性界面活性剤を含む、１３から１７のいずれか１項に記載の検出キット。
［１９］前記陰イオン性界面活性剤がデオキシコール酸ナトリウム及び／又はコール酸ナトリウムである、１８に記載の検出キット。
［２０］前記中和液が非イオン性界面活性剤を含む、１３から１９のいずれか１項に記載の検出キット。
［２１］前記非イオン性界面活性剤が
ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、及び
ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレートからなる群より選ばれる少なくとも１種である、２０に記載の検出キット。
［２２］前記中和液が中和物のｐＨを１０．０以下にするものである、１３〜２１のいずれか１項に記載の検出キット。
［２３］前記中和液が、該偽陽性反応上有効な手段として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液及び／又はリン酸緩衝液を含む、１３から２２のいずれか１項に記載の検出キット。
That is, the present invention provides the following.
[1] A method for detecting bacteria contained in a sample.
An extraction step in which the sample is brought into contact with an alkaline solution and the intracellular antigens of the bacteria contained in the sample are extracted into the alkaline solution to obtain a sample extract.
A neutralization step of contacting the sample extract with a neutralizing solution to obtain a neutralized product,
A detection step of subjecting the neutralized product to an immunoassay using an antibody against the intracellular antigen of a bacterium to detect the intracellular antigen,
Including
The neutralizing solution contains effective means for suppressing false positive reactions in the immunoassay.
Method.
[2] The method according to 1, wherein the immunoassay is an immunochromatography method.
[3] The method according to 1 or 2, wherein the intracellular antigen is ribosomal protein L7 / L12.
[4] The method according to any one of 1 to 3, wherein the sample is an upper respiratory tract sample.
[5] The method according to 4, wherein the upper respiratory tract sample is any one of a pharyngeal swab, a nasopharyngeal swab, a nasal aspirate, saliva, and sputum.
[6] The method according to any one of 1 to 5, wherein the bacterium is selected from the group consisting of Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, and Haemophilus influenza.
[7] The method according to any one of 1 to 6, wherein the alkaline solution contains an anionic surfactant.
[8] The method according to 7, wherein the anionic surfactant is sodium deoxycholate and / or sodium cholic acid.
[9] The method according to any one of 1 to 9, wherein the neutralizing solution contains a nonionic surfactant.
[10] The nonionic surfactant is poly (oxyethylene) nonylphenyl ether,
Poly (oxyethylene) poly (oxypropylene) alkyl ether,
Poly (oxyethylene) alkyl ether,
9. The method according to 9, which is at least one selected from the group consisting of poly (oxyethylene) octylphenyl ether and poly (oxyethylene) sorbitan monolaurate.
[11] The method according to any one of 1 to 10, wherein the pH of the neutralized product is 10.0 or less.
[12] The item according to any one of 1 to 11, wherein the neutralizing solution contains a tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer solution and / or a phosphate buffer solution as an effective means for suppressing the false positive reaction. the method of.
[13] A kit for detecting bacteria contained in a sample.
The kit
An alkaline solution for contacting with the sample to extract the intracellular antigen of the bacterium contained in the sample to obtain a sample extract, and a neutralizing solution for contacting with the sample extract to obtain a neutralized product. , Neutralized, containing immunoassay device for detecting intracellular antigens,
The neutralizing solution contains effective means for suppressing false positive reactions in the immunoassay.
The immunoassay device comprises an antibody against the intracellular antigen of the bacterium.
Detection kit.
[14] The detection kit according to 13, wherein the immunoassay device is an immunochromatography device.
[15] The detection method according to 13 or 14, wherein the intracellular antigen is ribosomal protein L7 / L12.
[16] The detection kit according to any one of 13 to 15, wherein the sample is an upper respiratory tract sample and further includes a tool for collecting the sample.
[17] The detection kit according to any one of 13 to 16, wherein the bacterium is selected from the group consisting of Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, and Haemophilus influenza.
[18] The detection kit according to any one of 13 to 17, wherein the alkaline solution contains an anionic surfactant.
[19] The detection kit according to 18, wherein the anionic surfactant is sodium deoxycholate and / or sodium cholic acid.
[20] The detection kit according to any one of 13 to 19, wherein the neutralizing solution contains a nonionic surfactant.
[21] The nonionic surfactant is poly (oxyethylene) nonylphenyl ether,
Poly (oxyethylene) poly (oxypropylene) alkyl ether,
Poly (oxyethylene) alkyl ether,
20. The detection kit according to 20, which is at least one selected from the group consisting of poly (oxyethylene) octylphenyl ether and poly (oxyethylene) sorbitan monolaurate.
[22] The detection kit according to any one of 13 to 21, wherein the neutralizing solution brings the pH of the neutralized product to 10.0 or less.
[23] The detection according to any one of 13 to 22, wherein the neutralizing solution contains a tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer solution and / or a phosphate buffer solution as an effective means for the false positive reaction. kit.
本発明の方法によれば、検体に含まれる細菌を精度よく検出することができる。 According to the method of the present invention, bacteria contained in a sample can be detected with high accuracy.
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明の方法は、検体に含まれる細菌を検出する方法であって、該検体とアルカリ溶液を接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原をアルカリ溶液中に抽出し、検体抽出物を得る抽出工程と、該検体抽出物と中和液を接触させ中和物を得る中和工程と、該中和物を細菌の細胞内抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該細胞内抗原を検出する検出工程と、を含み、該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む、方法を提供する。
なお、「検出する」とは、細菌の存在の有無又はその量を分析することをいう。したがって、検出の結果、細菌が検出されなかった場合も、検出された場合と同様、本発明の方法の実施に該当する。
Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
The method of the present invention is a method for detecting bacteria contained in a sample, in which the sample is brought into contact with an alkaline solution, the intracellular antigen of the bacteria contained in the sample is extracted into the alkaline solution, and the sample extract is obtained. The extraction step of obtaining the sample, the neutralization step of contacting the sample extract with the neutralizing solution to obtain the neutralized product, and the immunoassay method using the antibody against the intracellular antigen of the bacterium were applied to the neutralized product in the cell. Provided is a method comprising a detection step of detecting an antigen, wherein the neutralizing solution comprises an effective means for suppressing a false positive reaction in the immunoassay.
In addition, "detection" means to analyze the presence or absence of bacteria or the amount thereof. Therefore, even if the bacterium is not detected as a result of the detection, it corresponds to the implementation of the method of the present invention as in the case where the bacterium is detected.
［検体について］
本発明において用いられる検体は、ヒトの生体の任意の場所から採取することができ、細菌を含む可能性があるものであればよい。好ましくは上気道から採取された検体であり、より好ましくは咽頭ぬぐい液、鼻咽腔ぬぐい液、鼻腔吸引液、唾液、喀痰等である。これらの検体を採取する方法は特に限定されず、公知の方法を採用することができる。例えば咽頭ぬぐい液、鼻咽腔ぬぐい液、唾液、喀痰は綿棒を用いて採取することができ、また鼻腔吸引液は吸引カテーテルを用いて採取することができる。
検体には測定対象である細菌以外にも様々な物質が含まれている。例えば咽頭ぬぐい液にはヒト由来の組織片や分泌物の他、検出対象である細菌以外の細菌等の組織が含まれている場合がある。これらの一部は検体を処理した溶液中に浮遊又は溶解した状態で存在する。
これらを含んだ状態で免疫測定法、特に免疫クロマトグラフィー法による測定に供すると、非特異反応により偽陽性が発生する場合がある。
[About the sample]
The sample used in the present invention may be any sample that can be collected from any place in the human body and may contain bacteria. It is preferably a sample collected from the upper respiratory tract, and more preferably a pharyngeal swab, a nasopharyngeal swab, a nasal aspirate, saliva, sputum and the like. The method for collecting these samples is not particularly limited, and a known method can be adopted. For example, pharyngeal swab, nasopharyngeal swab, saliva, and sputum can be collected using a cotton swab, and nasal suction can be collected using a suction catheter.
The sample contains various substances other than the bacteria to be measured. For example, the pharyngeal swab may contain tissues such as human-derived tissue fragments and secretions, as well as bacteria other than the bacteria to be detected. Some of these exist in a suspended or dissolved state in the treated solution of the sample.
When subjected to measurement by an immunoassay method, particularly an immunochromatography method, in a state containing these, false positives may occur due to a non-specific reaction.
［細胞内成分の抽出］
細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に代表されるような、細胞内抗原を免疫測定法等で検出する場合には、該タンパク質が細胞内に存在することから、細胞を覆っている外膜等を破壊して該タンパク質を露出させる必要がある。
本発明者らは、検討の結果、細菌をアルカリ溶液で処理することで、簡易に細胞内成分であるリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を抽出できることを見出した。
[Extraction of intracellular components]
When an intracellular antigen such as the ribosome protein L7 / L12 of a bacterium is detected by an immunoassay method or the like, the protein is present in the cell, so that the outer membrane covering the cell is destroyed. It is necessary to expose the protein.
As a result of the study, the present inventors have found that the ribosomal protein L7 / L12, which is an intracellular component, can be easily extracted by treating the bacterium with an alkaline solution.
［抽出液］
本発明で用いることができるアルカリ溶液として、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の、第１族元素又は第２族元素の水酸化物の水溶液を用いることができる。アルカリ溶液のｐＨは１１．０〜１３．５であることが好ましい。アルカリ金属の濃度は、５〜１０００ｍＭ、好ましくは１０〜５００ｍＭとすることができる。
[Extract]
As the alkaline solution that can be used in the present invention, for example, an aqueous solution of a hydroxide of a Group 1 element or a Group 2 element such as sodium hydroxide and potassium hydroxide can be used. The pH of the alkaline solution is preferably 11.0 to 13.5. The concentration of the alkali metal can be 5 to 1000 mM, preferably 10 to 500 mM.
また、本発明はアルカリ溶液と同時に陰イオン性界面活性剤を用いることができる。陰イオン性界面活性剤は、細胞膜を可溶化する働きがあるので好ましい。本発明で使用できる陰イオン性界面活性剤は、細菌の外膜を破壊することができる限り特に限定されないが、好ましい例として、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムを挙げることができる。なかでもコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムがより好ましい。 Further, in the present invention, an anionic surfactant can be used at the same time as the alkaline solution. Anionic surfactants are preferable because they have a function of solubilizing cell membranes. The anionic surfactant that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can destroy the outer membrane of bacteria, but preferred examples thereof include sodium N-lauroyl sarcosine, sodium cholic acid, and sodium deoxycholate. Can be done. Of these, sodium cholic acid and sodium deoxycholate are more preferable.
本発明の陰イオン性界面活性剤はアルカリ溶液に対して０．１％〜２．０％添加することが好ましく、０．３％〜１．０％添加することがより好ましい。濃度が低いと期待される効果が十分に得られない可能性があり、また濃度が高いと特異性（抗原と抗体の反応）を阻害したり、逆に非特異的な反応を誘発・促進したりする場合がある。 The anionic surfactant of the present invention is preferably added in an amount of 0.1% to 2.0%, more preferably 0.3% to 1.0%, based on the alkaline solution. If the concentration is low, the expected effect may not be obtained sufficiently, and if the concentration is high, specificity (antigen-antibody reaction) may be inhibited, or conversely, non-specific reaction may be induced / promoted. It may happen.
必要に応じ陰イオン性界面活性剤を含んだアルカリ溶液と検体との接触は、環境温度において行うことができ、必要に応じ、タンパク質等の成分の劣化がより生じにくい冷却条件下で行ってもよい。接触は、細胞内抗原が十分抽出できる時間、例えば数秒〜数時間行うことができ、接触の際には必要に応じ、撹拌、振とうを行ってもよい。 If necessary, the alkaline solution containing the anionic surfactant can be contacted with the sample at an environmental temperature, and if necessary, even under cooling conditions where deterioration of components such as proteins is less likely to occur. Good. The contact can be carried out for a time during which the intracellular antigen can be sufficiently extracted, for example, several seconds to several hours, and the contact may be carried out with stirring and shaking as necessary.
［中和液について］
本発明では、検体に含まれる細菌の細胞内成分であるリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を、アルカリ溶液を用いて抽出できることを先記した。この抽出液を免疫クロマトグラフィー法に直接用いると免疫クロマトグラフィー法で用いる抗体が変性してしまい、検出することができない。そこで免疫クロマトグラフィー法で測定する前に抽出液のｐＨを中和することが好ましい。
[About neutralizer]
In the present invention, it has been described above that the ribosomal protein L7 / L12, which is an intracellular component of bacteria contained in a sample, can be extracted using an alkaline solution. If this extract is used directly in the immunochromatography method, the antibody used in the immunochromatography method is denatured and cannot be detected. Therefore, it is preferable to neutralize the pH of the extract before measuring by immunochromatography.
中和後のｐＨは、抗リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体が適切に機能する範囲であれば特に限定はされないが、本発明者らの検討によると、ｐＨは、１０．０以下とすることができ、９．８以下であることが好ましい。ｐＨ値が１０を超えると、抗体が変性する恐れがあるからである。ｐＨの下限値は、主として中和液に含まれる緩衝液の能力によって定まる。中和後のｐＨは、例えば６．９以上、ｐＨ７．０以上、又はｐＨ７．２以上であり得る。 The pH after neutralization is not particularly limited as long as the anti-ribosome protein L7 / L12 antibody functions appropriately, but according to the study by the present inventors, the pH can be 10.0 or less. , 9.8 or less is preferable. This is because if the pH value exceeds 10, the antibody may be denatured. The lower limit of pH is mainly determined by the capacity of the buffer solution contained in the neutralizing solution. The pH after neutralization can be, for example, 6.9 or higher, pH 7.0 or higher, or pH 7.2 or higher.
ところで、本発明者らの検討では、検体をアルカリ溶液に接触させた後、特定の条件で中和して得た中和物を免疫測定法で測定した場合、偽陽性反応が発生することが新たに判った。検体をアルカリ溶液で処理することで、抗リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体と非特異反応を起こす成分が生じたものと推測される。また、このような偽陽性反応は、検体が咽頭ぬぐい液以外でも鼻咽頭ぬぐい液、鼻腔吸引液、唾液、喀痰でも同様に生じた。 By the way, in the study by the present inventors, a false positive reaction may occur when a neutralized product obtained by contacting a sample with an alkaline solution and then neutralizing under specific conditions is measured by an immunoassay method. I found out anew. It is presumed that the treatment of the sample with an alkaline solution produced a component that caused a non-specific reaction with the anti-ribosome protein L7 / L12 antibody. In addition, such a false positive reaction occurred not only when the sample was a pharyngeal swab, but also when the sample was a nasopharyngeal swab, a nasal aspirate, saliva, and sputum.
そのため、本発明者らは本発明の方法においては、この偽陽性反応を抑制する手段を講じることが有効であることを見出した。本発明においては、中和液は、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む。「偽陽性反応抑制上有効」とは、検体をアルカリで処理する際に発生する偽陽性反応を防止又は低減する効果があることをいう。偽陽性反応抑制上有効な手段は、当業者であれば予備実験を行い、適宜既存の手段（例えば、緩衝液）の中から、試行錯誤を要さず選択することができる。既存のものから選択するというこの行為自体は一般的であるが、本発明で用いる検体がアルカリ処理すると偽陽性を示すことは本発明者らによって初めて確認されたものであり、その偽陽性反応の抑制が、特定の緩衝液等によって達成できることも本発明者らによって初めて発見されたものである。偽陽性反応は、本発明者らの検討によるとアルカリ溶液と検体が接触することで生じ、アルカリ溶液中の陰イオン性界面活性剤の有無には関わらない。偽陽性反応抑制上有効な手段が講じやすいとの観点からは、抗体として、細胞内抗原に対する抗体を用いることが好ましく、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体を用いることがさらに好ましい。偽陽性反応抑制上有効な手段の例は、検出対象となる細菌がクラジミア・ニューモニエ、レジオネラ・ニューモフィラ、又はヘモフィルス・インフルエンザであり、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を検出する場合、中和液がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液及び／又はリン酸緩衝液を含むことである。このような中和液を用いることで、検体がアルカリ溶液と接触することで生じる成分に起因する偽陽性反応を抑制し、高い検出精度を達成することが可能となる。 Therefore, the present inventors have found that it is effective to take measures to suppress this false positive reaction in the method of the present invention. In the present invention, the neutralizing solution contains an effective means for suppressing a false positive reaction in the immunoassay. “Effective in suppressing false positive reactions” means having the effect of preventing or reducing false positive reactions that occur when a sample is treated with an alkali. Those skilled in the art can carry out preliminary experiments and appropriately select from existing means (for example, buffer solution) without trial and error as a means effective for suppressing false positive reactions. This act of selecting from existing ones is common, but it was first confirmed by the present inventors that the sample used in the present invention shows false positives when treated with alkali, and the false positive reaction It was also discovered for the first time by the present inventors that suppression can be achieved by a specific buffer solution or the like. According to the studies by the present inventors, the false positive reaction occurs when the alkaline solution comes into contact with the sample, regardless of the presence or absence of the anionic surfactant in the alkaline solution. From the viewpoint that effective measures for suppressing false positive reactions can be easily taken, it is preferable to use an antibody against an intracellular antigen as an antibody, and it is more preferable to use a ribosomal protein L7 / L12 antibody. An example of an effective means for suppressing a false positive reaction is that when the bacterium to be detected is Crazimia pneumoniae, Legionella pneumophila, or Haemophilus influenza, and the ribosome protein L7 / L12 antigen is detected, the neutralizing solution is Tris. Includes (hydroxymethyl) aminomethane buffer and / or phosphate buffer. By using such a neutralizing solution, it is possible to suppress false positive reactions caused by components caused by contact of a sample with an alkaline solution and achieve high detection accuracy.
また、本発明の中和液には、緩衝液の他に非イオン性界面活性剤を添加することもできる。非イオン性界面活性剤を添加することで、後工程の免疫クロマトグラフィー法で試験液の流れ性が向上する。 In addition to the buffer solution, a nonionic surfactant can be added to the neutralizing solution of the present invention. By adding a nonionic surfactant, the flowability of the test solution is improved by the immunochromatography method in the subsequent step.
本発明で中和液に添加して用いることができる非イオン性界面活性剤は、免疫クロマトグラフィー法で溶液の展開性を向上せしめるものであればよく、具体的には例えば、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテル、ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレートなどを用いることが可能であり、中でもポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテルが好ましい。 The nonionic surfactant that can be added to the neutralizing solution in the present invention may be any one that improves the expandability of the solution by immunochromatography. Specifically, for example, poly (oxyethylene). ) Nonylphenyl ether, poly (oxyethylene) poly (oxypropylene) alkyl ether, poly (oxyethylene) alkyl ether, poly (oxyethylene) octylphenyl ether, poly (oxyethylene) sorbitan monolaurate, etc. can be used. Of these, poly (oxyethylene) poly (oxypropylene) alkyl ether is preferable.
アルカリ溶液による検体抽出物と中和液との接触は、環境温度において行うことができ、必要に応じ、タンパク質等の成分の劣化がより生じにくい冷却条件下で行ってもよい。接触は、中和に必要な時間、例えば数秒〜数時間行うことができ、接触の際には必要に応じ、撹拌、振とうを行ってもよい。 The contact between the sample extract and the neutralizing solution with an alkaline solution can be performed at an environmental temperature, and if necessary, it may be performed under cooling conditions in which deterioration of components such as proteins is less likely to occur. The contact can be carried out for the time required for neutralization, for example, several seconds to several hours, and the contact may be agitated and shaken as necessary.
［方法、装置及びキットについて］
本発明の方法は、免疫測定法により、細菌の細胞内抗原を検出するものである。本発明に用いられる免疫測定法には特に限定はなく、例えば、免疫クロマトグラフィー法、凝集反応法、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）、放射能免疫測定法（ＲＩＡ法）、又は蛍光免疫測定法（ＦＩＡ法）などを挙げることができる。
[About methods, devices and kits]
The method of the present invention is for detecting intracellular antigens of bacteria by immunoassay. The immunoassay used in the present invention is not particularly limited, and is, for example, an immunochromatography method, an agglutination reaction method, an enzyme-linked immunosorbent assay method (ELISA method), a radioimmunoassay method (RIA method), or a fluorescent immunoassay method. (FIA method) and the like can be mentioned.
［免疫クロマトグラフィー装置及びキットについて］
本発明の方法は、好ましい態様の一つにおいて、免疫クロマトグラフィー法（「免疫クロマト法」ということもある）を利用した装置又はキットを用いる。キットは、免疫クロマトグラフィー装置を含み、それ以外に、検体と接触させ、検体に含まれる細菌の細胞内抗原を抽出し、検体抽出物を得るためのアルカリ溶液、及び／又は検体抽出物と接触させ、中和物を得るための中和液を含んでいてもよい。アルカリ溶液及び中和液については、上述した。キットはさらに、検体を採取するための用具、例えば綿棒、及び／又は吸引カテーテルを含んでいてもよい。
[About immunochromatography equipment and kits]
In one of the preferred embodiments, the method of the present invention uses an apparatus or kit that utilizes an immunochromatography method (sometimes referred to as "immunochromatography"). The kit includes an immunochromatographic device, which is otherwise contacted with a sample, an alkaline solution for extracting the intracellular antigens of the bacteria contained in the sample, and / or contacting the sample extract. It may contain a neutralizing solution for obtaining a neutralized product. The alkaline solution and the neutralizing solution have been described above. The kit may further include tools for collecting specimens, such as cotton swabs and / or suction catheters.
免疫クロマトグラフィー装置は、細菌の有無を判定するための判定部を有し、判定部上には抗原である細菌の細胞内抗原、例えばリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体が固定される。キット又は免疫クロマトグラフィー装置は、固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体を用いるサンドイッチアッセイ（「サンドイッチ免疫アッセイ」ということもある。）を利用したものでもよい。 The immunochromatography apparatus has a determination unit for determining the presence or absence of bacteria, and an antibody against an intracellular antigen of the bacterium, for example, ribosomal protein L7 / L12, which is an antigen, is immobilized on the determination unit. The kit or immunochromatographic apparatus may utilize a sandwich assay (sometimes referred to as a "sandwich immunoassay") using an antibody that binds to a site different from the immobilized antibody.
より詳細には、抗原である細菌の細胞内抗原は、判定部に固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体と、判定部に固定化された抗体とを用いてサンドイッチアッセイ法により検出することができる。あるいは、標識された抗原と、判定部上に固定化された抗体とは異なる部位と結合する抗体を用いて競合法にて検出してもよい。但し、本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法が好ましい。 More specifically, the intracellular antigen of the bacterium, which is an antigen, is detected by a sandwich assay method using an antibody that binds to a site different from the antibody immobilized on the determination unit and an antibody immobilized on the determination unit. can do. Alternatively, the labeled antigen and an antibody that binds to a site different from the antibody immobilized on the determination unit may be used for detection by a competitive method. However, in the present invention, a sandwich assay method in which the detection sensitivity is high and a positive antibody detection line appears is preferable.
図１に、免疫クロマトグラフィー装置の例の、断面模式図を示した。１は基材、２は標識抗体含浸部材、３はクロマト展開用膜担体、４は吸収用部材、５は試料添加用部材を示す。６は細菌の細胞内抗原と反応する抗体が固定された判定部であり、ここに抗原である細菌の細胞内抗原が捕捉されることから、捕捉部位ということもある。 FIG. 1 shows a schematic cross-sectional view of an example of an immunochromatography apparatus. 1 is a base material, 2 is a labeled antibody-impregnated member, 3 is a chromatographic development membrane carrier, 4 is an absorption member, and 5 is a sample addition member. Reference numeral 6 denotes a determination unit in which an antibody that reacts with the intracellular antigen of the bacterium is fixed, and since the intracellular antigen of the bacterium, which is the antigen, is captured here, it may be a capture site.
免疫クロマトグラフィー装置は、公知の方法にて市販の材料を用いて作製することができる。以下のその具体例を示す。 The immunochromatographic apparatus can be prepared by a known method using commercially available materials. The following is a specific example.
［基材について］
装置基材としては、水溶液と界面を形成することが可能な固体、ならびにそれらの表面を改質してなる固体である。基材の材質としては、入手のしやすさや安定性、安全性、成形性及び滅菌性に優れるという点でポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアクリルアミド、ポリウレタン等の合成高分子、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、キチン、キトサン、アルギン酸塩等の天然高分子自体ならびにそれを架橋した構造体や改質した構造体、ヒドロキシアパタイト、ガラス、アルミナ、チタニア等の無機材料、ステンレス、チタン、アルミニウム等の金属を用いることができる。中でも合成高分子や天然高分子誘導体が好ましい。また基材の形状としては平板、メッシュ、織布、不織布、スポンジ状構造体、３次元成型体（ブロック状）等で用いることができ、中でも平板が好ましい。
[About base material]
The device base material is a solid capable of forming an interface with an aqueous solution, and a solid obtained by modifying the surface thereof. As the material of the base material, synthesis of polyethylene, polypropylene, polystyrene, acrylic resin, nylon, polyester, polycarbonate, polyacrylamide, polyurethane, etc. in terms of easy availability, stability, safety, moldability and sterility. Natural polymers such as polymers, agarose, cellulose, nitrocellulose, cellulose acetate, chitin, chitosan, and alginate, as well as cross-linked structures and modified structures, and inorganic substances such as hydroxyapatite, glass, alumina, and titania. Materials, metals such as stainless steel, titanium and aluminum can be used. Of these, synthetic polymers and natural polymer derivatives are preferable. Further, as the shape of the base material, a flat plate, a mesh, a woven fabric, a non-woven fabric, a sponge-like structure, a three-dimensional molded body (block shape) or the like can be used, and a flat plate is particularly preferable.
［標識抗体、及び標識抗体含浸部材について］
標識抗体含浸部材には標識化された抗体が保持されている。標識としては、着色粒子、酵素、ラジオアイソトープなどが挙げられるが、特殊な設備不要で目視によって検出可能な着色粒子を使用することが好ましい。着色粒子としては、金や白金などの金属微粒子（金コロイド粒子、白金コロイド粒子ということもある。）、非金属粒子、ラテックス粒子などが挙げられ、好ましくは金コロイド粒子であるが、これらに限定されるものではない。着色粒子は、試験片の空隙内を通って下流に輸送されることができるサイズであればいかなるサイズでもよいが、直径が１ｎｍから１０μｍが好ましい。より好ましくは、５ｎｍから１μｍであり、さらに好ましくは１０ｎｍから１００ｎｍである。
標識抗体含浸部材に使用する材料は、免疫クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、セルロース誘導体等の繊維マトリックス、濾紙、ガラス繊維、布、綿等であり、より好ましくはガラス繊維である。
[About labeled antibody and labeled antibody impregnated member]
A labeled antibody is retained in the labeled antibody-impregnated member. Examples of the label include colored particles, enzymes, radioisotopes and the like, but it is preferable to use colored particles that can be visually detected without the need for special equipment. Examples of the colored particles include metal fine particles such as gold and platinum (sometimes referred to as gold colloid particles and platinum colloid particles), non-metal particles, latex particles, and the like, and are preferably gold colloid particles, but are limited thereto. It is not something that is done. The colored particles may be of any size as long as they can be transported downstream through the voids of the test piece, but are preferably 1 nm to 10 μm in diameter. It is more preferably 5 nm to 1 μm, and even more preferably 10 nm to 100 nm.
The material used for the labeled antibody-impregnated member is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but is preferably a fiber matrix such as a cellulose derivative, filter paper, glass fiber, cloth, cotton, or the like, and more preferably glass. It is a fiber.
［クロマト展開用担体について］
クロマト展開用担体に使用する材料は、免疫クロマトグラフィーを行えるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ニトロセルロース、混合ニトロセルロースエステル、ポリビニリデンフロライド、ナイロン等である。
[About the carrier for chromatographic development]
The material used for the carrier for chromatography development is not particularly limited as long as it can perform immunochromatography, but nitrocellulose, mixed nitrocellulose ester, polyvinylidene fluoride, nylon and the like are preferable.
［判定部について］
前述したクロマト展開用担体には判定部を設けてあり、ここには細菌の細胞内抗原に結合する抗体が固定化されている。この判定部（すなわちクロマト展開用担体）への抗体の固定化においては、基材表面に抗体分子が直接結合していてもよいし、又は活性基を介して結合していてもよい。基材から抗体分子又は活性基が基材表面に固定化された状態であれば、いずれの結合状態であってもよい。結合状態としては、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス結合、水素結合又は疎水結合の単独又はこれら複数の合力があげられる。特に抗体溶液と基材表面との単純な接触による物理的な吸着法は、簡便で本発明に特に好適に用いられる。また抗体の吸着後に基材表面を洗浄や乾燥させること、あるいは基材表面に抗体溶液を塗布後に水分を蒸発せしめて基材表面に抗体を固定化する方法も、本発明に極めて好適に使用することができる。
[About the judgment unit]
The above-mentioned carrier for chromatographic development is provided with a determination unit, in which an antibody that binds to the intracellular antigen of the bacterium is immobilized. In the immobilization of the antibody on the determination unit (that is, the carrier for chromatographic development), the antibody molecule may be directly bound to the surface of the substrate, or may be bound via an active group. Any binding state may be used as long as the antibody molecule or active group is immobilized on the surface of the base material from the base material. Examples of the bonding state include a covalent bond, an ionic bond, a van der Waals bond, a hydrogen bond, a hydrophobic bond alone, or a plurality of these combined forces. In particular, the physical adsorption method by simple contact between the antibody solution and the surface of the substrate is simple and is particularly preferably used in the present invention. Further, a method of washing or drying the surface of the base material after adsorption of the antibody, or applying an antibody solution to the surface of the base material and then evaporating water to immobilize the antibody on the surface of the base material is also extremely preferably used in the present invention. be able to.
検体に含まれる細菌の細胞内抗原が、前述した標識化された抗体と結合しながらクロマト展開用担体を展開した後、判定部にて標識化された抗体とは異なる部位で結合する抗体と抗原を挟んでサンドイッチを形成することにより、細菌の細胞内抗原を検出できる（サンドイッチアッセイ法）。
なお、判定部に固定化された抗体と、標識化された抗体は、いずれも細菌の細胞内抗原と反応する抗体であり、１つの該タンパク質に同時に結合できることができる抗体である。したがって一方の抗体が結合するエピトープは、他方の抗体が結合するエピトープとは異なることが好ましい。
また、判定部に標識された抗原が保持されている場合には、競合法により特定物質を検出することができる（競合アッセイ法）。本発明においては、検出感度が高く、陽性で抗体検出ラインが出現するサンドイッチアッセイ法の方が好ましい。
The intracellular antigen of the bacterium contained in the sample develops a carrier for chromatographic development while binding to the labeled antibody described above, and then the antibody and antigen that bind at a site different from the antibody labeled by the determination unit. Bacterial intracellular antigens can be detected by forming a sandwich between the two (sandwich assay method).
The antibody immobilized on the determination unit and the labeled antibody are both antibodies that react with the intracellular antigen of the bacterium, and are antibodies that can simultaneously bind to one of the proteins. Therefore, the epitope to which one antibody binds is preferably different from the epitope to which the other antibody binds.
In addition, when the labeled antigen is retained in the determination unit, a specific substance can be detected by a competitive method (competitive assay method). In the present invention, a sandwich assay method in which the detection sensitivity is high and a positive antibody detection line appears is preferable.
［抗体の作製方法］
本発明で用いる抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれでもよいが好ましくはモノクローナル抗体である。
リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体は、国際公開第００／０６６０３号公報（前掲特許文献１）に記載の方法で作製することができる。抗体は、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長タンパク質あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができるが、全長タンパク質を抗原として作製することが好ましい。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質をそのまま、又はキャリアタンパク質と架橋した後必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種せしめ、その血清を回収することでＬ７／Ｌ１２リボソームタンパク質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また抗血清より抗体を精製して使用することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にポリクローナル抗体作製にはヒツジ、ウサギなどが好ましい。また、抗体としてはハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法により取得したモノクローナル抗体を適用することがより好ましいが、この場合はマウスが好ましい。当該モノクローナル抗体として、特定の細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２と反応し、特定の細菌とは異なる種に属する細菌、又は異なる属に属する細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２とは反応しないモノクローナル抗体をスクリーニングすることにより、当該細菌による感染症にかかっているかどうかの診断に役立てることが可能となる。リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原以外の細胞内抗原を抗原として用いる場合も、同様に抗体を作成することができる。なお以下では、本発明を、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を検出する態様を例に説明することがあるが、その説明は、当業者であれば、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２以外の細胞内抗原を抗原として用いる場合にも適宜あてはめて理解することができる。
[How to prepare antibody]
The antibody used in the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
Antibodies to the ribosomal proteins L7 / L12 can be prepared by the method described in International Publication No. 00/06603 (Patent Document 1 above). The antibody can be prepared by using the full-length protein of the ribosomal protein L7 / L12 or a partial peptide thereof as an antigen, but it is preferable to prepare the antibody by using the full-length protein as an antigen. This partial peptide or full-length protein is used as it is, or after cross-linking with a carrier protein, it is inoculated into an animal with an adjuvant as needed, and the serum is collected to recognize an antibody (polyclonal antibody) that recognizes the L7 / L12 ribosome protein. Serum can be obtained. It is also possible to purify the antibody from antiserum and use it. The animals to be inoculated include sheep, horses, goats, rabbits, mice, rats and the like, and sheep, rabbits and the like are particularly preferable for producing polyclonal antibodies. Further, as the antibody, it is more preferable to apply a monoclonal antibody obtained by a known method for producing hybridoma cells, but in this case, a mouse is preferable. As the monoclonal antibody, a monoclonal antibody that reacts with the ribosome protein L7 / L12 of a specific bacterium and does not react with the ribosome protein L7 / L12 of a bacterium belonging to a species different from the specific bacterium or a bacterium belonging to a different genus is screened. This makes it possible to use it for diagnosing whether or not an infectious disease caused by the bacterium is present. When an intracellular antigen other than the ribosomal protein L7 / L12 antigen is used as an antigen, an antibody can be produced in the same manner. In the following, the present invention may be described by exemplifying an embodiment of detecting a ribosomal protein L7 / L12 antigen, but those skilled in the art may use an intracellular antigen other than the ribosomal protein L7 / L12 as an antigen. It can be understood by applying it as appropriate even when it is used as.
本発明では検体に含まれる細菌が抗体を用いて検出される。ここで用いられる抗体は、該細菌の細胞内抗原、例えばリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原と種特異的又は属選択的に反応する抗体である。ここで、「種に特異的」とは、該細菌が属するある特定の種の細菌とのみ反応し、該細菌が属する属以外の、他の属に属する細菌、並びに該細菌が属する属の、上記特定の種以外の種の細菌とは反応しないことを意味する。また、「属に選択的」とは、該細菌が属する属の一部又はすべての細菌とのみ反応し、該細菌が属する属以外の他の属に属する細菌とは反応しないことを意味する。 In the present invention, bacteria contained in a sample are detected using an antibody. The antibody used here is an antibody that reacts with the intracellular antigen of the bacterium, for example, the ribosomal protein L7 / L12 antigen in a species-specific or genus-selective manner. Here, "species-specific" means a bacterium belonging to another genus other than the genus to which the bacterium belongs, and a genus to which the bacterium belongs, which reacts only with a bacterium of a specific species to which the bacterium belongs. It means that it does not react with bacteria of species other than the above specific species. Further, "selective to a genus" means that it reacts only with a part or all of the genus to which the bacterium belongs, and does not react with a bacterium belonging to a genus other than the genus to which the bacterium belongs.
本態様で用いる抗体は、細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長あるいはその部分ペプチドを抗原として用いて作製することができる。細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列は公知である。
例えば、クラミジア・ニューモニエではＷＯ０１／０５７０８９に記載されており、レジオネラ・ニューモフィラでは特開２００４−２０１６０５に記載されている。また、ヘモフィルス・インフルエンザではＷＯ００／０６６０３に記載されている。
The antibody used in this embodiment can be prepared by using the full length of the bacterial ribosomal protein L7 / L12 or a partial peptide thereof as an antigen. The amino acid sequence of the bacterial ribosomal protein L7 / L12 is known.
For example, in Chlamydia pneumoniae, it is described in WO01 / 057089, and in Legionella pneumophila, it is described in JP-A-2004-201605. Also, for Haemophilus influenza, it is described in WO00 / 06603.
本態様で用いる細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原に対する抗体は、以下のａ）又はｂ）記載の方法、あるいはその他の類似の方法によって取得することができるが、これらの方法に限定されるものではない。 Antibodies to the bacterial ribosomal protein L7 / L12 antigen used in this embodiment can be obtained by the methods described in a) or b) below, or other similar methods, but are not limited to these methods. Absent.
ａ）リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列は公知であるため、他のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列をコードする遺伝子配列が公知な微生物における該タンパク質のアミノ酸配列との類似性が少ない領域についてアミノ酸数５個から３０個ほどのペプチド断片を合成し、それを免疫原としてポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体を作製することにより目的の抗体を取得することができる。 a) Since the gene sequence encoding the amino acid sequence of ribosomal protein L7 / L12 is known, the gene sequence encoding the amino acid sequence of other ribosomal proteins L7 / L12 is similar to the amino acid sequence of the protein in a known microorganism. A target antibody can be obtained by synthesizing a peptide fragment having about 5 to 30 amino acids in a region having a small amount of amino acids and using it as an immunogen to prepare a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
ｂ）また、既知の該遺伝子の両端部位におけるＤＮＡ配列をプローブとしたＰＣＲ手法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。その後、他のタンパク質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョンタンパク質として用いたタンパク質に対する抗体アフィニティーカラム法などにより発現タンパク質を精製することにより目的とするタンパク質抗原を取得することができる。 b) In addition, the full-length sequence of the gene can be obtained by using a normal gene manipulation method such as gene amplification by a PCR method using DNA sequences at both ends of the known gene as a probe and hybridization method using a homologous partial sequence as a template probe. Can be obtained. After that, a fusion gene with another protein gene is constructed, and the relevant fusion gene is inserted into the host by a known gene transfer method using Escherichia coli or the like as a host and expressed in a large amount, and then antibody affinity for the protein used as the fusion protein. The desired protein antigen can be obtained by purifying the expressed protein by a column method or the like.
この場合、細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の全長タンパク質が抗原となるため、異なる微生物間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても本発明の目的に合致しない。したがって、本法によって取得した抗原に対しては公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２とのみ反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。 In this case, since the full-length protein of the bacterial ribosomal protein L7 / L12 serves as an antigen, obtaining an antibody against an amino acid moiety conserved between different microorganisms does not meet the object of the present invention. Therefore, for the antigen obtained by this method, a hybridoma that produces a monoclonal antibody is obtained by a known method, and a clone that produces an antibody that reacts only with the bacterial ribosomal protein L7 / L12 is selected to obtain the target antibody. Can be obtained.
抗原となるリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の精製度が不足している場合は、公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過などの手法により精製した後、すでに作製した抗体によるウェスタンブロットなどの方法によりリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２の溶出画分を同定しさらに精製度の高いタンパク質を得ることができる。得られた精製細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗原を基にして公知の方法によりハイブリドーマあるいはポリクローナル抗体を取得し、同様に目的の微生物に特異的に反応するハイブリドーマあるいはポリクローナル抗体を選択することにより目的の抗体を取得することができる。 If the degree of purification of the ribosome protein L7 / L12 as an antigen is insufficient, it is purified by a known purification method such as ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, etc., and then Western with the antibody already prepared. The eluted fraction of the ribosome protein L7 / L12 can be identified by a method such as blotting to obtain a protein with a higher degree of purification. A hybridoma or polyclonal antibody is obtained by a known method based on the obtained purified bacterial ribosome protein L7 / L12 antigen, and similarly, a hybridoma or polyclonal antibody that specifically reacts with the target microorganism is selected. Antibodies can be obtained.
［実施例１：免疫測定用キットの作製］
（抗体の準備）
例としてクラミジア・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体の作製方法を述べる。なお、他の細菌についても同様の手順でリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を作製することが可能である。
[Example 1: Preparation of immunoassay kit]
(Preparation of antibody)
As an example, a method for producing an antibody against the ribosome protein L7 / L12 of Chlamydia pneumoniae will be described. For other bacteria, it is possible to prepare an antibody against the ribosomal protein L7 / L12 by the same procedure.
クラミジア・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体は国際公開第０１／０５７０８９号公報に記載の方法で作製することができる。具体的には、例えば、クラミジア・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２のアミノ酸配列の全部又は一部をコードしたＤＮＡを組み込んだ発現ベクターで形質転換した大腸菌をＬＢ培地等を用いて培養し、アフィニティカラムにより発現ベクター由来のタグ配列を利用して融合タンパク質として精製する。この部分ペプチドあるいは全長タンパク質を必要に応じてアジュバントとともに動物へ接種する。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等であり、特にモノクローナル抗体を得る場合にはマウスが好ましい。マウスの脾臓細胞を摘出して骨髄腫細胞と細胞融合して抗体産生ハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマより産生されるモノクローナル抗体をＥＬＩＳＡ法等を用いて選別し、クラミジア・ニューモニエと特異的に反応するモノクローナル抗体を取得する。
なお他の細菌についても上述した方法を用いてリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を作製することができる。
Antibodies to Chlamydia pneumoniae ribosomal proteins L7 / L12 can be prepared by the method described in WO 01/057089. Specifically, for example, Escherichia coli transformed with an expression vector incorporating DNA encoding all or part of the amino acid sequence of the ribosomal protein L7 / L12 of Chlamydia pneumoniae is cultured in an LB medium or the like, and an affinity column is used. Purify as a fusion protein using the tag sequence derived from the expression vector. The animal is inoculated with this partial peptide or full-length protein with an adjuvant as needed. The animals to be inoculated include sheep, horses, goats, rabbits, mice, rats and the like, and mice are particularly preferable when obtaining a monoclonal antibody. Mouse spleen cells are removed and fused with myeloma cells to produce antibody-producing hybridomas. Monoclonal antibodies produced from hybridomas are selected by using an ELISA method or the like to obtain a monoclonal antibody that specifically reacts with Chlamydia pneumoniae.
For other bacteria, antibodies against the ribosomal proteins L7 / L12 can be prepared by using the above-mentioned method.
（免疫クロマトグラフィー装置の作製）
例としてクラミジア・ニューモニエ用免疫クロマトグラフィー装置（ＣＰ用装置）の作製手順を下記に述べる。なお他の細菌についても同様の手順で免疫クロマトグラフィー装置を作製することが可能である。
(Preparation of immunochromatography equipment)
As an example, the procedure for producing an immunochromatographic device for Chlamydia pneumoniae (device for CP) is described below. For other bacteria, it is possible to prepare an immunochromatography apparatus by the same procedure.
＜クロマト展開用膜担体の作製＞
クラミジア・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体及びトレハロースをそれぞれ２．０ｍｇ／ｍｌ及び３％（ｖ／ｖ）となるように５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液に希釈した。これを、市販のニトロセルロース膜を幅２．５ｃｍ、長さ３０ｃｍにカットしたものに１ｃｍあたり１μｌ液量で塗布し、その後乾燥させて、クロマト展開用膜担体とした。
<Preparation of membrane carrier for chromatographic development>
Antibodies to Chlamydia pneumoniae ribosomal proteins L7 / L12 and trehalose were diluted in 50 mM sodium phosphate buffer to 2.0 mg / ml and 3% (v / v), respectively. This was applied to a commercially available nitrocellulose membrane cut into a width of 2.5 cm and a length of 30 cm at a liquid amount of 1 μl per 1 cm, and then dried to obtain a membrane carrier for chromatographic development.
＜金コロイド標識抗体及び標識抗体含浸部材の作製＞
金コロイド溶液（粒径６０ｎｍ）に１／１０量の０．１Ｍ感作Ｂｕｆｆｅｒとクラミジア・ニューモニエのリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を加えて混合し、室温で３０分間静置して抗体を金コロイド粒子表面に結合させた後、金コロイド溶液における最終濃度が０．１％となるように１％ウシ血清アルブミン水溶液を加えてブロッキングし、金コロイド標識クラミジア・ニューモニエ・リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２抗体液を調製した。
この液を市販のガラス繊維シートに浸み込ませた後、湿度０〜６０％の乾燥庫にて一晩乾燥させて、標識抗体浸潤部材とした。
＜免疫クロマトグラフィー装置の組み立て＞
上述した手順で作製したクロマト展開用膜担体及び金コロイド標識抗体含浸部材に加えて、さらに試料添加用部材として綿布と、吸収用部材として濾紙を用意した。そして、これらの部材を基材に貼り合せた後、６ｍｍ幅に切断し、図１と同様の免疫クロマトグラフィー装置を作製した。
<Preparation of colloidal gold labeled antibody and labeled antibody impregnated member>
Add 1/10 amount of 0.1M sensitized buffer and antibody against Chlamydia pneumoniae ribosome protein L7 / L12 to a colloidal gold solution (particle size 60 nm), mix, and leave at room temperature for 30 minutes to allow the antibody to colloidal gold. After binding to the particle surface, 1% bovine serum albumin aqueous solution was added so that the final concentration in the gold colloid solution was 0.1% to block, and the gold colloid-labeled Chlamydia pneumoniae ribosome protein L7 / L12 antibody solution was applied. Prepared.
This solution was soaked in a commercially available glass fiber sheet and then dried overnight in a drying chamber having a humidity of 0 to 60% to obtain a labeled antibody infiltration member.
<Assembly of immunochromatography device>
In addition to the chromatographic development membrane carrier and the gold colloid-labeled antibody-impregnated member prepared by the above procedure, a cotton cloth was further prepared as a sample addition member, and a filter paper was prepared as an absorption member. Then, after attaching these members to the base material, they were cut into a width of 6 mm to prepare an immunochromatography apparatus similar to that in FIG.
［実施例２：抽出液の調製］
５０ｍＭ水酸化ナトリウム（和光純薬）にコール酸ナトリウム（和光純薬）を０．５％濃度になるように溶解した。
[Example 2: Preparation of extract]
Sodium cholic acid (Wako Pure Drug) was dissolved in 50 mM sodium hydroxide (Wako Pure Drug) to a concentration of 0.5%.
［実施例３：中和液の調製１］
リン酸水素二カリウム（和光純薬）３４．８４ｇを蒸留水に溶解して４００ｍｌにメスアップし０．５Ｍリン酸水素二カリウム水溶液とした。さらにリン酸二水素カリウム（和光純薬）１７．０１ｇを蒸留水に溶解して２５０ｍｌにメスアップし０．５Ｍリン酸二水素カリウム水溶液とした。これらを混合して０．５Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）を調製した。
ビーカーに塩化ナトリウム（和光純薬）０．５８ｇ、ウシ血清アルブミン０．２５ｇ（ＳＩＧＭＡ）、アジ化ナトリウム（和光純薬）０．０２５ｇ、ＰＢＣ−４４（日光ケミカルズ）０．５ｇをそれぞれ量りとり、上記の５００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して５０ｍｌにメスアップした（中和液(1)）。
[Example 3: Preparation of neutralizing solution 1]
34.84 g of dipotassium hydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in distilled water and increased to 400 ml to prepare a 0.5 M aqueous solution of dipotassium hydrogen phosphate. Further, 17.01 g of potassium dihydrogen phosphate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in distilled water and increased to 250 ml to prepare a 0.5 M aqueous potassium dihydrogen phosphate solution. These were mixed to prepare a 0.5 M potassium phosphate buffer solution (pH 7.0).
Weigh 0.58 g of sodium chloride (Wako Pure Chemicals), 0.25 g of bovine serum albumin (SIGMA), 0.025 g of sodium azide (Wako Pure Chemicals), and 0.5 g of PBC-44 (Nikko Chemicals) in a beaker. It was dissolved in the above-mentioned 500 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) and adjusted to 50 ml (neutralizing solution (1)).
最終組成は下記のとおりである。
中和液(1)：０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、１．０％ＰＢＣ−４４、０．０５％ＮａＮ３、０．５Ｍ リン酸Ｋ／ｐＨ６．８
The final composition is as follows.
Neutralizing solution (1): 0.2M NaCl, 0.5% BSA, 1.0% PBC-44, 0.05% NaN3, 0.5M K / pH 6.8
［実施例４：中和液の調製２］
ビーカーに塩化ナトリウム（和光純薬）０．５８ｇ、ウシ血清アルブミン０．２５ｇ（ＳＩＧＭＡ）、アジ化ナトリウム（和光純薬）０．０２５ｇ、ＰＢＣ−４４（日光ケミカルズ）０．５ｇをそれぞれ量りとり、４０ｍｌの蒸留水に溶解した。これを８本調製した。
[Example 4: Preparation of neutralizing solution 2]
Weigh 0.58 g of sodium chloride (Wako Pure Drug), 0.25 g of bovine serum albumin (SIGMA), 0.025 g of sodium azide (Wako Pure Drug), and 0.5 g of PBC-44 (Nikko Chemicals) in a beaker. It was dissolved in 40 ml of distilled water. Eight of these were prepared.
８本のうち１本に、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．０３ｇを加え、塩酸を滴下してｐＨ６．６に合わせた後、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(2)）。
８本のうち１本にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン３．０３ｇを加え、リン酸を滴下してｐＨ６．６に合わせた後、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(3)）。
８本のうち１本にＨＥＰＥＳ（同仁堂）２．３８ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(4)）。
８本のうち１本にホウ酸（和光純薬）１．５５ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(5)）。
８本のうち１本にＢｉｃｉｎｅ（同仁堂）２．０４ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(6)）
８本のうち１本にＢＥＳ（同仁堂）２．６７ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(7)）。
８本のうち１本にＴＥＳ（同仁堂）２．８７ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(8)）。
８本のうち１本にＴＡＰＳＯ（同仁堂）３．２４ｇを加え、蒸留水で５０ｍｌにメスアップした（中和液(9)）。
To one of the eight bottles, 3.03 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane was added, hydrochloric acid was added dropwise to adjust the pH to 6.6, and then the mixture was adjusted to 50 ml with distilled water (neutralizing solution (2)). ..
3.03 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane was added to one of the eight bottles, phosphoric acid was added dropwise to adjust the pH to 6.6, and the mixture was adjusted to 50 ml with distilled water (neutralizing solution (3)). ..
2.38 g of HEPES (Dojindo) was added to one of the eight bottles, and the mixture was made up to 50 ml with distilled water (neutralizing solution (4)).
1.55 g of boric acid (Wako Junyaku) was added to one of the eight bottles, and the mixture was made up to 50 ml with distilled water (neutralizing solution (5)).
2.04 g of Bicine (Dojindo) was added to one of the eight bottles, and the mixture was adjusted to 50 ml with distilled water (neutralizing solution (6)).
2.67 g of BES (Dojindo) was added to one of the eight bottles, and the mixture was made up to 50 ml with distilled water (neutralizing solution (7)).
2.87 g of TES (Dojindo) was added to one of the eight bottles, and the mixture was made up to 50 ml with distilled water (neutralizing solution (8)).
3.24 g of TAPSO (Dojindo) was added to one of the eight bottles, and the mixture was made up to 50 ml with distilled water (neutralizing solution (9)).
各中和液の最終組成は下記のとおりである。
中和液(2)：０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、１．０％ＰＢＣ−４４、０．０５％ＮａＮ３、０．３Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−ＨＣｌ／ｐＨ６．６
中和液(3)：０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、１．０％ＰＢＣ−４４、０．０５％ＮａＮ３、０．３Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−リン酸／ｐＨ６．６
中和液(4)：０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＢＳＡ、１．０％ ＰＢＣ−４４、０．０５％ ＮａＮ３、０．２Ｍ ＨＥＰＥＳ
中和液(5)：０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＢＳＡ、１．０％ ＰＢＣ−４４、０．０５％ ＮａＮ３、０．２５Ｍホウ酸
中和液(6)：０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＢＳＡ、１．０％ ＰＢＣ−４４、０．０５％ ＮａＮ３、０．２５ＭＢｉｃｉｎｅ
中和液(7)：０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ ＢＳＡ、１．０％ ＰＢＣ−４４、０．０５％ ＮａＮ３、０．２５Ｍ ＢＥＳ
中和液(8)：０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、１．０％ＰＢＣ−４４、０．０５％ＮａＮ３、０．２５Ｍ ＴＥＳ
中和液(9)：０．２Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ＢＳＡ、１．０％ＰＢＣ−４４、０．０５％ＮａＮ３、０．２５Ｍ ＴＡＰＳＯ
The final composition of each neutralizing solution is as follows.
Neutralizer (2): 0.2M NaCl, 0.5% BSA, 1.0% PBC-44, 0.05% NaN3, 0.3M Tris (hydroxymethyl) aminomethane-HCl / pH 6.6
Neutralizer (3): 0.2M NaCl, 0.5% BSA, 1.0% PBC-44, 0.05% NaN3, 0.3M Tris (hydroxymethyl) aminomethane-phosphate / pH 6.6
Neutralizer (4): 0.2M NaCl, 0.5% BSA, 1.0% PBC-44, 0.05% NaN3, 0.2M HEPES
Neutralizing solution (5): 0.2M NaCl, 0.5% BSA, 1.0% PBC-44, 0.05% NaN3, 0.25M boric acid Neutralizing solution (6): 0.2M NaCl, 0 .5% BSA, 1.0% PBC-44, 0.05% NaN3, 0.25MBicine
Neutralizer (7): 0.2M NaCl, 0.5% BSA, 1.0% PBC-44, 0.05% NaN3, 0.25M BES
Neutralizing solution (8): 0.2M NaCl, 0.5% BSA, 1.0% PBC-44, 0.05% NaN3, 0.25M TES
Neutralizer (9): 0.2M NaCl, 0.5% BSA, 1.0% PBC-44, 0.05% NaN3, 0.25M TAPSO
［実施例５：検体をアルカリ溶液及び中和液で処理することによる偽陽性の発生、及び中和液を構成する緩衝液による偽陽性の抑制効果］
（検体の採取）
滅菌綿棒（平和メディク製、咽頭用）を用いてヒトの咽頭後壁を擦過し、これを検体とした。
[Example 5: Generation of false positives by treating the sample with an alkaline solution and a neutralizing solution, and the effect of suppressing false positives by the buffer solution constituting the neutralizing solution]
(Collection of samples)
The posterior wall of the human pharynx was scraped with a sterile cotton swab (manufactured by Heiwa Medic, for the pharynx), and this was used as a sample.
（検体を含んだサンプルの調製）
≪工程１：検体をアルカリ溶液で処理した後に中和する工程≫
低密度ポリエチレン製のチューブの中に実施例２で調製した抽出液を３００μｌ入れ、この中に検体を採取した綿棒を差し込んで、チューブの外側から５〜２０回よく揉んだ。ここに実施例４で調製した中和液(1)〜(9)のいずれかを２００μｌ添加した後、綿棒を取り出した。得られた溶液を工程１のサンプルとした。
(Preparation of sample including sample)
<< Step 1: Neutralize the sample after treating it with an alkaline solution >>
300 μl of the extract prepared in Example 2 was placed in a tube made of low-density polyethylene, a cotton swab from which a sample was collected was inserted into the tube, and the mixture was thoroughly kneaded 5 to 20 times from the outside of the tube. After adding 200 μl of any of the neutralizing solutions (1) to (9) prepared in Example 4 to this, a cotton swab was taken out. The obtained solution was used as a sample in step 1.
≪工程２：検体をアルカリ溶液と中和液の混合溶液で処理する工程≫
低密度ポリエチレン製のチューブの中に実施例２で調製した抽出液を３００μｌ入れ、ここに実施例４で調製した中和液(1)〜(9)のいずれかを２００μｌ添加した。この中に検体を採取した綿棒を差し込んで、チューブの外側から５〜２０回よく揉んだ後、綿棒を取り出した。得られた溶液を工程２のサンプルとした。
<< Step 2: Process of treating the sample with a mixed solution of an alkaline solution and a neutralizing solution >>
300 μl of the extract prepared in Example 2 was placed in a tube made of low-density polyethylene, and 200 μl of any of the neutralizing solutions (1) to (9) prepared in Example 4 was added thereto. The cotton swab from which the sample was collected was inserted into the swab, and the cotton swab was taken out after kneading well from the outside of the tube 5 to 20 times. The obtained solution was used as a sample in step 2.
（免疫クロマトグラフィー装置での測定）
サンプルを実施例１に記載の手順で作製したクラミジア・ニューモニエ用免疫クロマトグラフィー装置（ＣＰ用装置）及びレジオネラ・ニューモフィラ用免疫クロマトグラフィー装置（ＬＰ用装置）、ヘモフィルス・インフルエンザ用免疫クロマトグラフィー装置（ＨＩ用装置）に１４０μｌずつ滴下し、１５分後に目視で判定を行った。結果を次に示す。
(Measurement with immunochromatography device)
An immunochromatographic device for Chlamydia pneumoniae (device for CP), an immunochromatographic device for Legionella pneumophila (device for LP), and an immunochromatographic device for hemophilus influenza (devices for LP) prepared by preparing samples according to the procedure described in Example 1. 140 μl was added dropwise to the device for HI), and a visual judgment was made 15 minutes later. The results are shown below.
中和液(4)〜(9)（緩衝液の成分として、ＨＥＰＥＳ、ホウ酸、Ｂｉｃｉｎｅ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＴＡＰＳＯのいずれかを含む中和液）を用いた場合、検体を≪工程１≫で処理すると、いずれの免疫クロマトグラフィー装置（ＣＰ用装置、ＬＰ用装置、ＨＩ装置）でも偽陽性が高い頻度で発生した。一方、検体を≪工程２≫で処理すると、いずれの免疫クロマトグラフィー装置でも偽陽性は全く発生しなかった。
これらの結果から、検体がまずアルカリ溶液と接触する（いわゆる≪工程１≫）ことで、抗リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２マウスモノクローナル抗体と非特異反応を起こす成分が生じているものと推測される。
When neutralizing solutions (4) to (9) (neutralizing solutions containing any of HEPES, boric acid, Bicine, BES, TES, and TAPSO as the components of the buffer solution) are used, the sample is prepared in << Step 1 >>. Upon treatment, false positives frequently occurred in all immunochromatographic devices (CP device, LP device, HI device). On the other hand, when the sample was treated in << Step 2 >>, no false positives were generated in any of the immunochromatographic devices.
From these results, it is presumed that when the sample first comes into contact with the alkaline solution (so-called << step 1 >>), a component that causes a non-specific reaction with the anti-ribosome protein L7 / L12 mouse monoclonal antibody is generated.
一方、中和液(1)〜(3)（緩衝液の成分として、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン及び／又はリン酸を含む中和液）を用いた場合、検体を≪工程２≫で処理すると、いずれの免疫クロマトグラフィー装置でも偽陽性は全く発生しなかったのは上述した中和液(4)〜(9)と同じ結果であるが、検体を≪工程１≫で処理した場合は上述した中和液(4)〜(9)とは異なり、いずれの免疫クロマトグラフィーでも偽陽性は全く発生しなかった。
すなわち、中和液(1)〜(3)を用いた場合には、抗リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２マウスモノクローナル抗体と非特異反応を起こす成分の影響を抑制できるという結果が得られた。
On the other hand, when the neutralizing solutions (1) to (3) (neutralizing solutions containing tris (hydroxymethyl) aminomethane and / or phosphoric acid as the components of the buffer solution) are used, the sample is treated in << Step 2 >>. Then, no false positives were generated in any of the immunochromatographic devices, which is the same result as the above-mentioned neutralizing solutions (4) to (9), but when the sample was treated in << Step 1 >>, it was described above. Unlike the neutralized solutions (4) to (9), no false positives occurred in any of the immunochromatography.
That is, when the neutralizing solutions (1) to (3) were used, the result was obtained that the influence of the component causing a non-specific reaction with the anti-ribosome protein L7 / L12 mouse monoclonal antibody could be suppressed.
［実施例６：各細菌の試験菌液の調製］
（クラミジア・ニューモニエ（ＣＰ）の試験菌液の調製）
市販のＣｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ Ａｎｔｉｇｅｎ （Ｍｉｃｒｏｂｉｘ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．（２６５ Ｗａｔｌｉｎｅ Ａｖｅｎｕｅ Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， Ｏｎｔａｒｉｏ， Ｃａｎａｄａ Ｌ４Ｚ １Ｐ３）より購入）を用いた。
[Example 6: Preparation of test bacterial solution for each bacterium]
(Preparation of test bacterial solution of Chlamydia pneumoniae (CP))
A commercially available Chlamydia pneumonia Antigen (purchased from Microbics Biosystem Inc. (265 Watline Avenue Mississauga, Ontario, Canada L4Z 1P3)) was used.
（レジオネラ・ニューモフィラ（ＬＰ）の試験菌液の調製）
レジオネラ・ニューモフィラ（ＡＴＣＣ３３１５２株）をＢＣＹＥ寒天培地（日本ベクトン・ディッキンソン）で３７℃、４日間培養した。増殖した菌体を白金耳を用いて回収し、生理食塩水に懸濁したものを試験菌液として用いた。
(Preparation of test bacterial solution of Legionella pneumophila (LP))
Legionella pneumophila (ATCC 33152 strain) was cultured on BCYE agar medium (Becton Dickinson, Japan) at 37 ° C. for 4 days. The grown bacterial cells were collected using a platinum loop and suspended in physiological saline, which was used as a test bacterial solution.
（ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＩ）の試験菌液の調製）
ヘモフィルス・インフルエンザ（ＡＴＣＣ１０２１１株）をポアメディア チョコレート寒天培地（栄研化学）で３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下で１８時間培養した。増殖した菌体を白金耳を用いて回収し、生理食塩水に懸濁したものを試験菌液として用いた。
(Preparation of test bacterial solution for Haemophilus influenza (HI))
Hemophilus influenza (ATCC10211 strain) was cultured in Poremedia chocolate agar medium (Eiken Chemical) for 18 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. The grown bacterial cells were collected using a platinum loop and suspended in physiological saline, which was used as a test bacterial solution.
［実施例７：各種細菌の試験菌液を用いた評価］
（測定用の陽性サンプルの調製）
マイクロチューブに実施例２で調製した抽出液を３００μｌ入れ、この中に実施例６で調製した各種細菌の試験菌液のいずれかひとつを１０μｌ添加した。ここに実施例４で調製した中和液(3)を２００μｌ添加し、得られた溶液を陽性サンプルとした。
上記手順を実施例６で調製した３種類の試験菌液について行った。
[Example 7: Evaluation using test bacterial solutions of various bacteria]
(Preparation of positive sample for measurement)
300 μl of the extract prepared in Example 2 was placed in a microtube, and 10 μl of any one of the test bacterial solutions of various bacteria prepared in Example 6 was added thereto. 200 μl of the neutralizing solution (3) prepared in Example 4 was added thereto, and the obtained solution was used as a positive sample.
The above procedure was performed on the three types of test bacterial solutions prepared in Example 6.
（測定用の陰性サンプルの調製）
マイクロチューブに実施例２で調製した抽出液を３００μｌ入れ、この中にＰＢＳ（和光純薬）を１０μｌ添加した。ここに実施例４で調製した中和液(3)を２００μｌ添加し、得られた溶液を陰性サンプルとした。
(Preparation of negative sample for measurement)
300 μl of the extract prepared in Example 2 was placed in a microtube, and 10 μl of PBS (Wako Pure Chemical Industries) was added thereto. 200 μl of the neutralizing solution (3) prepared in Example 4 was added thereto, and the obtained solution was used as a negative sample.
（免疫クロマトグラフィー装置での測定）
陽性サンプル又は陰性サンプルを、実施例１で作製したクラミジア・ニューモニエ（ＣＰ）用免疫クロマトグラフィー装置、同様に作製したレジオネラ・ニューモフィラ（ＬＰ）用免疫クロマトグラフィー装置、ヘモフィルス・インフルエンザ（ＨＩ）用免疫クロマトグラフィー装置のそれぞれに１４０μｌずつ滴下し、１５分後に目視で判定を行った。結果を次に示す。
(Measurement with immunochromatography device)
An immunochromatographic apparatus for Chlamydia pneumoniae (CP) prepared in Example 1, an immunochromatographic apparatus for Legionella pneumophila (LP) prepared in the same manner, and an immunity for hemophilus influenza (HI), in which a positive sample or a negative sample was prepared. 140 μl was added dropwise to each of the chromatographic devices, and a visual judgment was made after 15 minutes. The results are shown below.
本発明は、細菌感染症の診断において利用することができる。 The present invention can be used in the diagnosis of bacterial infections.
Claims (25)
該検体とアルカリ溶液を接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原であるリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２をアルカリ溶液中に抽出し、検体抽出物を得る抽出工程と、
該検体抽出物と中和液を接触させ中和物を得る中和工程と、
該中和物を細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を検出する検出工程と、
を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む、
方法。 A method of detecting bacteria contained in a sample,
An extraction step in which the sample is brought into contact with an alkaline solution and the ribosomal proteins L7 / L12, which are intracellular antigens of bacteria contained in the sample, are extracted into the alkaline solution to obtain a sample extract.
A neutralization step of contacting the sample extract with a neutralizing solution to obtain a neutralized product,
A detection step of detecting the ribosome protein L7 / L12 by subjecting the neutralized product to an immunoassay using an antibody against the bacterial ribosomal protein L7 / L12.
Including
The neutralizing solution contains effective means for suppressing false positive reactions in the immunoassay.
Method.
該検体とアルカリ溶液を接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原をアルカリ溶液中に抽出し、検体抽出物を得る抽出工程と、
該検体抽出物と中和液を接触させ中和物を得る中和工程と、
該中和物を細菌の細胞内抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該細胞内抗原を検出する検出工程と、
を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む、
方法。 A method for detecting any bacterium selected from the group consisting of Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, and Haemophilus influenza contained in a sample.
An extraction step in which the sample is brought into contact with an alkaline solution and the intracellular antigens of the bacteria contained in the sample are extracted into the alkaline solution to obtain a sample extract.
A neutralization step of contacting the sample extract with a neutralizing solution to obtain a neutralized product,
A detection step of subjecting the neutralized product to an immunoassay using an antibody against the intracellular antigen of a bacterium to detect the intracellular antigen,
Including
The neutralizing solution contains effective means for suppressing false positive reactions in the immunoassay.
Method.
該上気道検体とアルカリ溶液を接触させ、該上気道検体に含まれる細菌の細胞内抗原をアルカリ溶液中に抽出し、上気道検体抽出物を得る抽出工程と、
該上気道検体抽出物と中和液を接触させ中和物を得る中和工程と、
該中和物を細菌の細胞内抗原に対する抗体を用いた免疫測定法に供し、該細胞内抗原を検出する検出工程と、
を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含む、
方法。 A method for detecting bacteria contained in upper respiratory tract specimens.
An extraction step in which the upper respiratory tract sample is brought into contact with an alkaline solution and the intracellular antigens of the bacteria contained in the upper respiratory tract sample are extracted into the alkaline solution to obtain an upper respiratory tract sample extract.
A neutralization step of contacting the upper respiratory tract sample extract with a neutralizing solution to obtain a neutralized product,
A detection step of subjecting the neutralized product to an immunoassay using an antibody against the intracellular antigen of a bacterium to detect the intracellular antigen,
Including
The neutralizing solution contains effective means for suppressing false positive reactions in the immunoassay.
Method.
ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、及び
ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレートからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１０に記載の方法。 The nonionic surfactant is poly (oxyethylene) nonylphenyl ether,
Poly (oxyethylene) poly (oxypropylene) alkyl ether,
Poly (oxyethylene) alkyl ether,
The method according to claim 10, wherein the method is at least one selected from the group consisting of poly (oxyethylene) octylphenyl ether and poly (oxyethylene) sorbitan monolaurate.
該キットが、
該検体と接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原であるリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を抽出し、検体抽出物を得るためのアルカリ溶液と、該検体抽出物と接触させ、中和物を得るための中和液と、中和物が供され、リボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２を検出するための免疫測定法の実施用の免疫測定装置を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含み、
該免疫測定装置が、細菌のリボソームタンパク質Ｌ７／Ｌ１２に対する抗体を含む、
検出キット。 A kit for detecting bacteria contained in a sample,
The kit
Contact with the sample to extract ribosomal proteins L7 / L12, which are intracellular antigens of bacteria contained in the sample, and contact with an alkaline solution for obtaining the sample extract and the sample extract to obtain a neutralized product. An immunoassay device for carrying out an immunoassay for detecting ribosomal proteins L7 / L12, provided with a neutralizing solution for obtaining and a neutralizing product, is included.
The neutralizing solution contains effective means for suppressing false positive reactions in the immunoassay.
The immunoassay device comprises an antibody against the bacterial ribosome protein L7 / L12.
Detection kit.
該キットが、
該検体と接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原を抽出し、検体抽出物を得るためのアルカリ溶液と、該検体抽出物と接触させ、中和物を得るための中和液と、中和物が供され、細胞内抗原を検出するための免疫測定法の実施用の免疫測定装置を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含み、
該免疫測定装置が、細菌の細胞内抗原に対する抗体を含む、
検出キット。 A kit for detecting any of the bacteria selected from the group consisting of Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila, and Haemophilus influenza contained in the sample.
The kit
An alkaline solution for contacting with the sample to extract the intracellular antigen of the bacterium contained in the sample to obtain a sample extract, and a neutralizing solution for contacting with the sample extract to obtain a neutralized product. , Neutralized and containing an immunoassay device for performing immunoassays for detecting intracellular antigens.
The neutralizing solution contains effective means for suppressing false positive reactions in the immunoassay.
The immunoassay device comprises an antibody against the intracellular antigen of the bacterium.
Detection kit.
該キットが、
該上気道検体を採取するための用具と、
該上気道検体と接触させ、該検体に含まれる細菌の細胞内抗原を抽出し、検体抽出物を得るためのアルカリ溶液と、該検体抽出物と接触させ、中和物を得るための中和液と、
該中和物が供され、細胞内抗原を検出するための免疫測定法の実施用の免疫測定装置を含み、
該中和液が、該免疫測定法における偽陽性反応の抑制上有効な手段を含み、
該免疫測定装置が、細菌の細胞内抗原に対する抗体を含む、
検出キット。 A kit for detecting bacteria contained in upper respiratory tract specimens
The kit
A tool for collecting the upper respiratory tract sample and
Contact with the upper respiratory tract sample to extract the intracellular antigen of the bacterium contained in the sample, contact with an alkaline solution for obtaining the sample extract, and contact with the sample extract for neutralization to obtain a neutralized product. With liquid
The neutralized product is provided and comprises an immunoassay device for carrying out an immunoassay for detecting intracellular antigens.
The neutralizing solution contains effective means for suppressing false positive reactions in the immunoassay.
The immunoassay device comprises an antibody against the intracellular antigen of the bacterium.
Detection kit.
ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）アルキルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテル、
ポリ（オキシエチレン）ソルビタンモノラウレートからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項２２に記載の検出キット。 The nonionic surfactant is poly (oxyethylene) nonylphenyl ether,
Poly (oxyethylene) poly (oxypropylene) alkyl ether,
Poly (oxyethylene) alkyl ether,
Poly (oxyethylene) octyl phenyl ether,
The detection kit according to claim 22, which is at least one selected from the group consisting of poly (oxyethylene) sorbitan monolaurate.
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