JP6807680B2 - Subject analysis method - Google Patents
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Description
本発明は、被検体分析方法に関するものである。 The present invention relates to a subject analysis method.
被検体を分析する方法として、該被検体に励起光を照射したときに発生するラマン散乱光のスペクトルに基づく方法が知られている。ラマン散乱スペクトルは被検体の分子振動を反映したものであることから、ラマン散乱スペクトルの形状に基づいて被検体を分析することができる。しかし、この分析方法では、通常、ラマン散乱の効率が非常に小さく、被検体が微量である場合には分析が困難である。このことから、従来、この分析方法が実用的に適用される被検体は、鉱物や高密度なプラスチックなどの物質に限定されてきた。 As a method for analyzing a subject, a method based on the spectrum of Raman scattered light generated when the subject is irradiated with excitation light is known. Since the Raman scattering spectrum reflects the molecular vibration of the subject, the subject can be analyzed based on the shape of the Raman scattering spectrum. However, with this analysis method, the efficiency of Raman scattering is usually very low, and analysis is difficult when the amount of the subject is very small. For this reason, conventionally, the subjects to which this analysis method is practically applied have been limited to substances such as minerals and high-density plastics.
一方、表面増強ラマン散乱（Surface Enhanced Raman Scattering：ＳＥＲＳ）分光は、ラマン散乱効率の大幅な向上により高感度の測定が可能であり、低濃度試料の分析が可能であるとして注目されている。ＳＥＲＳ分光では、励起光が照射された金属微小構造において増強された電場（光子場）を発生させること（第１条件）、および、その増強された電場が到達する金属微小構造のごく近傍に定常的に被検体が存在すること（第２条件）、の２つの主条件が満たされることにより、被検体から高強度のラマン散乱光を発生させることができる。 On the other hand, Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) spectroscopy has been attracting attention as it enables highly sensitive measurement due to a significant improvement in Raman scattering efficiency and enables analysis of low-concentration samples. In SERS spectroscopy, an enhanced electric field (photon field) is generated in a metal microstructure irradiated with excitation light (first condition), and the enhanced electric field is stationary in the immediate vicinity of the metal microstructure reached by the enhanced electric field. High-intensity Raman scattered light can be generated from the subject by satisfying the two main conditions of the presence of the subject (second condition).
第１条件を効率よく達成するために、近年では、ナノメートルオーダーのサイズの多様な形状の金属微小構造配列体が設計され、この金属微小構造配列体を表面に備える基板（ＳＥＲＳ基板）を利用してＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うことが検討されている。 In recent years, in order to efficiently achieve the first condition, metal microstructure arrays of various shapes having a size on the order of nanometers have been designed, and a substrate (SERS substrate) having this metal microstructure array on the surface is used. Then, it is considered to analyze the subject by SERS spectroscopy.
特許文献１に記載された発明は、銀の錯イオンを含む溶液に分散剤を加えた銀鏡反応により基板上に銀ナノ微粒子（金属微小構造）を析出させることでＳＥＲＳ基板を作製し、このＳＥＲＳ基板に被検体を滴下するなどしてＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行う。 The invention described in Patent Document 1 prepares a SERS substrate by precipitating silver nanoparticles (metal microstructure) on the substrate by a silver mirror reaction in which a dispersant is added to a solution containing silver complex ions, and this SERS The subject is analyzed by SERS spectroscopy by dropping the subject onto the substrate.
非特許文献１には、還元剤により金属イオンを還元して金属コロイド（金属微小構造）が分散した分散液を作製すると、この分散液から還元剤由来のＳＥＲＳ光が観測されることが記載されている。 Non-Patent Document 1 describes that when a dispersion liquid in which metal colloids (metal microstructures) are dispersed is produced by reducing metal ions with a reducing agent, SERS light derived from the reducing agent is observed from this dispersion liquid. ing.
ＳＥＲＳ基板を利用する場合および金属コロイド分散液を利用する場合の何れにおいても、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うには上記第２条件が満たされることが必要である。すなわち、増強された電場が得られる領域は、金属微小構造に依存して空間的に制限されており、多くの場合は金属微小構造の間隙に位置する。したがって、第２条件をも満たしてＳＥＲＳ光を効率よく発生させるためには、この制限された間隙に被検体が存在することが必要である。 Regardless of whether the SERS substrate is used or the metal colloidal dispersion is used, it is necessary that the above second condition is satisfied in order to analyze the subject by SERS spectroscopy. That is, the region where the enhanced electric field is obtained is spatially limited depending on the metal microstructure, and is often located in the gap of the metal microstructure. Therefore, in order to satisfy the second condition and efficiently generate SERS light, it is necessary that the subject is present in this restricted gap.
第２条件を満たすためには、被検体は、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が高く吸着し易いことが必要である。このような被検体として、ピリジンおよびその誘導体、ならびに、チオール基を有する化合物が挙げられる。しかし、増強された電場を効率よく発生させることができるＳＥＲＳ基板により第１条件を満たすことができたとしても、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が低く吸着し難い被検体は、金属微小構造の狭隘な間隙に入り込むことができず、第２条件を満たすことができないので、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うことが困難である。 In order to satisfy the second condition, the subject needs to have a high affinity for the metal constituting the metal microstructure and to be easily adsorbed. Examples of such a subject include pyridine and its derivatives, and compounds having a thiol group. However, even if the first condition can be satisfied by the SERS substrate capable of efficiently generating an enhanced electric field, the subject having a low affinity for the metal constituting the metal microstructure and is difficult to adsorb may be present. It is difficult to analyze the subject by SERS spectroscopy because it cannot enter the narrow gaps of the metal microstructure and the second condition cannot be satisfied.
ＳＥＲＳ基板や金属コロイドを利用して行うＳＥＲＳ分光による被検体の分析は、予めＳＥＲＳ基板や金属コロイドを用意しておく必要がある。ＳＥＲＳ光は特に銀（Ａｇ）を用いる場合に効率よく発生するものの、銀は酸化し易い。分光測定時にＳＥＲＳ基板上の銀の微小構造や銀コロイドの表面に酸化膜が形成されていると、効率的なＳＥＲＳ分光による被検体の分析ができない。また、分光測定時までにＳＥＲＳ基板や金属コロイドが汚染されないようにする必要があり、これらの扱いは容易でない。 For the analysis of the subject by SERS spectroscopy performed using the SERS substrate or the metal colloid, it is necessary to prepare the SERS substrate or the metal colloid in advance. Although SERS light is efficiently generated especially when silver (Ag) is used, silver is easily oxidized. If an oxide film is formed on the surface of the silver microstructure or silver colloid on the SERS substrate during spectroscopic measurement, efficient analysis of the subject by SERS spectroscopy cannot be performed. In addition, it is necessary to prevent the SERS substrate and the metal colloid from being contaminated by the time of spectroscopic measurement, and these are not easy to handle.
本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が低い被検体であっても高効率なＳＥＲＳ分光による被検体の分析を容易に行うことができる方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made to solve the above problems, and it is easy to analyze a subject by highly efficient SERS spectroscopy even if the subject has a low affinity for the metal constituting the metal microstructure. The purpose is to provide a method that can be done in.
本発明の被検体分析方法は、還元作用を有する被検体を分析する方法であって、(1) 被検体、金属イオンの溶液およびｐＨ調整剤を混合して混合液を作製する混合ステップと、(2) 混合液中の被検体の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、被検体または被検体由来の物質を金属微小構造に付着させる金属微小構造生成ステップと、(3) 支持体上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、(4) ラマン散乱光のスペクトルに基づいて被検体を分析する分析ステップと、を備える。 The subject analysis method of the present invention is a method for analyzing a subject having a reducing action, and includes (1) a mixing step of mixing the subject, a solution of metal ions and a pH adjuster to prepare a mixed solution. (2) The metal ions in the mixed solution are reduced by the reducing action of the subject in the mixed solution to generate metal microstructures on the support, and the subject or substances derived from the subject are attached to the metal microstructures. The metal microstructure generation step, (3) the measurement step of irradiating the metal microstructure on the support with excitation light and measuring the spectrum of the Raman scattered light generated by the excitation light irradiation, and (4) the Raman scattered light. It comprises an analysis step of analyzing a subject based on a spectrum.
混合ステップにおいて、被検体および金属イオンの溶液を混合して中間混合液を作製し、この中間混合液およびｐＨ調整剤を混合して混合液を作製するのが好適である。金属微小構造生成ステップにおいて、加湿環境下で支持体を所定時間に亘って静置して金属微小構造を支持体上に生成させるのが好適である。 In the mixing step, it is preferable to mix the solution of the subject and the metal ion to prepare an intermediate mixed solution, and then mix the intermediate mixed solution and the pH adjuster to prepare a mixed solution. In the metal microstructure generation step, it is preferable to allow the support to stand for a predetermined time in a humidified environment to generate the metal microstructure on the support.
本発明の被検体分析方法は、金属微小構造生成ステップと測定ステップとの間に設けられ、支持体上において金属微小構造が生成されている領域を洗浄する洗浄ステップを更に備えるのが好適である。また、測定ステップにおいて、支持体上において金属微小構造を液体に浸漬させた状態とし、その浸漬した金属微小構造に励起光を照射するのが好適である。 The subject analysis method of the present invention is preferably provided between the metal microstructure generation step and the measurement step, and further includes a washing step for washing the region where the metal microstructure is generated on the support. .. Further, in the measurement step, it is preferable that the metal microstructure is immersed in a liquid on the support and the immersed metal microstructure is irradiated with excitation light.
本発明によれば、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が低い被検体であっても、高効率なＳＥＲＳ分光による被検体の分析を容易に行うことができる。 According to the present invention, even a subject having a low affinity for a metal constituting a metal microstructure can be easily analyzed by highly efficient SERS spectroscopy.
以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。本発明は、これらの例示に限定されるものではなく、特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. In the description of the drawings, the same elements are designated by the same reference numerals, and duplicate description will be omitted. The present invention is not limited to these examples, and is indicated by the scope of claims, and is intended to include all modifications within the meaning and scope equivalent to the scope of claims.
図１は、被検体分析方法のフローチャートである。この被検体分析方法は、還元作用を有する被検体を分析する方法であって、混合ステップＳ１、金属微小構造生成ステップＳ２、洗浄ステップＳ３、測定ステップＳ４および分析ステップＳ５を順に行うことで被検体の分析を行う。 FIG. 1 is a flowchart of a subject analysis method. This subject analysis method is a method for analyzing a subject having a reducing action, and is a subject by sequentially performing a mixing step S1, a metal microstructure generation step S2, a washing step S3, a measurement step S4, and an analysis step S5. To analyze.
混合ステップＳ１では、被検体を含む被測定溶液、金属イオンの溶液およびｐＨ調整剤を十分に混合して、混合液を作製する。これら被測定溶液、金属イオン溶液およびｐＨ調整剤の混合の仕方または順序として様々な態様があり得る。被測定溶液、金属イオン溶液およびｐＨ調整剤を同時に混合してもよい。また、被測定溶液および金属イオン溶液を混合して中間混合液を作製し、次に、この中間混合液およびｐＨ調整剤を混合して最終的な混合液を作製してもよい。 In the mixing step S1, the solution to be measured containing the subject, the solution of the metal ion, and the pH adjuster are sufficiently mixed to prepare a mixed solution. There may be various modes of mixing the solution to be measured, the metal ion solution and the pH adjuster. The solution to be measured, the metal ion solution and the pH adjuster may be mixed at the same time. Alternatively, the solution to be measured and the metal ion solution may be mixed to prepare an intermediate mixed solution, and then the intermediate mixed solution and the pH adjuster may be mixed to prepare a final mixed solution.
被検体は、還元作用を有する化合物であれば任意であり、例えば糖類およびアルデヒド等である。被検体としての糖類には、グルコース、フルクトースおよびガラクトース等が含まれる。金属イオンは、被検体の還元作用により還元され得るものであれば任意であり、例えば金イオンや銀イオン等である。ｐＨ調整剤は、混合液をアルカリ性とするために混合される。最終的な混合液として混合される金属イオン溶液およびｐＨ調整剤それぞれの量および濃度は、被測定溶液の量および被測定溶液中の被検体の濃度に応じて適切に調製される。 The subject is arbitrary as long as it is a compound having a reducing action, and is, for example, saccharides and aldehydes. Sugars as subjects include glucose, fructose, galactose and the like. The metal ion is arbitrary as long as it can be reduced by the reducing action of the subject, and is, for example, gold ion or silver ion. The pH regulator is mixed to make the mixture alkaline. The amounts and concentrations of the metal ion solution and the pH adjuster to be mixed as the final mixed solution are appropriately adjusted according to the amount of the solution to be measured and the concentration of the subject in the solution to be measured.
金属微小構造生成ステップＳ２では、被検体の還元作用により金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、被検体または被検体由来の物質を金属微小構造に付着させる。支持体上の金属微小構造とは、金属微粒子が析出してその凝集体が支持体上に島状に分布している構造である。このとき、混合液の蒸発を防止するために加湿環境下で支持体を所定時間に亘って静置するのが好ましい。 In the metal microstructure generation step S2, the metal ions are reduced by the reducing action of the subject to generate the metal microstructure on the support, and the subject or the substance derived from the subject is attached to the metal microstructure. The metal microstructure on the support is a structure in which metal fine particles are precipitated and the aggregates are distributed in an island shape on the support. At this time, in order to prevent evaporation of the mixed solution, it is preferable to allow the support to stand for a predetermined time in a humidified environment.
支持体は、中間混合液または混合液を作製する際に用いた容器であってもよいが、容器とは別に用意された基板であってもよく、基板として例えばスライドガラスであってもよい。また、所定パターンで撥水処理したスライドガラスを用いて、このスライドガラス上の撥水処理していない領域において混合液を作製して金属微小構造を生成させてもよい。容器とは別に用意された基板を支持体として用いる場合には、中間混合液およびｐＨ調整剤それぞれを適量だけ基板上に滴下して、マイクロピペット等を用いて基板上で中間混合液とｐＨ調整剤とを十分に混合して最終的な混合液を作製し、基板上で金属微小構造を生成させる。 The support may be an intermediate mixed solution or a container used when preparing the mixed solution, but may be a substrate prepared separately from the container, and the substrate may be, for example, a slide glass. Further, a slide glass treated with water repellent in a predetermined pattern may be used to prepare a mixed solution in a region of the slide glass not treated with water repellent to generate a metal microstructure. When a substrate prepared separately from the container is used as a support, an appropriate amount of each of the intermediate mixture and the pH adjuster is dropped onto the substrate, and the intermediate mixture and the pH adjuster are adjusted on the substrate using a micropipette or the like. The agent is thoroughly mixed to prepare the final mixture, which produces metal microstructures on the substrate.
被検体としてグルコースを例にして説明すると、塩基性条件下においてグルコース（Glucose）が酸化されると、グルコン酸（Gluconic acid）、グルカン酸、グリコール酸、シュウ酸、ギ酸等が生成され、その反応に応じて複数個の水素イオンＨ＋および電子ｅ−が放出される（非特許文献２参照）。一方、混合液中に溶解して存在するｎ価の金属イオンＭｎ＋はｎ個の電子ｅ−の供給により還元され、固体状の金属Ｍが生成される。そして、この金属Ｍはコロイド状の金属微粒子となる。これが凝集して金属微小構造が支持体上に生成される。 Taking glucose as an example as a subject, when glucose (Glucose) is oxidized under basic conditions, gluconic acid, glucanic acid, glycolic acid, oxalic acid, formic acid and the like are produced, and the reaction thereof. A plurality of hydrogen ions H + and electron e − are released according to the above (see Non-Patent Document 2). On the other hand, the n-valent metal ion M n + present dissolved in the mixed solution is reduced by the supply of n electrons e − to produce a solid metal M. Then, the metal M becomes colloidal metal fine particles. This aggregates to form metal microstructures on the support.
洗浄ステップＳ３では、支持体上において金属微小構造が生成されている領域を水（好適には超純水）により洗浄する。この洗浄により、後の測定ステップＳ４での測定に不要な溶液を除去することができる。なお、この洗浄ステップＳ３は試料によっては行わなくてもよい。 In the cleaning step S3, the region where the metal microstructure is formed on the support is cleaned with water (preferably ultrapure water). By this washing, the solution unnecessary for the measurement in the subsequent measurement step S4 can be removed. Note that this cleaning step S3 may not be performed depending on the sample.
測定ステップＳ４では、支持体上の金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する。励起光照射方向に対してラマン散乱光測定方向は任意であり、後方散乱光および前方散乱光の何れを測定してもよいし、他の方向への散乱光を測定してもよい。また、測定光学系の途中に、ラマン散乱光を選択的に透過させる光フィルタを設けるのが好ましい。励起光は好適にはレーザ光である。励起光が照射された金属微小構造において増強された電場が発生し（第１条件）、その増強された電場が到達する金属微小構造に被検体または被検体由来の物質が付着している（第２条件）ので、測定されるラマン散乱光は、被検体または被検体由来の物質から発生したＳＥＲＳ光である。 In the measurement step S4, the metal microstructure on the support is irradiated with excitation light, and the spectrum of Raman scattered light generated by the excitation light irradiation is measured. The Raman scattered light measurement direction is arbitrary with respect to the excitation light irradiation direction, and either backscattered light or forward scattered light may be measured, or scattered light in the other direction may be measured. Further, it is preferable to provide an optical filter that selectively transmits Raman scattered light in the middle of the measurement optical system. The excitation light is preferably laser light. An enhanced electric field is generated in the metal microstructure irradiated with excitation light (first condition), and a subject or a substance derived from the subject is attached to the metal microstructure reached by the enhanced electric field (first condition). (2 conditions) Therefore, the Raman scattered light to be measured is SERS light generated from the subject or a substance derived from the subject.
支持体上の狭い領域に金属微小構造が生成されている場合には、顕微分光装置を用いて励起光を照射するとともにＳＥＲＳ光スペクトルを測定するのが好ましい。支持体上の金属微小構造が生成されている領域が乾燥している状態で、励起光を照射してＳＥＲＳ光スペクトルを測定してもよい。金属微小構造に付着した被検体または被検体由来の物質が励起光照射により焼損することを抑制する為には、支持体上において金属微小構造を液体（例えば水）に浸漬させた状態とし、その浸漬した金属微小構造に励起光を照射するのが好ましい。この場合、液浸対物レンズを用いるのが好ましい。 When a metal microstructure is generated in a narrow region on the support, it is preferable to irradiate the excitation light with a microspectroscopy and measure the SERS optical spectrum. The SERS optical spectrum may be measured by irradiating with excitation light while the region on the support where the metal microstructure is generated is dry. In order to prevent the subject or the substance derived from the subject attached to the metal microstructure from being burnt by irradiation with excitation light, the metal microstructure is immersed in a liquid (for example, water) on the support. It is preferable to irradiate the immersed metal microstructure with excitation light. In this case, it is preferable to use an immersion objective lens.
分析ステップＳ５では、ラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）のスペクトルに基づいて被検体を分析する。具体的には、得られたＳＥＲＳ光スペクトルにおいてピークが現れるラマンシフト量の位置および該ピークの高さに基づいて、被検体を分析する。 In the analysis step S5, the subject is analyzed based on the spectrum of Raman scattered light (SERS light). Specifically, the subject is analyzed based on the position of the Raman shift amount at which the peak appears in the obtained SERS optical spectrum and the height of the peak.
次に実施例１〜８について説明する。図２は、実施例１〜８それぞれで用いた試料を纏めた表である。 Next, Examples 1 to 8 will be described. FIG. 2 is a table summarizing the samples used in each of Examples 1 to 8.
実施例１では、金属イオン溶液として５ｍＭ硝酸銀水溶液を用い、ｐＨ調整剤として１０ｍＭ水酸化カリウム水溶液を用い、被検体を含む被測定溶液として１ｍＭグルコース水溶液を用いた。実施例２では、金属イオン溶液として１０ｍＭ硝酸銀水溶液を用い、ｐＨ調整剤として１０ｍＭ水酸化カリウム水溶液を用い、被検体を含む被測定溶液として１ｍＭガラクトース水溶液を用いた。 In Example 1, a 5 mM silver nitrate aqueous solution was used as the metal ion solution, a 10 mM potassium hydroxide aqueous solution was used as the pH adjuster, and a 1 mM glucose aqueous solution was used as the test solution containing the subject. In Example 2, a 10 mM silver nitrate aqueous solution was used as the metal ion solution, a 10 mM potassium hydroxide aqueous solution was used as the pH adjuster, and a 1 mM galactose aqueous solution was used as the test solution containing the subject.
実施例３では、金属イオン溶液として１０ｍＭ硝酸銀水溶液を用い、ｐＨ調整剤として１０ｍＭ水酸化カリウム水溶液を用い、被検体を含む被測定溶液として１ｍＭフルクトース水溶液を用いた。実施例４では、金属イオン溶液として２５ｍＭ硝酸銀水溶液を用い、ｐＨ調整剤として１０ｍＭ水酸化カリウム水溶液を用い、被検体を含む被測定溶液として１２ｍＭホルムアルデヒド水溶液を用いた。 In Example 3, a 10 mM silver nitrate aqueous solution was used as the metal ion solution, a 10 mM potassium hydroxide aqueous solution was used as the pH adjuster, and a 1 mM fructose aqueous solution was used as the test solution containing the subject. In Example 4, a 25 mM silver nitrate aqueous solution was used as the metal ion solution, a 10 mM potassium hydroxide aqueous solution was used as the pH adjuster, and a 12 mM formaldehyde aqueous solution was used as the test solution containing the subject.
実施例５では、金属イオン溶液として５０ｍＭ硝酸銀水溶液を用い、ｐＨ調整剤として１０ｍＭ水酸化カリウム水溶液を用い、被検体を含む被測定溶液として６８ｍＭアセトアルデヒド水溶液を用いた。実施例６では、金属イオン溶液として２５ｍＭ硝酸銀水溶液を用い、ｐＨ調整剤として２５ｍＭ水酸化カリウム水溶液を用い、被検体を含む被測定溶液として５.６５ｍＭベンズアルデヒド水溶液を用いた。 In Example 5, a 50 mM silver nitrate aqueous solution was used as the metal ion solution, a 10 mM potassium hydroxide aqueous solution was used as the pH adjuster, and a 68 mM acetaldehyde aqueous solution was used as the test solution containing the subject. In Example 6, a 25 mM silver nitrate aqueous solution was used as the metal ion solution, a 25 mM potassium hydroxide aqueous solution was used as the pH adjuster, and a 5.65 mM benzaldehyde aqueous solution was used as the test solution containing the subject.
実施例７では、金属イオン溶液として１０ｍＭ硝酸銀水溶液を用い、ｐＨ調整剤として２５ｍＭ水酸化カリウム水溶液を用い、被検体を含む被測定溶液として２０ｍＭプロピオンアルデヒド水溶液を用いた。実施例８では、金属イオン溶液として１０ｍＭ硝酸銀水溶液を用い、ｐＨ調整剤として１０ｍＭ水酸化カリウム水溶液を用い、被検体を含む被測定溶液として１００ｍＭブチルアルデヒド水溶液を用いた。 In Example 7, a 10 mM silver nitrate aqueous solution was used as the metal ion solution, a 25 mM potassium hydroxide aqueous solution was used as the pH adjuster, and a 20 mM propionaldehyde aqueous solution was used as the test solution containing the subject. In Example 8, a 10 mM silver nitrate aqueous solution was used as the metal ion solution, a 10 mM potassium hydroxide aqueous solution was used as the pH adjuster, and a 100 mM butyraldehyde aqueous solution was used as the test solution containing the subject.
グルコース、ガラクトース、フルクトース、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、ベンズアルデヒド、プロピオンアルデヒドおよびブチルアルデヒドは、何れも、還元作用を有する被検体である。金属微小構造を支持する支持体としてスライドガラスを用いた。 Glucose, galactose, fructose, formaldehyde, acetaldehyde, benzaldehyde, propionaldehyde and butyraldehyde are all subjects having a reducing action. A slide glass was used as a support for supporting the metal microstructure.
実施例１〜８それぞれの手順は共通であり以下のとおりであった。混合ステップＳ１では、金属イオン溶液、ｐＨ調整剤および被測定溶液それぞれを所定濃度に調整した。支持体としてのスライドガラス上に金属イオン溶液１０μＬを滴下し、この滴下スポットに対して被測定溶液１０μＬを更に滴下して、これら金属イオン溶液と被測定溶液とを十分に混合して中間混合液を作製した。そして、この滴下スポットに対してｐＨ調整剤５μＬを更に滴下して、中間混合液とｐＨ調整剤とを十分に混合して混合液を作製した。 The procedures of Examples 1 to 8 were common and were as follows. In the mixing step S1, each of the metal ion solution, the pH adjuster and the solution to be measured was adjusted to a predetermined concentration. 10 μL of the metal ion solution is dropped onto a slide glass as a support, 10 μL of the solution to be measured is further dropped to the dropping spot, and the metal ion solution and the solution to be measured are sufficiently mixed to form an intermediate mixture. Was produced. Then, 5 μL of the pH adjuster was further added dropwise to the dropping spot, and the intermediate mixture and the pH adjuster were sufficiently mixed to prepare a mixed solution.
金属微小構造生成ステップＳ２では、加湿環境下でスライドガラス上の液滴を１時間に亘って静置して、被検体の還元作用により金属イオンを還元して金属微小構造をスライドガラス上に生成させるとともに、被検体または被検体由来の物質を金属微小構造に付着させた。洗浄ステップＳ３では、スライドガラス上において金属微小構造が生成されている領域を超純水により洗浄して、後の測定ステップＳ４での測定に不要な溶液を除去した。 In the metal microstructure generation step S2, the droplets on the slide glass are allowed to stand for 1 hour in a humid environment, and the metal ions are reduced by the reducing action of the subject to generate the metal microstructure on the slide glass. At the same time, the subject or a substance derived from the subject was attached to the metal microstructure. In the washing step S3, the region where the metal microstructure was formed on the slide glass was washed with ultrapure water to remove the solution unnecessary for the measurement in the subsequent measurement step S4.
測定ステップＳ４では、スライドガラス上の金属微小構造に励起光（波長６３２.８ｎｍのＨｅ-Ｎｅレーザ光）を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）のスペクトルを測定した。このとき、顕微分光装置を用いるとともに、スライドガラス上において金属微小構造を超純粋に浸漬させた状態とし、水浸対物レンズを介して、その浸漬した金属微小構造に励起光を照射した。 In the measurement step S4, the metal microstructure on the slide glass was irradiated with excitation light (He-Ne laser light having a wavelength of 632.8 nm), and the spectrum of Raman scattered light (SERS light) generated by the excitation light irradiation was measured. .. At this time, a microspectroscopy was used, and the metal microstructure was immersed in a slide glass in an ultrapure state, and the immersed metal microstructure was irradiated with excitation light via a water-immersed objective lens.
図３は、実施例１〜８それぞれの測定ステップＳ４においてＳＥＲＳ光スペクトルの測定の際に用いた顕微分光装置１の光学系を示す図である。支持体（スライドガラス）２１の表面に、金属微粒子が析出してその凝集体が島状に分布している金属微小構造２２を形成した。この金属微小構造２２に被検体（または被検体由来の物質）２３を付着させた。これら金属微小構造２２および被検体２３を水２４に浸漬させた。
FIG. 3 is a diagram showing an optical system of the microspectroscopy device 1 used when measuring the SERS optical spectrum in each measurement step S4 of Examples 1 to 8. Metal fine particles were deposited on the surface of the support (slide glass) 21 to form a
励起光源１１として、波長６３２.８ｎｍのレーザ光を励起光ＬＰとして出力するＨｅ-Ｎｅレーザ光源を用いた。励起光源１１から出力された励起光ＬＰは、ダイクロイックミラー１２により反射された後、水浸対物レンズ１３を経て金属微小構造２２および被検体２３に照射された。水浸対物レンズ１３の倍率は６３倍であり、開口数は１.０であった。水浸対物レンズ１３を経て試料面に照射されたレーザ光のパワーは６９μＷであった。
As an
励起光ＬＰの照射により発生して水浸対物レンズ１３により捕集されたラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）ＬＳは、ダイクロイックミラー１２および光フィルタ１４を透過して、分光器１５に入射された。分光器１５は冷却ＣＣＤ検出器を備えたものであり、この分光器１５によりＳＥＲＳ光のスペクトルが測定された。
Excitation light L P Raman scattered light is collected by the
図４は、実施例１〜５それぞれの測定ステップＳ４において得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。図５は、実施例６〜８それぞれの測定ステップＳ４において得られたＳＥＲＳ光スペクトルを示す図である。これらの図において、横軸はラマンシフト量（単位ｃｍ-1）を表し、縦軸はラマン散乱強度（任意単位）を表す。また、これらの図において、ＳＥＲＳ光スペクトルの縦軸のゼロ点は実施例毎に異なっている。 FIG. 4 is a diagram showing the SERS optical spectrum obtained in the measurement steps S4 of each of Examples 1 to 5. FIG. 5 is a diagram showing the SERS optical spectrum obtained in each measurement step S4 of Examples 6 to 8. In these figures, the horizontal axis represents the Raman shift amount (unit: cm -1 ), and the vertical axis represents the Raman scattering intensity (arbitrary unit). Further, in these figures, the zero point on the vertical axis of the SERS optical spectrum is different for each example.
図４に示されたＳＥＲＳ光スペクトルは、グルコース、ガラクトース、フルクトース、ホルムアルデヒドおよびアセトアルデヒドそれぞれを被検体として用いた場合に得られたものである。これらの被検体では略同じ形状のＳＥＲＳ光スペクトルが得られた。ホルムアルデヒドおよびアセトアルデヒドそれぞれが酸化すると、ギ酸が生成される。また、糖類（グルコース、ガラクトース、フルクトース等）が酸化剤（金属イオン）により分解された場合にも、ギ酸が生成される。したがって、図４に示されたＳＥＲＳ光スペクトルは、被検体由来の物質であるギ酸が金属微小構造に吸着したことにより得られたものであると考えられる。 The SERS optical spectrum shown in FIG. 4 was obtained when glucose, galactose, fructose, formaldehyde and acetaldehyde were used as subjects. In these subjects, SERS optical spectra having substantially the same shape were obtained. Formic acid is produced when formaldehyde and acetaldehyde are each oxidized. Formic acid is also produced when sugars (glucose, galactose, fructose, etc.) are decomposed by an oxidizing agent (metal ion). Therefore, it is considered that the SERS optical spectrum shown in FIG. 4 was obtained by adsorbing formic acid, which is a substance derived from the subject, to the metal microstructure.
図５に示されたＳＥＲＳ光スペクトルは、ベンズアルデヒド、プロピオンアルデヒドおよびブチルアルデヒドそれぞれを被検体として用いた場合に得られたものである。これらを被検体として用いた場合には、図４に示されたものとは異なる形状のＳＥＲＳ光スペクトルが得られた。ＳＥＲＳ光スペクトルのうちラマンシフト量１０００ｃｍ-１付近の形状は、元の被検体のスペクトルと同様である。しかし、ＳＥＲＳ光スペクトルのうちＣ=Ｏ伸縮振動に帰属されるラマンシフト量１６００ｃｍ-１付近の形状は、元の被検体のスペクトルとは大きく異なる。したがって、これら被検体は分解されずにホルミル基がカルボキシル基に酸化されたことを示すと考えられる。 The SERS optical spectrum shown in FIG. 5 was obtained when benzaldehyde, propionaldehyde, and butyraldehyde were used as subjects, respectively. When these were used as subjects, SERS optical spectra having a shape different from that shown in FIG. 4 were obtained. The shape of the SERS optical spectrum near the Raman shift amount of 1000 cm- 1 is the same as the spectrum of the original subject. However, the shape of the SERS optical spectrum near the Raman shift amount of 1600 cm -1 attributed to C = O stretching vibration is significantly different from the spectrum of the original subject. Therefore, it is considered that these subjects were not decomposed and the formyl group was oxidized to the carboxyl group.
以上のとおり、本実施形態の被検体分析方法は、合液中の被検体の還元作用により混合液中の金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、被検体または被検体由来の物質を金属微小構造に付着させ、これに対する励起光照射により発生するラマン散乱光（ＳＥＲＳ光）のスペクトルを測定して、このスペクトルに基づいて被検体を分析する。従来の分析方法と比べると、本実施形態の被検体分析方法は簡便かつ迅速に分析を行うことができる。 As described above, in the subject analysis method of the present embodiment, the metal ions in the mixed solution are reduced by the reducing action of the subject in the mixed solution to generate metal microstructures on the support, and the subject or the subject is formed. A substance derived from a sample is attached to a metal microstructure, the spectrum of Raman scattered light (SERS light) generated by irradiation with excitation light is measured, and the subject is analyzed based on this spectrum. Compared with the conventional analysis method, the subject analysis method of the present embodiment can perform analysis easily and quickly.
従来の分析方法においては、ＳＥＲＳ分光が可能な被検体は、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が高く吸着し易いものに限られている。これに対して、本実施形態の被検体分析方法では、金属微小構造を構成する金属に対して親和性が低く吸着し難い被検体であっても、その被検体または被検体由来の物質が金属微小構造の狭隘な間隙に入り込むことができ、第２条件を満たすことができるので、ＳＥＲＳ分光による被検体の分析を行うことが可能となる。 In the conventional analysis method, the subject capable of SERS spectroscopy is limited to one having a high affinity for the metal constituting the metal microstructure and being easily adsorbed. On the other hand, in the subject analysis method of the present embodiment, even if the subject has a low affinity for the metal constituting the metal microstructure and is difficult to be adsorbed, the subject or the substance derived from the subject is a metal. Since it is possible to enter the narrow gap of the microstructure and satisfy the second condition, it is possible to analyze the subject by SERS spectroscopy.
従来の分析方法においては、ＳＥＲＳ光スペクトル測定に際して事前にＳＥＲＳ基板や金属コロイドを用意しておくことが必要である。これに対して、本実施形態の被検体分析方法は、ＳＥＲＳ光スペクトル測定の直前に、金属微小構造の生成および被検体（または被検体由来の物質）の金属微小構造への付着を同時に行うことができる。したがって、本実施形態の被検体分析方法は、酸化しやすい銀による金属微小構造を生成する場合であっても、銀の酸化の問題を抑制することができ、効率的なＳＥＲＳ分光を行うことができる。また、本実施形態の被検体分析方法は、ＳＥＲＳ基板や金属コロイの事前用意が不要であるので、これらの汚染が問題となることはなく、被検体の分析を容易に行うことができる。 In the conventional analysis method, it is necessary to prepare a SERS substrate and a metal colloid in advance when measuring the SERS optical spectrum. On the other hand, in the subject analysis method of the present embodiment, immediately before the SERS optical spectrum measurement, the metal microstructure is generated and the subject (or the substance derived from the subject) is attached to the metal microstructure at the same time. Can be done. Therefore, the subject analysis method of the present embodiment can suppress the problem of silver oxidation even when a metal microstructure made of easily oxidizable silver is generated, and efficient SERS spectroscopy can be performed. it can. Further, since the subject analysis method of the present embodiment does not require the preparation of the SERS substrate and the metal colloid in advance, these contaminations do not become a problem, and the subject can be easily analyzed.
また、従来の金属コロイド分散液を利用する分析方法は、被検体が微量である場合にはＳＥＲＳ分光が困難である。これに対して、本実施形態の被検体分析方法は、被検体が微量であってもＳＥＲＳ分光が可能である。 Further, in the conventional analysis method using a metal colloidal dispersion, SERS spectroscopy is difficult when the amount of the subject is small. On the other hand, the subject analysis method of the present embodiment enables SERS spectroscopy even if the amount of the subject is small.
１…顕微分光装置、１１…励起光源、１２…ダイクロイックミラー、１３…水浸対物レンズ、１４…光フィルタ、１５…分光器、２１…支持体、２２…金属微小構造、２３…被検体（または被検体由来の物質）、２４…水。 1 ... Microspectroscopy, 11 ... Excitation light source, 12 ... Dichroic mirror, 13 ... Immersion objective lens, 14 ... Optical filter, 15 ... Spectrometer, 21 ... Support, 22 ... Metal microstructure, 23 ... Subject (or subject) Subject-derived substance), 24 ... water.
Claims (5)
前記被検体、金属イオンの溶液およびｐＨ調整剤を混合して混合液を作製する混合ステップと、
前記混合液中の前記被検体の還元作用により前記混合液中の前記金属イオンを還元して金属微小構造を支持体上に生成させるとともに、前記被検体または前記被検体由来の物質を前記金属微小構造に付着させる金属微小構造生成ステップと、
前記支持体上の前記金属微小構造に励起光を照射し、その励起光照射により発生したラマン散乱光のスペクトルを測定する測定ステップと、
前記ラマン散乱光のスペクトルに基づいて前記被検体を分析する分析ステップと、
を備える被検体分析方法。 A method for analyzing a subject having a reducing action.
A mixing step of mixing the subject, a solution of metal ions, and a pH adjuster to prepare a mixed solution,
The metal ion in the mixed solution is reduced by the reducing action of the subject in the mixed solution to generate a metal microstructure on the support, and the subject or a substance derived from the subject is produced as the metal micro. The metal microstructure generation step to attach to the structure,
A measurement step of irradiating the metal microstructure on the support with excitation light and measuring the spectrum of Raman scattered light generated by the excitation light irradiation.
An analysis step of analyzing the subject based on the spectrum of Raman scattered light,
Subject analysis method comprising.
請求項１に記載の被検体分析方法。 In the mixing step, a solution of the subject and the metal ion is mixed to prepare an intermediate mixed solution, and the intermediate mixed solution and the pH adjusting agent are mixed to prepare a mixed solution.
The subject analysis method according to claim 1.
請求項１または２に記載の被検体分析方法。 In the metal microstructure generation step, the support is allowed to stand for a predetermined time in a humidified environment to generate the metal microstructure on the support.
The subject analysis method according to claim 1 or 2.
請求項１〜３の何れか１項に記載の被検体分析方法。 A cleaning step is further provided between the metal microstructure generation step and the measurement step to clean the region on the support where the metal microstructure is generated.
The subject analysis method according to any one of claims 1 to 3.
請求項１〜４の何れか１項に記載の被検体分析方法。 In the measurement step, the metal microstructure is immersed in a liquid on the support, and the immersed metal microstructure is irradiated with excitation light.
The subject analysis method according to any one of claims 1 to 4.
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