JP6806440B2 - New fusion and its detection method - Google Patents

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Description

本発明は、ＡＬＫキナーゼ領域を含む新規の融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びそれらの検出方法に関する。
本発明は、ＺＳＣＡＮ９の少なくとも一部を含む新規の融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子、及びそれらの検出方法に関する。The present invention relates to novel fusion proteins containing the ALK kinase region or fusion genes encoding the fusion proteins, and methods for detecting them.
The present invention relates to novel fusion proteins containing at least a portion of ZSCAN9 or fusion genes encoding the fusion proteins, and methods for detecting them.

染色体転座又は逆位等の結果、本来は別々の遺伝子が融合して融合遺伝子が作られる。これまで慢性骨髄性白血病におけるＢＣＲ−ＡＢＬ１融合体や、肺がんにおけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合体、肺がんを含む種々のがんにおけるＲＯＳ１融合体のように、キナーゼ遺伝子の一部を構成要素に含む融合遺伝子はしばしば発がんに本質的な役割を担い、その機能を抑制する薬剤は極めて有効な抗がん剤となることが知られている（非特許文献１、特許文献１及び特許文献２）。
例えば、チロシンキナーゼ阻害剤のイレッサやタルセバの登場により、分子診断とがん治療効果の関係について、臨床で示されつつあり、分子診断による適応患者の選別により、患者を層別化した上での治療薬投与というコンセプトが広がりつつある。As a result of chromosomal translocation or inversion, originally separate genes are fused to form a fusion gene. So far, fusion genes containing a part of kinase genes as components, such as BCR-ABL1 fusion in chronic myelogenous leukemia, EML4-ALK fusion in lung cancer, and ROS1 fusion in various cancers including lung cancer, have been used. It is known that a drug that often plays an essential role in carcinogenesis and suppresses its function is an extremely effective anticancer drug (Non-Patent Document 1, Patent Document 1 and Patent Document 2).
For example, with the advent of tyrosine kinase inhibitors Iressa and Tarceva, the relationship between molecular diagnosis and cancer therapeutic effects is being clinically shown, and patients are stratified by selecting eligible patients by molecular diagnosis. The concept of therapeutic drug administration is spreading.

ＡＬＫ（anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase）は、受容体型チロシンキナーゼであり、インスリン受容体スーパーファミリーに属し、細胞外ドメイン、１回膜貫通ドメイン及び細胞内キナーゼドメインを有する（非特許文献２）。ＡＬＫは上記ＥＭＬ４のみならず、種々の遺伝子と融合遺伝子を構成することが知られており、これらの融合遺伝子も、がんの原因遺伝子であることが示されている（非特許文献３、４）。
ＺＳＣＡＮ９（zinc finger and SCAN domain containing 9、ＺＮＦ１９３（zinc finger protein 193）ともいう。）は、krueppel C2H2-type zinc-finger タンパクファミリーに属し、５つのC2H2-type zinc fingerドメインと、１つのSCAN box domainを有する細胞内タンパクである（非特許文献５）。当該遺伝子が融合遺伝子を構成することは知られていない。ALK (anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase) is a receptor tyrosine kinase, belongs to the insulin receptor superfamily, and has an extracellular domain, a transmembrane domain, and an intracellular kinase domain (Non-Patent Document 2). It is known that ALK constitutes a fusion gene with various genes as well as the above EML4, and these fusion genes have also been shown to be the causative genes of cancer (Non-Patent Documents 3 and 4). ).
ZSCAN 9 (also referred to as zinc finger and SCAN domain containing 9, ZNF 193 (zinc finger protein 193)) belongs to the krueppel C2H2-type zinc-finger protein family, with five C2H2-type zinc finger domains and one SCAN box domain. It is an intracellular protein having a zinc finger (Non-Patent Document 5). It is not known that the gene constitutes a fusion gene.

特許第４３０３３０３号公報Japanese Patent No. 4303303 ＷＯ２０１１／１６２２９５号パンフレットWO2011 / 162295 Pamphlet

Lugo TG et al., Science. 1990 Mar 2;247(4946):1079-1082Lugo TG et al., Science. 1990 Mar 2; 247 (4946): 1079-1082 Iwahara T et al. , Oncogene. 1997 Jan 30;14(4):439-449Iwahara T et al., Oncogene. 1997 Jan 30; 14 (4): 439-449 Takeuchi K et al., Nat Med. 2012 Feb 12;18(3):378-381Takeuchi K et al., Nat Med. 2012 Feb 12; 18 (3): 378-381 Takeuchi K et al., Clin Cancer Res. 2009 May 1;15(9):3143-3149Takeuchi K et al., Clin Cancer Res. 2009 May 1; 15 (9): 3143-3149 Lee PL et al., Genomics. 1997 Jul 15;43(2):191-201Lee PL et al., Genomics. 1997 Jul 15; 43 (2): 191-201

本発明の課題は、がんの新たな原因因子である融合体（融合タンパク質及び融合遺伝子）を解明したことに基づき、融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法、当該検出方法を用いたがんの診断方法、がん治療用医薬組成物の適用対象者の判定方法、前記検出方法のためのキット及びプライマーセット、前記融合タンパク質であるポリペプチドの活性及び／又は発現の阻害物質のスクリーニング方法、ならびに前記阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物及び前記がん治療用医薬組成物を投与するがん治療方法を提供することにある。 The subject of the present invention is a method for detecting a fusion protein or a fusion gene encoding the fusion protein, based on the elucidation of a fusion (fusion protein and fusion gene) which is a new causative factor of cancer. The method for diagnosing cancer used, the method for determining the target person to which the pharmaceutical composition for cancer treatment is applied, the kit and primer set for the detection method, the activity and / or expression inhibitor of the polypeptide as the fusion protein The present invention is to provide a method for treating a cancer, and a method for treating a cancer, which comprises the above-mentioned inhibitor and the above-mentioned pharmaceutical composition for treating cancer.

本発明者は、大腸がん患者から得た検体から、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の一部と、キナーゼであるＡＬＫ遺伝子の一部とが融合した新規の融合遺伝子を単離同定し（実施例１〜３）、当該融合遺伝子が大腸がん患者検体に存在することを見出した（実施例４〜７）。
本発明者は、これらの知見から、ＡＬＫ融合タンパク質又は当該タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し（実施例４〜７）、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出することにより、ＡＬＫ阻害物質を用いた薬物治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にＡＬＫ阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。
本発明者は、これらの知見から、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質又は当該タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法を提供し（実施例４〜７）、そのためのキット及びプライマーセットを提供し、この融合タンパク質又は当該融合タンパク質をコードする融合遺伝子を検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質阻害物質を用いた薬物治療の対象となるがん患者を判別することを可能とし、当該がん患者にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質阻害物質を投与する工程を含む、がんの治療方法を提供する。The present inventor isolated and identified a novel fusion gene in which a part of the ZSCAN9 gene and a part of the kinase ALK gene were fused from a sample obtained from a colorectal cancer patient (Examples 1 to 3). , It was found that the fusion gene is present in a colorectal cancer patient sample (Examples 4 to 7).
Based on these findings, the present inventor provides a method for detecting an ALK fusion protein or a fusion gene encoding the protein (Examples 4 to 7), and provides a kit and a primer set for that purpose, and provides the fusion protein or the fusion protein. By detecting the fusion gene encoding the fusion protein, it is possible to identify a cancer patient to be treated with a drug using an ALK inhibitor, which includes a step of administering the ALK inhibitor to the cancer patient. , Provides a method of treating cancer.
Based on these findings, the present inventor provides a method for detecting a ZSCAN9 fusion protein or a fusion gene encoding the protein (Examples 4 to 7), provides a kit and a primer set for that purpose, and provides the fusion protein or the fusion protein. By detecting the fusion gene encoding the fusion protein, it is possible to identify a cancer patient to be treated with a drug using the ZSCAN9 fusion protein inhibitor, and administer the ZSCAN9 fusion protein inhibitor to the cancer patient. Provide a method of treating cancer, including the process of performing.

本発明は、以下の発明に関する：
［１］ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質。
［２］ＺＳＣＡＮ９とＡＬＫとの融合タンパク質。
［３］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［１］に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［４］［１］〜［３］のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［５］［４］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［６］［５］に記載のベクターで形質転換された細胞。
［７］被験者から得た試料中の、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
［８］前記検出方法が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の切断、又は、ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、［７］に記載の検出方法。
［９］前記検出方法が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、［７］に記載の検出方法。
［１０］前記融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質である、［７］〜［９］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１１］前記融合タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［７］〜［１０］のいずれか一項に記載の検出方法：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［１２］前記ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、［３］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、［７］〜［１１］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１３］前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、［７］〜［１２］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１４］前記試料が、消化器由来試料である、［７］〜［１３］のいずれか一項に記載の検出方法。
［１５］前記消化器が、消化管由来試料である、［１４］に記載の検出方法。
［１６］前記消化器が、下部消化管である、［１４］に記載の検出方法。
［１７］前記消化器が、大腸である、［１４］に記載の検出方法。
［１８］ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。
［１９］ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構成する他の遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。
［２０］ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。
［２１］ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
［２２］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［２３］ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＺＳＣＡＮ９抗体、及び、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＺＳＣＡＮ９抗体を含む、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キット。
［２４］ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キット。
［２５］前記他のタンパク質が、ＡＬＫタンパク質である、［２４］に記載のキット。
［２６］ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びＡＬＫタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは［２２］に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは［２２］に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
［２７］ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［２８］配列番号１の塩基番号１から５６８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号５６９から２２５９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号１２の塩基番号１から７１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１２の塩基番号７１７から２８５７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
［２９］（１）［３］に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
［３０］前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療剤である、［２９］に記載のスクリーニング方法。
［３１］前記がんが消化器がんである、［２９］又は［３０］に記載のスクリーニング方法。
［３２］前記がんが消化管がんである、［２９］又は［３０］に記載のスクリーニング方法。
［３３］前記がんが下部消化管がんである、［２９］又は［３０］に記載のスクリーニング方法。
［３４］前記がんが大腸がんである、［２９］又は［３０］に記載のスクリーニング方法。
［３５］ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
［３６］前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、［３５］に記載の医薬組成物。
［３７］前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、［３］に記載のポリペプチドである、［３５］又は［３６］に記載の医薬組成物。
［３８］前記がんが消化器がんである、［３５］〜［３７］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［３９］前記がんが消化管がんである、［３５］〜［３７］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［４０］前記がんが下部消化管がんである、［３５］〜［３７］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［４１］前記がんが大腸がんである、［３５］〜［３７］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［４２］ＡＬＫ融合タンパク質。
［４３］ＺＳＣＡＮ９とＡＬＫとの融合タンパク質。
［４４］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、［４２］に記載の融合タンパク質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［４５］［４２］〜［４４］のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［４６］［４５］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［４７］［４６］に記載のベクターで形質転換された細胞。
［４８］被験者から得た試料中の、ＡＬＫ融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードする融合遺伝子の検出方法。
［４９］前記検出方法が、ＡＬＫタンパク質の切断、又は、ＡＬＫタンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、［４８］に記載の検出方法。
［５０］前記検出方法が、ＡＬＫタンパク質とそれ以外の他のタンパク質とから構築される融合タンパク質の存在、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子の存在、を検出する工程を含む、［４８］に記載の検出方法。
［５１］前記融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質である、［４８］〜［５０］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５２］前記融合タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、４８〜５１のいずれか一項に記載の検出方法：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［５３］前記ＡＬＫ融合遺伝子が、［４４］に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、［４８］〜［５２］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５４］前記融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、［４８］〜［５３］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５５］前記試料が消化器である、［４８］〜［５４］のいずれか一項に記載の検出方法。
［５６］前記消化器が、消化管である、［５５］に記載の検出方法。
［５７］前記消化器が、下部消化管である、［５５］に記載の検出方法。
［５８］前記消化器が、大腸である、［５５］に記載の検出方法。
［５９］ＡＬＫ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
［６０］ＡＬＫ遺伝子と共にＡＬＫ融合遺伝子を構成する他の遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
［６１］ＡＬＫタンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
［６２］ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質であるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット。
［６３］以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。
［６４］ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＡＬＫ抗体、及び、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＡＬＫ抗体を含む、ＡＬＫ融合タンパク質の検出用キット。
［６５］ＡＬＫタンパク質と共にＡＬＫ融合タンパク質を構成する他のタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、ＡＬＫ融合タンパク質の検出用キット。
［６６］前記他のタンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質である、［６５］に記載のキット。
［６７］ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるセンスプライマー及びＡＬＫタンパク質をコードするポリヌクレオチド部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは［６３］に記載のポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなり、センスプライマーは［６３］に記載のポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件でアニールする核酸分子からなるプライマーセット。
［６８］ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドにストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び該ポリヌクレオチドの相補鎖にストリンジェントな条件下でアニールする核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。
［６９］配列番号１の塩基番号１から５６８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号５６９から２２５９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号１２の塩基番号１から７１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１２の塩基番号７１７から２８５７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。
［７０］（１）［４４］に記載のポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。
［７１］前記ポリペプチドの活性及び／又は発現を阻害する物質が、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療剤である、［７０］に記載のスクリーニング方法。
［７２］前記がんが消化器がんである、［７０］又は［７１］に記載のスクリーニング方法。
［７３］前記がんが消化管がんである、［７０］又は［７１］に記載のスクリーニング方法。
［７４］前記がんが下部消化管がんである、［７０］又は［７１］に記載のスクリーニング方法。
［７５］前記がんが大腸がんである、［７０］又は［７１］に記載のスクリーニング方法。
［７６］ＡＬＫ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を含有する、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。
［７７］前記ＡＬＫ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、［７６］に記載の医薬組成物。
［７８］前記ＡＬＫ融合タンパク質が、［４４］に記載のポリペプチドである、［７６］又は［７７］に記載の医薬組成物。
［７９］前記がんが消化器がんである、［７６］〜［７８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［８０］前記がんが消化管がんである、［７６］〜［７８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［８１］前記がんが下部消化管がんである、［７６］〜［７８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［８２］前記がんが大腸がんである、［７６］〜［７８］のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［８３］ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療方法。
［８４］ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質の、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性の癌の治療用医薬組成物の製造への使用。
［８５］前記ポリペプチドを発現している細胞が、［６］に記載の形質転換細胞である、［２９］〜［３４］のいずれかに記載のスクリーニング方法。
［８６］ＡＬＫ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、キナーゼ阻害剤である、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療方法。
［８７］ＡＬＫ融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質の、ＡＬＫ融合体陽性の癌の治療用医薬組成物の製造への使用。
［８８］前記ポリペプチドを発現している細胞が、［４７］に記載の形質転換細胞である、［７０］〜［７５］のいずれかに記載のスクリーニング方法。The present invention relates to the following invention:
[1] ZSCAN9 fusion protein.
[2] A fusion protein of ZSCAN9 and ALK.
[3] The fusion protein according to [1], which is a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity.
In (c) a polypeptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenicity.
[4] A polynucleotide encoding the fusion protein according to any one of [1] to [3].
[5] A vector containing the polynucleotide according to [4].
[6] Cells transformed with the vector according to [5].
[7] A method for detecting a ZSCAN9 fusion protein or a fusion gene encoding the fusion protein in a sample obtained from a subject.
[8] The detection method according to [7], wherein the detection method includes a step of detecting cleavage of the ZSCAN9 protein or cleavage of a gene encoding the ZSCAN9 protein.
[9] The detection method includes a step of detecting the presence of a fusion protein constructed from the ZSCAN9 protein and other proteins, or the presence of a fusion gene encoding the fusion protein [7]. The detection method described in.
[10] The detection method according to any one of [7] to [9], wherein the fusion protein is a fusion protein of ZSCAN9 protein and ALK protein.
[11] The detection method according to any one of [7] to [10], wherein the fusion protein is a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity.
In (c) a polypeptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenicity.
[12] The detection method according to any one of [7] to [11], wherein the ZSCAN9 fusion gene is a polynucleotide encoding the polypeptide according to [3].
[13] The detection method according to any one of [7] to [12], wherein the fusion gene is DNA or mRNA.
[14] The detection method according to any one of [7] to [13], wherein the sample is a digestive organ-derived sample.
[15] The detection method according to [14], wherein the digestive organ is a sample derived from the digestive tract.
[16] The detection method according to [14], wherein the digestive organ is the lower digestive tract.
[17] The detection method according to [14], wherein the digestive organ is the large intestine.
[18] Detection of the ZSCAN9 fusion gene, which comprises a first probe capable of specifically recognizing the ZSCAN9 gene 5'terminal genomic region and a second probe capable of specifically recognizing the ZSCAN9 gene 3'terminal genomic region. Kit for.
[19] A first probe capable of specifically recognizing the 3'terminal genomic region of another gene constituting the ZSCAN9 fusion gene together with the ZSCAN9 gene, and a second probe capable of specifically recognizing the 5'terminal genomic region of the ZSCAN9 gene. Kit for detecting the ZSCAN9 fusion gene, including the probe of.
[20] A sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify the 5'terminal region of the polynucleotide encoding the ZSCAN9 protein, and the 3'terminal region of the polynucleotide are specifically amplified. A kit for detecting a ZSCAN9 fusion gene, which comprises a sense primer and an antisense primer designed to be capable of this.
[21] A kit for detecting a ZSCAN9-ALK fusion gene, which comprises a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding a polypeptide which is a fusion protein of a ZSCAN9 protein and an ALK protein.
[22] A ZSCAN9-ALK fusion gene containing a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d). Detection kit:
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity.
In (c) a polypeptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenicity.
[23] A kit for detecting a ZSCAN9 fusion protein, which comprises an anti-ZSCAN9 antibody capable of specifically recognizing the N-terminal region of the ZSCAN9 protein and an anti-ZSCAN9 antibody capable of specifically recognizing the C-terminal region of the ZSCAN9 protein.
[24] An antibody that specifically binds to a polypeptide in the C-terminal region of another protein constituting the ZSCAN9 fusion protein together with the ZSCAN9 protein, and an antibody that specifically binds to a polypeptide in the N-terminal region of the ZSCAN9 protein. Kit for detecting ZSCAN9 fusion protein, including.
[25] The kit according to [24], wherein the other protein is an ALK protein.
[26] For detecting a fusion gene of ZSCAN9 gene and ALK gene, which comprises a sense primer designed from a polynucleotide moiety encoding a ZSCAN9 protein and an antisense primer designed from a polynucleotide moiety encoding an ALK protein. In the primer set, the antisense primer consists of a nucleic acid molecule that anneals to the polynucleotide described in [22] under stringent conditions, and the sense primer is stringent to the complementary strand of the polynucleotide described in [22]. A primer set consisting of nucleic acid molecules that are annealed under conditions.
[27] An antisense consisting of a nucleic acid molecule that is a primer set for detecting a fusion gene of ZSCAN9 gene and ALK gene and anneals to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions. A primer set containing a primer and a sense primer consisting of a nucleic acid molecule that anneals to the complementary strand of the polynucleotide under stringent conditions.
[28] A sense primer consisting of any contiguous at least 16 oligonucleotides between base numbers 1 to 568 of SEQ ID NO: 1 and any contiguous at least 16 nucleotide oligonucleotides between base numbers 569 to 2259 of SEQ ID NO: 1. An antisense primer consisting of an oligonucleotide complementary to, or a sense primer consisting of any contiguous at least 16 oligonucleotides between base numbers 1 to 716 of SEQ ID NO: 12 and base number 717 of SEQ ID NO: 12. A primer set comprising an antisense primer consisting of an oligonucleotide that is complementary to any contiguous at least 16 nucleotides of oligonucleotide between 1 and 2857.
[29] The step of bringing the test substance into contact with the polypeptide according to (1) [3] or a cell expressing the polypeptide.
The poly comprises (2) analyzing whether or not the activity and / or expression of the polypeptide is inhibited, and (3) selecting a substance that inhibits the activity and / or expression of the polypeptide. A method of screening for substances that inhibit the activity and / or expression of a peptide.
[30] The screening method according to [29], wherein the substance that inhibits the activity and / or expression of the polypeptide is a therapeutic agent for ZSCAN9 fusion-positive cancer.
[31] The screening method according to [29] or [30], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
[32] The screening method according to [29] or [30], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
[33] The screening method according to [29] or [30], wherein the cancer is a lower gastrointestinal cancer.
[34] The screening method according to [29] or [30], wherein the cancer is colorectal cancer.
[35] A pharmaceutical composition for treating a ZSCAN9 fusion-positive cancer, which comprises a substance that inhibits the activity and / or expression of the ZSCAN9 fusion protein.
[36] The pharmaceutical composition according to [35], wherein the substance that inhibits the activity and / or expression of the ZSCAN9 fusion protein is a kinase inhibitor.
[37] The pharmaceutical composition according to [35] or [36], wherein the ZSCAN9 fusion protein is the polypeptide according to [3].
[38] The pharmaceutical composition according to any one of [35] to [37], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
[39] The pharmaceutical composition according to any one of [35] to [37], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
[40] The pharmaceutical composition according to any one of [35] to [37], wherein the cancer is lower gastrointestinal cancer.
[41] The pharmaceutical composition according to any one of [35] to [37], wherein the cancer is colorectal cancer.
[42] ALK fusion protein.
[43] A fusion protein of ZSCAN9 and ALK.
[44] The fusion protein according to [42], which is a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity.
In (c) a polypeptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenicity.
[45] A polynucleotide encoding the fusion protein according to any one of [42] to [44].
[46] A vector containing the polynucleotide according to [45].
[47] Cells transformed with the vector according to [46].
[48] A method for detecting an ALK fusion protein or a fusion gene encoding the fusion protein in a sample obtained from a subject.
[49] The detection method according to [48], wherein the detection method includes a step of detecting cleavage of an ALK protein or cleavage of a gene encoding an ALK protein.
[50] The detection method comprises the step of detecting the presence of a fusion protein constructed from an ALK protein and another protein, or the presence of a fusion gene encoding the fusion protein [48]. The detection method described in.
[51] The detection method according to any one of [48] to [50], wherein the fusion protein is a fusion protein of ZSCAN9 protein and ALK protein.
[52] The detection method according to any one of 48 to 51, wherein the fusion protein is a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity.
In (c) a polypeptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenicity.
[53] The detection method according to any one of [48] to [52], wherein the ALK fusion gene is a polynucleotide encoding the polypeptide according to [44].
[54] The detection method according to any one of [48] to [53], wherein the fusion gene is DNA or mRNA.
[55] The detection method according to any one of [48] to [54], wherein the sample is a digestive organ.
[56] The detection method according to [55], wherein the digestive organ is a digestive tract.
[57] The detection method according to [55], wherein the digestive organ is the lower digestive tract.
[58] The detection method according to [55], wherein the digestive organ is the large intestine.
[59] Detection of an ALK fusion gene, including a first probe capable of specifically recognizing the ALK gene 5'terminal genomic region and a second probe capable of specifically recognizing the ALK gene 3'terminal genomic region. Kit for.
[60] A first probe capable of specifically recognizing the 5'terminal genomic region of another gene constituting the ALK fusion gene together with the ALK gene, and a second probe capable of specifically recognizing the 3'terminal genomic region of the ALK gene. A kit for detecting ALK fusion genes, including the probe of ALK fusion gene.
[61] A sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify the 5'terminal region of the polynucleotide encoding the ALK protein, and the 3'terminal region of the polynucleotide are specifically amplified. A kit for detecting an ALK fusion gene, which contains a sense primer and an antisense primer designed so as to be capable.
[62] A kit for detecting a ZSCAN9-ALK fusion gene, which comprises a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding a polypeptide which is a fusion protein of the ZSCAN9 protein and the ALK protein.
[63] A ZSCAN9-ALK fusion gene containing a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d). Detection kit:
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity.
In (c) a polypeptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenicity.
[64] A kit for detecting an ALK fusion protein, which comprises an anti-ALK antibody capable of specifically recognizing the N-terminal region of the ALK protein and an anti-ALK antibody capable of specifically recognizing the C-terminal region of the ALK protein.
[65] An antibody that specifically binds to a polypeptide in the N-terminal region of another protein constituting the ALK fusion protein together with the ALK protein, and an antibody that specifically binds to a polypeptide in the C-terminal region of the ALK protein. Kit for detecting ALK fusion proteins, including.
[66] The kit according to [65], wherein the other protein is the ZSCAN9 protein.
[67] For detecting a fusion gene of ZSCAN9 gene and ALK gene, which comprises a sense primer designed from a polynucleotide moiety encoding a ZSCAN9 protein and an antisense primer designed from a polynucleotide moiety encoding an ALK protein. In the primer set, the antisense primer consists of a nucleic acid molecule that anneals to the polynucleotide described in [63] under stringent conditions, and the sense primer is stringent to the complementary strand of the polynucleotide described in [63]. A primer set consisting of nucleic acid molecules that are annealed under conditions.
[68] An antisense consisting of a nucleic acid molecule that is a primer set for detecting a fusion gene of the ZSCAN9 gene and the ALK gene and anneals to a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions. A primer set containing a primer and a sense primer consisting of a nucleic acid molecule that anneals to the complementary strand of the polynucleotide under stringent conditions.
[69] A sense primer consisting of any contiguous at least 16 nucleotides of oligonucleotides between base numbers 1 to 568 of SEQ ID NO: 1 and any contiguous at least 16 nucleotides of oligonucleotide between base numbers 569 to 2259 of SEQ ID NO: 1. An antisense primer consisting of an oligonucleotide complementary to, or a sense primer consisting of any contiguous at least 16 oligonucleotides between base numbers 1 to 716 of SEQ ID NO: 12 and base number 717 of SEQ ID NO: 12. A primer set comprising an antisense primer consisting of an oligonucleotide that is complementary to any contiguous at least 16 nucleotides of oligonucleotide between 1 and 2857.
[70] (1) The step of bringing the test substance into contact with the polypeptide according to [44] or a cell expressing the polypeptide.
The poly comprises (2) analyzing whether or not the activity and / or expression of the polypeptide is inhibited, and (3) selecting a substance that inhibits the activity and / or expression of the polypeptide. A method of screening for substances that inhibit the activity and / or expression of a peptide.
[71] The screening method according to [70], wherein the substance that inhibits the activity and / or expression of the polypeptide is an ALK fusion-positive therapeutic agent for cancer.
[72] The screening method according to [70] or [71], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
[73] The screening method according to [70] or [71], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
[74] The screening method according to [70] or [71], wherein the cancer is a lower gastrointestinal cancer.
[75] The screening method according to [70] or [71], wherein the cancer is colorectal cancer.
[76] A pharmaceutical composition for treating ALK fusion-positive cancer, which comprises a substance that inhibits the activity and / or expression of an ALK fusion protein.
[77] The pharmaceutical composition according to [76], wherein the substance that inhibits the activity and / or expression of the ALK fusion protein is a kinase inhibitor.
[78] The pharmaceutical composition according to [76] or [77], wherein the ALK fusion protein is the polypeptide according to [44].
[79] The pharmaceutical composition according to any one of [76] to [78], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
[80] The pharmaceutical composition according to any one of [76] to [78], wherein the cancer is gastrointestinal cancer.
[81] The pharmaceutical composition according to any one of [76] to [78], wherein the cancer is lower gastrointestinal cancer.
[82] The pharmaceutical composition according to any one of [76] to [78], wherein the cancer is colorectal cancer.
[83] A method for treating ZSCAN9 fusion-positive cancer, wherein the substance that inhibits the activity and / or expression of the ZSCAN9 fusion protein is a kinase inhibitor.
[84] Use of a substance that inhibits the activity and / or expression of a ZSCAN9 fusion protein in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of ZSCAN9 fusion-positive cancer.
[85] The screening method according to any one of [29] to [34], wherein the cell expressing the polypeptide is the transformed cell according to [6].
[86] A method for treating ALK fusion-positive cancer, wherein the substance that inhibits the activity and / or expression of the ALK fusion protein is a kinase inhibitor.
[87] Use of a substance that inhibits the activity and / or expression of an ALK fusion protein in the manufacture of a pharmaceutical composition for the treatment of ALK fusion-positive cancer.
[88] The screening method according to any one of [70] to [75], wherein the cell expressing the polypeptide is the transformed cell according to [47].

本発明の検出方法は、ＡＬＫ融合体陽性のがん（特に消化器がん）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、被験者におけるＡＬＫ融合体陽性のがんを診断することができ、更に、ＡＬＫ阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングにより得られた物質は、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療に用いることができる。
本発明の検出方法は、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがん（特に消化器がん）を検出する方法として利用できる。また、本発明の検出方法によれば、被験者におけるＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんを診断することができ、更に、ＺＳＣＡＮ９阻害物質の適用対象者であるか否かを判定することができる。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、本発明の検出方法に用いることができる。更に、本発明の阻害物質スクリーニング方法によれば、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングすることができる。前記スクリーニングにより得られた物質は、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができ、また、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療に用いることができる。The detection method of the present invention can be used as a method for detecting ALK fusion-positive cancer (particularly gastrointestinal cancer). In addition, according to the detection method of the present invention, it is possible to diagnose ALK fusion-positive cancer in a subject, and further, it is possible to determine whether or not the subject is an ALK inhibitor application target. The detection kit and primer set of the present invention can be used for the detection method of the present invention. Furthermore, according to the inhibitor screening method of the present invention, it is possible to screen a drug effective for treating the fusion-positive cancer patient. The substance obtained by the screening can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating ALK fusion-positive cancer, and can also be used for treating ALK fusion-positive cancer.
The detection method of the present invention can be used as a method for detecting a ZSCAN9 fusion-positive cancer (particularly gastrointestinal cancer). Further, according to the detection method of the present invention, it is possible to diagnose a ZSCAN9 fusion-positive cancer in a subject, and further, it is possible to determine whether or not the subject is a target of application of a ZSCAN9 inhibitor. The detection kit and primer set of the present invention can be used for the detection method of the present invention. Furthermore, according to the inhibitor screening method of the present invention, it is possible to screen a drug effective for treating the fusion-positive cancer patient. The substance obtained by the screening can be used as an active ingredient of a pharmaceutical composition for treating ZSCAN9 fusion-positive cancer, and can also be used for treating ZSCAN9 fusion-positive cancer.

３Ｔ３繊維芽細胞に融合遺伝子ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０（配列番号１）を導入し、１１日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。It is a micrograph instead of the drawing which shows the state after the fusion gene ZSCAN9ex3-ALKex20 (SEQ ID NO: 1) was introduced into 3T3 fibroblasts and cultured for 11 days. ３Ｔ３繊維芽細胞に遺伝子導入試薬のみを処理し、１１日間培養後の状態を示す、図面に代わる顕微鏡写真である。3T3 fibroblasts are treated with only a gene transfer reagent, and are micrographs instead of drawings showing the state after culturing for 11 days. 融合遺伝子ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０（配列番号１）を導入した３Ｔ３繊維芽細胞をヌードマウスの皮下に接種した後、１０日後の状態を示す、図面に代わる写真である。It is a photograph instead of a drawing showing the state 10 days after subcutaneously inoculating 3T3 fibroblasts into which the fusion gene ZSCAN9ex3-ALKex20 (SEQ ID NO: 1) was introduced into nude mice. 遺伝子導入試薬のみの処理をおこなった３Ｔ３繊維芽細胞を、ヌードマウスの皮下に接種した後、１０日後の状態を示す、図面に代わる写真である。It is a photograph instead of a drawing showing the state 10 days after subcutaneously inoculating nude mice with 3T3 fibroblasts treated with only a gene transfer reagent. 図３及び図４に示すヌードマウスにおける、接種後６乃至１７日後の腫瘍サイズの経時的変化を示すグラフである。3 is a graph showing the time course of tumor size 6 to 17 days after inoculation in the nude mice shown in FIGS. 3 and 4. ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現するＢａ／Ｆ３細胞における各ＡＬＫ阻害剤（クリゾチニブ、ＣＨ５４２４８０２、ＴＡＥ６８４、ＡＳＰ３０２６）に対する感受性を示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing susceptibility to each ALK inhibitor (crizotinib, CH542402, TAE684, ASP3026) in Ba / F3 cells expressing the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide. ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現するＢａ／Ｆ３細胞を各ＡＬＫ阻害剤で処理した後、各培養細胞由来の抽出物のウェスタンブロッティングを実施した結果を示す、図面に代わる写真である。It is a photograph instead of a drawing which shows the result of having performed Western blotting of the extract derived from each cultured cell after treating Ba / F3 cells expressing a ZZCAN9-ALK fusion polypeptide with each ALK inhibitor.

≪定義等≫
＜融合点＞
本明細書における「ＡＬＫ融合遺伝子における融合点」とは、ＡＬＫ融合遺伝子におけるＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドと、ＡＬＫ遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。例えば、配列番号１で表されるＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、塩基配列の第５６８番塩基と第５６９番の塩基の結合した箇所である。
本明細書における「ＡＬＫ融合タンパク質における融合点」とは、ＡＬＫ融合タンパク質における、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、ＡＬＫ遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。≪Definition, etc.≫
<Fusion point>
As used herein, the term "fusion point in an ALK fusion gene" means a site where a polynucleotide derived from the ALK gene in the ALK fusion gene is bound to a polynucleotide derived from another gene that constructs the fusion gene together with the ALK gene. .. For example, in the case of the ZSCAN9-ALK fusion gene represented by SEQ ID NO: 1, it is the position where the bases 568 and 569 of the base sequence are bound.
As used herein, the term "fusion point in an ALK fusion protein" refers to a polypeptide encoded by a polynucleotide derived from the ALK gene in the ALK fusion protein and a polypeptide derived from the other gene that constructs the fusion gene together with the ALK gene. It means the place where the polypeptide encoded by the above is bound.

本明細書における「ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子における融合点」とは、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子におけるＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共に融合遺伝子を構築する他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが結合した箇所を意味する。例えば、配列番号１で表されるＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、塩基配列の第５６８番塩基と第５６９番の塩基の結合した箇所である。
本明細書における「ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質における融合点」とは、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質における、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子由来のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドとが結合した箇所を意味する。As used herein, the term "fusion point in a ZSCAN9 fusion gene" means a site where a polynucleotide derived from the ZSCAN9 gene in the ZSCAN9 fusion gene is bound to a polynucleotide derived from another gene that constructs a fusion gene together with the ZSCAN9 gene. .. For example, in the case of the ZSCAN9-ALK fusion gene represented by SEQ ID NO: 1, it is the position where the bases 568 and 569 of the base sequence are bound.
As used herein, the term "fusion point in a ZSCAN9 fusion protein" means a polypeptide encoded by a polynucleotide derived from the ZSCAN9 gene in the ZSCAN9 fusion protein and a polynucleotide derived from the other gene that constructs the fusion gene together with the ZSCAN9 gene. It means the place where the polypeptide encoded by the above is bound.

＜ＡＬＫ遺伝子又はＡＬＫタンパク質の切断＞
更に、本明細書において、「ＡＬＫ遺伝子の切断」又は「ＡＬＫ遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりＡＬＫ遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、ＡＬＫ遺伝子がＡＬＫキナーゼ領域を含むポリヌクレオチドと、それ以外のポリヌクレオチドと、の少なくとも２つのポリヌクレオチドとに分かれている状態を指す。なお、ＡＬＫ遺伝子の切断点（break point）は、ＡＬＫ遺伝子が切断されてできたポリヌクレオチドの少なくとも一つがコードするタンパク質がＡＬＫキナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも２つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。<Cleavage of ALK gene or ALK protein>
Further, in the present specification, "ALK gene cleavage" or "ALK gene cleavage" means a state in which the continuity of the ALK gene is lost due to gene translocation or inversion, that is, ALK. It refers to a state in which a gene is divided into at least two polynucleotides, a polynucleotide containing an ALK kinase region and a other polynucleotide. The break point of the ALK gene is not limited to the range in which the protein encoded by at least one of the polynucleotides formed by cleaving the ALK gene retains the ALK kinase activity.
In addition, "cutting of a gene other than the ALK gene" or "cutting of a gene other than the ALK gene" means that the continuity of the other gene is lost due to gene translocation or inversion or the like. That is, the state in which another gene is divided into at least two polynucleotides.

また、本明細書において、「ＡＬＫタンパク質の切断」又は「ＡＬＫタンパク質が切断されている」とは、ＡＬＫ遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、ＡＬＫタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、ＡＬＫタンパク質がＡＬＫキナーゼ領域を含むポリペプチドと、それ以外のポリペプチドと、の少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。なお、ＡＬＫタンパク質の切断点は、ＡＬＫタンパク質が切断されてできたポリペプチドの少なくとも一つがＡＬＫキナーゼ活性を保持する範囲で限定されない。
また、「ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。Further, in the present specification, "ALK protein cleavage" or "ALK protein cleavage" is based on the state in which the ALK gene is cleavage as described above, and the continuity of the ALK protein. Is lost, that is, the ALK protein is divided into at least two polypeptides, a polypeptide containing the ALK kinase region and a other polypeptide. The cleavage point of the ALK protein is not limited as long as at least one of the polypeptides formed by cleaving the ALK protein retains the ALK kinase activity.
Further, "cleaved protein other than ALK protein" or "cleaved protein other than ALK protein" is based on the state in which other genes are cleaved as described above. , A state in which the continuity of another protein is lost, that is, a state in which the other protein is divided into at least two polypeptides.

＜ＺＳＣＡＮ９遺伝子又はＺＳＣＡＮ９タンパク質の切断＞
更に、本明細書において、「ＺＳＣＡＮ９遺伝子の切断」又は「ＺＳＣＡＮ９遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等によりＺＳＣＡＮ９遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、ＺＳＣＡＮ９遺伝子が少なくとも２つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。なお、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の切断点（break point）は、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構築する他の遺伝子によってコードされるＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の腫瘍形成能を保持する範囲で限定されない。
また、「ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子の切断」又は「ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子が切断されている」とは、遺伝子の転座又は逆位等により他の遺伝子の連続性が失われている状態、すなわち、他の遺伝子が少なくとも２つのポリヌクレオチドに分かれている状態を指す。<Cleavage of ZSCAN9 gene or ZSCAN9 protein>
Further, in the present specification, "Cleavage of ZSCAN9 gene" or "Cleavage of ZSCAN9 gene" means a state in which continuity of ZSCAN9 gene is lost due to gene translocation or inversion, that is, ZSCAN9. It refers to a state in which a gene is divided into at least two polynucleotides. The break point of the ZSCAN9 gene is not limited as long as it retains the tumorigenicity of the ZSCAN9 fusion protein encoded by other genes that construct the ZSCAN9 fusion gene together with the ZSCAN9 gene.
In addition, "cutting of genes other than ZSCAN9 gene" or "cutting of genes other than ZSCAN9 gene" means that the continuity of other genes is lost due to gene translocation or inversion or the like. That is, the state in which another gene is divided into at least two polynucleotides.

また、本明細書において、「ＺＳＣＡＮ９タンパク質の切断」又は「ＺＳＣＡＮ９タンパク質が切断されている」とは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、ＺＳＣＡＮ９タンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。なお、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の切断点は、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構築する他のタンパク質の、融合タンパク質の腫瘍形成能を有するために必要な機能（例えば、当該他のタンパク質がキナーゼドメインを有する場合、キナーゼ活性）を保持する範囲で限定されない。
また、「ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質の切断」又は「ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている」とは、他の遺伝子が、前述のように切断されている状態であることに基づき、他のタンパク質の連続性が失われている状態、すなわち、他のタンパク質が少なくとも２つのポリペプチドに分かれている状態を指す。Further, in the present specification, "cleaved ZSCAN9 protein" or "cleaved ZSCAN9 protein" means continuity of ZSCAN9 protein based on the state in which the ZSCAN9 gene is cleaved as described above. Is lost, that is, the ZSCAN9 protein is divided into at least two polypeptides. The cleavage point of the ZSCAN9 protein is a function necessary for the other protein that constructs the ZSCAN9 fusion protein together with the ZSCAN9 protein to have the tumorigenicity of the fusion protein (for example, when the other protein has a kinase domain). It is not limited as long as it retains (kinase activity).
Further, "cleaved protein other than ZSCAN9 protein" or "cleaved protein other than ZSCAN9 protein" is based on the state in which other genes are cleaved as described above. , A state in which the continuity of another protein is lost, that is, a state in which the other protein is divided into at least two polypeptides.

＜５’末端側領域／３’末端側領域、Ｎ末端側領域／Ｃ末端側領域＞
５’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より５’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子（融合遺伝子でない遺伝子）の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より５’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、５’末端側領域は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡの場合は、５’末端側ゲノム領域ともいう。
３’末端側領域とは、融合遺伝子の場合は、融合点より３’末端側のポリヌクレオチド、野生型遺伝子（融合遺伝子でない遺伝子）の場合は、当該野生型遺伝子が融合遺伝子を構築した場合の、切断点より３’末端側のポリヌクレオチドを示す。なお、３’末端側領域は、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡのいずれにおける領域であってもよく、例えば、ゲノムＤＮＡの場合は、３’末端側ゲノム領域ともいう。
Ｎ末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりＮ末端側のポリペプチド、野生型タンパク質（融合タンパク質でないタンパク質）の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりＮ末端側のポリヌクレオチドを示す。
Ｃ末端側領域とは、融合タンパク質の場合は、融合点よりＣ末端側のポリペプチド、野生型タンパク質（融合タンパク質でないタンパク質）の場合は、当該野生型タンパク質が融合遺伝子を構築した場合の、切断点よりＣ末端側のポリヌクレオチドを示す。
例えば、配列番号１で表されるＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、５’末端側領域は、第１番〜第５６８番、３’末端側領域は、第５６９番〜２２５９番の塩基配列からなるポリヌクレオチドである。ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質の場合、Ｎ末端側領域は、前記５’末端側領域にコードされるポリペプチドであり、Ｃ末端側領域は、前記３’末端側領域にコードされるポリペプチドである。<5'terminal region / 3'terminal region, N-terminal region / C-terminal region>
In the case of a fusion gene, the 5'terminal region is a polynucleotide on the 5'end side from the fusion point, and in the case of a wild-type gene (a gene that is not a fusion gene), the wild-type gene constructs the fusion gene. , 5'terminal side polynucleotide from the cleavage point. The 5'terminal region may be a region in any of genomic DNA, mRNA, and cDNA. For example, in the case of genomic DNA, it is also referred to as a 5'terminal genomic region.
In the case of a fusion gene, the 3'terminal region is a polynucleotide on the 3'end side from the fusion point, and in the case of a wild-type gene (a gene that is not a fusion gene), the wild-type gene constructs the fusion gene. , The polynucleotide on the 3'end side from the cleavage point is shown. The 3'terminal region may be a region in any of genomic DNA, mRNA, and cDNA. For example, in the case of genomic DNA, it is also referred to as a 3'terminal genomic region.
In the case of a fusion protein, the N-terminal region is a polypeptide on the N-terminal side from the fusion point, and in the case of a wild-type protein (protein that is not a fusion protein), cleavage when the wild-type protein constructs a fusion gene. The polynucleotide on the N-terminal side from the point is shown.
In the case of a fusion protein, the C-terminal region is a polypeptide on the C-terminal side from the fusion point, and in the case of a wild-type protein (a protein that is not a fusion protein), it is cleaved when the wild-type protein constructs a fusion gene. The polynucleotide on the C-terminal side from the point is shown.
For example, in the case of the ZSCAN9-ALK fusion gene represented by SEQ ID NO: 1, the 5'terminal region consists of base sequences 1 to 568, and the 3'terminal region consists of the base sequences 569 to 2259. It is a polynucleotide. In the case of the ZSCAN9-ALK fusion protein, the N-terminal region is the polypeptide encoded by the 5'terminal region, and the C-terminal region is the polypeptide encoded by the 3'terminal region.

＜リファレンス配列＞
また、本明細書において、各由来遺伝子のｃＤＮＡリファレンス配列として、ＺＳＣＡＮ９はENST 00000252207、ＡＬＫはENST 00000389048を、タンパク質のアミノ酸リファレンス配列としては、ＺＳＣＡＮ９はENSP00000252207、ＡＬＫはENSP00000373700、を用いた。<Reference array>
Further, in the present specification, ENST 00000252207 for ZSCAN9 and ENST 00000389048 for ALK were used as cDNA reference sequences for each derived gene, and ENSP00000252207 for ZSCAN9 and ENSP00000373700 for ALK were used as amino acid reference sequences for proteins.

＜ストリンジェントな条件＞
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」の条件である。「よりストリンジェントな条件」とは、ハイブリダイゼーションのための条件として、「５×ＳＳＰＥ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ液、０．５％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド、２００μｇ／ｍＬ鮭精子ＤＮＡ、４２℃オーバーナイト」、洗浄のための条件として、「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」の条件である。<Stringent conditions>
The term "stringent condition" as used herein refers to "5 x SSPE, 5 x Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 200 μg / mL salmon sperm DNA," as a condition for hybridization. "42 ° C. overnight", and the conditions for cleaning are "0.5 x SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.". “More stringent conditions” means “5 × SSPE, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 200 μg / mL salmon sperm DNA, 42 ° C. over” as conditions for hybridization. The conditions for "night" and cleaning are "0.2 x SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.".

＜腫瘍形成能＞
あるポリペプチドが「腫瘍形成能を有する」ことは、後述の実施例８の方法で確認することができる。具体的には、当該ポリペプチドを発現するプラスミドを導入した宿主（３Ｔ３繊維芽細胞）をヌードマウスの皮下に接種し、腫瘍形成の有無で判断する方法で確認する。<Tumorogenic ability>
It can be confirmed by the method of Example 8 described later that a certain polypeptide has "tumor-forming ability". Specifically, a host (3T3 fibroblasts) into which a plasmid expressing the polypeptide is introduced is subcutaneously inoculated into a nude mouse, and confirmation is performed by a method of determining the presence or absence of tumor formation.

《本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、形質転換細胞》
＜本発明のポリペプチド（１）＞
本発明のポリペプチドは、ＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドと、ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチド（「ＡＬＫ融合タンパク質」ともいう）であって、前記ＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドは、ＡＬＫタンパク質における少なくともＡＬＫキナーゼ領域のポリペプチドを含み、ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
前記他のタンパク質としては、ＡＬＫキナーゼドメインを含むＡＬＫタンパク質の一部と融合することにより、ＡＬＫキナーゼ活性化が恒常的に維持され、構築されたＡＬＫ融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。
ＡＬＫ融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、少なくともＡＬＫキナーゼ領域のポリペプチドを含む、ＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質（以下、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質ともいう）であることが好ましい。<< Polypeptides, polynucleotides, vectors, transformed cells of the present invention >>
<Polypeptide of the present invention (1)>
The polypeptide of the present invention is a fusion polypeptide (also referred to as "ALK fusion protein") constructed from a polypeptide derived from an ALK protein and a polypeptide derived from a protein other than the ALK protein, and is the ALK. The protein-derived polypeptide includes at least a polypeptide in the ALK kinase region in the ALK protein, and the polypeptide derived from a protein other than the ALK protein is not particularly limited as long as it contains at least a part of the polypeptides in the other protein. ..
As the other protein, if the ALK kinase activation is constitutively maintained by fusing with a part of the ALK protein containing the ALK kinase domain, and the constructed ALK fusion protein has tumorigenicity. There are no particular restrictions.
As the ALK fusion protein, a fusion protein in which the other protein is the ZSCAN9 protein is particularly preferable. That is, the ZSCAN9 protein and ALK constructed from a polypeptide derived from the ALK protein containing at least a polypeptide in the ALK kinase region and a polypeptide derived from the ZSCAN9 gene containing at least a portion of the polypeptide of the ZSCAN9 protein. It is preferably a fusion protein with a protein (hereinafter, also referred to as a ZSCAN9-ALK fusion protein).

＜本発明のポリペプチド（２）＞
本発明のポリペプチドは、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来のポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドと、から構築される融合ポリペプチド（「ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質」ともいう）であって、前記ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来のポリペプチドは、ＺＳＣＡＮ９タンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含み、ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドは、当該他のタンパク質における少なくとも一部のポリペプチドを含む範囲で特に制限されない。
前記他のタンパク質としては、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と融合することにより、当該他のタンパク質の有する機能性ドメインの活性化が恒常的に維持され、構築されたＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が腫瘍形成能を有するものであれば特に制限されない。
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質としては、前記他のタンパク質が、キナーゼドメインを有するタンパク質である融合タンパク質が好ましく、ＡＬＫタンパク質である融合タンパク質が特に好ましい。すなわち、前記他のタンパク質がＡＬＫタンパク質である場合、少なくともＡＬＫキナーゼ領域のポリペプチドを含む、ＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の少なくとも一部のポリペプチドとを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリペプチドと、から構築された、ＺＳＣＡＮ９タンパク質とＡＬＫタンパク質との融合タンパク質（以下、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質ともいう）であることが好ましい。<Polypeptide of the present invention (2)>
The polypeptide of the present invention is a fusion polypeptide (also referred to as "ZSCAN9 fusion protein") constructed from a polypeptide derived from ZSCAN9 protein and a polypeptide derived from a protein other than ZSCAN9 protein, and is said to be ZSCAN9. The protein-derived polypeptide includes at least a part of the polypeptides in the ZSCAN9 protein, and the polypeptides derived from other proteins other than the ZSCAN9 protein are not particularly limited as long as they contain at least a part of the polypeptides in the other protein. ..
As the other protein, if the activation of the functional domain of the other protein is constantly maintained by fusing with the ZSCAN9 protein, and the constructed ZSCAN9 fusion protein has tumorigenicity. There are no particular restrictions.
As the ZSCAN9 fusion protein, the fusion protein in which the other protein is a protein having a kinase domain is preferable, and the fusion protein which is an ALK protein is particularly preferable. That is, when the other protein is an ALK protein, a ZSCAN9 gene-derived polypeptide containing at least a polypeptide in the ALK kinase region and containing at least a portion of the ZSCAN9 protein. And, it is preferable that it is a fusion protein of ZSCAN9 protein and ALK protein (hereinafter, also referred to as ZSCAN9-ALK fusion protein) constructed from.

本発明のポリペプチドの好適態様である「ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質」としては、下記（ａ）〜（ｄ）に記載のポリペプチドが特に好ましい：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称する）、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド（以下、機能的等価改変体と称する）。As the "ZSCAN9-ALK fusion protein" which is a preferred embodiment of the polypeptide of the present invention, the polypeptides described in (a) to (d) below are particularly preferable:
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity.
(C) A polypeptide having an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity (hereinafter referred to as a homologous polypeptide), and the sequence (d). In the amino acid sequence represented by No. 2, a polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted and having tumorigenicity (hereinafter referred to as a functional equivalent variant). ).

配列番号２で表されるアミノ酸配列は、配列番号１で表される塩基配列によりコードされる配列である。また、配列番号１で表される塩基配列は、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン３までとＡＬＫ遺伝子のエクソン２０からエクソン２９の停止コドンまでの塩基配列からなる。配列番号１で表される塩基配列の内、塩基番号１〜５６８の配列はＺＳＣＡＮ９遺伝子に由来し、塩基番号５６９〜２２５９の配列はＡＬＫ遺伝子に由来する。以下、配列番号１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０と称する。 The amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a sequence encoded by the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The base sequence represented by SEQ ID NO: 1 consists of the base sequences from the start codon ATG to exon 3 of the ZSCAN9 gene and the stop codons of exon 20 to exon 29 of the ALK gene. Among the base sequences represented by SEQ ID NO: 1, the sequences of base numbers 1 to 568 are derived from the ZSCAN9 gene, and the sequences of base numbers 569 to 2259 are derived from the ALK gene. Hereinafter, the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 will be referred to as ZSCAN9ex3-ALKex20.

「機能的等価改変体」において置換、欠失、及び／又は挿入可能なアミノ酸数は、１〜数個であるが、好ましくは１〜１０個、更に好ましくは１〜７個、最も好ましくは１〜５個である。 The number of amino acids that can be substituted, deleted, and / or inserted in the "functional equivalent variant" is 1 to several, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 7, and most preferably 1. ~ 5 pieces.

「相同ポリペプチド」は、「配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が８０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも、腫瘍形成能を有するポリペプチド」であるが、該同一性が、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上であるアミノ酸配列を含むポリペプチドが好ましい。 The "homologous polypeptide" is a "polypeptide containing an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having a tumor-forming ability", but the identity is , Preferably a polypeptide containing an amino acid sequence of 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more.

なお、本明細書における前記「同一性」とは、ＮＥＥＤＬＥ ｐｒｏｇｒａｍ（J Mol Biol 1970; 48: 443-453）検索によりデフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値Ｉｄｅｎｔｉｔｙを意味する。前記のパラメータは以下のとおりである。
Ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ １０
Ｅｘｔｅｎｄ ｐｅｎａｌｔｙ ＝ ０．５
Ｍａｔｒｉｘ ＝ ＥＢＬＯＳＵＭ６２The term "identity" as used herein means a value Identity obtained by using the parameters prepared by default by the NEEDLE program (J Mol Biol 1970; 48: 443-453) search. The above parameters are as follows.
Gap penalty = 10
Extend penalty = 0.5
Matrix = EBLOSUM62

＜本発明のポリヌクレオチド（１）＞
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド（すなわち、ＡＬＫ融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（「ＡＬＫ融合遺伝子」ともいう）である限り、特に限定されるものではない。なお、「ＡＬＫ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、ＡＬＫ融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、ＡＬＫ融合遺伝子のゲノムＤＮＡ全長であっても、ＡＬＫ融合遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡであってもよい。<Polynucleotide of the present invention (1)>
The polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide (also referred to as "ALK fusion gene") encoding the polynucleotide of the present invention (that is, an ALK fusion protein). The "polynucleotide encoding the ALK fusion protein" is the mRNA or cDNA of the ALK fusion gene, regardless of whether it is a polynucleotide consisting only of a translation region in the ALK fusion gene or the full length of the genomic DNA of the ALK fusion gene. There may be.

＜本発明のポリヌクレオチド（２）＞
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチド（すなわち、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド（「ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子」ともいう）である限り、特に限定されるものではない。なお、「ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド」は、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子において翻訳領域のみからなるポリヌクレオチドであっても、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のゲノムＤＮＡ全長であっても、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のｍＲＮＡやｃＤＮＡであってもよい。<Polynucleotide of the present invention (2)>
The polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide (also referred to as "ZSCAN9 fusion gene") encoding the polypeptide of the present invention (that is, a ZSCAN9 fusion protein). The "polynucleotide encoding the ZSCAN9 fusion protein" is the mRNA or cDNA of the ZSCAN9 fusion gene, whether it is a polynucleotide consisting only of a translation region in the ZSCAN9 fusion gene or the full length of the genomic DNA of the ZSCAN9 fusion gene. There may be.

＜本発明のベクター＞
また、本発明のベクターは、前記本発明のポリヌクレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換できる適当なベクターに当該ポリヌクレオチドを組み込むことにより調製することができる。前記ベクターは、当該ポリヌクレオチドの発現に必要な配列、例えば、プロモーター、エンハンサーを含むことができ、更に、宿主への導入確認に必要な配列、例えば、薬剤耐性遺伝子を含むことができる。<Vector of the present invention>
Further, the vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention, and by incorporating the polynucleotide into an appropriate vector capable of transforming a host cell of a eukaryote or a prokaryote. Can be prepared. The vector can contain a sequence required for expression of the polynucleotide, for example, a promoter, an enhancer, and can further contain a sequence required for confirmation of introduction into a host, for example, a drug resistance gene.

＜本発明の形質転換細胞＞
本発明の形質転換細胞は、本発明のベクターにより、適当な宿主細胞、例えば、真核生物又は原核生物の宿主細胞を形質転換することにより調製することができる。本発明の形質転換細胞は、本発明のポリペプチドを製造するのに用いることができる。<Transformed cell of the present invention>
The transformed cells of the present invention can be prepared by transforming a suitable host cell, for example, a eukaryotic or prokaryotic host cell, with the vector of the present invention. The transformed cells of the present invention can be used to produce the polypeptides of the present invention.

≪本発明の検出方法に係る試料≫
＜対象臓器＞
本発明に係る検出方法は、対象臓器に生じるがんの検出に好適に用いることができる。被験者の被験部位（対象臓器）としては、本発明に係る融合体が存在している範囲で限定されないが、消化器が好ましく、消化管がより好ましく、胃腸が更に好ましく、下部消化管が更に好ましく、大腸が更に好ましい。
より具体的には、本発明に係る検出方法は、消化器がんの検出に好適に、消化管がんの検出により好適に、胃腸がんの検出に更に好適に、下部消化管がんの検出に更に好適に、大腸がんの検出に更に好適に用いることができる。<< Sample according to the detection method of the present invention >>
<Target organ>
The detection method according to the present invention can be suitably used for detecting cancer occurring in a target organ. The test site (target organ) of the subject is not limited to the range in which the fusion according to the present invention exists, but the digestive system is preferable, the digestive tract is more preferable, the gastrointestinal tract is more preferable, and the lower digestive tract is further preferable. , The large intestine is more preferred.
More specifically, the detection method according to the present invention is suitable for detecting gastrointestinal cancer, more suitable for detecting gastrointestinal cancer, and more suitable for detecting gastrointestinal cancer. It can be more preferably used for detection and more preferably for detection of colorectal cancer.

＜被験者からの採取物＞
本発明に係る検出方法における、被験者から得た試料としては、被験者からの採取物（生体から分離した試料）、具体的には、任意の採取された体液（好ましくは血液）、被験者患部からの摘出検体、生検試料又は擦過検体、糞便、尿、消化管洗浄液等を用いることができる。前記消化管洗浄液は、消化管全体の洗浄液であっても、あるいは、少なくとも被験部位を含む消化管の洗浄液、例えば、下部消化管の洗浄液、大腸の洗浄液であってもよい。検出感度を考慮すると、前記対象臓器における被験部位の細胞が含まれる試料が好ましく、被験者の被験部位からの摘出検体又は生検試料が更に好ましい。<Collection from subjects>
In the detection method according to the present invention, the sample obtained from the subject is a sample collected from the subject (sample separated from the living body), specifically, any collected body fluid (preferably blood), or from the affected part of the subject. Excised samples, biopsy samples or scraped samples, feces, urine, gastrointestinal lavage fluid and the like can be used. The gastrointestinal tract cleaning solution may be a cleaning solution for the entire digestive tract, or may be a cleaning solution for the digestive tract including at least the test site, for example, a cleaning solution for the lower gastrointestinal tract, a cleaning solution for the large intestine. Considering the detection sensitivity, a sample containing cells of a test site in the target organ is preferable, and a sample removed from the test site of the subject or a biopsy sample is more preferable.

＜採取物の調製＞
本発明に係るＡＬＫ融合遺伝子、又は、ＡＬＫ融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、ＡＬＫ融合遺伝子、又は、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、ＡＬＫ融合遺伝子、又は、ＡＬＫ融合タンパク質を検出してもよい。なお、ＡＬＫ融合遺伝子の検出とは、ＡＬＫ融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡ、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。<Preparation of sample>
The method for detecting an ALK fusion gene or an ALK fusion protein according to the present invention is to prepare a tissue section or cell suspension of a sample obtained from a subject, and use the cells contained in the tissue section or cell suspension. On the other hand, it can be carried out by detecting an ALK fusion gene or an ALK fusion protein by a technique well known to those skilled in the art. Alternatively, a solubilized solution is prepared from the sample obtained from the above-mentioned subject, and the gene or protein contained therein is extracted, and in this extracted sample, the ALK fusion gene or the ALK fusion gene or a technique well known to those skilled in the art is used. ALK fusion proteins may be detected. The detection of the ALK fusion gene may be either the detection of the genomic DNA of the ALK fusion gene, the mRNA which is a transcript of the genomic DNA, or the detection of the cDNA obtained by using the mRNA as a template.

本発明に係るＺＳＣＡＮ９融合遺伝子、又は、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出方法は、被験者から得た試料の組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成し、組織切片又は細胞懸濁液に含まれる細胞に対し、当業者に周知の技法により、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子、又は、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することにより実施できる。あるいは、前述の被験者から得た試料から、可溶化液を調製し、ここに含まれる遺伝子、又は、タンパク質を抽出し、この抽出試料において、当業者に周知の技法により、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子、又は、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出してもよい。なお、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出とは、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡ、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。 In the method for detecting the ZSCAN9 fusion gene or the ZSCAN9 fusion protein according to the present invention, a tissue section or cell suspension of a sample obtained from a subject is prepared, and the cells contained in the tissue section or cell suspension are used. On the other hand, it can be carried out by detecting the ZSCAN9 fusion gene or the ZSCAN9 fusion protein by a technique well known to those skilled in the art. Alternatively, a solubilized solution is prepared from the sample obtained from the above-mentioned subject, and the gene or protein contained therein is extracted, and in this extracted sample, the ZSCAN9 fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene is extracted by a technique well known to those skilled in the art. The ZSCAN9 fusion protein may be detected. The detection of the ZSCAN9 fusion gene may be either the detection of the genomic DNA of the ZSCAN9 fusion gene, the mRNA that is a transcript of the genomic DNA, or the detection of the cDNA obtained using the mRNA as a template.

≪本発明の検出方法に係る検出対象≫
＜ＡＬＫ融合体：ＡＬＫ融合遺伝子とＡＬＫ融合タンパク質＞
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＡＬＫ融合体の検出方法、すなわち、ＡＬＫキナーゼ領域を含む融合タンパク質（ＡＬＫ融合タンパク質）の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子（ＡＬＫ融合遺伝子）の検出方法が含まれる。
＜ＺＳＣＡＮ９融合体：ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子とＺＳＣＡＮ９融合タンパク質＞
本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＺＳＣＡＮ９融合体の検出方法、すなわち、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出方法、又は、前記融合タンパク質をコードする融合遺伝子（ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子）の検出方法が含まれる。<< Detection target according to the detection method of the present invention >>
<ALK fusion: ALK fusion gene and ALK fusion protein>
The detection method of the present invention includes a method for detecting an ALK fusion in a sample obtained from a subject, that is, a method for detecting a fusion protein containing an ALK kinase region (ALK fusion protein), or a fusion encoding the fusion protein. A method for detecting a gene (ALK fusion gene) is included.
<ZSCAN9 fusion: ZSCAN9 fusion gene and ZSCAN9 fusion protein>
The detection method of the present invention includes a method for detecting a ZSCAN9 fusion in a sample obtained from a subject, that is, a method for detecting a ZSCAN9 fusion protein, or a method for detecting a fusion gene (ZSCAN9 fusion gene) encoding the fusion protein. Is included.

≪本発明の検出方法の態様（融合タンパク質及び融合遺伝子の検出方法）≫
本発明の検出方法には、被験者から得た消化器由来試料中の、ＡＬＫ遺伝子の切断、又は、ＡＬＫ遺伝子にコードされるポリペプチドの切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た消化器由来試料中の、ＡＬＫ遺伝子とそれ以外の他の遺伝子とから構築される融合遺伝子の存在、又は、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。<< Aspects of the detection method of the present invention (method for detecting fusion proteins and fusion genes) >>
The detection method of the present invention includes a detection method including a step of detecting cleavage of the ALK gene or cleavage of a polypeptide encoded by the ALK gene in a digestive organ-derived sample obtained from the subject, and a detection method obtained from the subject. A detection method including a step of detecting the presence of a fusion gene constructed from an ALK gene and other genes in a sample derived from a digestive organ, or the presence of a fusion protein encoded by the fusion gene. included.

本発明の検出方法には、被験者から得た試料中の、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の切断、又は、ＺＳＣＡＮ９遺伝子にコードされるポリペプチドの切断、を検出する工程を含む検出方法と、被験者から得た試料中の、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とそれ以外の他の遺伝子とから構築される融合遺伝子の存在、又は、前記融合遺伝子によってコードされる融合タンパク質の存在、を検出する工程を含む検出方法が含まれる。 The detection method of the present invention includes a detection method including a step of detecting cleavage of the ZSCAN9 gene or cleavage of a polypeptide encoded by the ZSCAN9 gene in a sample obtained from a subject, and a detection method in a sample obtained from the subject. The detection method includes a step of detecting the presence of a fusion gene constructed from the ZSCAN9 gene and other genes, or the presence of a fusion protein encoded by the fusion gene.

＜ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様＞
以下、ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。
ここで、正常試料（がんに罹患していない組織由来試料）には、ＡＬＫ融合体のみならずＡＬＫ遺伝子又はＡＬＫタンパク質も存在しないので、ＡＬＫ遺伝子又はＡＬＫタンパク質自体の存在を検出することによってＡＬＫ融合体を検出することもできる。<Aspect for detecting ALK fusion gene>
Hereinafter, modes for detecting the ALK fusion gene will be described, but the present invention is not limited thereto.
Regardless of the example, the detection of a specific region of a gene in each of the following embodiments may be carried out using a probe or primer designed based on a base sequence analyzed in advance, or by sequencing. May be good.
Here, since not only the ALK fusion but also the ALK gene or ALK protein does not exist in the normal sample (tissue-derived sample not affected by cancer), ALK is detected by detecting the presence of the ALK gene or ALK protein itself. Fusions can also be detected.

〔ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（１）〕
〈ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（１−ａ）〉
ＡＬＫ融合遺伝子を検出する一態様として、ＡＬＫ融合遺伝子が構築されているとき、ＡＬＫ遺伝子が２つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、ＡＬＫ遺伝子が切断されている状態、すなわち、ＡＬＫ遺伝子５’末端側領域とＡＬＫ遺伝子３’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫ遺伝子５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で離れていることを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。あるいは、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域のみが存在することを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出してもよい。[Aspect for detecting ALK fusion gene (1)]
<Aspect for detecting ALK fusion gene (1-a)>
As one aspect of detecting the ALK fusion gene, when the ALK fusion gene is constructed, the ALK gene is cleaved based on the fact that the ALK gene is cleaved into two or more polynucleotides, that is, ALK. The ALK fusion gene can be detected by detecting that the continuity between the gene 5'terminal region and the ALK gene 3'terminal region is lost.
Specifically, for example, a first probe that specifically hybridizes to the ALK gene 5'terminal region and a second probe that specifically hybridizes to the ALK gene 3'terminal region are used. The ALK fusion gene can be detected by detecting that the two gene regions are separated on the chromosome. Alternatively, the ALK fusion gene can be detected by detecting the presence of only the ALK gene 3'terminal region.
The ALK fusion gene may be detected by confirming the state in which the other gene that is fused with the polynucleotide derived from the ALK gene to construct the fusion gene is cleaved by the above method.

〈ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＡＬＫ遺伝子の、５’末端側領域と、３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側領域の発現量と、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域の発現量とが異なる場合、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、ＡＬＫ遺伝子と共にＡＬＫ融合遺伝子を構築しているＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出してもよい。<Aspect for detecting ALK fusion gene (1-b)>
As another embodiment, the ALK fusion gene is detected by specifically detecting the expression levels of the 5'terminal region and the 3'terminal region of the ALK gene and determining the ratio of the expression levels. Can be done. Specifically, for example, when the expression level of the 5'terminal region of the ALK gene and the expression level of the 3'terminal region of the ALK gene are different, the ALK fusion gene can be detected.
Alternatively, the ALK fusion gene may be detected by confirming the genes other than the ALK gene that constructs the ALK fusion gene together with the ALK gene by the above method.

〈ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（１−ｃ）〉
他の一態様として、ＡＬＫ融合体の形成過程において、ＡＬＫ遺伝子又はＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製（duplication）を伴う場合、すなわち、ＡＬＫ遺伝子由来の重複したポリヌクレオチド、及び、ＡＬＫ遺伝子と共にＡＬＫ融合遺伝子を構築しているＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとから、ＡＬＫ融合遺伝子が構築されている場合、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。<Aspect for detecting ALK fusion gene (1-c)>
In another embodiment, the process of forming the ALK fusion involves duplication of at least a portion of the ALK gene or a gene other than the ALK gene, ie, duplicate polynucleotides derived from the ALK gene, and When the ALK fusion gene is constructed from duplicate polynucleotides derived from genes other than the ALK gene that constructs the ALK fusion gene together with the ALK gene, if the ALK fusion gene is constructed, the polynucleotide derived from the ALK gene or the above-mentioned other gene is derived. The ALK fusion gene can be detected by detecting the duplication of polynucleotides.

〔ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（２）〕
ＡＬＫ融合遺伝子を検出する一態様として、ＡＬＫ融合遺伝子が、ＡＬＫ遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが融合して構築されていることに基づき、ＡＬＫ融合遺伝子における、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９の場合、すなわちＡＬＫ融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子である場合、第１のプローブはＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。[Aspect for detecting ALK fusion gene (2)]
As one aspect of detecting the ALK fusion gene, the ALK fusion gene is constructed based on the fact that the ALK fusion gene is constructed by fusing a polynucleotide derived from the ALK gene and a polynucleotide derived from a gene other than the ALK gene. , ALK fusion gene is detected by detecting a fusion polynucleotide in which at least a part of a polynucleotide derived from the ALK gene and at least a part of a polynucleotide derived from a gene other than the ALK gene are continuously contained. be able to.
Specifically, for example, a first probe that specifically hybridizes to the 5'terminal region of a polynucleotide derived from a gene other than the ALK gene and a first probe that specifically hybridizes to the 3'terminal region of the ALK gene. The ALK fusion gene can be detected by detecting that the two gene regions are close to each other on the chromosome by using the second probe. When the gene other than the ALK gene is ZSCAN9, that is, when the ALK fusion gene is the ZSCAN9-ALK fusion gene, the first probe specifically hybridizes to the 5'terminal region of the polynucleotide derived from the ZSCAN9 gene. A probe to be used may be used.

〔ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（３）〕
ＡＬＫ融合遺伝子を検出する一態様として、ＡＬＫ融合遺伝子が、ＡＬＫ遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、ＡＬＫ融合遺伝子における、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にアニールする第１のプライマーと、ＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にアニールする第２のプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、融合点の存在を示す所定のＰＣＲ産物が得られることを確認することにより、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。[Aspect for detecting ALK fusion gene (3)]
As one aspect of detecting the ALK fusion gene, ALK is constructed based on the fact that the ALK fusion gene is constructed by fusing a polynucleotide derived from the ALK gene and a polynucleotide derived from a gene other than the ALK gene at the fusion point. Detects a fusion polynucleotide in which at least a part of a polynucleotide derived from the ALK gene and at least a part of a polynucleotide derived from a gene other than the ALK gene are continuously contained in the fusion gene including a fusion point. Thereby, the ALK fusion gene can be detected.
Specifically, for example, a first primer that specifically anneals to the 5'terminal region of a polynucleotide derived from a gene other than the ALK gene, and a specific primer to the 3'terminal region of a polynucleotide derived from the ALK gene. The ALK fusion gene can be detected by performing a PCR reaction with a second primer to anneaate the gene and confirming that a predetermined PCR product indicating the presence of a fusion point is obtained.

＜ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様＞
以下、ＡＬＫタンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。<Aspect for detecting ALK fusion protein>
Hereinafter, aspects for detecting the ALK protein will be described, but the present invention is not limited thereto.

〔ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（１）〕
〈ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（１−ａ）〉
ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様として、ＡＬＫ融合遺伝子が構築されているとき、ＡＬＫ遺伝子にコードされるＡＬＫタンパク質も切断されることに基づき、ＡＬＫタンパク質が切断されている状態、すなわち、ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域とＣ末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、異なるタンパク質に存在することを確認することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＡＬＫタンパク質と共に融合タンパク質を構築しているＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、ＡＬＫ融合タンパク質を検出してもよい。[Aspect for detecting ALK fusion protein (1)]
<Aspect for detecting ALK fusion protein (1-a)>
As an embodiment for detecting the ALK fusion protein, when the ALK fusion gene is constructed, the ALK protein encoded by the ALK gene is also cleaved, and the ALK protein is cleaved, that is, the N of the ALK protein. The ALK fusion protein can be detected by detecting that the terminal region and the C-terminal region are discontinuously cleaved.
Specifically, for example, a first antibody that specifically binds to the N-terminal region of the ALK protein and a second antibody that specifically binds to the C-terminal region of the ALK protein are used, and the two regions are used. However, the ALK fusion protein can be detected by confirming that it is present in a different protein.
Alternatively, the ALK fusion protein may be detected by confirming that a protein other than the ALK protein that is constructing the fusion protein together with the ALK protein is cleaved by the above method.

〈ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＡＬＫタンパク質の、Ｎ末端側領域と、Ｃ末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域の発現量と、ＡＬＫタンパク質Ｃ末端側領域の発現量とが異なることを指標として、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＡＬＫタンパク質と共にＡＬＫ融合タンパク質を構築しているＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出してもよい。<Aspect for detecting ALK fusion protein (1-b)>
As another aspect, the ALK fusion protein can be detected by specifically detecting the expression levels of the N-terminal region and the C-terminal region of the ALK protein and determining the ratio of the expression levels. .. Specifically, for example, the ALK fusion protein can be detected using the difference between the expression level of the N-terminal region of the ALK protein and the expression level of the C-terminal region of the ALK protein as an index.
Alternatively, the ALK fusion protein may be detected by confirming the protein other than the ALK protein that constructs the ALK fusion protein together with the ALK protein by the above method.

〔ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（２）〕
ＡＬＫ融合タンパク質を検出する一態様では、ＡＬＫ融合タンパク質が、ＡＬＫタンパク質由来ポリペプチドと、ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、ＡＬＫ融合タンパク質における、ＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。[Aspect for detecting ALK fusion protein (2)]
In one aspect of detecting an ALK fusion protein, the ALK fusion protein is constructed based on the fact that the ALK fusion protein is constructed by fusing a polypeptide derived from the ALK protein and a polypeptide derived from a protein other than the ALK protein. , ALK fusion protein can be detected by detecting a fusion polypeptide containing at least a part of a polypeptide derived from the ALK protein and at least a part of the polypeptide derived from the other protein in succession.
Specifically, for example, a first antibody that specifically binds to the N-terminal region of a protein other than the ALK protein and a second antibody that specifically binds to the C-terminal region of the ALK protein are used. The ALK fusion protein can be detected by confirming that the two regions are present in the same protein.

〔ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（３）〕
ＡＬＫ融合タンパク質を検出する一態様では、ＡＬＫ融合タンパク質が、ＡＬＫタンパク質由来ポリペプチドと、ＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、ＡＬＫ融合タンパク質における、前記融合点を含むＡＬＫタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＡＬＫ融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、ＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。[Aspect for detecting ALK fusion protein (3)]
In one aspect of detecting an ALK fusion protein, the ALK fusion protein is constructed based on the fusion of an ALK protein-derived polypeptide and a polypeptide derived from a protein other than the ALK protein at a fusion point. ALK fusion by detecting a fusion polypeptide in which at least a part of an ALK protein-derived polypeptide containing the fusion point and at least a part of the other protein-derived polypeptide are continuously contained in the fusion protein. Protein can be detected.
Specifically, for example, the ALK fusion protein can be detected by an immunological measurement method using an antibody that specifically recognizes a polypeptide containing a fusion point of the ALK fusion protein.

〔ＡＬＫ融合タンパク質を検出する態様（４）〕
ＡＬＫ融合タンパク質を検出する一態様では、ＡＬＫ融合タンパク質の活性を指標にＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、野生型ＡＬＫタンパク質に対して阻害活性のある物質を用いて野生型ＡＬＫタンパク質の活性を阻害した上で、ＡＬＫタンパク質のキナーゼ活性を測定し、ＡＬＫ融合タンパク質を含まない（野生型ＡＬＫタンパク質のみを含む）場合に比較して、活性が高いことを指標にＡＬＫ融合タンパク質を検出することができる。なお、ＡＬＫタンパク質のキナーゼ活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、ＡＬＫによりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。[Aspect for detecting ALK fusion protein (4)]
In one aspect of detecting an ALK fusion protein, the ALK fusion protein can be detected using the activity of the ALK fusion protein as an index.
Specifically, for example, after inhibiting the activity of the wild-type ALK protein with a substance having an inhibitory activity against the wild-type ALK protein, the kinase activity of the ALK protein is measured, and the ALK fusion protein is not contained (ALK fusion protein is not contained). The ALK fusion protein can be detected using the high activity as an index as compared with the case (containing only the wild type ALK protein). A method well known to those skilled in the art can be appropriately selected for measuring the kinase activity of the ALK protein. For example, the phosphorylated state of a molecule phosphorylated by ALK may be detected.

なお、ＡＬＫ融合タンパク質の検出は、ＡＬＫ融合タンパク質を構成する全長ポリペプチドの存在、あるいは、ＡＬＫ融合タンパク質の一部を構成するポリペプチドの存在を指標として行ってもよく、ＡＬＫ融合タンパク質の存在が確認できる範囲で制限されない。 The detection of the ALK fusion protein may be carried out using the presence of the full-length polypeptide constituting the ALK fusion protein or the presence of the polypeptide constituting a part of the ALK fusion protein as an index, and the presence of the ALK fusion protein is present. It is not limited to the extent that it can be confirmed.

＜ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様＞
以下、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。
なお、以下の各態様における遺伝子の特定の領域の検出は、その例示に関わらず、あらかじめ解析した塩基配列に基づいて設計されたプローブ又はプライマーを用いて行っても、あるいは、シーケンシングによって行ってもよい。<Aspect for detecting ZSCAN9 fusion gene>
Hereinafter, modes for detecting the ZSCAN9 fusion gene will be described, but the present invention is not limited thereto.
Regardless of the example, the detection of a specific region of a gene in each of the following embodiments may be carried out using a probe or primer designed based on a base sequence analyzed in advance, or by sequencing. May be good.

〔ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（１）〕
〈ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（１−ａ）〉
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する一態様として、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が構築されているとき、ＺＳＣＡＮ９遺伝子が２つ以上のポリヌクレオチドに切断されていることに基づき、ＺＳＣＡＮ９遺伝子が切断されている状態、すなわち、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域とＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側領域との連続性が失われていることを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で離れていることを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。あるいは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域のみが存在することを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
なお、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドと融合して融合遺伝子を構築している他の遺伝子が切断されている状態を前記方法で確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出してもよい。[Aspects for detecting the ZSCAN9 fusion gene (1)]
<Aspect for detecting ZSCAN9 fusion gene (1-a)>
As one aspect of detecting the ZSCAN9 fusion gene, when the ZSCAN9 fusion gene is constructed, the ZSCAN9 gene is cleaved based on the fact that the ZSCAN9 gene is cleaved into two or more polynucleotides, that is, ZSCAN9. The ZSCAN9 fusion gene can be detected by detecting that the continuity between the gene 5'terminal region and the ZSCAN9 gene 3'terminal region is lost.
Specifically, for example, a first probe that specifically hybridizes to the ZSCAN9 gene 5'terminal region and a second probe that specifically hybridizes to the ZSCAN9 gene 3'terminal region are used. The ZSCAN9 fusion gene can be detected by detecting that the two gene regions are separated on the chromosome. Alternatively, the ZSCAN9 fusion gene can be detected by detecting the presence of only the ZSCAN9 gene 5'terminal region.
The ZSCAN9 fusion gene may be detected by confirming the state in which the other gene that is fused with the polynucleotide derived from the ZSCAN9 gene to construct the fusion gene is cleaved by the above method.

〈ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の、５’末端側領域と、３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側領域の発現量と、ＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側領域の発現量とが異なる場合、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
あるいは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構築しているＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子について、前記方法で確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出してもよい。<Aspect for detecting ZSCAN9 fusion gene (1-b)>
As another embodiment, the ZSCAN9 fusion gene is detected by specifically detecting the expression levels of the 5'terminal region and the 3'terminal region of the ZSCAN9 gene and determining the ratio of the expression levels. Can be done. Specifically, for example, when the expression level of the 5'terminal region of the ZSCAN9 gene and the expression level of the 3'terminal region of the ZSCAN9 gene are different, the ZSCAN9 fusion gene can be detected.
Alternatively, the ZSCAN9 fusion gene may be detected by confirming the genes other than the ZSCAN9 gene that constructs the ZSCAN9 fusion gene together with the ZSCAN9 gene by the above method.

〈ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（１−ｃ）〉
他の一態様として、ＺＳＣＡＮ９融合体の形成過程において、ＺＳＣＡＮ９遺伝子又はＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子の少なくとも一部の複製（duplication）を伴う場合、すなわち、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来の重複したポリヌクレオチド、及び、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構築しているＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来の重複したポリヌクレオチドとから、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が構築されている場合、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチド又は前記他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの重複を検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。<Aspect for detecting ZSCAN9 fusion gene (1-c)>
In another embodiment, the process of forming the ZSCAN9 fusion involves duplication of at least a portion of the ZSCAN9 gene or a gene other than the ZSCAN9 gene, ie, duplicate polynucleotides derived from the ZSCAN9 gene, and When the ZSCAN9 fusion gene is constructed from duplicate polynucleotides derived from genes other than the ZSCAN9 gene that constructs the ZSCAN9 fusion gene together with the ZSCAN9 gene, the polynucleotide derived from the ZSCAN9 gene or the above-mentioned other gene is derived. The ZSCAN9 fusion gene can be detected by detecting duplication of polynucleotides.

〔ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（２）〕
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する一態様として、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドとが融合して構築されていることに基づき、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子における、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域に特異的にハイブリダイズする第２のプローブを用い、当該２つの遺伝子領域が染色体上で近接していることを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子が、ＡＬＫの場合、すなわちＺＳＣＡＮ９融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子である場合、第１のプローブはＡＬＫ遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にハイブリダイズするプローブを用いればよい。[Aspects for detecting the ZSCAN9 fusion gene (2)]
As one aspect of detecting the ZSCAN9 fusion gene, the ZSCAN9 fusion gene is constructed based on the fact that the ZSCAN9 fusion gene is constructed by fusing a polynucleotide derived from the ZSCAN9 gene and a polynucleotide derived from a gene other than the ZSCAN9 gene. , The ZSCAN9 fusion gene is detected by detecting a fusion polynucleotide in which at least a part of a polynucleotide derived from the ZSCAN9 gene and at least a part of a polynucleotide derived from a gene other than the ZSCAN9 gene are continuously contained. be able to.
Specifically, for example, a first probe that specifically hybridizes to the 3'terminal region of a polynucleotide derived from a gene other than the ZSCAN9 gene and a first probe that specifically hybridizes to the 5'terminal region of the ZSCAN9 gene. The ZSCAN9 fusion gene can be detected by detecting that the two gene regions are close to each other on the chromosome using the second probe. When the gene other than the ZSCAN9 gene is ALK, that is, when the ZSCAN9 fusion gene is a ZSCAN9-ALK fusion gene, the first probe specifically hybridizes to the 3'terminal region of the ALK gene-derived polynucleotide. A probe to be used may be used.

〔ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（３）〕
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する一態様として、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来ポリヌクレオチドと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来ポリヌクレオチドとが、融合点において融合して構築されていることに基づき、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子における、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部と、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの少なくとも一部とが、融合点を含んで連続して含まれる融合ポリヌクレオチドを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子由来のポリヌクレオチドの３’末端側領域に特異的にアニールする第１のプライマーと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来のポリヌクレオチドの５’末端側領域に特異的にアニールする第２のプライマーとを用いてＰＣＲ反応を行い、融合点の存在を示す所定のＰＣＲ産物が得られることを確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。[Aspects for detecting the ZSCAN9 fusion gene (3)]
As one aspect of detecting the ZSCAN9 fusion gene, ZSCAN9 is constructed based on the fact that the ZSCAN9 fusion gene is constructed by fusing a polynucleotide derived from the ZSCAN9 gene and a polynucleotide derived from a gene other than the ZSCAN9 gene at the fusion point. A fusion polynucleotide in which at least a part of a polynucleotide derived from the ZSCAN9 gene and at least a part of a polynucleotide derived from a gene other than the ZSCAN9 gene are continuously contained including a fusion point in the fusion gene is detected. Thereby, the ZSCAN9 fusion gene can be detected.
Specifically, for example, a first primer that specifically anneals to the 3'terminal region of a polynucleotide derived from a gene other than the ZSCAN9 gene, and a specific 5'terminal region of a polynucleotide derived from the ZSCAN9 gene. The ZSCAN9 fusion gene can be detected by performing a PCR reaction with a second primer to anneaate the gene and confirming that a predetermined PCR product indicating the presence of a fusion point is obtained.

＜ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様＞
以下、ＺＳＣＡＮ９タンパク質を検出する態様について述べるが、これらに限定されるものではない。<Aspect for detecting ZSCAN9 fusion protein>
Hereinafter, aspects for detecting the ZSCAN9 protein will be described, but the present invention is not limited thereto.

〔ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（１）〕
〈ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（１−ａ）〉
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様として、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が構築されているとき、ＺＳＣＡＮ９遺伝子にコードされるＺＳＣＡＮ９タンパク質も切断されることに基づき、ＺＳＣＡＮ９タンパク質が切断されている状態、すなわち、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域とＣ末端側領域とが連続せずに切断されていることを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、異なるタンパク質に存在することを確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共に融合タンパク質を構築しているＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質が切断されている状態を前記方法により確認することで、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出してもよい。[Aspects for detecting ZSCAN9 fusion protein (1)]
<Aspect for detecting ZSCAN9 fusion protein (1-a)>
As an embodiment for detecting the ZSCAN9 fusion protein, when the ZSCAN9 fusion gene is constructed, the ZSCAN9 protein encoded by the ZSCAN9 gene is also cleaved, so that the ZSCAN9 protein is cleaved, that is, the N of the ZSCAN9 protein. The ZSCAN9 fusion protein can be detected by detecting that the terminal region and the C-terminal region are discontinuously cleaved.
Specifically, for example, a first antibody that specifically binds to the N-terminal region of the ZSCAN9 protein and a second antibody that specifically binds to the C-terminal region of the ZSCAN9 protein are used, and the two regions are used. However, the ZSCAN9 fusion protein can be detected by confirming that it is present in a different protein.
Alternatively, the ZSCAN9 fusion protein may be detected by confirming the state in which a protein other than the ZSCAN9 protein constructing the fusion protein together with the ZSCAN9 protein is cleaved by the above method.

〈ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（１−ｂ）〉
他の一態様として、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の、Ｎ末端側領域と、Ｃ末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域の発現量と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質Ｃ末端側領域の発現量とが異なることを指標として、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
あるいは、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構築しているＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質について、前記方法で確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出してもよい。<Aspect for detecting ZSCAN9 fusion protein (1-b)>
As another aspect, the ZSCAN9 fusion protein can be detected by specifically detecting the expression levels of the N-terminal region and the C-terminal region of the ZSCAN9 protein and determining the ratio of the expression levels. .. Specifically, for example, the ZSCAN9 fusion protein can be detected using the difference between the expression level of the N-terminal region of the ZSCAN9 protein and the expression level of the C-terminal region of the ZSCAN9 protein as an index.
Alternatively, the ZSCAN9 fusion protein may be detected by confirming the proteins other than the ZSCAN9 protein that constructs the ZSCAN9 fusion protein together with the ZSCAN9 protein by the above method.

〔ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（２）〕
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する一態様では、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来ポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合して構築されていることに基づき、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質における、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質のＣ末端側領域に特異的に結合する第１の抗体と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域に特異的に結合する第２の抗体を用い、当該２つの領域が、同一のタンパク質に存在することを確認することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。[Aspects for detecting ZSCAN9 fusion protein (2)]
In one aspect of detecting a ZSCAN9 fusion protein, the ZSCAN9 fusion protein is constructed based on the fact that the ZSCAN9 fusion protein is constructed by fusing a polypeptide derived from the ZSCAN9 protein and a polypeptide derived from a protein other than the ZSCAN9 protein. , ZSCAN9 fusion protein can be detected by detecting a fusion polypeptide in which at least a part of a polypeptide derived from the ZSCAN9 protein and at least a part of the polypeptide derived from the other protein are continuously contained.
Specifically, for example, a first antibody that specifically binds to the C-terminal region of a protein other than the ZSCAN9 protein and a second antibody that specifically binds to the N-terminal region of the ZSCAN9 protein are used. , The ZSCAN9 fusion protein can be detected by confirming that the two regions are present in the same protein.

〔ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（３）〕
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する一態様では、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来ポリペプチドと、ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドとが融合点で融合して構築されていることに基づき、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質における、前記融合点を含むＺＳＣＡＮ９タンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部と、前記ＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質由来のポリペプチドの少なくとも一部が連続して含まれる融合ポリペプチドを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法により、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。[Aspect for detecting ZSCAN9 fusion protein (3)]
In one aspect of detecting a ZSCAN9 fusion protein, ZSCAN9 is constructed based on the fact that the ZSCAN9 fusion protein is constructed by fusing a polypeptide derived from the ZSCAN9 protein and a polypeptide derived from a protein other than the ZSCAN9 protein at a fusion point. To detect a fusion polypeptide in which at least a part of a polypeptide derived from ZSCAN9 protein containing the fusion point and at least a part of a polypeptide derived from a protein other than the ZSCAN9 protein are continuously contained in the fusion protein. Allows the ZSCAN9 fusion protein to be detected.
Specifically, for example, the ZSCAN9 fusion protein can be detected by an immunological measurement method using an antibody that specifically recognizes a polypeptide containing a fusion point of the ZSCAN9 fusion protein.

〔ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する態様（４）〕
ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する一態様では、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性を指標にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。
具体的には、例えば、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共に融合タンパク質を構築するＺＳＣＡＮ９以外の他のタンパク質が酵素活性を有するタンパク質である場合、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を含まない（野生型ＺＳＣＡＮ９タンパク質のみを含む）場合に比較して、当該酵素活性が高いことを指標に、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出することができる。なお、酵素活性の測定には当業者に周知の方法を適宜選択することができ、例えば、前記他のタンパク質がキナーゼ活性を有するタンパク質（好ましくはＡＬＫタンパク質）である場合、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質によりリン酸化を受ける分子のリン酸化状態を検出してもよい。[Aspects for detecting ZSCAN9 fusion protein (4)]
In one aspect of detecting the ZSCAN9 fusion protein, the ZSCAN9 fusion protein can be detected using the activity of the ZSCAN9 fusion protein as an index.
Specifically, for example, when the protein other than ZSCAN9 that constructs the fusion protein together with the ZSCAN9 protein is a protein having enzymatic activity, it is compared with the case where the ZSCAN9 fusion protein is not contained (only the wild type ZSCAN9 protein is contained). Therefore, the ZSCAN9 fusion protein can be detected using the high enzyme activity as an index. A method well known to those skilled in the art can be appropriately selected for measuring the enzyme activity. For example, when the other protein is a protein having kinase activity (preferably ALK protein), it is phosphorylated by the ZSCAN9 fusion protein. The phosphorylated state of the receiving molecule may be detected.

なお、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出は、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構成する全長ポリペプチドの存在、あるいは、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の一部を構成するポリペプチドの存在を指標として行ってもよく、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の存在が確認できる範囲で制限されない。 The detection of the ZSCAN9 fusion protein may be carried out using the presence of the full-length polypeptide constituting the ZSCAN9 fusion protein or the presence of the polypeptide constituting a part of the ZSCAN9 fusion protein as an index, and the presence of the ZSCAN9 fusion protein is present. It is not limited as far as it can be confirmed.

≪検出方法に用いる技法≫
以下、ＡＬＫ融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ）の検出、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、又はｃＤＮＡ）の検出、ＡＬＫ融合タンパク質の検出、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出の工程及び検出技法について、より詳細に説明するが、これらに制限されるものではない。
なお、被験者から得た試料から、遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）又は、タンパク質を抽出した場合、あるいは、組織切片、又は、細胞懸濁液等を作成した場合において、調製された試料においてＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子、あるいは、ＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出するために好適な技法は、当業者が適宜選択することができる。≪Technology used for detection method≫
The steps and techniques for detecting the ALK fusion gene (genomic DNA, mRNA, or cDNA), the ZSCAN9 fusion gene (genomic DNA, mRNA, or cDNA), the ALK fusion protein, and the ZSCAN9 fusion protein are described below. It will be described in more detail, but is not limited to these.
In addition, when a gene (genomic DNA or mRNA) or protein is extracted from a sample obtained from a subject, or when a tissue section, a cell suspension, or the like is prepared, ALK is used in the prepared sample. Suitable techniques for detecting the fusion gene or ZSCAN9 fusion gene, or ALK fusion protein or ZSCAN9 fusion protein can be appropriately selected by those skilled in the art.

＜融合遺伝子の検出＞
ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出は、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のゲノムＤＮＡの検出、当該ゲノムＤＮＡの転写産物であるｍＲＮＡの検出、又は、ｍＲＮＡを鋳型として得られるｃＤＮＡの検出のいずれであってもよい。
被験者から得た試料中の、ＡＬＫ融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）又はＺＳＣＡＮ融合遺伝子（ゲノムＤＮＡ、又は、ｍＲＮＡ）を検出する技法としては、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部にハイブリダイズするプローブ（核酸プローブ等）を使用したハイブリダイゼーション技術、あるいは、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部にアニールするプライマーを用いた遺伝子増幅技術等、遺伝子の検出に用いられる当業者に周知のいかなる技法、及び、これらの技法を応用した技法を用いることができる。
すなわち、ＰＣＲ、ＬＣＲ（Ligase chain reaction）、ＳＤＡ（Strand displacement amplification）、ＮＡＳＢＡ（Nucleic acid sequence-based amplification）、ＩＣＡＮ（Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids）、ＬＡＭＰ（Loop-mediated isothermal amplification）法、ＴＭＡ法（Gen-Probe’s TMA system）、インサイチュハイブリダイゼーション法、マイクロアレイ法、ノーザンハイブリダイゼーション、サザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＲＮＡプロテクション法、ＤＮＡシーケンス、ＲＮＡシーケンス等のいかなる技法を用いてもよい。<Detection of fusion gene>
The detection of the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene is either the detection of the genomic DNA of the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene, the detection of mRNA which is a transcript of the genomic DNA, or the detection of the cDNA obtained by using the mRNA as a template. There may be.
As a technique for detecting an ALK fusion gene (genomic DNA or mRNA) or a ZSCAN fusion gene (genomic DNA or mRNA) in a sample obtained from a subject, at least a part of the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene is used. For those skilled in the art used for gene detection, such as hybridization technology using a hybridizing probe (nucleic acid probe, etc.), or gene amplification technology using a primer that anneals to at least a part of an ALK fusion gene or ZSCAN9 fusion gene. Any well-known technique and techniques applying these techniques can be used.
That is, PCR, LCR (Ligase chain reaction), SDA (Strand displacement amplification), NASBA (Nucleic acid sequence-based amplification), ICAN (Isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids), LAMP (Loop-mediated isothermal amplification). Any technique such as method, TMA method (Gen-Probe's TMA system), in situ hybridization method, microarray method, Northern hybridization, Southern hybridization, dot blot method, RNA protection method, DNA sequence, RNA sequence, etc. may be used. ..

〔ゲノムＤＮＡの検出〕
ゲノムＤＮＡの検出には、インサイチュハイブリダイゼーション技術を好適に用いることができる。インサイチュハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、公知のＦＩＳＨ法に従って実施することができる。又は、クロモジェニックインサイチュハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）法とシルバーインサイチュハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）法を組み合わせたフュージョンアッセイ（fusion assay）で実施することができる。好適には、実施例４又は５に記載のＦＩＳＨ法スプリットアッセイ、又は、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイで検出することができる。[Detection of genomic DNA]
In situ hybridization techniques can be suitably used for the detection of genomic DNA. Detection using in situ hybridization techniques can be performed, for example, according to known FISH methods. Alternatively, it can be performed in a fusion assay that combines the chromogenic in situ hybridization (CISH) method and the silver in situ hybridization (SISH) method. Preferably, it can be detected by the FISH method split assay or the FISH method fusion assay according to Example 4 or 5.

あるいは、ゲノムＤＮＡの検出には、ＤＮＡシーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、従来のサンガー法に基づくシーケンサーを使用してもよいが、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい（例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照）。次世代シーケンサーとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑ/ＨｉＳｅｑ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ社のＳＯＬｉＤシステム、Ｒｏｃｈｅ社の４５４シーケンスシステム（ＧＳ ＦＬＸ＋／ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）等が例示できる。シーケンシングにおいては、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮（enrich）することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Ｒｏｃｈｅ社のＲｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ等が例示できる。
以下に、ゲノムＤＮＡの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。Alternatively, DNA sequencing techniques can be preferably used to detect genomic DNA. A sequencer based on the conventional Sanger method may be used for sequencing, but considering the efficiency of analysis, it is preferable to use a next-generation sequencer (for example, Metzker ML, Nat Rev Genet. 2010 Jan; 11). (1): See 31-46). Examples of the next-generation sequencer include Illumina's MiSeq / HiSeq, Life Technologies' SOLiD system, Roche's 454 sequencer system (GS FLX + / GS Junior), and the like. In sequencing, the efficiency of analysis can be improved by enriching the region where the fusion gene may be present by using sequence capture technology or the like. Examples of the sequence capture technique include Roche NimbleGen from Roche, Sure Select from Agilent Technologies, and the like.
Hereinafter, typical methods for detecting genomic DNA will be illustrated, but the method is not limited thereto.

〈ＦＩＳＨ法スプリットアッセイ〉
ＡＬＫ融合遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、後述の実施例６で詳細に説明するように、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合（野生型ＡＬＫ遺伝子の場合）には、２つの遺伝子領域（各遺伝子ごとの５’末端側領域と３’末端側領域）が近接しているため、２つのシグナルが重なった色（例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色）として検出されるのに対して、転座又は逆位等により２つの遺伝子領域が切断されている場合は、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が孤在性に検出される。従って、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＡＬＫ遺伝子３’末端側ゲノム領域とが染色体上で近接していないことを検出することにより、ＡＬＫ融合遺伝子の存在を検出している。<FISH split assay>
In the FISH split assay of the ALK fusion gene, as a detection probe, a polynucleotide covering the 5'terminal genomic region of the ALK gene and fluorescently labeled, as described in detail in Example 6 below, is used. , A polynucleotide that covers the 3'terminal genomic region of the gene and is labeled with another fluorescent dye is used in combination. In the normal case (in the case of the wild-type ALK gene), the two gene regions (5'terminal region and 3'terminal region for each gene) are close to each other, so that the colors in which the two signals overlap (the color of the two signals overlap) For example, when a red fluorescent dye and a green fluorescent dye are used, they are detected as yellow), whereas when two gene regions are cleaved due to translocation or inversion, two types of fluorescence are detected. Dye-derived signals (eg, red and green) are detected solitarily. Therefore, the FISH split assay detects the presence of the ALK fusion gene by detecting that the 5'terminal genomic region of the ALK gene and the 3'terminal genomic region of the ALK gene are not close on the chromosome. ing.

また、ＺＳＣＡＮ融合遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、検出用プローブとして、後述の実施例６で詳細に説明するように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用する。正常な場合（野生型ＺＳＣＡＮ９遺伝子の場合）には、２つの遺伝子領域（各遺伝子ごとの５’末端側領域と３’末端側領域）が近接しているため、２つのシグナルが重なった色（例えば、赤色蛍光色素と緑色蛍光色素を使用する場合には、黄色）として検出されるのに対して、転座又は逆位等により２つの遺伝子領域が切断されている場合は、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が孤在性に検出される。従って、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイでは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側ゲノム領域とが染色体上で近接していないことを検出することにより、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の存在を検出している。 Further, in the FISH method split assay of the ZSCAN fusion gene, as a detection probe, as described in detail in Example 6 described later, a polynucleotide covering the 5'terminal genomic region of the ZSCAN9 gene was fluorescently labeled. A combination of one and a polynucleotide covering the 3'terminal genomic region of the gene and labeled with another fluorescent dye is used. In the normal case (in the case of the wild-type ZSCAN9 gene), the two gene regions (5'terminal region and 3'terminal region for each gene) are close to each other, so that the colors in which the two signals overlap (the color of the two signals overlaps). For example, when a red fluorescent dye and a green fluorescent dye are used, they are detected as yellow), whereas when two gene regions are cleaved due to translocation or inversion, two types of fluorescence are detected. Dye-derived signals (eg, red and green) are detected solitarily. Therefore, in the FISH split assay, the presence of the ZSCAN9 fusion gene is detected by detecting that the 5'terminal genomic region of the ZSCAN9 gene and the 3'terminal genomic region of the ZSCAN9 gene are not close to each other on the chromosome. ing.

ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例６に示すように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせ、あるいは、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、同遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することにより、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。 When the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene is the ZSCAN9-ALK fusion gene, as a detection probe, as shown in Example 6 below, it is a polynucleotide that covers the 5'terminal genomic region of the ZSCAN9 gene and is fluorescent. A combination of the labeled gene and a polynucleotide that covers the 3'terminal genomic region of the gene and is labeled with another fluorescent dye, or a polynucleotide that covers the 5'terminal genomic region of the ALK gene. The ZSCAN9-ALK fusion gene is detected by using a combination of a fluorescently labeled gene and a polynucleotide covering the 3'terminal genomic region of the gene and labeled with another fluorescent dye. can do.

〈ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイ〉
ＡＬＫ融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは、例えば、ＡＬＫ融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例５で詳細に説明するように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合（野生型ＡＬＫ遺伝子の場合）には、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出されるのに対して、転座又は逆位等により２つの遺伝子領域が近接している場合は、２つのシグナルが重なった色（例えば、黄色）として検出される。<FISH fusion assay>
In the FISH fusion assay of an ALK fusion gene, for example, when the ALK fusion gene is a ZSCAN9-ALK fusion gene, the 5'terminal genome of the ZSCAN9 gene is used as a detection probe as described in detail in Example 5 below. A combination of a polynucleotide covering a region and fluorescently labeled and a polynucleotide covering the 3'terminal genomic region of the ALK gene and labeled with another fluorescent dye can be used. In the normal case (in the case of the wild-type ALK gene), signals derived from two types of fluorescent dyes (for example, red and green) are detected separately, whereas by translocation or inversion, etc. When two gene regions are in close proximity, the two signals are detected as overlapping colors (eg, yellow).

また、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは、例えば、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例５で詳細に説明するように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識したものと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素で標識したものとの組み合わせを使用することができる。正常な場合（野生型ＺＳＣＡＮ９遺伝子の場合）には、２種類の蛍光色素に由来するシグナル（例えば、赤色と緑色）が別々に離れて検出されるのに対して、転座又は逆位等により２つの遺伝子領域が近接している場合は、２つのシグナルが重なった色（例えば、黄色）として検出される。 Further, in the FISH method fusion assay of the ZSCAN9 fusion gene, for example, when the ZSCAN9 fusion gene is the ZSCAN9-ALK fusion gene, the 5'end of the ZSCAN9 gene is used as a detection probe as described in detail in Example 5 below. A combination of a polynucleotide covering the lateral genomic region and fluorescently labeled and a polynucleotide covering the 3'terminal genomic region of the ALK gene and labeled with another fluorescent dye can be used. it can. In the normal case (in the case of the wild-type ZSCAN9 gene), signals derived from two types of fluorescent dyes (for example, red and green) are detected separately, whereas by translocation or inversion, etc. When two gene regions are in close proximity, the two signals are detected as overlapping colors (eg, yellow).

〈ＦＩＳＨ法スプリットアッセイとフュージョンアッセイの組み合わせ〉
上記、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイは、同一の病理切片に対して同時におこなうこともできる。
例えば、ＡＬＫ融合遺伝子またはＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、検出用プローブとして、後述の実施例７で詳細に説明するように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって蛍光標識（例えば青色）したものと、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって別の蛍光色素（例えば赤色）で標識したものと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであってさらに別の蛍光色素（例えば緑色）で標識したものと、の組み合わせを使用することができる。すなわち、異なる３色の蛍光色素（例えば、青色、赤色、緑色）でそれぞれのプローブを標識して用いる。<Combination of FISH split assay and fusion assay>
The FISH fusion assay and split assay described above can also be performed simultaneously on the same pathological section.
For example, when the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene is the ZSCAN9-ALK fusion gene, as a detection probe, a poly covering the 5'terminal genomic region of the ZSCAN9 gene, as described in detail in Example 7 below. A nucleotide that is fluorescently labeled (for example, blue), a polynucleotide that covers the 5'terminal genomic region of the ALK gene and is labeled with another fluorescent dye (for example, red), and a 3'of the ALK gene. A combination of a polynucleotide covering the terminal genomic region and labeled with yet another fluorescent dye (eg, green) can be used. That is, each probe is labeled and used with three different colors of fluorescent dyes (for example, blue, red, and green).

正常な場合（野生型ＡＬＫ遺伝子の場合）には、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域が連続（近接）しているため、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域と３’末端側ゲノム領域を標識したそれぞれ異なる蛍光標識の蛍光が重なったシグナル（例えば、赤色と緑色が重なった黄色）が検出され、かつ、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素のシグナル（例えば青色）が、孤在性に検出される。 In the normal case (in the case of the wild-type ALK gene), the 5'terminal genomic region of the ALK gene and the 3'terminal genomic region of the ALK gene are continuous (close), so that the 5'terminal side of the ALK gene A signal in which the fluorescence of different fluorescent labels that labeled the genomic region and the 3'terminal genomic region overlapped (for example, yellow in which red and green overlapped) was detected, and the 5'terminal genomic region of the ZSCAN9 gene was labeled. The signal of the fluorescent dye (for example, blue) is detected solitarily.

一方、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子が構成されている場合、遺伝子転座、欠失又は逆位等により、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域が、本来の位置から失われ、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域が連続（挿入塩基を間に含んで連続する場合もある）して、融合点を形成することになる。このため、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素の蛍光とＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素の蛍光とが重なったシグナル（例えば、青色と緑色が重なった青緑色）のみが、当該融合遺伝子構成部位において検出され、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素のシグナル（例えば赤色）は、当該融合遺伝子構成部位においては検出されなくなる。 On the other hand, when the ZSCAN9-ALK fusion gene is constructed, the 5'terminal genomic region of the ALK gene is lost from its original position due to gene translocation, deletion, inversion, etc., and the 5'end of the ZSCAN9 gene is lost. The lateral genomic region and the 3'terminal genomic region of the ALK gene are continuous (may be continuous with an inserted base in between) to form a fusion point. Therefore, a signal (for example, blue and green overlapped) in which the fluorescence of the fluorescent dye labeled on the 5'terminal genomic region of the ZSCAN9 gene and the fluorescence of the fluorescent dye labeled on the 3'terminal genomic region of the ALK gene overlapped. Only bluish green) is detected at the fusion gene component, and the fluorescent dye signal (eg, red) that labels the 5'terminal genomic region of the ALK gene is not detected at the fusion gene component.

なお、このとき、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域を標識した蛍光色素のシグナル（例えば赤色）は、孤在性に検出されるか、または、どこにも検出されないことになる。
フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイを同一の病理切片に対して同時におこなう本ＦＩＳＨアッセイは、両手法の結果を一つの病理切片上で得られるため、効率性、および、判定の信頼性向上の観点から好適である。At this time, the signal of the fluorescent dye (for example, red) labeled the 5'terminal genomic region of the ALK gene is detected lonely or not detected anywhere.
This FISH assay, in which the fusion assay and the split assay are performed simultaneously on the same pathological section, is suitable from the viewpoint of improving efficiency and reliability of determination because the results of both methods can be obtained on one pathological section. is there.

一方、異なる蛍光色素で標識された２つのプローブを用い、前述の〈ＦＩＳＨ法スプリットアッセイ〉と〈ＦＩＳＨフュージョンアッセイ〉によって、融合遺伝子を構築する２つの遺伝子の切断と融合をそれぞれ検出する場合、複数の病理切片が必要になる。
特に、融合遺伝子を構成する遺伝子同士が染色体上の近い距離に位置する場合、フュージョンアッセイだけを行った場合では、遺伝子転座又は逆位等が起きていないにも関わらず、融合遺伝子を構成する一つの遺伝子の５’末端側領域と、融合遺伝子を構成する他の遺伝子の３’末端側領域が近い場合に、見る角度等によっては、近接したシグナル（例えば青緑色）が観察され、偽陽性の判定が生じる恐れがある。その際、融合遺伝子を構成する他の遺伝子の５’末端側のシグナル（例えば赤色）が、融合遺伝子構成部位に、近接して検出されないことを確認することにより、偽陽性の判定を回避することができるため、好ましい。On the other hand, when using two probes labeled with different fluorescent dyes and detecting cleavage and fusion of the two genes that construct the fusion gene by the above-mentioned <FISH method split assay> and <FISH fusion assay>, a plurality of probes are used. Pathological section is required.
In particular, when the genes constituting the fusion gene are located close to each other on the chromosome, and when only the fusion assay is performed, the fusion gene is composed even though no gene translocation or inversion has occurred. When the 5'terminal region of one gene and the 3'terminal region of another gene constituting the fusion gene are close to each other, a close signal (for example, blue-green) is observed depending on the viewing angle, etc., and false positives are observed. There is a risk that the judgment will occur. At that time, false positive determination should be avoided by confirming that the signal (for example, red) on the 5'end side of the other genes constituting the fusion gene is not detected in close proximity to the fusion gene constituent site. It is preferable because it can be used.

なお、融合遺伝子が構成された時に孤在性を示すシグナル（例えば赤色）のプローブは、例えば、融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ遺伝子の場合、ＡＬＫ遺伝子の５’末端領域に限らず、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域と、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域との間のゲノム領域内にハイブリダイズするよう設計すれば、同様の効果を得ることができる。 The probe of the signal (for example, red) showing loneliness when the fusion gene is constructed is not limited to the 5'terminal region of the ALK gene when the fusion gene is the ZSCAN9-ALK gene, for example, 5 of the ZSCAN9 gene. Similar effects can be obtained by designing to hybridize within the genomic region between the'terminal genomic region and the 3'terminal genomic region of the ALK gene.

また、例えばＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、それぞれの構成遺伝子の５’末端側ゲノム領域および３’末端側ゲノム領域をカバーするポリヌクレオチドであって、すべて異なる蛍光色素で標識された４種のプローブを同時に用いれば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子それぞれの切断、および、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域とＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域との融合を一つの病理切片上で検出することができる。 Further, for example, in the case of the ZSCAN9-ALK fusion gene, it is a polynucleotide that covers the 5'terminal genomic region and the 3'terminal genomic region of each constituent gene, and all four probes labeled with different fluorescent dyes. Can be used simultaneously to detect cleavage of each of the ZSCAN9 gene and the ALK gene, and fusion of the 5'terminal genomic region of the ZSCAN9 gene and the 3'terminal genomic region of the ALK gene on a single pathological section. ..

〈検出に用いるプローブ（ゲノム用）〉
ＡＬＫ融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＡＬＫ融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。<Probe used for detection (for genome)>
The probe used for hybridization for detecting the ALK fusion gene is hybridized under stringent conditions (preferably under more stringent conditions) to at least some nucleotides of the ALK fusion gene or their complementary strands. Probes that hybridize are preferred.

例えば、融合点を含むＡＬＫ融合遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する場合、ＡＬＫ融合遺伝子の融合点をはさんでその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる、連続した少なくとも３２塩基の核酸分子（具体的には、配列番号１で表される塩基配列の第９９４番〜第１０２５番）、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いてもよい。 For example, when detecting the genomic DNA of an ALK fusion gene containing a fusion point, a continuous at least 32 base nucleic acid molecule (specifically, consisting of 16 bases upstream and downstream of the fusion point of the ALK fusion gene). 994 to 1025) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1), or a probe containing a complementary strand thereof may be used.

ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出するための、ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。 The probe used for hybridization for detecting the ZSCAN9 fusion gene is hybridized under stringent conditions (preferably under more stringent conditions) to at least some nucleotides of the ZSCAN9 fusion gene or their complementary strands. Probes that hybridize are preferred.

例えば、融合点を含むＺＳＣＡＮ９融合遺伝子のゲノムＤＮＡを検出する場合、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の融合点をはさんでその上流及び下流のそれぞれ１６塩基からなる、連続した少なくとも３２塩基の核酸分子（具体的には、配列番号１で表される塩基配列の第９９４番〜第１０２５番）、又はそれらの相補鎖を含むプローブを用いてもよい。 For example, when detecting the genomic DNA of a ZSCAN9 fusion gene containing a fusion point, a continuous at least 32 base nucleic acid molecule (specifically, consisting of 16 bases upstream and downstream of the fusion point of the ZSCAN9 fusion gene). 994 to 1025) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1), or a probe containing a complementary strand thereof may be used.

例えば、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイに用いることのできるプローブとしては、ＺＳＣＡＮ９遺伝子又はＡＬＫ遺伝子のいずれか一方の遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、残る一方の遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ（好ましくは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ）を用いることができ、より具体的には、後述の実施例５で使用したＢＡＣクローンの各組み合わせを挙げることができる。 For example, when the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene is the ZSCAN9-ALK fusion gene, the probe that can be used in the FISH method fusion assay is the 5'terminal genomic region of either the ZSCAN9 gene or the ALK gene. A combination of a first probe capable of specifically recognizing the 3'terminal genomic region of one of the remaining genes and a second probe capable of specifically recognizing the 3'terminal genomic region of the remaining gene (preferably, the 5'terminal genomic region of the ZSCAN9 gene. A combination of a first probe capable of specifically recognizing and a second probe capable of specifically recognizing the 3'terminal genomic region of the ALK gene) can be used, and more specifically, Examples described later. Each combination of BAC clones used in 5 can be mentioned.

一方、例えば、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、ＦＩＳＨ法スプリットアッセイに用いることのできるプローブとしては、ＡＬＫ遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ、あるいは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ（好ましくは、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとの組み合わせ）を用いることができ、より具体的には、後述の実施例６で使用したＢＡＣクローンの各組み合わせを挙げることができる。 On the other hand, for example, when the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene is the ZSCAN9-ALK fusion gene, the probe that can be used in the FISH method split assay is a first probe capable of specifically recognizing the ALK gene 5'terminal genomic region. The combination of the probe and the second probe capable of specifically recognizing the 3'terminal genomic region of the ALK gene, or the first probe capable of specifically recognizing the ZSCAN9 gene 5'terminal genomic region and ZSCAN9. Combination with a second probe capable of specifically recognizing the gene 3'terminal genomic region (preferably, a first probe capable of specifically recognizing the 5'terminal genomic region of the ALK gene and 3'of the ALK gene A combination with a second probe capable of specifically recognizing the terminal genomic region) can be used, and more specifically, each combination of BAC clones used in Example 6 described later can be mentioned.

〔ｍＲＮＡの検出〕
ｍＲＮＡの検出は、ノーザンハイブリダイゼーション法等によりｍＲＮＡ自体を解析することにより行っても、又は、当業者に周知の方法によりｍＲＮＡを鋳型として合成した、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を解析することにより行ってもよい。
上記ＲＮＡの検出には、シーケンス技術を好適に用いることができる。シーケンシングには、解析の効率を考慮すると、次世代シーケンサーを使用することが好ましい（例えば、Metzker ML、Nat Rev Genet. 2010 Jan;11(1):31-46参照）。次世代シーケンサーとしては、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＭｉＳｅｑ/ＨｉＳｅｑ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｇｉｅｓ社のＳＯＬｉＤシステム、Ｒｏｃｈｅ社の４５４シーケンスシステム（ＧＳ ＦＬＸ＋／ＧＳ Ｊｕｎｉｏｒ）等が例示できる。シーケンシングにおいては、後述の遺伝子増幅反応方法、シーケンスキャプチャ技術等を用いて、融合遺伝子が存在している可能性がある領域を濃縮（enrich）することで、解析の効率を向上させることができる。シーケンスキャプチャ技術としては、Ｒｏｃｈｅ社のＲｏｃｈｅ ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＳｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ等が例示できる。[Detection of mRNA]
The detection of mRNA is carried out by analyzing the mRNA itself by a Northern hybridization method or the like, or by analyzing complementary DNA (cDNA) synthesized by using mRNA as a template by a method well known to those skilled in the art. You may.
A sequencing technique can be preferably used to detect the RNA. Considering the efficiency of analysis, it is preferable to use a next-generation sequencer for sequencing (see, for example, Metzker ML, Nat Rev Genet. 2010 Jan; 11 (1): 31-46). Examples of the next-generation sequencer include Illumina's MiSeq / HiSeq, Life Technologies' SOLiD system, Roche's 454 sequencer system (GS FLX + / GS Junior), and the like. In sequencing, the efficiency of analysis can be improved by enriching the region where the fusion gene may be present by using the gene amplification reaction method, sequence capture technology, etc. described later. .. Examples of the sequence capture technique include Roche NimbleGen from Roche, Sure Select from Agilent Technologies, and the like.

〈遺伝子増幅反応方法による検出〉
ｍＲＮＡは、検出対象であるＡＬＫ融合遺伝子又はＡＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したプライマーを用いた、遺伝子増幅反応方法にて検出することができる。以下に、ｍＲＮＡの検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。<Detection by gene amplification reaction method>
The mRNA can be detected by a gene amplification reaction method using a primer designed to specifically amplify at least a part of the polynucleotide of the ALK fusion gene or the ASCAN9 fusion gene to be detected. The following exemplifies typical methods for detecting mRNA, but are not limited thereto.

==ＰＣＲ法==
例えば、ＰＣＲ法では、ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイド染色等によって目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを確認できる。目的とするサイズの増幅断片が得られた場合は、被験者から得た試料において、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が存在していたことになる。このように、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。
本発明のＡＬＫ融合遺伝子の検出方法としては、被験者から得た試料中の、特定のポリヌクレオチドを遺伝子増幅反応により増幅する工程に加え、更に目的とするサイズの増幅断片が得られたか否かを検出する工程を含むことが好ましい。== PCR method ==
For example, in the PCR method, the PCR product can be analyzed by agarose gel electrophoresis, and it can be confirmed whether or not an amplified fragment of a desired size has been obtained by ethidium bromide staining or the like. When an amplified fragment of the desired size is obtained, it means that the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene was present in the sample obtained from the subject. In this way, the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene can be detected.
As a method for detecting an ALK fusion gene of the present invention, in addition to the step of amplifying a specific polynucleotide in a sample obtained from a subject by a gene amplification reaction, whether or not an amplified fragment of a desired size is obtained is further determined. It is preferable to include a step of detecting.

ＰＣＲ法は、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を定量的に検出することに適している。
従って、前述の<ＡＬＫ融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）>に記載のように、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってＡＬＫ融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、ＡＬＫ遺伝子と共にＡＬＫ融合遺伝子を構築しているＡＬＫ遺伝子以外の他の遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、ＡＬＫ融合遺伝子を検出することができる。
また、前述の<ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する態様（１−ｂ）>に記載のように、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによってＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する方法に好適に用いることができる。あるいは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共にＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構築しているＺＳＣＡＮ９遺伝子以外の他の遺伝子の５’末端側領域と３’末端側領域の発現量をそれぞれ特異的に検出し、その発現量の比を求めることによって、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出することができる。The PCR method is suitable for quantitatively detecting the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene.
Therefore, as described in the above-mentioned <Aspect for detecting ALK fusion gene (1-b)>, the expression levels of the 5'-terminal region and the 3'-terminal region of the ALK gene are specifically detected, respectively. It can be suitably used for a method of detecting an ALK fusion gene by determining the expression level ratio. Alternatively, the expression levels of the 5'terminal region and the 3'terminal region of genes other than the ALK gene that constructs the ALK fusion gene together with the ALK gene are specifically detected, and the ratio of the expression levels is determined. Thereby, the ALK fusion gene can be detected.
Further, as described in the above-mentioned <Aspect (1-b) for detecting the ZSCAN9 fusion gene>, the expression levels of the 5'terminal region and the 3'terminal region of the ZSCAN9 gene are specifically detected and the expression levels thereof are detected. It can be suitably used for a method of detecting a ZSCAN9 fusion gene by determining the expression level ratio. Alternatively, the expression levels of the 5'terminal region and the 3'terminal region of genes other than the ZSCAN9 gene that constructs the ZSCAN9 fusion gene together with the ZSCAN9 gene are specifically detected, and the ratio of the expression levels is determined. Thereby, the ZSCAN9 fusion gene can be detected.

なお、ＰＣＲ法、及び、これに用いるプライマー設計法は、公知の方法に従って当業者が行うことができる。
例えば、ＡＬＫ遺伝子の５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、ＡＬＫ遺伝子の３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。
例えば、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを用いることができる。A person skilled in the art can carry out the PCR method and the primer design method used for this method according to a known method.
For example, a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify the 5'terminal region of the ALK gene, and a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify the 3'terminal region of the ALK gene. Antisense primers can be used.
For example, a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify the 5'terminal region of the ZSCAN9 gene, and a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify the 3'terminal region of the ZSCAN9 gene. Antisense primers can be used.

==リアルタイムＰＣＲ法==
更には、ＰＣＲ法においては、遺伝子の増幅過程においてＰＣＲ増幅モニター（リアルタイムＰＣＲ）法（Genome Res., 6(10), 986, 1996）を用いることにより、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出において、より定量的な解析を行うことが可能である。ＰＣＲ増幅モニター法としては、例えば、ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７９００（ＰＥバイオシステムズ社）を用いることが出来る。リアルタイムＰＣＲは公知の方法であり、そのための装置及びキットは市販されており、これらを利用して簡便に行える。== Real-time PCR method ==
Furthermore, in the PCR method, the PCR amplification monitor (real-time PCR) method (Genome Res., 6 (10), 986, 1996) is used in the gene amplification process to detect the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene. , It is possible to perform a more quantitative analysis. As the PCR amplification monitoring method, for example, ABI PRISM7900 (PE Biosystems) can be used. Real-time PCR is a known method, and devices and kits for that purpose are commercially available and can be easily performed using these.

より具体的には、例えばＡＬＫ融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子であって、ｍＲＮＡを指標にしてＡＬＫ融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー（５’−プライマー）を、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）を、ＡＬＫ遺伝子由来の任意の部分から設計する。
また、例えばＺＳＣＡＮ９融合遺伝子がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子であって、ｍＲＮＡを指標にしてＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出する場合、センスプライマー（５’−プライマー）を、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来の任意の部分から、アンチセンスプライマー（３’−プライマー）を、ＡＬＫ遺伝子由来の任意の部分から設計する。More specifically, for example, when the ALK fusion gene is a ZSCAN9-ALK fusion gene and the ALK fusion gene is detected using mRNA as an index, the sense primer (5'-primer) is used as an arbitrary portion derived from the ZSCAN9 gene. To design an antisense primer (3'-primer) from any part derived from the ALK gene.
Further, for example, when the ZSCAN9 fusion gene is a ZSCAN9-ALK fusion gene and the ZSCAN9 fusion gene is detected using mRNA as an index, an antisense primer (5'-primer) is used from an arbitrary portion derived from the ZSCAN9 gene. The primer (3'-primer) is designed from any part derived from the ALK gene.

==マルチプレックスＰＣＲ==
ＡＬＫ融合遺伝子を検出するためのＰＣＲ法では、ＡＬＫ遺伝子と融合してＡＬＫ融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出するためのＰＣＲ法では、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と融合してＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を構成する他の各遺伝子、及び、複数の融合点に対応した上記センスプライマーを混ぜることにより、１反応液により全ての融合ポリヌクレオチドを検出するマルチプレックスＰＣＲ（Multiplex PCR）を設計することもできる。== Multiplex PCR ==
In the PCR method for detecting the ALK fusion gene, each of the other genes fused with the ALK gene to form the ALK fusion gene and the above-mentioned sense primers corresponding to a plurality of fusion points are mixed with one reaction solution. Multiplex PCR can also be designed to detect all fused polynucleotides.
In the PCR method for detecting the ZSCAN9 fusion gene, each of the other genes fused with the ZSCAN9 gene to form the ZSCAN9 fusion gene and the above-mentioned sense primers corresponding to a plurality of fusion points are mixed with one reaction solution. Multiplex PCR can also be designed to detect all fused polynucleotides.

==質量分析による検出==
上記遺伝子増幅反応方法を用いた検出方法において、増幅断片の解析のために、特開2012-100628記載の質量分析法を用いることができる。== Detection by mass spectrometry ==
In the detection method using the above gene amplification reaction method, the mass spectrometry method described in JP2012-100628 can be used for the analysis of the amplified fragment.

==検出に用いるプライマーセット==
本発明のＡＬＫ融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるＡＬＫ融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＡＬＫ融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
本発明のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出するための検出方法に用いられるプライマーセットは、検出対象であるＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出できるものであれば、特には限定されず、当業者が、検出対象ポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。
ＰＣＲ増幅モニター法におけるプライマー設計は、プライマー設計ソフトウェア（例えば、Primer Express; PE Biosystems）などを利用してできる。また、ＰＣＲ産物のサイズが大きくなると増幅効率が悪くなるため、センスプライマーとアンチセンスプライマーは、ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡを対象に増幅したときの増幅産物の大きさが１ｋｂ以下になるように設定するのが適切である。== Primer set used for detection ==
The primer set used in the detection method for detecting the ALK fusion gene of the present invention is particularly capable of specifically amplifying at least a part of the ALK fusion gene to be detected and detecting the ALK fusion gene. Can be designed by those skilled in the art based on the base sequence of the polynucleotide to be detected.
The primer set used in the detection method for detecting the ZSCAN9 fusion gene of the present invention is particularly capable of specifically amplifying at least a part of the ZSCAN9 fusion gene to be detected and detecting the ZSCAN9 fusion gene. Can be designed by those skilled in the art based on the base sequence of the polynucleotide to be detected.
Primer design in the PCR amplification monitoring method can be performed by using primer design software (for example, Primer Express; PE Biosystems). In addition, as the size of the PCR product increases, the amplification efficiency deteriorates. Therefore, the sense primer and antisense primer should be set so that the size of the amplification product when amplified on mRNA or cDNA is 1 kb or less. Appropriate.

〈ハイブリダイゼーション法による検出〉
ｍＲＮＡは、検出対象であるＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブを用いた、ハイブリダイゼーション法にて検出することができる。
ハイブリダイゼーション技術を利用した検出は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ドットブロット法、ＤＮＡマイクロアレイ法、ＲＮＡプロテクション法などが挙げられる。<Detection by hybridization method>
mRNA can be detected by a hybridization method using a probe that hybridizes to at least a part of the polynucleotide of the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene to be detected.
Detection using the hybridization technique includes, for example, Northern hybridization, dot blotting, DNA microarray method, RNA protection method and the like.

==プローブ（ｍＲＮＡ用）==
ハイブリダイゼーションに用いるプローブとしては、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝の少なくとも一部又はそれらの相補鎖にストリンジェントな条件下で（好ましくはよりストリンジェントな条件下で）ハイブリダイズするプローブが好ましい。== Probe (for mRNA) ==
As the probe used for hybridization, a probe that hybridizes to at least a part of the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion inheritance or its complementary strand under stringent conditions (preferably under more stringent conditions) is preferable.

＜融合タンパク質の検出＞
被験者から得た試料中の、ＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を検出する技法としては、タンパク質を解析するために用いられる当業者に周知いかなる技法、又は、これらの技法を応用したいかなる技法を用いてもよい。<Detection of fusion protein>
As a technique for detecting the ALK fusion protein or the ZSCAN9 fusion protein in the sample obtained from the subject, any technique well known to those skilled in the art used for analyzing the protein, or any technique applying these techniques is used. May be good.

例えば、ＡＬＫ融合タンパク質の検出に用いる方法としては、ＡＬＫタンパク質、又は、ＡＬＫタンパク質と共にＡＬＫ融合タンパク質を構築するＡＬＫタンパク質以外の他のタンパク質を特異的に認識する抗体、あるいは、ＡＬＫ融合タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法（イムノアッセイ法）、酵素活性測定法（ＥＬＩＳＡ法）、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫沈降法、ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法、ＦＲＥＴ法を例示することができる。あるいは、これらと組み合わせて、又は単独で、質量分析法、アミノ酸シーケンス法を用いることができる。 For example, as a method used for detecting an ALK fusion protein, an ALK protein, an antibody that specifically recognizes an antibody other than the ALK protein that constructs the ALK fusion protein together with the ALK protein, or an ALK fusion protein is specifically used. Immunoassay method (immunoassay method), enzyme activity measurement method (ELISA method), 2-antibody sandwich ELISA method, radioimmunoassay method, radioimmunoassay method, western blotting method, immunohistochemistry method , Immunoprecipitation method, iAEP (intercalated antibody-enhanced protein) method, FRET method can be exemplified. Alternatively, mass spectrometry and amino acid sequencing can be used in combination with or alone.

例えば、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出に用いる方法としては、ＺＳＣＡＮ９タンパク質、又は、ＺＳＣＡＮ９タンパク質と共にＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構築するＺＳＣＡＮ９タンパク質以外の他のタンパク質を特異的に認識する抗体、あるいは、ＺＳＣＡＮ９融合タンパクを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的測定法（イムノアッセイ法）、酵素活性測定法（ＥＬＩＳＡ法）、２抗体サンドイッチＥＬＩＳＡ法、蛍光免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロッティング法、免疫組織化学法、免疫沈降法、ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法、ＦＲＥＴ法を例示することができる。あるいは、これらと組み合わせて、又は単独で、質量分析法、アミノ酸シーケンス法を用いることができる。
以下に、タンパク質の検出のための代表的な方法を例示するが、これらに限定されるものではない。For example, as a method used for detecting a ZSCAN9 fusion protein, an antibody that specifically recognizes a ZSCAN9 protein, an antibody that specifically recognizes a protein other than the ZSCAN9 protein that constructs the ZSCAN9 fusion protein together with the ZSCAN9 protein, or a ZSCAN9 fusion protein is specific. Immunoassay method (immunoassay method), enzyme activity measurement method (ELISA method), 2-antibody sandwich ELISA method, fluorescence immunomeasurement method, radioimmunity measurement method, western blotting method, immunohistochemistry method , Immunoprecipitation method, iAEP (intercalated antibody-enhanced protein) method, FRET method can be exemplified. Alternatively, mass spectrometry and amino acid sequencing can be used in combination with or alone.
The following exemplifies typical methods for detecting proteins, but the present invention is not limited thereto.

〔検出に用いる代表的な手法〕
抗体を用いる検出方法としては、上記公知の方法によればよいが、例えば以下の方法を用いることができる。[Typical method used for detection]
As the detection method using an antibody, the above-mentioned known method may be used, and for example, the following method can be used.

〈免疫組織化学法〉
例えば、検出対象のＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある組織切片に対し、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＡＬＫ抗体及びＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＺＳＣＡＮ９抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、ＡＬＫタンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接せずに局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、それらの抗体が近接せずに局在していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いた免疫染色を行い、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。<Immunohistochemistry>
For example, when the ALK fusion protein or ZSCAN9 fusion protein to be detected is a ZSCAN9-ALK fusion protein, the poly of the C-terminal region of the ALK protein is obtained with respect to a tissue section in which the fusion protein to be detected may be present. Immunostaining is performed using an anti-ALK antibody that binds to a peptide and an anti-ZSCAN9 antibody that binds to a polypeptide in the N-terminal region of the ZSCAN9 protein, and the fusion protein to be detected is used as an index based on the proximity of these antibodies. It is also possible to detect the presence of. In addition, immunostaining was performed using an antibody that specifically binds to the polypeptide in the N-terminal region of the ALK protein and an antibody that specifically binds to the polypeptide in the C-terminal region of the ALK protein, and these antibodies were obtained. It is also possible to detect the presence of the fusion protein to be detected by using the fact that it is localized without being close to each other as an index. In addition, immunostaining was performed using an antibody that specifically binds to the polypeptide in the N-terminal region of the ZSCAN9 protein and an antibody that specifically binds to the polypeptide in the C-terminal region of the ZSCAN9 protein, and these antibodies were obtained. It is also possible to detect the presence of the fusion protein to be detected by using the fact that it is localized without being close to each other as an index. It is also possible to detect the presence of the fusion protein to be detected by performing immunostaining using an antibody that specifically binds to the polypeptide containing the fusion point.

〈ウェスタンブロッティング法〉
例えば、検出対象のＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質がＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液を、当業者に周知の方法により電気泳動して細胞抽出液中のタンパク質を分離した後、メンブレンにブロッティングする。
そして、タンパク質がブロッティングされたメンブレンに対し、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＡＬＫ抗体及びＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域に結合する抗ＺＳＣＡＮ９抗体を用いた免疫染色を行い、メンブレン上の所望の位置に、抗ＡＬＫ抗体と抗ＺＳＣＡＮ９抗体が結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
また、融合点を含むポリペプチドに特異的に結合する抗体を用い、当該抗体がメンブレン上の所望の位置に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。
あるいは、抗ＡＬＫ抗体を用い、当該抗体が、メンブレン上のＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質に結合していることを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。この際、メンブレン上で野生型ＡＬＫタンパク質が予測される位置とは異なる位置に抗ＡＬＫ抗体が結合することを指標に、検出対象の融合タンパク質の存在を検出してもよい。
抗ＺＳＣＡＮ９抗体を用い、抗ＡＬＫ抗体を用いた場合と同じ原理で、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質を検出してもよい。<Western blotting method>
For example, when the ALK fusion protein to be detected or the ZSCAN9 fusion protein is a ZSCAN9-ALK fusion protein, a cell extract in which the fusion protein to be detected may be present is electrophoresed by a method well known to those skilled in the art. After separating the protein in the cell extract, it is blotted on the membrane.
Then, the membrane on which the protein is blotted is immunostained with an anti-ALK antibody that binds to the polypeptide in the C-terminal region of the ALK protein and an anti-ZSCAN9 antibody that binds to the N-terminal region of the ZSCAN9 protein. The presence of the fusion protein to be detected can also be detected by using the fact that the anti-ALK antibody and the anti-ZSCAN9 antibody are bound to the above desired position as an index.
It is also possible to detect the presence of the fusion protein to be detected by using an antibody that specifically binds to the polypeptide containing the fusion point and using the fact that the antibody is bound to a desired position on the membrane as an index. ..
Alternatively, an anti-ALK antibody can be used to detect the presence of the fusion protein to be detected by using the fact that the antibody is bound to the ZSCAN9-ALK fusion protein on the membrane as an index. At this time, the presence of the fusion protein to be detected may be detected by using the binding of the anti-ALK antibody to a position different from the position where the wild-type ALK protein is predicted on the membrane as an index.
The ZSCAN9-ALK fusion protein may be detected using the anti-ZSCAN9 antibody on the same principle as when the anti-ALK antibody is used.

〈免疫沈降法〉
例えば、検出対象のＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質の場合、検出対象の融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＡＬＫ抗体又はＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＺＳＣＡＮ９抗体のいずれか一方の抗体で免疫沈降を行い、その沈降物に対して残るもう一方の抗体で検出することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。上記の通り、免疫沈降と検出をした後、更には、検出抗体により、検出したポリペプチドが目的の検出対象ポリペプチドの大きさであることを確認することが好ましい。
あるいは、検出対象のＡＬＫ融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＡＬＫ抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型ＡＬＫと異なる質量の抗ＡＬＫ抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。検出対象のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が存在している可能性のある細胞抽出液に対し、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに結合する抗ＺＳＣＡＮ９抗体で免疫沈降を行い、さらにその沈降物の質量分析を行うことにより、野生型ＺＳＣＡＮ９と異なる質量の抗ＺＳＣＡＮ９抗体と結合するタンパク質の存在を確認することで、検出対象の融合タンパク質の存在を検出することもできる。<Immunoprecipitation method>
For example, when the ALK fusion protein or ZSCAN9 fusion protein to be detected is a ZSCAN9-ALK fusion protein, the C-terminal region of the ALK protein is located in the cell extract in which the fusion protein to be detected may be present. Immunoprecipitation is performed with either an anti-ALK antibody that binds to a polypeptide or an anti-ZSCAN9 antibody that binds to a polypeptide in the N-terminal region of the ZSCAN9 protein, and the other antibody that remains against the precipitate is used for detection. By doing so, the presence of the fusion protein to be detected can also be detected. As described above, after immunoprecipitation and detection, it is preferable to further confirm with the detection antibody that the detected polypeptide is the size of the target polypeptide to be detected.
Alternatively, immunoprecipitation is performed on a cell extract in which the ALK fusion protein to be detected may be present with an anti-ALK antibody that binds to a polypeptide in the C-terminal region of the ALK protein, and the precipitate is further precipitated. By performing mass spectrometry, the presence of a fusion protein to be detected can be detected by confirming the presence of a protein that binds to an anti-ALK antibody having a mass different from that of wild-type ALK. A cell extract in which the ZSCAN9 fusion protein to be detected may be present is immunoprecipitated with an anti-ZSCAN9 antibody that binds to a polypeptide in the N-terminal region of the ZSCAN9 protein, and then mass spectrometry of the sediment is performed. By confirming the presence of a protein that binds to an anti-ZSCAN9 antibody having a mass different from that of the wild type ZSCAN9, the presence of the fusion protein to be detected can also be detected.

〔検出に用いる抗体〕
なお、本発明に係る検出方法に用いる抗体は、ＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の所望の部位に特異的に結合する範囲で特に制限されず、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を組みあわせて用いることもできる。前記抗体としては、免疫グロブリンそれ自体であっても、抗原結合能を保持した抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、又はＦｖでもよい。また、抗体の結合を検出するため、当業者に周知のいかなる標識やシグナル増幅法が用いられてもよい。[Antibody used for detection]
The antibody used in the detection method according to the present invention is not particularly limited as long as it specifically binds to a desired site of the ALK fusion protein or the ZSCAN9 fusion protein, and may be a monoclonal antibody or a polyclonal antibody. , Monoclonal antibody and polyclonal antibody can also be used in combination. The antibody may be an immunoglobulin itself or an antibody fragment having an antigen-binding ability, for example, Fab, Fab', F (ab') 2 , or Fv. In addition, any labeling or signal amplification method well known to those skilled in the art may be used to detect antibody binding.

＜標識手法＞
上記遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ等）及びタンパク質の検出方法において、プローブ、増幅産物、抗体等の標識は公知の技術を用いればよい。例えば、蛍光標識、放射性標識、酵素標識等を挙げることができる。
プローブを用いた検出方法において、プローブを標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよく、例えば、ＢＡＣクローンから、標識された核酸プローブを作製する場合、ニックトランスレーション、ランダムプライム法等の公知手法を用いることができる。またその際、ビオチン−ｄＵＴＰ（例えば、Roche Applied Science社製）を用いてプローブをビオチン標識し、アビジンと結合させた、蛍光体、放射性同位体、酵素等、をさらに処理することでプローブを標識することができる。
抗体を用いた検出方法において、抗体を標識する場合、その標識方法は上記のとおり、公知の方法によればよいが、例えば、下記の標識方法が挙げられる。<Signing method>
In the method for detecting genes (genomic DNA, mRNA, cDNA, etc.) and proteins, known techniques may be used for labeling probes, amplification products, antibodies, and the like. For example, fluorescent labeling, radioactive labeling, enzyme labeling and the like can be mentioned.
In the detection method using a probe, when labeling the probe, the labeling method may be a known method as described above. For example, when producing a labeled nucleic acid probe from a BAC clone, nick translation, A known method such as a random prime method can be used. At that time, the probe is labeled with biotin using biotin-dUTP (for example, manufactured by Roche Applied Science), and the probe is labeled by further treating a fluorescent substance, a radioisotope, an enzyme, etc. bound to avidin. can do.
In the detection method using an antibody, when an antibody is labeled, the labeling method may be a known method as described above, and examples thereof include the following labeling methods.

〔ｉＡＥＰ（intercalated antibody-enhanced polymer）法〕
検出対象となるタンパク質に結合する第一抗体と、ポリマー試薬の間に介在抗体を入れることにより、染色感度を上げることが可能である（Takeuchiら、Clin Cancer Res, 2009 May 1; 15(9):3143-3149）。[IAEP (intercalated antibody-enhanced polymer) method]
Staining sensitivity can be increased by inserting an intervening antibody between the primary antibody that binds to the protein to be detected and the polymer reagent (Takeuchi et al., Clin Cancer Res, 2009 May 1; 15 (9)). : 3143-3149).

〔蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）〕
２つの抗体の近接を検出する手法として、例えば、ＦＲＥＴ現象を利用したプローブ（ＦＲＥＴプローブ）を用いることができる。抗体の一つをドナー蛍光物質（ＣＦＰ等）で標識し、他の抗体をアクセプター蛍光物質（ＹＦＰ等）で標識した場合、両者が十分に近い距離にあると、ＦＲＥＴ現象により、ＹＦＰが励起状態となり、基底状態に戻る際に蛍光を発する。この蛍光を検出することで、２つの抗体が近接していることを検出することができる。[Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)]
As a method for detecting the proximity of two antibodies, for example, a probe utilizing the FRET phenomenon (FRET probe) can be used. When one of the antibodies is labeled with a donor fluorescent substance (CFP, etc.) and the other antibody is labeled with an acceptor fluorescent substance (YFP, etc.), if the two are sufficiently close to each other, the YFP is excited by the FRET phenomenon. And emits fluorescence when returning to the ground state. By detecting this fluorescence, it is possible to detect that the two antibodies are in close proximity.

≪ＡＬＫ阻害物質による治療の適用対象の判定≫
本発明の検出方法における検出対象のＡＬＫ融合遺伝子又は検出対象のＡＬＫ融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、ＡＬＫ融合体陽性のがんを有する対象（患者）であり、ＡＬＫ阻害物質による治療の適用対象となる。≪Determining the target of treatment with ALK inhibitors≫
When the ALK fusion gene to be detected or the ALK fusion protein to be detected in the detection method of the present invention is detected in a sample obtained from a subject, the subject is a subject (patient) having ALK fusion-positive cancer. Therefore, it is the target of treatment with ALK inhibitors.

≪ＺＳＣＡＮ９阻害物質による治療の適用対象の判定≫
本発明の検出方法における検出対象のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子又は検出対象のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、被験者から得た試料から検出された場合は、当該被験者は、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんを有する対象（患者）であり、ＺＳＣＡＮ９阻害物質による治療の適用対象となる。≪Determining the target of treatment with ZSCAN9 inhibitor≫
When the ZSCAN9 fusion gene to be detected or the ZSCAN9 fusion protein to be detected in the detection method of the present invention is detected in a sample obtained from a subject, the subject is a subject (patient) having a ZSCAN9 fusion-positive cancer. Therefore, it is the target of treatment with ZSCAN9 inhibitor.

≪検出用キット≫
本発明の検出用キットには、検出対象のＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のＡＬＫ融合タンパク質の検出用キットが含まれる。
本発明の検出用キットには、検出対象のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット、又は、検出対象のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キットが含まれる
本発明の検出対象のＡＬＫ融合遺伝子の検出用キット、又は、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キットには、本発明の検出方法においてＦＩＳＨ法フュージョンアッセイ又はＦＩＳＨ法スプリットアッセイに用いることのできるプローブ、あるいは、本発明の検出方法における検出対象のＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅できるように設計したセンス及びアンチセンスプライマーが含まれる。センス及びアンチセンスプライマーセットは、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチドであり、かつ、増幅対象であるポリヌクレオチドの増幅用のプライマーとして機能するポリヌクレオチドのセットである。
また、本発明の検出対象のＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キットには、本発明の検出方法において用いることができる抗体が含まれる。≪Detection kit≫
The detection kit of the present invention includes a kit for detecting an ALK fusion gene to be detected or a kit for detecting an ALK fusion protein to be detected.
The detection kit of the present invention includes a kit for detecting the ZSCAN9 fusion gene to be detected, or a kit for detecting the ZSCAN9 fusion protein to be detected, or a kit for detecting the ALK fusion gene to be detected of the present invention. , ZSCAN9 fusion gene detection kit includes a probe that can be used in the FISH fusion assay or FISH split assay in the detection method of the present invention, or the ALK fusion gene or ZSCAN9 fusion to be detected in the detection method of the present invention. Includes sense and antisense primers designed to specifically amplify at least a portion of the gene. The sense and antisense primer set is a set of polynucleotides that are at least a part of the polynucleotide of the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene and that function as a primer for amplification of the polynucleotide to be amplified.
Further, the kit for detecting the ALK fusion protein or the ZSCAN9 fusion protein to be detected of the present invention contains an antibody that can be used in the detection method of the present invention.

＜プローブ＞
本発明のＡＬＫ融合遺伝子の検出用キットは、ＡＬＫ融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ＡＬＫ融合遺伝子を検出できるプローブを１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キットは、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部のポリヌクレオチド、又は、その相補鎖にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、前記ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出できるプローブを１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。<Probe>
The kit for detecting an ALK fusion gene of the present invention hybridizes to at least a part of the polynucleotide of the ALK fusion gene or its complementary strand under stringent conditions, and provides one type of probe capable of detecting the ALK fusion gene. Or, it can be included in a combination of two or more types.
The kit for detecting the ZSCAN9 fusion gene of the present invention hybridizes to at least a part of the polynucleotide of the ZSCAN9 fusion gene or its complementary strand under stringent conditions, and provides one type of probe capable of detecting the ZSCAN9 fusion gene. Or, it can be included in a combination of two or more types.

プローブとして、前述の≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか１種類以上のプローブが例示できる。
例えば、ＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の場合、ＡＬＫ遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上の（好ましくは２種類以上の）プローブ、又は、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上の（好ましくは２種類以上の）プローブ、のいずれかのみを含んでも、ＡＬＫ遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、及び、ＺＳＣＡＮ９遺伝子由来ポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、の両方を含んでも、あるいは、ＡＬＫ融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブ、又は、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドにハイブリダイズする１種類以上のプローブを含んでもよい。As the probe, any one or more types of probes described in the above-mentioned << Technique used for detection method >> can be exemplified.
For example, when the ALK fusion gene or ZSCAN9 fusion gene is a ZSCAN9-ALK fusion gene, one or more (preferably two or more) probes that hybridize to the ALK gene-derived polynucleotide, or the ZSCAN9 gene-derived polynucleotide. Hybridizes to one or more probes that hybridize to ALK gene-derived polynucleotides and to ZSCAN9 gene-derived polynucleotides, even if they contain only one or more (preferably two or more) probes to hybridize. Hybridizes to one or more probes that contain both of one or more probes, or to a polynucleotide that contains a fusion point of an ALK fusion gene, or to a polynucleotide that contains a fusion point of a ZSCAN9 fusion gene. It may contain one or more kinds of probes.

＜プライマーセット＞
本発明のＡＬＫ融合遺伝子の検出用キットは、ＡＬＫ融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＡＬＫ融合遺伝子を検出できるプライマーセットを１セット、あるいは、２セット以上の組み合わせで含むことができる。
本発明のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キットは、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の少なくとも一部を特異的に増幅でき、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子を検出できるプライマーセットを１セット、あるいは、２セット以上の組み合わせで含むことができる。
プライマーセットとして、前述の≪本発明の検出方法の態様≫又は≪検出方法に用いる技法≫に記載したいずれか１種類以上のプライマーセットが例示できる。<Primer set>
The kit for detecting an ALK fusion gene of the present invention can specifically amplify at least a part of the ALK fusion gene and can include one set or a combination of two or more sets of primers capable of detecting the ALK fusion gene. ..
The kit for detecting the ZSCAN9 fusion gene of the present invention can specifically amplify at least a part of the ZSCAN9 fusion gene and can include one set or a combination of two or more primer sets capable of detecting the ZSCAN9 fusion gene. ..
As the primer set, any one or more of the primer sets described in << Aspects of the detection method of the present invention >> or << Techniques used in the detection method >> described above can be exemplified.

本発明のプライマーセットには、好ましくは、
（１）ＺＳＣＡＮ９をコードする部分から設計されるセンスプライマー及びＡＬＫをコードする部分から設計されるアンチセンスプライマーを含む、ＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」にストリンジェントな条件下（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でアニールする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなり、センスプライマーは「検出対象ポリヌクレオチド」の相補鎖にストリンジェントな条件（好ましくは、よりストリンジェントな条件下）でアニールする核酸分子（好ましくは、少なくとも１６塩基の核酸分子）からなるプライマーセット、が含まれる。The primer set of the present invention preferably contains
(1) A primer set for detecting a fusion gene of ZSCAN9 gene and ALK gene, which contains a sense primer designed from a portion encoding ZSCAN9 and an antisense primer designed from a portion encoding ALK. The antisense primer consists of a nucleic acid molecule (preferably at least 16 bases of nucleic acid molecule) that anneals to the "detection target polynucleotide" under stringent conditions (preferably more stringent conditions), and the sense primer is " The complementary strand of the "polynucleotide to be detected" includes a primer set consisting of nucleic acid molecules (preferably at least 16 base nucleic acid molecules) that are annealed under stringent conditions (preferably more stringent conditions).

また、前記プライマーセット（１）のより具体的な態様として、本発明のプライマーセットには、以下の（２）及び／又は（３）のプライマーセットが含まれる。 Further, as a more specific embodiment of the primer set (1), the primer set of the present invention includes the following primer sets (2) and / or (3).

（２）配列番号１（ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０）の塩基番号１から５６８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号４）及び配列番号１の塩基番号５６９から２２５９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号５）のプライマーセット。 (2) A sense primer (preferably SEQ ID NO: 4) consisting of any contiguous at least 16 nucleotide oligonucleotides between base numbers 1 to 568 of SEQ ID NO: 1 (ZSCAN9ex3-ALKex20) and base numbers 569 to 2259 of SEQ ID NO: 1. A primer set of antisense primers (preferably SEQ ID NO: 5) consisting of oligonucleotides that are complementary to any contiguous at least 16 nucleotides of oligonucleotide in between.

（３）配列番号１２の塩基番号１から７１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー（好ましくは配列番号４）及び配列番号１２の塩基番号７１７から２８５７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー（好ましくは配列番号５）のプライマーセット。 (3) A sense primer (preferably SEQ ID NO: 4) consisting of any contiguous at least 16 nucleotide oligonucleotides between base numbers 1 to 716 of SEQ ID NO: 12 and any contiguous sequence between base numbers 717 to 2857 of SEQ ID NO: 12. A primer set of antisense primers (preferably SEQ ID NO: 5) consisting of oligonucleotides that are complementary to the oligonucleotide of at least 16 bases.

なお、配列番号１２で表されるポリヌクレオチドの塩基配列は、配列番号１（ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０）で表される融合遺伝子の塩基配列について、さらにその非翻訳領域（untranslated region;UTR）をも含む塩基配列である。 The nucleotide sequence of the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 12 is a nucleotide that further includes an untranslated region (UTR) of the nucleotide sequence of the fusion gene represented by SEQ ID NO: 1 (ZSCAN9ex3-ALKex20). It is an array.

これらのプライマーセット（１）〜（３）においては、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーの選択位置の間隔が１ｋｂ以下であるか、あるいは、センスプライマーとアンチセンスセンスプライマーにより増幅される増幅産物の大きさが１ｋｂ以下であることが好ましい。
また、本発明のプライマーは、通常、１５〜４０塩基、好ましくは１６〜２４塩基、更に好ましくは１８〜２４塩基、特に好ましくは２０〜２４塩基の鎖長を有する。In these primer sets (1) to (3), the distance between the selection positions of the sense primer and the antisense sense primer is 1 kb or less, or the size of the amplification product amplified by the sense primer and the antisense sense primer. The primer is preferably 1 kb or less.
In addition, the primers of the present invention usually have a chain length of 15 to 40 bases, preferably 16 to 24 bases, more preferably 18 to 24 bases, and particularly preferably 20 to 24 bases.

本発明のプライマーセットは、本発明の検出方法において、検出対象ポリヌクレオチドを増幅及び検出するために用いることができる。また、本発明のプライマーセットに含まれる各プライマーは、特に限定されるものではないが、例えば、化学合成法によって製造することができる。 The primer set of the present invention can be used for amplifying and detecting the polynucleotide to be detected in the detection method of the present invention. Further, each primer contained in the primer set of the present invention is not particularly limited, but can be produced by, for example, a chemical synthesis method.

＜抗体＞
本発明のＡＬＫ融合タンパク質の検出用キットには、ＡＬＫ融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の＜融合タンパク質の検出＞に記載した抗体が例示できる。
本発明のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キットには、ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の任意の部位に特異的に結合する抗体を１種類、あるいは、２種類以上の組み合わせで含むことができる。具体的には、前述の＜融合タンパク質の検出＞に記載した抗体が例示できる。
例えば、ＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合タンパク質の場合、ＡＬＫタンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の（好ましくは２種類以上の）抗体、又は、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の（好ましくは２種類以上の）抗体、のいずれかのみを含んでも、ＡＬＫタンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、及び、ＺＳＣＡＮ９タンパク質由来ポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、の両方を含んでも、あるいは、ＡＬＫ融合タンパク質の融合点を含むポリペプチドに結合する１種類以上の抗体、又は、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の融合点を含むポリヌクレオチドに結合する１種類以上の抗体を含んでもよい。<Antibody>
The kit for detecting an ALK fusion protein of the present invention may contain one type or a combination of two or more types of antibodies that specifically bind to any site of the ALK fusion protein. Specifically, the antibody described in <Detection of fusion protein> described above can be exemplified.
The kit for detecting the ZSCAN9 fusion protein of the present invention may contain one type or a combination of two or more types of antibodies that specifically bind to any site of the ZSCAN9 fusion protein. Specifically, the antibody described in <Detection of fusion protein> described above can be exemplified.
For example, if the ALK fusion protein or ZSCAN9 fusion protein is a ZSCAN9-ALK fusion protein, it binds to one or more (preferably two or more) antibodies that bind to the ALK protein-derived polypeptide, or to the ZSCAN9 protein-derived polypeptide. One or more antibodies that bind to an ALK protein-derived polypeptide and one or more that bind to a ZSCAN9 protein-derived polypeptide, even if they contain only one or more (preferably two or more) antibodies. One or more antibodies that bind to a polypeptide that contains both of the antibodies of the ALK fusion protein, or one or more antibodies that bind to a polynucleotide that contains the fusion point of the ZSCAN9 fusion gene. May include.

≪阻害物質のスクリーニング方法≫
＜ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングする工程＞
本発明の、阻害物質のスクリーニング方法は、前記検出対象ポリペプチドを阻害する物質をスクリーニングすることができ、
（１）検出対象ポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を接触させる工程、
（２）前記ポリペプチドが阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ポリペプチドを阻害する物質を選択する工程
を含む。≪Inhibitor screening method≫
<Step of screening for substances that inhibit polypeptides>
The method for screening an inhibitor of the present invention can screen a substance that inhibits the polypeptide to be detected.
(1) A step of contacting a test substance with a polypeptide to be detected or a cell expressing the polypeptide.
It includes (2) a step of analyzing whether or not the polypeptide is inhibited, and (3) a step of selecting a substance that inhibits the polypeptide.

本明細書において、「ポリペプチドの阻害」には、ポリペプチドの活性の阻害と、ポリペプチドの発現の阻害とが含まれる。また、「阻害」は、少なくとも一部の阻害を意味する。 As used herein, "inhibition of a polypeptide" includes inhibition of the activity of the polypeptide and inhibition of the expression of the polypeptide. In addition, "inhibition" means at least a part of inhibition.

＜阻害物質スクリーニング工程とその指標＞
本発明のスクリーニング方法には、
（Ａ）精製又は粗製のポリペプチドを用いて、インビトロでポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
（Ｂ）ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの活性阻害を指標とする方法、
（Ｃ）ポリペプチドを発現している細胞を用いて、ポリペプチドの発現阻害を指標とする方法
が含まれる。<Inhibitor screening process and its indicators>
The screening method of the present invention includes
(A) A method in which the activity inhibition of a polypeptide is used as an index in vitro using a purified or crude polypeptide.
(B) A method using cells expressing a polypeptide as an index for inhibiting the activity of the polypeptide,
(C) A method of using a cell expressing a polypeptide as an index for inhibiting the expression of the polypeptide is included.

〔（Ａ）精製又は粗製ポリペプチドを用い、活性阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ａ）には、インビトロでポリペプチドに試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかったポリペプチド）と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
インビトロにおけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するＡＤＰ量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。[(A) Method using purified or crude polypeptide and using activity inhibition as an index]
In the method (A), a step of adding a test substance to a polypeptide in vitro and contacting the polypeptide, and whether or not the activity of the polypeptide was inhibited by the test substance was determined by a control (poly without contacting the test substance). A method including a step of analyzing by comparison with a peptide) and a step of selecting a substance that inhibits the activity of the polypeptide is included.
For the measurement of the polypeptide activity in vitro, a known kinase activity measurement method can be used, and for example, the amount of ADP produced by the kinase reaction may be used as an index, or the tyrosine phosphorylation level of the polypeptide may be used as an index. A commercially available kinase activity measurement kit can also be used.

〔（Ｂ）ポリペプチド発現細胞を用い、活性阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ｂ）には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの活性が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかった細胞）と比較して分析する工程、ポリペプチドの活性を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチド活性の測定は、公知のキナーゼ活性測定法を用いることができ、例えば、キナーゼ反応により生成するＡＤＰ量を指標としても、あるいは、ポリペプチドのチロシンリン酸化レベルを指標としてもよく、市販のキナーゼ活性測定キットを用いることもできる。[(B) Method using polypeptide-expressing cells and using activity inhibition as an index]
In the method (B), a step of adding a test substance to cells expressing a polypeptide and contacting the cells, and whether or not the activity of the polypeptide was inhibited by the test substance was determined by a control (contacting the test substance). A method including a step of comparing with a non-treated cell) and a step of selecting a substance that inhibits the activity of the polypeptide is included.
For the measurement of the polypeptide activity in the cells, a known kinase activity measurement method can be used, and for example, the amount of ADP produced by the kinase reaction may be used as an index, or the tyrosine phosphorylation level of the polypeptide may be used as an index. , A commercially available kinase activity measurement kit can also be used.

〔（Ｃ）ポリペプチド発現細胞を用い、発現阻害を指標とする方法〕
前記方法（Ｃ）には、ポリペプチドを発現している細胞に試験物質を添加して接触させる工程、前記試験物質により前記ポリペプチドの発現が阻害されたか否かを、対照（試験物質を接触させなかった細胞）と比較して分析する工程、ポリペプチドの発現を阻害した物質を選択する工程を含む方法が含まれる。
前記細胞におけるポリペプチドの発現は、タンパク質又はｍＲＮＡの量を測定することにより分析することができる。タンパク質量の測定には、例えば、ＥＬＩＳＡ法、イムノブロット法を用いることができ、ｍＲＮＡ量の測定には、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロット法を用いることができる。[(C) Method using polypeptide-expressing cells and using expression inhibition as an index]
In the method (C), a step of adding a test substance to cells expressing a polypeptide and contacting the cells, and whether or not the test substance inhibited the expression of the polypeptide as a control (contacting the test substance). A method including a step of comparing with a non-treated cell) and a step of selecting a substance that inhibits the expression of the polypeptide is included.
Expression of the polypeptide in the cells can be analyzed by measuring the amount of protein or mRNA. For example, an ELISA method or an immunoblotting method can be used for measuring the amount of protein, and for example, an RT-PCR method or a Northern blotting method can be used for measuring the amount of mRNA.

ここで、ＡＬＫ融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、ＡＬＫ融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がＡＬＫ融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。
また、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子は、腫瘍形成能を有する遺伝子である。従って、本発明の阻害物質スクリーニング方法で選択したポリペプチド阻害物質は、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療薬又はその候補物質として有用であり、本発明方法は、所望により、前記阻害物質がＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんに対する治療活性を有することを確認する工程を更に含むことができる。Here, the ALK fusion gene is a gene having a tumor-forming ability. Therefore, the polypeptide inhibitor selected by the inhibitor screening method of the present invention is useful as a therapeutic agent for ALK fusion-positive cancer or a candidate substance thereof, and in the method of the present invention, the inhibitor is ALK, if desired. It can further include a step of confirming that it has therapeutic activity against fusion-positive cancer.
In addition, the ZSCAN9 fusion gene is a gene having a tumor-forming ability. Therefore, the polypeptide inhibitor selected by the inhibitor screening method of the present invention is useful as a therapeutic agent for ZSCAN9 fusion-positive cancer or a candidate substance thereof, and in the method of the present invention, the inhibitor is ZSCAN9, if desired. It can further include a step of confirming that it has therapeutic activity against fusion-positive cancer.

前記確認工程は、公知の評価系を用いて実施することができ、例えば、培養細胞を用いるインビトロ評価系、腫瘍細胞を移植した担がんモデル動物を用いる評価系などを挙げることができる。
前記ポリペプチド発現細胞は、本発明のポリヌクレオチドを、常法にしたがって、所望の細胞に導入することで得ることもできる（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition（2012）、Cold Spring Harbor Laboratory Press参照）。具体的には、例えば、本発明のＡＬＫ融合遺伝子又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子であるｃＤＮＡを、組換えベクターに導入し、これをさらに細胞に導入することで、前記ポリペプチド発現細胞（形質転換細胞）を得ることができる。The confirmation step can be carried out using a known evaluation system, and examples thereof include an in vitro evaluation system using cultured cells and an evaluation system using a cancer-bearing model animal transplanted with tumor cells.
The polypeptide-expressing cells can also be obtained by introducing the polynucleotide of the present invention into desired cells according to a conventional method (for example, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th Edition (2012), Cold Spring Harbor Laboratory). See Press). Specifically, for example, the cDNA which is the ALK fusion gene or the ZSCAN9 fusion gene of the present invention is introduced into a recombinant vector, and this is further introduced into cells to obtain the polypeptide-expressing cells (transformed cells). Obtainable.

≪阻害物質を含有するがん治療用医薬組成物≫
本発明の、ＡＬＫ融合体陽性のがん（例えば、消化器がん）の治療用医薬組成物は、ＡＬＫ融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質（例えば、低分子化合物、二重鎖核酸（ｓｉＲＮＡを含む）、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物）を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。
本発明のＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療用医薬組成物は、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質を含む。例えば、本発明の阻害物質スクリーニング方法で得られる阻害物質（例えば、低分子化合物、二重鎖核酸（ｓｉＲＮＡを含む）、タンパク質（抗体又は抗体断片を含む）、ペプチド、又はそれ以外の化合物）を有効成分として含有し、所望により、製剤学的に許容される担体を含有することができる。<< Pharmaceutical composition for cancer treatment containing an inhibitor >>
The therapeutic pharmaceutical composition of an ALK fusion positive cancer (eg, gastrointestinal cancer) of the present invention contains an inhibitor of the ALK fusion gene or its transcript. For example, inhibitors obtained by the inhibitor screening method of the present invention (for example, low molecular weight compounds, double-stranded nucleic acids (including siRNA), proteins (including antibodies or antibody fragments), peptides, or other compounds) can be used. It can be contained as an active ingredient and, if desired, a pharmaceutically acceptable carrier.
The therapeutic pharmaceutical composition for ZSCAN9 fusion-positive cancer of the present invention contains an inhibitor for the ZSCAN9 fusion gene or a transcript thereof. For example, inhibitors obtained by the inhibitor screening method of the present invention (for example, low molecular weight compounds, double-stranded nucleic acids (including siRNA), proteins (including antibodies or antibody fragments), peptides, or other compounds) can be used. It can be contained as an active ingredient and, if desired, a pharmaceutically acceptable carrier.

＜ＡＬＫ融合遺伝子又は転写産物、あるいは、ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子又は転写産物に対する阻害物質＞
ＡＬＫ融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、キナーゼ阻害剤、例えば、ＡＬＫ阻害物質、又は、ＡＬＫ遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子又はその転写物質に対する阻害物質を挙げることができる。
ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、ＺＳＣＡＮ９遺伝子又はその転写物質、あるいは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子と共に融合遺伝子を構築するもう一方の遺伝子の少なくともいずれか一方に対する阻害物質を挙げることができる。例えば、前記もう一方の遺伝子がＡＬＫ遺伝子の場合、阻害物質としてキナーゼ阻害剤を例示できる。<ALK fusion gene or transcript, or inhibitor of ZSCAN9 fusion gene or transcript>
Examples of the inhibitor of the ALK fusion gene or its transcript include a kinase inhibitor, for example, an ALK inhibitor, or an inhibitor of the other gene that constructs the fusion gene together with the ALK gene or its transcript.
Examples of the inhibitor of the ZSCAN9 fusion gene or its transcript include an inhibitor of the ZSCAN9 gene or its transcript, or at least one of the other genes that construct the fusion gene with the ZSCAN9 gene. For example, when the other gene is an ALK gene, a kinase inhibitor can be exemplified as an inhibitor.

〔低分子化合物〕
前記阻害物質のうち、低分子化合物の具体例としては、AG879（CAS148741-30-4）、国際公開公報WO2008/045627、WO2008/073480に記載の化合物等を挙げることができる。[Low molecular weight compounds]
Among the above-mentioned inhibitors, specific examples of low molecular weight compounds include the compounds described in AG879 (CAS148741-30-4), WO2008 / 045627, WO2008 / 073480 and the like.

また、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子又はその転写産物に対する阻害物質としては、例えば、クリゾチニブ（crizotinib、Pfizer Inc、製品名「Ｘａｌｋｏｒｉ」）、ＣＨ５４２４８０２（Chugai Pharmaceutical Co Ltd）、ＴＡＥ６８４（Novartis AG）、ＡＳＰ３０２６（Astellas Pharma Inc）、 ＬＤＫ−３７８（Novartis AG）、ＴＳＲ−０１１（Amgen Inc、TESARO Inc）、ＡＰ−２６１１３（ARIAD Pharmaceuticals Inc）、Ｘ−３７６／３９６（Xcovery Inc）、４ＳＣ−２０３（4SC AG; ProQinase GmbH）、ＮＭＳ−Ｅ６２８（Nerviano Medical Sciences Srl）、ＡＺＤ−３４６３（AstraZeneca plc）、ＣＥＰ−２８１２２（Cephalon Inc）、ＣＥＰ−３７４４０（Cephalon Inc）、ＫＲＡ−０００８（Korea Research Institute of Chemical Technology）を挙げることができる。 Examples of inhibitors of the ZSCAN9-ALK fusion gene or its transcript include crizotinib (Pfizer Inc, product name "Xalkori"), CH542402 (Chugai Pharmaceutical Co Ltd), TAE684 (Novartis AG), ASP3026 (Astellas). Pharma Inc), LDK-378 (Novartis AG), TSR-011 (Amgen Inc, TESARO Inc), AP-26113 (ARIAD Pharmaceuticals Inc), X-376 / 396 (Xcovery Inc), 4SC-203 (4SC AG; ProQinase) GmbH), NMS-E628 (Nerviano Medical Sciences Srl), AZD-3463 (AstraZeneca plc), CEP-28122 (Cephalon Inc), CEP-37440 (Cephalon Inc), KRA-0008 (Korea Research Institute of Chemical Technology) be able to.

〔二重鎖核酸〕
二重鎖核酸は、二重鎖の核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）部分と、好ましくはセンス鎖及びアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハングとからなり、ＲＮＡｉを誘導する。ＲＮＡｉは進化的に保存された現象で、ＲＮａｓｅIIIエンドヌクレアーゼによって生じる２１〜２３塩基の二重鎖核酸を介して起こる（Genes Dev. 15, 485-490, 2001）。３’側のオーバーハングはそれぞれ１又は２塩基の任意の核酸であるが、２塩基が好ましい。なお、前記塩基数（２１〜２３塩基）は、オーバーハングを含むセンス鎖又はアンチセンス鎖の各々の塩基数である。また、センス鎖及びアンチセンス鎖は、同じ塩基数であることもできるし、異なる塩基数であることもできるが、同じ塩基数であることが好ましい。[Double-stranded nucleic acid]
Double-stranded nucleic acids consist of a double-stranded nucleic acid (RNA or DNA) portion and preferably an overhang at the 3'end of the sense and antisense strands to induce RNAi. RNAi is an evolutionarily conserved phenomenon that occurs via double-stranded nucleic acids of 21 to 23 bases produced by RNase III endonucleases (Genes Dev. 15, 485-490, 2001). The overhang on the 3'side is any nucleic acid of 1 or 2 bases, respectively, with 2 bases being preferred. The number of bases (21 to 23 bases) is the number of bases of each of the sense strand or antisense strand including the overhang. Further, the sense strand and the antisense strand may have the same number of bases or different numbers of bases, but preferably have the same number of bases.

二重鎖核酸の３’側オーバーハングを構成するリボ核酸としては、例えば、Ｕ（ウリジン）、Ａ（アデノシン）、Ｇ（グアノシン）、又はＣ（シチジン）を用いることができ、３’側のオーバーハングを構成するデオキシリボ核酸としては、例えば、ｄＴ（デオキシチミジン）、ｄＡ（デオキシアデノシン）、ｄＧ（デオキシグアノシン）、又はｄＣ（デオキシシチジン）を用いることができる。 As the ribonucleic acid constituting the 3'side overhang of the double-stranded nucleic acid, for example, U (uridine), A (adenosine), G (guanosine), or C (cytidine) can be used, and the 3'side of the double-stranded nucleic acid can be used. As the deoxyribonucleic acid constituting the overhang, for example, dT (deoxythymidine), dA (deoxyadenosine), dG (deoxyguanosine), or dC (deoxycytidine) can be used.

本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる二重鎖核酸は、ＡＬＫ融合遺伝子に対する阻害作用又はＺＳＣＡＮ９融合遺伝子に対する阻害作用を有するものであれば、特に限定されない。例えば、二重鎖部分が融合点を含むポリヌクレオチドの塩基配列、例えば、配列番号１の第５６８番〜第５６９番を含む塩基配列に基づいて設計することができる。あるいは、二重鎖部分が、キナーゼ部分をコードするポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて設計することができる。本発明の二重鎖核酸は、常法（例えば、J. Am. Chem. Soc., 120, 11820-11821, 1998; 及びMethods, 23, 206-217, 2001）により製造することができる。また、二重鎖核酸を委託製造する会社（例えば、ＲＮＡｉ社）は、当業者によく知られており、二重鎖核酸の製造に利用できる。また、ｓｉＲＮＡ配列設計システム（商用ｓｉＤｉｒｅｃｔ（登録商標）、ＲＮＡｉ社）により、二重鎖核酸を設計することができる。 The double-stranded nucleic acid that can be used as the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it has an inhibitory action on the ALK fusion gene or an inhibitory action on the ZSCAN9 fusion gene. For example, it can be designed based on the base sequence of a polynucleotide whose double chain portion contains a fusion point, for example, a base sequence containing Nos. 568 to 569 of SEQ ID NO: 1. Alternatively, the duplex moiety can be designed based on the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the kinase moiety. The double-stranded nucleic acid of the present invention can be produced by a conventional method (for example, J. Am. Chem. Soc., 120, 11820-11821, 1998; and Methods, 23, 206-217, 2001). Further, a company that manufactures double-stranded nucleic acids on consignment (for example, RNAi) is well known to those skilled in the art and can be used for manufacturing double-stranded nucleic acids. In addition, double-stranded nucleic acids can be designed by the siRNA sequence design system (commercial siDirect (registered trademark), RNAi).

〔タンパク質・抗体〕
本発明の医薬組成物の有効成分として用いることのできる抗体は、ＡＬＫ融合遺伝子の転写産物又はＺＳＣＡＮ９遺伝子の転写産物、好ましくは、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ遺伝子の転写産物を阻害するものであれば、限定されない。例えば、ＡＬＫ融合タンパク質又はＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性、好ましくはキナーゼ活性を阻害するものが挙げられる。[Protein / antibody]
The antibody that can be used as the active ingredient of the pharmaceutical composition of the present invention is not limited as long as it inhibits the transcript of the ALK fusion gene or the transcript of the ZSCAN9 gene, preferably the transcript of the ZSCAN9-ALK gene. .. For example, those that inhibit the activity of the ALK fusion protein or the ZSCAN9 fusion protein, preferably the kinase activity.

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を限定するものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described with reference to Examples, but these do not limit the scope of the present invention.

［実施例１］臨床検体でのＡＬＫ遺伝子異常のＦＩＳＨ法による検出
目的遺伝子の５’末端側領域及び３’末端側領域を異なる色素で染め、遺伝子の転座又は逆位等を観察する方法が知られている。ＦＩＳＨ法の一種であるこの方法はスプリットアッセイ（split assay）と呼ばれている。スプリットアッセイでは、染色体転座又は逆位等を調べたい目的遺伝子の５’末端側領域及び３’末端側領域のそれぞれを異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、テキサスレッド（TexasRed）（赤）標識及びＦＩＴＣ（緑）標識した２種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合（融合遺伝子が構築されていない場合）は１つの黄色のシグナル（緑色と赤色のシグナルが近傍に存在している状態）として検出され、転座又は逆位等が起きている場合は、離れた緑色と赤色のシグナルとして検出される。[Example 1] Detection of ALK gene abnormality in clinical specimens by FISH method A method of observing gene translocation or inversion by dyeing the 5'terminal region and 3'terminal region of a target gene with different dyes. Are known. This method, which is a type of FISH method, is called a split assay. In the split assay, the 5'-terminal region and the 3'-terminal region of the gene of interest for which chromosomal translocation or inversion is to be examined are stained with probes labeled with different fluorescent dyes. For example, by fluorescently labeling with two types of probes labeled Texas Red (red) and FITC (green), one yellow signal (when the fusion gene is not constructed) It is detected as a state in which green and red signals are present in the vicinity), and when translocation or inversion occurs, it is detected as a distant green and red signal.

臨床検体でのＡＬＫ遺伝子異常をＦＩＳＨ法スプリットアッセイで検出した。手術により摘出され、２０％ホルマリンで固定化されパラフィンに包埋された大腸がん組織を４μｍの厚さで切り、スライドガラス上に乗せ病理切片を作製した。ＦＩＳＨ法は文献（Takeuchi K, Choi YL, Soda M, Inamura K, Togashi Y, Hatano S, Enomoto M, Takada S, Yamashita Y, Satoh Y, Okumura S, Nakagawa K, Ishikawa Y, Mano H. Multiplex reverse transcription-PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008;14:6618-6624.）の方法に従い行った。作製した未染色の切片は、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ＦＩＳＨアクセサリーキット（Dako社）で処理し、続いて、緑（ＦＩＴＣ）の蛍光標識したＡＬＫ遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣ（bacterial artificial chromosome）クローン（クローン番号 RP11-984121、RP11-62B19）と、赤（TexasRed）の蛍光標識したＡＬＫ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP11-701P18）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。緑と赤のシグナルが離れて観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。約１５００例の病理検体での検討から２例のＡＬＫ遺伝子領域のゲノム構造異常を示唆する検体（結腸がん患者由来）を見出した。 ALK gene abnormalities in clinical specimens were detected by the FISH split assay. Colorectal cancer tissue excised by surgery, immobilized with 20% formalin and embedded in paraffin was cut to a thickness of 4 μm and placed on a slide glass to prepare a pathological section. The FISH method is a literature (Takeuchi K, Choi YL, Soda M, Inamura K, Togashi Y, Hatano S, Enomoto M, Takada S, Yamashita Y, Satoh Y, Okumura S, Nakagawa K, Ishikawa Y, Mano H. Multiplex reverse transcription. -PCR screening for EML4-ALK fusion transcripts. Clin Cancer Res. 2008; 14: 6618-6624.). The prepared unstained sections were treated with a Histology FISH accessory kit (Dako), followed by a BAC (bacterial artificial chromosome) clone (clone number) covering the fluorescently labeled ALK gene 5'terminal region of green (FITC). RP11-984121 (RP11-62B19) and a BAC clone (clone number RP11-701P18) covering the fluorescently labeled ALK gene 3'terminal region of red (TexasRed) were used for hybridization. Subsequently, staining was performed with 4,6-diamino-2-phenylindole. A fluorescence microscope BX51 (Olympus) was used for fluorescence observation. We found sections suggesting genomic structural abnormalities in which green and red signals were observed apart. From the examination of about 1500 pathological specimens, we found two specimens (derived from colon cancer patients) suggesting genomic structural abnormalities in the ALK gene region.

［実施例２］臨床検体でのＡＬＫ融合ポリヌクレオチド遺伝子の同定
ＦＩＳＨ法解析によりＡＬＫゲノム構造異常が示唆された組織由来のＲＮＡをテンプレートに、インバースＲＴ−ＰＣＲ法により、ＡＬＫ遺伝子キナーゼ領域の５’側に存在する遺伝子を調べた。
まず、逆転写及び二本鎖ｃＤＮＡ合成は、臨床検体由来のＲＮＡ０．５μｇと、ＡＬＫ遺伝子キナーゼコード領域に設計した逆転写プライマーＡＬＫＲＥＶｅｘ２２−２３（配列番号３）とを用いて、cDNA Synthesis System（Roche）により行った。合成した二本鎖ｃＤＮＡを High Pure PCR Product Purification Kit（Roche）により精製した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（TaKaRa）を用いて自己環状化（self-ligation）した。環状化ＤＮＡを鋳型として、第１回ＰＣＲ（フォワードプライマーＡＬＫＦＷＤｅｘ２０−２１（配列番号４）とリバースプライマーＡＬＫＲＥＶ３（配列番号５）との組合せ）と、第２回ＰＣＲ（フォワードプライマーＡＬＫＦＷＤｅｘ２１−２２（配列番号６）とリバースプライマーＡＬＫＲＥＶ４（配列番号７）との組合せ）とを行った後、得られたＰＣＲ産物を用いてダイレクトシークエンスを行った。本実施例及び以下の実施例で使用したプライマーの塩基配列を表１に示す。
その結果、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の一部がＡＬＫ遺伝子キナーゼ領域の５’側に融合していることが明らかとなった。[Example 2] Identification of ALK fusion polynucleotide gene in clinical specimens Using RNA derived from a tissue whose ALK genomic structural abnormality was suggested by FISH analysis as a template, 5'in the ALK gene kinase region by inverse RT-PCR method The genes present on the side were examined.
First, reverse transcription and double-stranded cDNA synthesis were performed using 0.5 μg of RNA derived from a clinical sample and a reverse transcription primer ALKREVex22-23 (SEQ ID NO: 3) designed for the ALK gene kinase coding region, and a cDNA Synthesis System (Roche). ). The synthesized double-stranded cDNA was purified by the High Pure PCR Product Purification Kit (Roche) and then self-ligated using T4 DNA ligase (TaKaRa). Using the cyclized DNA as a template, the first PCR (combination of forward primer ALKFWDex20-21 (SEQ ID NO: 4) and reverse primer ALKREV3 (SEQ ID NO: 5)) and the second PCR (forward primer ALKFWDex21-22 (SEQ ID NO: 5)) 6) and the reverse primer ALKREV4 (combination of SEQ ID NO: 7) were performed), and then a direct sequence was performed using the obtained PCR product. Table 1 shows the base sequences of the primers used in this example and the following examples.
As a result, it was clarified that a part of the ZSCAN9 gene was fused to the 5'side of the ALK gene kinase region.

［実施例３］臨床検体でのＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチド遺伝子の単離
ＦＩＳＨ法解析によりＡＬＫゲノム構造異常が示唆され、融合する遺伝子が同定された大腸がん臨床検体由来のｃＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡポリメラーゼ（PrimeStar HS DNAポリメラーゼ）を用いてＰＣＲを行い、増幅産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ−２にクローニングした。プライマーセットとしては、フォワードプライマーＺＳＣＡＮ９−ＨｉｎｄIII（配列番号８）とリバースプライマーＡＬＫ−ＥｃｏＲＩ（配列番号９）との組合せを用いた。
得られた増幅産物の配列を確認した結果、ＺＳＣＡＮ９遺伝子の開始コドンＡＴＧからエクソン３までと、ＡＬＫ遺伝子のエクソン２０からエクソン２９の停止コドンまでの塩基配列からなるポリヌクレオチド（ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０；配列番号１）が取得できた。[Example 3] Isolation of ZSCAN9-ALK fusion polynucleotide gene in clinical specimens Using cDNA from a colon cancer clinical specimen in which an ALK genomic structural abnormality was suggested by FISH analysis and the gene to be fused was identified, as a template. PCR was performed using DNA polymerase (PrimeStar HS DNA polymerase) and the amplification product was cloned into pT7Blue-2. As a primer set, a combination of a forward primer ZSCAN9-HindIII (SEQ ID NO: 8) and a reverse primer ALK-EcoRI (SEQ ID NO: 9) was used.
As a result of confirming the sequence of the obtained amplification product, a polynucleotide (ZSCAN9ex3-ALKex20; SEQ ID NO:) consisting of the base sequences from the start codon ATG to exon 3 of the ZSCAN9 gene and the stop codons from exon 20 to exon 29 of the ALK gene (ZSCAN9ex3-ALKex20; SEQ ID NO: 1) was obtained.

なお、ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０がコードするアミノ酸配列（配列番号２）に関して、ＡＬＫ−００１の登録アミノ酸配列（Ensemble database, Protein ID: ENSP00000373700）との比較により、Ｉ５９３Ｖ、Ｋ６２３Ｒ、Ｄ６６１Ｅの３箇所のアミノ酸置換が認められた。なお、前記アミノ酸置換において、最初のアミノ酸（例：Ｉ５９３Ｖにおける「Ｉ」）は登録アミノ酸配列におけるアミノ酸を、その後のアミノ酸番号（例：Ｉ５９３Ｖにおける「５９３」）は配列番号２におけるアミノ酸番号を、最後のアミノ酸（例：Ｉ５９３Ｖにおける「Ｖ」）は配列番号２で表されるアミノ酸配列におけるアミノ酸を、それぞれ、意味する。
なお、上記アミノ酸置換について、ＡＬＫ−００１の登録アミノ酸配列（Ensemble database, Protein ID: ENSP00000373700）における相当箇所のアミノ酸番号で示した場合、前記Ｉ５９３Ｖ、Ｋ６２３Ｒ、Ｄ６６１Ｅは、それぞれ、Ｉ１４６１Ｖ、Ｋ１４９１Ｒ、Ｄ１５２９Ｅ、と表すこともできる。これらのアミノ酸置換は、それぞれ一塩基多型（rs1670283、rs1881420、rs1881421）として報告されている。Regarding the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) encoded by ZSCAN9ex3-ALKex20, by comparison with the registered amino acid sequence of ALK-001 (Ensembl database, Protein ID: ENSP00000373700), three amino acid substitutions of I593V, K623R, and D661E were found. Admitted. In the amino acid substitution, the first amino acid (eg, "I" in I593V) is the amino acid in the registered amino acid sequence, and the subsequent amino acid number (eg, "593" in I593V) is the amino acid number in SEQ ID NO: 2. Amino acids (eg, "V" in I593V) mean amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, respectively.
When the amino acid substitution is indicated by the amino acid number of the corresponding part in the registered amino acid sequence (Ensembl database, Protein ID: ENSP00000373700) of ALK-001, the I593V, K623R, and D661E are I1461V, K1491R, and D1529E, respectively. It can also be expressed as. Each of these amino acid substitutions has been reported as a single nucleotide polymorphism (rs1670283, rs1881420, rs1881421).

［実施例４］ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子の検出
表１に示すプライマーを用いて、融合部を含む領域を直接増幅するＲＴ−ＰＣＲで融合遺伝子の検出を行い、融合遺伝子ｃＤＮＡががん組織に存在していることを示した。具体的には、検体由来ＲＮＡテンプレートに対して、ＺＳＣＡＮ９遺伝子上に設計したフォワードプライマーＺＳＣＡＮ９−３９４Ｆ（配列番号１０）とＡＬＫ遺伝子上に設計したリバースプライマーＡＬＫ３０７８ＲＲ（配列番号１１）とを使用してＰＣＲを行った。増幅産物を電気泳動したところ、プライマー設定位置から予想されるサイズのバンド（４９２ｂｐ）が観察され、臨床検体を用いた融合遺伝子の検出が、これらの遺伝子上にプライマーを設計することによって可能であることが示された。[Example 4] Detection of ZSCAN9-ALK fusion gene Using the primers shown in Table 1, the fusion gene was detected by RT-PCR that directly amplifies the region containing the fusion site, and the fusion gene cDNA was present in the cancer tissue. I showed that I was doing it. Specifically, PCR is performed on a sample-derived RNA template using the forward primer ZSCAN9-394F (SEQ ID NO: 10) designed on the ZSCAN9 gene and the reverse primer ALK3078RR (SEQ ID NO: 11) designed on the ALK gene. Was done. When the amplification product was electrophoresed, a band (492 bp) of the size expected from the primer setting position was observed, and detection of fusion genes using clinical specimens is possible by designing primers on these genes. Was shown.

［実施例５］臨床検体でのＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイによる検出
融合遺伝子がゲノム上で融合していることを確認するため、ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイにて検出を行った。[Example 5] Detection of ZSCAN9-ALK fusion gene in clinical specimen by FISH fusion assay In order to confirm that the fusion gene is fused on the genome, detection was performed by the FISH fusion assay.

ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイでは染色体転座又は逆位等によって近接する二つの目的遺伝子領域を異なる蛍光色素で標識したプローブで染める。例えば、ＴｅｘａｓＲｅｄ（赤）標識及びＦＩＴＣ（緑）標識した２種類のプローブにて蛍光標識することにより、正常な場合（融合遺伝子が構築されていない場合）は赤と緑はそれぞれのシグナル（赤色と緑色のシグナルが離れて存在している状態）として検出され、転座又は逆位等が起きることにより２つの遺伝子領域が近接している場合は、赤色と緑色のシグナルが重なり黄色として検出される。
具体的には、赤（TexasRed）の蛍光標識をした、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 CTD-2382I15）と、緑（FITC）の蛍光標識をした、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP11-984I21, RP11-62B19）との組み合わせを使用した。
蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例４において融合遺伝子が陽性であった病理切片上でのフュージョンアッセイの結果、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域とＡＬＫ遺伝子３’末端側領域との近接したシグナル（黄）が観察され、融合遺伝子が染色体転座又は逆位等により生成されたことが確かめられた。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。In the FISH fusion assay, two adjacent gene regions of interest are stained with probes labeled with different fluorescent dyes by chromosomal translocation or inversion. For example, by fluorescently labeling with two types of probes labeled TexasRed (red) and FITC (green), in the normal case (when the fusion gene is not constructed), red and green are the respective signals (red and green). When the two gene regions are close to each other due to translocation or inversion, etc., the red and green signals overlap and are detected as yellow. ..
Specifically, a BAC clone (clone number CTD-2382I15) covering the terminal region of the ZSCAN9 gene 5'with a red (TexasRed) fluorescent label and an ALK gene 3'with a green (FITC) fluorescent label. A combination with a BAC clone covering the distal region (clone numbers RP11-984I21, RP11-62B19) was used.
A fluorescence microscope BX51 (Olympus) was used for fluorescence observation. As a result of the fusion assay on the pathological section in which the fusion gene was positive in Example 4, a close signal (yellow) between the ZSCAN9 gene 5'terminal region and the ALK gene 3'terminal region was observed, and the fusion gene was observed. Was confirmed to have been generated by chromosomal translocation or inversion.
It was found that this method can be used as a method for detecting the presence of the fusion gene.

［実施例６］臨床検体でのＺＳＣＡＮ９遺伝子又はＡＬＫ遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイによる検出
実施例１に記載の方法にしたがい、ＺＳＣＡＮ９遺伝子又はＡＬＫ遺伝子のＦＩＳＨ法スプリットアッセイを実施した。病理切片の作製は、実施例１と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ＦＩＳＨアクセサリーキット（Dako社）で処理した。[Example 6] Detection of ZSCAN9 gene or ALK gene by FISH method split assay in clinical specimens A FISH method split assay of ZSCAN9 gene or ALK gene was performed according to the method described in Example 1. The pathological section was prepared in the same manner as in Example 1. The prepared unstained sections were treated with a Histology FISH accessory kit (Dako).

ＺＳＣＡＮ９を対象としたスプリットアッセイの場合、続いて、赤（TexasRed）の蛍光標識したＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 CTD-2382I15）と、緑（FITC）の蛍光標識したＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP5-874C20）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。
蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例４において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、５’側のシグナル（本実施例では赤）が弧在性に観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。In the case of the split assay for ZSCAN9, the BAC clone (clone number CTD-2382I15) covering the red (TexasRed) fluorescently labeled ZSCAN9 gene 5'terminal region was subsequently fluorescently labeled with green (FITC). Hybridization was performed using a BAC clone (clone number RP5-874C20) covering the 3'terminal region of the ZSCAN9 gene. Subsequently, staining was performed with 4,6-diamino-2-phenylindole.
A fluorescence microscope BX51 (Olympus) was used for fluorescence observation. On the pathological section in which the fusion gene was positive in Example 4, a section suggesting a genomic structural abnormality in which a signal on the 5'side (red in this example) was observed in an arc is found.

ＡＬＫを対象としたスプリットアッセイの場合、続いて、赤（TexasRed）の蛍光標識したＡＬＫ遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP11-701P18）と、緑（FITC）の蛍光標識したＡＬＫ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP11-984I21、RP11-62B19）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。
蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例４において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、３’側のシグナル（実施例では緑）が弧在性に観察されるゲノム構造異常が示唆される切片を見出した。
この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使えることがわかった。In the case of the split assay for ALK, the BAC clone (clone number RP11-701P18) covering the red (TexasRed) fluorescently labeled ALK gene 5'terminal region was subsequently fluorescently labeled with green (FITC). Hybridization was performed using BAC clones (clone numbers RP11-984I21, RP11-62B19) covering the 3'terminal region of the ALK gene. Subsequently, staining was performed with 4,6-diamino-2-phenylindole.
A fluorescence microscope BX51 (Olympus) was used for fluorescence observation. On the pathological section in which the fusion gene was positive in Example 4, a section was found suggesting a genomic structural abnormality in which a signal on the 3'side (green in Example) was observed arcutically.
It was found that this method can be used as a method for detecting the presence of the fusion gene.

［実施例７］臨床検体でのＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子のＦＩＳＨ法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイの組み合わせによる検出
ＦＩＳＨ法フュージョンアッセイおよびスプリットアッセイを、同一の病理切片に対しておこなった。病理切片の作製は、実施例１と同様に実施した。作製した未染色の切片は、Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ＦＩＳＨアクセサリーキット（Dako社）で処理した。[Example 7] Detection of ZSCAN9-ALK fusion gene in clinical specimen by a combination of FISH fusion assay and split assay The FISH fusion assay and split assay were performed on the same pathological section. The pathological section was prepared in the same manner as in Example 1. The prepared unstained sections were treated with a Histology FISH accessory kit (Dako).

具体的には、青（Aqua）の蛍光標識をした、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 CTD-2382I15）と、赤（TexasRed）の蛍光標識をした、ＡＬＫ遺伝子５’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP11-701P18）と、緑（FITC）の蛍光標識をした、ＡＬＫ遺伝子３’末端側領域をカバーするＢＡＣクローン（クローン番号 RP11-984I21、RP11-62B19）とを用いてハイブリダイゼーションした。更に続いて４，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（4,6-diamino-2-phenylindole）で染色を行った。
蛍光観察は蛍光顕微鏡ＢＸ５１（Olympus社）を使用した。実施例４において融合遺伝子が陽性であった病理切片上で、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側領域とＡＬＫ遺伝子３’末端側領域との近接したシグナル（青緑）と、このシグナルから離れた孤在性のＡＬＫ遺伝子５’末端側のシグナル（赤）が観察され、融合遺伝子の生成を伴うゲノム構造異常が示された。よって、この方法が当該融合遺伝子の存在を検出する方法として使用できる。Specifically, a BAC clone (clone number CTD-2382I15) covering the terminal region of the ZSCAN9 gene 5'with a blue (Aqua) fluorescent label and an ALK gene 5'with a red (TexasRed) fluorescent label. BAC clones covering the distal region (clone number RP11-701P18) and fluorescently labeled green (FITC) BAC clones covering the distal region of the ALK gene 3'(clone numbers RP11-984I21, RP11-62B19) Hybridization was performed using. Subsequently, staining was performed with 4,6-diamino-2-phenylindole.
A fluorescence microscope BX51 (Olympus) was used for fluorescence observation. On the pathological section in which the fusion gene was positive in Example 4, a close signal (blue-green) between the ZSCAN9 gene 5'terminal region and the ALK gene 3'terminal region and loneliness away from this signal. The signal (red) on the 5'end side of the ALK gene was observed, indicating a genomic structural abnormality associated with the production of the fusion gene. Therefore, this method can be used as a method for detecting the presence of the fusion gene.

フュージョンアッセイだけでは、遺伝子転座等が起きていないにも関わらず、見る角度等によっては、近接したシグナルが観察され、偽陽性の判定が生じる恐れがある。その際、融合遺伝子を形成することになる２つの遺伝子領域間に存在する遺伝子領域を標識したシグナルが、近接したシグナルが観察される部位に近接していないことを確認することにより、偽陽性の判定を回避できる点で、本手法は好適である。 In the fusion assay alone, although no gene translocation or the like has occurred, a close signal may be observed depending on the viewing angle or the like, resulting in a false positive determination. At that time, false positives are obtained by confirming that the signal labeling the gene region existing between the two gene regions forming the fusion gene is not close to the site where the close signal is observed. This method is preferable in that the determination can be avoided.

［実施例８］ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドの腫瘍形成能の検討
本実施例では、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドをコードするｃＤＮＡ（ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０（配列番号１））を発現ベクターｐＬｅｎｔｉ６（Invitrogen（登録商標）、Life Technologies社）に挿入して得られたｐＬｅｎｔｉ６−ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫを用いて、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドの腫瘍形成能を検討した。ｐＬｅｎｔｉ６−ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫをマウス繊維芽細胞株ＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入し１１日間培養したところ、図１（ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチド発現）に示すように形質転換フォーカスが観察された。遺伝子導入試薬のみの処理をしたＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ（図２））及び、ＬａｃＺを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞（図示せず）においては、形質転換フォーカスは認められなかった。すなわち、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現するベクターを導入した場合に限り形質転換フォーカスが観察された。[Example 8] Examination of tumorigenicity of ZSCAN9-ALK fusion polypeptide In this example, the cDNA (ZSCAN9ex3-ALKex20 (SEQ ID NO: 1)) encoding the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide was expressed by the expression vector pLenti6 (Invitrogen (registered) The tumorigenicity of the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide was examined using pLenti6-ZSCAN9-ALK obtained by inserting it into Life Technologies, Inc.). When pLenti6-ZSCAN9-ALK was introduced into mouse fibroblast line NIH3T3 cells and cultured for 11 days, a transformation focus was observed as shown in FIG. 1 (ZSCAN9-ALK fusion polypeptide expression). No transformation focus was observed in NIH3T3 cells (control (Fig. 2)) treated with only the gene transfer reagent and NIH3T3 cells (not shown) into which LacZ was introduced. That is, the transformation focus was observed only when a vector expressing the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide was introduced.

ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞又は遺伝子導入試薬処理のみをおこなったＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）をヌードマウスの皮下に１×１０６個ずつ接種したところ、１０日以降には融合ポリペプチドを発現するベクターを導入したＮＩＨ３Ｔ３細胞を接種したマウスにおいて腫瘍形成が確認された（図３）。遺伝子導入試薬処理のみをおこなったＮＩＨ３Ｔ３細胞（ｃｏｎｔｒｏｌ）を接種したマウスにおいては、腫瘍形成は確認されなかった（図４）。接種６日目以降の両マウスにおける腫瘍サイズを図５に示す。この結果より、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドが腫瘍形成能を持っていたことから、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリヌクレオチドはがんの原因遺伝子であることが示された。NIH3T3 cells into which a vector expressing the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide was introduced or NIH3T3 cells (control) treated only with a gene transfer reagent were subcutaneously inoculated into nude mice by 1 × 10 6 cells each, and after 10 days, Tumor formation was confirmed in mice inoculated with NIH3T3 cells into which a vector expressing the fusion polypeptide was introduced (Fig. 3). No tumorigenesis was confirmed in the mice inoculated with NIH3T3 cells (control) that had been treated with the gene transfer reagent only (Fig. 4). The tumor size in both mice after the 6th day of inoculation is shown in FIG. From this result, it was shown that the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide is a causative gene of cancer because the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide had a tumorigenicity.

［実施例９］ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチド発現細胞の各ＡＬＫ阻害剤に対する感受性の検討
マウスリンパ系細胞株Ｂａ／Ｆ３細胞は、増殖因子であるＩＬ−３依存性細胞株であり、その増殖にＩＬ−３を必要とするが、がん化遺伝子（例えば、チロシンキナーゼ融合遺伝子）を導入することにより、ＩＬ−３を添加しなくても増殖できるようになることが知られている（Daley GQ and Baltimore D. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec;85(23):9312-9316.）。
本実施例では、親株Ｂａ/Ｆ３細胞及び実施例７で作製したｐＬｅｎｔｉ６−ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫを導入したＢａ／Ｆ３細胞について、細胞数２０００の状態から、所定濃度の各ＡＬＫ阻害剤（クリゾチニブ、ＣＨ５４２４８０２、ＴＡＥ６８４、ＡＳＰ３０２６）を添加し、７２時間培養した後の細胞数をカウントすることにより、各ＡＬＫ阻害剤に対する感受性を検討した。より具体的な試験方法については、例えば、Ｋａｔａｙａｍａらの文献（Katayama R et al., Sci Transl Med, 2012(4):120ra17）を参照することができる。[Example 9] Examination of susceptibility of ZSCAN9-ALK fusion polypeptide-expressing cells to each ALK inhibitor The mouse lymphoid cell line Ba / F3 cell is an IL-3 dependent cell line which is a growth factor, and its proliferation Although IL-3 is required, it is known that the introduction of a carcinogenic gene (for example, a tyrosine kinase fusion gene) enables proliferation without the addition of IL-3 (Daley GQ). and Baltimore D. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec; 85 (23): 9312-9316.).
In this example, for the parent strain Ba / F3 cells and the Ba / F3 cells introduced with pLenti6-ZSCAN9-ALK prepared in Example 7, each ALK inhibitor (crizotinib, CH542,802,) having a predetermined concentration from the state of the cell number 2000, TAE684, ASP3026) was added, and the susceptibility to each ALK inhibitor was examined by counting the number of cells after culturing for 72 hours. For a more specific test method, for example, the literature of Katayama et al. (Katayama R et al., Sci Transl Med, 2012 (4): 120ra17) can be referred to.

結果を図６に示す。コントロールである親株Ｂａ／Ｆ３細胞（ＩＬ−３濃度＝０．５ｎｇ／ｍＬ）では、各ＡＬＫ阻害剤の濃度が細胞毒性を示す過剰量を超えない場合（ＡＳＰ３０２６以外の阻害剤は約１００ｎｍｏｌ／Ｌ以下、ＡＳＰ３０２６は約１０００ｎｍｏｌ／Ｌ以下）には、細胞増殖能に影響は認められなかった。一方、ｐＬｅｎｔｉ６−ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫを導入したＢａ／Ｆ３細胞（ＩＬ−３非添加）では、いずれのＡＬＫ阻害剤においても、濃度依存的に細胞増殖が顕著に抑制された。
この結果は、ＡＬＫ阻害剤が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効であることを示すと同時に、ｐＬｅｎｔｉ６−ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫを導入したＢａ／Ｆ３細胞を用いる本評価系が、当該融合遺伝子陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするために用いることができることを示すものである。The results are shown in FIG. In the control parent strain Ba / F3 cells (IL-3 concentration = 0.5 ng / mL), when the concentration of each ALK inhibitor does not exceed the excess amount indicating cytotoxicity (inhibitors other than ASP3026 are about 100 nmol / L). Hereinafter, ASP3026 did not affect the cell proliferation ability at about 1000 nmol / L or less). On the other hand, in Ba / F3 cells (without IL-3 addition) into which pLenti6-ZSCAN9-ALK was introduced, cell proliferation was remarkably suppressed in a concentration-dependent manner with any ALK inhibitor.
This result shows that the ALK inhibitor is effective for the treatment of cancer patients positive for the ZSCAN9-ALK fusion gene, and at the same time, this evaluation system using Ba / F3 cells introduced with pLenti6-ZSCAN9-ALK It shows that it can be used for screening an effective drug for treating a cancer patient positive for the fusion gene.

［実施例１０］ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチド発現細胞における各ＡＬＫ阻害剤によるＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドの自己リン酸化抑制の検討
実施例８で確認した、各ＡＬＫ阻害剤によるＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチド発現細胞の増殖抑制が、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されたことによるものであることを確認するために、各ＡＬＫ阻害剤で処理した各培養細胞由来抽出物のウェスタンブロッティングを行った。
結果を図７に示す。抗体としては、抗リン酸化ＡＬＫ抗体（図７におけるｐＡＬＫ；ｐＹ１６０４）、抗ＡＬＫ抗体（図７のＡＬＫ）を使用した。ＡＬＫのポリペプチド量については、各ＡＬＫ阻害剤の処理の有無（及び処理濃度）に関してほとんど差異は認められなかった。一方、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドのリン酸化は、各ＡＬＫ阻害剤による処理により、濃度依存的に顕著に減少しており、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドのキナーゼ活性が阻害されることにより、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合ポリペプチドの自己リン酸化が抑制されることが確認された。[Example 10] Examination of self-kinase suppression of ZSCAN9-ALK fusion polypeptide by each ALK inhibitor in ZSCAN9-ALK fusion polypeptide-expressing cells The ZSCAN9-ALK fusion polypeptide by each ALK inhibitor confirmed in Example 8. Western blotting of each cultured cell-derived extract treated with each ALK inhibitor was performed to confirm that the growth inhibition of the expressing cells was due to the inhibition of the kinase activity of the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide. It was.
The results are shown in FIG. As the antibody, an anti-phosphorylated ALK antibody (pALK in FIG. 7; pY1604) and an anti-ALK antibody (ALK in FIG. 7) were used. Regarding the amount of ALK polypeptide, there was almost no difference in the presence or absence of treatment (and treatment concentration) of each ALK inhibitor. On the other hand, the phosphorylation of the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide was significantly reduced in a concentration-dependent manner by treatment with each ALK inhibitor, and the kinase activity of the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide was inhibited, so that the phosphorylation of the ZSCAN9-ALK fusion polypeptide was inhibited. It was confirmed that the autophosphorylation of the ALK fusion polypeptide was suppressed.

以上より、本発明において、一部の消化器がん患者においてＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子が存在し、その遺伝子ががんの原因となっていることが明らかとなった。即ち、ＡＬＫ阻害薬物治療の対象となるがん患者を、ＺＳＣＡＮ９−ＡＬＫ融合遺伝子を検出することで、好ましくは、ＺＳＣＡＮ９ｅｘ３−ＡＬＫｅｘ２０を検出することで選別できることが明らかとなった。 From the above, it has been clarified that, in the present invention, a fusion gene of ZSCAN9 gene and ALK gene exists in some patients with gastrointestinal cancer, and that gene is the cause of cancer. That is, it has been clarified that cancer patients to be treated with ALK inhibitory drugs can be selected by detecting the ZSCAN9-ALK fusion gene, preferably by detecting ZSCAN9ex3-ALKex20.

本発明の検出方法は、ＡＬＫ融合体陽性のがん患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。本発明の阻害物質スクリーニング方法は、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。前記スクリーニングにより得られる薬剤は、当該融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができる。前記検出方法により、当該融合体陽性のがん患者と判定された患者に、前記薬剤を投与することにより、がんを治療することができる。 The detection method of the present invention is useful for determining ALK fusion-positive cancer patients. The detection kit and primer set of the present invention can be used for the detection method. The inhibitor screening method of the present invention can be used to screen a drug effective for treating the fusion-positive cancer patient. The drug obtained by the screening can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for treating the fusion-positive cancer. Cancer can be treated by administering the drug to a patient determined to be a fusion-positive cancer patient by the detection method.

本発明の検出方法は、ＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがん患者の判定に有用である。本発明の検出用キット及びプライマーセットは、前記検出方法に用いることができる。本発明の阻害物質スクリーニング方法は、当該融合体陽性のがん患者の治療に有効な薬剤をスクリーニングするのに用いることができる。前記スクリーニングにより得られる薬剤は、当該融合体陽性のがんの治療用医薬組成物の有効成分として使用することができる。前記検出方法により、当該融合体陽性のがん患者と判定された患者に、前記薬剤を投与することにより、がんを治療することができる。
以上、本発明を特定の態様に沿って説明したが、当業者に自明の変形や改良は本発明の範囲に含まれる。The detection method of the present invention is useful for determining a cancer patient positive for ZSCAN9 fusion. The detection kit and primer set of the present invention can be used for the detection method. The inhibitor screening method of the present invention can be used to screen a drug effective for treating the fusion-positive cancer patient. The drug obtained by the screening can be used as an active ingredient of the pharmaceutical composition for treating the fusion-positive cancer. Cancer can be treated by administering the drug to a patient determined to be a fusion-positive cancer patient by the detection method.
Although the present invention has been described above according to a specific aspect, modifications and improvements that are obvious to those skilled in the art are included in the scope of the present invention.

配列表の配列番号３〜１１の配列で表される塩基配列は、合成プライマー配列である。 The base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOs: 3 to 11 in the sequence listing is a synthetic primer sequence.

Claims (31)

ＺＳＣＡＮ９とＡＬＫとのＺＳＣＡＮ９融合タンパク質であって、前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構成するＡＬＫタンパク質の一部がＡＬＫキナーゼドメインを含み、前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を構成するＺＳＣＡＮ９タンパク質の一部が、前記ＡＬＫキナーゼドメインのキナーゼ活性を恒常的に維持し、前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が腫瘍形成能を有し、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドである、前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 A ZSCAN9 fusion protein of ZSCAN9 and ALK, a part of the ALK protein constituting the ZSCAN9 fusion protein contains an ALK kinase domain, and a part of the ZSCAN9 protein constituting the ZSCAN9 fusion protein is a part of the ALK kinase domain. The ZSCAN9 fusion protein, which constantly maintains kinase activity, has tumorigenicity, and is a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity.
In (c) a polypeptide containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenicity. 請求項１に記載のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。 A polynucleotide encoding the ZSCAN9 fusion protein according to claim 1. 請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。 A vector containing the polynucleotide according to claim 2. 請求項３に記載のベクターで形質転換された細胞。 A cell transformed with the vector according to claim 3. 被験者から得た試料中の、請求項１に記載のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質又は該融合タンパク質をコードするＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出方法。 The method for detecting the ZSCAN9 fusion protein according to claim 1 or the ZSCAN9 fusion gene encoding the fusion protein in a sample obtained from a subject. 前記検出方法が、ＺＳＣＡＮ９タンパク質の切断、又は、ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードする遺伝子の切断、を検出する工程を含む、請求項５に記載の検出方法。 The detection method according to claim 5, wherein the detection method includes a step of detecting cleavage of the ZSCAN9 protein or cleavage of a gene encoding the ZSCAN9 protein. 前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される
ポリペプチドである、請求項５又は６に記載の検出方法：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 The detection method according to claim 5 or 6, wherein the ZSCAN9 fusion protein is a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d).
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity.
In (c) a polypeptide containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenicity. 請求項５に記載のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、請求項１に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の検出方法。 The detection method according to any one of claims 5 to 7, wherein the ZSCAN9 fusion gene according to claim 5 is a polynucleotide encoding the polypeptide according to claim 1. 前記ＺＳＣＡＮ９融合遺伝子が、ＤＮＡ又はｍＲＮＡである、請求項５〜８のいずれか一項に記載の検出方法。 The detection method according to any one of claims 5 to 8, wherein the ZSCAN9 fusion gene is DNA or mRNA. 前記試料が、消化器由来試料である、請求項５〜９のいずれか一項に記載の検出方法。 The detection method according to any one of claims 5 to 9, wherein the sample is a digestive organ-derived sample. 前記消化器が、消化管である、請求項１０に記載の検出方法。 The detection method according to claim 10, wherein the digestive organ is a digestive tract. 前記消化器が、下部消化管である、請求項１０に記載の検出方法。 The detection method according to claim 10, wherein the digestive organ is the lower digestive tract. 前記消化器が、大腸である、請求項１０に記載の検出方法。 The detection method according to claim 10, wherein the digestive organ is the large intestine. ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、請求項５に記載のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。 The ZSCAN9 fusion according to claim 5, comprising a first probe capable of specifically recognizing the ZSCAN9 gene 5'terminal genomic region and a second probe capable of specifically recognizing the ZSCAN9 gene 3'terminal genomic region. Gene detection kit. ＡＬＫ遺伝子の３’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第１のプローブと、ＺＳＣＡＮ９遺伝子５’末端側ゲノム領域を特異的に認識できる第２のプローブとを含む、請求項５に記載のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。 The ZSCAN9 according to claim 5, further comprising a first probe capable of specifically recognizing the 3'terminal genomic region of the ALK gene and a second probe capable of specifically recognizing the ZSCAN9 gene 5'terminal genomic region. A kit for detecting fusion genes. ＺＳＣＡＮ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドの、５’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマー、ならびに、前記ポリヌクレオチドの３’末端側領域を特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、請求項５に記載のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。 Sense primers and antisense primers designed to specifically amplify the 5'terminal region of the polynucleotide encoding the ZSCAN9 protein, and the 3'terminal region of the polynucleotide can be specifically amplified. The kit for detecting the ZSCAN9 fusion gene according to claim 5, which comprises the designed sense primer and antisense primer. 請求項２に記載のポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、請求項５に記載のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット。 The kit for detecting the ZSCAN9 fusion gene according to claim 5, which comprises a sense primer and an antisense primer designed so that the polynucleotide according to claim 2 can be specifically amplified. 以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅できるように設計したセンスプライマー及びアンチセンスプライマーを含む、請求項５に記載のＺＳＣＡＮ９融合遺伝子の検出用キット：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、
（ｃ）配列番号２で表されるアミノ酸配列との同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を
含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド、及び
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／若しくは挿入されたアミノ酸配列を含み、しかも腫瘍形成能を有するポリペプチド。 The ZSCAN9 fusion according to claim 5, which comprises a sense primer and an antisense primer designed to specifically amplify a polynucleotide encoding a polypeptide selected from the group consisting of the following (a) to (d). Gene detection kit:
(A) A polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
(B) A polypeptide containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity.
In (c) a polypeptide containing an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and having tumorigenicity, and (d) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. A polypeptide containing an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted, and having tumorigenicity. ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域を特異的に認識できる抗ＺＳＣＡＮ９抗体、及び、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＣ末端側領域を特異的に認識できる抗ＺＳＣＡＮ９抗体を含む、請求項１に記載のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キット。 The ZSCAN9 fusion protein according to claim 1, which comprises an anti-ZSCAN9 antibody capable of specifically recognizing the N-terminal region of the ZSCAN9 protein and an anti-ZSCAN9 antibody capable of specifically recognizing the C-terminal region of the ZSCAN9 protein. kit. ＡＬＫタンパク質のＣ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体と、ＺＳＣＡＮ９タンパク質のＮ末端側領域のポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む、請求項１に記載のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の検出用キット。 Detection of the ZSCAN9 fusion protein according to claim 1, which comprises an antibody that specifically binds to the polypeptide in the C-terminal region of the ALK protein and an antibody that specifically binds to the polypeptide in the N-terminal region of the ZSCAN9 protein. Kit for. 請求項２に記載のポリヌクレオチドからなるＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、アンチセンスプライマーは、ＡＬＫ遺伝子部分から設計され、且つ、請求項２に記載のポリヌクレオチドから融合点を含むＰＣＲ産物が得られるように設計される核酸分子からなり、センスプライマーは、ＺＳＣＡＮ９遺伝子部分から設計され、且つ、請求項２に記載のポリヌクレオチドの相補鎖から融合点を含むＰＣＲ産物が得られるように設計される核酸分子からなるプライマーセット。 The primer set for detecting a fusion gene of the ZSCAN9 gene consisting of the polynucleotide according to claim 2 and the ALK gene, wherein the antisense primer is designed from the ALK gene portion and according to claim 2 . It consists of a nucleic acid molecule designed to obtain a PCR product containing a fusion point from a polynucleotide, the sense primer is designed from the ZSCAN9 gene portion, and the fusion point is derived from the complementary strand of the polynucleotide according to claim 2. A set of primers consisting of nucleic acid molecules designed to obtain a PCR product containing. 配列番号１で示される塩基配列からなるＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１に示される塩基配列のＡＬＫ遺伝子部分から設計され、且つ、配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドから融合点を含むＰＣＲ産物が得られるように設計される核酸分子からなるアンチセンスプライマー及び配列番号１に示される塩基配列のＺＳＣＡＮ９遺伝子部分から設計され、且つ、該ポリヌクレオチドの相補鎖から融合点を含むＰＣＲ産物が得られるように設計される核酸分子からなるセンスプライマーを含むプライマーセット。 A primer set for detecting a fusion gene of the ZSCAN9 gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the ALK gene, which is designed from the ALK gene portion of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and has a SEQ ID NO: An antisense primer consisting of a nucleic acid molecule designed to obtain a PCR product containing a fusion point from a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in 1 and a ZSCAN9 gene portion of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. , A primer set containing a sense primer consisting of a nucleic acid molecule designed to obtain a PCR product containing a fusion point from the complementary strand of the polynucleotide. 配列番号１で示される塩基配列からなるＺＳＣＡＮ９遺伝子とＡＬＫ遺伝子との融合遺伝子を検出するためのプライマーセットであって、配列番号１の塩基番号１から５６８間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１の塩基番号５６９から２２５９間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマー、あるいは、配列番号１２の塩基番号１から７１６間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドからなるセンスプライマー及び配列番号１２の塩基番号７１７から２８５７間の任意の連続する少なくとも１６塩基のオリゴヌクレオチドに対して相補的であるオリゴヌクレオチドからなるアンチセンスプライマーを含む、プライマーセット。 A primer set for detecting a fusion gene of the ZSCAN9 gene consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the ALK gene, which is an oligonucleotide of at least 16 consecutive arbitrary nucleotides between nucleotide numbers 1 to 568 of SEQ ID NO: 1. An antisense primer consisting of a sense primer consisting of a nucleotide and an oligonucleotide consisting of an oligonucleotide complementary to any contiguous at least 16 nucleotides of an oligonucleotide between base numbers 569 and 2259 of SEQ ID NO: 1, or a base number of SEQ ID NO: 12. A sense primer consisting of any contiguous at least 16 nucleotides of an oligonucleotide between 1 and 716 and an oligonucleotide complementary to any contiguous at least 16 nucleotides of an oligonucleotide between nucleotides 717 and 2857 of SEQ ID NO: 12. A primer set containing an antisense primer consisting of. （１）請求項１に記載のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質、又は前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質を発現している細胞にインビトロで試験物質を接触させる工程、
（２）前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現が阻害されるか否かを分析する工程、及び
（３）前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質を選択する工程
を含む、前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質をスクリーニングする方法。 (1) A step of bringing a test substance into contact with the ZSCAN9 fusion protein according to claim 1 or a cell expressing the ZSCAN9 fusion protein in vitro .
It comprises (2) analyzing whether or not the activity and / or expression of the ZSCAN9 fusion protein is inhibited, and (3) selecting a substance that inhibits the activity and / or expression of the ZSCAN9 fusion protein. A method for screening for substances that inhibit the activity and / or expression of the ZSCAN9 fusion protein. 前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質の活性及び／又は発現を阻害する物質が、請求項１に記載のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質又は請求項２に記載のポリヌクレオチドであるＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療剤である、請求項２４に記載のスクリーニング方法。 Claimed that the substance that inhibits the activity and / or expression of the ZSCAN9 fusion protein is a therapeutic agent for ZSCAN9 fusion protein-positive cancer, which is the ZSCAN9 fusion protein according to claim 1 or the polynucleotide according to claim 2. Item 24. The screening method. ＡＬＫ阻害剤を含有する、請求項１に記載のＺＳＣＡＮ９融合タンパク質又は請求項２に記載のポリヌクレオチドであるＺＳＣＡＮ９融合体陽性のがんの治療用医薬組成物。 A pharmaceutical composition for treating cancer positive for ZSCAN9 fusion, which is the ZSCAN9 fusion protein according to claim 1 or the polynucleotide according to claim 2, containing an ALK inhibitor. 前記ＺＳＣＡＮ９融合タンパク質が、請求項１に記載のポリペプチドである、請求項２６に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 26, wherein the ZSCAN9 fusion protein is the polypeptide according to claim 1. 前記がんが消化器がんである、請求項２６又は２７に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 26 or 27, wherein the cancer is gastrointestinal cancer. 前記がんが消化管がんである、請求項２６又は２７に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 26 or 27, wherein the cancer is gastrointestinal cancer. 前記がんが下部消化管がんである、請求項２６又は２７に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 26 or 27, wherein the cancer is lower gastrointestinal cancer. 前記がんが大腸がんである、請求項２６又は２７に記載の医薬組成物。 The pharmaceutical composition according to claim 26 or 27, wherein the cancer is colorectal cancer.
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