JP6789051B2 - Olfactory receptor complex and cells expressing it - Google Patents

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Description

本発明は、嗅覚受容体複合体、具体的には、昆虫由来の嗅覚受容体と別の昆虫由来の嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体、及びそれを発現する細胞に関する。 The present invention relates to an olfactory receptor complex, specifically an olfactory receptor complex formed from an olfactory receptor derived from an insect and an olfactory receptor coreceptor derived from another insect, and a cell expressing the olfactory receptor complex. Regarding.

近年、揮発性化学物質（匂い物質）を測定する様々な技術が知られている。このような技術は、癌診断等の診断・ヘルスケア分野、人探索、麻薬等の検出等の防災・セキュリティ分野、有害物質の検出等の環境分野等への応用が期待されている。 In recent years, various techniques for measuring volatile chemical substances (odorous substances) have been known. Such technologies are expected to be applied to diagnostic / healthcare fields such as cancer diagnosis, disaster prevention / security fields such as human search and detection of narcotics, and environmental fields such as detection of harmful substances.

匂い物質の検出には犬や線虫等の生物を利用することがある。しかしながら、生物を利用する方法は高感度に匂い物質を検知できるものの、体調や個体によってバラツキがあるため安定性に欠け、また、集中力の持続時間に限界があるため長時間の利用が難しいといった側面もあった。 Organisms such as dogs and nematodes may be used to detect odorants. However, although the method using living organisms can detect odorous substances with high sensitivity, it lacks stability due to variations depending on the physical condition and individual, and it is difficult to use for a long time because the duration of concentration is limited. There was also a side.

そのため、生物そのものではなく、生物が備える嗅覚機能が注目されている。特に昆虫の嗅覚機能は匂い物質の認識特異性が高いとされており、嗅覚センサー等への利用が模索されている。昆虫の嗅覚器には、匂い物質を認識する嗅覚受容体（ｏｄｏｒａｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＯＲ」という場合もある。）と嗅覚受容体共受容体（ｏｄｏｒａｎｔ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ、以下「ＯＲＣＯ」又は「共受容体」という場合もある。）とが形成した嗅覚受容体複合体が存在しており、匂い物質により活性化されると、上記複合体がイオンチャネル活性を示し、それにより匂い物質が検知される（非特許文献１）。 Therefore, attention is being paid to the olfactory function of living things, not the living things themselves. In particular, the olfactory function of insects is said to have high recognition specificity for odorous substances, and its use in olfactory sensors and the like is being sought. Insect olfactory organs include olfactory receptors (hereinafter sometimes referred to as "OR") and olfactory receptor co-receptors (hereinafter "ORCO" or "co-receptors") that recognize odorants. There is an olfactory receptor complex formed by "receptors"), and when activated by an odorant, the complex exhibits ion channel activity, thereby detecting the odorant. (Non-Patent Document 1).

Ｕ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｋａｕｐｐ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ １１（２０１０），ｐ１８８−２００U.S. Benjamin Kaupp, Nature Reviews Neuroscience, vol 11 (2010), p188-200

しかしながら、匂い物質を現場で検出しようとする場合、その濃度は非常に低い場合がある。そのため、匂い物質を検出するために用いられる嗅覚センサーは、高感度であることが求められる。 However, when trying to detect odorants in the field, their concentration can be very low. Therefore, the olfactory sensor used to detect the odorant substance is required to have high sensitivity.

本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、匂い物質に対して優れた検出感度を発揮する、昆虫の嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とから形成される昆虫嗅覚受容体複合体を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above circumstances, and is an olfactory receptor complex formed from an olfactory receptor and an olfactory receptor co-receptor of an insect, which exhibits excellent detection sensitivity for odorants. The purpose is to provide.

本発明者らは、ミツバチ科昆虫の嗅覚受容体共受容体とミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体とから形成される複合体によれば、上記嗅覚受容体と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体と上記嗅覚受容体とから形成される嗅覚受容体複合体よりも、匂い物質に対する検出感度に優れることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。 According to the complex formed by the olfactory receptor co-receptors of honeybee insects and the olfactory receptors of insects that do not belong to the honeybee family, the present inventors have stated that the olfactory receptors of insects of the same species as the above-mentioned olfactory receptors. It was found that the detection sensitivity to odorants is superior to that of the olfactory receptor complex formed from the co-receptor and the above-mentioned olfactory receptor. The present invention is based on these findings.

すなわち、本発明は、例えば、以下の［１］〜［６］に関する。
［１］ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と、ミツバチ科昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される、嗅覚受容体複合体。
［２］嗅覚受容体が、カ科昆虫、カイコガ科昆虫、及びショウジョウバエ科昆虫からなる群から選択される昆虫の嗅覚受容体である、［１］に記載の嗅覚受容体複合体。
［３］嗅覚受容体が、１−オクテン−３−オール、ベンズアルデヒド、２，４，５−トリメチルチアゾール、ｃｉｓ−ジャスモン、及びペンチルアセテートからなる群から選択される化合物をリガンドとする嗅覚受容体である、［１］又は［２］に記載の嗅覚受容体複合体。
［４］嗅覚受容体が、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）のＯＲ８若しくはＯＲ１０、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）のＯＲ１０若しくはＯＲ２８、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のＯＲ５６、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＯＲ４７ａ、或いは、これらのうちいずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であり、嗅覚受容体共受容体が、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）又はその近縁種昆虫の嗅覚受容体共受容体である、［１］〜［３］のいずれかに記載の嗅覚受容体複合体。
［５］嗅覚受容体が、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）のＯＲ８若しくはＯＲ１０、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）のＯＲ１０若しくはＯＲ２８、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のＯＲ５６、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＯＲ４７ａ、或いは、これらのうちいずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であり、嗅覚受容体共受容体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質である、［１］〜［３］のいずれかに記載の嗅覚受容体複合体。
［６］［１］〜［５］のいずれかに記載の嗅覚受容体複合体を発現する細胞。 That is, the present invention relates to, for example, the following [1] to [6].
[1] An olfactory receptor complex formed from an olfactory receptor of an insect that does not belong to the Apidae family and an olfactory receptor coreceptor of an insect of the Apidae family.
[2] The olfactory receptor complex according to [1], wherein the olfactory receptor is an olfactory receptor of an insect selected from the group consisting of insects of the family Silkworm, Bombyx mori, and Drosophila.
[3] An olfactory receptor whose ligand is a compound selected from the group consisting of 1-octen-3-ol, benzaldehyde, 2,4,5-trimethylthiazole, cis-jasmon, and pentylacetate. The olfactory receptor complex according to [1] or [2].
[4] The olfactory receptors are OR8 or OR10 of Aedes aegypti, OR10 or OR28 of Anopheles gambiae, OR56 of Bombyx mori, or Ora, scorpionfish, and olfactory receptors. It is an olfactory receptor having an olfactory receptor having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of the entire olfactory receptor of any of these, and the olfactory receptor co-receptor is Apis mellifera or a closely related thereof. The olfactory receptor complex according to any one of [1] to [3], which is an olfactory receptor co-receptor of a species insect.
[5] The olfactory receptors are OR8 or OR10 of Aedes aegipti, OR10 or OR28 of Anopheles gambiae, OR56 of Bombyx mori, or OR56 of Kiiroshojoba, D. It is an olfactory receptor having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of the entire olfactory receptor of any of these, and the olfactory receptor co-receptor is 90 with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. Described in any one of [1] to [3], which is a protein having an amino acid sequence having% or more identity and having an ability to allow cations to flow into cells in conjugation with an olfactory receptor for insects. Olfactory receptor complex.
[6] A cell expressing the olfactory receptor complex according to any one of [1] to [5].

本発明によれば、匂い物質に対して優れた検出感度を発揮する、昆虫の嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とから形成される嗅覚受容体複合体を提供することができる。 According to the present invention, it is possible to provide an olfactory receptor complex formed from an olfactory receptor and an olfactory receptor co-receptor of an insect, which exhibits excellent detection sensitivity to an odorant.

ＡａＯＲ８とＡａＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＡａＯＲ８とＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、１−オクテン−３−オールを添加した際の発光量の相対値を示す。The relative values of the amount of luminescence when 1-octen-3-ol is added to the cells expressing the complex of AaOR8 and AaORCO and the cells expressing the complex of AaOR8 and AmORCO are shown. ＡａＯＲ１０とＡａＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＡａＯＲ１０とＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、ベンズアルデヒドを添加した際の発光量の相対値を示す。The relative values of the amount of luminescence when benzaldehyde is added to the cells expressing the complex of AaOR10 and AaORCO and the cells expressing the complex of AaOR10 and AmORCO are shown. ＡｇＯＲ１０とＡｇＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＡｇＯＲ１０とＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、ベンズアルデヒドを添加した際の発光量の相対値を示す。The relative values of the amount of luminescence when benzaldehyde is added to the cells expressing the complex of AgOR10 and AgORCO and the cells expressing the complex of AgOR10 and AmORCO are shown. ＡｇＯＲ２８とＡｇＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＡｇＯＲ２８とＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、２，４，５−トリメチルチアゾールを添加した際の発光量の相対値を示す。The relative values of the amount of luminescence when 2,4,5-trimethylthiazole is added to the cells expressing the complex of AgOR28 and AgORCO and the cells expressing the complex of AgOR28 and AmORCO are shown. ＢｍＯＲ５６とＢｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＢｍＯＲ５６とＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、ｃｉｓ−ジャスモンを添加した際の発光量の相対値を示す。The relative values of the amount of luminescence when cis-jasmonic acid is added to the cells expressing the complex of BmOR56 and BmORCO and the cells expressing the complex of BmOR56 and AmORCO are shown. ＤｍＯＲ４７ａとＤｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞、及びＤｍＯＲ４７ａとＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞に対し、ペンチルアセテートを添加した際の発光量の相対値を示す。The relative values of the amount of luminescence when pentyl acetate is added to the cells expressing the complex of DmOR47a and DmORCO and the cells expressing the complex of DmOR47a and AmORCO are shown.

以下、本発明を実施するための形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明する。なお、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではない。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention (hereinafter, referred to as “the present embodiment”) will be described in detail. The present invention is not limited to the following embodiments.

昆虫の嗅覚受容体複合体は、嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とがヘテロ複合体を形成したものである。昆虫の嗅覚受容体は、７回膜貫通構造を有するＧタンパク質共役型受容体の一種であり、その匂い物質の認識特異性が高い。いくつかの匂い物質特異的な嗅覚受容体が知られている。一方、昆虫の嗅覚受容体共受容体は、嗅覚受容体と同様に７回膜貫通構造を有する膜タンパク質であるものの、それ自身は匂い物質を認識せず、嗅覚受容体とヘテロ複合体を形成して機能する。Ｏｒｃｏファミリーとして知られている上記嗅覚受容体共受容体は、比較的高い相同性で全ての昆虫に保存されている。嗅覚受容体複合体は、匂い物質で活性化されるイオンチャンネル活性が備わっており、活性化されるとナトリウムイオン（Ｎａ＋）、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）等の陽イオンを細胞内に流入させる。 The olfactory receptor complex of insects is a heterocomplex of olfactory receptors and olfactory receptor co-receptors. The olfactory receptor of insects is a kind of G protein-coupled receptor having a 7-transmembrane structure, and its odorant has high recognition specificity. Several odorant-specific olfactory receptors are known. On the other hand, the olfactory receptor co-receptor of insects is a membrane protein having a 7-transmembrane structure like the olfactory receptor, but does not recognize an odorant by itself and forms a heterocomplex with the olfactory receptor. And work. The olfactory receptor co-receptors, known as the Orco family, are relatively highly homologous and conserved in all insects. The olfactory receptor complex has ion channel activity that is activated by odorants, and when activated, it causes cations such as sodium ion (Na + ) and calcium ion (Ca 2+ ) to flow into the cell. ..

本実施形態の嗅覚受容体複合体は、ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と、ミツバチ科昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される。 The olfactory receptor complex of the present embodiment is formed from an olfactory receptor of an insect that does not belong to the Apidae family and an olfactory receptor coreceptor of an insect of the Apidae family.

ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体としては、例えば、カ科昆虫、カイコガ科昆虫、及びショウジョウバエ科昆虫からなる群から選択される昆虫の嗅覚受容体が挙げられる。カ科の昆虫としては、例えば、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）、ネッタイイエカ（Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ）等が挙げられる。カイコガ科の昆虫としては、例えば、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍａｎｄａｒｉｎａ）、イチジクカサン（Ｔｒｉｌｏｃｈａ ｖａｒｉａｎｓ）等が挙げられる。ショウジョウバエ科の昆虫としては、例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ウスグロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ）、クロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｖｉｒｉｌｌｉｓ）等が挙げられる。 Examples of the olfactory receptor of an insect that does not belong to the Apidae family include the olfactory receptor of an insect selected from the group consisting of the mosquito family insect, the silkworm family insect, and the Drosophila family insect. Examples of insects of the mosquito family include Anopheles gambiae, Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus and the like. Examples of insects of the Bombyx family include Bombyx mori, Bombyx mandarina, and Trilocha varians. Examples of Drosophila insects include Drosophila melanogaster, Drosophila pseudoobscura, and Drosophila virilis.

嗅覚受容体の種類は、標的とするリガンドに応じて適宜選択することができる。嗅覚受容体は、１−オクテン−３−オール、ベンズアルデヒド、２，４，５−トリメチルチアゾール、ｃｉｓ−ジャスモン、及びペンチルアセテートからなる群から選択される化合物をリガンドとする嗅覚受容体であってもよい。嗅覚受容体は、具体的には、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）のＯＲ８若しくはＯＲ１０、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）のＯＲ１０若しくはＯＲ２８、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のＯＲ５６、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＯＲ４７ａであってもよい。嗅覚受容体は、上記いずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であってもよく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であってもよく、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であってもよく、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であってもよい。上記いずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と比較した場合に同一性が９０％以上であるアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であれば、アミノ酸配列を比較した元の嗅覚受容体と同程度のリガンド特異性及び検出感度が得られる傾向にある。 The type of olfactory receptor can be appropriately selected depending on the target ligand. The olfactory receptor may be an olfactory receptor whose ligand is a compound selected from the group consisting of 1-octen-3-ol, benzaldehyde, 2,4,5-trimethylthiazole, cis-jasmon, and pentyl acetate. Good. The olfactory receptors are specifically OR8 or OR10 of Aedes aegypti, OR10 or OR28 of Anopheles gambiae, OR56 of Bombyx mori, or 47 of Drosophila melanogaster. There may be. The olfactory receptor may be an olfactory receptor having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of the entire olfactory receptor, and has an amino acid sequence having 95% or more identity. It may be an olfactory receptor, an olfactory receptor having an amino acid sequence having 98% or more identity, or an olfactory receptor having an amino acid sequence having 99% or more identity. .. If the olfactory receptor has an olfactory receptor having an amino acid sequence having an identity of 90% or more when compared with the amino acid sequence of the entire olfactory receptor, the ligand having the same level as the original olfactory receptor whose amino acid sequence is compared. Specificity and detection sensitivity tend to be obtained.

ミツバチ科昆虫に由来する嗅覚受容体共受容体としては、例えば、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）、ヒメミツバチ（Ａｐｉｓ ｆｌｏｒｅａ）、オオミツバチ（Ａｐｉｓ ｄｏｒｓａｔａ）、セイヨウオオマルハナバチ（Ｂｏｍｂｕｓ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）等のミツバチ科昆虫に由来するものが挙げられる。ミツバチ科の嗅覚受容体共受容体とミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と組み合わせた複合体によれば、上記嗅覚受容体と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体と上記嗅覚受容体とから形成される嗅覚受容体複合体よりも、匂い物質に対する検出感度に優れるものとなる。 Examples of the olfactory receptor co-receptor derived from honeybee insects include honeybee (Apis mellifera), honeybee (Apis florea), honeybee (Apis dorsata), Apis dorsata (Bombus terrestris) and the like. There are those derived from. According to the complex combining the olfactory receptor co-receptor of the honeybee family and the olfactory receptor of an insect not belonging to the honeybee family, the olfactory receptor co-receptor of the same kind of insect as the olfactory receptor and the olfactory receptor of the same species It has better detection sensitivity to odorants than the olfactory receptor complex formed from.

嗅覚受容体共受容体は、セイヨウミツバチ又はその近縁種に由来する嗅覚受容体共受容体であってもよい。本明細書において「セイヨウミツバチの近縁種」とは、ミツバチ族（Ａｐｉｎｉ）のハチ、又は、シタバチ族（Ｅｕｇｌｏｓｓｉｎｉ）、マルハナバチ族 ｂｕｍｂｌｅ ｂｅｅ（Ｂｏｍｂｉｎｉ）、もしくは、ハリナシバチ族 ｓｔｉｎｇｌｅｓｓ ｂｅｅ（Ｍｅｌｉｐｏｎｉｎｉ）のハチである。これらの族のハチは、後脚脛節の外側に花粉かご ｃｏｒｂｉｃｕｌａ（ｐｏｌｌｅｎ ｂａｓｋｅｔ）を有する。セイヨウミツバチの近縁種としては、例えば、ミツバチ族に属するヒメミツバチ、及びオオミツバチ；並びに、マルハナバチ族に属するセイヨウオオマルハナバチ等が挙げられる。このような近縁種の嗅覚受容体共受容体であれば、セイヨウミツバチの嗅覚受容体共受容体とのアミノ酸配列同一性が高く、同等の機能を備える傾向にある。 The olfactory receptor co-receptor may be an olfactory receptor co-receptor derived from Western honey bee or a related species thereof. As used herein, the term "related species of Western honey bee" refers to a bee of the honey bee (Apini), or a stingless bee of the Euglossini, the bumblebee (Bombini), or the stingless bee (Mel) of the bumblebee. Is. Bees of these families have a pollen basket corbicula (pollen basket) on the outside of the hind limb tibia. Examples of closely related species of Western honey bee include honey bee and Apis dorsata belonging to the honey bee family; and bumblebee bumblebee belonging to the bumblebee family. Such closely related olfactory receptor co-receptors have high amino acid sequence identity with the olfactory receptor co-receptors of Western honey bee and tend to have equivalent functions.

嗅覚受容体共受容体は、セイヨウミツバチの嗅覚受容体共受容体のアミノ酸配列（配列番号１に記載のアミノ酸配列）と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質であってもよく、９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質であってもよく、９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質であってもよく、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質であってもよい。配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質であれば、セイヨウミツバチの嗅覚受容体共受容体と同様に、ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と組み合わせて複合体を形成させることで、上記嗅覚受容体と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体と上記嗅覚受容体とから形成される嗅覚受容体複合体よりも、匂い物質に対する検出感度に優れるものとなる傾向にある。 The olfactory receptor co-receptor has an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of the olfactory receptor co-receptor of the honeybee (the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1), and is an insect olfactory receptor. It may be a protein that has the ability to couple with the body to allow cations to flow into cells, has an amino acid sequence with 95% or more identity, and couples with insect olfactory receptors to produce cations. It may be a protein that has the ability to flow into cells, has an amino acid sequence having 98% or more identity, and has the ability to allow cations to flow into cells in conjugation with insect olfactory receptors. It may be a protein, or it may be a protein having an amino acid sequence having 99% or more identity and having an ability to allow cations to flow into a cell in conjugation with an insect olfactory receptor. Any protein having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having the ability to allow cations to flow into cells in conjugation with the olfactory receptor of insects. Similar to the olfactory receptor co-receptors of honeybees, by forming a complex in combination with the olfactory receptors of insects that do not belong to the family Bee, the olfactory receptor co-receptors of insects of the same species as the above-mentioned olfactory receptors and the above It tends to be more sensitive to odorants than the olfactory receptor complex formed from olfactory receptors.

配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質としては、例えば、ヒメミツバチの嗅覚受容体共受容体（同一性９９％）、オオミツバチの嗅覚受容体共受容体（同一性９８％）、セイヨウオオマルハナバチの嗅覚受容体共受容体（同一性９１％）等が挙げられる。 Examples of proteins having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having the ability to induce cations to flow into cells in conjugation with an olfactory receptor for insects include, for example. The olfactory receptor co-receptor of the bee (99% identity), the olfactory receptor co-receptor of the bee (98% identity), the olfactory receptor co-receptor of the Japanese bee (91% identity), etc. Can be mentioned.

本実施形態の嗅覚受容体複合体は、嗅覚受容体と嗅覚受容体共受容体とが１：１の割合で相互作用して複合体を形成している。嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体は、それぞれ１つずつから複合体が形成されてもよく、それぞれ２つずつから複合体が形成されてもよく、それぞれ４つずつから複合体が形成されてもよい。 In the olfactory receptor complex of the present embodiment, the olfactory receptor and the olfactory receptor co-receptor interact at a ratio of 1: 1 to form a complex. The olfactory receptor and the olfactory receptor co-receptor may be formed from one each, a complex may be formed from two each, and a complex may be formed from four each. You may.

本実施形態の嗅覚受容体複合体は、嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体を同じ細胞の細胞膜に同時に発現させ、場合によって精製する方法、又は、嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体をそれぞれ別の細胞で発現させ、精製した後に混合する方法等により調製することができる。嗅覚受容体及び嗅覚受容体共受容体を細胞で発現させる方法は、特に限定されるものではなく公知の方法を用いることができる。このような方法としては、例えば、上記嗅覚受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドと、上記嗅覚受容体共受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドとを細胞に導入してこれらを発現させる方法がある。この際、上記嗅覚受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドと、上記嗅覚受容体共受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドとを同じ細胞に導入することで、嗅覚受容体複合体として直接調製することもできる。細胞に各種プラスミドが導入されたことは、ＰＣＲ等の方法により確認することができる。細胞で発現させた嗅覚受容体、嗅覚受容体共受容体、又は嗅覚受容体複合体は、細胞膜を可溶化した後、各種精製用カラムに供することにより精製することができる。 The olfactory receptor complex of the present embodiment is a method of simultaneously expressing and purifying the olfactory receptor and the olfactory receptor co-receptor on the cell membrane of the same cell, or the olfactory receptor and the olfactory receptor co-receptor. It can be prepared by a method of expressing each in different cells, purifying and then mixing. The method for expressing the olfactory receptor and the olfactory receptor co-receptor in cells is not particularly limited, and a known method can be used. As such a method, for example, an expression plasmid incorporating the DNA encoding the olfactory receptor and an expression plasmid incorporating the DNA encoding the olfactory receptor co-receptor are introduced into cells and these are used. There is a way to express. At this time, by introducing the expression plasmid incorporating the DNA encoding the olfactory receptor and the expression plasmid incorporating the DNA encoding the olfactory receptor co-receptor into the same cell, the olfactory receptor complex is incorporated. It can also be prepared directly as a body. It can be confirmed by a method such as PCR that various plasmids have been introduced into the cells. The olfactory receptor, olfactory receptor co-receptor, or olfactory receptor complex expressed in cells can be purified by solubilizing the cell membrane and then subjecting it to various purification columns.

本実施形態の嗅覚受容体複合体によれば、当該複合体を構成する嗅覚受容体と同種の昆虫の嗅覚受容体共受容体と上記嗅覚受容体とから形成される嗅覚受容体複合体よりも匂い物質に対する検出感度に優れる。このような特性を有する嗅覚受容体複合体は、より低濃度の匂い物質を検出することができる嗅覚センサーとして有用である。 According to the olfactory receptor complex of the present embodiment, the olfactory receptor complex formed from the olfactory receptor coreceptors of insects of the same type as the olfactory receptors constituting the complex and the above-mentioned olfactory receptors is higher than that of the olfactory receptor complex. Excellent detection sensitivity to olfactory substances. An olfactory receptor complex having such properties is useful as an olfactory sensor capable of detecting a lower concentration of an odorant substance.

本実施形態の細胞は、上記嗅覚受容体複合体を発現する。すなわち、本実施形態の細胞は、その細胞内において、ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体とミツバチ科昆虫の嗅覚共受容体とを発現し、それにより細胞膜上において本実施形態の嗅覚受容体複合体を発現する。 The cells of this embodiment express the olfactory receptor complex. That is, the cell of the present embodiment expresses the olfactory receptor of an insect not belonging to the honeybee family and the olfactory coceptor of the honeybee family insect in the cell, thereby expressing the olfactory receptor of the present embodiment on the cell membrane. Express the complex.

本実施形態の細胞は、嗅覚受容体複合体の調製方法と同様に、嗅覚受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドと、嗅覚受容体共受容体をコードするＤＮＡを組み入れた発現用プラスミドとを同じ細胞に導入することで調製することができる。発現プラスミドを導入する細胞としては、発現プラスミドの種類に応じて適宜選択することができる。細胞としては、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２等の大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＩ１１４等のバチルス属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２等の酵母、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ 由来の Ｓｆ細胞系もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来のＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞系等の昆虫細胞、ＣＯＳ７細胞等の動物細胞等を挙げることができる。動物細胞としては、好ましくは、哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＰＣ１２細胞、Ｎ１Ｅ−１１５細胞、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞等が挙げられる。 The cells of the present embodiment have an expression plasmid incorporating a DNA encoding an olfactory receptor and an expression plasmid incorporating a DNA encoding an olfactory receptor co-receptor, similar to the method for preparing an olfactory receptor complex. Can be prepared by introducing and into the same cell. The cell into which the expression plasmid is introduced can be appropriately selected depending on the type of the expression plasmid. The cells include, for example, Escherichia coli K12 and other Escherichia coli, Bacillus subtilis MI114 and other Bacillus bacteria, Saccharomyces cerevisiae AH22 and other yeast, Spodoptera frugiperda-derived Insect-derived SiFi cell line-derived Sif cells from Examples include animal cells such as cells. Examples of the animal cells are preferably cultured cells derived from mammals, specifically, COS7 cells, CHO cells, HEK293 cells, HEK293FT cells, Hela cells, PC12 cells, N1E-115 cells, SH-SY5Y cells and the like. Be done.

以下、実施例に基づき本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be specifically described based on Examples. However, the present invention is not limited to the following examples.

本実施例に記載の昆虫は以下のとおりである。
ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ：以下、「ハマダラカ」又は「Ａｇ」という場合もある。）
ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ：以下、「シマカ」又は「Ａａ」という場合もある。）
キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ：以下、「ショウジョウバエ」又は「Ｄｍ」という場合もある。）
セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ：以下、「ミツバチ」又は「Ａｍ」という場合もある。）
カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ：以下、「カイコガ」又は「Ｂｍ」という場合もある。） The insects described in this example are as follows.
Anopheles gambiae (hereinafter, may also be referred to as "Anopheles gambiae" or "Ag")
Aedes aegypti (hereinafter, also referred to as "shimaka" or "Aa")
Drosophila melanogaster (hereinafter, also referred to as "Drosophila" or "Dm")
Western honey bee (Apis mellifera: hereinafter, also referred to as "honey bee" or "Am")
Bombyx mori (Bombyx mori: hereinafter, also referred to as "silkworm" or "Bm")

＜共受容体の発現プラスミドの作製＞
ハマダラカ共受容体（以下、ＡｇＯＲＣＯという場合もある。）の発現プラスミド
ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）Ｋｉｓｕｍ系統又はＧ３系統の頭部を液体窒素で凍結させた後、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を加えて液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いて破砕した。得られた破砕物から、ＴＲＩｚｏｌ試薬に添付の説明書に従いＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、当該キットに添付された説明書に従って精製した。得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型にし、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温することにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ1μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡｇＯｒｃｏ−５’（5’-caccatgcaagtccagccgaccaagtacgtcggcct；配列番号２）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｇＯｒｃｏ−３’（5’-ttacttcagctgcaccagcaccatgaagt；配列番号３）１μＬ及びＫＯＤ ＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、５分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．４ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＡｇＯｒｃｏと名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＡｇＯｒｃｏ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号４で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号４で示される塩基配列は配列番号５で示されるアミノ酸配列をコードする。 <Preparation of co-receptor expression plasmid>
Expression plasmid of Anopheles gambia co-receptor (hereinafter, also referred to as AgORCO) After freezing the head of Anopheles gambiae Kisum strain or G3 strain with liquid nitrogen, add TRIzol (manufactured by Invitrogen). It was crushed using a milk bowl and a milk stick in the presence of liquid nitrogen. RNA was extracted from the obtained crushed product according to the instructions attached to the TRIzol reagent. The extracted RNA was purified using an RNA purification kit (RNeasy Mini Kit; manufactured by QIAGEN) according to the instructions attached to the kit. Using the obtained Total RNA as a template, Super Script III reverse transcriptase (manufactured by Invitrogen) was added, and the mixture was kept warm at 55 ° C. for 50 minutes and then at 75 ° C. for 15 minutes to carry out a reverse transcription reaction to obtain cDNA. .. Using 1 μL of the obtained cDNA as a template, 10 μM forward primer AgOrco-5'(5'-caccatgcaagtccagccgaccaagtacgtcggcct; SEQ ID NO: 2) 1 μL, 10 μM reverse primer AgOrco-3'(5'-ttacttcagctgcaccagcaccatgaagt; SEQ ID NO: 3) 1 μL PCR was performed using 1 μL of Plus DNA polymerase (manufactured by Toyobo). The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 5 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 60 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1.5 minutes, and (2) to (4). ) Was repeated for 35 cycles. After electrophoresis of the obtained PCR product on an agarose gel, about 1.4 kb of DNA detected on the gel was recovered. The recovered DNA was introduced into a pENTR / D-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) to obtain a plasmid named pENTR-AgOrco. 4 μL of pENTR-AgOrco, 1 μL of pcDNA6.2V5-DEST and 2 μL of LR Chronase II (manufactured by Invitrogen) were mixed and kept at room temperature for 1 hour. The obtained mixture was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA6.2-AgOrco. When the nucleotide sequence of the expression plasmid pcDNA6.2-AgOrco was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5.

ショウジョウバエ共受容体（以下、ＤｍＯＲＣＯという場合もある。）の発現プラスミド
ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）成虫ＲＮＡ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を鋳型に用いて、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温することにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＤｍＯｒｃｏ−５’（5’-caccatgacaacctcgatgcagccgagcaagt；配列番号６）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＤｍＯｒｃｏ−３’（5’-ttacttgagctgcaccagcaccataaagt；配列番号７）１μＬ及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（３）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＤｍＯｒｃｏと名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＤｍＯｒｃｏ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号８で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号８で示される塩基配列は配列番号９で示されるアミノ酸配列をコードする。 Expression plasmid of Drosophila co-receptor (hereinafter, also referred to as DmORCO) Using adult Drosophila (Drosophila melanogaster) RNA (manufactured by TAKARA) as a template, Super Script III reverse transcriptase (manufactured by Invitrogen) was added. The reverse transcription reaction was carried out by keeping the temperature at 55 ° C. for 50 minutes and then at 75 ° C. for 15 minutes to obtain cDNA. Using 1 μL of the obtained cDNA as a template, 10 μM forward primer DmOrco-5'(5'-caccatgacaacctcgatgcagccgagcaagt; SEQ ID NO: 6) 1 μL, 10 μM reverse primer DmOrco-3'(5'-ttacttgagctgcaccagcaccataaagt; SEQ ID NO: 7) 1 μL PCR was performed using 1 μL of Plus neo DNA polymerase (manufactured by Toyobo). The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 68 ° C. for 1.5 minutes, and the steps (2) to (3) were repeated for 35 cycles. .. After electrophoresis of the obtained PCR product on an agarose gel, about 1.5 kb of DNA detected on the gel was recovered. The recovered DNA was introduced into a pENTR / D-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) to obtain a plasmid named pENTR-DmOrco. 4 μL of pENTR-DmOrco, 1 μL of pcDNA6.2V5-DEST and 2 μL of LR Chronase II (manufactured by Invitrogen) were mixed and kept at room temperature for 1 hour. The obtained mixture was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA6.2-DmOrco. When the nucleotide sequence of the expression plasmid pcDNA6.2-DmOrco was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9.

シマカ共受容体（以下、ＡａＯＲＣＯという場合もある。）の発現プラスミド
ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）の頭部を液体窒素で凍結させた後、ＴＲＩｚｏｌ（インビトロジェン社製）を加えて液体窒素存在下で乳鉢と乳棒を用いて破砕した。得られた破砕物から、ＴＲＩｚｏｌ試薬に添付の説明書に従いＲＮＡを抽出した。抽出されたＲＮＡを、ＲＮＡ精製キット（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、当該キットに添付された説明書に従って精製した。得られたＴｏｔａｌ ＲＮＡを鋳型にし、Ｓｕｐｅｒ Ｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（インビトロジェン社製）を添加し、５５℃で５０分間、次いで７５℃で１５分間保温することにより逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。得られたｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯｒｃｏ−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgtccaaccgacaaagtacc；配列番号１０）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯｒｃｏ−３’（5’-gccactgtgctggatttatttcaactgcaccaacacc；配列番号１１）１μＬ及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１２で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１２で示される塩基配列は配列番号１３で示されるアミノ酸配列をコードする。 Expression plasmid of Aedes aegypti (hereinafter sometimes referred to as AaORCO) After freezing the head of Aedes aegypti with liquid nitrogen, add TRIzol (manufactured by Invitrogen) to a dairy pot in the presence of liquid nitrogen. It was crushed using a milk stick. RNA was extracted from the obtained crushed product according to the instructions attached to the TRIzol reagent. The extracted RNA was purified using an RNA purification kit (RNeasy Mini Kit; manufactured by QIAGEN) according to the instructions attached to the kit. Using the obtained Total RNA as a template, Super Script III reverse transcriptase (manufactured by Invitrogen) was added, and the mixture was kept warm at 55 ° C. for 50 minutes and then at 75 ° C. for 15 minutes to carry out a reverse transcription reaction to obtain cDNA. .. Using 1 μL of the obtained cDNA as a template, 10 μM forward primer AaOrco-5'(5'-tggaattctgcagatcaccatgaacgtccaaccgacaaagtacc; SEQ ID NO: 10) 1 μL, 10 μM reverse primer AaOrco-3'(5'-gccactgtgctggatttatttcaactgcaccaaccc); PCR was performed using 1 μL of Plus neo DNA polymerase (manufactured by Toyobo). The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 63 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1.5 minutes, and (2) to (4). ) Was repeated for 35 cycles. The obtained PCR product was ligated to EcoRV-digested pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA). Then, this was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA3.11-AaOrco. When the nucleotide sequence of the expression plasmid pcDNA3.1-AaOrco was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 12 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13.

ミツバチ共受容体（以下、ＡｍＯＲＣＯという場合もある。）の発現プラスミド
いずれか一方のＤＮＡ鎖に配列番号１４で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡｍＯｒｃｏ−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaagttcaagcaacaagggctaa；配列番号１５）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｍＯｒｃｏ−３’（5’-gccactgtgctggattcacttcagttgcaccaacaccatgaa；配列番号１６）１μＬ及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡｍＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡｍＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１４で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１４で示される塩基配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列をコードする。 Expression plasmid of honeybee co-receptor (hereinafter, also referred to as AmORCO) Double-stranded DNA having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 14 on one of the DNA strands was synthesized. Using 100 ng of the obtained DNA as a template, 10 μM forward primer AmOrco-5'(5'-tggaattctgcagatcaccatgaagttcaagcaacaagggctaa; SEQ ID NO: 15) 1 μL, 10 μM reverse primer AmOrco-3'(5'-gccactgtgctggattcacttcagttgcacac) PCR was performed using 1 μL of Plus neo DNA polymerase (manufactured by Toyobo). The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 63 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1.5 minutes, and (2) to (4). ) Was repeated for 35 cycles. The obtained PCR product was ligated to EcoRV-digested pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA). Then, this was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA3.1-AmOrco. When the nucleotide sequence of the expression plasmid pcDNA3.1-AmOrco was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.

カイコガ共受容体（以下、ＢｍＯＲＣＯという場合もある。）の発現プラスミド
いずれか一方のＤＮＡ鎖に配列番号１７で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。得られたＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＢｍＯｒｃｏ−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgatgaccaaggtcaagacgcagggcct；配列番号１８）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＢｍＯｒｃｏ−３’（5’-gccactgtgctggatctacttcagttggatcaacaccatga；配列番号１９）１μＬ及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＢｍＯｒｃｏと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＢｍＯｒｃｏの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号１７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号１７で示される塩基配列は配列番号２０で示されるアミノ酸配列をコードする。 Expression plasmid of silkworm co-receptor (hereinafter, also referred to as BmORCO) Double-stranded DNA having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 17 on one of the DNA strands was synthesized. Using 100 ng of the obtained DNA as a template, 10 μM forward primer BmOrco-5'(5'-tggaattctgcagatcaccatgatgaccaaggtcaagacgcagggcct; SEQ ID NO: 18) 1 μL, 10 μM reverse primer BmOrco-3'(5'-gccactgtgctggatctacttcagtt) PCR was performed using 1 μL of Plus neo DNA polymerase (manufactured by Toyobo). The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 63 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1.5 minutes, and (2) to (4). ) Was repeated for 35 cycles. The obtained PCR product was ligated to EcoRV-digested pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA). Then, this was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA3.1-BmOrco. When the base sequence of the expression plasmid pcDNA3.1-BmOrco was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the base sequence shown by SEQ ID NO: 17. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 20.

＜嗅覚受容体の発現プラスミドの作製＞
シマカ嗅覚受容体ＯＲ８（以下、ＡａＯＲ８という場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたシマカ頭部由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯＲ８−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaacgacctggtgaagtttgagt；配列番号２１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯＲ８−３’（5’-gccactgtgctggattcacttctgacttggttcatagatggt；配列番号２２）１μＬ及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３０サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ８と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ８の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号２３で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号２３で示される塩基配列は配列番号２４で示されるアミノ酸配列をコードする。 <Preparation of olfactory receptor expression plasmid>
Expression plasmid of Shimaka olfactory receptor OR8 (hereinafter, also referred to as AaOR8) Using 1 μL of PCR from the head of Shimaka prepared by the above method as a template, 10 μM forward primer AaOR8-5'(5'-tggaattctgcagatcaccatgaacgacctggtgaagtttgagt; sequence No. 21) PCR was performed using 1 μL of 1 μL and 10 μM of reverse primer AaOR8-3'(5'-gccactgtgctggattcacttctgacttggttcatagatggt; SEQ ID NO: 22) 1 μL and KOD Plus neoDNA polymerase (manufactured by Toyobo) 1 μL. The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 68 ° C. for 1 minute, and the steps (2) to (4) were repeated for 30 cycles. The obtained PCR product was ligated to EcoRV-digested pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA). Then, this was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA3.11-AaOR8. When the base sequence of the expression plasmid pcDNA3.1-AaOR8 was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the base sequence shown by SEQ ID NO: 23. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 24.

シマカ嗅覚受容体ＯＲ１０（以下、ＡａＯＲ１０という場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたシマカ頭部由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡａＯＲ１０−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatggcaagcattcttgattgcccg；配列番号２５）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡａＯＲ１０−３’（5’-gccactgtgctggatttaattataaacccgacgcagcag；配列番号２６）１μＬ及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）にＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ１０と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＡａＯＲ１０の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号２７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号２７で示される塩基配列は配列番号２８で示されるアミノ酸配列をコードする。 Expression plasmid of Shimaka olfactory receptor OR10 (hereinafter, also referred to as AaOR10) Using 1 μL of PCR from the head of Shimaka prepared by the above method as a template, 10 μM forward primer AaOR10-5'(5'-tggaattctgcagatcaccatggcaagcattcttgattgcccg; sequence No. 25) PCR was performed using 1 μL of 1 μL and 10 μM of reverse primer AaOR10-3'(5'-gccactgtgctggatttaattataaacccgacgcagcag; SEQ ID NO: 26) 1 μL and KOD Plus neoDNA polymerase (manufactured by Toyobo) 1 μL. The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 63 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1.5 minutes, and (2) to (4). ) Was repeated for 35 cycles. The obtained PCR product was ligated to EcoRV-digested pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA). Then, this was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA3.11-AaOR10. When the base sequence of the expression plasmid pcDNA3.1-AaOR10 was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the base sequence shown by SEQ ID NO: 27. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 27 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 28.

ハマダラカ嗅覚受容体ＯＲ１０（以下、ＡｇＯＲ１０という場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたハマダラカ頭部由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡｇＯＲ１０−５’（5’-caccatggaggtcctcaactgtccgctact；配列番号２９）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｇＯＲ１０−３’（5’-ttaattgtaaactcttctcagaagcgtaa；配列番号３０）１μＬ及びＫＯＤ ＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、５分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．１ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＡｇＯＲ１０と名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＡｇＯＲ１０、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯＲ１０と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯＲ１０の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号３１で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号３１で示される塩基配列は配列番号３２で示されるアミノ酸配列をコードする。 Expression plasmid of Anopheles olfactory receptor OR10 (hereinafter, also referred to as AgOR10) Using 1 μL of cDNA from the head of Anopheles mosquito prepared by the above method as a template, 10 μM forward primer AgOR10-5'(5'-caccatggaggtcctcaactgtccgctact; sequence) No. 29) PCR was performed using 1 μL of 1 μL and 10 μM of reverse primer AgOR10-3'(5'-ttaattgtaaactcttctcagaagcgtaa; SEQ ID NO: 30) and 1 μL of KOD Plus DNA polymerase (Toyobo). The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 5 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 60 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1.5 minutes, and (2) to (4). ) Was repeated for 35 cycles. After electrophoresis of the obtained PCR product on an agarose gel, about 1.1 kb of DNA detected on the gel was recovered. The recovered DNA was introduced into a pENTR / D-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) to obtain a plasmid named pENTR-AgOR10. 4 μL of pENTR-AgOR10, 1 μL of pcDNA6.2V5-DEST and 2 μL of LR Chronase II (manufactured by Invitrogen) were mixed and kept at room temperature for 1 hour. The obtained mixture was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA6.22-AgOR10. When the base sequence of the expression plasmid pcDNA6.2-AgOR10 was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the base sequence shown by SEQ ID NO: 31. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 31 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 32.

ハマダラカ嗅覚受容体ＯＲ２８（以下、ＡｇＯＲ２８という場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたハマダラカ頭部由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、
１０μＭのフォワードプライマーＡｇＯＲ２８−５’（5’-caccatggcccgtttggtactgcacgaggt；配列番号３３）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡｇＯＲ２８−３’（5’-ttattgctgattgatggtttgcagtaagg；配列番号３４）１μＬ及びＫＯＤ ＰｌｕｓＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、５分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．３ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＡｇＯＲ２８と名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＡｇＯＲ１０、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯＲ２８と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＡｇＯＲ２８の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号３５で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号３５で示される塩基配列は配列番号３６で示されるアミノ酸配列をコードする。 Expression plasmid of Anopheles olfactory receptor OR28 (hereinafter, also referred to as AgOR28) Using 1 μL of cDNA from Anopheles mosquito head prepared by the above method as a template.
10 μM forward primer AgOR28-5'(5'-caccatggcccgtttggtactgcacgaggt; SEQ ID NO: 33) 1 μL, 10 μM reverse primer AgOR28-3'(5'-ttattgctgattgatggtttgcagtaagg; SEQ ID NO: 34) 1 μL and KOD Plus DNA polymerase (Toyobo) PCR was performed. The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 5 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 60 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1.5 minutes, and (2) to (4). ) Was repeated for 35 cycles. After electrophoresis of the obtained PCR product on an agarose gel, about 1.3 kb of DNA detected on the gel was recovered. The recovered DNA was introduced into a pENTR / D-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) to obtain a plasmid named pENTR-AgOR28. 4 μL of pENTR-AgOR10, 1 μL of pcDNA6.2V5-DEST and 2 μL of LR Chronase II (manufactured by Invitrogen) were mixed and kept at room temperature for 1 hour. The obtained mixture was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA6.22-AgOR28. When the base sequence of the expression plasmid pcDNA6.2-AgOR28 was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the base sequence shown by SEQ ID NO: 35. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 35 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 36.

カイコガ嗅覚受容体ＯＲ５６（以下、ＢｍＯＲ５６という場合もある。）の発現プラスミド
いずれか一方のＤＮＡ鎖に配列番号３７で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡを合成した。配列番号３７で示される塩基配列を有する二本鎖ＤＮＡ１００ｎｇを鋳型に用いて、１０μＭのフォワードプライマーＢｍＯＲ５６−５’（5’-tggaattctgcagatcaccatgaagctcctggagaagctag；配列番号３８）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＢｍＯＲ５６−３’（5’-gccactgtgctggattcatgttttattcatttgcgactgac；配列番号３９）１μＬ及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６３℃、３０秒間、（４）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＶで消化されたｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を使用して連結した。その後、これを大腸菌へ導入して培養することにより、ｐｃＤＮＡ３．１−ＢｍＯＲ５６と名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＢｍＯＲ５６の塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号３７で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号３７で示される塩基配列は配列番号４０で示されるアミノ酸配列をコードする。 Expression plasmid of Bombyx mori olfactory receptor OR56 (hereinafter, also referred to as BmOR56) A double-stranded DNA having the nucleotide sequence shown by SEQ ID NO: 37 on one of the DNA strands was synthesized. Using 100 ng of double-stranded DNA having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 37 as a template, 10 μM forward primer BmOR56-5'(5'-tggaattctgcagatcaccatgaagctcctggagaagctag; SEQ ID NO: 38) 1 μL, 10 μM reverse primer BmOR56-3'(5') PCR was performed using 1 μL of'-gccactgtgctggattcatgttttattcatttgcgactgac; SEQ ID NO: 39) and 1 μL of KOD Plus neoDNA polymerase (Toyobo). The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 63 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1.5 minutes, and (2) to (4). ) Was repeated for 35 cycles. The obtained PCR product was ligated to EcoRV-digested pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) using an In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA). Then, this was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA3.1-BmOR56. When the base sequence of the expression plasmid pcDNA3.1-BmOR56 was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the base sequence shown by SEQ ID NO: 37. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 37 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40.

ショウジョウバエ嗅覚受容体ＯＲ４７ａ（以下、ＤｍＯＲ４７ａという場合もある。）の発現プラスミド
上記方法により調製されたショウジョウバエ由来のｃＤＮＡ１μＬを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＤｍＯＲ４７ａ−５’（5’-caccatggacagttttctgcaagtacagaaga；配列番号４１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＤｍＯＲ４７ａ−３’（5’-ttaggagaatgatctcagcattgtgatgta；配列番号４２）１μＬ及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９４℃、２分間、（２）９８℃、１０秒間、（３）６８℃、１．５分間で行い、（２）〜（３）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約１．５ｋｂのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へクローニングし、ｐＥＮＴＲ−ＤｍＯＲ４７ａと名付けたプラスミドを得た。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＤｍＯＲ４７ａ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合して室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し培養することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯＲ４７ａと名付けた発現プラスミドを得た。発現プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＤｍＯＲ４７ａの塩基配列をＤＮＡシーケンサーにより解析したところ、配列番号４３で示される塩基配列を含有することが判った。配列番号４３で示される塩基配列は配列番号４４で示されるアミノ酸配列をコードする。 Expression plasmid of Drosophila olfactory receptor OR47a (hereinafter, also referred to as DmOR47a) Using 1 μL of Drosophila-derived cDNA prepared by the above method as a template, 10 μM forward primer DmOR47a-5'(5'-caccatggacagttttctgcaagtacagaaga; SEQ ID NO: 41) ) PCR was performed using 1 μL of 1 μL and 10 μM reverse primer DmOR47a-3'(5'-ttaggagaatgatctcagcattgtgatgta; SEQ ID NO: 42) 1 μL and KOD Plus neo DNA polymerase (manufactured by Toyo Boseki) 1 μL. The PCR reaction was carried out at (1) 94 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 10 seconds, (3) 68 ° C. for 1.5 minutes, and the steps (2) to (3) were repeated for 35 cycles. .. After electrophoresis of the obtained PCR product on an agarose gel, about 1.5 kb of DNA detected on the gel was recovered. The recovered DNA was cloned into a pENTR / D-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) to obtain a plasmid named pENTR-DmOR47a. 4 μL of pENTR-DmOR47a, 1 μL of pcDNA6.2V5-DEST and 2 μL of LR Chronase II (manufactured by Invitrogen) were mixed and kept at room temperature for 1 hour. The obtained mixture was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain an expression plasmid named pcDNA6.2-DmOR47a. When the base sequence of the expression plasmid pcDNA6.2-DmOR47a was analyzed by a DNA sequencer, it was found to contain the base sequence shown by SEQ ID NO: 43. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 43 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 44.

＜イクオリン（Ａｅｑｕｏｒｉｎ）発現プラスミドの作製＞
Ａｅｑｕｏｒｉｎをコードする配列番号４５で示される塩基配列がｐＭＤ１９ベクターにクローニングされたプラスミド（ｐＭＤ１９−ＡＥＱ）５０ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＡＥＱ−５’（5’-caccatgacaagcaaacaatactc；配列番号４６）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＡＥＱ−３’（5’-ttaggggacagctccaccgtag；配列番号４７）１μＬ及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９５℃、３分間、（２）９５℃、３０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約６００ｂｐのＤＮＡを回収した。回収されたＤＮＡをｐＥＮＴＲ／Ｄ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン社製）へ導入し、ｐＥＮＴＲ−ＡＥＱと名付けたプラスミドを得た。配列番号４５で示される塩基配列は配列番号４８で示されるアミノ酸配列をコードする。４μＬのｐＥＮＴＲ−ＡＥＱ、１μＬのｐｃＤＮＡ６．２Ｖ５−ＤＥＳＴ及び２μＬのＬＲクロナーゼＩＩ（インビトロジェン社製）を混合し室温で１時間保持した。得られた混合物を大腸菌へ導入し増幅することにより、ｐｃＤＮＡ６．２−ＡＥＱと名付けたプラスミドを得た。プラスミドｐｃＤＮＡ６．２−ＡＥＱ１００ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＡＥＱ−５’（5’-gtggcggccgctcgaggccaccatgacaagcaaacaatactc；配列番号４９）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＡＥＱ−３’（5’-gccctctagactcgagttaggggacagctccaccgtag；配列番号５０）１μＬ及びＫＯＤ ｎｅｏ Ｐｌｕｓ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９５℃、３分間、（２）９５℃、３０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約６００ｂｐのＤＮＡを回収してこれをインサートＤＮＡ１とした。ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）をＸｈｏＩで消化したものをベクターとして用い、これに上記インサートＤＮＡ１をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて連結した。その後、これを大腸菌へ導入し培養することによりｐｃＤＮＡ３．１−ＡＥＱと名付けたプラスミドを得た。ｐｃＤＮＡ６．２−ＡＥＱ５０ｎｇを鋳型に用い、１０μＭのフォワードプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＡＥＱ−５’（5’-gtggcggccgctcgaggccaccatgacaagcaaacaatactc；配列番号５１）１μＬ、１０μＭのリバースプライマーＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＡＥＱ−３’（5’-gccctctagactcgagttaggggacagctccaccgtag；配列番号５２）１μＬ及びＫＯＤ Ｐｌｕｓ ｎｅｏ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）１μＬを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、（１）９５℃、３分間、（２）９５℃、３０秒間、（３）６０℃、３０秒間、（４）６８℃、１分間で行い、（２）〜（４）の工程は３５サイクル繰り返し行った。得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動した後、当該ゲル上で検出された約６００ｂｐのＤＮＡを回収してこれをインサートＤＮＡ２とした。ｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇｒｏ）（インビトロジェン社製）をＸｈｏＩで消化したものをベクターとして用い、これに上記インサートＤＮＡ２をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（ＴＡＫＡＲＡ社製）を用いて連結した後、大腸菌へ導入し培養することによりｐｃＤＮＡ３．１（ｈｙｇｒｏ）−ＡＥＱと名付けた発現プラスミドを得た。 <Preparation of Aequorin expression plasmid>
Using 50 ng of a plasmid (pMD19-AEQ) in which the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 45 encoding Aequorin was cloned into the pMD19 vector as a template, 10 μM forward primer AEQ-5'(5'-caccatgacaagcaaacaatactc; SEQ ID NO: 46) 1 μL PCR was performed using 1 μL of 10 μM reverse primer AEQ-3'(5'-ttaggggacagctccaccgtag; SEQ ID NO: 47) and 1 μL of KOD Plus neoDNA polymerase (manufactured by Toyo Boseki). The PCR reaction was carried out at (1) 95 ° C. for 3 minutes, (2) 95 ° C. for 30 seconds, (3) 60 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1 minute, and (2) to (4). The process was repeated for 35 cycles. After electrophoresis of the obtained PCR product on an agarose gel, about 600 bp of DNA detected on the gel was recovered. The recovered DNA was introduced into a pENTR / D-TOPO vector (manufactured by Invitrogen) to obtain a plasmid named pENTR-AEQ. The nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 45 encodes the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 48. 4 μL of pENTR-AEQ, 1 μL of pcDNA6.2V5-DEST and 2 μL of LR Chronase II (manufactured by Invitrogen) were mixed and kept at room temperature for 1 hour. The resulting mixture was introduced into E. coli and amplified to give a plasmid named pcDNA6.2-AEQ. Using the plasmid pcDNA6.2-AEQ100ng as a template, 10 μM forward primer In-Fusion AEQ-5'(5'-gtggcggccgctcgaggccaccatgacaagcaaacaatactc; SEQ ID NO: 49) 1 μL, 10 μM reverse primer In-Fusion AEQ-3'(5'-gcccctagctagc PCR was performed using 1 μL of SEQ ID NO: 50) and 1 μL of KOD neo Plus DNA polymerase (manufactured by Toyobo). The PCR reaction was carried out at (1) 95 ° C. for 3 minutes, (2) 95 ° C. for 30 seconds, (3) 60 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1 minute, and (2) to (4). The process was repeated for 35 cycles. After electrophoresing the obtained DNA on an agarose gel, about 600 bp of DNA detected on the gel was recovered and used as insert DNA1. A vector obtained by digesting pcDNA3.1 (manufactured by Invitrogen) with XhoI was used as a vector, and the above-mentioned insert DNA1 was ligated to this using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA). Then, this was introduced into Escherichia coli and cultured to obtain a plasmid named pcDNA3.1-AEQ. Using PCR6.2-AEQ50ng as a template, 10 μM forward primer In-Fusion AEQ-5'(5'-gtggcggccgctcgaggccaccatgacaagcaaacaatactc; SEQ ID NO: 51) 1 μL, 10 μM reverse primer In-Fusion AEQ-3'(5'-gccctctagacct PCR was performed using 1 μL of SEQ ID NO: 52) and 1 μL of KOD Plus neo DNA polymerase (manufactured by Toyobo). The PCR reaction was carried out at (1) 95 ° C. for 3 minutes, (2) 95 ° C. for 30 seconds, (3) 60 ° C. for 30 seconds, (4) 68 ° C. for 1 minute, and (2) to (4). The process was repeated for 35 cycles. After electrophoresing the obtained DNA on an agarose gel, about 600 bp of DNA detected on the gel was recovered and used as insert DNA2. A vector obtained by digesting pcDNA3.1 (hygro) (manufactured by Invitrogen) with XhoI was used as a vector, and the above insert DNA2 was ligated to this using In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by TAKARA) and then introduced into Escherichia coli. By culturing, an expression plasmid named pcDNA3.1 (hygro) -AEQ was obtained.

＜発現プラスミドの細胞への導入＞
ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）を１０ｃｍシャーレに３×１０６ｃｅｌｌｓ／シャーレで播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて約２４時間培養した。作製したいずれかの共受容体発現プラスミド３μｇと、作製したいずれかの嗅覚受容体発現プラスミド１．５μｇと、Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド８μｇとを、１２．５μＬのＰｌｕｓ試薬及び３１．２５μＬのリポフェクトアミンＬＴＸ（インビトロジェン社製）と混合し、３０分間保持した。その後、この混合液を上記細胞にトランスフェクションした。トランスフェクション開始４時間後に９６ｗｅｌｌプレートに９×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地（ナカライテスク社製）中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下にて約２４時間培養した。これにより、共受容体発現プラスミド、嗅覚受容体発現プラスミド及びＡｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミドが導入されたトランジェントな形質転換細胞を得た。 <Introduction of expression plasmid into cells>
HEK293FT cells (purchased from Invitrogen) were seeded in a 10 cm petri dish at 3 × 10 6 cells / petri dish in DMEM medium (manufactured by Nacalai Tesque) containing 10% FBS under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. It was cultured for about 24 hours. 3 μg of any of the prepared co-receptor expression plasmids, 1.5 μg of any of the prepared olfactory receptor expression plasmids, and 8 μg of Aequourin expression plasmid were combined with 12.5 μL of Plus reagent and 31.25 μL of lipofectamine LTX. It was mixed with (manufactured by Invitrogen) and held for 30 minutes. The mixture was then transfected into the cells. 4 hours after the start of transfection, seeded on a 96-well plate at 9 × 10 4 cells / well, and in DMEM medium (manufactured by Nacalai Tesque) containing 10% FBS, for about 24 hours under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions. It was cultured. As a result, transient transformed cells into which a co-receptor expression plasmid, an olfactory receptor expression plasmid, and an Aequorin expression plasmid were introduced were obtained.

＜活性測定＞
イクオリンはカルシウムイオンと結合すると活性化されてセレンテラジン等の基質を酸化して発光する。したがって、イクオリンを発現する細胞の細胞内カルシウムイオン濃度の上昇は直接、発光量の増大として現れることになるため、被検物質の添加により嗅覚受容体複合体がイオンチャネルとして機能しているかどうかを発光量の変化から測定することができる。
上記形質転換細胞の培養液を除去してＡｓｓａｙ ｂｕｆｆｅｒ（０．５μＭセレンテラジンｈ（プロメガ社製）及び０．３％のＢＳＡを含むＨａｎｋｓ−ＨＥＰＥＳ（２０ ｍＭ ｐＨ ７．４））に置換し、更に４時間、室温で静置した。次いで、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ社製）を用いて、嗅覚受容体に対応する被検物質を細胞の培養液中に添加するとともに細胞の発光量を測定した。対照物質としてジメチルスルホキシドを添加した細胞での発光量を１とし、被検物質を添加した細胞の発光量を相対値として算出した。 <Activity measurement>
When aequorin binds to calcium ions, it is activated to oxidize substrates such as coelenterazine and emit light. Therefore, since the increase in intracellular calcium ion concentration of aequorin-expressing cells directly appears as an increase in the amount of luminescence, whether or not the olfactory receptor complex functions as an ion channel by adding a test substance is determined. It can be measured from the change in the amount of light emitted.
The culture solution of the transformed cells was removed and replaced with Assay buffer (Hanks-HEPES (20 mM pH 7.4) containing 0.5 μM coelenterazine h (manufactured by Promega) and 0.3% BSA), and further. It was allowed to stand at room temperature for 4 hours. Next, using Flexstation 3 (manufactured by Molecular devices), a test substance corresponding to the olfactory receptor was added to the culture medium of the cells, and the amount of luminescence of the cells was measured. The amount of luminescence in cells to which dimethyl sulfoxide was added as a control substance was set to 1, and the amount of luminescence in cells to which the test substance was added was calculated as a relative value.

（実施例１）
嗅覚受容体ＡａＯＲ８の発現プラスミド、
共受容体ＡａＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては１−オクテン−３−オールを用い、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、又は１０−９Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図１に示す。シマカのＡａＯＲ８とＡａＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、シマカＡａＯＲ８とミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、１−オクテン−３−オールに対して、強く応答することが示された。 (Example 1)
Expression plasmid of olfactory receptor AaOR8,
The amount of luminescence was measured as described above using cells having either the co-receptor AaORCO or AmORCO expression plasmid and the Aequorin expression plasmid. 1-octen-3-ol was used as the test substance, and the culture solution was used at a concentration of 10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, or 10-9 M. Was added to. The result is shown in FIG. It has been shown that cells expressing the complex of Shimaka AaOR8 and honeybee AmORCO respond more strongly to 1-octen-3-ol than cells expressing the complex of Shimaka AaOR8 and AaORCO. Was done.

（実施例２）
嗅覚受容体ＡａＯＲ１０の発現プラスミド、
共受容体ＡａＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはベンズアルデヒドを用い、１０−３Ｍ、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、又は１０−７Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図２に示す。シマカのＡａＯＲ１０とＡａＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、シマカＡａＯＲ１０とミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、ベンズアルデヒドに対して、強く応答することが示された。 (Example 2)
Expression plasmid of olfactory receptor AaOR10,
The amount of luminescence was measured as described above using cells having either the co-receptor AaORCO or AmORCO expression plasmid and the Aequorin expression plasmid. Benzaldehyde was used as a test substance, and was added to the culture broth at a concentration of 10 -3 M, 10 -4 M, 10 -5 M, 10 -6 M, or 10 -7 M. The result is shown in FIG. It was shown that cells expressing the complex of Shimaka AaOR10 and honeybee AmORCO responded more strongly to benzaldehyde than cells expressing the complex of Shimaka AaOR10 and AaORCO.

（実施例３）
嗅覚受容体ＡｇＯＲ１０の発現プラスミド、
共受容体ＡｇＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはベンズアルデヒドを用い、１０−３Ｍ、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、又は１０−７Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図３に示す。ハマダラカのＡｇＯＲ１０とＡｇＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、ハマダラカＡｇＯＲ１０とミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、ベンズアルデヒドに対して、強く応答することが示された。 (Example 3)
Expression plasmid of olfactory receptor AgOR10,
The amount of luminescence was measured as described above using cells having either the co-receptor AgORCO or AmORCO expression plasmid and the Aequorin expression plasmid. Benzaldehyde was used as a test substance, and was added to the culture broth at a concentration of 10 -3 M, 10 -4 M, 10 -5 M, 10 -6 M, or 10 -7 M. The result is shown in FIG. It was shown that cells expressing the complex of Anopheles mosquito AgOR10 and honeybee AmORCO responded more strongly to benzaldehyde than cells expressing the complex of Anopheles mosquito AgOR10 and AgORCO.

（実施例４）
嗅覚受容体ＡｇＯＲ２８の発現プラスミド、
共受容体ＡｇＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としては２，４，５−トリメチルチアゾールを用い、１０−３Ｍ、１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、又は１０−８Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図４に示す。ハマダラカのＡｇＯＲ２８とＡｇＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、ハマダラカＡｇＯＲ２８とミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、２，４，５−トリメチルチアゾールに対して、強く応答することが示された。 (Example 4)
Expression plasmid of olfactory receptor AgOR28,
The amount of luminescence was measured as described above using cells having either the co-receptor AgORCO or AmORCO expression plasmid and the Aequorin expression plasmid. 2,4,5-trimethylthiazole was used as the test substance, and the cells were cultured at a concentration of 10 -3 M, 10 -4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, or 10-8 M. Added to the solution. The result is shown in FIG. Cells expressing the complex of Anopheles mosquito AgOR28 and honeybee AmORCO may respond more strongly to 2,4,5-trimethylthiazole than cells expressing the complex of Anopheles mosquito AgOR28 and AgORCO. Shown.

（実施例５）
嗅覚受容体ＢｍＯＲ５６の発現プラスミド、
共受容体ＢｍＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはｃｉｓ−ジャスモンを用い、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ又は１０−１０Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図５に示す。カイコガのＢｍＯＲ５６とＢｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、カイコガＢｍＯＲ５６とミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、ｃｉｓ−ジャスモンに対して、強く応答することが示された。 (Example 5)
Expression plasmid of olfactory receptor BmOR56,
The amount of luminescence was measured as described above using cells having either the co-receptor BmORCO or AmORCO expression plasmid and the Aequorin expression plasmid. Cis-jasmon was used as a test substance, and was added to the culture broth at a concentration of 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M or 10-10 M. The result is shown in FIG. It was shown that the cells expressing the complex of Bombyx mori BmOR56 and the honeybee AmORCO responded more strongly to cis-jasmon than the cells expressing the complex of BmOR56 of Bombyx mori and BmORCO.

（実施例６）
嗅覚受容体ＤｍＯＲ４７ａの発現プラスミド、
共受容体ＤｍＯＲＣＯ又はＡｍＯＲＣＯのいずれかの発現プラスミド、及び
Ａｅｑｕｏｒｉｎ発現プラスミド
を有する細胞を用いて、上述のように発光量を測定した。被検物質としてはペンチルアセテートを用い、１０−４Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、又は５×１０−７Ｍの濃度で培養液に添加した。その結果を図６に示す。ショウジョウバエのＤｍＯＲ４７ａとＤｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞よりも、ショウジョウバエＤｍＯＲ４７ａとミツバチＡｍＯＲＣＯとの複合体を発現する細胞の方が、ペンチルアセテートに対して、強く応答することが示された。 (Example 6)
Expression plasmid of olfactory receptor DmOR47a,
The amount of luminescence was measured as described above using cells having either the co-receptor DmORCO or AmORCO expression plasmid and the Aequorin expression plasmid. Pentyl acetate was used as the test substance, and 10-4 M, 5 × 10 -4 M, 10-5 M, 5 × 10-5 M, 10-6 M, 5 × 10-6 M, 10-7 M. , Or added to the culture medium at a concentration of 5 × 10-7 M. The result is shown in FIG. It was shown that cells expressing the complex of Drosophila DmOR47a and honeybee AmORCO responded more strongly to pentyl acetate than cells expressing the complex of Drosophila DmOR47a and DmORCO.

Claims (4)

ミツバチ科に属さない昆虫の嗅覚受容体と、ミツバチ科昆虫の嗅覚受容体共受容体とから形成される、嗅覚受容体複合体であって、
前記嗅覚受容体が、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ）のＯＲ８若しくはＯＲ１０、ガンビエハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ）のＯＲ１０若しくはＯＲ２８、カイコガ（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）のＯＲ５６、又はキイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）のＯＲ４７ａ、或いは、これらのうちいずれかの嗅覚受容体全体のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する嗅覚受容体であり、
前記嗅覚受容体共受容体が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、昆虫嗅覚受容体と共役して陽イオンを細胞内へ流入させる能力を有するタンパク質である、嗅覚受容体複合体。 An olfactory receptor complex formed from the olfactory receptors of insects that do not belong to the Apidae family and the olfactory receptor co-receptors of the Apidae insects .
The olfactory receptors are OR8 or OR10 of Aedes aegypti, OR10 or OR28 of Anopheles gambiae, OR56 of Bombyx mori, or Drosophila melanogaster, Dross flies, Dross flies, Dross flies. It is an olfactory receptor having an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence of the entire olfactory receptor.
The olfactory receptor co-receptor has an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and is coupled with the olfactory receptor of insects to allow cations to flow into the cell. An olfactory receptor complex that is a capable protein . 前記嗅覚受容体が、１−オクテン−３−オール、ベンズアルデヒド、２，４，５−トリメチルチアゾール、ｃｉｓ−ジャスモン、及びペンチルアセテートからなる群から選択される化合物をリガンドとする嗅覚受容体である、請求項１に記載の嗅覚受容体複合体。 The olfactory receptor is an olfactory receptor whose ligand is a compound selected from the group consisting of 1-octen-3-ol, benzaldehyde, 2,4,5-trimethylthiazole, cis-jasmon, and pentyl acetate. The olfactory receptor complex according to claim 1 . 前記嗅覚受容体共受容体が、セイヨウミツバチ（Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ）又はその近縁種昆虫の嗅覚受容体共受容体である、請求項１又は２に記載の嗅覚受容体複合体。 Before SL olfactory receptor co receptors, Honeybee (Apis mellifera) or a olfactory receptor co-receptors of related species insect olfactory receptor complex according to claim 1 or 2. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の嗅覚受容体複合体を発現する細胞。 A cell expressing the olfactory receptor complex according to any one of claims 1 to 3 .
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