JP6781877B2 - Target cell capture device - Google Patents

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Description

本発明は、標的細胞を特異的に捕捉する装置(以下「標的細胞捕捉装置」と称す。)に関し、特に腫瘍細胞を特異的に捕捉する装置(以下「腫瘍細胞捕捉装置」と称す。)に関する。 The present invention relates to a device that specifically captures a target cell (hereinafter referred to as a “target cell capture device”), and more particularly to a device that specifically captures a tumor cell (hereinafter referred to as a “tumor cell capture device”). ..

癌疾患特定に用いられる代表的な手法として腫瘍マーカーを用いる生検が一般的であるが、腫瘍は単クローン性の細胞の集合体ではなく、異なるプロファイルを持った細胞で構成されているため、細胞を採取する場所の違いで判定に異なる結果が生じるなどの問題点が指摘されている。進行癌では、腫瘍細胞が原発腫瘍細胞組織から剥離し、血液やリンパ液の流れに乗り、体内の別の臓器に移動することで癌転移が起こっていると考えられている。血流に乗って体内を循環する腫瘍細胞である血中循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell:CTC)の単位血液量(体積)当たりのCTCの個数が癌病態に対して高い相関を示すことが確認されているが、1mLの血液中にわずか数個〜10個程度のCTCが含まれているに過ぎず、一方血液細胞は10億個も存在しているため、CTCの検出が極めて困難である。これまで提案されているCTCの検出方法は、細胞サイズの差を利用するフィルター(たとえば特許文献1及び2、非特許文献1)や誘電泳動特性の差を利用するマイクロ流体デバイス(たとえば非特許文献2)などで分離した後に捕捉する方法、アビジン修飾プレートにビオチン修飾核酸アプタマーを固定化したプレートリーダーで捕捉する方法などが提案されている。しかし、フィルターは標的細胞以外の血球細胞やタンパク質成分などによる目詰まりを起こしやすく、前処理が必要になり、マイクロ流体デバイスは分離しながら捕捉するまでに長時間を要し、プレートリーダーは検出装置が限定されるなどの問題があり、標的細胞のみを簡便に短時間でかつ効率よく捕捉する手法が望まれている。 Biopsy using tumor markers is common as a typical method used to identify cancer diseases, but because tumors are not aggregates of monoclonal cells but composed of cells with different profiles. It has been pointed out that there are problems such as different results in the judgment depending on the place where the cells are collected. In advanced cancer, cancer metastasis is thought to occur when tumor cells detach from the primary tumor cell tissue, ride on the flow of blood and lymph, and move to other organs in the body. It was confirmed that the number of CTCs per unit blood volume (volume) of circulating Tumor Cells (CTCs), which are tumor cells that circulate in the body in the bloodstream, shows a high correlation with the pathological condition of cancer. However, it is extremely difficult to detect CTCs because 1 mL of blood contains only a few to 10 CTCs, while there are 1 billion blood cells. .. The CTC detection methods proposed so far include filters that utilize differences in cell size (for example, Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1) and microfluidic devices that utilize differences in dielectrophoretic properties (for example, Non-Patent Documents). A method of capturing after separation by 2) or the like, a method of capturing with a plate reader in which a biotin-modified nucleic acid aptamer is immobilized on an avidin-modified plate, and the like have been proposed. However, filters are prone to clogging due to blood cells other than target cells, protein components, etc., requiring pretreatment, microfluidic devices take a long time to capture while separating, and plate readers are detectors. There is a problem that the number of cells is limited, and a method for easily and efficiently capturing only target cells in a short time is desired.

特開2015-30881号公報JP-A-2015-30881 特開2014-83000号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2014-83000

"Development of a New Rapid Isolation Device for Circulating Tumor Cells (CTCs) Using 3D Palladium Filter and Its Application for Genetic Analysis", PLOS ONE, Vol. 9, Issue 2, e88821"Development of a New Rapid Isolation Device for Circulating Tumor Cells (CTCs) Using 3D Palladium Filter and Its Application for Genetic Analysis", PLOS ONE, Vol. 9, Issue 2, e88821 「誘電泳動を利用した血中希少がん細胞の検出・解析システムの開発」東ソー研究・技術報告 第58巻(2014)"Development of a detection and analysis system for rare cancer cells in blood using dielectrophoresis" Tosoh Research and Technology Report Vol. 58 (2014)

本発明は、血液などの生体試料中に含まれる標的細胞を簡便に短時間で且つ効率よく分離捕捉するための装置を提供することを目的とする。特に、従来の微細孔フィルターの目詰まり等の欠点を解消し、微量乃至大量の生体試料を扱うことのできる標的細胞捕捉装置を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide an apparatus for easily, quickly and efficiently separating and capturing target cells contained in a biological sample such as blood. In particular, it is an object of the present invention to provide a target cell capture device capable of handling a small amount or a large amount of a biological sample by eliminating defects such as clogging of a conventional micropore filter.

本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意研究した結果、(i)元素周期表第10族元素、第11族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む担持層と、(ii)当該担持層上に設けられている自己組織化単分子膜と、(iii)当該担持層上に直接、又は当該自己組織化単分子膜を介して設けられており、標的細胞と特異的に結合するアプタマー又は抗体と、を備える標的細胞捕捉フィルターを用いることで、フィルターの孔径に左右されずに、標的細胞のみを捕捉し得ることを知見し、本発明を完成するに至った。 As a result of diligent research to solve the above problems, the present inventors have found that (i) a supporting layer containing elements of Group 10 and Group 11 of the Periodic Table of the Elements and elements selected from a combination thereof, and (ii). A self-assembled monomolecular membrane provided on the supporting layer and (iii) provided directly on the supporting layer or via the self-assembling monomolecular membrane, and specifically bind to a target cell. It has been found that only target cells can be captured without being influenced by the pore size of the filter by using a target cell capture filter provided with an aptamer or an antibody, and the present invention has been completed.

本発明の具体的態様は以下を含む。
[1]生体試料を吸引して保持する本体と、
当該本体の先端部に着脱自在に取り付けられるディスポーサブル部と、
を備える標的細胞捕捉装置であって、
当該ディスポーサブル部は、
先端に生体試料導入部となる開口が設けられ、
当該本体との連結側に着脱自在に取り付けられる標的細胞捕捉フィルターを備え、
当該標的細胞捕捉フィルターは、
(i)元素周期表第10族元素、第11族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む担持層と、
(ii)当該担持層上に設けられている自己組織化単分子膜と、
(iii)当該担持層上に直接、又は当該自己組織化単分子膜を介して設けられており、標的細胞と特異的に結合するアプタマー又は抗体と、
を備える、標的細胞捕捉装置。
[2]前記自己組織化単分子膜は、一方の末端基が前記担持層を構成する元素と結合しており、前記担持層に結合していない側の末端基の少なくとも一部は、前記アプタマー又は抗体と結合している、[1]に記載の標的細胞捕捉装置。
[3]前記自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基のうち前記アプタマー又は抗体が結合していない末端基の全部又は一部はキャップされている、[1]又は[2]に記載の標的細胞捕捉装置。
[4]前記担持層は、金、白金、銀、パラジウム、銅及びこれらの組み合わせからなる群から選択される元素を含む、[1]〜[3]のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。
[5]請前記自己組織化単分子膜は、一方の末端にチオール基を含み、他方の末端にカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基又はN−ヒドロキシスクシンイミド基を含む、[1]〜[4]のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。
[6]前記アプタマー及び/又は前記自己組織化単分子膜は、チオール結合により前記担持層を構成する元素と結合している、[1]〜[5]のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。
[7]前記アプタマーは、アミド結合により前記自己組織化単分子膜と結合している、[1]〜[6]のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。
[8]前記自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基のうち前記アプタマー又は抗体が結合していない末端基の全部又は一部は、メトキシ基、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ヒドロキシル基から選択される基でキャップされている、[1]〜[7]のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。
[9]前記自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基であって、前記アプタマー又は抗体が結合していない末端基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はアミノ基である、[1]〜[8]のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。
[10]前記標的細胞は血中循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell:CTC)である、[1]〜[9]のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。
Specific embodiments of the present invention include:
[1] A main body that sucks and holds a biological sample,
A disposable part that can be detachably attached to the tip of the main body,
It is a target cell capture device equipped with
The disposable part is
An opening is provided at the tip to serve as a biological sample introduction part.
Equipped with a target cell capture filter that can be detachably attached to the connection side with the main body
The target cell capture filter is
(I) Periodic Table of Elements A carrier layer containing Group 10 elements, Group 11 elements and an element selected from a combination thereof, and a supporting layer.
(Ii) A self-assembled monolayer provided on the carrier layer,
(Iii) An aptamer or antibody that is provided directly on the carrier layer or via the self-assembled monolayer and that specifically binds to the target cell.
A target cell capture device.
[2] In the self-assembled monolayer, one terminal group is bonded to an element constituting the supporting layer, and at least a part of the terminal group on the side not bonded to the supporting layer is the aptamer. Alternatively, the target cell capture device according to [1], which is bound to an antibody.
[3] Of the terminal groups on the side not bound to the supporting layer of the self-assembled monolayer, all or part of the terminal groups to which the aptamer or antibody is not bound are capped, [1] or The target cell capture device according to [2].
[4] The target cell capture device according to any one of [1] to [3], wherein the carrier layer contains an element selected from the group consisting of gold, platinum, silver, palladium, copper and combinations thereof. ..
[5] The self-assembled monolayer contains a thiol group at one end and a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group or an N-hydroxysuccinimide group at the other end, [1] to [4]. The target cell capture device according to any one of.
[6] The target cell capture according to any one of [1] to [5], wherein the aptamer and / or the self-assembled monolayer is bound to an element constituting the supporting layer by a thiol bond. apparatus.
[7] The target cell capture device according to any one of [1] to [6], wherein the aptamer is bound to the self-assembled monolayer by an amide bond.
[8] Of the terminal groups on the side not bound to the supporting layer of the self-assembled monomolecular membrane, all or part of the terminal groups to which the aptamer or antibody is not bound are methoxy group, carbamoyl group, methylcarbamoyl. The target cell capture device according to any one of [1] to [7], which is capped with a group selected from a group and a hydroxyl group.
[9] The terminal group on the side not bound to the supporting layer of the self-assembled monolayer and to which the aptamer or antibody is not bound is a hydroxyl group, a carboxyl group, or an amino group. , The target cell capture device according to any one of [1] to [8].
[10] The target cell capture device according to any one of [1] to [9], wherein the target cell is a circulating tumor cell (CTC) in blood.

本発明の標的細胞捕捉装置は、標的細胞をアプタマー又は抗体によって特異的に捕捉するため、フィルターの孔径に左右されずに、誤検出を抑制できる。また、フィルターの孔径を大きくすることができるため、従来の細胞径に依存するフィルタリングと異なり、大きな細胞を含む生体試料であってもフィルターの目詰まりが生じにくく、小さな標的細胞であってもアプタマー又は抗体によって特異的に捕捉することができる。また、フィルターの孔径を大きくすると、一度に多量の生体試料を流通させることができ、標的細胞の捕捉に要する時間を短縮することができる。さらに、フィルターの孔径に左右されないため、微量乃至大量の生体試料から標的細胞のみを捕捉することができる。 Since the target cell capture device of the present invention specifically captures the target cell with an aptamer or an antibody, erroneous detection can be suppressed regardless of the pore size of the filter. In addition, since the pore size of the filter can be increased, unlike conventional filtering that depends on the cell size, clogging of the filter is less likely to occur even in a biological sample containing large cells, and even small target cells are aptamers. Alternatively, it can be specifically captured by an antibody. In addition, if the pore size of the filter is increased, a large amount of biological sample can be circulated at one time, and the time required for capturing target cells can be shortened. Furthermore, since it does not depend on the pore size of the filter, only target cells can be captured from a small amount or a large amount of biological sample.

本発明の標的細胞捕捉装置を用いることで、簡易かつ迅速に標的細胞のみを特異的に捕捉することができる。 By using the target cell capture device of the present invention, only target cells can be specifically captured easily and quickly.

本発明の標的細胞捕捉装置に用いる標的細胞捕捉フィルターを簡易に製造することができる。 The target cell capture filter used in the target cell capture device of the present invention can be easily produced.

本発明の標的細胞捕捉装置の断面図である。It is sectional drawing of the target cell capture apparatus of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置の全体斜視図である。It is an overall perspective view of the target cell capture apparatus of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置のディスポーサブル部の全体斜視図である。It is the whole perspective view of the disposable part of the target cell capture apparatus of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置のディスポーサブル部の断面図である。It is sectional drawing of the disposable part of the target cell capture apparatus of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置のディスポーサブル部の分解図である。It is an exploded view of the disposable part of the target cell capture device of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置のディスポーサブル部に挿入する標的細胞捕捉フィルターカセット保持部の分解図である。It is an exploded view of the target cell capture filter cassette holding part to be inserted into the disposable part of the target cell capture device of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置のディスポーサブル部に挿入する標的細胞捕捉フィルターの標的細胞捕捉を示す模式図である。It is a schematic diagram which shows the target cell capture of the target cell capture filter inserted into the disposable part of the target cell capture apparatus of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置のディスポーサブル部に挿入する標的細胞捕捉フィルターの構成例(アプタマーが直接担持層に結合している態様)を示す概略説明図である。It is a schematic explanatory drawing which shows the structural example of the target cell capture filter (a mode in which an aptamer is directly bound to a support layer) to be inserted into the disposable part of the target cell capture apparatus of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置のディスポーサブル部に挿入する標的細胞捕捉フィルターの別の構成例(アプタマーが自己組織化単分子膜に結合している態様)を示す概略説明図である。It is a schematic explanatory drawing which shows another structural example (a mode in which an aptamer is bound to a self-assembled monolayer) of the target cell capture filter to be inserted into the disposable part of the target cell capture apparatus of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置のディスポーサブル部に挿入する標的細胞捕捉フィルターの開口パターンの一例(円形)を示す電子顕微鏡写真(以下「SEM写真」と称す。)である。It is an electron micrograph (hereinafter referred to as "SEM photograph") which shows an example (circular) of the opening pattern of the target cell capture filter inserted into the disposable part of the target cell capture apparatus of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置のディスポーサブル部に挿入する標的細胞捕捉フィルターの開口パターンの別の一例(菱形)を示すSEM写真である。It is an SEM photograph which shows another example (diamond) of the opening pattern of the target cell capture filter inserted into the disposable part of the target cell capture apparatus of this invention. 本発明の標的細胞捕捉装置のディスポーサブル部に挿入する標的細胞捕捉フィルターのパターンの別の一例(ピラー)を示すSEM写真である。It is an SEM photograph which shows another example (pillar) of the pattern of the target cell capture filter inserted into the disposable part of the target cell capture apparatus of this invention. 実施例4において本発明の標的細胞捕捉フィルターで捕捉した標的細胞、正常細胞及び比較例の蛍光観察写真である。It is a fluorescence observation photograph of the target cell, the normal cell and the comparative example captured by the target cell capture filter of the present invention in Example 4. 実施例5において本発明の標的細胞捕捉フィルターで捕捉した標的細胞及び正常細胞の蛍光観察写真である。5 is a fluorescence observation photograph of target cells and normal cells captured by the target cell capture filter of the present invention in Example 5. 実施例6において本発明の標的細胞捕捉フィルターで捕捉した標的細胞及び正常細胞の蛍光観察写真である。6 is a fluorescence observation photograph of target cells and normal cells captured by the target cell capture filter of the present invention in Example 6. 実施例7において本発明の標的細胞捕捉フィルターで捕捉した標的細胞及び正常細胞の蛍光観察写真である。It is a fluorescence observation photograph of the target cell and the normal cell captured by the target cell capture filter of the present invention in Example 7. 実施例8において本発明の標的細胞捕捉フィルターで捕捉した標的細胞及び正常細胞の蛍光観察写真である。8 is a fluorescence observation photograph of target cells and normal cells captured by the target cell capture filter of the present invention in Example 8.

好ましい実施形態Preferred embodiment

添付図面を参照しながら本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 The present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings, but the present invention is not limited thereto.

図1乃至2は本発明の標的細胞捕捉装置全体、図3乃至5はディスポーサブル部、図6は標的細胞捕捉フィルターを示す。 1 and 2 show the entire target cell capture device of the present invention, FIGS. 3 to 5 show a disposable portion, and FIG. 6 shows a target cell capture filter.

図1乃至2に示されているように、本発明の標的細胞捕捉装置1は、生体試料を吸引する本体10と、本体10の先端部に着脱自在に取り付けられるディスポーサブル部20と、を備える。本体10は、図示した実施態様では、先端のチップ部分を除いて一般的なマイクロピペットと同様の構造であり、生体試料を吸引して保持する生体試料保持部11と、生体試料の吸引と撹拌及び吐出を実現する2段階の押し込み形式のプッシュボタン12とを有する。しかし、本発明の標的細胞捕捉装置の本体10は生体試料を吸引できる構成であれば特に限定されず、また正確な微量の吸引及び吐出を必要としない場合には通常の注射器やチューブでもよい。ディスポーサブル部20は、図示した実施態様では、ネジ13で本体10に着脱自在に取り付けられる形式である。しかし、着脱自在に流体漏洩が生じない状態で取り付けられれば特に限定されず、気密シール付きの嵌合式でもよい。本体10及びディスポーサブル部20は、樹脂から射出成形等の公知の方法で作製することができる。樹脂としては、生体試料から標的細胞を捕捉する目的を阻害しない限り、一般的な樹脂を特に限定されずに用いることができる。 As shown in FIGS. 1 and 2, the target cell capture device 1 of the present invention includes a main body 10 that sucks a biological sample, and a disposable part 20 that is detachably attached to a tip end portion of the main body 10. In the illustrated embodiment, the main body 10 has a structure similar to that of a general micropipette except for the tip portion at the tip, and has a biological sample holding portion 11 that sucks and holds a biological sample, and suction and stirring of the biological sample. It also has a two-stage push-type push button 12 that realizes discharge. However, the main body 10 of the target cell capture device of the present invention is not particularly limited as long as it can suck a biological sample, and a normal syringe or tube may be used when an accurate trace amount of suction and discharge is not required. In the illustrated embodiment, the disposable portion 20 is detachably attached to the main body 10 with screws 13. However, it is not particularly limited as long as it is detachably attached without causing fluid leakage, and a fitting type with an airtight seal may be used. The main body 10 and the disposable portion 20 can be manufactured from a resin by a known method such as injection molding. As the resin, a general resin can be used without particular limitation as long as the purpose of capturing the target cells from the biological sample is not impaired.

図3乃至4に示されているように、ディスポーサブル部20は、先端に生体試料導入部211となる開口が形成されており、本体10との連結側の開口にフランジ212が形成されており、生体試料導入部211とフランジ212との間に形成された空間213及び214を有する本体部21に生体試料を吸引する。図示した形態において、空間213は、生体試料導入部211に向かって縮径するテーパー形状であり、空間213とフランジ212との間に形成される空間214は寸胴形状である。空間213と214との境界に標的細胞捕捉フィルター30が定置される。 As shown in FIGS. 3 to 4, the disposable portion 20 has an opening formed at the tip thereof to serve as the biological sample introduction portion 211, and a flange 212 is formed at the opening on the connecting side with the main body 10. The biological sample is sucked into the main body 21 having the spaces 213 and 214 formed between the biological sample introduction portion 211 and the flange 212. In the illustrated form, the space 213 has a tapered shape that reduces in diameter toward the biological sample introduction portion 211, and the space 214 formed between the space 213 and the flange 212 has a barrel shape. The target cell capture filter 30 is placed at the boundary between the spaces 213 and 214.

図5乃至6に示されているように、標的細胞捕捉フィルター30は、フィルターカセット23及びカセット保持部22を用いてディスポーサブル部20の空間214に挿入され、定置に保持される。 As shown in FIGS. 5 to 6, the target cell capture filter 30 is inserted into the space 214 of the disposable portion 20 by using the filter cassette 23 and the cassette holding portion 22, and is held stationary.

図示した態様において、フィルターカセット23は、標的細胞捕捉フィルター30と同径のリング231と、リング231の半周にわたって立設されている保持用側壁面232とを有する。カセット保持部22は、ディスポーサブル部20のフランジ212に載置されるフランジ221と、標的細胞捕捉フィルター30を載置して、ディスポーサブル部20の空間214に嵌合する円筒の底面外周部223と、底面外周部223の半円周に沿って立設されている側壁面222と、を有する。側壁面222には、底面外周部223の上にフィルターカセット23を受け入れて嵌合する寸法及び形状の凹部224が形成されている。標的細胞捕捉フィルター30は、フィルターカセット23のリング231及び保持用側壁面232で挟まれた状態でカセット保持部22の底面外周部223の上に載置され、フィルターカセット23を側壁面222に向けてスライドさせて、側壁面222の凹部に挿入する。フィルターカセット23を保持した状態でのカセット保持部22の底面の径は、ディスポーサブル部20の空間214に嵌合保持される大きさである。図示した態様において、カセット保持部22のフランジ221の開口部内径と、底面外周部223の開口部内径とは同じ寸法である。なお、図示した態様では、標的細胞捕捉フィルター30は1枚であるが、同じ形状あるいは異なる形状の複数枚の標的細胞捕捉フィルターを組み合わせて用いてもよい。 In the illustrated embodiment, the filter cassette 23 has a ring 231 having the same diameter as the target cell capture filter 30, and a holding side wall surface 232 erected over half a circumference of the ring 231. The cassette holding portion 22 includes a flange 221 mounted on the flange 212 of the disposable portion 20, a bottom outer peripheral portion 223 of a cylinder on which the target cell capture filter 30 is placed and fitted in the space 214 of the disposable portion 20. It has a side wall surface 222 that is erected along the semicircumference of the bottom outer peripheral portion 223. On the side wall surface 222, a recess 224 having a size and shape for receiving and fitting the filter cassette 23 is formed on the bottom outer peripheral portion 223. The target cell capture filter 30 is placed on the bottom outer peripheral portion 223 of the cassette holding portion 22 in a state of being sandwiched between the ring 231 of the filter cassette 23 and the holding side wall surface 232, and the filter cassette 23 is directed toward the side wall surface 222. And slide it into the recess on the side wall surface 222. The diameter of the bottom surface of the cassette holding portion 22 in the state of holding the filter cassette 23 is a size that is fitted and held in the space 214 of the disposable portion 20. In the illustrated embodiment, the inner diameter of the opening of the flange 221 of the cassette holding portion 22 and the inner diameter of the opening of the bottom outer peripheral portion 223 have the same dimensions. In the illustrated embodiment, the number of target cell capture filters 30 is one, but a plurality of target cell capture filters having the same shape or different shapes may be used in combination.

図7は標的細胞捕捉フィルター30の標的細胞を捕捉した状態を示す模式図である。図示した態様において、標的細胞Tは、アプタマー33に特異的に結合して捕捉され、赤血球R及び白血球Wは担持層31の開孔を通過する。なお、赤血球及び白血球は説明のために示したものであるがこれらに限定されず、標的細胞以外の細胞など生体試料に含まれている物質である。 FIG. 7 is a schematic view showing a state in which the target cells of the target cell capture filter 30 are captured. In the illustrated embodiment, the target cell T specifically binds to and is captured by the aptamer 33, and the erythrocytes R and leukocytes W pass through the openings of the carrier layer 31. Red blood cells and leukocytes are shown for the sake of explanation, but are not limited to these, and are substances contained in biological samples such as cells other than target cells.

次に、図8乃至12を参照しながら、標的細胞捕捉フィルター30について説明する。 Next, the target cell capture filter 30 will be described with reference to FIGS. 8 to 12.

図8乃至9に示されているように、標的細胞捕捉フィルター30は、(i)元素周期表第10族元素、第11族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む担持層31と、(ii)担持層31上に設けられている自己組織化単分子膜32と、(iii)担持層31上に直接又は自己組織化単分子膜32を介して設けられており、標的細胞と特異的に結合するアプタマー又は抗体33と、を備える。 As shown in FIGS. 8 to 9, the target cell capture filter 30 includes (i) a carrying layer 31 containing elements of Group 10 and Group 11 of the Periodic Table of the Elements and elements selected from a combination thereof. (Ii) A self-assembling monomolecular film 32 provided on the supporting layer 31, and (iii) provided directly on the supporting layer 31 or via a self-assembling monomolecular film 32, which is specific to a target cell. It comprises an aptamer or antibody 33 that binds specifically.

担持層31は、元素周期表第10族元素、第11族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む金属基板、あるいは金属、ガラス、プラスチック又は紙などの支持基板の少なくとも一面に上記元素をメッキ、蒸着、スパッタリングなどの公知の方法を用いて成膜したものでよい。また、ニッケル系合金(たとえばニッケル−コバルト、ニッケル−リンなど)、クロム系合金、スズ系合金などで支持基板をメッキした後に、元素周期表第10族元素、第11族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を電鋳により成膜して、担持層31を形成してもよい。いずれの成膜方法でも、支持基板は特に限定されず、担持層31の少なくとも表面に、元素周期表第10族元素、第11族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を有していればよく、特に金、白金、銀、パラジウム、銅及びこれらの組み合わせからなる群から選択される元素を含むことが好ましい。また、担持層31は、10乃至20μmの薄膜でも形状を保持して自立できる硬さを有することが好ましい。 The supporting layer 31 has the above elements on at least one surface of a metal substrate containing elements of Group 10 and Group 11 of the Periodic Table of the Elements and elements selected from a combination thereof, or a supporting substrate such as metal, glass, plastic or paper. The film may be formed by using a known method such as plating, vapor deposition, or sputtering. In addition, after plating the support substrate with nickel-based alloys (for example, nickel-cobalt, nickel-phosphorus, etc.), chromium-based alloys, tin-based alloys, etc., the elements of Group 10 and Group 11 of the Periodic Table of the Elements and their combinations are used. The element to be selected may be formed into a film by electrocasting to form the supporting layer 31. In any of the film forming methods, the supporting substrate is not particularly limited, as long as the supporting layer 31 has at least the surface of the group 10 element, the group 11 element of the periodic table, and an element selected from a combination thereof. Often, it preferably contains an element selected from the group consisting of gold, platinum, silver, palladium, copper and combinations thereof. Further, the supported layer 31 preferably has a hardness that allows it to retain its shape and stand on its own even with a thin film of 10 to 20 μm.

図8はアプタマー又は抗体33が担持層31に直接、化学的に結合している態様である。図9はアプタマー又は抗体33が自己組織化単分子膜32に化学的に結合した状態で担持層31に設けられている態様である。図示した態様において、アプタマー又は抗体33、及び/又は、自己組織化単分子膜32は、チオール結合により担持層31を構成する元素と結合している。 FIG. 8 shows an embodiment in which the aptamer or antibody 33 is directly chemically bound to the carrier layer 31. FIG. 9 shows an embodiment in which the aptamer or antibody 33 is provided on the carrier layer 31 in a state of being chemically bound to the self-assembled monolayer 32. In the illustrated embodiment, the aptamer or antibody 33 and / or the self-assembled monolayer 32 is bound to the element constituting the supporting layer 31 by a thiol bond.

自己組織化単分子膜32は、一方の末端にチオール基を含み、他方の末端にカルボキシル基、ヒドロキシ基、アミノ基、又はN−ヒドロキシスクシンイミド基を含む。これらの官能基で末端が修飾されているポリエチレングリコール膜又はヒドロキシアルカンチオール膜から形成することができる。ヒドロキシアルカンチオールとしては、例えば、ヒドロキシ−EG6−ウンデカンチオール、ヒドロキシ−EG3−ウンデカンチオール、ヒドロキシ−EG6−ヘキサデカンチオール、ヒドロキシ−EG3−ヘキサデカンチオール、6−メルカプト−1−ヘキサノール、アミノ−EG6−ウンデカンチオールヒドロクロライド、アミノ−EG6−ヘキサデカンチオールヒドロクロライド、カルボキシ−EG6−ヘキサデカンチオール、カルボキシ−EG6−ウンデカンチオール、15−カルボキシ−1ペンタデカンチオール、10−カルボキシ−1−デカンチオール、7−カルボキシ−1−ヘプタンチオール、5−カルボキシ−1−ペンタンチオール、16−アミノ−1−ヘキサデカンチオールヒドロクロライド、11−アミノ−1−ウンデカンチオールヒドロクロライド、8−アミノ−1−オクタンチオールヒドロクロライド、6−アミノ−1−ヘキサンチオールヒドロクロライド、16−ヒドロキシ−1−ヘキサンデカンチオール、11−ヒドロキシ−1−ウンデカンチオール、8−ヒドロキシ−1−オクタンチオール、6−ヒドロキシ−1−ヘキサンチオールを好適に挙げることができるが、これらに限定されない。 The self-assembled monolayer 32 contains a thiol group at one end and a carboxyl group, a hydroxy group, an amino group, or an N-hydroxysuccinimide group at the other end. It can be formed from a polyethylene glycol membrane or a hydroxyalkanethiol membrane whose ends are modified with these functional groups. Examples of the hydroxyalcanthiol include hydroxy-EG6-undecanethiol, hydroxy-EG3-undecanethiol, hydroxy-EG6-hexadecanethiol, hydroxy-EG3-hexadecanethiol, 6-mercapto-1-hexanol, and amino-EG6-undecanethiol. Hydrochloride, Amino-EG6-Hexadecane Thiol Hydrochloride, Carboxy-EG6-Hexadecane Thiol, Carboxy-EG6-Undecane Thiol, 15-carboxy-1 Pentadecane Thiol, 10-carboxy-1-Decan Thiol, 7-carboxy-1-Heptane Thiol, 5-carboxy-1-pentanethiol, 16-amino-1-hexadecanethiol thiolhydrochloride, 11-amino-1-undecanethiol thiolhydrochloride, 8-amino-1-octanethiol thiolhydrochloride, 6-amino-1- Preferable examples include hexanethiol hydrochloride, 16-hydroxy-1-hexanedecanethiol, 11-hydroxy-1-undecanethiol, 8-hydroxy-1-octanethiol and 6-hydroxy-1-hexanethiol. Not limited to these.

自己組織化単分子膜32にアプタマー又は抗体33が結合している態様では、自己組織化単分子膜32の末端のカルボキシル基又はヒドロキシル基を活性化するために官能基で修飾した後に、当該官能基をアプタマー又は抗体33で置換してもよい。非限定的に自己組織化単分子膜32の末端基を修飾する官能基は、N−ヒドロキシスクシンイミド基、又はマレイミド基であることが好ましい。 In the embodiment in which the aptamer or antibody 33 is bound to the self-assembled monolayer 32, the functional group is modified with a functional group to activate the carboxyl group or hydroxyl group at the end of the self-assembled monolayer 32. The group may be replaced with an aptamer or antibody 33. The functional group that modifies the terminal group of the self-assembled monolayer 32 without limitation is preferably an N-hydroxysuccinimide group or a maleimide group.

自己組織化単分子膜32の末端がN−ヒドロキシスクシンイミド基の場合、アミノ化アプタマー又は抗体33のアミノ基と反応させて、これらを自己組織化単分子膜32に結合させることができる。自己組織化単分子膜32の末端がアミノ基の場合、例えば化学合成したN−ヒドロキシスクシンイミド化アプタマー、又は、カルボキシル末端をN−ヒドロキシスクシンイミド化した抗体を、自己組織化単分子膜32に結合させることができる。 When the end of the self-assembled monolayer 32 is an N-hydroxysuccinimide group, it can be reacted with an amination aptamer or an amino group of the antibody 33 to bind them to the self-assembled monolayer 32. When the end of the self-assembled monolayer 32 is an amino group, for example, a chemically synthesized N-hydroxysuccinimided aptamer or an antibody having a carboxyl end of N-hydroxysuccinimide is bound to the self-assembled monolayer 32. be able to.

自己組織化単分子膜32の末端がアミノ基の場合、これをさらにマレイミド化して、自己組織化単分子膜32の末端を修飾する官能基をマレイミド基としてもよい。具体的には、非限定的に、片方の端にN−ヒドロキシスクシンイミド基を有し、もう一方の端にマレイミド基を有する二価性試薬、例えば、N−(6−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド(EMCS)(例えば、株式会社 同仁化学研究所より入手可能)を、末端にアミノ基を有する自己組織化単分子膜と反応させると、自己組織化単分子膜32の末端を修飾する官能基がマレイミド基となる。この場合、化学合成したチオール化アプタマー、又は、チオール基を有する抗体(システイン残基を有する抗体)を、自己組織化単分子膜32に結合させることができる。 When the end of the self-assembled monolayer 32 is an amino group, it may be further maleimided and the functional group that modifies the end of the self-assembled monolayer 32 may be a maleimide group. Specifically, a divalent reagent having an N-hydroxysuccinimide group at one end and a maleimide group at the other end, such as N- (6-maleimide caproyloxy) succinimide, without limitation. When (EMCS) (for example, available from Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd.) is reacted with a self-assembled monomolecular film having an amino group at the end, a functional group that modifies the end of the self-assembled monomolecular film 32 is generated. It becomes a maleimide group. In this case, a chemically synthesized thiolated aptamer or an antibody having a thiol group (an antibody having a cysteine residue) can be bound to the self-assembled monolayer 32.

アプタマー又は抗体33で置換されなかった官能基が残存することもある。核酸アプタマーが結合しなかった官能基、たとえばN−ヒドロキシスクシンイミド基は水中で分解し、自己組織化単分子膜32の末端としてはヒドロキシル基又はカルボキシル基が残る。自己組織化単分子膜32の末端基がマレイミド基で修飾されている場合には、核酸アプタマーが結合しなかったマレイミド基は自己組織化単分子膜32の末端基として残る。残ったマレイミド基は、一方の末端にSH基を有し、他方の末端がメトキシ基(−OCH)、カルバモイル基(−CONH)、メチルカルバモイル基(−CONHCH)及びヒドロキシル基(−OH)を有するキャッピング剤でキャッピングすることが必要となる。 Functional groups that have not been substituted with aptamers or antibody 33 may remain. A functional group to which the nucleic acid aptamer is not bound, for example, an N-hydroxysuccinimide group, is decomposed in water, and a hydroxyl group or a carboxyl group remains as the terminal of the self-assembled monolayer 32. When the terminal group of the self-assembled monolayer 32 is modified with a maleimide group, the maleimide group to which the nucleic acid aptamer is not bound remains as the terminal group of the self-assembled monolayer 32. The remaining maleimide group has an SH group at one end and a methoxy group (-OCH 3 ), a carbamoyl group (-CONH 2 ), a methylcarbamoyl group (-CONHCH 3 ) and a hydroxyl group (-OH) at the other end. It is necessary to cap with a capping agent having).

自己組織化単分子膜32の末端基のうちアプタマー又は抗体33が結合していない末端基がN−ヒドロキシスクシンイミド基である場合、その全部又は一部は、一方の末端にNH基を有し、他方の末端がメトキシ基(−OCH)、カルバモイル基(−CONH)、メチルカルバモイル基(−CONHCH)及びヒドロキシル基(−OH)から選択される基を有するキャッピング剤でキャップされていることがより好ましい。 When the terminal group to which the aptamer or the antibody 33 is not bound is an N-hydroxysuccinimide group among the terminal groups of the self-assembled monomolecular membrane 32, all or a part thereof has two NH groups at one end. , The other end is capped with a capping agent having a group selected from a methoxy group (-OCH 3 ), a carbamoyl group (-CONH 2 ), a methyl carbamoyl group (-CONHCH 3 ) and a hydroxyl group (-OH). Is more preferable.

自己組織化単分子膜32の末端基のうちアプタマー又は抗体33が結合していない末端基がアミノ基である場合、その全部又は一部は、一方の末端にN−ヒドロキシスクシンイミド基を有し、他方の末端がメトキシ基(−OCH)、カルバモイル基(−CONH)、メチルカルバモイル基(−CONHCH)及びヒドロキシル基(−OH)から選択される基を有するキャッピング剤でキャップされていることがより好ましい。 When the terminal group to which the aptamer or the antibody 33 is not bound is an amino group among the terminal groups of the self-assembled monomolecular membrane 32, all or a part thereof has an N-hydroxysuccinimide group at one end. The other end is capped with a capping agent having a group selected from a methoxy group (-OCH 3 ), a carbamoyl group (-CONH 2 ), a methyl carbamoyl group (-CONHCH 3 ) and a hydroxyl group (-OH). Is more preferable.

上記のように、アプタマー又は抗体33が結合していない末端基をキャップすることで、標的細胞以外の細胞との非特異的結合を抑制することができ、より確実に標的細胞のみを捕捉することができる。 As described above, by capping the terminal group to which the aptamer or antibody 33 is not bound, non-specific binding to cells other than the target cell can be suppressed, and only the target cell can be captured more reliably. Can be done.

アプタマー33は、特定の分子と特異的に結合する分子やペプチドである。通常ランダム配列の巨大ライブラリ中から選び出してくるが、自然界にも存在し、リボスイッチとして知られており、基礎から薬剤探索などの応用まで幅広く研究されている。リボザイムと複合体化したアプタマーも存在しており、ターゲット分子存在下で自己切断するものが知られている。アプタマーは、核酸(DNA・RNA)アプタマー、ペプチドアプタマーの2種に大別される。核酸アプタマーは化学合成が可能であるため、コストを大幅に下げることができ、核酸を用いることでDNA折り紙やナノワイヤー等のように「静的な構造」のみならず、DNAウォーカーや、リボスイッチ、アプタザイムのような「動的な構造」を自在にプログラミングすることが可能となる(ダイナミックプログラミング)ので好ましい。このプログラムを利用して、腫瘍細胞捕捉のシグナルを増幅することも可能である。当業者は、標的細胞の種類に応じて細胞の細胞表面物質に特異的に結合する核酸アプタマーを適宜選択することができる。たとえば、上皮細胞接着分子(EpCAM:Epithelial Cell Adhesion Molecule)に対する核酸アプタマーを好適に挙げることができる。上皮細胞接着分子は、特に血中循環腫瘍細胞(CTC)の細胞表面物質であることが知られており、これに対する核酸アプタマーを利用可能である(例えば、Analytical Chemistry, 2013,85,p.4141−4149を参照されたい)。したがって、本発明の標的細胞捕捉装置は、標的細胞として血中循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell:CTC)を特異的に捕捉することができる。 The aptamer 33 is a molecule or peptide that specifically binds to a specific molecule. It is usually selected from a huge library of random sequences, but it also exists in nature and is known as a riboswitch, and has been widely studied from basics to applications such as drug search. Aptamers complexed with ribozymes also exist, and those that self-cleave in the presence of the target molecule are known. Aptamers are roughly classified into two types: nucleic acid (DNA / RNA) aptamers and peptide aptamers. Since nucleic acid aptamers can be chemically synthesized, the cost can be significantly reduced. By using nucleic acids, not only "static structures" such as DNA origami and nanowires, but also DNA walkers and riboswitches can be used. , It is preferable because it is possible to freely program a "dynamic structure" such as aptamer (dynamic programming). This program can also be used to amplify the signal for tumor cell capture. One of ordinary skill in the art can appropriately select a nucleic acid aptamer that specifically binds to the cell surface substance of the cell according to the type of the target cell. For example, a nucleic acid aptamer for an epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) can be preferably mentioned. Epithelial cell adhesion molecules are known to be cell surface substances, especially in blood circulating tumor cells (CTCs), for which nucleic acid aptamers are available (eg, Analytical Chemistry, 2013, 85, p. 4141). See -4149). Therefore, the target cell capture device of the present invention can specifically capture blood circulating tumor cells (Circulating Tumor Cell: CTC) as target cells.

抗体33としては、特に限定されるわけではないが、標的細胞がCTCである場合には、上皮細胞接着分子(EpCAM:Epithelial Cell Adhesion Molecule)に対する抗体を好適に挙げることができる。たとえば、abcam製カタログNo.ab32392で入手可能なウサギ抗ヒトEpCAMモノクローナルIgG抗体などを挙げることができる。また、標的細胞がCTCでない場合も、標的細胞表層に発現しているタンパク質を介して、特異的に捕捉することができる。たとえば急性骨髄性白血病を発症している白血球を捕捉する場合、abcam製カタログNo.ab97426を用いればよい。 The antibody 33 is not particularly limited, but when the target cell is CTC, an antibody against an epithelial cell adhesion molecule (EpCAM: Epithelial Cell Attachment Molecule) can be preferably mentioned. For example, Abcam Catalog No. Examples include the rabbit anti-human EpCAM monoclonal IgG antibody available at ab32392. Further, even when the target cell is not CTC, it can be specifically captured via the protein expressed on the surface layer of the target cell. For example, in the case of capturing leukocytes developing acute myeloid leukemia, Abcam Catalog No. ab97426 may be used.

図10乃至12は、標的細胞捕捉フィルター30の担持層31のパターン例を示すSEM写真である。図10は金基板に円形微細孔を形成した担持層31であり、図11は金基板に菱形の粗大孔を形成した担持層31である。円形微細孔を有する担持層31は、大きな寸法の細胞のみ捕捉し、小さな寸法の細胞(たとえば、約7μm径の赤血球や約15μm径の白血球)は通過させ、大きな標的細胞のみを捕捉する篩の機能も有する。菱形粗大孔を有する担持層31は、アプタマー又は抗体33と特異的に結合する細胞のみを捕捉し、アプタマー又は抗体33と結合しない大きな寸法の細胞も小さな寸法の細胞も共に通過させる。図12は、金基板上に複数のピラーを立設した担持層31である。金基板及びピラーの全表面にアプタマー又は抗体33を直接又は間接的に結合させることで、基板面積当たりの標的細胞との接触を増やし、より多量の標的細胞を捕捉することが可能となる。 10 to 12 are SEM photographs showing a pattern example of the carrier layer 31 of the target cell capture filter 30. FIG. 10 is a supporting layer 31 having circular micropores formed on the gold substrate, and FIG. 11 is a supporting layer 31 having diamond-shaped coarse pores formed on the gold substrate. The carrier layer 31 having circular micropores captures only large-sized cells, passes small-sized cells (for example, erythrocytes having a diameter of about 7 μm or leukocytes having a diameter of about 15 μm), and captures only large target cells. It also has a function. The carrying layer 31 having the diamond-shaped coarse pores captures only cells that specifically bind to the aptamer or antibody 33, and allows both large-sized cells and small-sized cells that do not bind to the aptamer or antibody 33 to pass through. FIG. 12 is a carrier layer 31 in which a plurality of pillars are erected on a gold substrate. By directly or indirectly binding the aptamer or antibody 33 to the entire surface of the gold substrate and pillars, it is possible to increase the contact with the target cells per substrate area and capture a larger amount of target cells.

次に、本発明の標的細胞捕捉装置に組み込む標的細胞捕捉フィルター30の製造方法を説明する。 Next, a method for producing the target cell capture filter 30 to be incorporated into the target cell capture device of the present invention will be described.

担持層31は、元素周期表第10族元素、第11族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む金属基板を所定厚み(約5〜約50μm、好ましくは約10〜約20μm)に加工したものをそのまま用いてもよいし、あるいは金属、ガラス、プラスチック又は紙などの支持基板の少なくとも一面に上記元素をメッキ、蒸着、スパッタリングなどの公知の方法を用いて成膜したものを用いてもよい。担持層31に図10乃至12に示すような開孔又はピラーを設ける場合には、公知のフォトリソグラフィー技術や電鋳技術などを用いて形成することができる。 The supporting layer 31 is formed by processing a metal substrate containing elements of Group 10 and Group 11 of the Periodic Table of the Elements and an element selected from a combination thereof to a predetermined thickness (about 5 to about 50 μm, preferably about 10 to about 20 μm). The above-mentioned elements may be used as they are, or at least one surface of a support substrate such as metal, glass, plastic or paper may be coated with the above elements by a known method such as plating, vapor deposition or sputtering. Good. When the supporting layer 31 is provided with holes or pillars as shown in FIGS. 10 to 12, it can be formed by using a known photolithography technique, electroforming technique, or the like.

次いで、担持層31の上に、アプタマー又は抗体33を直接化学結合させ、自己組織化単分子膜32を成膜させるか、もしくは担持層31の上に自己組織化単分子膜32を化学結合させ、自己組織化単分子膜32にアプタマー又は抗体33を化学結合させる。 Next, the aptamer or the antibody 33 is directly chemically bonded to the supporting layer 31 to form a self-assembling monomolecular film 32, or the self-assembling monomolecular film 32 is chemically bonded to the supporting layer 31. , The aptamer or antibody 33 is chemically bound to the self-assembling monomolecular membrane 32.

担持層31とアプタマー又は抗体33とを直接結合させるか、もしくは自己組織化単分子膜32を化学結合させるには、担持層31を構成する金属元素とのチオール結合が好適であり、アプタマー又は抗体、もしくは自己組織化単分子膜の一方の末端にチオール基を導入しておくことが望ましい。 In order to directly bond the supporting layer 31 to the aptamer or the antibody 33 or to chemically bond the self-assembled monolayer 32, a thiol bond with the metal element constituting the supporting layer 31 is preferable, and the aptamer or the antibody Alternatively, it is desirable to introduce a thiol group at one end of the self-assembled monolayer.

自己組織化単分子膜32とアプタマー又は抗体33とはアミド結合させることが好適である。アミド結合を導入するには、自己組織化単分子膜32の末端基を活性化させておくことが好適であり、N−ヒドロキシスクシンイミド基、カルボキシル基、マレイミド基及びアミノ基からなる群から選択される官能基を導入することが好ましい。これらの官能基を導入するには、担持層31上に形成されている自己組織化単分子膜を脂肪族アミン化合物、脂肪族チオール、脂肪族アルコールもしくは脂肪族カルボン酸と接触させることが好ましい。次いでこの官能基とアプタマー又は抗体33とを置換することで、自己組織化単分子膜32にアプタマー又は抗体33を結合させることができる。 It is preferable that the self-assembled monolayer 32 and the aptamer or antibody 33 are amide-bonded. In order to introduce an amide bond, it is preferable to activate the terminal group of the self-assembled monomolecular film 32, and it is selected from the group consisting of N-hydroxysuccinimide group, carboxyl group, maleimide group and amino group. It is preferable to introduce a functional group. In order to introduce these functional groups, it is preferable to contact the self-assembled monomolecular film formed on the supporting layer 31 with an aliphatic amine compound, an aliphatic thiol, an aliphatic alcohol or an aliphatic carboxylic acid. Then, by substituting this functional group with the aptamer or the antibody 33, the aptamer or the antibody 33 can be bound to the self-assembled monolayer 32.

アプタマー又は抗体33が結合していない自己組織化単分子膜32の末端基は、メトキシ基(−OCH)、カルバモイル基(−CONH)、メチルカルバモイル基(−CONHCH)基またはヒドロキシル基(−OH)などでキャッピングすることが好ましく、自己組織化単分子膜32及びアプタマー又は抗体33が形成されている担持層31をこれらの基を含む脂肪族アミンなどと接触させることが好ましい。 The terminal group of the self-assembled monolayer 32 to which the aptamer or antibody 33 is not bound is a methoxy group (-OCH 3 ), a carbamoyl group (-CONH 2 ), a methyl carbamoyl group (-CONHCH 3 ) group or a hydroxyl group (-CONHCH 3 ). It is preferable to cap it with −OH) or the like, and it is preferable to bring the self-assembled monomolecular film 32 and the supporting layer 31 on which the aptamer or the antibody 33 is formed into contact with an aliphatic amine containing these groups.

具体的に、非限定的例として、担持層31として銅基板上に金メッキを施し、自己組織化単分子膜32としてヒドロキシアルカンチオール膜を成膜し、アプタマー33として末端アミノ化アプタマーを結合させた標的細胞捕捉フィルターの製造を説明する。
(1)自己組織化単分子膜の末端がヒドロキシル基である標的細胞捕捉フィルターの製造(図9(1))
銅基板の一面にNiメッキを施した後、金メッキを施して、担持層31を調製する。次いで、担持層31を自己組織化単分子膜の溶液(ヒドロキシ−EG6−ウンデカンチオールのエタノール溶液)中に浸漬し、担持層31上に自己組織化単分子膜32を形成させる。次いで、自己組織化単分子膜32が形成されている担持層31に、炭酸N,N’−ジスクシンイミジル(DSC)を滴下し、自己組織化単分子膜32の末端に官能基(N−ヒドロキシスクシンイミド基)を導入して、末端基を活性化させる。次いで、末端アミノ化アプタマー溶液を滴下して、自己組織化単分子膜32の末端の官能基と反応させ、アミド結合にてアプタマーを結合させて、標的細胞捕捉フィルター30を作製する。この際、アプタマーと結合しなかった末端の官能基は水中で分解されてヒドロキシル基として残る。
(2)自己組織化単分子膜の末端がカルボキシル基である標的細胞捕捉フィルターの製造
銅基板の一面にNiメッキを施した後、金メッキを施して、担持層31を調製する。次いで、担持層31を自己組織化単分子膜の溶液(カルボキシ−EG6−ウンデカンチオールのエタノール溶液)中に浸漬し、担持層31上に自己組織化単分子膜32を形成させる。次いで、自己組織化単分子膜32が形成されている担持層31に、炭酸N,N’−ジスクシンイミジル(DSC)を滴下し、自己組織化単分子膜32の末端に官能基(N−ヒドロキシスクシンイミド基)を導入して、末端基を活性化させる。次いで、末端アミノ化アプタマー溶液を滴下して、自己組織化単分子膜32の末端の官能基と反応させ、アミド基結合にてアプタマーを結合させて、標的細胞捕捉フィルター30を作製する。この際、アプタマーと結合しなかった末端の官能基は水中で分解されてカルボキシル基として残る。
(3)自己組織化単分子膜の末端がアミノ基である標的細胞捕捉フィルターの製造
銅基板の一面にNiメッキを施した後、金メッキを施して、担持層31を調製する。次いで、担持層31を自己組織化単分子膜の溶液(アミノ−EG6−ウンデカンチオールのエタノール溶液)中に浸漬し、自己組織化単分子膜32を形成させる。次いで、末端N−ヒドロキシスクシンイミド化アプタマー溶液を滴下して、自己組織化単分子膜32の末端のアミノ基とアプタマーのN−ヒドロキシスクシンイミド基を反応させ、アプタマーをアミド結合によって連結させて、標的細胞捕捉フィルター30を作製する。この際、アプタマーと結合しなかった末端の官能基はそのままアミノ基として残る。
(4)自己組織化単分子膜の末端をマレイミド基で修飾してアプタマーを結合させた標的細胞捕捉フィルターの製造
銅基板の一面にNiメッキを施した後、金メッキを施して、担持層31を調製する。次いで、担持層31を自己組織化単分子膜の溶液(アミノ−EG6−ウンデカンチオールのエタノール溶液)中に浸漬し、担持層31上に自己組織化単分子膜32を形成させる。次いで、自己組織化単分子膜32が形成されている担持層31に、マレイミド基及びN−ヒドロキシスクシンイミド基を両末端に有する二価性試薬溶液(EMCS(N−(6−マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド:化1)のアセトニトリル溶液)を滴下し、自己組織化単分子膜32の末端に官能基(マレイミド基)を導入する。次いで、末端チオール化アプタマー溶液を滴下して、自己組織化単分子膜32の末端の官能基とアプタマーチオール基を反応させることで、アプタマーを結合させ、標的細胞捕捉フィルター30を作製する。この際、アプタマーと結合しなかった末端のマレイミド基はキャッピング剤(片方にチオール基、もう片方にメトキシ基(−OCH)、カルバモイル基(−CONH)、メチルカルバモイル基(−CONHCH)基、又はヒドロキシル基(−OH)などを含む化合物)でキャッピングする。
Specifically, as a non-limiting example, a copper substrate was plated with gold as a supporting layer 31, a hydroxyalkanethiol film was formed as a self-assembled monolayer 32, and a terminal aptamer was bonded as an aptamer 33. The production of a target cell capture filter will be described.
(1) Production of a target cell capture filter in which the end of the self-assembled monolayer is a hydroxyl group (Fig. 9 (1))
After Ni plating is applied to one surface of the copper substrate, gold plating is applied to prepare the supporting layer 31. Next, the supported layer 31 is immersed in a solution of the self-assembled monolayer (an ethanol solution of hydroxy-EG6-undecanethiol) to form the self-assembled monolayer 32 on the supported layer 31. Next, N, N'-disuccinimidel (DSC) carbonate was added dropwise to the carrier layer 31 on which the self-assembled monolayer 32 was formed, and a functional group (N) was added to the end of the self-assembled monolayer 32. -Hydroxysuccinimide group) is introduced to activate the terminal group. Next, a terminal amination aptamer solution is added dropwise to react with the functional group at the end of the self-assembled monolayer 32, and the aptamer is bound by an amide bond to prepare a target cell capture filter 30. At this time, the terminal functional group that did not bind to the aptamer is decomposed in water and remains as a hydroxyl group.
(2) Manufacture of a target cell capture filter in which the end of the self-assembled monolayer is a carboxyl group After Ni plating is applied to one surface of the copper substrate, gold plating is applied to prepare the supporting layer 31. Next, the supported layer 31 is immersed in a solution of the self-assembled monolayer (ethanol solution of carboxy-EG6-undecanethiol) to form the self-assembled monolayer 32 on the supported layer 31. Next, N, N'-disuccinimidel (DSC) carbonate was added dropwise to the carrier layer 31 on which the self-assembled monolayer 32 was formed, and a functional group (N) was added to the end of the self-assembled monolayer 32. -Hydroxysuccinimide group) is introduced to activate the terminal group. Next, a terminal amination aptamer solution is added dropwise to react with the functional group at the end of the self-assembled monolayer 32, and the aptamer is bound by an amide group bond to prepare a target cell capture filter 30. At this time, the terminal functional group not bonded to the aptamer is decomposed in water and remains as a carboxyl group.
(3) Manufacture of a target cell capture filter in which the end of the self-assembled monolayer is an amino group After Ni plating is applied to one surface of the copper substrate, gold plating is applied to prepare the supporting layer 31. Next, the carrier layer 31 is immersed in a solution of the self-assembled monolayer (ethanol solution of amino-EG6-undecanethiol) to form the self-assembled monolayer 32. Next, a terminal N-hydroxysuccinimided aptamer solution is added dropwise to react the terminal amino group of the self-assembled monomolecular membrane 32 with the N-hydroxysuccinimide group of the aptamer, and the aptamer is linked by an amide bond to form a target cell. The capture filter 30 is manufactured. At this time, the terminal functional group that did not bind to the aptamer remains as an amino group.
(4) Manufacture of a target cell capture filter in which the end of the self-assembled monolayer is modified with a maleimide group to bind an aptamer. After Ni plating is applied to one surface of a copper substrate, gold plating is applied to form a supporting layer 31. Prepare. Next, the supported layer 31 is immersed in a solution of the self-assembled monolayer (ethanol solution of amino-EG6-undecanethiol) to form the self-assembled monolayer 32 on the supported layer 31. Next, a divalent reagent solution (EMCS (N- (6-maleimide caproyloxy)) having a maleimide group and an N-hydroxysuccinimide group at both ends on the supporting layer 31 on which the self-assembled monomolecular film 32 is formed. A functional group (maleimide group) is introduced into the terminal of the self-assembling monomolecular film 32 by dropping (succinimide: acetonitrile solution of 1). Next, a terminal thiolated aptamer solution is added dropwise to react the functional group at the end of the self-assembled monolayer 32 with the aptamer thiol group to bind the aptamer and prepare a target cell capture filter 30. At this time, the terminal maleimide group that did not bind to the aptamer was a capping agent (thiol group on one side, methoxy group (-OCH 3 ), carbamoyl group (-CONH 2 ), methylcarbamoyl group (-CONHCH 3 ) group on the other side. , Or a compound containing a hydroxyl group (-OH) or the like).

(5)自己組織化単分子膜の末端を官能基でキャップした標的細胞捕捉フィルターの製造(図9(2))
自己組織化単分子膜32の末端に官能基を導入した後、末端アミノ化アプタマーとキャッピング剤(メトキシ基(−OCH)、カルバモイル基(−CONH)、メチルカルバモイル基(−CONHCH)基、又はヒドロキシル基(−OH)などを含む)を添加する以外は、上記(1)〜(3)と同様にして、自己組織化単分子膜の末端官能基をキャップした標的細胞捕捉フィルターを作製する。
(6)担持層31に核酸アプタマー33を直接結合させた標的細胞捕捉フィルターの製造(図8)
銅基板の一面にNiメッキを施した後、金メッキを施して担持層31を調製する。次に、末端チオール化アプタマー溶液を担持層31表面に添加し、担持層31にアプタマー33を直接、チオール結合させる。次いで、アプタマー33が結合している担持層31を自己組織化単分子膜の溶液(ヒドロキシ−EG6−ウンデカンチオールのエタノール)中に浸漬し、自己組織化単分子膜32を形成させて、標的細胞捕捉フィルター30を作製する。この場合、自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端は、ヒドロキシル基若しくは上記キャッピング剤でキャップされた官能基でよい。
(5) Production of target cell capture filter in which the end of the self-assembled monolayer is capped with a functional group (Fig. 9 (2))
After introducing a functional group at the end of the self-assembled monomolecular membrane 32, a terminal amination aptamer and a capping agent (methoxy group (-OCH 3 ), carbamoyl group (-CONH 2 ), methyl carbamoyl group (-CONHCH 3 ) group) , Or a target cell capture filter capped with the terminal functional group of the self-assembled monomolecular membrane in the same manner as in (1) to (3) above, except that (including a hydroxyl group (-OH)) is added. To do.
(6) Production of a target cell capture filter in which the nucleic acid aptamer 33 is directly bound to the carrier layer 31 (FIG. 8).
After Ni plating is applied to one surface of the copper substrate, gold plating is applied to prepare the supporting layer 31. Next, a terminal thiolated aptamer solution is added to the surface of the supported layer 31, and the aptamer 33 is directly thiol-bonded to the supported layer 31. Next, the carrying layer 31 to which the aptamer 33 is bound is immersed in a solution of the self-assembled monolayer (ethanol of hydroxy-EG6-undecanethiol) to form the self-assembled monolayer 32, and the target cells are formed. The capture filter 30 is manufactured. In this case, the end on the side not bonded to the supporting layer of the self-assembled monolayer may be a hydroxyl group or a functional group capped with the capping agent.

次に、本発明の標的細胞捕捉装置の使用方法を説明する。 Next, a method of using the target cell capture device of the present invention will be described.

標的細胞捕捉フィルター30をカセット保持部22の底面外周部223の上に載置し、標的細胞捕捉フィルター30の上にフィルターカセット23のリング231を載置する。この状態で、標的細胞捕捉フィルター30及びフィルターカセット23をカセット保持部22の側壁面222の凹部に挿入する。次いで、カセット保持部22をディスポーサブル部20の空間214にはめ込み、カセット保持部22のフランジ221をディスポーサブル部20のフランジ212に載置して固定する。組み立てたディスポーサブル部20を本体10にネジ13で取り付ける。 The target cell capture filter 30 is placed on the bottom outer peripheral portion 223 of the cassette holding portion 22, and the ring 231 of the filter cassette 23 is placed on the target cell capture filter 30. In this state, the target cell capture filter 30 and the filter cassette 23 are inserted into the recesses on the side wall surface 222 of the cassette holding portion 22. Next, the cassette holding portion 22 is fitted into the space 214 of the disposable portion 20, and the flange 221 of the cassette holding portion 22 is placed and fixed on the flange 212 of the disposable portion 20. The assembled disposable portion 20 is attached to the main body 10 with screws 13.

生体試料にディスポーサブル部20を浸漬し、プッシュボタン12を1段目の押し込み部まで押し込み、生体試料をディスポーサブル部20の空間213及び214に吸引する。この状態で、プッシュボタン12を1段目の押し込み部まで押し込む操作を複数回繰り返す。こうして、生体試料が標的細胞捕捉フィルター30と複数回接触し、標的細胞が捕捉される。所定量の生体試料の吸引が完了したら、プッシュボタン12を2段目の押し込み部まで押し込み、生体試料を排出する。 The disposable portion 20 is immersed in the biological sample, the push button 12 is pushed to the first-stage pushing portion, and the biological sample is sucked into the spaces 213 and 214 of the disposable portion 20. In this state, the operation of pushing the push button 12 to the first-stage pushing portion is repeated a plurality of times. In this way, the biological sample comes into contact with the target cell capture filter 30 multiple times, and the target cells are captured. When the suction of the predetermined amount of the biological sample is completed, the push button 12 is pushed to the second-stage pushing portion to discharge the biological sample.

本体10からディスポーサブル部20を取り外し、カセット保持部22を取り出し、フィルターカセット23を外して、標的細胞捕捉フィルター30を直接蛍光観察に供するか、あるいは検出用試薬に投入し、検出用試薬内での検出シグナル応答を観察することができる。検出用試薬は、標的細胞に応じて適宜選択することができる。また、捕捉された標的細胞が微量である場合には、トリガーが結合した核酸アプタマー(以下「トリガー−核酸アプタマー複合体」と称す。)を含む検出用試薬を用いて、蛍光シグナルを増幅させてもよい。トリガー−核酸アプタマー複合体に用いる核酸アプタマーは、標的細胞捕捉フィルターに用いられているアプタマーと同種でも異種でもよい。トリガー−核酸アプタマー複合体が標的細胞と結合すると、トリガー核酸が放出され、蛍光色素で修飾されているDNAプローブが発光し、蛍光シグナルが増幅される。 The disposable portion 20 is removed from the main body 10, the cassette holding portion 22 is taken out, the filter cassette 23 is removed, and the target cell capture filter 30 is directly subjected to fluorescence observation or put into a detection reagent and placed in the detection reagent. The detection signal response can be observed. The detection reagent can be appropriately selected depending on the target cells. When the amount of captured target cells is very small, the fluorescence signal is amplified by using a detection reagent containing a nucleic acid aptamer to which a trigger is bound (hereinafter referred to as "trigger-nucleic acid aptamer complex"). May be good. The nucleic acid aptamer used in the trigger-nucleic acid aptamer complex may be the same or different from the aptamer used in the target cell capture filter. When the trigger-nucleic acid aptamer complex binds to the target cell, the trigger nucleic acid is released, the fluorescent dye-modified DNA probe emits light, and the fluorescent signal is amplified.

本発明の標的細胞捕捉装置は、生体試料から標的細胞を特異的に捕捉することができる。生体試料としては、例えば体液又は組織単離液から選択され得る、標的細胞を含む可能性のある液体試料を好適に挙げることができる。「体液」とは、一般に、血液(血液全体又は血漿)、リンパ液、組織液(組織間液、細胞間液、間質液)、体腔液(関節液、脳脊髄液、漿膜腔液、眼房水等)等を意味する。さらに、消化液(唾液、胃液、胆汁、膵液、腸液等)、汗、涙等も含まれる。好ましくは、血液(血液全体又は血漿)である。「組織単離液」とは、生体組織を公知の方法で単離・分散し、液体状にしたものを意味する。組織の種類は特に限定されず、胃、腸、皮膚、肺、乳房、前立腺、精巣、卵巣、子宮、骨髄等、任意の生体組織を適宜対象として使用しうる。生体組織の単離・分散のための試薬は、例えば、トリプシン、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニターゼ、コラゲナーゼ又はこれらの混合物などの酵素を含む試薬を、生体組織や細胞の種類に応じて適宜使用し得る。例えば、トリプシン、コラゲナーゼなどの複数の酵素を含むCell Isolation Optimizing System(フナコシ株式会社製)など市販の試薬を用いてもよい。 The target cell capture device of the present invention can specifically capture target cells from a biological sample. As the biological sample, for example, a liquid sample that may contain target cells, which can be selected from a body fluid or a tissue isolation solution, can be preferably mentioned. "Body fluid" generally refers to blood (whole blood or plasma), lymph, tissue fluid (interstitial fluid, interstitial fluid, interstitial fluid), body cavity fluid (joint fluid, cerebrospinal fluid, serous cavity fluid, atrioventricular fluid). Etc.) etc. Further, digestive juice (saliva, gastric juice, bile, pancreatic juice, intestinal juice, etc.), sweat, tears, etc. are also included. Preferably, it is blood (whole blood or plasma). The "tissue isolate" means a liquid obtained by isolating and dispersing a biological tissue by a known method. The type of tissue is not particularly limited, and any living tissue such as stomach, intestine, skin, lung, breast, prostate, testis, ovary, uterus, and bone marrow can be appropriately used as a target. As the reagent for isolation / dispersion of living tissue, for example, a reagent containing an enzyme such as trypsin, papain, elastase, hyaluronitase, collagenase or a mixture thereof can be appropriately used depending on the type of living tissue and cells. For example, a commercially available reagent such as Cell Isolation Optimizing System (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) containing a plurality of enzymes such as trypsin and collagenase may be used.

標的細胞としては、腫瘍細胞、その他の一般的な培養細胞、分化多能性細胞などを含み得る。好ましくは、腫瘍細胞である。腫瘍の種類は特に限定されず、脳悪性腫瘍、胃癌、肺癌、乳癌、咽頭癌、食道癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、精巣癌、卵巣癌、膀胱癌、前立腺癌、基底細胞癌、悪性リンパ腫、白血病、神経膠腫等を含む。腫瘍細胞は、原発性腫瘍細胞、転移性腫瘍細胞、血中循環腫瘍細胞等を含む。好ましくは、血中循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell:CTC)である。 Target cells may include tumor cells, other common cultured cells, pluripotent cells and the like. Tumor cells are preferred. The type of tumor is not particularly limited, and is brain malignant tumor, gastric cancer, lung cancer, breast cancer, pharyngeal cancer, esophageal cancer, colon cancer, liver cancer, uterine cancer, testicular cancer, ovarian cancer, bladder cancer, prostate cancer, basal cell cancer, malignant. Includes lymphoma, leukemia, glioma, etc. Tumor cells include primary tumor cells, metastatic tumor cells, circulating tumor cells in the blood, and the like. Preferably, it is a circulating tumor cell (CTC).

本発明の標的細胞捕捉装置により捕捉した標的細胞が検出できないほど極微量である場合には、適宜のシグナル(蛍光など)増幅方法や核酸複製増幅方法などを用いることで、微量標的細胞の検出にも適用できる。たとえば、血液から血中循環腫瘍細胞(CTC)を標的細胞として捕捉した標的細胞捕捉フィルターをトリガー−核酸アプタマー複合体、核酸複合体及び燃料核酸を含む検出溶液に浸漬し、核酸アプタマー複合体から放出されるトリガー核酸によってCTCの蛍光を増幅させて蛍光を検出し、癌細胞の有無を判断することができる。 When the amount of the target cell captured by the target cell capture device of the present invention is too small to be detected, the trace target cell can be detected by using an appropriate signal (fluorescence or the like) amplification method or nucleic acid replication amplification method. Can also be applied. For example, a target cell capture filter that captures circulating tumor cells (CTCs) in blood from blood as target cells is immersed in a detection solution containing a trigger-nucleic acid aptamer complex, a nucleic acid complex, and a fuel nucleic acid, and released from the nucleic acid aptamer complex. The trigger nucleic acid is amplified to amplify the fluorescence of CTC, and the fluorescence can be detected to determine the presence or absence of cancer cells.

以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

標的細胞として血中循環腫瘍細胞を捕捉する場合を例にして、本発明の標的細胞捕捉装置の製作及び標的細胞の捕捉を説明する。 The production of the target cell capture device of the present invention and the capture of target cells will be described by taking as an example the case of capturing blood circulating tumor cells as target cells.

[実施例1]
−自己組織化単分子膜の末端がヒドロキシル基である標的細胞捕捉フィルターの製造
担持層31として、銅基板の一面にNiメッキを施した後、金メッキを施した基板を準備した。この基板をピラニア溶液と10分間接触させて表面を洗浄し、さらに、超純水及びエタノールで洗浄した後、窒素を吹きかけて乾燥させた。次いで、この基板を1mMヒドロキシ−EG6−ウンデカンチオールのエタノール溶液中に浸漬し、飽和蒸気圧下、12時間室温で反応させて自己組織化単分子膜32を形成させた。次いで、この基板をエタノールで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させた後、10mM N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を滴下し、飽和蒸気圧下で5時間静置し、自己組織化単分子膜32の末端にN−ヒドロキシスクシンイミド基を導入した。次いで、乾燥アセトニトリルで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させた後、PBS(リン酸緩衝食塩水)中にて調製した10μM末端アミノ化アプタマー溶液(3’末端側にトリエチレングリコールスペーサーを介し、ヘキサメチレンアミンを導入した構造のアプタマー)を滴下して、飽和蒸気圧下で3時間静置し、自己組織化単分子膜32の末端のN−ヒドロキシスクシンイミド基とアプタマーのアミノ基を反応させ、アミド結合にてアプタマーを結合させた。最後にPBSで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させ、標的細胞捕捉フィルター30を作製した。
[Example 1]
-Manufacture of a target cell capture filter in which the end of the self-assembled monolayer is a hydroxyl group As the supporting layer 31, a copper-plated substrate was prepared after Ni-plating on one surface. The substrate was brought into contact with a piranha solution for 10 minutes to wash the surface, further washed with ultrapure water and ethanol, and then sprayed with nitrogen to dry. Next, this substrate was immersed in an ethanol solution of 1 mM hydroxy-EG6-undecanethiol and reacted at room temperature for 12 hours under saturated vapor pressure to form a self-assembled monolayer 32. Next, the substrate was washed with ethanol, sprayed with nitrogen to dry, and then a 10 mM N, N'-dicyclohexylcarbodiimide solution was added dropwise and allowed to stand for 5 hours under saturated vapor pressure to form a self-assembled monolayer 32. An N-hydroxysuccinimide group was introduced at the end. Then, it was washed with dry acetonitrile, sprayed with nitrogen and dried, and then a 10 μM terminal amination aptamer solution prepared in PBS (phosphate buffered saline) (with a triethylene glycol spacer on the 3'terminal side, hexaxa). An aptamer having a structure in which methyleneamine is introduced) is added dropwise, and the mixture is allowed to stand under saturated vapor pressure for 3 hours to react the N-hydroxysuccinimide group at the terminal of the self-assembled monomolecular film 32 with the amino group of the aptamer to form an amide bond. The aptamers were combined at. Finally, the cells were washed with PBS, sprayed with nitrogen and dried to prepare a target cell capture filter 30.

[実施例2]
−自己組織化単分子膜の末端を官能基でキャップした標的細胞捕捉フィルターの製造
ヒドロキシ−EG6−ウンデカンチオールの自己組織化単分子膜32の末端にN−ヒドロキシスクシンイミド基を導入した後、10μM末端アミノ化アプタマー(3’末端側にトリエチレングリコールスペーサーを介し、ヘキサメチレンアミンを導入した構造のアプタマー)と0.1μMメトキシエチルアミンの混合溶液(PBS中にて調製)を添加し、37℃で3時間静置し、PBSで洗浄後、窒素を吹きかけて乾燥させ、次に2mg/mLメトキシエチルアミン溶液(PBS中にて調製)を基板上に添加し、37℃で3時間静置した以外は、実施例1と同様にして、自己組織化単分子膜の末端を官能基でキャップした標的細胞捕捉フィルターを作製した。
[Example 2]
-Manufacture of a target cell capture filter in which the end of the self-assembled monolayer is capped with a functional group. After introducing an N-hydroxysuccinimide group into the end of the self-assembled monolayer 32 of hydroxy-EG6-undecanthyl, the end is 10 μM. A mixed solution of amination aptamer (aptamer having a structure in which hexamethyleneamine is introduced via a triethylene glycol spacer on the 3'end side) and 0.1 μM methoxyethylamine (prepared in PBS) is added, and 3 at 37 ° C. Allowed for hours, washed with PBS, sprayed with nitrogen to dry, then added 2 mg / mL methoxyethylamine solution (prepared in PBS) onto the substrate and allowed to stand at 37 ° C. for 3 hours, except In the same manner as in Example 1, a target cell capture filter in which the end of the self-assembled monolayer was capped with a functional group was prepared.

[実施例3]
−担持層31に核酸アプタマー33を直接結合させた標的細胞捕捉フィルターの製造
担持層31として、銅基板の一面にNiメッキを施した後、金メッキを施した基板を準備した。この基板をピラニア溶液と10分間接触させて表面を洗浄し、さらに、超純水及びエタノールで洗浄した後、窒素を吹きかけて乾燥させた。次いで、PBS溶液中にて調製した10μM末端チオール化アプタマー溶液(3’末端側にヘキサエチレングリコールスペーサーを介し、トリメチレンチオールを導入した構造のアプタマー)を基板表面に添加し、飽和蒸気圧下で24時間反応させて、担持層31にアプタマー33を直接、チオール結合させた。次いで、アプタマー33が結合している担持層31を1mMヒドロキシ−EG6−ウンデカンチオールのエタノール溶液中に浸漬し、飽和蒸気圧下、2時間室温で反応させて自己組織化単分子膜32を形成させた。次いで、エタノールで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させて、標的細胞捕捉フィルター30を作製した。
[Example 3]
-Manufacture of a target cell capture filter in which the nucleic acid aptamer 33 is directly bound to the supporting layer 31 As the supporting layer 31, a substrate subjected to Ni plating on one surface of a copper substrate and then gold-plated was prepared. The substrate was brought into contact with a piranha solution for 10 minutes to wash the surface, further washed with ultrapure water and ethanol, and then sprayed with nitrogen to dry. Next, a 10 μM-terminated thiolated aptamer solution prepared in PBS solution (aptamer having a structure in which trimethylenethiol was introduced via a hexaethylene glycol spacer on the 3'-terminal side) was added to the substrate surface, and 24 under saturated vapor pressure. After a time reaction, the aptamer 33 was directly thiol-bonded to the carrying layer 31. Next, the carrying layer 31 to which the aptamer 33 was bound was immersed in an ethanol solution of 1 mM hydroxy-EG6-undecanthyl and reacted at room temperature for 2 hours under saturated vapor pressure to form a self-assembled monolayer 32. .. Then, the cells were washed with ethanol and sprayed with nitrogen to dry them to prepare a target cell capture filter 30.

[実施例4]
−標的細胞としての腫瘍細胞の捕捉
多くの固形癌種の細胞膜上に高発現しているEpCAMに対するアプタマー(配列番号1)を用い、癌細胞の特異的な捕捉を試みた。
[Example 4]
-Capture of tumor cells as target cells We attempted to specifically capture cancer cells using an aptamer (SEQ ID NO: 1) for EpCAM, which is highly expressed on the cell membrane of many solid cancer types.

MDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)(独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより入手)及びKATOIII(ヒト胃癌由来細胞)(独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより入手)を標的細胞として、細胞膜をDiO(緑色標識染色体)で染色し、HEK293T(ヒト胎児腎由来細胞)(独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターより入手)を対照となる正常細胞として、細胞膜をDiD(赤色標識染色体)で染色し、細胞の核をDAPI(4’、6−ジアミジノ−2−フェニルインドール、青色標識染色体)で染色した後、それぞれの懸濁液(2×10細胞/mL)中に、細胞膜上の疎水性が高い部位への非特異的な吸着を抑えるため、マスキング剤としてtRNA(1mg/mL)を加え、撹拌後、37℃で30分インキュベートし、3種類のサンプル生体試料を調製した。 The cell membrane is DiO with MDA-MB-453 (human breast cancer cells) (obtained from the Bioresource Center of the Institute of Physical and Chemical Research) and KATO III (cells derived from human gastric cancer) (obtained from the Bioresource Center of the Institute of Physical and Chemical Research) as target cells. Stain with (green-labeled chromosome) and use HEK293T (human fetal kidney-derived cells) (obtained from BioResource Center, Institute of Physical and Chemical Research) as a control normal cell, and stain the cell membrane with DiD (red-labeled chromosome). nuclei DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole, blue labeled chromosome) after staining with, during each suspension (2 × 10 5 cells / mL), more hydrophobic on the cell membrane In order to suppress non-specific adsorption to the site, tRNA (1 mg / mL) was added as a masking agent, and after stirring, the cells were incubated at 37 ° C. for 30 minutes to prepare three types of sample biological samples.

次いで、実施例2で作製した標的細胞捕捉フィルターに3種類の生体試料を滴下し、PBSで洗浄した後、蛍光を観察した。結果を図13に示す。比較例として、標的細胞捕捉フィルターの代わりに、アプタマーを修飾していない金メッキ銅基板からなるフィルターを用いた以外は同様に行った。 Next, three types of biological samples were added dropwise to the target cell capture filter prepared in Example 2, washed with PBS, and then fluorescence was observed. The results are shown in FIG. As a comparative example, the same procedure was performed except that a filter made of an aptamer-unmodified gold-plated copper substrate was used instead of the target cell capture filter.

図13左側からMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)及びKATOIII(ヒト胃癌由来細胞)の赤色の蛍光は観察されたが、正常細胞であるHEK293T(ヒト胎児腎由来細胞)の赤色の蛍光は観察されなかったことから、本発明の標的細胞捕捉装置を用いることで、標的細胞のみを特異的に捕捉できたことが確認できた。また、比較例(図13右側)では、赤色の蛍光が観察できず、標的細胞を捕捉できなかったことが確認できた。 From the left side of FIG. 13, red fluorescence of MDA-MB-453 (human breast cancer cells) and KATO III (human gastric cancer-derived cells) was observed, but red fluorescence of normal cells HEK293T (human fetal kidney-derived cells) was observed. Therefore, it was confirmed that only the target cells could be specifically captured by using the target cell capture device of the present invention. Further, in the comparative example (right side of FIG. 13), it was confirmed that the red fluorescence could not be observed and the target cells could not be captured.

[実施例5]
実施例1で製造した標的細胞捕捉フィルターを用いた以外は実施例4と同様にして、標的細胞を捕捉し、蛍光観察を行った。結果を図14に示す。
[Example 5]
Target cells were captured and fluorescence observation was performed in the same manner as in Example 4 except that the target cell capture filter produced in Example 1 was used. The results are shown in FIG.

図14(a)は正常細胞であるHEK293T(ヒト胎児腎由来細胞)をDiDの蛍光で観察した画像であり、図14(b)はHEK293TをDAPIの蛍光で観察した画像であり、図14(c)は(a)と(b)をマージした画像である。図14(a)〜(c)より、正常細胞はほとんど捕捉されていないことが確認できる。図14(d)は捕捉されたMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)の細胞膜をDiOの蛍光で観察した画像であり、図14(e)は捕捉されたMDA−MB−453の細胞核をDAPIの蛍光で観察した画像であり、図14(f)は(d)と(e)をマージした画像である。図14(d)〜(f)より、標的細胞であるMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)の蛍光が確認できた。図14(c)と(f)を対比することによって標的細胞のみを特異的に捕捉できたといえる。 FIG. 14A is an image of normal cells HEK293T (human fetal kidney-derived cells) observed by fluorescence of DiD, and FIG. 14B is an image of HEK293T observed by fluorescence of DAPI. c) is an image obtained by merging (a) and (b). From FIGS. 14 (a) to 14 (c), it can be confirmed that almost no normal cells are captured. FIG. 14 (d) is an image of the cell membrane of the captured MDA-MB-453 (human breast cancer cell) observed by fluorescence of DiO, and FIG. 14 (e) shows the cell nucleus of the captured MDA-MB-453 with DAPI. 14 (f) is an image obtained by merging (d) and (e). From FIGS. 14 (d) to 14 (f), the fluorescence of the target cells MDA-MB-453 (human breast cancer cells) could be confirmed. It can be said that only the target cells could be specifically captured by comparing FIGS. 14 (c) and 14 (f).

[実施例6]
実施例3で製造した標的細胞捕捉フィルターを用いた以外は実施例4と同様にして、標的細胞を捕捉し、蛍光観察を行った。結果を図15に示す。
[Example 6]
The target cells were captured and fluorescence observation was performed in the same manner as in Example 4 except that the target cell capture filter produced in Example 3 was used. The results are shown in FIG.

図15(a)は正常細胞であるHEK293T(ヒト胎児腎由来細胞)をDiDの蛍光で観察した画像であり、図15(b)はHEK293TをDAPIの蛍光で観察した画像であり、図15(c)は(a)と(b)をマージした画像である。図15(a)〜(c)より、赤色の蛍光は非常に少なく、正常細胞はあまり捕捉されていないことが確認できる。図15(d)はMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)の細胞膜をDiO蛍光で観察した画像であり、図15(e)はMDA−MB−453の細胞核をDAPIの蛍光で観察した画像であり、図15(f)は(d)と(e)をマージした画像である。図15(d)〜(f)より、標的細胞であるMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)の蛍光が多数確認できた。図15(c)と(f)を対比することによって標的細胞のみを特異的に捕捉できたといえる。 FIG. 15 (a) is an image of normal cells HEK293T (human fetal kidney-derived cells) observed by fluorescence of DiD, and FIG. 15 (b) is an image of HEK293T observed by fluorescence of DAPI. c) is an image obtained by merging (a) and (b). From FIGS. 15 (a) to 15 (c), it can be confirmed that the red fluorescence is very small and normal cells are not well captured. FIG. 15 (d) is an image obtained by observing the cell membrane of MDA-MB-453 (human breast cancer cells) with DiO fluorescence, and FIG. 15 (e) is an image obtained by observing the cell nucleus of MDA-MB-453 with DAPI fluorescence. Yes, FIG. 15 (f) is an image obtained by merging (d) and (e). From FIGS. 15 (d) to 15 (f), a large number of fluorescences of the target cells MDA-MB-453 (human breast cancer cells) could be confirmed. It can be said that only the target cells could be specifically captured by comparing FIGS. 15 (c) and 15 (f).

[実施例7]
担持層31として、銅基板の一面にNiメッキを施した後、金メッキを施した基板を準備した。この基板をピラニア溶液と10分間接触させて表面を洗浄し、さらに、超純水及びエタノールで洗浄した後、窒素を吹きかけて乾燥させた。次いで、この基板を1mM6−メルカプト−1−ヘキサノールのエタノール溶液中に浸漬し、飽和蒸気圧下、12時間室温で反応させて自己組織化単分子膜32を形成させた。次いで、この基板をエタノールで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させた後、10mM N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド溶液を滴下し、飽和蒸気圧下で5時間静置し、自己組織化単分子膜32の末端にN−ヒドロキシスクシンイミド基を導入した。次いで、乾燥アセトニトリルで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させた後、PBS(リン酸緩衝食塩水)中にて調製した10μM末端アミノ化アプタマー溶液(3’末端側にトリエチレングリコールスペーサーを介し、ヘキサメチレンアミンを導入した構造のアプタマー)を滴下して、飽和蒸気圧下で3時間静置し、自己組織化単分子膜32の末端のN−ヒドロキシスクシンイミド基とアプタマーのアミノ基を反応させ、アミド結合にてアプタマーを結合させた。最後にPBSで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させ、標的細胞捕捉フィルター30を作製した。
[Example 7]
As the supporting layer 31, a gold-plated substrate was prepared after Ni-plating on one surface of the copper substrate. The substrate was brought into contact with a piranha solution for 10 minutes to wash the surface, further washed with ultrapure water and ethanol, and then sprayed with nitrogen to dry. Next, this substrate was immersed in an ethanol solution of 1 mM 6-mercapto-1-hexanol and reacted at room temperature for 12 hours under saturated vapor pressure to form a self-assembled monolayer 32. Next, the substrate was washed with ethanol, sprayed with nitrogen to dry, and then a 10 mM N, N'-dicyclohexylcarbodiimide solution was added dropwise and allowed to stand for 5 hours under saturated vapor pressure to form a self-assembled monolayer 32. An N-hydroxysuccinimide group was introduced at the end. Then, it was washed with dry acetonitrile, sprayed with nitrogen and dried, and then a 10 μM terminal amination aptamer solution prepared in PBS (phosphate buffered saline) (with a triethylene glycol spacer on the 3'terminal side, hexaxa). An aptamer having a structure in which methyleneamine is introduced) is added dropwise, and the mixture is allowed to stand under saturated vapor pressure for 3 hours to react the N-hydroxysuccinimide group at the terminal of the self-assembled monomolecular film 32 with the amino group of the aptamer to form an amide bond. The aptamers were combined at. Finally, the cells were washed with PBS, sprayed with nitrogen and dried to prepare a target cell capture filter 30.

自己組織化単分子膜として6−メルカプト−1−ヘキサノールを用いて上記の標的細胞捕捉フィルターを用いた以外は、実施例4と同様にして、標的細胞を捕捉し、蛍光観察を行った。結果を図16に示す。 Target cells were captured and fluorescence observation was performed in the same manner as in Example 4, except that 6-mercapto-1-hexanol was used as the self-assembled monolayer and the above-mentioned target cell capture filter was used. The results are shown in FIG.

図16(a)は正常細胞であるHEK293T(ヒト胎児腎由来細胞)をDiDの蛍光で観察した画像であり、図16(b)はHEK293TをDAPIの蛍光で観察した画像であり,図16(c)は(a)と(b)をマージした画像である。図16(a)〜(c)より、正常細胞はあまり捕捉されていないことが確認できる。図16(d)はMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)の細胞膜をDiO蛍光で観察した画像であり、図16(e)はMDA−MB−453の細胞核をDAPIの蛍光で観察した画像であり、図16(f)は(d)と(e)をマージした画像である。図16(d)〜(f)より、標的細胞であるMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)の多数の蛍光が明瞭に確認できた。図16(c)と(f)を対比することによって標的細胞のみを特異的に捕捉できたといえる。 FIG. 16A is an image of normal cells HEK293T (human fetal kidney-derived cells) observed by fluorescence of DiD, and FIG. 16B is an image of HEK293T observed by fluorescence of DAPI. c) is an image obtained by merging (a) and (b). From FIGS. 16A to 16C, it can be confirmed that normal cells are not well captured. FIG. 16 (d) is an image of the cell membrane of MDA-MB-453 (human breast cancer cells) observed by DiO fluorescence, and FIG. 16 (e) is an image of the cell nucleus of MDA-MB-453 observed by DAPI fluorescence. Yes, FIG. 16 (f) is an image obtained by merging (d) and (e). From FIGS. 16 (d) to 16 (f), a large number of fluorescences of the target cells MDA-MB-453 (human breast cancer cells) could be clearly confirmed. It can be said that only the target cells could be specifically captured by comparing FIGS. 16 (c) and 16 (f).

[実施例8]
担持層31として、銅基板の一面にNiメッキを施した後、金メッキを施した基板を準備した。この基板をピラニア溶液と10分間接触させて表面を洗浄し、さらに、超純水及びエタノールで洗浄した後、窒素を吹きかけて乾燥させた。次いで、PBS溶液中にて調製した10μM末端チオール化アプタマー溶液(3’末端側にヘキサエチレングリコールスペーサーを介し、トリメチレンチオールを導入した構造のアプタマー)を基板表面に添加し、飽和蒸気圧下で24時間反応させて、担持層31にアプタマー33を直接、チオール結合させた。次いで、アプタマー33が結合している担持層31を1mM6−メルカプト−1−ヘキサノールのエタノール溶液中に浸漬し、飽和蒸気圧下、2時間室温で反応させて自己組織化単分子膜32を形成させた。次いで、エタノールで洗浄し、窒素を吹きかけて乾燥させて、標的細胞捕捉フィルター30を作製した。
[Example 8]
As the supporting layer 31, a gold-plated substrate was prepared after Ni-plating on one surface of the copper substrate. The substrate was brought into contact with a piranha solution for 10 minutes to wash the surface, further washed with ultrapure water and ethanol, and then sprayed with nitrogen to dry. Next, a 10 μM-terminal thiolated aptamer solution prepared in PBS solution (aptamer having a structure in which trimethylenethiol was introduced via a hexaethylene glycol spacer on the 3'-terminal side) was added to the substrate surface, and 24 under saturated vapor pressure. After a time reaction, the aptamer 33 was directly thiol-bonded to the carrying layer 31. Next, the carrying layer 31 to which the aptamer 33 was bound was immersed in an ethanol solution of 1 mM 6-mercapto-1-hexanol and reacted at room temperature for 2 hours under saturated vapor pressure to form a self-assembled monolayer 32. .. Then, it was washed with ethanol and sprayed with nitrogen to dry it to prepare a target cell capture filter 30.

自己組織化単分子膜として6−メルカプト−1−ヘキサノールを用いて上記の標的細胞捕捉フィルターを用いた以外は、実施例4と同様にして、標的細胞を捕捉し、蛍光観察を行った。結果を図17に示す。 Target cells were captured and fluorescence observation was performed in the same manner as in Example 4, except that 6-mercapto-1-hexanol was used as the self-assembled monolayer and the above-mentioned target cell capture filter was used. The results are shown in FIG.

図17(a)は正常細胞であるHEK293T(ヒト胎児腎由来細胞)をDiDの蛍光で観察した画像であり、図17(b)はHEK293TをDAPIの蛍光で観察した画像であり、図17(c)は(a)と(b)をマージした画像である。図17(a)〜(c)より、正常細胞はあまり捕捉されていないことが確認できる。図17(d)はMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)の細胞膜をDiO蛍光で観察した画像であり、図17(e)はMDA−MB−453の細胞核をDAPIの蛍光で観察した画像であり、図17(f)は(d)と(e)をマージした画像である。図17(d)〜(f)より、標的細胞であるMDA−MB−453(ヒト乳癌細胞)の多数の蛍光が明瞭に確認できた。図17(c)と(f)を対比することによって、標的細胞のみを特異的に捕捉できたといえる。 FIG. 17 (a) is an image of normal cells HEK293T (human fetal kidney-derived cells) observed by fluorescence of DiD, and FIG. 17 (b) is an image of HEK293T observed by fluorescence of DAPI. c) is an image obtained by merging (a) and (b). From FIGS. 17 (a) to 17 (c), it can be confirmed that normal cells are not well captured. FIG. 17 (d) is an image of the cell membrane of MDA-MB-453 (human breast cancer cells) observed with DiO fluorescence, and FIG. 17 (e) is an image of the cell nucleus of MDA-MB-453 observed with DAPI fluorescence. Yes, FIG. 17 (f) is an image obtained by merging (d) and (e). From FIGS. 17 (d) to 17 (f), a large number of fluorescences of the target cells MDA-MB-453 (human breast cancer cells) could be clearly confirmed. By comparing FIGS. 17 (c) and 17 (f), it can be said that only the target cells could be specifically captured.

なお、本実施例で使用した核酸アプタマー等の配列は以下のとおりである。 The sequences of nucleic acid aptamers and the like used in this example are as follows.

核酸アプタマー:
SYL3C:5’−CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG−3’ (配列番号1)
Nucleic acid aptamer:
SYL3C: 5'-CACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG-3'(SEQ ID NO: 1)

本発明の標的細胞捕捉装置は、迅速に標的細胞のみを特異的に捕捉することができ、標的細胞を捕捉した後、標的細胞捕捉フィルターを取り外して直接蛍光を観察するか、もしくは検出液に浸漬して標的細胞を検出できるため、例えばがん患者への外科手術中に病巣摘出の奏功を判断するための検査にも利用することが可能である。超高齢社会の進展による医療費の高騰という課題に対してもがんの早期発見による利点は大きく、社会のニーズに対して時適を得ており、将来性も高い。 The target cell capture device of the present invention can rapidly and specifically capture only the target cell, and after capturing the target cell, the target cell capture filter is removed and the fluorescence is directly observed or immersed in the detection solution. Since the target cells can be detected, for example, it can be used for a test for determining the success of lesion removal during surgery on a cancer patient. The benefits of early detection of cancer are great against the problem of soaring medical costs due to the development of a super-aging society, and it is timely to meet the needs of society and has high potential.

10:本体
20:ディスポーサブル部
30:標的細胞捕捉フィルター
31:担持層
32:自己組織化単分子膜
33:アプタマー又は抗体
10: Body 20: Disposable part 30: Target cell capture filter 31: Support layer 32: Self-assembled monolayer 33: Aptamer or antibody

Claims (10)

生体試料を吸引して保持する本体と、
当該本体の先端部に着脱自在に取り付けられるディスポーサブル部と、
を備える標的細胞捕捉装置であって、
当該ディスポーサブル部は、
先端に生体試料導入部となる開口が設けられ、
当該本体との連結側に着脱自在に取り付けられる標的細胞捕捉フィルターを備え、
当該標的細胞捕捉フィルターは、
(i)元素周期表第10族元素、第11族元素及びこれらの組み合わせから選択される元素を含む担持層と、
(ii)当該担持層上に設けられている自己組織化単分子膜と、
(iii)当該担持層上に直接、又は当該自己組織化単分子膜を介して設けられており、標的細胞と特異的に結合するアプタマー又は抗体と、
を備え
当該担持層は、当該アプタマー又は抗体と結合しない大きな寸法の細胞も小さな寸法の細胞も共に通過させる粗大孔を有する、標的細胞捕捉装置。
The main body that sucks and holds the biological sample,
A disposable part that can be detachably attached to the tip of the main body,
It is a target cell capture device equipped with
The disposable part is
An opening is provided at the tip to serve as a biological sample introduction part.
Equipped with a target cell capture filter that can be detachably attached to the connection side with the main body
The target cell capture filter is
(I) Periodic Table of Elements A carrier layer containing Group 10 elements, Group 11 elements and an element selected from a combination thereof, and a supporting layer.
(Ii) A self-assembled monolayer provided on the carrier layer,
(Iii) An aptamer or antibody that is provided directly on the carrier layer or via the self-assembled monolayer and that specifically binds to the target cell.
Equipped with a,
The carrier layer is a target cell capture device having coarse pores through which both large-sized cells and small-sized cells that do not bind to the aptamer or antibody can pass through .
前記自己組織化単分子膜は、一方の末端基が前記担持層を構成する元素と結合しており、前記担持層に結合していない側の末端基の少なくとも一部は、前記アプタマー又は抗体と結合している、請求項1に記載の標的細胞捕捉装置。 In the self-assembled monolayer, one terminal group is bonded to an element constituting the supporting layer, and at least a part of the terminal group on the side not bonded to the supporting layer is the aptamer or the antibody. The target cell capture device according to claim 1, which is bound. 前記自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基のうち前記アプタマー又は抗体が結合していない末端基の全部又は一部はキャップされている、請求項1又は2に記載の標的細胞捕捉装置。 The first or second claim, wherein all or a part of the terminal groups on the side not bound to the supporting layer of the self-assembled monolayer and the terminal groups to which the aptamer or antibody is not bound is capped. Target cell capture device. 前記担持層は、金、白金、銀、パラジウム、銅及びこれらの組み合わせからなる群から選択される元素を含む、請求項1〜3のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。 The target cell capture device according to any one of claims 1 to 3, wherein the supporting layer contains an element selected from the group consisting of gold, platinum, silver, palladium, copper and combinations thereof. 前記自己組織化単分子膜は、一方の末端にチオール基を含み、他方の末端にカルボキシル基、ヒドロキシル基、アミノ基又はN−ヒドロキシスクシンイミド基を含む、請求項1〜4のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。 The self-assembled monolayer comprises any one of claims 1 to 4, wherein the self-assembled monolayer contains a thiol group at one end and a carboxyl group, a hydroxyl group, an amino group or an N-hydroxysuccinimide group at the other end. Target cell capture device. 前記アプタマー及び/又は前記自己組織化単分子膜は、チオール結合により前記担持層を構成する元素と結合している、請求項1〜5のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。 The target cell capture device according to any one of claims 1 to 5, wherein the aptamer and / or the self-assembled monolayer is bound to an element constituting the supporting layer by a thiol bond. 前記アプタマーは、アミド結合により前記自己組織化単分子膜と結合している、請求項1〜6のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。 The target cell capture device according to any one of claims 1 to 6, wherein the aptamer is bound to the self-assembled monolayer by an amide bond. 前記自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基のうち前記アプタマー又は抗体が結合していない末端基の全部又は一部は、メトキシ基、カルバモイル基、メチルカルバモイル基、ヒドロキシル基から選択される基でキャップされている、請求項1〜7のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。 Of the terminal groups on the side not bound to the supporting layer of the self-assembled monomolecular membrane, all or part of the terminal groups to which the aptamer or antibody is not bound are methoxy group, carbamoyl group, methylcarbamoyl group, hydroxyl group. The target cell capture device according to any one of claims 1 to 7, which is capped with a group selected from the groups. 前記自己組織化単分子膜の担持層に結合していない側の末端基であって、前記アプタマー又は抗体が結合していない末端基は、ヒドロキシル基、カルボキシル基、又はアミノ基である、請求項1〜8のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。 Claimed that the terminal group on the side not bound to the supporting layer of the self-assembled monolayer and to which the aptamer or antibody is not bound is a hydroxyl group, a carboxyl group, or an amino group. The target cell capture device according to any one of 1 to 8. 前記標的細胞は血中循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell:CTC)である、請求項1〜8のいずれか1に記載の標的細胞捕捉装置。 The target cell capture device according to any one of claims 1 to 8, wherein the target cell is a circulating tumor cell (CTC).
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