JP6762932B2 - シーケンシングリードのde novoアセンブリーの方法、システム、およびプロセス - Google Patents
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Description
被験体は、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト動物、植物、細菌、菌類、ウイルス、または原生生物を含めて、任意の生きているまたは生きていない生物でありうる。被験体は任意の年齢でありうる(たとえば、胚、胎児、乳児、子供、成人)。被験体は任意の性別でありうる(たとえば、男性、女性、またはそれらの組合せ)。被験体は妊娠していてもよい。被験体は患者でありうる(たとえば、ヒト患者)。
本明細書には、サンプルを分析するための方法および組成物が提供される。サンプル(たとえば、核酸を含むサンプル)は好適な被験体から取得しうる。サンプルは被験体またはその一部から直接的に単離または取得しうる。いくつかの実施形態では、サンプルは個人または医療専門家から間接的に取得される。サンプルは、被験体またはその一部から単離または取得される任意の検体でありうる。サンプルは、複数の被験体から単離または取得される任意の検体でありうる。検体の例としては、限定されるものではないが、被験体に由来する流体または組織、たとえば、限定されるものではないが、血液または血液産物(たとえば、血清、血漿、血小板、バフィーコートなど)、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、脳脊髄液、脊髄液、洗浄液(たとえば、肺、胃、腹膜、腺管、耳、関節鏡検査)、生検サンプル、羊膜外腔穿刺サンプル、細胞(血液細胞、リンパ球、胎盤細胞、幹細胞、骨髄由来細胞、胚細胞、もしくは胎児細胞)またはその一部(たとえば、ミトコンドリア、核、抽出物など)、尿、糞便、痰、唾液、鼻粘液、前立腺液、洗浄液、精液、リンパ液、胆汁、涙液、汗、母乳、胸液など、またはそれらの組合せが挙げられる。核酸が抽出される流体サンプルまたは組織サンプルは無細胞でありうる(たとえば、細胞フリー)。組織の例としては、限定されるものではないが、器官組織(たとえば、肝臓、腎臓、肺、胸腺、副腎、皮膚、膀胱、生殖器官、腸、結腸、脾臓、脳など、またはそれらの一部)、上皮組織、毛髪、毛嚢、導管、管路、骨、眼、鼻、口、咽頭、耳、爪など、それらの一部、またはそれらの組合せが挙げられる。サンプルは、正常、健常、疾患(たとえば感染)、および/または癌性の細胞または組織を含みうる(たとえば癌細胞)。被験体から取得されるサンプルは、複数の生物の細胞または細胞物質(たとえば核酸)を含みうる(たとえば、ウイルス核酸、胎児核酸、細菌核酸、寄生生物核酸)。
「核酸」という用語は、DNA(たとえば、相補的DNA(cDNA)、ゲノムDNA(gDNA)など)、RNA(たとえば、メッセージRNA(mRNA)、低分子阻害RNA(siRNA)、リボソームRNA(rRNA)、tRNA、マイクロRNA)、ならびに/またはDNAアナログもしくはRNAアナログ(たとえば、塩基アナログ、糖アナログ、および/もしくは非天然骨格などを含有する)、RNA/DNAハイブリッド、さらにはポリアミド核酸(PNA)などの任意の組成の1つ以上の核酸(たとえば、核酸のセットまたはサブセット)を意味する。これらの核酸はすべて、一本鎖または二本鎖の形態でありうるとともに、とくに限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同じように機能しうる天然のヌクレオチドの公知のアナログを包含しうる。とくに限定されない限り、この用語は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および天然のヌクレオチドの公知のアナログを含む核酸を包含する。核酸は、その等価体、誘導体、または変異体として、ヌクレオチドアナログ、一本鎖(「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「マイナス」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム)ポリヌクレオチド、および二本鎖ポリヌクレオチドから合成されたRNAまたはDNAの好適なアナログを含みうる。核酸は一本鎖または二本鎖でありうる。核酸は、2以上、3以上、4以上、または5以上の任意の長さの隣接ヌクレオチドでありうる。核酸は、配列(たとえば核酸配列、たとえば配列)として当技術分野で公知の特定の5’→3’の順のヌクレオチドを含みうる。
核酸は、当技術分野で公知の好適な方法を用いて1つ以上の被験体、1つ以上のサンプル、または1つ以上の供給源から誘導、単離、抽出、精製、または部分精製しうる。核酸の単離、抽出、および/または精製のために任意の好適な方法を使用可能である。
ある特定の実施形態では、核酸(たとえば、アンプリコン、ライブラリーの核酸、キャプチャーされた核酸)は、核酸シーケンシングを含むプロセスにより分析される。いくつかの実施形態では、核酸はシーケンシングされうる。いくつかの実施形態では、完全または実質的に完全な配列が得られ、ときには部分配列が得られる。
核酸をシーケンシング法に付すと、多くの場合、シーケンスリードが提供される。本明細書で用いられる場合、「リード」(たとえば、「リード」、「シーケンスリード」)とは、本明細書に記載のまたは当技術分野で公知の任意のシーケンシングプロセスにより生成された短いヌクレオチド配列のことである。リードは、核酸断片の一方の末端から生成可能であり(「シングルエンドリード」)、ときには核酸断片の両方の末端から生成される(たとえば、ペアエンドリード、ペアエンドシーケンスリード、ダブルエンドリード)。ペアエンドリードは、多くの場合、1つ以上のリードペア(たとえば、2つのリード、リードメイトペア)を含み、各リードペアは、シーケンシングされた核酸断片の各末端から取得したものである。リードメイトペアの各リードは、本明細書ではリードメイトと呼ばれることもある。ペアエンドシーケンシング法(たとえば、1つ以上の核酸ライブラリーがシーケンシングされる場合)は、多くの場合、複数のリードメイトペアおよび複数のリードメイトをもたらす。
シーケンスリードはマッピング可能である。いくつかの実施形態では、好適なマッピング方法、プロセス、またはアルゴリズムを使用可能である。ある特定の実施形態では、修正マッピング方法およびプロセスが本明細書で使用される。マッピングプロセスのある特定の態様を以下に記載する。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法、プロセス、またはシステムは、リードリクルートメントプロセスを含む。リードリクルートメントプロセスは、多くの場合、リードリクルートメントコンポーネントにより行われる。ある特定の実施形態では、リードリクルートメントプロセスは、本明細書に記載のシーケンスリードを取得および/または選択するステップを含む。いくつかの実施形態では、リードリクルートメントプロセスは、複数のリードからリードサブセットを取得および/または選択する方法を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書の方法またはプロセスは、シーケンスリードのセットまたはサブセットでパイルアップ関係を決定するステップを含む。いくつかの実施形態では、パイルアップ関係は、対象の参照ゲノムの領域にリードのいくつかをマッピングする場合にセットの複数のリード間に1つ以上のオーバーラップ(たとえば、複数のオーバーラップ)を含む。いくつかの実施形態では、パイルアップ関係はタイリンググラフの構築を含む。いくつかの実施形態では、パイルアップ関係はペアエンドシーケンスリードセットのすべてのリードを含む。いくつかの実施形態では、パイルアップ関係はペアエンドシーケンスリードセットの選択されたリードを含む。いくつかの実施形態では、オーバーラップは2つ以上のリードのアライメントを含む。ある特定の実施形態では、オーバーラップはアライメントスコアを含む。ある特定の実施形態では、オーバーラップはk−merハッシングストラテジーに従って決定される。
いくつかの実施形態では、1つ以上のコンティグは、リードセットでアセンブルおよび/または構築される。いくつかの実施形態では、1つ以上のコンティグは、リードセットで選択および/または記憶される複数のオーバーラップに従って構築される。ある特定の実施形態では、1つ以上のコンティグは、リードセットの複数のオーバーラップを含むパイルアップ関係に従って構築される。ある特定の実施形態では、コンティグは、1つ以上のスターターリードから構築される。ある特定の実施形態では、1つ以上のコンティグは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10またはそれ以上のスターターリードから構築される。スターターリードはセットの任意の好適なリードでありうる。ときには、スターターリードは、リードセットの最も5’側のリードおよび/または最も3’側のリードを含む。最も5’側のリードは、多くの場合、セットのシーケンスリードの一部または全部がマッピングされる対象のゲノム領域の最も5’側の領域にマッピングされるリードである。同様に、最も3’側のリードは、多くの場合、セットのシーケンスリードの一部または全部がマッピングされる対象のゲノム領域の最も3’側の領域にマッピングされるリードである。ある特定の実施形態では、コンティグは、セットの最も3’側のリードでも最も5’側のリードでもないスターターリードからアセンブルされる。
たとえば、前のステップでアセンブルされたコンティグは、対象の全ゲノム領域に延在しうるか、またはカバレッジが低下する位置もしくは高いリードエラー率(たとえば通常系統誤差)により高スコアオーバーラップが阻止される位置で終了しうる。ある特定の実施形態では、対象の全ゲノム領域に延在するコンティグはスーパーコンティグであり、追加のアセンブリーを必要としない。スーパーコンティグは、多くの場合、対象の全ゲノム領域に延在する。対象の全ゲノム領域に延在しないコンティグは、スーパーコンティグにアセンブルしうる。いくつかの実施形態では、1つ以上のスーパーコンティグが2つ以上のコンティグからアセンブルされる。ある特定の実施形態では、コンティグを一体的にリンクしてスーパーコンティグを形成するためにするために、リードメイト(たとえばリードメイトペアのもの)が使用される。たとえば、いくつかの実施形態では、ペアの第1のリードメイトが第1のコンティグとのオーバーラップを提供し、かつペアの第2のリードメイトが他のコンティグとのオーバーラップを提供する場合、2つの近接コンティグ間のカバレッジギャップは、リードメイトペアのリードメイトによりブリッジしうる。2つの近接コンティグをブリッジまたは連結するペアのリードメイトは、コンティグ間の推定距離、コンティグの順序および向きに関する情報を提供しうる。たとえば、リードメイト間の推定インサート長は、2つのブリッジされたコンティグ間の推定距離を提供しうる。ときには、2つのコンティグをブリッジするリードメイトの向きは、2つの互いにブリッジされたコンティグの相対向きおよび順序を提供する。いくつかの実施形態では、第1のコンティグは、複数のリードメイトペアにより第2のコンティグに連結される。いくつかの実施形態では、第1のコンティグは、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも15個、少なくとも20個、少なくとも30個、または少なくとも50個のリードメイトペアにより第2のコンティグに連結される。
いくつかの実施形態では、以上に記載のプロセスによりアセンブルされるスーパーコンティグは、すべての可能な配列配置を表すので、すべての可能なハプロタイプ配列(すなわちハプロタイプ)を表す。いくつかの実施形態では、ハプロタイプは、所定の倍数性に従ってコーラーにより直接組み合わせることにより、すべての可能な遺伝子型(たとえば、遺伝子型仮説、遺伝子型尤度、または遺伝子型尤度比)を生成する。いくつかの実施形態では、ハプロタイプはすべて、コーラーにより処理される前にハプロタイピングプロセスに付される。いくつかの実施形態では、ハプロタイピングプロセスは、各ハプロタイプに関連するオブジェクト(たとえば、ハプロタイプオブジェクト)を開始する。ハプロタイプオブジェクトは、マッピングウェイト、同定された偽接合、および/または同定された偽挿入を含みうる。たとえば、ある特定の実施形態では、ハプロタイピングプロセスは、一部または全部のリードをハプロタイプ配列(たとえば、スーパーコンティグ)に再マッピングするステップを含む。ある特定の実施形態では、この再マッピングは、実施例Iの「コーラー」の節に記載のマッピングウェイトの前計算を含む。マッピングウェイトは、各ハプロタイプに関連付けられる。ある特定の実施形態では、ハプロタイパープロセスはまた、ハプロタイプ配列中の偽接合および偽挿入の同定を実施する(以下を参照されたい)。ハプロタイパープロセスは、多くの場合、遺伝子型配列仮説と組み合わせる前に、ハプロタイピングプロセスの出力に基づいて、ハプロタイプをフィルタリングする機会をコーラーコンポーネントに与えるコーラーの機能と切り離して実施される(たとえば、ハプロタイプオブジェクト、たとえば、マッピングウェイト、偽接合および/または偽挿入の同定)。いくつかの実施形態では、同定された偽接合および偽挿入は、リードによりそれらのサポートを決定する必要情報と共に各ハプロタイプオブジェクトに列挙される。次いで、コーラーコンポーネントは、偽挿入などのハプロタイプオブジェクトの属性に基づいてカットオフを用いてハプロタイプをフィルタリングおよび/または除去することが可能である。任意の好適なカットオフを使用することが可能である。
ある特定の実施形態では、ハプロタイパープロセスは、偽接合の同定方法を含む。いくつかの実施形態では、偽接合は、偽陽性アライメントに起因して生成される。いくつかの実施形態では、偽接合は、いくらかの配列類似性に起因してコンティグアセンブリー時にリクルート(たとえば取得)されて組み込まれた、ゲノムの異なる部分(たとえば、対象のゲノム領域外のゲノムの部分)に由来するシーケンスリードで構成される。かかる配列類似性は、ときには、いくつかのリードをある特定の配列に連結させうるが、接合はまばらにカバーされるであろう。ハプロタイパープロセスは、接合位置をまたぐリードペアの数が予想よりもかなり少ないハプロタイプ配列中の位置を同定しうる。いくつかの実施形態では、ハプロタイパープロセスは、ある距離だけ離れたリードメイトの期待数(たとえば、インサートサイズ分布から推定される)を計算して観測されたカウントと比較することにより可能な偽接合を見いだす。低い観測数/期待数比の位置は、偽接合の可能性があるとしてマーク付けしうる。いくつかの実施形態では、統計的当てはめ(たとえば、χ2検定)の好適な推定値を用いて観測数−期待数差の有意性を決定しうる。いくつかの実施形態では、偽接合は、インサートサイズ分布の平均の周りのセンターバンドまたは非センターバンドを用いて偽接合を検定することにより同定される。インサートサイズ分布平均の周りのバンドの−20%および+80%のインターバル(たとえば、Illuminaリードペアライブラリーの現在のサイズは50)は、ときには、期待カウントを計算するために使用され、観測カウントを検索するために使用される。いくつかの実施形態では、ハプロタイパープロセスは、フォワードリードおよびリバースリード(逆方向)に対して観測カウントおよび期待カウントを個別に計算してから比の局所最小値を見いだす。ハプロタイパープロセスは、ときには、特定の比カットオフを超える局所最小値をすべて報告する。ある特定の実施形態では、順方向および逆方向の両方で検索を行って接合のアルゴリズム的確認を与えうる。
いくつかの実施形態では、ハプロタイパープロセスは偽挿入検出プロセスを含む。いくつかの実施形態では、偽挿入は、in silicoアセンブルされたスーパーコンティグ内への外来核酸配列または誤配置核酸配列の望ましくない挿入または偽挿入である。いくつかの実施形態では、偽挿入検出プロセスは、ハプロタイプ中の偽挿入の存在または不在を決定する。いくつかの実施形態では、偽挿入検出プロセスは、偽挿入がハプロタイプ中に存在するかまたは不在である尤度または確率を決定する。いくつかの実施形態では、偽挿入検出プロセスは、可能性のある偽挿入をマーク付け、ウェイト付け、またはスコア付けして、それらのオブジェクトをハプロタイプに関連付ける。いくつかの実施形態では、偽挿入は、偽接合(たとえば、以上に記載される)と組み合わせて同定可能である。しかしながら、偽挿入の同定では、専用の偽挿入検出プロセスは、多くの場合、偽接合アルゴリズムよりも高感度かつ特異的である。
いくつかの実施形態では、コーラープロセスは、遺伝子型をアセンブルし遺伝子型尤度比を決定する。コーラーコンポーネントは、多くの場合、コーラープロセスを実施する。コーラー(たとえばコーラーコンポーネント)は、スーパーコンティグアセンブリーコンポーネントからおよび/またはハプロタイパー(たとえばハプロタイプコンポーネント)からハプロタイプを受け入れることが可能である。ある特定の実施形態では、コーラープロセスは、ハプロタイプを組み合わせて所与の倍数性のすべての可能な遺伝子型を生成する。いくつかの実施形態では、所与の倍数性のすべての可能な遺伝子型は、コーラーコンポーネント(たとえば「コーラー」)によりアセンブルされる。いくつかの実施形態では、所与の倍数性で決定された各可能な遺伝子型は遺伝子型仮説と呼ばれる。ハプロタイプは、一倍体、二倍体、三倍体の被験体、または任意の倍数性の被験体に対してすべての可能な配置で組合せ可能である。たとえば、二倍体配列仮説では、同一のハプロタイプの2つのコピーからなるホモ接合配置を含めて任意の2つのハプロタイプのすべての可能な組合せをコーラーによりアセンブル可能であり、それぞれ遺伝子型仮説と呼ばれる。
本明細書に記載されるある特定のプロセスおよび方法は、多くの場合、コンピューター、マイクロプロセッサー、ソフトウェア、コンピュータープログラムコンポーネントまたは他のマシンなしでは実施できない。本明細書に記載の方法は、典型的には、コンピューターインプリメント方法であり、方法の1つ以上の一部は、ときには、1つ以上のハードウェアプロセッサー(たとえばマイクロプロセッサー)、コンピューター、またはマイクロプロセッサーにより制御されるマシンにより実施される。本文書に記載の方法に関する実施形態は、一般に、本明細書に記載のシステム、マシン、およびコンピュータープログラム製品の命令により実行されるものと同一のプロセスまたは関連するプロセスに適用可能である。本文書に記載の方法に関する実施形態は、一般に、実行可能プログラムを記憶した非一時的コンピューター可読記憶媒体により実行されるものと同一のプロセスまたは関連するプロセスに適用可能であり、このプログラムは、方法またはその一部を実行するようにマイクロプロセッサーに命令する。本明細書で用いられる「非一時的(non-transitory)」という記述語は、明示的に限定するものであり、一時的伝搬シグナル(たとえば、伝送シグナル、電子伝送、波(たとえば搬送波))を除外する。本明細書で用いられる「非一時的コンピューター可読媒体」という用語は、一時的伝搬シグナルを除くすべてのコンピューター可読媒体を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセスおよび方法は、自動化された方法により実施される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の1つ以上のステップおよび方法は、マイクロプロセッサーおよび/もしくはコンピューターにより実施されるならびに/またはメモリーと組み合わせて実施される。いくつかの実施形態では、自動化された方法は、ソフトウェア、コンピュータープログラムコンポーネント、マイクロプロセッサー、周辺機器、および/または同様のものを含むマシンで具現化され、本方法は、(i)複数のリードメイトペアを含むペアエンドシーケンスリードセットを取得するステップであって、各ペアが2つのリードメイトを含み、各ペアの2つのリードメイトの少なくとも1つが、所定の対象のゲノム領域を含む参照ゲノムの少なくとも1つの部分にマッピングされ、かつペアエンドシーケンスリードのいくつかが参照ゲノムの少なくとも1つの部分にマッピングされない、ステップ、(ii)シーケンスリードセットのパイルアップ関係を決定するステップ、(iii)パイルアップ関係に従って1つ以上のコンティグを構築するステップ、(iv)1つ以上のスーパーコンティグをアセンブルするステップ、(v)遺伝子型尤度比を生成するステップ、(vi)遺伝子変異の存在または不在を決定するステップ、または(vii)それらの組合せを実施するステップ、を含む。
いくつかの実施形態では、システムは、シーケンスリードを生成するように構成されたシーケンスコンポーネントを含む。シーケンスコンポーネントは、核酸シーケンサー(たとえば、核酸ライブラリーのためのシーケンスリードを生成するように設計され構成されたマシンまたは装置)ならびに/またはシーケンスリードを生成、アセンブル、マッピング、およびトリミングするように構成されたソフトウェアおよび命令を含みうる。シーケンスコンポーネントは、多くの場合、データファイルの形式(たとえば、bamファイル、fastaファイルなど)でシーケンスリードを提供する。シーケンスコンポーネントは、任意の好適なファイル形式でのシーケンスリードを提供可能である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステム、プロセスまたは方法は、被験体における遺伝的変異の存在または不在を決定する。いくつかの実施形態では、被験体における遺伝子変異の存在または不在は、遺伝子型尤度比および/またはアウトカムコンポーネントにより決定される。遺伝的変異は、一般に、ある特定の個体に存在する特定の遺伝子表現型である。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、染色体異常(たとえば、染色体の1つ以上の部分の損失または獲得)である。遺伝的変異の例としては、限定されるものではないが、1つ以上の欠失、重複、挿入、マイクロ挿入、付加、転座、突然変異、多型(たとえば、単一ヌクレオチド多型、多重ヌクレオチド多型)、融合、反復(たとえば、ショートタンデムリピート(すなわちSTR))など、およびそれらの組合せが挙げられる。挿入、反復、欠失、重複、突然変異、または多型は、任意の長さであり、いくつかの実施形態では、約1塩基または塩基対(bp)〜約250メガ塩基(Mb)の長さである。いくつかの実施形態では、挿入、反復、STR、欠失、重複、突然変異、または多型は、約1ヌクレオチド(nt)〜約50,000ntの長さである(たとえば、約1〜約10,000のヌクレオチド、約1〜約10,000ヌクレオチド、約1〜約10,000ヌクレオチド、約1〜約1,000ヌクレオチド、約1〜約500、ヌクレオチド、約1〜約400ヌクレオチド、約1〜約300ヌクレオチド、約1〜約200ヌクレオチド、約1〜約100ヌクレオチド、または約1〜約50のヌクレオチド)。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のプロセス、システム、または方法により決定される遺伝的変異は、約2〜約500ヌクレオチド、約2〜約400ヌクレオチド、約2〜約300ヌクレオチド、約2〜約200ヌクレオチド、約2〜約100ヌクレオチド、約2〜約50ヌクレオチド、10〜約500のヌクレオチド、約10〜約400ヌクレオチド、約10〜約300のヌクレオチド、約10〜約200ヌクレオチド、約10〜約100ヌクレオチド、約10〜約50ヌクレオチド、約20〜約500ヌクレオチド、約20〜約400ヌクレオチド、約20〜約300ヌクレオチド、約20〜約200ヌクレオチド、約20〜約100ヌクレオチド、または約20〜約50のヌクレオチドの長さからなる。
Kragleは、ローカルde−novo配列アセンブリーおよびジェノタイピングパッケージとして設計された。Kragleは、ペアエンドリードから任意の倍数性配列をアセンブルするように設計された。Kragleは、リード長まで伸長するリピート配列を取り扱うために専用に設計されたものであるが、配列の逆位、転座、重複、または欠失から生じる配列接合をコールすることも可能である。Kragleは、一連の遺伝的病態に関与するAR、ATXN1、ATNX2、ATXN3、ATXN7、DMPK、FXN、およびHTT遺伝子のショートタンデムリピート(STR)の二倍体遺伝子型をコールするためにうまく適用された。Kragleは、ヒトBRACA1遺伝子における大きな欠失から生じる仮説接合を確認するためにも、さらにはヒトCFTR遺伝子におけるホモ多量体および近接ジヌクレオチドリピートが関与する複合変異をコールするためにも、使用された。
参照配列と有意に異なるサンプルのゲノム領域から取得されるシーケンスリードは、標準的なリードアライナーに著しい難題を課す。たとえば、ゲノムの変化部分から生じたリードは、間違ったゲノム位置にマッピングされるかまたはマッピングされずに残留することが多かった。しかしながら、そのような場合には、リードメイトペアのリードメイトは、不変の(またはほとんど変化のない)フランキング領域の配列を含有することが多いので、適正にマッピング可能である。拡張STR、配列接合、および大きな複合変異の領域におけるリードマッピング問題を回避するために、リクルートコンポーネントは、リードペアからマッピングされたリードメイトの位置を用いて、Kragleがアセンブルしようとする領域(たとえば、特定の対象のゲノム領域)の情報を与えうるリードを同定する。
スーパーコンティガーは3つのコンポーネント、すなわち、パイルアップ関係コンポーネント(たとえばリード−リードアライナー)、コンティグアセンブリーコンポーネント、およびスーパーコンティグアセンブリーコンポーネントで構成される。3つのコンポーネントは、リクルートコンポーネントから取得したリクルートリードペアセットから始めて、ハプロタイプ配列セット(スーパーコンティグ)を生成する。スーパーコンティグは、対象となるアセンブルされたゲノム領域のハプロタイプ配列(たとえば、中断されている可能性のあるハプロタイプ配列)を生成するように適正な向きで一体的にリンクされかつ順序付けられる1つ以上のコンティグで構成される。
パイルアップ関係コンポーネントは、かかる可能なリード−リードオーバーラップを同定する機能を発揮するように構成され、作成されたグラフ中のある重複を除外することも可能である。他のリードの配列に完全に含まれた各リードを除外するオーバーラップグラフ(Myers EW,et al.,(2005))とは対照的に、パイルアップ関係コンポーネントにより生成されたリードタイリンググラフは、頂点としてすべてのリードを含有し、かつエッジはリード−リードオーバーラップを表す。ローカルde−novoアセンブリーのみを行ってマッピングされたメイトによりリードペアをリクルートする利点は、各リードの向き(鎖)が既知でありリードタイリンググラフが各リードに対する2つの鎖可能性を表現する必要がないことである。代替リード向きが探索されないので、これによりリードタイリンググラフおよびアセンブリータスクが単純化される。
コンティグアセンブリーコンポーネントは、リードタイリンググラフを用いてオーバーラッピングリードを集め、グラフを介してオーバーラッピングリードの経路を伸長する。各コンティグアセンブリーは単一リードから出発する。コンティグアセンブリーは、最初に、アセンブラーがコールしようとした領域(たとえば、対象のゲノム領域)の3’側および5’側から取り出されたリードから始まる2つのコンティグをアセンブルする。各コンティグは各リードを1回のみ使用するが、異なるコンティグはリードを共有可能である。コンティグ構築プロセスは、多型位置に遭遇したら既存のコンティグをスプリットすることにより新しいコンティグを生成する。2つの初期コンティグおよびそれらのスプリットオフコンティグを終了したら、コンティグアセンブラーは、コンティグのいずれでも使用されなかったリードのセットを検査する。未使用リード間にカットオフよりも大きいリードの接続クラスターが見いだされる場合(すでにアセンブルされたコンティグの平均カバレッジ深さに対するパーセントとして計算される − デフォルト10%)、クラスター中のリードの1つから新しいコンティグの構築を始める。カットオフよりも大きい未使用リードクラスターが存在しなくなるまで、新しいコンティグが始められる。
前のステップでアセンブルされたコンティグは、Kragleがコールしようとする全領域にまたがることもあれば、カバレッジが落下する位置または高いリードエラー率(通常系統誤差)により高スコアリード−リードオーバーラップが抑制される位置で終了することもある。かかる場合には、リードペアを用いてコンティグを一体的にリンクすることによりスーパーコンティグを形成することが可能である。リードペアのリード間ギャップが2つの近接コンティグ中に位置し、コンティグ間のカバレッジギャップにまたがるのを許容する場合、かかるリードペアは、コンティグリンクおよびその向きを通知しうる。
コンティグおよびスーパーコンティグの構築はすべての可能な配列配置を生成するので、スーパーコンティグは可能なハプロタイプ配列を表現し、これらを組み合わせればコーラーで適正な倍数性(すなわち二倍体)の配列仮説が生成されよう。ハプロタイパーはハプロタイプオブジェクトを開始し、すべてのリードからすべてのハプロタイプ配列への再マッピングを実施する。この再マッピングは、「コーラー」の節に記載のマッピングウェイトの前計算も含む。ハプロタイパーはまた、ハプロタイプ配列中の偽接合および偽挿入の同定を実施する。ハプロタイパーをコーラーから分離する主な理由は、配列仮説に組み合わせる前に、偽接合および偽挿入の同定のアウトカムに基づいて、コーリングプログラムにハプロタイプのフィルタリング機会を与えうることである。同定された偽接合および偽挿入は、リードによりそれらのサポートを決定する必要情報と共に各ハプロタイプオブジェクトに列挙される。コーリングプログラムは、サポート情報に基づくカットオフを使用してハプロタイプフィルタリングのそれ自体のストリンジェンシーを適用することが可能である。
アルゴリズムは、いくらかの配列類似性に起因してアセンブリープロセスで連結されたゲノムの異なる部分に属する配列の間の接合を同定すること目的をとする。配列類似性は、いくつかのリードをある特定の配列に連結させうるが、接合はまばらにカバーされるであろう。したがって、これらの接合は、接合位置にまたがるリードペアの数が予想よりもかなり低い配列中の点として同定可能である。アルゴリズムは、ある距離だけ離れたメイトの期待数を計算してそれを観測カウントと比較することにより可能な偽接合(インサートサイズ分布の範囲)を見いだす。次いで、低い観測数/期待数比の位置を偽接合の可能性があるとしてマーク付けする。χ2検定を用いて観測数−期待数差の有意性を決定することが可能であるが、かかるp値は、インサートサイズ分布中の正規変動を有する位置に対するカバレッジの増加に伴って次第に感度が高くなるであろう。
偽挿入検出アルゴリズムは、接合位でなんらかの配列類似性を用いてフランクで親配列に連結された外来(または誤配置)配列の挿入を検出することを目的とする。かかる挿入は、偽接合(以上に記載)の組合せを用いて潜在的に同定可能であるが、以下に記載の専用アルゴリズムは、偽接合アルゴリズムよりもかなり高感度かつ特異的である。
ハプロタイパーにより生成されたハプロタイプは、偽接合および偽挿入に関してフィルタリング可能であり、次いで、それらを組み合わせて一倍体、二倍体、一般的には任意の倍数性の配列仮説を生成可能である。二倍体配列仮説では、コーラーは、同一のハプロタイプの2つのコピーからなるホモ接合配置を含めて、すべての可能なハプロタイプペアを探索した。したがって、二倍体仮説評価プロセスは、ハプロタイプの数の二乗で計算の複雑さをスケールインした。したがって、アドホックなハプロタイプおよび仮説フィルタリングを回避するために、仮説尤度評価は計算効率が良くなければならない。Carnevali(Carnevali et al.2012)により記載された統計的フレームワークを検討したが、ある特定の態様ではうまく行かなかった。たとえば、Carnevaliのフレームワークは、いずれの対立遺伝子比にも対処できなかった(モザイクゲノムおよび癌ゲノムの場合)。式2の統計的フレームワークは、任意の対立遺伝子比(モザイクと癌のゲノム用の)に対処するように拡張修正された。この新しいフレームワーク(たとえば、式1を参照されたい)は、各ハプロタイプに対して尤度計算の多くのコンポーネントの前計算を可能にしたので、ハプロタイプを組み合わせて二倍体仮説にしたりその尤度を計算したりするのにかなり少ない計算量を要するにすぎなかった。
Carnevali,P.,et al.2012.Computational Techniques for Human Genome Resequencing Using Mated Gapped Reads.J.Comput.Biol.19,279−292。
Claims (11)
- 被験体で遺伝子変異の存在または不在を決定するコンピューターインプリメント方法であって、
(a)複数のリードメイトペアを含むペアエンドシーケンスリードセットを取得するステップであって、各ペアが2つのリードメイトを含み、各ペアの2つのリードメイトの少なくともの1つが、所定の対象のゲノム領域を含む参照ゲノムの少なくとも一部にマッピングされ、前記ペアエンドシーケンスリードのいくつかが、前記参照ゲノムの前記少なくとも一部にマッピングされない、ステップと、
(b)前記シーケンスリードセットでパイルアップ関係を決定するステップであって、前記パイルアップ関係が前記セットの2つ以上のリード間の複数のオーバーラップを含み、前記複数のオーバーラップのそれぞれを、(i)前記セットの第1のリードが前記セットの第2のリードとの第1のオーバーラップを含み、(ii)前記第1のオーバーラップが所定のアライメントスコア閾値よりも大きいアライメントスコアを含み、(iii)前記第2のリードが前記第1のリードの3’末端または5’末端を越えて1つ以上のヌクレオチドを伸長し、かつ(iv)前記第1のオーバーラップが(i)、(ii)、および(iii)を満たす第1のリードと第2のリードとの間のすべての可能なオーバーラップのうち最も高いアライメントスコアを含むように選択する、ステップと、
(c)(b)で決定されたパイルアップ関係に従って1つ以上のコンティグを構築するステップであって、1つのスターターリードの3’前進位置または5’前進位置に1つヌクレオチドを繰り返し付加するステップを含み、前記付加されたヌクレオチドが、(b)で決定されたオーバーラッピングリードの30%以上または5個以上前進位置に存在するマジョリティーコンセンサスヌクレオチドである、ステップと、
(d)(c)で構築した1つ以上のコンティグおよび/または(c)で構築したコンティグの2つ以上をブリッジする1つ以上のリードメイトペアから所定の対象のゲノム領域の全長にまたがる1つ以上のスーパーコンティグをアセンブルするステップであって、これにより前記被験体の可能なハプロタイプを各々表す1つ以上のスーパーコンティグを提供する、ステップと、
(e)すべての予想ハプロタイプから1つ以上の予想遺伝子型を決定し、および各予想遺伝子型について遺伝子型尤度比を生成するステップと、
(f)(e)で生成した最も高い遺伝子型尤度比を有する遺伝子型に従って前記被験体で遺伝子変異の存在または不在を決定するステップと、
を含む、方法。 - (c)において前記1つ以上のコンティグを構築するステップが、前記前進位置が2つの異なるマジョリティーコンセンサスヌクレオチドを含むときはコンティグの1つのコピーを生成することにより2つの同一の中間コンティグを提供するステップと、異なるヌクレオチドが前記2つの同一の中間コンティグのそれぞれに付加されるように前記2つの異なるマジョリティーコンセンサスヌクレオチドの1つを前記2つの同一の中間コンティグのそれぞれに付加するステップと、を含む;または
前記前進位置が3つの異なるマジョリティーコンセンサスヌクレオチドを含むときはコンティグの2つのコピーを生成することにより3つの同一の中間コンティグを提供するステップと、異なるヌクレオチドが前記3つの同一の中間コンティグのそれぞれに付加されるように前記3つの異なるマジョリティーコンセンサスヌクレオチドの1つを前記3つの同一の中間コンティグのそれぞれに付加するステップと、を含む請求項1に記載の方法。 - (e)の前記遺伝子型尤度比を生成するステップが、前記1つ以上のスーパーコンティグに前記シーケンスリードを再アライメントすることにより1つ以上のマッピングウェイトを提供するステップ、および遺伝子型仮説尤度比を前記1つ以上のマッピングウェイトに従って生成するステップを含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記パイルアップ関係に従ってタイリンググラフを生成するステップを含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数のオーバーラップのそれぞれがk−merハッシングストラテジーに従って決定される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記スターターリードが所定の対象のゲノム領域の最も5’側に位置するリードを含むか、または
前記スターターリードが所定の対象のゲノム領域の最も3’側に位置するリードを含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1のコンティグが複数のリードメイトペアに従って第2のコンティグに連結される、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝的変異が、ショートタンデムリピートまたは1つ以上の単一ヌクレオチド多型を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝的変異が、AR、ATXN1、ATXN2、ATXN7、ATXN8、ATXN10、DMPK、FXN、JPH3、CACNA1A、PPP2R2B、TBP、ATN1、ARX、PHOX2B、PABPN1、ATT、CFTR、およびBRACA1から選択される遺伝子内に含まれる、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記シーケンスリードが二倍体ヒト被験体から得られる、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 実行可能プログラムを記憶した非一時的コンピューター可読記憶媒体であって、プログラムが請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法の実行をマイクロプロセッサーに命令するように構成される、前記記憶媒体。
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