JP6762518B2 - Method for measuring microbial colonies - Google Patents

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本発明は、培地上に形成される微生物コロニーに試薬を接触させて染色等を行い、光学的に観測する微生物コロニーの測定方法に関する。詳しくは、試薬を接触させたときに微生物コロニーの凝集体が溶解しないようにし、測定後も引き続き微生物を培養可能にする微生物コロニーの測定方法に関する。 The present invention relates to a method for measuring a microbial colony formed on a medium by bringing a reagent into contact with the medium to perform staining or the like and optically observing the microbial colony. More specifically, the present invention relates to a method for measuring a microbial colony, which prevents agglomerates of microbial colonies from dissolving when they are brought into contact with a reagent and enables the microbial colony to be continuously cultivated even after the measurement.

各種培地上に培養した微生物コロニーに試薬を付着させて染色したり、蛍光を発するようにさせたりすることで光学観測を容易にすることが行われている。また、微生物を含む液体等をメンブレンフィルタにより濾過することにより、そのメンブレンフィルタに微生物を付着させ、そのメンブレンフィルタを培地上に載置して付着させた微生物を培養してコロニーを形成させ、試薬により染色後観測することが行われている（例えば、特許文献１〜３を参照。）。 Optical observation is facilitated by attaching reagents to microbial colonies cultured on various media and staining them, or by causing them to fluoresce. Further, by filtering a liquid or the like containing microorganisms with a membrane filter, microorganisms are attached to the membrane filter, the membrane filter is placed on the medium, and the attached microorganisms are cultured to form colonies, and a reagent is formed. (For example, see Patent Documents 1 to 3).

例えば、特許文献１に開示されている微生物の計測方法は、培地の上に検体を滴下拡散し、この検体入り培地を所定時間だけ培養した後、検体入り培地に試薬を滴下拡散し、顕微鏡で光学観測している。
特許文献２に開示されている生理活性判定方法は、微生物をメンブレンフィルタ上に捕集して培養した後、そのメンブレンフィルタの下面側から浸透させた蛍光染色液でメンブレンフィルタ上の微生物を染色する。その後、顕微鏡で光学観測している。
特許文献３に開示されている自己拡散式微生物培養装置は、基材と、台座と、カバーシートとを備え、培養面又はカバーシートに培地及び指示薬等が堆積されており、カバーシートが透明であるため、カバーシートを被せたまま培地上の微生物コロニーを観察することができる。
特許文献４に開示されている微生物を迅速に検出するための装置は、基材と基材を覆う透明のカバーシートとを備え、基材やカバーシートに冷水溶性粉末が接着剤により接着されている。また、冷水溶性粉末は、ゲル化剤及び培養のための栄養素が含まれている。更に、冷水溶性粉末は蛍光試薬等の検出試薬を含めることができ、この試薬により染色して観察することができる。このような装置は、カバーシートをめくった状態で基材上に試験サンプルを載置した後、カバーシートを戻して覆うことで、微生物の培養を行うことができ、カバーシートを被せたまま基材上の微生物コロニーを観察することができる。
他方、病原体と蛍光色素の結合率を向上させて迅速な検知を行うために、捕集した病原体に蛍光色素を含むミストを衝突させる手法（ミスト標識法）が知られている（例えば、非特許文献１を参照）。これによれば、捕集基板の表面を蛍光色素の水溶液に浸漬する従来法よりも、結合率を大幅に向上できるとされている。 For example, in the method for measuring microorganisms disclosed in Patent Document 1, a sample is dropped and diffused on a medium, the medium containing the sample is cultured for a predetermined time, and then the reagent is dropped and diffused on the medium containing the sample with a microscope. I am observing optically.
In the method for determining physiological activity disclosed in Patent Document 2, microorganisms are collected and cultured on a membrane filter, and then the microorganisms on the membrane filter are stained with a fluorescent staining solution permeated from the lower surface side of the membrane filter. .. After that, optical observation is performed with a microscope.
The self-diffusion type microbial culture apparatus disclosed in Patent Document 3 includes a base material, a pedestal, and a cover sheet, and a medium, an indicator, etc. are deposited on the culture surface or the cover sheet, and the cover sheet is transparent. Therefore, it is possible to observe the microbial colonies on the medium with the cover sheet covered.
The device for rapidly detecting microorganisms disclosed in Patent Document 4 includes a base material and a transparent cover sheet covering the base material, and a cold water-soluble powder is adhered to the base material and the cover sheet by an adhesive. There is. In addition, the cold water-soluble powder contains a gelling agent and nutrients for culturing. Further, the cold water-soluble powder can contain a detection reagent such as a fluorescent reagent, and can be stained and observed with this reagent. In such a device, a test sample is placed on a base material with the cover sheet turned over, and then the cover sheet is returned and covered, so that microorganisms can be cultured, and the base is covered with the cover sheet. Microbial colonies on the wood can be observed.
On the other hand, in order to improve the binding rate between the pathogen and the fluorescent dye and perform rapid detection, a method of colliding the collected pathogen with a mist containing the fluorescent dye (mist labeling method) is known (for example, non-patent). See Document 1). According to this, it is said that the binding rate can be significantly improved as compared with the conventional method in which the surface of the collection substrate is immersed in an aqueous solution of a fluorescent dye.

特開平０７−１４７９９７号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 07-147997 特開２００７−０９７５３２号公報Japanese Unexamined Patent Publication No. 2007-07532 特表２００４−５１５２３６号公報Japanese Patent Publication No. 2004-515236 特表２０１３−５３５５２２号公報Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-535522

富樫盛典他「食品中細菌数および呼気中病原体の迅速計測技術」、日立評論２０１３年９月号、第４８−５３頁Morinori Togashi et al., "Technology for Rapid Measurement of Bacterial Counts in Foods and Pathogens in Breath", Hitachi Review, September 2013, pp. 48-53

しかし、特許文献１に記載されているような微生物の計測方法は、検体入り培地に試薬を滴下拡散しているため、培地の微生物コロニーの構成菌が融け出す等により微生物コロニーの形状が崩れ、微生物コロニーの正確な測定ができなくなるおそれがある。
また、特許文献２に記載されているような生理活性判定方法では、メンブレンフィルタ上に形成された微生物コロニーの形状が失われないように、検体を乾燥させ、染色液をメンブレンフィルタの下面側から浸透させたりする必要があった。このため、観測後に微生物を続けて培養させることができなかった。
また、特許文献３に開示されている自己拡散式微生物培養装置では、培地に蛍光試薬等の溶液を付着させて染色させた後に、カバーシートを再度被せると微生物コロニーを構成する微生物が平滑なカバーシートと培地との間を蛍光試薬等の水分により流動可能となり、時間が経過するにつれて微生物コロニーの形状が崩れ、微生物コロニーの正確な測定や測定後の培養ができなくなるおそれがある。
また、特許文献４に開示されている微生物を迅速に検出するための装置では、基材上に試験サンプルを載置等する作業中に、基材やカバーシートの冷水溶性粉末中の検出試薬が微生物に接触するため、その接触時間を制御することができず、観測時に検出試薬の退色や自己着色等が生じて、適切な観察ができなくなる恐れがある。
他方、非特許文献１に記載されているようなミスト標識法では、ミストによる微生物の捕集範囲を限定することが困難である。また、個別微生物の計数が可能であっても微生物の集合体を観測することはできない。更に、一定の湿度を保った状態で一定時間反応させることができないため、抗体以外の反応性試薬（蛍光染色剤等）を使用することが困難であるという問題がある。これらの問題により、蛍光染色剤等を用いて微生物コロニーを測定し、測定後も継続して培養可能とする目的には、ミストを利用する微生物の検知手法は適さない。 However, in the method for measuring microorganisms as described in Patent Document 1, since the reagent is dropped and diffused in the medium containing the sample, the shape of the microbial colony collapses due to melting of the constituent bacteria of the microbial colony in the medium. Accurate measurement of microbial colonies may not be possible.
Further, in the bioactivity determination method as described in Patent Document 2, the sample is dried and the staining solution is applied from the lower surface side of the membrane filter so that the shape of the microbial colonies formed on the membrane filter is not lost. It had to be infiltrated. Therefore, it was not possible to continue culturing the microorganisms after the observation.
Further, in the self-diffusion type microbial culture apparatus disclosed in Patent Document 3, when a solution such as a fluorescent reagent is attached to a medium for staining and then covered with a cover sheet again, the microorganisms constituting the microbial colonies are covered smoothly. Moisture such as a fluorescent reagent makes it possible to flow between the sheet and the medium, and as time passes, the shape of the microbial colonies may collapse, making it impossible to accurately measure the microbial colonies or culture after the measurement.
Further, in the apparatus for rapidly detecting microorganisms disclosed in Patent Document 4, the detection reagent in the cold water-soluble powder of the base material or the cover sheet is used during the work of placing the test sample on the base material. Since it comes into contact with microorganisms, the contact time cannot be controlled, and the detection reagent may fade or self-color during observation, making proper observation impossible.
On the other hand, it is difficult to limit the collection range of microorganisms by mist by the mist labeling method as described in Non-Patent Document 1. Moreover, even if individual microorganisms can be counted, it is not possible to observe an aggregate of microorganisms. Further, since the reaction cannot be carried out for a certain period of time while maintaining a certain humidity, there is a problem that it is difficult to use a reactive reagent (fluorescent dye or the like) other than the antibody. Due to these problems, the method for detecting microorganisms using mist is not suitable for the purpose of measuring microbial colonies using a fluorescent dye or the like and enabling continuous culturing even after the measurement.

本発明は、上記現状に鑑みてなされたものであり、試薬を接触させたときに微生物コロニーを構成する凝集体が溶解しないようにし、測定後も微生物を引き続き培養可能にする微生物コロニーの測定方法を提供することを目的とする。 The present invention has been made in view of the above situation, and is a method for measuring a microbial colony, which prevents the aggregates constituting the microbial colony from being dissolved when the reagent is brought into contact with the reagent, and enables the microorganism to be continuously cultured even after the measurement. The purpose is to provide.

１．培地上に形成される微生物コロニーを測定する微生物コロニーの測定方法であって、培地上で微生物を培養する培養工程と、所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種を、多孔質膜に付着物として付着させる付着工程と、前記培養工程の後に、前記多孔質膜を前記培地上に載置して介在物を介することなく前記付着物を前記微生物に接触させて、前記付着物により前記微生物を染色する多孔質膜載置工程と、前記載置されている前記多孔質膜の上方から励起光を照射し、前記多孔質膜を介して前記微生物により発せられる蛍光を上方から観測することにより微生物コロニーを測定する測定工程と、を行い、前記多孔質膜の平均孔径は目的とする微生物よりも小さい、又は前記多孔質膜の平均孔径は目的とする微生物よりも大きく且つ前記付着工程において乾燥した前記付着物を前記多孔質膜に付着させることを特徴とする微生物コロニーの測定方法。
２．前記微生物は複数種類を含み、
前記付着工程は、１種類以上の前記微生物を染色する抗体と１種類以上の前記微生物を染色する前記蛍光試薬とを前記多孔質膜に付着させ、前記測定工程は、前記載置されている前記多孔質膜に励起光を照射し、前記多孔質膜を介して前記抗体により発せられる蛍光と前記蛍光試薬による染色によって発せられる蛍光とをそれぞれ観測することにより微生物コロニーを測定する前記１．記載の微生物コロニーの測定方法。
３．前記微生物は複数種類を含み、前記付着工程は、１種類以上の前記微生物を染色する抗体を付着させて第１の多孔質膜を形成する第１付着工程と、１種類以上の前記微生物を染色する前記蛍光試薬を付着させて第２の多孔質膜を形成する第２付着工程と、を行い、前記多孔質膜載置工程は、前記第１の多孔質膜を前記培地上に載置する第１載置工程と、前記第２の多孔質膜を前記培地上に載置する第２載置工程と、を行い、前記測定工程は、前記第１載置工程後に前記第１の多孔質膜に励起光を照射し、前記第１の多孔質膜を介して前記抗体により発せられる蛍光を観測する第１測定工程と、前記第２載置工程後に前記第２の多孔質膜に励起光を照射し、前記第２の多孔質膜を介して前記蛍光試薬による染色によって発せられる蛍光を観測する第２測定工程と、を行う前記１．記載の微生物コロニーの測定方法。
４．前記培養工程は、前記微生物が混ざった溶液をフィルタにより濾過し、当該フィルタを前記培地上に載置することによって前記微生物を培養する前記１．乃至３．のいずれかに記載の微生物コロニーの測定方法。
５．前記培養工程を行った後、前記付着物を付着させることなく前記多孔質膜を前記培地上に載置し、次いで、前記培地上の前記多孔質膜に対して前記付着工程を行い、その後前記測定工程を行う前記１．に記載の微生物コロニーの測定方法。
６．前記多孔質膜の平均孔径は目的とする微生物よりも小さく、前記付着工程は、界面活性剤を含む溶媒に前記付着物を溶かした溶液により前記多孔質膜を湿潤させることによって、前記付着物を前記多孔質膜に付着させる前記１．乃至５．のいずれかに記載の微生物コロニーの測定方法。
７．前記多孔質膜の平均孔径は目的とする微生物よりも小さく、前記付着工程は、前記付着物の安定化剤を含む溶媒に前記付着物を溶かした溶液により前記多孔質膜を湿潤させることによって、前記付着物を前記多孔質膜に付着させる前記１．乃至６．のいずれかに記載の微生物コロニーの測定方法。 1. 1. A method for measuring microbial colonies formed on a medium, in which a culturing step of culturing microorganisms on the medium and at least one of a predetermined fluorescent reagent and a predetermined antibody are used as a porous membrane. After the attachment step of adhering to the microorganism as an adhering substance and the culturing step, the porous film is placed on the medium and the adhering substance is brought into contact with the microorganism without intervening inclusions, and the adhering substance is used. The step of placing the porous film for staining the microorganism and the excitation light are irradiated from above the above-mentioned porous film, and the fluorescence emitted by the microorganism through the porous film is observed from above. There rows and measuring step, the measuring microbial colonies by the average pore size of the porous membrane is less than the microorganisms of interest, or the average pore diameter of the porous membrane is larger and the adhesion than microorganisms of interest A method for measuring microbial colonies, which comprises attaching the deposits dried in the step to the porous membrane .
2. 2. The microorganisms include multiple types
In the attachment step, an antibody that stains one or more types of the microorganism and the fluorescent reagent that stains one or more types of the microorganism are attached to the porous membrane, and the measurement step is described above. 1. The microbial colony is measured by irradiating the porous membrane with excitation light and observing the fluorescence emitted by the antibody and the fluorescence emitted by staining with the fluorescent reagent through the porous membrane. The method for measuring a microbial colony according to the above.
3. 3. The microorganisms include a plurality of types, and the adhesion step includes a first attachment step of adhering an antibody that stains one or more types of the microorganism to form a first porous film, and staining one or more types of the microorganism. The second attachment step of adhering the fluorescent reagent to form a second porous film is performed, and in the porous film placement step, the first porous film is placed on the medium. A first placement step and a second placement step of placing the second porous film on the medium are performed, and the measurement step is performed after the first placement step of the first porous. The first measurement step of irradiating the membrane with excitation light and observing the fluorescence emitted by the antibody through the first porous membrane, and the excitation light on the second porous membrane after the second placement step. The second measurement step of observing the fluorescence emitted by the staining with the fluorescent reagent through the second porous film is performed. The method for measuring a microbial colony according to the above.
4. In the culturing step, the solution in which the microorganism is mixed is filtered by a filter, and the filter is placed on the medium to cultivate the microorganism. To 3. The method for measuring a microbial colony according to any one of.
5. After performing the culture step, the porous membrane is placed on the medium without adhering the deposits, and then the adhesion step is performed on the porous membrane on the medium, and then the above-mentioned. Perform the measurement process 1. The method for measuring a microbial colony according to.
6 . The average pore size of the porous membrane is smaller than that of the target microorganism, and the adhesion step is performed by moistening the porous membrane with a solution of the deposit in a solvent containing a surfactant to obtain the deposit. Adhering to the porous membrane 1. To 5. The method for measuring a microbial colony according to any one of .
7 . The average pore size of the porous membrane is smaller than that of the target microorganism, and the adhesion step is performed by wetting the porous membrane with a solution of the deposit in a solvent containing a stabilizer for the deposit. 1. Adhering the deposit to the porous membrane . To 6. The method for measuring a microbial colony according to any one of.

本発明によれば、培地上に形成される微生物コロニーを測定する微生物コロニーの測定方法であって、培地上で微生物を培養する培養工程と、所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種を、多孔質膜に付着物として付着させる付着工程と、前記培養工程の後に、前記多孔質膜を前記培地上に載置し、前記付着物により前記微生物を染色する多孔質膜載置工程と、前記載置されている前記多孔質膜の上方から励起光を照射し、前記多孔質膜を介して前記微生物により発せられる蛍光を上方から観測することにより微生物コロニーを測定する測定工程と、を行うため、培地上の微生物コロニーの形状を溶解等によって変化させることなく、培地上に載置した多孔質膜に付着された抗体や試薬を微生物コロニーに接触させ、微生物を染色することができる。また、培地上に多孔質膜を載置したまま多孔質膜を透過した蛍光を上方から観測するため、培地上の微生物コロニーの溶解や形状変化が生じないようにすることができる。更に、培地上の微生物コロニーを乾燥等させることなく、多孔質膜の孔に余分な水分を逃がして観測することができるため、測定後も引き続き培地上の微生物の培養を継続することができる。また、培養した培地上の微生物コロニーの溶解等が生じないようにすることができる。 According to the present invention, a method for measuring a microbial colony for measuring a microbial colony formed on a medium, wherein the microbial colony is cultivated on the medium, and at least one of a predetermined fluorescent reagent and a predetermined antibody. After the attachment step of attaching the seeds to the porous membrane as an deposit and the culture step, the porous membrane placement step of placing the porous membrane on the medium and staining the microorganism with the deposits. A measurement step of irradiating the excitation light from above the above-mentioned porous membrane and observing the fluorescence emitted by the microorganism through the porous membrane from above to measure the microbial colony. Therefore, the shape of the microbial colony on the medium is not changed by dissolution or the like, and the antibody or reagent attached to the porous membrane placed on the medium is brought into contact with the microbial colony to stain the microbial colony. .. Further, since the fluorescence transmitted through the porous membrane is observed from above while the porous membrane is placed on the medium, it is possible to prevent the dissolution and shape change of the microbial colonies on the medium. Further, since the microbial colonies on the medium can be observed by allowing excess water to escape to the pores of the porous membrane without drying or the like, the culturing of the microorganisms on the medium can be continued even after the measurement. In addition, it is possible to prevent the dissolution of microbial colonies on the cultured medium.

前記微生物は複数種類を含み、前記付着工程は、１種類以上の前記微生物を染色する抗体と１種類以上の前記微生物を染色する前記蛍光試薬とを前記多孔質膜に付着させ、前記測定工程は、前記載置されている前記多孔質膜に励起光を照射し、前記多孔質膜を介して前記抗体により発せられる蛍光と前記蛍光試薬による染色によって発せられる蛍光とをそれぞれ観測することにより微生物コロニーを測定する場合は、１枚又は複数枚の多孔質膜を用いた多重染色によって選択的な染色を行うことができ、種類の異なる微生物のうち特定の種類の微生物を識別して測定を行うことができる。
前記微生物は複数種類を含み、前記付着工程は、１種類以上の前記微生物を染色する抗体を付着させて第１の多孔質膜を形成する第１付着工程と、１種類以上の前記微生物を染色する前記蛍光試薬を付着させて第２の多孔質膜を形成する第２付着工程と、を行い、前記多孔質膜載置工程は、前記第１の多孔質膜を前記培地上に載置する第１載置工程と、前記第２の多孔質膜を前記培地上に載置する第２載置工程と、を行い、前記測定工程は、前記第１載置工程後に前記第１の多孔質膜に励起光を照射し、前記第１の多孔質膜を介して前記抗体により発せられる蛍光を観測する第１測定工程と、前記第２載置工程後に前記第２の多孔質膜に励起光を照射し、前記第２の多孔質膜を介して前記蛍光試薬による染色によって発せられる蛍光を観測する第２測定工程と、を行う場合は、第１測定工程において抗体によって発せられる蛍光を測定することができ、第２測定工程において蛍光試薬により微生物が発する蛍光を測定することができる。このため、波長が同じである場合等、抗体による蛍光と蛍光試薬による蛍光とが区別できない場合であっても、１種類の微生物と微生物の全体とを識別することができる。また、多孔質膜により、抗体の溶液と、次に蛍光試薬の溶液を微生物コロニーに接触させても、微生物コロニーの溶解等をさせないようにすることができる。 The microorganism includes a plurality of types, and in the attachment step, an antibody that stains one or more types of the microorganism and the fluorescent reagent that stains one or more types of the microorganism are attached to the porous membrane, and the measurement step is performed. , The above-mentioned porous membrane is irradiated with excitation light, and the fluorescence emitted by the antibody and the fluorescence emitted by staining with the fluorescent reagent are observed through the porous membrane, respectively, to obtain microbial colonies. When measuring, selective staining can be performed by multiple staining using one or more porous membranes, and specific types of microorganisms among different types of microorganisms are identified and measured. Can be done.
The microorganisms include a plurality of types, and the adhesion step includes a first attachment step of adhering an antibody that stains one or more types of the microorganism to form a first porous film, and staining one or more types of the microorganism. The second attachment step of adhering the fluorescent reagent to form a second porous film is performed, and in the porous film placement step, the first porous film is placed on the medium. A first placement step and a second placement step of placing the second porous film on the medium are performed, and the measurement step is performed after the first placement step of the first porous. The first measurement step of irradiating the membrane with excitation light and observing the fluorescence emitted by the antibody through the first porous membrane, and the excitation light on the second porous membrane after the second mounting step. In the second measurement step of observing the fluorescence emitted by staining with the fluorescent reagent through the second porous membrane, the fluorescence emitted by the antibody is measured in the first measurement step. This allows the fluorescence emitted by the microorganism to be measured by the fluorescent reagent in the second measurement step. Therefore, even when the fluorescence by the antibody and the fluorescence by the fluorescent reagent cannot be distinguished, such as when the wavelengths are the same, one type of microorganism and the whole microorganism can be distinguished. In addition, the porous membrane can prevent the microbial colonies from being dissolved even when the antibody solution and then the fluorescent reagent solution are brought into contact with the microbial colonies.

前記培養工程は、前記微生物が混ざった溶液をフィルタにより濾過し、当該フィルタを前記培地上に載置することによって前記微生物を培養する場合には、培地に直接微生物を付着させる工程を不要とし、容易にフィルタ上で培養することができる。
前記多孔質膜の平均孔径が目的とする微生物よりも小さい場合には、多孔質膜の孔を通じて微生物が流動することを防止することができる。また、培地の湿気により湿潤して孔が塞がり、透光性が向上した多孔質膜を透過する蛍光の光量が多くなるため、より高感度に測定を行うことができる。
前記付着工程は、界面活性剤を含む溶媒に前記付着物を溶かした溶液により前記多孔質膜を湿潤させることによって、前記付着物を前記多孔質膜に付着させる場合には、界面活性剤により撥水性のある多孔質膜であっても湿潤させることができ、場所によらず蛍光試薬等の濃度が均一となるように分散させることができる。また、多孔質膜の乾燥による反りを抑制することができる。これによって、多孔質膜を培地上に載置したときに蛍光試薬等の溶液を培地上の微生物に均一に接触させ、微生物の染色を均一にすることができる。
前記付着工程は、前記付着物の安定化剤を含む溶媒に前記付着物を溶かした溶液により前記多孔質膜を湿潤させることによって、前記付着物を前記多孔質膜に付着させる場合には、蛍光をむらなく発するようにすることができる。
培養工程を行った後、付着部を付着させることなく多孔質膜を培地上に載置し、次いで、培地上の多孔質膜に対して付着工程を行い、その後測定工程を行う場合は、蛍光試薬等の付着を測定工程の直前に行うことができ、短時間で反応する蛍光試薬であっても適切な時間で観察することができる。
前記多孔質膜の平均孔径が目的とする微生物よりも大きく、前記付着工程は、乾燥した前記付着物を前記多孔質膜に付着させる場合には、培地の湿気によって蛍光試薬等を溶解することができ、培地上に生育した遊走性の少ない微生物によるコロニーの溶解等を起こすことなく好適に染色することができる。また、蛍光試薬等を付着させた多孔質膜が乾燥状態であるため、その取扱いを容易にし、保管性も向上させることができる。 In the culturing step, when the solution in which the microorganism is mixed is filtered by a filter and the microorganism is cultivated by placing the filter on the medium, the step of directly adhering the microorganism to the medium becomes unnecessary. It can be easily cultured on a filter.
When the average pore size of the porous membrane is smaller than the target microorganism, it is possible to prevent the microorganism from flowing through the pores of the porous membrane. In addition, the moisture of the medium causes the pores to be closed, and the amount of fluorescent light transmitted through the porous membrane with improved translucency increases, so that the measurement can be performed with higher sensitivity.
In the adhesion step, the porous membrane is moistened with a solution of the deposit in a solvent containing a surfactant, and when the deposit is adhered to the porous membrane, it is repelled by the surfactant. Even an aqueous porous membrane can be moistened, and the concentration of the fluorescent reagent or the like can be dispersed regardless of the location. In addition, warpage due to drying of the porous membrane can be suppressed. As a result, when the porous membrane is placed on the medium, a solution such as a fluorescent reagent can be uniformly contacted with the microorganisms on the medium, and the staining of the microorganisms can be made uniform.
In the adhesion step, the porous membrane is wetted with a solution in which the deposit is dissolved in a solvent containing a stabilizer for the deposit, and when the deposit is adhered to the porous membrane, it is fluorescent. Can be made to emit evenly.
After performing the culturing step, the porous membrane is placed on the medium without adhering the adhering part, and then the adhering step is performed on the porous membrane on the medium, and then the measurement step is performed. Adhesion of the reagent or the like can be performed immediately before the measurement step, and even a fluorescent reagent that reacts in a short time can be observed in an appropriate time.
The average pore size of the porous membrane is larger than that of the target microorganism, and in the attachment step, when the dried deposits are attached to the porous membrane, the fluorescent reagent or the like can be dissolved by the moisture of the medium. Therefore, it can be suitably stained without causing lysis of colonies by microorganisms having low migration properties grown on the medium. Further, since the porous membrane to which the fluorescent reagent or the like is attached is in a dry state, it can be easily handled and the storability can be improved.

本発明について、本発明による典型的な実施形態の非限定的な例を挙げ、言及された複数の図面を参照しつつ以下の詳細な記述にて更に説明するが、同様の参照符号は図面のいくつかの図を通して同様の部品を示す。
本微生物コロニーの測定方法による光学観測を行うときの構成を説明するための模式図である。 メンブレンフィルタに微生物が付着した状態を示す模式図である。 メンブレンフィルタを培地に載置し、培養により微生物コロニーが形成されている状態を示す模式図である。 試薬を含む多孔質膜を培地上のメンブレンフィルタ上に載置し、微生物コロニーを試薬により染色させている状態を示す模式図である。 実験例１における(a)観察結果、及び(b)蛍光部分が基点となるように２値化した画像である。 実験例１における観察後の培養後の状態を示す画像である。 実験例１における観察後の培養後、多孔質膜を除去した状態を示す画像である。 比較例１における観察後の培養後の状態を示す画像である。 実験例２における観察結果を示す画像である。 図９の画像を画像処理して２値化した画像である。 実験例２における観察後の培養後の状態を示す画像である。 実験例２における観察後の培養後、多孔質膜を除去した状態を示す画像である。 実験例３における抗体により励起する蛍光の(a)観察結果、及び(b)蛍光部分が基点となるように２値化した画像である。 実験例３における蛍光試薬により励起する蛍光の(a)観察結果、及び(b)蛍光部分が基点となるように２値化した画像である。 実験例４における(a)可視光による観察結果を示す画像、(b)抗体により励起する蛍光のみに制限した(a)の点線部分における観察結果を示す画像、(c)蛍光試薬により励起する蛍光のみに制限した(a)の点線部分における観察結果を示す画像である。 カメラによる観察を行うための装置の例を示す模式図である。 The present invention will be further described in the following detailed description with reference to the plurality of references mentioned with reference to non-limiting examples of typical embodiments according to the invention. Similar parts are shown through several figures.
It is a schematic diagram for demonstrating the structure at the time of optical observation by the measuring method of this microbial colony. It is a schematic diagram which shows the state which the microorganism adhered to the membrane filter. It is a schematic diagram which shows the state which the membrane filter is placed on the culture medium, and the microbial colony is formed by the culture. It is a schematic diagram which shows the state in which the porous membrane containing a reagent is placed on the membrane filter on the medium, and the microbial colony is stained with the reagent. It is (a) the observation result in Experimental Example 1 and (b) the binarized image so that the fluorescent portion becomes the base point. It is an image which shows the state after culture after observation in Experimental Example 1. It is an image which shows the state which the porous membrane was removed after the culture after observation in Experimental Example 1. It is an image which shows the state after culture after observation in Comparative Example 1. It is an image which shows the observation result in Experimental Example 2. It is an image obtained by image processing the image of FIG. 9 and binarizing it. It is an image which shows the state after culture after observation in Experimental Example 2. It is an image which shows the state which the porous membrane was removed after the culture after observation in Experimental Example 2. It is (a) observation result of fluorescence excited by an antibody in Experimental Example 3 and (b) a binarized image so that the fluorescence portion becomes a base point. It is (a) observation result of fluorescence excited by a fluorescent reagent in Experimental Example 3 and (b) a binarized image so that the fluorescent portion becomes a base point. In Experimental Example 4, (a) an image showing the observation result with visible light, (b) an image showing the observation result in the dotted line portion of (a) limited to fluorescence excited by an antibody, and (c) fluorescence excited by a fluorescence reagent. It is an image which shows the observation result in the dotted line part of (a) limited only to. It is a schematic diagram which shows the example of the apparatus for observing by a camera.

ここで示される事項は例示的なもの及び本発明の実施形態を例示的に説明するためのものであり、本発明の原理と概念的な特徴とを最も有効に且つ難なく理解できる説明であると思われるものを提供する目的で述べたものである。この点で、本発明の根本的な理解のために必要である程度以上に本発明の構造的な詳細を示すことを意図してはおらず、図面と合わせた説明によって本発明の幾つかの形態が実際にどのように具現化されるかを当業者に明らかにするものである。 The matters shown here are for exemplifying and exemplifying embodiments of the present invention, and are considered to be the most effective and effortless explanations for understanding the principles and conceptual features of the present invention. It is stated for the purpose of providing what seems to be. In this regard, it is not intended to show structural details of the invention beyond a certain degree necessary for a fundamental understanding of the invention, and some embodiments of the invention are provided by description in conjunction with the drawings. It is intended to clarify to those skilled in the art how it is actually realized.

本実施形態に係る微生物コロニーの測定方法は、培地上に形成される微生物コロニーを測定する方法であって、培地上で微生物を培養する培養工程と、所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種を、多孔質膜に付着物として付着させる付着工程と、前記培養工程の後に、多孔質膜を培地上に載置し、前記付着物により前記微生物を染色する多孔質膜載置工程と、載置されている多孔質膜に励起光を照射し、多孔質膜を介して微生物により発せられる蛍光を上方から観測することにより微生物コロニーを測定する測定工程と、を行うことを特徴とする。 The method for measuring a microbial colony according to the present embodiment is a method for measuring a microbial colony formed on a medium, which is a culture step of culturing a microorganism on the medium, a predetermined fluorescent reagent, and a predetermined antibody. An attachment step of attaching at least one type to the porous film as an deposit, and a porous film placement step of placing the porous film on a medium after the culture step and staining the microorganism with the deposit. It is characterized by performing a measurement step of irradiating the placed porous membrane with excitation light and observing the fluorescence emitted by the microorganism through the porous membrane from above to measure the microbial colony. To do.

本測定方法により測定することができる微生物は特に問わず、例えば、大腸菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ、リステリア、クロストリジウム、バチルス等の、グラム陽性、グラム陰性、好気性、嫌気性を問わずコロニーを形成する細菌等を挙げることができる。
微生物を培養させて微生物コロニーを形成するための培地は、対象となる微生物に応じて適宜選択することができ、寒天培地等の固形培地、半流動培地等を用いることができる。また、培地に直接微生物を培養するに限られず、濾過等により微生物を付着させたメンブレンフィルタ等の多孔質膜を培地上に載置し、そのまま微生物を培養してフィルタ上に微生物コロニーを形成させてもよい。
微生物の培養方法は、必要とする観測方法に合わせて通常用いられる培養方法を選択することができる。 Microorganisms that can be measured by this measurement method are not particularly limited, and form colonies of Escherichia coli, Vibrio parahaemolyticus, Salmonella, Listeria, Clostridium, Bacillus, etc. regardless of Gram-positive, Gram-negative, aerobic, or anaerobic. Bacteria and the like can be mentioned.
The medium for culturing the microorganism to form a microbial colony can be appropriately selected according to the target microorganism, and a solid medium such as an agar medium, a semi-fluid medium or the like can be used. Further, the present invention is not limited to culturing microorganisms directly on the medium, and a porous membrane such as a membrane filter to which microorganisms are attached by filtration or the like is placed on the medium, and the microorganisms are cultured as they are to form microbial colonies on the filter. You may.
As the method for culturing the microorganism, a commonly used culturing method can be selected according to the required observation method.

前記蛍光試薬は、検出対象となる微生物コロニーを選択的に染色できるものであればよく、検出する微生物によって適宜選択される。微生物の活性を利用する蛍光染色剤として、例えば、微生物のエステラーゼ活性により染色されるフルオレセインジアセテート等のエステラーゼ系染色剤、呼吸活性により染色されるＣＴＣ等のテトラゾリウム塩系染色剤等を挙げることができる。検出対象となる微生物が生産する酵素、及び酵素の誘導体等により蛍光試薬を作用させてもよい。そのような酵素の例として、大腸菌が生成するβグルクロニダーゼ、βガラクトシダーゼ、βグルコシダーゼ等を挙げることができる。 The fluorescent reagent may be any as long as it can selectively stain the microbial colony to be detected, and is appropriately selected depending on the microbial colony to be detected. Examples of fluorescent stains that utilize the activity of microorganisms include esterase-based stains such as fluorescein diacetate that are stained by the esterase activity of microorganisms, tetrazolium salt-based stains such as CTC that are stained by respiratory activity, and the like. it can. The fluorescent reagent may be allowed to act on an enzyme produced by the microorganism to be detected, a derivative of the enzyme, or the like. Examples of such enzymes include β-glucuronidase, β-galactosidase, β-glucosidase and the like produced by Escherichia coli.

また、蛍光試薬に代わり又は蛍光試薬と共に、特定の微生物と結合して蛍光を発するように装飾された抗体を用いることができる。抗体は、特定の微生物にのみ結合するタンパク質や特異性を備える核酸であり、特定の微生物中の抗原と結合して発色反応（所謂免疫染色）を生じさせることができる。微生物の抗体として、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び合成核酸を用いた核酸アプタマー、ウシ、ウサギ、ヒト、マウス、モルモット及びニワトリ等から精製するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等に、蛍光色素を修飾基として結合させて用いることができる。また、修飾基となる蛍光色素の例としてＰＥ、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰｅｒＣＰ、ＡＰＣ等の蛍光タンパクや、ＦＩＴＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド等の小分子蛍光色素を挙げることができる。 Further, instead of or together with the fluorescent reagent, an antibody decorated to bind to a specific microorganism and emit fluorescence can be used. An antibody is a nucleic acid having a protein or specificity that binds only to a specific microorganism, and can bind to an antigen in a specific microorganism to cause a color-developing reaction (so-called immunostaining). As a microbial antibody, for example, a nucleic acid aptamer using DNA, RNA and synthetic nucleic acid, a polyclonal antibody purified from bovine, rabbit, human, mouse, guinea pig, chicken and the like, a monoclonal antibody and the like are bound to a fluorescent dye as a modifying group. Can be used. Examples of fluorescent dyes serving as modifying groups include fluorescent proteins such as PE, PE-Cy5, PerCP and APC, and small molecule fluorescent dyes such as FITC, Cy3, Cy5 and Texas Red.

前記多孔質膜は、微生物コロニーを構成する微生物が流動して微生物コロニーが溶解等して輪郭が変化しないように、蛍光試薬等を微生物に接触させるために用いられる。また、蛍光試薬等は多孔質膜の孔等に付着されることにより保持される。多孔質膜は、蛍光試薬等によって生じる蛍光物質に対する励起光、及び微生物から発せられる蛍光を、膜厚方向に透過可能である必要がある。励起光及び蛍光を透過可能にする手段は任意に選択することができ、例えば、湿潤時に励起光及び蛍光に対して透過性を備える材質を用いることを挙げることができる。また、多孔質膜を構成する孔内を介して膜厚方向に導光させてもよい。 The porous membrane is used to bring a fluorescent reagent or the like into contact with a microorganism so that the microorganisms constituting the microbial colony flow and the microbial colony is dissolved and the contour does not change. Further, the fluorescent reagent and the like are retained by adhering to the pores and the like of the porous membrane. The porous film needs to be able to transmit excitation light for a fluorescent substance generated by a fluorescent reagent or the like and fluorescence emitted from a microorganism in the film thickness direction. The means for making the excitation light and fluorescence transparent can be arbitrarily selected, and for example, a material having transparency to the excitation light and fluorescence when wet can be mentioned. Further, the light may be guided in the film thickness direction through the pores constituting the porous film.

多孔質膜の平均孔径は、目的に応じ適宜選択することができる。
このような孔径として、観測目的とする微生物の最小径よりも小さい径とすることを挙げることができる。微生物より小さな径とすることにより、培地上に載置した後において、孔を介して微生物が流動しないようにしつつ、蛍光試薬等による染色を行うことができる。更に、培地の湿気により湿潤して孔が塞がることで散光を抑制し、透光性が向上した多孔質膜を透過する蛍光の光量が多くなるため、より高感度に測定を行うことができる。このような径の例として、大腸菌等に対し、孔径を０．１〜０．４５μｍとすることを挙げることができる。
また、遊走性の少ない微生物（例えば、非運動性の菌や、鞭毛を欠落するなどの運動性陰性細菌）を所定濃度の培地（例えば寒天濃度が１．０％以上、より好ましくは１．５％以上の寒天培地）であり、蛍光試薬等を乾燥させた状態で付着させた多孔質膜において、その多孔質膜の平均孔径を目的とする微生物よりも大きな径としてもよい。このような条件であれば、微生物コロニーの観察後も培地上に多孔質膜を載置して微生物コロニーの培養を継続しても、微生物が孔を介して流動することないため、微生物コロニーが孔を介して拡大し、多孔質膜の上部表面まで成長させることができる。そして、多孔質膜を培地上から剥がし取ることで多孔質膜上に微生物コロニーの一部が付着した状態で培地から分離することができ、その後の観察等に利用することができる。 The average pore size of the porous membrane can be appropriately selected depending on the intended purpose.
As such a pore diameter, it can be mentioned that the diameter is smaller than the minimum diameter of the microorganism to be observed. By making the diameter smaller than that of the microorganism, it is possible to perform staining with a fluorescent reagent or the like while preventing the microorganism from flowing through the pores after being placed on the medium. Further, the moisture of the medium moistens the pores to suppress light scattering, and the amount of fluorescent light transmitted through the porous film having improved translucency increases, so that the measurement can be performed with higher sensitivity. As an example of such a diameter, the pore diameter may be 0.1 to 0.45 μm for Escherichia coli and the like.
In addition, a medium having a predetermined concentration (for example, an agar concentration of 1.0% or more, more preferably 1.5) containing microorganisms having low migration (for example, non-motile bacteria or motility-negative bacteria such as lacking flagella). % Or more agar medium), and in a porous film to which a fluorescent reagent or the like is attached in a dried state, the average pore size of the porous film may be larger than that of the target microorganism. Under such conditions, even if the porous membrane is placed on the medium and the culture of the microbial colonies is continued even after the observation of the microbial colonies, the microorganisms do not flow through the pores, so that the microbial colonies are formed. It can expand through the pores and grow to the upper surface of the porous membrane. Then, by peeling off the porous membrane from the medium, it can be separated from the medium with a part of the microbial colonies attached on the porous membrane, and it can be used for subsequent observation and the like.

多孔質膜に蛍光試薬等を付着物として付着させる方法は特に問わず、任意に選択することができる。
例えば、多孔質膜は、蛍光試薬等の溶液を湿潤させて使用することができる。蛍光試薬等の溶液を湿潤させた多孔質膜は、培地上に載置したときに蛍光試薬等の溶液が培地上の微生物に接触して染色することができる。また、多孔質に蛍光試薬等の溶液を湿潤させる方法として、例えば、溶液中に含浸、溶液を噴霧、溶液を塗布等の既知の手段を挙げることができる。
また、蛍光試薬等の溶液を多孔質膜に湿潤等させた後、乾燥させてもよい。培地の湿気等により乾燥している蛍光試薬等が溶解し、培地上の微生物に接触して染色することができる。このように蛍光試薬等を乾燥させた多孔質膜は、その取扱いを容易にし、保管性も向上させることができる。
更に、多孔質膜に蛍光試薬等の粉末を散布して付着させてもよい。また、多孔質膜を作成する際に蛍光試薬等を練り込んで一体に形成してもよい。 The method of adhering the fluorescent reagent or the like as an deposit to the porous membrane is not particularly limited and can be arbitrarily selected.
For example, the porous membrane can be used by wetting a solution such as a fluorescent reagent. A porous membrane moistened with a solution of a fluorescent reagent or the like can be stained by contacting the solution of the fluorescent reagent or the like with microorganisms on the medium when placed on the medium. Further, as a method of wetting the solution of the fluorescent reagent or the like on the porous material, for example, known means such as impregnation in the solution, spraying the solution, and applying the solution can be mentioned.
Further, a solution such as a fluorescent reagent may be moistened on the porous membrane and then dried. Fluorescent reagents and the like that are dried due to the humidity of the medium are dissolved, and can be stained by contacting with microorganisms on the medium. The porous membrane obtained by drying the fluorescent reagent or the like in this way can be easily handled and the storage stability can be improved.
Further, a powder such as a fluorescent reagent may be sprayed and adhered to the porous membrane. Further, when the porous film is produced, a fluorescent reagent or the like may be kneaded to form the film integrally.

多孔質膜に湿潤させる蛍光試薬等の溶液に、安定化剤を添加することができる。このような安定化剤の例として分散剤、ｐＨ緩衝剤、塩濃度調製剤を挙げることができる。より具体的な例としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又は界面活性剤を挙げることができる。これらを添加することにより多孔質膜に蛍光試薬等を湿潤する際に、場所によらず蛍光試薬等の濃度が均一となるように分散させることができ、微生物の染色を均一に行うことができる。また、多孔質膜を培地上に載置したときの蛍光試薬等の溶液の粘性を調節することができ、微生物が遊走したり、微生物コロニーが溶解したりすることによって、微生物コロニーの輪郭が溶解等しないよう制御することができる。更に、蛍光試薬等を付着させた多孔質膜の反りを抑制することができ、多孔質膜の表面を平坦にすることができる。そして、微生物の蛍光が多孔質膜により乱反射して観測精度が低下することを防止することができる。
ＤＭＳＯ、界面活性剤及び安定化剤の種類及び濃度は、微生物の増殖や、蛍光試薬等による染色を過度に阻害しない濃度において適時選択することができる。 A stabilizer can be added to a solution such as a fluorescent reagent that wets the porous membrane. Examples of such stabilizers include dispersants, pH buffers, and salt concentration adjusting agents. More specific examples include dimethyl sulfoxide (DMSO) or surfactants. By adding these, when the fluorescent reagent or the like is wetted on the porous membrane, it can be dispersed so that the concentration of the fluorescent reagent or the like becomes uniform regardless of the location, and the microorganisms can be uniformly stained. .. In addition, the viscosity of a solution such as a fluorescent reagent when the porous membrane is placed on the medium can be adjusted, and the outline of the microbial colony is dissolved by the migration of the microorganism or the dissolution of the microbial colony. It can be controlled not to be equal. Further, the warp of the porous film to which the fluorescent reagent or the like is attached can be suppressed, and the surface of the porous film can be flattened. Then, it is possible to prevent the fluorescence of the microorganism from being diffusely reflected by the porous film and the observation accuracy from being lowered.
The type and concentration of DMSO, surfactant and stabilizer can be selected in a timely manner at a concentration that does not excessively inhibit the growth of microorganisms and staining with fluorescent reagents and the like.

また、湿潤させた多孔質膜を乾燥させてもよい。例えば、蛍光試薬の溶液を多孔質膜に含浸させた後、乾燥させる。また、乾燥状態の蛍光試薬を多孔質膜に吹き付ける等により物理的に付着させてもよい。乾燥させた蛍光試薬を付着させた多孔質膜は、保存の管理が容易になる。
乾燥させた多孔質膜は、培地上に載置することで、培地の湿気により付着物を溶解させて染色することができる。また、培地上に載置後、水等の溶媒を噴霧することにより付着物を溶解させ、染色することができる。
尚、多孔質膜に蛍光試薬等を付着させる工程は、測定工程と同時に行ってもよい。例えば、培養工程を行った後、付着部を付着させることなく多孔質膜を培地上に載置し、次いで、培地上の多孔質膜に対して付着工程を行い、その後測定工程を行ってもよい。このとき、培地上に載置した多孔質膜に蛍光試薬を付着させる手段を任意に選択することができ、例えば、蛍光試薬の溶液を多孔質膜に滴下や噴霧等して付着させてもよいし、乾燥状態の蛍光試薬を多孔質膜に吹き付け等により付着させてもよい。 Alternatively, the moistened porous membrane may be dried. For example, the porous membrane is impregnated with a solution of a fluorescent reagent and then dried. Further, the fluorescent reagent in a dry state may be physically attached by spraying it on the porous membrane or the like. The porous membrane to which the dried fluorescent reagent is attached facilitates storage management.
By placing the dried porous film on the medium, the deposits can be dissolved and stained by the humidity of the medium. Further, after placing on the medium, the deposits can be dissolved and stained by spraying a solvent such as water.
The step of attaching the fluorescent reagent or the like to the porous membrane may be performed at the same time as the measurement step. For example, after performing the culturing step, the porous membrane may be placed on the medium without adhering the adhesion portion, then the adhesion step may be performed on the porous membrane on the medium, and then the measurement step may be performed. Good. At this time, a means for adhering the fluorescent reagent to the porous membrane placed on the medium can be arbitrarily selected. For example, a solution of the fluorescent reagent may be adhered to the porous membrane by dropping or spraying. Then, the dry fluorescent reagent may be attached to the porous membrane by spraying or the like.

多孔質膜を培地上に載置する多孔質膜載置工程は、付着物が付着する多孔質膜を培地等（培地上のフィルタ等）に載置することで、付着物を培地等に接触させ、微生物を付着物により染色させる工程である。多孔膜を載置する条件は特に問わないが、付着物の反応に適する温度（例えば２５〜３７℃）の温度下で行うことで、染色を促進させることができる。また、多孔質膜を予め所定の温度（例えば２５〜３７℃）になるまで加温してから載置しても良い。 In the porous membrane mounting step of placing the porous membrane on the medium, the porous membrane to which the deposits adhere is placed on the medium or the like (filter on the medium or the like), so that the deposits come into contact with the medium or the like. This is a step of allowing the microorganisms to be stained with deposits. The conditions under which the porous film is placed are not particularly limited, but dyeing can be promoted by carrying out the process at a temperature suitable for the reaction of the deposits (for example, 25 to 37 ° C.). Further, the porous membrane may be preheated to a predetermined temperature (for example, 25 to 37 ° C.) and then placed.

微生物コロニーの測定は、培地上に載置されている多孔質膜の上方から励起光を照射し、その多孔質膜を介して培地上の微生物から発せられる蛍光を上方から観測することで行われる。
照射する励起光は、蛍光試薬又は抗体によって得られる蛍光物質と、観測方法に合わせて適宜選択することができる。
また、微生物から発せられる蛍光を観測する手段は適宜選択することができ、例えば、蛍光顕微鏡等を用いた肉眼観察する、イメージセンサ等により撮像等を挙げることができる。イメージセンサ等により撮像を行う構成の例を図１６に挙げる。図１６に例示する撮像装置６は、光源６２及び撮像素子６３を備え、光源６２から発せられる励起光が落射照明部６１を介して照射されている培地１を、撮像素子６３により撮像することにより画像を取得する。光源６２は、対象となる微生物コロニーの蛍光の励起光を発するための光源であり、その種類を特に問わない。
例えば、光源６２として、ＬＥＤランプ、水銀ランプ、ハロゲンランプ、レーザ発振器等を挙げることができる。落射照明部６１は、培地１に照射する光源６２の光路と、培地１を撮像する撮像素子６３の光路の光軸と、を同一にするためのものであり、ダイクロイックミラーやプリズム等を組み合わせて構成することができる。撮像素子６３は、微生物コロニーから発する蛍光の波長により撮像して、その画像を得ることができる手段であればよく、ＣＣＤイメージセンサ、ＣＭＯＳイメージセンサ、ＳＩＴイメージセンサ等を例示することができる。
また、落射照明部６１又は撮像素子６３にダイクロイックミラーや光学フィルタ等を任意に組み合わせて、撮像素子６３に到達する蛍光の波長を選択したり、到着する波長の切替を行ったりすることができる。 Microbial colonies are measured by irradiating excitation light from above the porous membrane placed on the medium and observing the fluorescence emitted from the microorganisms on the medium through the porous membrane from above. ..
The excitation light to be irradiated can be appropriately selected according to the fluorescent substance obtained by the fluorescent reagent or antibody and the observation method.
In addition, the means for observing the fluorescence emitted from the microorganism can be appropriately selected, and examples thereof include visual observation using a fluorescence microscope and imaging with an image sensor and the like. FIG. 16 shows an example of a configuration in which an image is taken by an image sensor or the like. The image pickup device 6 illustrated in FIG. 16 is provided with a light source 62 and an image pickup device 63, and the culture medium 1 in which the excitation light emitted from the light source 62 is irradiated through the epi-illumination unit 61 is imaged by the image pickup device 63. Get an image. The light source 62 is a light source for emitting fluorescence excitation light of the target microbial colony, and the type thereof is not particularly limited.
For example, as the light source 62, an LED lamp, a mercury lamp, a halogen lamp, a laser oscillator, or the like can be mentioned. The epi-illumination unit 61 is for making the optical path of the light source 62 that irradiates the medium 1 and the optical path of the optical path of the image sensor 63 that images the medium 1 the same, and is combined with a dichroic mirror, a prism, or the like. Can be configured. The image sensor 63 may be any means as long as it can take an image by the wavelength of fluorescence emitted from the microbial colony and obtain the image, and examples thereof include a CCD image sensor, a CMOS image sensor, and a SIT image sensor.
Further, the dichroic mirror, the optical filter, or the like can be arbitrarily combined with the epi-illumination unit 61 or the image sensor 63 to select the wavelength of fluorescence that reaches the image sensor 63 or switch the wavelength of arrival.

本微生物コロニーの測定方法においては、複数（多重）の染色を行ってもよい。例えば、複数の染色は、２種類以上の複数種類の微生物に対してそれぞれを特定するために、複数の蛍光試薬や抗体を任意に組み合わせて行うことができる。また、複数の微生物コロニーに対して特定の物質を生成しているかを特定するために行うことができる。
例えば、多孔質膜載置工程では、多孔質膜を１種類の微生物を染色する抗体の溶液と蛍光試薬の溶液とで多孔質膜を湿潤させて培地上に載置する。次に、測定工程では、載置されている多孔質膜に励起光を照射し、多孔質膜を介して抗体から発せられる蛍光と微生物から発せられる蛍光とをそれぞれ観測することにより微生物コロニーを測定することができる。これによって、１つの多孔質膜を用いて、多重染色によって選択的な染色を行うことができ、種類の異なる微生物のうち特定種類の微生物を識別して測定を行うことができる。 In the method for measuring the microbial colonies, a plurality of (multiple) stains may be performed. For example, the plurality of stains can be performed by arbitrarily combining a plurality of fluorescent reagents and antibodies in order to identify each of the two or more types of microorganisms. It can also be done to identify whether a particular substance is being produced for a plurality of microbial colonies.
For example, in the step of placing a porous membrane, the porous membrane is placed on a medium by moistening the porous membrane with a solution of an antibody that stains one type of microorganism and a solution of a fluorescent reagent. Next, in the measurement step, the microbial colonies are measured by irradiating the placed porous membrane with excitation light and observing the fluorescence emitted from the antibody and the fluorescence emitted from the microorganism through the porous membrane. can do. Thereby, selective staining can be performed by multiplex staining using one porous membrane, and a specific type of microorganism among different types of microorganisms can be identified and measured.

また、複数の染色を行う場合において各染色を分けて行い、染色毎に測定工程を行ってもよい。
例えば、前記多孔質膜載置工程は、抗体を付着させた第１の多孔質膜を培地上に載置する第１の多孔質膜載置工程と、更に蛍光試薬を付着させた第２の多孔質膜を培地上の第１の多孔質膜上に載置する第２の多孔質膜載置工程と、を行うようにすることができる。そして、前記測定工程は、前記第１の多孔質膜載置工程後に第１の多孔質膜に励起光を照射し、第１の多孔質膜を介して抗体から発せられる蛍光を観測する第１の測定工程と、前記第２の多孔質膜載置工程後に第２の多孔質膜に励起光を照射し、第１の多孔質膜及び第２の多孔質膜を介して抗体から発せられる蛍光を観測する第２の測定工程と、を行うことができる。このようにすれば、第１の測定工程において抗体が発する蛍光を測定することができ、第２の測定工程において蛍光試薬により微生物全体が発する蛍光を測定することができる。このため、抗体による蛍光の波長と蛍光試薬による蛍光の波長とを区別して観測できない場合であっても、第１の測定工程において抗体により染色された１種類以上の微生物を測定することができる。次に、第２の多孔質膜載置工程を行った後に第２の測定工程を行うことによって、蛍光試薬によって染色された抗体による染色とは異なる１種類以上の微生物コロニーの全体を測定することができることとなる。
また、第１の測定工程の後に、抗体を失活させて、抗体と蛍光試薬が同時に蛍光を発しないようにしてもよい。このような失活の条件は適宜選択され、例えば４〜２５℃の温度で所定時間静置することで行うことができる。
更に、複数の波長を放射する光源によって、複数波長の蛍光を発するようにし、観測時に各波長の蛍光をバンドパスフィルタ等によりそれぞれ選択して観察してもよい。 Further, in the case of performing a plurality of dyeings, each dyeing may be performed separately, and a measurement step may be performed for each dyeing.
For example, the porous membrane mounting step includes a first porous membrane mounting step in which the first porous membrane to which the antibody is attached is placed on the medium, and a second porous membrane mounting step in which a fluorescent reagent is further attached. The second porous membrane mounting step of placing the porous membrane on the first porous membrane on the medium can be performed. Then, in the measurement step, after the first porous membrane placing step, the first porous membrane is irradiated with excitation light, and the fluorescence emitted from the antibody is observed through the first porous membrane. After the measurement step of the above and the second porous membrane placement step, the second porous membrane is irradiated with excitation light, and the fluorescence emitted from the antibody via the first porous membrane and the second porous membrane. A second measurement step of observing the above can be performed. In this way, the fluorescence emitted by the antibody can be measured in the first measurement step, and the fluorescence emitted by the entire microorganism by the fluorescent reagent can be measured in the second measurement step. Therefore, even when the wavelength of fluorescence by the antibody and the wavelength of fluorescence by the fluorescent reagent cannot be separately observed, one or more types of microorganisms stained with the antibody can be measured in the first measurement step. Next, by performing the second measurement step after performing the second porous film placement step, the entire one or more types of microbial colonies different from the staining with the antibody stained with the fluorescent reagent are measured. Will be possible.
Further, after the first measurement step, the antibody may be inactivated so that the antibody and the fluorescent reagent do not fluoresce at the same time. Such deactivation conditions are appropriately selected, and can be carried out, for example, by allowing them to stand at a temperature of 4 to 25 ° C. for a predetermined time.
Further, a light source that emits a plurality of wavelengths may emit fluorescence of a plurality of wavelengths, and the fluorescence of each wavelength may be selected and observed by a bandpass filter or the like at the time of observation.

本微生物コロニーの測定方法により、大腸菌の観測を行った。
１．実験例１
（１）培養工程
大腸菌を含む水溶液である検体をメンブレンフィルタ２（メルク社、HABG02500）によって濾過し、メンブレンフィルタ２に大腸菌５を付着させた（図２）。大腸菌５は、大きさが短軸０．４−０．７μｍ、長軸２．０−４．０μｍ程度の桿状体である。
このメンブレンフィルタ２をトリプトソイ寒天平板培地１上に載置した状態で、３７℃の恒温槽内に５時間静置して培養し、大腸菌５の微生物コロニー４を形成させた（図３）。 Escherichia coli was observed by the method for measuring this microbial colony.
1. 1. Experimental Example 1
(1) Culture Step A sample, which is an aqueous solution containing Escherichia coli, was filtered through a membrane filter 2 (Merck & Co., HABG02500), and Escherichia coli 5 was attached to the membrane filter 2 (FIG. 2). Escherichia coli 5 is a rod-shaped body having a minor axis of 0.4-0.7 μm and a major axis of about 2.0-4.0 μm.
This membrane filter 2 was placed on a trypto soy agar plate medium 1 and cultured in a constant temperature bath at 37 ° C. for 5 hours to form microbial colonies 4 of Escherichia coli 5 (FIG. 3).

（２）多孔質膜載置工程
その後、多孔質膜３である厚さ０．１ｍｍ、平均孔径０．２μｍの未着色ＰＴＦＥ製メンブレンフィルタ（メルクミリポア社、JGWP02500）を０．０１mol/m3のＣＴＣ溶液に浸漬し、湿潤させた。そして、ＣＴＣを湿潤させた多孔質膜３を培地１上のメンブレンフィルタ２上に重ね合わせるように載置した。このとき、湿潤した多孔質膜３は着色されておらず、且つ透光性を備えており、図６に例示するように多孔質膜３下のメンブレンフィルタ２の表面の状態が透けて見える。その後、３７℃の恒温槽内で５分以上静置した（図４）。 (2) Porous Membrane Placement Step After that, an uncolored PTFE membrane filter (Merck Millipore, JGWP02500) having a thickness of 0.1 mm and an average pore diameter of 0.2 μm, which is the porous membrane 3, was applied to 0.01 mol / m 3 . It was immersed in a CTC solution and moistened. Then, the porous membrane 3 moistened with CTC was placed so as to be superposed on the membrane filter 2 on the medium 1. At this time, the wet porous film 3 is not colored and has translucency, and as illustrated in FIG. 6, the state of the surface of the membrane filter 2 under the porous film 3 can be seen through. Then, it was allowed to stand in a constant temperature bath at 37 ° C. for 5 minutes or more (Fig. 4).

（３）測定工程
多孔質膜３及びメンブレンフィルタ２を載置した培地１をシャーレに移し、蓋をした後、培地１の上方から多孔質膜３に向けて励起光を照射して、蛍光顕微鏡により培地１上から多孔質膜３を介して観察、及び撮影を行った（図１、図５）。
図５に示すように、メンブレンフィルタ２を介した状態で合っても、微生物コロニー４から発せられる蛍光を確認することができた。また、微生物コロニー４の形状も輪郭が崩れたりすることがなく円形状であった。
更に、撮影後、多孔質膜３を載置した状態で、３７℃の恒温槽に戻し、１８時間静置して、追加の培養を行った（図６、図７）に示す。次いで、多孔質膜３を剥がして撮影したメンブレンフィルタ２上の画像を図７に示す。
図６に示すように、メンブレンフィルタ２上の各微生物コロニー４は、多孔質膜３が載置されていてもその輪郭が崩れることなく存在していることを、多孔質膜３を介して観察することができる。また、図７に示すように、多孔質膜３を除去しても輪郭が崩れることなく存在していることが分かる。 (3) Measurement step The medium 1 on which the porous membrane 3 and the membrane filter 2 are placed is transferred to a petri dish, covered, and then irradiated with excitation light from above the medium 1 toward the porous membrane 3, and a fluorescence microscope is used. The medium 1 was observed and photographed through the porous film 3 (FIGS. 1 and 5).
As shown in FIG. 5, it was possible to confirm the fluorescence emitted from the microbial colony 4 even when the membrane filter 2 was used for the combination. Further, the shape of the microbial colony 4 was also circular without the contour being broken.
Further, after photographing, the porous film 3 was placed in a constant temperature bath at 37 ° C. and allowed to stand for 18 hours for additional culture (FIGS. 6 and 7). Next, an image on the membrane filter 2 taken by peeling off the porous film 3 is shown in FIG.
As shown in FIG. 6, it is observed through the porous membrane 3 that each microbial colony 4 on the membrane filter 2 exists without breaking its contour even when the porous membrane 3 is placed. can do. Further, as shown in FIG. 7, it can be seen that even if the porous film 3 is removed, the contour does not collapse and exists.

２．比較例１
実験例１と同じ条件で平均孔径を１０μｍとした多孔質膜（メルクミリポア社、JGWP02500）を用いて染色を行った比較例１の結果を図８に示す。図８に示すように、多孔質膜の孔の大きさが微生物（大腸菌）よりも大きいため、コロニーを構成する微生物が流動して、多孔質膜の全体に分散したため観測ができない状態となった。 2. 2. Comparative Example 1
FIG. 8 shows the results of Comparative Example 1 in which staining was performed using a porous membrane (Merck Millipore, JGWP02500) having an average pore size of 10 μm under the same conditions as in Experimental Example 1. As shown in FIG. 8, since the pore size of the porous membrane is larger than that of the microorganism (Escherichia coli), the microorganisms constituting the colony flowed and dispersed throughout the porous membrane, so that the observation could not be performed. ..

３．実験例２
次いで、染色による観察を行った。
（１）培養工程
乳酸菌（Lactobacillus casei）をミスラ法により培養した。始めに、寒天培地に乳酸菌を含む検体を滴下・浸透させ、好気条件で２０時間培養を行い、乳酸菌のコロニーを形成させた。 3. 3. Experimental Example 2
Then, observation by staining was performed.
(1) Culturing step Lactobacillus casei was cultivated by the Misra method. First, a sample containing lactic acid bacteria was dropped and permeated into an agar medium, and cultured under aerobic conditions for 20 hours to form colonies of lactic acid bacteria.

（２）多孔質膜載置工程
その後、多孔質膜である厚さ０．１ｍｍ、平均孔径０．２μｍの未着色ＰＴＦＥ製メンブレンフィルタを０．０１mol/m3のＣＴＣ溶液に浸漬させた。そして、ＣＴＣを湿潤させた多孔質膜を培地上のメンブレンフィルタ上に重ね合わせるように載置し、３７℃の恒温槽内で５分以上静置した。 (2) Porous Membrane Placement Step After that, an uncolored PTFE membrane filter having a thickness of 0.1 mm and an average pore diameter of 0.2 μm, which is a porous membrane, was immersed in a CTC solution of 0.01 mol / m 3 . Then, the porous membrane moistened with CTC was placed so as to be superposed on the membrane filter on the medium, and allowed to stand in a constant temperature bath at 37 ° C. for 5 minutes or more.

（３）測定工程
多孔質膜及びメンブレンフィルタを載置した培地をシャーレに移して蓋をした後、上方から多孔質膜に向けて励起光を照射して、蛍光顕微鏡により観察、及び撮影を行った（図９、図１０）。
図９、図１０に示すように、実施例１と同様に微生物コロニーが観察できることが分かる。
また、撮影後、多孔質膜を載置した状態で３７℃の恒温槽に戻した後、２４時間静置して、追加の培養を行った画像を図１１に示す。次いで、多孔質膜を剥がして撮影したメンブレンフィルタ上の画像を図１２に示す。
図１１に示すように、培地上の各微生物コロニーは、多孔質膜が載置されていてもその輪郭が崩れることなく存在していることが、多孔質膜を介して観察することができる。また、図１２に示すように、多孔質膜を除去しても輪郭が崩れることなく存在していることが分かる。 (3) Measurement step After transferring the medium on which the porous membrane and the membrane filter are placed to a petri dish and covering it, irradiate the porous membrane with excitation light from above, and observe and photograph with a fluorescence microscope. (FIGS. 9 and 10).
As shown in FIGS. 9 and 10, it can be seen that microbial colonies can be observed in the same manner as in Example 1.
In addition, FIG. 11 shows an image in which the porous film was placed and the mixture was returned to a constant temperature bath at 37 ° C. and then allowed to stand for 24 hours for additional culture. Next, an image on the membrane filter taken by peeling off the porous membrane is shown in FIG.
As shown in FIG. 11, it can be observed through the porous membrane that each microbial colony on the medium exists even if the porous membrane is placed on the medium without breaking its contour. Further, as shown in FIG. 12, it can be seen that even if the porous film is removed, the contour does not collapse and exists.

４．実験例３
複数の微生物が存在する培地を二重染色法による観察を行った。
（１）培養工程
微生物として、病原大腸菌（Ｏ１５７、ＧＴＣ０３９０４株）と、一般大腸菌（ＡＴＣＣ８７３９株）を含む生理食塩水である検体をメンブレンフィルタ（メルク社、HABG02500）によって濾過し、メンブレンフィルタに各大腸菌を付着させた。
各大腸菌が付着したメンブレンフィルタをトリプトソイ寒天寒天平板培地上に載置した状態で、恒温槽内に３７℃５時間静置して培養し、各大腸菌の微生物コロニーを形成させた。 4. Experimental Example 3
The medium in which multiple microorganisms were present was observed by the double staining method.
(1) Culture step A sample which is a physiological saline solution containing pathogenic Escherichia coli (O157, GTC03904 strain) and general Escherichia coli (ATCC8739 strain) as microorganisms is filtered by a membrane filter (Merck, HABG02500), and each Escherichia coli is filtered through a membrane filter. Was attached.
The membrane filter to which each Escherichia coli was attached was placed on a trypto soy agar plate medium and cultured in a constant temperature bath at 37 ° C. for 5 hours to form microbial colonies of each Escherichia coli.

（２）第１多孔質膜載置工程及び第１測定工程
その後、第１多孔質膜である厚さ０．１ｍｍ、平均孔径０．２μｍの未着色ＰＴＦＥ製メンブレンフィルタ（メルクミリポア社、JGWP02500）を０．１ｍｇ／ｍＬの抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories社、02-95-90、Anti-E.coli O157:H7, Goat-Poly, FITC, BacTrace）の溶液に浸漬し、湿潤させて、培地上のメンブレンフィルタ上に載置した（第１の多孔質膜載置工程）。
前記第１の多孔質膜載置工程の後、第１多孔質膜及びメンブレンフィルタを載置した培地をシャーレに移し、蓋をした後、図１６に例示するように、複数のダイクロイックミラーを用いた落射照明部６１を介して上方から第１多孔質膜に向けて光源６２であるＬＥＤライトにより励起光（中心波長４９０ｎｍ）を照射して、５２５nm以上の波長を透過するように設計された光学フィルタを取り付けたＣＣＤカメラ６３によって撮影を行った（第１測定工程、図５、図１３）。抗体による蛍光の波長は５３０ｎｍであり、図１３は抗体により発色した病原大腸菌のコロニーの分布を表している。 (2) First Porous Membrane Placement Step and First Measurement Step After that, an uncolored PTFE membrane filter having a thickness of 0.1 mm and an average pore diameter of 0.2 μm, which is the first porous membrane (Merck Millipore, JGWP02500). Is immersed in a solution of 0.1 mg / mL antibody (Kirkegaard & Perry Laboratories, 02-95-90, Anti-E.coli O157: H7, Goat-Poly, FITC, BacTrace), moistened, and placed on a medium. It was placed on the membrane filter of (1st porous membrane mounting step).
After the first porous membrane mounting step, the medium on which the first porous membrane and the membrane filter are placed is transferred to a chalet, covered, and then a plurality of dichroic mirrors are used as illustrated in FIG. Optics designed to transmit excitation light (center wavelength 490 nm) from above toward the first porous film via the dichroic illumination unit 61 by an LED light that is a light source 62 and transmit a wavelength of 525 nm or more. The image was taken by the CCD camera 63 to which the filter was attached (first measurement step, FIGS. 5, 13). The wavelength of fluorescence by the antibody is 530 nm, and FIG. 13 shows the distribution of colonies of pathogenic Escherichia coli colored by the antibody.

（３）第２多孔質膜載置工程及び第２測定工程
更に、第１多孔質膜と同種の第２多孔質膜を０．０１mol/m3のＣＴＣ溶液に湿潤させて、第１多孔質膜上に載置した（第２の多孔質膜載置工程）。このとき、培地から順にメンブレンフィルタ、第１多孔質膜、第２多孔質膜が積層された状態となる。このとき、第２多孔質膜に付着しているＣＴＣが、第１多孔質膜内に分散し、メンブレンフィルタ上の各微生物に接触することで、各微生物を染色する。
前記第２の多孔質膜載置工程の後、蓋をしたシャーレの上方から第２多孔質膜に向けて励起光（中心波長４９０ｎｍ）を照射して、６３０nm以上の波長を透過するように設計された光学フィルタを取り付けたＣＣＤカメラによって撮影を行った（図１４）。図１４はＣＴＣにより発色した一般大腸菌のコロニーの分布を表している。
上記のような測定工程によって、第１多孔質膜及び第２多孔質膜を介した状態であっても、別種の微生物コロニーから発せられる蛍光を識別することが可能になる。また、微生物コロニーの形状も、輪郭が崩れたりすることがなく円形状に保たれている。 (3) Second Porous Membrane Placement Step and Second Measurement Step Further, the second porous membrane of the same type as the first porous membrane is moistened with a 0.01 mol / m 3 CTC solution to make the first porous membrane. It was placed on a membrane (second porous membrane placement step). At this time, the membrane filter, the first porous membrane, and the second porous membrane are laminated in this order from the medium. At this time, the CTC adhering to the second porous membrane is dispersed in the first porous membrane and comes into contact with each microorganism on the membrane filter to stain each microorganism.
After the second porous film mounting step, it is designed to transmit excitation light (center wavelength 490 nm) from above the covered chalet toward the second porous film to transmit a wavelength of 630 nm or more. The image was taken with a CCD camera equipped with the optical filter (Fig. 14). FIG. 14 shows the distribution of colonies of general Escherichia coli colored by CTC.
By the measurement step as described above, it becomes possible to identify the fluorescence emitted from another type of microbial colony even in the state through the first porous membrane and the second porous membrane. In addition, the shape of the microbial colony is also maintained in a circular shape without the contour being broken.

５．実験例４
微生物コロニーの測定方法による二重染色法による観察は、複数枚の多孔質膜を用いる実験例３の方法に限られない。抗体の蛍光波長と、染色剤の蛍光波長とは異なるため、複数の多孔質膜載置工程をまとめることができる。
例えば、多孔質膜載置工程として前記抗体と、前記ＣＴＣとを混合した溶液を多孔質に湿潤させた多孔質膜を培地上に載置させた後、第１測定工程として波長５３０ｎｍ付近を透過するバンドパスフィルタを取り付けたＣＣＤカメラによって撮影を行い（図１５（ａ）、（ｂ））、その後、第２測定工程として波長６３０ｎｍ付近を透過するバンドパスフィルタを取り付けたＣＣＤカメラによって撮影を行うことにより、抗体及び染色剤の蛍光をそれぞれ撮影することができる（図１５（ｃ））。
このように、撮影可能な蛍光を制限することにより単一の多孔質膜載置工程であっても、病原大腸菌のコロニー分布と、一般大腸菌と病原大腸菌を合わせた微生物コロニーの分布を観察することができる。 5. Experimental Example 4
Observation by the double staining method by the method for measuring microbial colonies is not limited to the method of Experimental Example 3 using a plurality of porous membranes. Since the fluorescence wavelength of the antibody and the fluorescence wavelength of the stain are different, a plurality of porous film mounting steps can be combined.
For example, as a step of placing a porous film, a porous film obtained by moistening a solution obtained by mixing the antibody and the CTC in a porous manner is placed on a medium, and then a wavelength of around 530 nm is transmitted as a first measurement step. The image is taken with a CCD camera equipped with a bandpass filter (FIGS. 15A and 15B), and then as a second measurement step, an image is taken with a CCD camera equipped with a bandpass filter that transmits a wavelength around 630 nm. As a result, the fluorescence of the antibody and the staining agent can be photographed (FIG. 15 (c)).
In this way, by limiting the fluorescence that can be photographed, the distribution of pathogenic Escherichia coli colonies and the distribution of microbial colonies that combine general Escherichia coli and pathogenic Escherichia coli can be observed even in a single porous membrane placement step. Can be done.

本発明は以上で詳述した実施形態に限定されず、本発明の請求項に示した範囲で様々な変形又は変更が可能である。 The present invention is not limited to the embodiments detailed above, and various modifications or modifications can be made within the scope of the claims of the present invention.

１；培地、２；メンブレンフィルタ、３；多孔質膜、４；微生物コロニー、５；微生物、６；撮像装置、６１；落射照明部、６２；光源、６３；カメラ、６３；撮像素子。 1; medium, 2; membrane filter, 3; porous membrane, 4; microbial colony, 5; microorganism, 6; image pickup device, 61; epi-illumination unit, 62; light source, 63; camera, 63; image sensor.

Claims (7)

培地上に形成される微生物コロニーを測定する微生物コロニーの測定方法であって、
培地上で微生物を培養する培養工程と、
所定の蛍光試薬及び所定の抗体のうちの少なくとも１種を、多孔質膜に付着物として付着させる付着工程と、
前記培養工程の後に、前記多孔質膜を前記培地上に載置して介在物を介することなく前記付着物を前記微生物に接触させて、前記付着物により前記微生物を染色する多孔質膜載置工程と、
前記載置されている前記多孔質膜の上方から励起光を照射し、前記多孔質膜を介して前記微生物により発せられる蛍光を上方から観測することにより微生物コロニーを測定する測定工程と、
を行い、
前記多孔質膜の平均孔径は目的とする微生物よりも小さい、又は前記多孔質膜の平均孔径は目的とする微生物よりも大きく且つ前記付着工程において乾燥した前記付着物を前記多孔質膜に付着させることを特徴とする微生物コロニーの測定方法。 A method for measuring microbial colonies formed on a medium, which is a method for measuring microbial colonies.
The culture process of culturing microorganisms on the medium and
An attachment step of attaching at least one of a predetermined fluorescent reagent and a predetermined antibody to the porous membrane as an deposit, and
After the culture step, the porous membrane is placed on the medium to bring the deposits into contact with the microorganisms without intervening inclusions, and the porous membranes are placed to stain the microorganisms with the deposits. Process and
A measurement step of irradiating excitation light from above the above-mentioned porous film and observing fluorescence emitted by the microorganism through the porous film from above to measure microbial colonies.
The stomach line,
The average pore size of the porous membrane is smaller than that of the target microorganism, or the average pore size of the porous membrane is larger than that of the target microorganism and the deposits dried in the attachment step are attached to the porous membrane. A method for measuring a microbial colony. 前記微生物は複数種類を含み、
前記付着工程は、１種類以上の前記微生物を染色する抗体と１種類以上の前記微生物を染色する前記蛍光試薬とを前記多孔質膜に付着させ、
前記測定工程は、前記載置されている前記多孔質膜に励起光を照射し、前記多孔質膜を介して前記抗体により発せられる蛍光と前記蛍光試薬による染色によって発せられる蛍光とをそれぞれ観測することにより微生物コロニーを測定する請求項１記載の微生物コロニーの測定方法。 The microorganisms include multiple types
In the attachment step, an antibody that stains one or more types of the microorganism and the fluorescent reagent that stains one or more types of the microorganism are attached to the porous membrane.
In the measurement step, the porous membrane described above is irradiated with excitation light, and the fluorescence emitted by the antibody and the fluorescence emitted by staining with the fluorescent reagent are observed through the porous membrane, respectively. The method for measuring a microbial colony according to claim 1, wherein the microbial colony is measured thereby. 前記微生物は複数種類を含み、
前記付着工程は、１種類以上の前記微生物を染色する抗体を付着させて第１の多孔質膜を形成する第１付着工程と、１種類以上の前記微生物を染色する前記蛍光試薬を付着させて第２の多孔質膜を形成する第２付着工程と、を行い、
前記多孔質膜載置工程は、前記第１の多孔質膜を前記培地上に載置する第１載置工程と、前記第２の多孔質膜を前記培地上に載置する第２載置工程と、を行い、
前記測定工程は、前記第１載置工程後に前記第１の多孔質膜に励起光を照射し、前記第１の多孔質膜を介して前記抗体により発せられる蛍光を観測する第１測定工程と、前記第２載置工程後に前記第２の多孔質膜に励起光を照射し、前記第２の多孔質膜を介して前記蛍光試薬による染色によって発せられる蛍光を観測する第２測定工程と、を行う請求項１記載の微生物コロニーの測定方法。 The microorganisms include multiple types
The attachment step is a first attachment step of attaching an antibody that stains one or more kinds of the microorganisms to form a first porous film, and attaching the fluorescent reagent that stains one or more kinds of the microorganisms. The second adhesion step of forming the second porous film is performed.
The porous membrane mounting step includes a first mounting step of mounting the first porous membrane on the medium and a second mounting of the second porous membrane on the medium. Perform the process and
The measurement step includes a first measurement step of irradiating the first porous membrane with excitation light after the first placement step and observing fluorescence emitted by the antibody through the first porous membrane. A second measurement step of irradiating the second porous membrane with excitation light after the second mounting step and observing fluorescence emitted by staining with the fluorescent reagent through the second porous membrane. The method for measuring a microbial colony according to claim 1. 前記培養工程は、前記微生物が混ざった溶液をフィルタにより濾過し、当該フィルタを前記培地上に載置することによって前記微生物を培養する請求項１乃至３のいずれかに記載の微生物コロニーの測定方法。 The method for measuring a microbial colony according to any one of claims 1 to 3, wherein in the culturing step, the solution in which the microorganism is mixed is filtered by a filter, and the filter is placed on the medium to cultivate the microorganism. .. 前記培養工程を行った後、前記付着物を付着させることなく前記多孔質膜を前記培地上に載置し、次いで、前記培地上の前記多孔質膜に対して前記付着工程を行い、その後前記測定工程を行う請求項１記載の微生物コロニーの測定方法。 After performing the culture step, the porous membrane is placed on the medium without adhering the deposits, and then the adhesion step is performed on the porous membrane on the medium, and then the above-mentioned. The method for measuring a microbial colony according to claim 1, wherein the measurement step is performed. 前記多孔質膜の平均孔径は目的とする微生物よりも小さく、
前記付着工程は、界面活性剤を含む溶媒に前記付着物を溶かした溶液により前記多孔質膜を湿潤させることによって、前記付着物を前記多孔質膜に付着させる請求項１乃至５のいずれかに記載の微生物コロニーの測定方法。 The average pore size of the porous membrane is smaller than that of the target microorganism,
The adhesion step is according to any one of claims 1 to 5 , wherein the adhesion is adhered to the porous membrane by wetting the porous membrane with a solution in which the deposit is dissolved in a solvent containing a surfactant. The method for measuring a microbial colony described. 前記多孔質膜の平均孔径は目的とする微生物よりも小さく、
前記付着工程は、前記付着物の安定化剤を含む溶媒に前記付着物を溶かした溶液により前記多孔質膜を湿潤させることによって、前記付着物を前記多孔質膜に付着させる請求項１乃至６のいずれかに記載の微生物コロニーの測定方法。 The average pore size of the porous membrane is smaller than that of the target microorganism,
In the adhesion step, claims 1 to 6 for adhering the deposit to the porous membrane by wetting the porous membrane with a solution in which the deposit is dissolved in a solvent containing a stabilizer for the deposit. The method for measuring a microbial colony according to any one of.
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