JP6745449B2 - Umbilical cord tissue cryopreservation method - Google Patents
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Description
本発明は、臍帯組織の凍結保存方法に関する。より詳細には、解凍後に回収される生細胞数が良好な、臍帯組織の凍結保存方法に関する。 The present invention relates to a method for cryopreserving umbilical cord tissue. More specifically, the present invention relates to a method for cryopreserving umbilical cord tissue, in which the number of viable cells recovered after thawing is good.
臍帯組織は、間葉系幹細胞をはじめとする、種々の組織幹細胞および前駆細胞を豊富に含んでいる。間葉系幹細胞は、骨髄、脂肪、臍帯血、臍帯、および胎盤等から分離され、付着性であり、多様な細胞に分化する能力を有する。そのため、臍帯組織は、医療または研究において、重要な細胞供給源となり得る。 Umbilical cord tissue is rich in various tissue stem cells and progenitor cells, including mesenchymal stem cells. Mesenchymal stem cells are separated from bone marrow, fat, cord blood, umbilical cord, placenta and the like, are adherent, and have the ability to differentiate into various cells. As such, umbilical cord tissue can be an important source of cells in medicine or research.
このような臍帯組織由来の細胞は、臍帯組織が新鮮なうちに回収され、凍結保存されている。しかしながら、通常、臍帯組織の摘出後すぐ（例えば２４時間以内）に処理を行う必要があり、臨床現場においては困難であった。また、臍帯組織から必要な細胞集団の分離を行っても、必ずしも目的とする細胞が効率良く分取できるとは限らない。さらに、目的とする細胞も将来的に変わる可能性がある。その上、臍帯組織から細胞を分離後に培養して凍結するための培養液等の費用が高い。通常、生きた細胞を凍結保存するためには、５〜１０％ＤＭＳＯ溶液またはグリセロール溶液に入れて素早く凍結を開始する。出産後に臍帯組織から間葉系幹細胞を分離培養して得るためには最低でも２週間程度はかかり、設備、費用および技術的スタッフも必要である。 Such umbilical cord tissue-derived cells are collected while the umbilical cord tissue is fresh and are stored frozen. However, it is usually necessary to perform the treatment immediately after the umbilical cord tissue is removed (for example, within 24 hours), which is difficult in clinical practice. Moreover, even if the necessary cell population is separated from the umbilical cord tissue, the target cells cannot always be efficiently collected. Furthermore, the target cells may change in the future. In addition, the cost of a culture solution for culturing and freezing the cells after separating them from the umbilical cord tissue is high. Usually, in order to cryopreserve live cells, the cells are immediately placed in a 5-10% DMSO solution or glycerol solution to start freezing. It takes at least about two weeks to obtain mesenchymal stem cells by separating and culturing them from the umbilical cord tissue after giving birth, and equipment, cost and technical staff are required.
そこで、臍帯組織ごと凍結できれば、将来目的とする細胞をその時点で解凍・分離できる可能性がある。臍帯組織は出産時の産物であり、これまで医療廃棄物として廃棄されることが多かったが、これを保存することによって、将来自他の医療または研究用として利用できる可能性がある。また、現在分取できない未知の細胞も分離できる可能性もある。 Therefore, if the whole umbilical cord tissue can be frozen, the cells of interest may be thawed and separated at that point in time. Umbilical cord tissue was a product of childbirth and was often disposed of as medical waste until now. However, by storing it, it may be possible to use it for own medical treatment or research in the future. Moreover, there is a possibility that unknown cells that cannot be sorted at present can be separated.
臍帯組織を凍結保存する技術として、特許文献１および２には、「生存可能な細胞を含んでなる臍帯組織を、血清を含有する細胞培養培地および低温保存剤を含んでなる低温保存溶液と組み合わせ、次いでこの組み合わせ物を、低温保存剤が組織に浸透できる期間および温度で、液体として組み合わせ物が冷蔵される冷却工程に供し、冷却した組み合わせ物を凍結し、そして次に場合により凍結した組み合わせ物を極低温条件下に保存する工程を含んでなる、臍帯組織に存在する細胞の生存能を保存する方法」が記載されている。 As a technique for cryopreserving umbilical cord tissue, Patent Documents 1 and 2 describe "Combination of umbilical cord tissue containing viable cells with a cryopreservation solution containing a cell culture medium containing serum and a cryopreservative. , Then subjecting the combination to a cooling step in which the combination is refrigerated as a liquid for a period and at a temperature that allows the cryopreservative to penetrate the tissue, freezing the cooled combination and then optionally the frozen combination. Is stored under cryogenic conditions for preserving the viability of cells present in umbilical cord tissue".
臍帯組織の凍結保存において、解凍後に回収される生細胞数を向上させることが望まれる。 In the cryopreservation of umbilical cord tissue, it is desired to improve the number of viable cells recovered after thawing.
本発明は、解凍後に回収される生細胞数が良好な、臍帯組織の凍結保存方法を提供することを主な目的とする。 The main object of the present invention is to provide a method for cryopreserving umbilical cord tissue in which the number of living cells recovered after thawing is good.
本願発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、凍害防御剤およびグルコースを含む溶液に、臍帯組織を浸漬して凍結を行うことにより、解凍後に良好な数の生細胞を回収できることを見出し、本発明を完成させるに至った。 The inventors of the present invention, as a result of intensive research to solve the above problems, by immersing the umbilical cord tissue in a solution containing a cryoprotective agent and glucose to perform freezing, a good number of living cells after thawing The inventors have found that the above can be recovered and have completed the present invention.
すなわち、本発明に係る凍結保存方法は、臍帯組織を凍結保存する方法であって、凍害防御剤およびグルコースを含む凍結保存用溶液に、生細胞を含む臍帯組織を浸漬する浸漬工程と、上記臍帯組織を、上記凍結保存用溶液に浸漬した状態で凍結する凍結工程と、を含む。 That is, the cryopreservation method according to the present invention is a method for cryopreserving umbilical cord tissue, which is a immersing step of immersing umbilical cord tissue containing live cells in a cryopreservation solution containing a cryoprotective agent and glucose, And a freezing step of freezing the tissue while being immersed in the solution for cryopreservation.
本発明に係る凍結保存方法において、上記凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。 In the cryopreservation method according to the present invention, it is preferable that the cryopreservation solution does not contain a natural animal-derived component.
本発明に係る凍結保存方法において、上記凍結保存用溶液は、増粘剤、凍害防御剤およびグルコースを含み、かつ天然の動物由来成分を含まない水溶液であることがより好ましい。 In the cryopreservation method according to the present invention, it is more preferable that the cryopreservation solution is an aqueous solution containing a thickener, a frost damage protector and glucose and containing no natural animal-derived component.
本発明に係る凍結保存方法において、上記凍結保存用溶液は、カルボキシメチルセルロースナトリウムを０．１〜１．０ｗ／ｖ％含み、ジメチルスルホキシドを１．０〜１５．０ｗ／ｖ％含み、グルコースを０．５〜１０．０ｗ／ｖ％含み、かつ天然の動物由来成分を含まない水溶液であることがさらに好ましい。 In the cryopreservation method according to the present invention, the cryopreservation solution contains 0.1 to 1.0 w/v% of sodium carboxymethyl cellulose, 1.0 to 15.0 w/v% of dimethyl sulfoxide, and 0 glucose. An aqueous solution containing 0.5 to 10.0 w/v% and containing no natural animal-derived component is more preferable.
本発明に係る凍結保存方法において、上記浸漬工程では、１〜６時間、上記凍結保存用溶液に上記臍帯組織を浸漬することが好ましい。 In the cryopreservation method according to the present invention, it is preferable that the umbilical cord tissue is immersed in the cryopreservation solution for 1 to 6 hours in the immersion step.
本発明に係る凍結保存方法において、上記臍帯組織は、ヒトの臍帯組織であってもよい。 In the cryopreservation method according to the present invention, the umbilical cord tissue may be human umbilical cord tissue.
本発明に係る回収方法は、凍結保存されている臍帯組織から生細胞を回収する方法であって、上記の凍結保存方法を用いて凍結保存されている臍帯組織を解凍する解凍工程と、解凍した臍帯組織から生細胞を回収する細胞回収工程と、を含む。 The recovery method according to the present invention is a method for recovering living cells from cryopreserved umbilical cord tissue, which comprises a thawing step of thawing the cryopreserved umbilical cord tissue using the above cryopreservation method, and thawing. A cell recovery step of recovering viable cells from the umbilical cord tissue.
本発明に係る回収方法において、上記生細胞は、間葉系幹細胞であってもよい。 In the recovery method according to the present invention, the living cells may be mesenchymal stem cells.
本発明に係る回収方法において、上記解凍工程では１０〜４０℃の温度で上記臍帯組織を解凍することが好ましい。 In the recovery method according to the present invention, it is preferable that the umbilical cord tissue is thawed at a temperature of 10 to 40°C in the thawing step.
本発明に係る回収方法は、上記細胞回収工程の前に、上記解凍した臍帯組織に付着している上記凍結保存用溶液を除去する洗浄工程を含むことが好ましい。 The recovery method according to the present invention preferably includes a washing step for removing the cryopreservation solution adhering to the thawed umbilical cord tissue before the cell recovery step.
本発明に係る回収方法は、上記細胞回収工程の前に、エクスプラント法による細胞培養を行う培養工程を含んでいてもよい。 The recovery method according to the present invention may include a culture step of performing cell culture by the explant method before the cell recovery step.
本発明に係る作製方法は、解凍後に生細胞を回収可能な、臍帯組織の凍結物を作製する方法であって、凍害防御剤およびグルコースを含む凍結保存用溶液に、生細胞を含む臍帯組織を浸漬する浸漬工程と、上記臍帯組織を、上記凍結保存用溶液に浸漬した状態で凍結する凍結工程と、を含む。 The production method according to the present invention is a method for producing a frozen product of umbilical cord tissue in which live cells can be collected after thawing, and a cryopreservation solution containing a cryoprotective agent and glucose is used to prepare umbilical cord tissue containing live cells. A dipping step of dipping and a freezing step of freezing the umbilical cord tissue in a state of being dipped in the cryopreservation solution are included.
本発明はまた、上記作製方法を用いて作製された、臍帯組織の凍結物を提供する。 The present invention also provides a umbilical cord tissue frozen product produced using the above-described production method.
本発明に係る臍帯組織の凍結保存用溶液は、凍害防御剤およびグルコースを含む。 The umbilical cord tissue cryopreservation solution according to the present invention contains a cryoprotective agent and glucose.
本発明に係る凍結保存用キットは、臍帯組織を凍結保存するためのキットであって、上記臍帯組織の凍結保存用溶液と、凍結保存用溶液および臍帯組織を格納可能な耐寒性の容器と、を備える。 A cryopreservation kit according to the present invention is a kit for cryopreserving umbilical cord tissue, a cryopreservation solution of the umbilical cord tissue, a cold-resistant container capable of storing the cryopreservation solution and umbilical cord tissue, Equipped with.
本発明はまた、上記回収方法を用いて回収された生細胞またはそれを継代培養した細胞を、所望の細胞に分化させる、分化方法を提供する。 The present invention also provides a differentiation method for differentiating a living cell or a subcultured cell thereof, which has been collected by the above-mentioned collection method, into a desired cell.
本発明の臍帯組織の凍結保存方法を用いれば、解凍後に良好な数の生細胞を回収することができる。 By using the umbilical cord tissue cryopreservation method of the present invention, a good number of viable cells can be recovered after thawing.
〔臍帯組織の凍結保存方法〕
本発明に係る臍帯組織の凍結保存方法は、凍害防御剤およびグルコースを含む凍結保存用溶液に、生細胞を含む臍帯組織を浸漬する浸漬工程と、当該臍帯組織を、当該凍結保存用溶液に浸漬した状態で凍結する凍結工程と、を含んでいる。
[Umbilical cord tissue cryopreservation method]
A method for cryopreserving umbilical cord tissue according to the present invention comprises a step of immersing umbilical cord tissue containing live cells in a cryopreservation solution containing a cryoprotective agent and glucose, and immersing the umbilical cord tissue in the cryopreservation solution. And a freezing step of freezing in a frozen state.
本発明に係る凍結保存方法に適用できる臍帯組織の由来は特に限定されず、有胎盤類の哺乳動物全般の臍帯組織を保存することができる。有胎盤類の哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヒトを除く霊長類等の実験動物；イヌ、ネコ等の愛玩動物（ペット）；ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等の家畜；ヒト；が挙げられる。本発明に係る凍結保存方法は、ヒトの臍帯組織に効果的に適用することが可能である。 The origin of the umbilical cord tissue applicable to the cryopreservation method according to the present invention is not particularly limited, and the umbilical cord tissue of all placental mammals can be preserved. Examples of placental mammals include experimental animals such as mice, rats, rabbits, guinea pigs and primates other than humans; pets such as dogs and cats (pets); domestic animals such as cows, horses, pigs and sheep; humans ; Are mentioned. The cryopreservation method according to the present invention can be effectively applied to human umbilical cord tissue.
また、臍帯組織は、組織全体であってもよいし、断片であってもよい。臍帯組織を断片化して別々に凍結保存すれば、必要な分だけその都度解凍して用いることができ、試薬等のコストを削減することができるため好ましい。断片化する場合、例えば、０．５〜５．０ｇに分ければよい。 The umbilical cord tissue may be the whole tissue or a fragment. If the umbilical cord tissue is fragmented and separately frozen and stored, it can be thawed and used as needed each time, and the cost of reagents and the like can be reduced, which is preferable. In the case of fragmentation, it may be divided into, for example, 0.5 to 5.0 g.
凍結保存用溶液に含まれる凍害防御剤は、臍帯組織を十分に保存できる凍結保存用溶液を構成し得るものであれば、特に限定されない。凍害防御剤としては、例えば、ジメチルスルホキシド（以下ＤＭＳＯとする）、グリセロール、プロピレングリコール、および１−メチル−２−ピロリドン等が挙げられる。凍害防御剤としては、ＤＭＳＯおよびプロピレングリコールが好ましく、ＤＭＳＯが特に好ましい。凍害防御剤は凍結保存用溶液中に１．０〜１５．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、５．０〜１５．０ｗ／ｖ％含まれることがより好ましく、５．０〜１２．０ｗ／ｖ％含まれることがさらに好ましく、８．０〜１１．０ｗ／ｖ％含まれることが特に好ましい。 The cryoprotective agent contained in the cryopreservation solution is not particularly limited as long as it can constitute a cryopreservation solution that can sufficiently preserve umbilical cord tissue. Examples of the frost damage protector include dimethyl sulfoxide (hereinafter referred to as DMSO), glycerol, propylene glycol, 1-methyl-2-pyrrolidone, and the like. As the anti-frost damage agent, DMSO and propylene glycol are preferable, and DMSO is particularly preferable. The cryoprotective agent is preferably contained in the cryopreservation solution in an amount of 1.0 to 15.0 w/v%, more preferably 5.0 to 15.0 w/v%, and further preferably 5.0 to 12.0 w. /V% is more preferable, and it is particularly preferable that the content is 8.0 to 11.0 w/v%.
凍結保存用溶液に含まれるグルコースは、凍結保存用溶液中に０．５〜１０．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、１．０〜１０．０ｗ／ｖ％含まれることがより好ましく、２．０〜８．０ｗ／ｖ％含まれることがさらに好ましく、２．０〜５．０ｗ／ｖ％含まれることが特に好ましい。 Glucose contained in the cryopreservation solution is preferably contained in the cryopreservation solution in an amount of 0.5 to 10.0 w/v%, more preferably 1.0 to 10.0 w/v%, and more preferably 2 to 2. It is more preferable that the content is 0.0 to 8.0 w/v%, and it is particularly preferable that the content is 2.0 to 5.0 w/v%.
凍結保存用溶液は、さらに、他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、例えば、ｐＨ調製剤、および増粘剤等が挙げられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、およびリン酸緩衝液等が挙げられる。また、Basic Stock Solution（ＢＳＳ）にリン酸緩衝液を添加しない場合には、臍帯組織に適したｐＨ付近で緩衝能を持たせる働きを有する塩化ナトリウムを添加したものも用いることもできる。このうちリン酸緩衝液を用いることが特に好ましい。ｐＨ調整剤は凍結保存用溶液中のｐＨをおよそ６．５〜９．０、好ましくは７．０〜８．５に調整するために適宜用いることが好ましい。なお、本発明におけるリン酸緩衝液とは、塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、リン酸一カリウム（無水）、リン酸二ナトリウム（無水）、リン酸三ナトリウム（無水）、塩化カリウム、およびリン酸二水素カリウム（無水）等のことをいい、特に塩化ナトリウム、リン酸一ナトリウム（無水）、塩化カリウム、またはリン酸二水素カリウム（無水）を用いることが好ましい。ｐＨ調整剤は凍結保存用溶液中に０．０１〜１．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、０．０５〜０．５ｗ／ｖ％含まれることがより好ましい。 The cryopreservation solution may further contain other components. Examples of other components include a pH adjuster and a thickener. Examples of the pH adjusting agent include sodium hydrogen carbonate, HEPES, phosphate buffer, and the like. When the phosphate buffer solution is not added to the Basic Stock Solution (BSS), it is also possible to use a solution to which sodium chloride having a function of providing a buffering function near a pH suitable for the umbilical cord tissue is added. Of these, it is particularly preferable to use a phosphate buffer. The pH adjuster is preferably used as appropriate to adjust the pH of the cryopreservation solution to about 6.5 to 9.0, preferably 7.0 to 8.5. The phosphate buffer in the present invention means sodium chloride, monosodium phosphate (anhydrous), monopotassium phosphate (anhydrous), disodium phosphate (anhydrous), trisodium phosphate (anhydrous), potassium chloride, And potassium dihydrogen phosphate (anhydrous) and the like, and it is particularly preferable to use sodium chloride, monosodium phosphate (anhydrous), potassium chloride, or potassium dihydrogen phosphate (anhydrous). The pH adjusting agent is preferably contained in the cryopreservation solution in an amount of 0.01 to 1.0 w/v%, more preferably 0.05 to 0.5 w/v%.
凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。天然の動物由来成分としては、例えば、血清および基礎培地等が挙げられる。血清としては成牛血清、仔牛血清、新生仔牛血清、および牛胎児血清等が挙げられる。基礎培地としては、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ＨａｍＦ−１２培地、およびＤＭ−１６０培地等が挙げられる。凍結保存用溶液は、天然の動物由来成分を含まないことが好ましい。天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液では、天然の動物由来成分のロット間での品質の違いの問題を生じることがない上、血清に含まれる各種サイトカイン、増殖因子およびホルモン等の本来細胞保存に不必要な成分による臍帯組織中の細胞の性質の変化の虞を回避でき、さらに、基礎培地に含まれる由来が不明な成分による影響も回避できる。そのため、天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液は、特に臨床使用において非常に有用である。 The cryopreservation solution may or may not contain natural animal-derived components. Examples of natural animal-derived components include serum and basal medium. Examples of the serum include adult bovine serum, calf serum, newborn calf serum, fetal bovine serum and the like. Examples of the basal medium include RPMI medium, MEM medium, HamF-12 medium, DM-160 medium and the like. The cryopreservation solution preferably does not contain natural animal-derived components. Cryopreservation solutions that do not contain natural animal-derived components do not cause the problem of quality differences between lots of natural animal-derived components, and also naturally contain various cytokines, growth factors and hormones contained in serum. It is possible to avoid the risk of changes in the properties of cells in the umbilical cord tissue due to components unnecessary for cell preservation, and to avoid the effects of components of unknown origin contained in the basal medium. Therefore, the cryopreservation solution containing no natural animal-derived component is very useful especially in clinical use.
凍結保存用溶液は、さらに、増粘剤を含んでいてもよい。増粘剤は、臍帯組織を十分に保存できる凍結保存用溶液を構成し得るものであれば、特に限定されない。増粘剤としては、例えば、カルボキシメチルセルロース（以下ＣＭＣとする）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（以下ＣＭＣ−Ｎａとする）、有機酸ポリマー、アルギン酸プロピレングリコール、およびアルギン酸ナトリウム等が挙げられる。増粘剤としては、ＣＭＣおよびＣＭＣ−Ｎａが好ましく、ＣＭＣ−Ｎａが特に好ましい。また、有機酸ポリマーのうちではポリアクリル酸ナトリウムが好ましい。増粘剤は凍結保存用溶液中に０．１〜１．０ｗ／ｖ％含まれることが好ましく、０．１〜０．５ｗ／ｖ％含まれることがより好ましく、０．２〜０．４ｗ／ｖ％含まれることがさらに好ましい。 The cryopreservation solution may further contain a thickening agent. The thickener is not particularly limited as long as it can form a cryopreservation solution that can sufficiently preserve umbilical cord tissue. Examples of the thickener include carboxymethyl cellulose (hereinafter referred to as CMC), sodium carboxymethyl cellulose (hereinafter referred to as CMC-Na), organic acid polymer, propylene glycol alginate, and sodium alginate. As the thickener, CMC and CMC-Na are preferable, and CMC-Na is particularly preferable. Further, among the organic acid polymers, sodium polyacrylate is preferable. The thickening agent is preferably contained in the cryopreservation solution in an amount of 0.1 to 1.0 w/v%, more preferably 0.1 to 0.5 w/v%, and 0.2 to 0.4 w. It is more preferable that the content is included in /v%.
凍結保存用溶液は、水溶液であることが好ましい。凍結保存用溶液の浸透圧は、保存液としての性能を保持するために、１０００ｍＯｓｍ以上であることが好ましく、１０００〜２７００ｍＯｓｍであることがより好ましい。 The cryopreservation solution is preferably an aqueous solution. The osmotic pressure of the cryopreservation solution is preferably 1000 mOsm or more, and more preferably 1000 to 2700 mOsm, in order to maintain the performance as a preservation solution.
なお、凍結保存用溶液の組成は、細胞を十分に保存できる組成であれば上記で列挙した各成分の具体例のうちいずれの成分の組み合わせも用いることができる。また、濃度についてもそれぞれ選択して組み合わせることができる。 The composition of the cryopreservation solution may be a combination of any of the specific examples of the above-listed components, as long as the composition can sufficiently preserve the cells. Further, the respective concentrations can be selected and combined.
凍結保存用溶液は、好ましい一例において、増粘剤、凍害防御剤、およびグルコースを含み、かつ天然の動物由来成分を含まない水溶液である。凍結保存用溶液は、より好ましい一例において、ＣＭＣ−Ｎａ、ＤＭＳＯ、およびグルコースを含み、かつ天然の動物由来成分を含まない水溶液である。凍結保存用溶液は、さらに好ましい一例において、ＣＭＣ−Ｎａを０．１〜１．０ｗ／ｖ％含み、ＤＭＳＯを１．０〜１５．０ｗ／ｖ％含み、グルコースを０．５〜１０．０ｗ／ｖ％含み、かつ天然の動物由来成分を含まない水溶液である。凍結保存用溶液は、よりさらに好ましい一例において、ＣＭＣ−Ｎａを０．２〜０．３ｗ／ｖ％含み、ＤＭＳＯを１０．０ｗ／ｖ％含み、グルコースを２．０〜４．０ｗ／ｖ％含み、かつ天然の動物由来成分を含まない水溶液である。 The cryopreservation solution is, in a preferred example, an aqueous solution containing a thickener, a cryoprotective agent, and glucose and containing no natural animal-derived component. In a more preferable example, the cryopreservation solution is an aqueous solution containing CMC-Na, DMSO, and glucose and containing no natural animal-derived component. In a further preferable example, the cryopreservation solution contains CMC-Na in an amount of 0.1 to 1.0 w/v%, DMSO in an amount of 1.0 to 15.0 w/v%, and glucose in an amount of 0.5 to 10.0 w. /V% and no natural animal-derived components. The cryopreservation solution contains CMC-Na in an amount of 0.2 to 0.3 w/v%, DMSO in an amount of 10.0 w/v%, and glucose in an amount of 2.0 to 4.0 w/v%. It is an aqueous solution that contains no natural animal-derived components.
浸漬工程では、生細胞を含む臍帯組織を凍結保存用溶液に浸漬する。浸漬する臍帯組織は、母体から採取されてからの時間が短いほど、生細胞の数が多いため、好ましい。例えば、母体から採取されてから４８時間以内のものを用いることが好ましく、３６時間以内のものを用いることがより好ましく、２４時間以内のものを用いることがさらに好ましい。臍帯組織は、出産後の母体から採取された胎盤・臍帯から、臍帯血を採血後に胎盤から切離して得ることができる。 In the dipping step, the umbilical cord tissue containing live cells is dipped in a cryopreservation solution. It is preferable that the umbilical cord tissue to be immersed has a large number of viable cells as the time after being collected from the mother is short. For example, it is preferably used within 48 hours after being collected from the mother, more preferably within 36 hours, even more preferably within 24 hours. The umbilical cord tissue can be obtained by removing the cord blood from the placenta/umbilical cord collected from the mother after delivery and then separating from the placenta.
浸漬工程における温度は特に限定されないが、酵素活性を低く抑え、細菌感染を防止する観点から０℃〜１５℃の範囲内であることが好ましく、１℃〜７℃の範囲内であることがより好ましい。浸漬時間は特に限定されないが、１時間以上であることが好ましく、細胞のエピジェネティクスへの影響を低減する観点からは１８時間以下であることが好ましく、６時間以下であることがより好ましい。浸漬工程における圧力は特に限定されず、例えば、常圧で行えばよい。 The temperature in the dipping step is not particularly limited, but it is preferably within the range of 0°C to 15°C, more preferably within the range of 1°C to 7°C from the viewpoint of suppressing enzyme activity and preventing bacterial infection. preferable. The immersion time is not particularly limited, but is preferably 1 hour or more, and is preferably 18 hours or less, and more preferably 6 hours or less from the viewpoint of reducing the influence on the epigenetics of cells. The pressure in the dipping step is not particularly limited, and may be normal pressure, for example.
浸漬工程において、凍結保存用溶液および臍帯組織を入れる容器は、特に限定されないが、例えば、耐寒性の容器内で浸漬工程を行い、容器ごと凍結工程に供すれば、手間が省けるため好ましい。耐寒性の程度は、臍帯組織を保存する温度に耐え得るものであれば特に限定されないが、例えば、−８０℃に耐え得る材料であることが好ましく、−２００℃に耐え得る材料であることが好ましい。耐寒性の容器としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネイト、およびフッ化エチレンプロピレン等の合成樹脂製の容器が挙げられ、容器の形態としては、バッグおよびチューブ等が挙げられる。容器は、凍結保存用溶液および臍帯組織を入れた後に密封できるものが好ましく、また内部が滅菌されていることが好ましい。 In the dipping step, the container for storing the cryopreservation solution and the umbilical cord tissue is not particularly limited, but for example, it is preferable to perform the dipping step in a cold-resistant container and subject the whole container to the freezing step because it saves labor. The degree of cold resistance is not particularly limited as long as it can withstand the temperature at which umbilical cord tissue is stored, but, for example, a material that can withstand -80°C is preferable, and a material that can withstand -200°C is preferable. preferable. Examples of the cold-resistant container include containers made of synthetic resin such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, and fluorinated ethylene propylene, and examples of the container form include bags and tubes. The container is preferably one that can be sealed after the cryopreservation solution and the umbilical cord tissue are put therein, and the inside is preferably sterilized.
凍結工程では、臍帯組織を、凍結保存用溶液に浸漬した状態で凍結する。最終的な凍結温度は特に限定されないが、好ましくは−８０℃以下、より好ましくは−１５０℃以下、さらに好ましくは−１９６．５℃以下である。冷却速度は特に限定されないが、緩速で冷却することが好ましい。緩速で冷却する場合、例えば、バイセル等を用いればよい。例えば、−８０℃付近で保存したい場合、０．５時間以上で５時間以下の時間をかけて当該温度まで冷却することが好ましい。また、−８０℃付近で保存した臍帯組織を−１８０℃〜−２００℃（例えば、液体窒素中）に移して保存してもよい。臍帯組織を耐寒性の容器に入れて凍結することが好ましい。 In the freezing step, the umbilical cord tissue is frozen while immersed in the cryopreservation solution. The final freezing temperature is not particularly limited, but is preferably −80° C. or lower, more preferably −150° C. or lower, further preferably −196.5° C. or lower. The cooling rate is not particularly limited, but slow cooling is preferable. When cooling at a slow speed, for example, a bicell may be used. For example, when it is desired to store at around −80° C., it is preferable to cool it to the temperature over 0.5 hours to 5 hours. Further, the umbilical cord tissue stored at around -80°C may be transferred to and stored at -180°C to -200°C (for example, in liquid nitrogen). It is preferred that the umbilical cord tissue is placed in a cold-resistant container and frozen.
本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯組織は、解凍後に良好な数の生細胞を回収することができる（後述の実施例を参照）。生細胞の回収は、例えば、後述の〔凍結保存組織からの生細胞の回収方法〕に従って行うことができる。本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯組織は、例えば、２週間経過後において、凍結していない臍帯組織から回収される生細胞数の、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％以上の数の生細胞を回収することができる。また、本発明に係る凍結保存方法を用いて凍結保存された臍帯組織は、１ヶ月経過後、３ヶ月経過後、６ヶ月経過後、１年経過後、３年経過後、５年経過後、もしくは１０年経過後において、またはそれ以上経過後において（半永久的に）、凍結していない臍帯組織から回収される生細胞数の、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％以上の数の生細胞を回収し得る。 The umbilical cord tissue cryopreserved using the cryopreservation method according to the present invention can recover a good number of viable cells after thawing (see Examples below). Collection of live cells can be performed, for example, according to [Method for collecting live cells from cryopreserved tissue] described below. The umbilical cord tissue cryopreserved using the cryopreservation method according to the present invention has, for example, 80% or more, preferably 90% or more of the number of viable cells recovered from unfrozen umbilical cord tissue after 2 weeks. , More preferably 95% or more, and even more preferably 100% or more of viable cells can be recovered. In addition, the umbilical cord tissue cryopreserved using the cryopreservation method according to the present invention, after 1 month, 3 months, 6 months, 1 year, 3 years, 5 years, Alternatively, after 10 years or more (more or less permanently), 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more of the number of viable cells recovered from unfrozen umbilical cord tissue. More preferably, 100% or more of viable cells can be recovered.
したがって、本発明に係る凍結保存方法を用いて臍帯組織を凍結保存しておけば、将来自他の医療の際に、解凍して用いることができる。また、現在の技術では分取されていない可能性のある未知の細胞が将来的に単離可能になった際に、有効に用いることができる。例えば、現在治療法がない疾患であっても、将来的に治療法が開発された際に、凍結保存しておいた臍帯組織を利用することが可能となる。また、先天性遺伝子疾患等においては、遺伝子治療用の自家細胞ソースとして利用することもできる。本発明に係る凍結保存方法は、他の組織の凍結保存に応用され得る。 Therefore, if the umbilical cord tissue is cryopreserved using the cryopreservation method according to the present invention, it can be thawed and used in future medical treatments. Further, it can be effectively used when an unknown cell which may not be fractionated by the current technique can be isolated in the future. For example, even for a disease for which there is currently no cure, it is possible to use the umbilical cord tissue that has been cryopreserved when a cure is developed in the future. Further, in congenital genetic diseases and the like, it can also be used as an autologous cell source for gene therapy. The cryopreservation method according to the present invention can be applied to the cryopreservation of other tissues.
〔凍結保存組織からの生細胞の回収方法〕
本発明に係る凍結保存組織からの生細胞の回収方法は、上述の凍結保存方法を用いて凍結保存されている組織を解凍する解凍工程と、解凍した組織から生細胞を回収する細胞回収工程と、を含んでいる。
[Method for recovering live cells from cryopreserved tissue]
The method for recovering live cells from the cryopreserved tissue according to the present invention comprises a thawing step of thawing the tissue cryopreserved using the above cryopreservation method, and a cell recovery step of recovering the live cells from the thawed tissue. , Is included.
解凍工程における温度は特に限定されないが、１０〜４０℃であることが好ましく、３０．０〜４０．０℃であることがより好ましい。解凍は急速に行うことが好ましく、例えば、３７〜３８℃のウォーターバスを用いて解凍すればよい。凍結工程において臍帯組織を格納した容器から臍帯組織を取り出して解凍工程に供してもよいが、好ましく容器ごと解凍工程に供する。 The temperature in the thawing step is not particularly limited, but is preferably 10 to 40°C, more preferably 30.0 to 40.0°C. It is preferable to perform thawing rapidly, and for example, thawing may be performed using a water bath at 37 to 38°C. The umbilical cord tissue may be taken out from the container storing the umbilical cord tissue in the freezing step and subjected to the thawing step, but preferably the whole container is subjected to the thawing step.
本発明に係る凍結保存組織からの生細胞の回収方法は、細胞回収工程の前に、解凍した組織に付着している凍結保存用溶液を除去する洗浄工程を含んでいることが好ましい。洗浄工程で用いる液体はその後の処理内容および細胞の使用用途に応じて適宜選択すればよく、例えば、培養培地、生理食塩水、またはPhosphate Buffered Saline（ＰＢＳ）等を用いて洗浄すればよい。洗浄工程は、解凍工程後すぐに行うことが好ましい。 The method for recovering live cells from a cryopreserved tissue according to the present invention preferably includes a washing step for removing the cryopreservation solution attached to the thawed tissue before the cell recovery step. The liquid used in the washing step may be appropriately selected according to the contents of the subsequent treatment and the intended use of the cells. For example, a culture medium, physiological saline, Phosphate Buffered Saline (PBS) or the like may be used for washing. The washing step is preferably performed immediately after the thawing step.
細胞回収工程では、解凍した臍帯組織から生細胞を回収する。細胞を回収する方法は特に限定されない。例えば、臍帯組織から細胞を回収するための公知の方法を用いることができる。その一例として、エクスプラント法による細胞培養を行う方法が挙げられる。エクスプラント法による細胞培養では、臍帯組織を細切し、細胞培養用ディッシュに組織片を張り付けて９〜２１日程度培養を行う。その後、トリプシンで細胞を組織片ごと剥離してメッシュ（セルストレーナー等も用いればよい）を用いて組織片を除いてから、細胞のみを回収する。したがって、本発明に係る回収方法の一実施形態では、細胞回収工程の前に、エクスプラント法による細胞培養を行う培養工程を含んでいる。その他、コラゲナーゼ等の酵素を用いて細切した組織片を分離して細胞を得る方法も挙げられる。培養工程の前に洗浄工程を行うことが好ましい。また、上述のように本発明に係る凍結保存方法は半永久的に良好な状態で保存し得るため、将来的に開発される細胞回収方法に供され得る。 In the cell recovery step, live cells are recovered from the thawed umbilical cord tissue. The method of collecting cells is not particularly limited. For example, known methods for collecting cells from umbilical cord tissue can be used. One example thereof is a method of culturing cells by the explant method. In the cell culture by the explant method, the umbilical cord tissue is cut into small pieces, a tissue piece is attached to a cell culture dish, and the culture is performed for about 9 to 21 days. After that, the cells are separated together with the tissue pieces with trypsin, the tissue pieces are removed using a mesh (a cell strainer or the like may be used), and then only the cells are collected. Therefore, an embodiment of the recovery method according to the present invention includes a culture step of performing cell culture by the explant method before the cell recovery step. In addition, a method for obtaining cells by separating finely sliced tissue pieces using an enzyme such as collagenase can also be mentioned. It is preferable to perform a washing step before the culturing step. Further, as described above, the cryopreservation method according to the present invention can be semipermanently preserved in a good state, and thus can be used for a cell recovery method to be developed in the future.
本発明に係る回収方法によって回収される生細胞は特に限定されず、例えば、間葉系幹細胞、血管構成細胞、および間質細胞等が挙げられる。回収される生細胞は、好ましくは幹細胞または前駆細胞であり、より好ましくは間葉系幹細胞である。あるいは、現在では分離できていない未知の細胞であり得る。なお、回収される生細胞は、臍帯組織に含まれるオリジナルの細胞に限らず、培養工程において増殖した細胞（すなわち、オリジナルの細胞のコピー）であってもよい。回収された生細胞は、医療または研究等に用いることができる。 Live cells recovered by the recovery method according to the present invention are not particularly limited, and examples thereof include mesenchymal stem cells, blood vessel-constituting cells, and stromal cells. The living cells to be recovered are preferably stem cells or progenitor cells, more preferably mesenchymal stem cells. Alternatively, it may be an unknown cell that cannot be separated at present. The living cells to be collected are not limited to the original cells contained in the umbilical cord tissue, but may be cells that have proliferated in the culturing process (that is, copies of the original cells). The collected living cells can be used for medical treatment or research.
本発明に係る凍結保存方法および回収方法を用いれば、幹細胞または前駆細胞のような分化の程度が低い細胞をその状態で回収し得る（後述の実施例を参照）。そのため、本発明はまた、本発明の回収方法を用いて回収された生細胞またはそれを継代培養した細胞を、所望の細胞に分化させる分化方法を提供する。継代培養および所望の細胞への分化方法は、例えば、公知の方法に従えばよい。 By using the cryopreservation method and the recovery method according to the present invention, cells with a low degree of differentiation such as stem cells or progenitor cells can be recovered in that state (see Examples below). Therefore, the present invention also provides a differentiation method for differentiating a living cell recovered by the recovery method of the present invention or a subcultured cell thereof into a desired cell. The subculture and the method of differentiating into desired cells may be performed according to known methods.
〔臍帯組織の凍結物の作製方法および臍帯組織の凍結物〕
本発明に係る臍帯組織の凍結物の作製方法は、解凍後に生細胞を回収可能な、臍帯組織の凍結物を作製する方法であって、凍害防御剤およびグルコースを含む凍結保存用溶液に、生細胞を含む臍帯組織を浸漬する浸漬工程と、当該臍帯組織を、当該凍結保存用溶液に浸漬した状態で凍結する凍結工程と、を含んでいる。
[Method for producing frozen material of umbilical cord tissue and frozen material of umbilical cord tissue]
The method for producing a frozen product of umbilical cord tissue according to the present invention is a method for producing a frozen product of umbilical cord tissue in which live cells can be recovered after thawing, and a frozen preservation solution containing a cryoprotective agent and glucose The method includes an immersion step of immersing the umbilical cord tissue containing cells, and a freezing step of freezing the umbilical cord tissue in the state of being immersed in the cryopreservation solution.
浸漬工程および凍結工程の説明は、上述の〔臍帯組織の凍結保存方法〕におけるものと同じである。 The description of the dipping step and the freezing step is the same as that in the above-mentioned [Method for cryopreserving umbilical cord tissue].
本発明に係る作製方法によって作製された臍帯組織の凍結物は、解凍後に良好な数の生細胞を回収することができ（後述の実施例を参照）、例えば、２週間経過後において、凍結していない臍帯組織から回収される生細胞数の、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％以上の数の生細胞を回収することができる。また、本発明に係る作製方法によって作製された臍帯組織の凍結物は、１ヶ月経過後、３ヶ月経過後、６ヶ月経過後、１年経過後、３年経過後、５年経過後、もしくは１０年経過後において、またはそれ以上経過後において（半永久的に）、凍結していない臍帯組織から回収される生細胞数の、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは１００％以上の数の生細胞を回収し得る。 The frozen product of the umbilical cord tissue produced by the production method according to the present invention can recover a good number of viable cells after thawing (see Examples described later). For example, it is frozen after 2 weeks. 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 100% or more, of the number of viable cells recovered from untreated umbilical cord tissue can be recovered. In addition, the frozen material of the umbilical cord tissue produced by the production method according to the present invention has 1 month, 3 months, 6 months, 1 year, 3 years, 5 years, or 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more of the number of viable cells recovered from unfrozen umbilical cord tissue after 10 years or more (semipermanently). More preferably, 100% or more viable cells can be recovered.
本発明に係る臍帯組織の凍結物は、上述の回収方法を用いて生細胞が回収されてもよい。回収された生細胞は、医療または研究等に用いることができる。 In the frozen material of the umbilical cord tissue according to the present invention, live cells may be collected by using the above-mentioned collection method. The collected living cells can be used for medical treatment or research.
〔臍帯組織の凍結保存用溶液〕
本発明に係る臍帯組織の凍結保存用溶液は、凍害防御剤およびグルコースを含んでいる。凍結保存用溶液の説明は、上述の〔臍帯組織の凍結保存方法〕におけるものと同じである。
[Umbilical cord tissue cryopreservation solution]
The umbilical cord tissue cryopreservation solution according to the present invention contains a cryoprotective agent and glucose. The description of the cryopreservation solution is the same as in the above [Cryogenic preservation method for umbilical cord tissue].
〔凍結保存用キット〕
本発明に係る臍帯組織を凍結保存するためのキットは、上述の臍帯組織の凍結保存用溶液と、凍結保存用溶液および臍帯組織を格納可能な耐寒性の容器と、を備える。
[Cryopreservation kit]
A kit for cryopreserving umbilical cord tissue according to the present invention comprises the above-mentioned cryopreservation solution for umbilical cord tissue, and a cold-resistant container capable of storing the cryopreservation solution and umbilical cord tissue.
本発明に係るキットは、上述の〔臍帯組織の凍結保存方法〕および〔臍帯組織の凍結物の作製方法〕に好適に用いられる。 The kit according to the present invention is preferably used in the above-mentioned [Method for cryopreserving umbilical cord tissue] and [Method for producing frozen product of umbilical cord tissue].
容器は、凍結保存用溶液および臍帯組織を格納可能であり、かつ耐寒性であれば、特に限定されない。容器の大きさは、格納する臍帯組織の大きさに応じて適宜選択すればよく、例えば、一辺が１ｃｍ〜１０ｃｍの箱型の容器であってもよいし、一辺が３ｃｍ〜１５ｃｍのバッグであってもよい。また、細胞および組織片の凍結保存時に通常使用される凍結チューブであってもよい。耐寒性の程度は、臍帯組織を保存する温度に耐え得るものであれば特に限定されないが、例えば、−８０℃に耐え得る材料であることが好ましく、−２００℃に耐え得る材料であることが好ましい。そのような容器としては、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネイト、およびフッ化エチレンプロピレン等の合成樹脂製の容器が挙げられる。 The container is not particularly limited as long as it can store the cryopreservation solution and the umbilical cord tissue and is cold resistant. The size of the container may be appropriately selected according to the size of the umbilical cord tissue to be stored, and may be, for example, a box-shaped container having a side of 1 cm to 10 cm, or a bag having a side of 3 cm to 15 cm. May be. It may also be a cryotube normally used for cryopreservation of cells and tissue pieces. The degree of cold resistance is not particularly limited as long as it can withstand the temperature at which umbilical cord tissue is stored, but, for example, a material that can withstand -80°C is preferable, and a material that can withstand -200°C is preferable. preferable. Examples of such a container include containers made of synthetic resin such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, and fluorinated ethylene propylene.
本発明に係るキットは、さらに、キットの使用説明書を備えていてもよい。キットの使用説明書には、上記〔臍帯組織の凍結保存方法〕の欄で説明した、本発明に係る凍結保存方法の内容、および／または上記〔臍帯組織の凍結物の作製方法〕の欄で説明した、本発明に係る作製方法の内容が記録されている。また、キットの使用説明書には、さらに、上記〔凍結保存組織からの生細胞の回収方法〕の欄で説明した、本発明に係る回収方法の内容が記録されていてもよい。 The kit according to the present invention may further include instructions for using the kit. In the instruction manual of the kit, the contents of the cryopreservation method according to the present invention described in the above section [Method for cryopreserving umbilical cord tissue], and/or the above description in the section [Method for producing frozen product of umbilical cord tissue] The contents of the manufacturing method according to the present invention described are recorded. Further, the instruction manual of the kit may further record the content of the recovery method according to the present invention described in the above section [Method for recovering live cells from cryopreserved tissue].
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。 Examples will be shown below to describe the embodiments of the present invention in more detail. Of course, the present invention is not limited to the following examples, and it goes without saying that various aspects are possible in details. Furthermore, the present invention is not limited to the above-described embodiments, and various modifications can be made within the scope of the claims, and the present invention is also applicable to embodiments obtained by appropriately combining the disclosed technical means. It is included in the technical scope of the invention. Further, all the documents described in the present specification are incorporated by reference.
〔凍結保存用溶液の用意〕
凍結保存用溶液Ａ：
ＣＭＣ−Ｎａを０．２〜０．３ｗ／ｖ％、ＤＭＳＯを１０．０ｗ／ｖ％、グルコースを２．０〜４．０ｗ／ｖ％、ｐＨ調整剤を適量含む、滅菌した水溶液を凍結保存用溶液Ａとして用意した。凍結保存用溶液Ａは、天然の動物由来成分を含んでいない。
[Preparation of cryopreservation solution]
Cryopreservation solution A:
Cryopreservation of a sterilized aqueous solution containing 0.2 to 0.3 w/v% of CMC-Na, 10.0 w/v% of DMSO, 2.0 to 4.0 w/v% of glucose, and an appropriate amount of a pH adjusting agent. Solution A was prepared. Cryopreservation solution A contains no natural animal-derived components.
凍結保存用溶液Ｂ：
ＣＭＣ−Ｎａを０．２〜０．３ｗ／ｖ％、ＦＢＳを３７．５ｗ／ｖ％、ＤＭＳＯを１０．０ｗ／ｖ％、グルコースを２．０〜４．０ｗ／ｖ％、ダルベッコＰＢＳ（−）粉末を０．１〜０．２ｗ／ｖ％、ｐＨ調整剤を適量含む、滅菌した水溶液を凍結保存用溶液Ｂとして用意した。
Cryopreservation solution B:
CMC-Na 0.2 to 0.3 w/v%, FBS 37.5 w/v%, DMSO 10.0 w/v%, glucose 2.0 to 4.0 w/v%, Dulbecco's PBS (- ) A sterilized aqueous solution containing 0.1 to 0.2 w/v% of powder and a proper amount of a pH adjuster was prepared as a solution B for cryopreservation.
凍結保存用溶液Ｃ：
ＤＭＳＯを１０．０ｗ／ｖ％、デキストラン（Dex40）を１．０ｗ／ｖ％、ＦＦＰを１５．０ｗ／ｖ％、αＭＥＭを６５．０ｗ／ｖ％含む滅菌した水溶液を凍結保存用溶液Ｃとして用意した。
Cryopreservation solution C:
Prepare a sterilized aqueous solution containing DMSO 10.0 w/v%, dextran (Dex40) 1.0 w/v%, FFP 15.0 w/v%, αMEM 65.0 w/v% as cryopreservation solution C did.
凍結保存用溶液Ｄ：
ＤＭＳＯを１０ｗ／ｖ％、ＦＢＳを９０％含む滅菌した水溶液を凍結保存用溶液Ｄとして用意した。
Cryopreservation solution D:
A sterilized aqueous solution containing 10% DMSO and 90% FBS was prepared as a cryopreservation solution D.
〔臍帯組織の処理〕
異なるドナーから臍帯組織１ｇ程度を採取した。合成樹脂製のバッグに臍帯組織および凍結保存用溶液Ａを入れて密封し、所定の時間（０ｈ、１ｈ、３ｈ、６ｈ、１８ｈ）、４℃で静置した。次いで、臍帯組織を凍結保存用溶液Ａに浸漬した状態でバッグをバイセルに入れて、−８０℃で凍結した。−８０℃まで３時間程度要した。２週間後、このバッグを３７〜３８℃のウォーターバスに入れて、臍帯組織を解凍した。培養培地（１０％ＦＢＳ／αＭＥＭ）を用いて臍帯組織を洗浄し、凍結保存用溶液Ａを除去した。次いで臍帯組織をメスで細かく刻んで組織片とし、細胞培養用ディッシュに組織片を張り付け、専用の押さえ具をかぶせて、組織片が浮遊しないようにして、培養培地（１０％ＦＢＳ／αＭＥＭ）を注いで培養を開始した（エクスプラント法）。なお、専用の押さえ具が無い場合には、組織片がディッシュの底に張り付いたことを確認後に培養培地を注いでもよい。９〜１４日後、トリプシンで細胞を組織片ごと剥離してセルストレーナーを用いて組織片を除いてから、細胞のみを回収した。対照として、凍結保存用溶液を用いずに臍帯組織を凍結および解凍したもの（「凍結保存用溶液なし」）、および、臍帯組織を凍結せずにそのまま組織を刻んだもの（「凍結なし」）からも、同様にエクスプラント法を用いて細胞を回収した。
[Treatment of umbilical cord tissue]
About 1 g of umbilical cord tissue was collected from different donors. The umbilical cord tissue and the solution A for cryopreservation were placed in a synthetic resin bag, sealed, and allowed to stand at 4° C. for a predetermined time (0 h, 1 h, 3 h, 6 h, 18 h). Then, the umbilical cord tissue was immersed in the cryopreservation solution A, and the bag was put in a bicell and frozen at -80°C. It took about 3 hours to reach -80°C. Two weeks later, the bag was placed in a 37-38° C. water bath to thaw the umbilical cord tissue. The umbilical cord tissue was washed with a culture medium (10% FBS/αMEM) to remove the cryopreservation solution A. Then, the umbilical cord tissue is finely minced with a scalpel to make a tissue piece, the tissue piece is attached to a cell culture dish, and a dedicated holding tool is covered to prevent the tissue piece from floating. Culture was started by pouring (explant method). When there is no dedicated presser, the culture medium may be poured after confirming that the tissue piece has stuck to the bottom of the dish. After 9 to 14 days, the cells together with the tissue piece were detached with trypsin, the tissue piece was removed using a cell strainer, and then only the cells were collected. As a control, the umbilical cord tissue was frozen and thawed without using the cryopreservation solution (“no cryopreservation solution”), and the umbilical cord tissue was not frozen and the tissue was directly cut (“no freezing”). Similarly, cells were recovered using the explant method.
〔回収した細胞数〕
回収した細胞数を凍結保存した組織重量で換算した結果を図１に示す。「凍結なし」の回収細胞数を１．０とし、その他の凍結保存用溶液Ａに所定時間浸漬したときの回収細胞数の比を表示している。ｎ＝３である。
[Number of recovered cells]
The result of converting the number of collected cells into the weight of the frozen and preserved tissue is shown in FIG. The number of collected cells of “without freezing” is set to 1.0, and the ratio of the number of collected cells when immersed in other cryopreservation solution A for a predetermined time is displayed. n=3.
〔間葉系幹細胞の表面マーカー〕
凍結保存用溶液Ａに３時間浸漬した臍帯組織から上述の方法で培養・回収したＰ２細胞を蛍光抗体で染色、フロサイトメトリー（FACS CantoII）で解析した。対照として、凍結なしの臍帯組織から上述の方法で培養・回収したＰ２細胞を用いた。間葉系幹細胞の表面マーカーであるＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＨＬＡ−ＡＢＣについての結果を図２に示す。図２に示されるように、凍結保存した臍帯組織由来の細胞は、凍結なしの臍帯組織由来の細胞と同様の表面マーカーを呈した。
[Surface marker of mesenchymal stem cells]
P2 cells cultured and collected from the umbilical cord tissue soaked in the cryopreservation solution A for 3 hours were stained with a fluorescent antibody and analyzed by flow cytometry (FACS CantoII). As a control, P2 cells cultured and collected from the umbilical cord tissue without freezing by the method described above were used. The results for the surface markers of mesenchymal stem cells, CD73, CD105, CD90, HLA-DR, and HLA-ABC are shown in FIG. As shown in FIG. 2, the cryopreserved umbilical cord tissue-derived cells exhibited similar surface markers to the umbilical cord tissue-derived cells without freezing.
〔リンパ球混合試験〕
凍結保存用溶液Ａに３時間浸漬した臍帯組織から上述の方法で培養・回収した細胞について、リンパ球混合試験を行った。リンパ球混合試験では、レスポンダー（Ｒ）のリンパ球がStimulator細胞（Ｓ）に反応して増殖するが、臍帯組織由来間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）はレスポンダー細胞の増殖を抑制する。レスポンダー細胞にはＣＦＳＥ染色を、Stimulator細胞には放射線照射した同種樹状細胞（ＤＣ）を使用した。細胞数がＲ：ＤＣ：ＭＳＣｓ＝１０：１：１の比となるよう混合した。結果を図３に示す。レスポンダー細胞が増殖した場合には、図３の波形のピークが左にシフトするが、増殖しない場合または増殖抑制された場合には、ピークが右にとどまる。凍結した臍帯組織由来のＭＳＣｓは凍結なしの臍帯組織由来のＭＳＣｓと同様に、リンパ球混合試験におけるリンパ球増殖抑制効果を示した。
[Lymphocyte mixture test]
A lymphocyte mixing test was performed on cells cultured and collected by the above method from the umbilical cord tissue immersed in the cryopreservation solution A for 3 hours. In the lymphocyte mixed test, responder (R) lymphocytes proliferate in response to Stimulator cells (S), whereas umbilical cord tissue-derived mesenchymal stem cells (MSCs) suppress the proliferation of responder cells. CFSE staining was used for responder cells, and irradiated allogeneic dendritic cells (DC) were used for stimulator cells. The cells were mixed at a ratio of R:DC:MSCs=10:1:1. Results are shown in FIG. When the responder cells proliferate, the peak of the waveform in FIG. 3 shifts to the left, but when it does not proliferate or when the proliferation is suppressed, the peak stays on the right. The frozen umbilical cord tissue-derived MSCs showed a lymphocyte proliferation inhibitory effect in the lymphocyte mixture test, like the umbilical cord tissue-derived MSCs without freezing.
〔分化試験〕
凍結保存用溶液Ａに３時間浸漬した臍帯組織から上述の方法で培養・回収した細胞について、脂肪細胞および軟骨細胞への分化能を試験した。対照として、臍帯組織を凍結せずにそのまま組織を刻んだもの（「凍結なし」）からも、同様にエクスプラント法を用いて細胞を回収し、分化能を試験した。試験においては、回収した細胞を何れもＰ３まで培養した後、脂肪細胞および軟骨細胞へと誘導した。
[Differentiation test]
The cells cultured and collected by the above method from the umbilical cord tissue immersed in the cryopreservation solution A for 3 hours were tested for their ability to differentiate into adipocytes and chondrocytes. As a control, cells were also recovered from the umbilical cord tissue that had been cut without being frozen (“without freezing”) using the same explant method, and the differentiation ability was tested. In the test, all the recovered cells were cultured to P3 and then induced into adipocytes and chondrocytes.
脂肪細胞への誘導は、Ｐ３の細胞を１２穴プレートに２×１０４cells/well播種し、１００μＭ インドメタシン（Sigma-Aldrich製）、０．５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチルキサチン（Sigma-Aldrich製）および１０μｇ／ｍＬ インスリン（Sigma-Aldrich製）を添加した培養液（１０％ＦＢＳ＋αＭＥＭ）中で培養することにより行った。培養液は３日ごとに交換し、３週間培養した。培養後、細胞を１０％ホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳ、６０％イソプロパノールでリンスした後、オイルレッドＯで染色した。オイルレッドＯでは、脂肪細胞中の脂肪が赤色に染色される。結果を図４の（ａ）および（ｂ）に示す。凍結・解凍した臍帯組織由来の細胞（図４の（ｂ））は、新鮮な臍帯組織由来の細胞（図４の（ａ））と同様に染色され、脂肪細胞への分化能を示した。 To induce adipocytes, P3 cells were seeded in a 12-well plate at 2×10 4 cells/well, 100 μM indomethacin (Sigma-Aldrich), 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxatin (Sigma-Aldrich). And 10 μg/mL insulin (Sigma-Aldrich) was added to the culture medium (10% FBS+αMEM). The culture medium was replaced every 3 days and cultured for 3 weeks. After culturing, the cells were fixed with 10% formaldehyde, rinsed with PBS and 60% isopropanol, and then stained with Oil Red O. With Oil Red O, fat in adipocytes is stained red. The results are shown in (a) and (b) of FIG. The frozen and thawed umbilical cord tissue-derived cells (FIG. 4(b)) were stained in the same manner as the fresh umbilical cord tissue-derived cells (FIG. 4(a)), and showed the ability to differentiate into adipocytes.
軟骨細胞への誘導は、ペレット培養法を用いた。すなわち、回収した細胞２．５×１０５cells/wellを１５ｍＬコニカルチューブに入れ、遠心した後、ペレットにStemMACSTMChondroDiff Media（Miltenyi Biotec GmbH 製）を添加した。培養液は３日ごとに交換し、３週間培養した。培養後、細胞を４％ホルムアルデヒドで固定し、細切し、トルイジンブルー染色を行った。トルイジンブルー染色では、軟骨組織が青色に染色される。結果を図４の（ｃ）〜（ｆ）に示す。培養後、どちらの細胞についても、直径約１ｍｍの弾力性の固いペレットが細胞中に観察された（図４の（ｃ）および（ｄ））。また、凍結・解凍した臍帯組織由来の細胞（図４の（ｅ））は、新鮮な臍帯組織由来の細胞（図４の（ｆ））と同様に染色され、軟骨細胞への分化能を示した。 The pellet culture method was used for induction into chondrocytes. That is, the collected cells (2.5×10 5 cells/well) were put into a 15 mL conical tube, centrifuged, and StemMACS ™ ChondroDiff Media (manufactured by Miltenyi Biotec GmbH) was added to the pellet. The culture medium was replaced every 3 days and cultured for 3 weeks. After culturing, the cells were fixed with 4% formaldehyde, cut into small pieces, and stained with toluidine blue. With toluidine blue staining, cartilage tissue is stained blue. The results are shown in (c) to (f) of FIG. After culturing, an elastic hard pellet having a diameter of about 1 mm was observed in the cells of both cells (FIGS. 4(c) and (d)). In addition, the frozen and thawed umbilical cord tissue-derived cells ((e) in FIG. 4) were stained in the same manner as the fresh umbilical cord tissue-derived cells ((f) in FIG. 4) and showed the ability to differentiate into chondrocytes. It was
〔異なる凍結保存用溶液での比較〕
同じドナーから臍帯組織１ｇ程度を採取した。合成樹脂製のバッグに臍帯組織および凍結保存用溶液Ａを入れて密封し、３時間、４℃で静置した。上記と同様の方法で、凍結、解凍、および培養し、細胞を回収した。また、凍結保存用溶液Ｂに浸漬したものからも、同様に細胞を回収した。対照として、凍結保存用溶液Ｃに浸漬したもの、凍結保存用溶液Ｄに浸漬したもの、凍結保存用溶液を用いずに臍帯組織を凍結および解凍したもの（「凍結保存用溶液なし」）、および、臍帯組織を凍結せずにそのまま組織を刻んだもの（「凍結なし」）からも、同様に細胞を回収した。
[Comparison with different cryopreservation solutions]
About 1 g of umbilical cord tissue was collected from the same donor. The umbilical cord tissue and the solution A for cryopreservation were placed in a synthetic resin bag, sealed, and allowed to stand at 4° C. for 3 hours. Cells were collected by freezing, thawing, and culturing in the same manner as above. Also, cells were similarly recovered from the one soaked in the cryopreservation solution B. As controls, those immersed in the cryopreservation solution C, those immersed in the cryopreservation solution D, those obtained by freezing and thawing umbilical cord tissue without using the cryopreservation solution (“no cryopreservation solution”), and Similarly, cells were also collected from the umbilical cord tissue which was not frozen but was directly carved into the tissue (“without freezing”).
回収した細胞数を凍結保存した組織重量で換算した結果を図５の（ａ）に示す。「凍結なし」を１．０としたときの比を表示している。図５の（ａ）に示すとおり、凍結保存用溶液ＡまたはＢを用いた場合は、凍結保存用溶液ＣまたはＤを用いた場合よりも多くの細胞を回収することができた。また、凍結保存用溶液Ａを用いた場合の方が、凍結保存用溶液Ｂを用いた場合よりもさらに多くの細胞を回収することができた。 The result of converting the number of collected cells into the weight of the frozen and preserved tissue is shown in (a) of FIG. The ratio when "no freezing" is set to 1.0 is displayed. As shown in FIG. 5(a), when the cryopreservation solution A or B was used, more cells could be recovered than when the cryopreservation solution C or D was used. Further, when the cryopreservation solution A was used, more cells could be recovered than when the cryopreservation solution B was used.
また、「凍結保存用溶液なし」、「凍結なし」、および凍結保存用溶液Ａ〜Ｃについて、異なるドナーから採取した臍帯組織を用いて同様の実験を行った。それぞれについての平均および標準偏差（ＳＤ）を図５の（ｂ）に示す。凍結保存用溶液Ａに３時間浸漬後の凍結・解凍群では、凍結なし群に比し、生細胞数の回収率の低下は認められず、むしろ有意に生細胞の回収率の増加を認めた。 In addition, similar experiments were performed using "no cryopreservation solution", "no freezing", and cryopreservation solutions A to C using umbilical cord tissues collected from different donors. The mean and standard deviation (SD) for each are shown in Figure 5(b). In the freeze/thaw group after being immersed in the solution A for cryopreservation for 3 hours, the recovery rate of the viable cells was not decreased as compared with the non-freezing group, but rather, the recovery rate of the viable cells was significantly increased. ..
本発明は、医療および研究等における臍帯組織の凍結保存に利用することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be used for cryopreservation of umbilical cord tissue in medical treatment and research.
Claims (15)
増粘剤、凍害防御剤およびグルコースを含み、かつ天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液に、生細胞を含む臍帯組織を浸漬する浸漬工程と、
上記臍帯組織を、上記凍結保存用溶液に浸漬した状態で凍結する凍結工程と、を含む、
上記凍結保存用溶液は、上記増粘剤としてのカルボキシメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウムを０．１〜１．０ｗ／ｖ％含み、上記凍害防御剤としてのジメチルスルホキシドを１．０〜１５．０ｗ／ｖ％含み、グルコースを０．５〜１０．０ｗ／ｖ％含む水溶液である、
凍結保存方法。 A method of cryopreserving umbilical cord tissue, comprising:
A thickening agent, a cryoprotective agent and glucose, and a soaking step of immersing umbilical cord tissue containing live cells in a solution for cryopreservation that does not contain natural animal-derived components,
The umbilical cord tissue, including a freezing step of freezing in a state of being immersed in the cryopreservation solution,
The cryopreservation solution contains 0.1 to 1.0 w/v% of carboxymethyl cellulose or sodium carboxymethyl cellulose as the thickening agent, and 1.0 to 15.0 w/v of dimethyl sulfoxide as the frost damage protecting agent. %, and an aqueous solution containing 0.5 to 10.0 w/v% glucose.
Cryopreservation method.
請求項１〜５の何れか１項に記載の凍結保存方法を用いて凍結保存されている臍帯組織を解凍する解凍工程と、
解凍した後に、エクスプラント法によって培養された臍帯組織から生細胞を回収する細胞回収工程と、を含む、回収方法。 A method for recovering live cells from cryopreserved umbilical cord tissue, comprising:
A thawing step of thawing umbilical cord tissue cryopreserved using the cryopreservation method according to any one of claims 1 to 5,
And a cell recovery step of recovering live cells from the umbilical cord tissue cultured by the explant method after thawing.
増粘剤、凍害防御剤およびグルコースを含み、かつ天然の動物由来成分を含まない凍結保存用溶液に、生細胞を含む臍帯組織を浸漬する浸漬工程と、
上記臍帯組織を、上記凍結保存用溶液に浸漬した状態で凍結する凍結工程と、を含む、
上記凍結保存用溶液は、上記増粘剤としてのカルボキシメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウムを０．１〜１．０ｗ／ｖ％含み、上記凍害防御剤としてのジメチルスルホキシドを１．０〜１５．０ｗ／ｖ％含み、グルコースを０．５〜１０．０ｗ／ｖ％含む水溶液である、作製方法。 A method for producing a frozen product of umbilical cord tissue, which is capable of recovering living cells after thawing,
A thickening agent, a cryoprotective agent and glucose, and a soaking step of immersing umbilical cord tissue containing live cells in a solution for cryopreservation that does not contain natural animal-derived components,
The umbilical cord tissue, including a freezing step of freezing in a state of being immersed in the cryopreservation solution,
The solution for cryopreservation contains 0.1 to 1.0 w/v% of carboxymethyl cellulose or sodium carboxymethyl cellulose as the thickener, and 1.0 to 15.0 w/v of dimethyl sulfoxide as the frost damage protector. %, and an aqueous solution containing 0.5 to 10.0 w/v% glucose .
上記増粘剤としてのカルボキシメチルセルロース又はカルボキシメチルセルロースナトリウムを０．１〜１．０ｗ／ｖ％含み、上記凍害防御剤としてのジメチルスルホキシドを１．０〜１５．０ｗ／ｖ％含み、グルコースを０．５〜１０．０ｗ／ｖ％含む水溶液である、
臍帯組織を浸漬して凍結保存をする、臍帯組織の凍結保存用溶液。 Contains thickeners, frost protection agents and glucose, and does not contain natural animal-derived ingredients,
Carboxymethylcellulose or sodium carboxymethylcellulose as the thickening agent is contained in an amount of 0.1 to 1.0 w/v%, dimethyl sulfoxide is contained as the antifreezing agent in an amount of 1.0 to 15.0 w/v%, and glucose is 0.1. An aqueous solution containing 5 to 10.0 w/v%,
A solution for cryopreservation of umbilical cord tissue, which is immersed in the umbilical cord tissue for cryopreservation.
請求項１３に記載の臍帯組織の凍結保存用溶液と、
凍結保存用溶液および臍帯組織を格納可能な耐寒性の容器と、を備える、凍結保存用キット。 A kit for cryopreserving umbilical cord tissue, comprising:
A solution for cryopreserving umbilical cord tissue according to claim 13 ,
A cryopreservation kit comprising a cryopreservation solution and a cold-resistant container capable of storing umbilical cord tissue.
解凍した後に、エクスプラント法によって培養された臍帯組織から生細胞を回収する細胞回収工程と、
回収された生細胞またはそれを継代培養した細胞を、所望の細胞に分化させる分化工程と、を含む、分化方法。 A thawing step of thawing umbilical cord tissue cryopreserved using the cryopreservation method according to any one of claims 1 to 5,
After thawing, a cell recovery step of recovering live cells from the umbilical cord tissue cultured by the explant method,
A differentiation step of differentiating the recovered live cells or cells subcultured thereof into desired cells.
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