JP6736676B2 - 運動類似効果誘導用薬学組成物 - Google Patents

Description

本発明は、α１−アドレナリン受容体効能剤（ａｇｏｎｉｓｔ）を有効成分として含む運動類似効果誘導用薬学組成物、及びα１−アドレナリン受容体効能剤を利用した運動類似効果誘導用薬物のスクリーニング方法に関する。

運動訓練は、骨格筋で表現型変化を起こすリモデリングプログラムを活性化させることによって、運動耐性を向上させ、適当な運動は、代謝疾患や心疾患などの病理状態の好転に効果的である。

特に、ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）、ＰＰＡＲ−δ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−δ）、ＰＧＣ−１α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇａｍｍａ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１α）は、運動耐性のための骨格筋の表現型変化に関与する重要因子として知られている。

この際、ＡＭＰＫは、α、β、γサブユニットからなるヘテロ三量体（ｈｅｔｅｒｏｔｒｉｍｅｒｉｃ）複合体であって、筋肉収縮及び運動時に、ＡＭＰＫの上位酵素であるＬＫＢ１及びＣａＭＫＫ（Ｃａ２＋／ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｋｉｎａｓｅ）によるリン酸化によって活性化され、グルコース恒常性、食欲、及び運動生理に対する細胞／器官代謝の主な調節子である。ＰＰＡＲ−δは、骨格筋代謝の転写調節において、核心的な役割を行い、ＰＧＣ−１αは、ミトコンドリア生合成及び機能の調節子であって、エネルギー代謝に関与し、骨格筋の耐性運動によって活性化される遺伝子を調節する転写共同活性化因子である。

ＡＭＰＫは、同時に多様な転写プログラムをターゲティングすることができると知られているが、このような転写プログラムは、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αのような基質によって調節されて、運動と類似した遺伝的効果を誘発する。これと関連して、ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ信号経路をターゲティングする運動類似薬物が、耐性表現型に対する筋肉を再びプログラミングする新たな薬剤学的戦略になりうるという点が報告されている（Ｃｅｌｌ ２００８，ｖｏｌ．１３４，ｐｐ４０５−４１５）。

また、Ａ−７６９６６２、メトホルミン（ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ）、５−アミノイミダゾール−４−カルボキシアミド−１−β−Ｄ−リボフラノシド（ＡＩＣＡＲ）及びレスベラトロール（ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ）のようなＡＭＰＫ活性化を促進する幾つかの薬物が、心不全症に対して治療効果を発揮すると報告されている。心疾患に対するＡＭＰＫの保護機能は、細胞質のうち、活性酸素種生産の減少、アンジオテンシンＩＩの活性抑制、心臓トロポニンＩのリン酸化、ＰＧＣ−１αの活性化、ｅＮＯＳ−ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ酸化酵素発現の調節、エストロゲン関連受容体の調節及びエネルギー均衡と心臓内信号伝達の調節などの重要な機能を通じて達成されるので、ＡＭＰＫ活性化は、直接・間接的に心筋機能を向上させうる。

このように、ＡＭＰＫ活性化（リン酸化）及びこれと関連した因子（ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１α）は、骨格筋内でのグルコース摂取（ｕｐｔａｋｅ）、エネルギー代謝恒常性維持、心機能増大などの運動類似効果を誘導するために、運動類似効果によって治療される代謝疾患、心血管疾患、炎症疾患などのターゲットとして、ＡＭＰＫを活性化させる薬物に対する要求が持続的にあった。

これにより、本発明者は、α１−アドレナリン受容体を活性化させる場合、高血圧、肥満、糖尿病などの代謝疾患、心疾患、炎症疾患が改善されうるということを見つけ、その作用メカニズムを鋭意研究した結果、α１−アドレナリン受容体が活性化されれば、活性型−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現を増加させ、それを通じて骨格筋、心筋、肝などの多器官で運動類似効果を起こしうるということを見つけ、本発明を完成した。

したがって、本発明の目的は、α１−アドレナリン受容体効能剤またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む運動類似効果誘導用薬学組成物及びそれを用いた治療方法を提供するところにある。

また、本発明の目的は、α１−アドレナリン受容体効能剤を利用した運動類似効果誘導用薬物のスクリーニング方法を提供するところにある。

しかし、本発明が解決しようとする技術的課題は、前述した課題に制限されず、言及されていないさらなる課題は、下記の記載から当業者に明確に理解される。

本発明は、α１−アドレナリン受容体効能剤またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む運動類似効果誘導用薬学組成物に関するものである。

また、本発明は、α１−アドレナリン受容体効能剤またはその薬学的に許容可能な塩を個体に投与する段階を含む運動類似効果誘導方法に関するものである。

また、本発明は、α１−アドレナリン受容体効能剤またはその薬学的に許容可能な塩の運動類似効果誘導用途に関するものである。

本発明の一具体例として、前記α１−アドレナリン受容体効能剤は、ＡＭＰＫ活性化を誘導することを特徴とする。

本発明の他の具体例として、前記α１−アドレナリン受容体効能剤は、ＰＰＡＲ−δまたはＰＧＣ−１αの発現を誘導することを特徴とする。

本発明のさらに他の具体例として、前記α１−アドレナリン受容体効能剤は、ミドドリン（ｍｉｄｏｄｒｉｎｅ）であることを特徴とする。

本発明のさらに他の具体例として、前記運動類似効果は、ＡＭＰＫ活性化が必要な疾患の治療効果であることを特徴とする。

また、本発明は、α１−アドレナリン受容体効能剤を利用した運動類似効果誘導用薬物のスクリーニング方法を提供する。

本発明の一具現例として、前記スクリーニング方法は、（ａ）インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で細胞にα１−アドレナリン受容体効能剤を処理する段階と、（ｂ）リン酸化−ＡＭＰＫ（ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）、ＰＰＡＲ−δ（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−δ）、またはＰＧＣ−１α（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｇａｍｍａ Ｃｏａｃｔｉｖａｔｏｒ−１α）の発現を測定する段階と、を含むことを特徴とする。

本発明の他の具現例として、前記スクリーニング方法は、（ｃ）効能剤未処理群に比べて、前記リン酸化−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δまたはＰＧＣ−１αの発現が増加する場合、処理効能剤を薬物として選定する段階をさらに含むことを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例として、前記段階（ｂ）で、発現は、ウェスタンブロッティング、抗体免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、質量分析法、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＲＴ−ＰＣＲ）、ＲＰＡ（ＲＮａｓｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）またはノーザンブロッティングを用いて測定することを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例として、前記段階（ａ）で、細胞は、骨格筋、心筋、肝、脂肪、及び膵臓からなる群から選択される組織の細胞であることを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例として、前記運動類似効果は、代謝疾患、心血管疾患、及び炎症疾患からなる群から選択される疾患の治療効果であることを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例として、前記代謝疾患は、高血圧、高脂血症、糖尿病、肥満、動脈硬化、及び脂肪肝からなる群から選択される疾患であることを特徴とする。

本発明のα１−アドレナリン受容体効能剤によれば、生体内エネルギー代謝活性保持と調節とに核心的な作用を行うｐ−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αの発現を増加させることによって、骨格筋細胞内へのブドウ糖吸収率を高め、脂肪細胞の分化と脂質蓄積とを抑制し、腹部脂肪量と体重とを減少させるだけではなく、ミトコンドリアの代謝障害を調節し、炎症反応を抑制することができるので、結局、ＡＭＰＫの活性化が必要な疾患（代謝疾患、心血管疾患、炎症疾患など）の予防及び治療に有用に用いられうる。

また、本発明の組成物によれば、従来、臨床で副作用がなく、安定性に優れていることが立証されたドラッグリポジショニング（ｄｒｕｇ ｒｅｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ）を利用したために、臨床に直ちに適用できるという長所がある。

また、本発明の方法によれば、運動類似効果を起こす薬物をインビトロで簡便かつ高精度でスクリーニングすることができる。

（Ａ）と（Ｂ）は、骨格筋、心筋、肝細胞で、ミドドリンによってα１−アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）を活性化させる場合、ＡＭＰＫ活性型（リン酸化型）であるｐ−ＡＭＰＫ及びＰＰＡＲ−δのタンパク質発現が増加することを示すウェスタンブロットの結果である。 基底４週齢対照群ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の骨格筋でα１−ＡＲのタンパク質発現状態をウェスタンブロッティングで確認した結果である。 前記ラットグループの心筋でＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ−ＰＧＣ１αのタンパク質発現状態をウェスタンブロッティングで確認した結果である。 前記ラットグループの骨格筋でＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ−ＰＧＣ１αのタンパク質発現状態をウェスタンブロッティングで確認した結果である。 前記ラットグループの肝でＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ−ＰＧＣ１αのタンパク質発現状態をウェスタンブロッティングで確認した結果である。 基底４週齢ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の大動脈組織で、血管収縮、一酸化窒素生成、酸化的ストレス、及び炎症と関連した遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを確認したノーザンブロットの結果である。 基底４週齢ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の心筋組織で、血管収縮、一酸化窒素生成、酸化的ストレス、及び炎症と関連した遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを確認したノーザンブロットの結果である。 基底４週齢ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の骨格筋でＳＤＨ（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）酵素活性度を測定した結果である。 前記グループの骨格筋組織に対してシトクロムｃオキシダーゼ（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ ｃ ｏｘｉｄａｓｅ）に対する免疫組織化学染色した結果である。 基底４週齢ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の心筋、骨格筋及び肝でＥＬＩＳＡ方法でＡＴＰレベルを測定した結果である。 マウス骨格筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）でインスリンのブドウ糖吸収に及ぼすミドドリン効果を確認した結果である。 図７Ａは、分化された脂肪細胞でミドドリン投与時に、脂肪合成／蓄積の減少効果が表われ、ＰＰＡＲ−δ拮抗剤投与時に、その効果が抑制され、図７Ｂは、脂肪細胞で脂肪合成／蓄積を抑制するミドドリン効果の機転をＰＰＡＲ−δ、ｐ−ＡＭＰＫ、ＰＧＣ−１αタンパク質発現に関連してウェスタンブロッティングで確認した同じ機転の結果である。 図７Ａは、分化された脂肪細胞でミドドリン投与時に、脂肪合成／蓄積の減少効果が表われ、ＰＰＡＲ−δ拮抗剤投与時に、その効果が抑制され、図７Ｂは、脂肪細胞で脂肪合成／蓄積を抑制するミドドリン効果の機転をＰＰＡＲ−δ、ｐ−ＡＭＰＫ、ＰＧＣ−１αタンパク質発現に関連してウェスタンブロッティングで確認した同じ機転の結果である。 体重及び腹部脂肪量に及ぼすミドドリン効果を確認した結果である。 （Ａ）と（Ｂ）は、炎症と関連侵食細胞でそれぞれマンノース受容体（ｍａｎｎｏｓｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＭＲ）及びヘキソキナーゼ（ｈｅｘｏｋｉｎａｓｅ）ＩＩ発現に及ぼすミドドリン効果を確認した結果であり、（Ｃ）は、基底４週齢ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の脾臓（ｓｐｌｅｅｎ）の肩甲下部分（ｓｕｂｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｒｔｉｏｎ）の大食細胞でマンノース受容体発現に対する免疫組織化学染色した結果であって、ミドドリン投与（ＩＩ）時に、他動物群に比べて、著しくマンノース受容体の発現が増加した結果である。 マウス骨格筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）で、化合物５によってα１−アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）を活性化させる場合、ｐ−ＡＭＰＫ（Ａ）及びＰＰＡＲ−δ（Ｂ）のタンパク質発現が増加することを示すウェスタンブロットの結果である。 マウス骨格筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）で、化合物７によってα１−アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）を活性化させる場合、ｐ−ＡＭＰＫ（Ａ）及びＰＰＡＲ−δ（Ｂ）のタンパク質発現が増加することを示すウェスタンブロットの結果である。 マウス骨格筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）で、化合物８によってα１−アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）を活性化させる場合、ｐ−ＡＭＰＫ（Ａ）、ＰＰＡＲ−δ（Ｂ）及びＰＧＣ−１α（Ｃ）のタンパク質発現が増加することを示すウェスタンブロットの結果である。 マウス骨格筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）で、化合物９によってα１−アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）を活性化させる場合、ｐ−ＡＭＰＫ（Ａ）、ＰＰＡＲ−δ（Ｂ）及びＰＧＣ−１α（Ｃ）のタンパク質発現が増加することを示すウェスタンブロットの結果である。 マウス骨格筋細胞株（Ｃ２Ｃ１２）で、化合物１０によってα１−アドレナリン受容体（α１−ＡＲ）を活性化させる場合、ｐ−ＡＭＰＫ（Ａ）、ＰＰＡＲ−δ（Ｂ）及びＰＧＣ−１α（Ｃ）のタンパク質発現が増加することを示すウェスタンブロットの結果である。

本発明は、α１−アドレナリン受容体効能剤またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む運動類似効果誘導用薬学組成物を提供する。

本発明では、α１−ＡＲ効能剤が、α１−ＡＲ刺激によって向上した心筋収縮という本来の効果だけではなく、ＡＭＰＫ活性化を通じて心筋、骨格筋、肝などの多器官に対して付加的な運動類似効果を発揮できるということを見つけて考案されたものである。

本発明において、α１−アドレナリン受容体効能剤は、α１−アドレナリン受容体に作用して活性化させる物質であれば、特に制限はない。アドレナリン受容体は、α１、α２、βという３種のタイプがあり、本発明では、α１タイプの受容体を活性化させる公知の化合物を制限なしに利用でき、例を挙げれば、ミドドリン、その類似体またはその薬学的に許容可能な塩であり得る。

この際、ミドドリン化合物は、アマチン（ａｍａｔｉｎｅ）、プロアマチン（ｐｒｏａｍａｔｉｎｅ）、グトロン（ｇｕｔｒｏｎ）などの商標名で販売され、そのＩＵＰＡＣ名は、（ＲＳ）− Ｎ−［２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル］グリシンアミド（（ＲＳ）− Ｎ−［２−（２，５−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ］ｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ）であって、下記化学式Ｉで表示される。

ミドドリンは、投与後、生体内で目的化合物に変化される薬物前駆体（ｐｒｏｄｒｕｇ）であり、生体内投与後、活性代謝産物であるデスグリミドドリン（ｄｅｓｇｌｙｍｉｄｏｄｒｉｎｅ）に変化されてα１−アドレナリン受容体を活性化させ、引き続きＡＭＰＫ活性化、ＰＰＡＲ−δ、またはＰＧＣ−１αの発現を誘導を通じて最終的に運動類似効果を誘導することができる。

また、前記化学式１で表される化合物は、「薬学的に許容可能な塩」を形成しうる。適した薬学的に許容可能な塩は、酸付加塩のように、本発明が属す技術分野で通常使われるものであって、特に制限されるものではない。望ましい薬学的に許容可能な酸付加塩としては、例えば、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、過塩素酸、または臭素酸のような無機酸；酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、フマル酸、マイレン酸、マロン酸、フタル酸、コハク酸、乳酸、クエン酸、シトロン酸、グルコン酸、酒石酸、サリチル酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、エンボン酸、アスパラギン酸、またはグルタミン酸のような有機酸が挙げられる。有機塩基付加塩の製造に使われる有機塩基としては、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、ジシクロヘキシルアミンなどを例として挙げられる。アミノ酸付加塩基の製造に使われるアミノ酸としては、アラニン、グリシンなどの天然アミノ酸を例として挙げられる。

また、本発明において、ミドドリン「類似体（ａｎａｌｏｇｕｅｓ）」は、ミドドリン化合物と類似した構造を有しながら、ミドドリンと同等の効果を有する化合物であれば、特に制限はないが、例を挙げれば、下記の化合物５、７、８、９、１０が挙げられる。

化合物５：２−アミノ−Ｎ−（２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）−３−フェニルプロパンアミド

化合物７：２−アミノ−Ｎ−（２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）プロパンアミド

化合物８：２−アミノ−Ｎ−（２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）アセトアミド塩酸塩

化合物９：２−アミノ−Ｎ−（２−（５−エチル−２−メトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）アセトアミド塩酸塩

化合物１０：２−アミノ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）アセトアミド塩酸塩

本発明において、α１−アドレナリン受容体効能剤は、ＡＭＰＫ活性化、及びＰＰＡＲ−δまたはＰＧＣ−１αの発現を誘導することによって、運動類似効果を果たすことができる。

この際、ＡＭＰＫは、生体内エネルギー状態を感知して、それを一定のレベルに保持させるエネルギーセンサー（ｅｎｅｒｇｙ ｓｅｎｓｏｒ）の役割を行うが、例えば、代謝性ストレスや運動によって細胞内のエネルギーが減少する場合、すなわち、ＡＴＰが枯渇してＡＭＰ／ＡＴＰ比率が増加する場合に活性化されて、ＡＴＰを消費する過程（例えば、脂肪酸酸化と当該過程）を促進する。ＡＭＰＫの活性化は、主要標的臓器（肝、筋肉、脂肪、膵臓）に代謝的に重要な結果を誘導するが、肝では、脂肪酸とコレステロールとの合成が抑制される一方、脂肪酸の酸化は促進され、骨格筋では、脂肪酸の酸化と糖吸収とを促進し、脂肪細胞では、脂肪合成を抑制し、膵臓β細胞では、インスリン分泌を促進すると知られている。

ＰＰＡＲ−δは、ＡＭＰＫを調節して細胞内異化的エネルギー代謝を促進し、抗炎症作用、インスリン抵抗性抑制など生体代謝の均衡（恒常性）保持に必須的な役割を行うと知られている。

ＰＧＣ−１αは、ミトコンドリア増殖の主要な調節物質であって、運動、飢え、寒さのような激しい代謝的変化に反応して発現が誘導され、ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＮＡＤ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ ｓｉｒｔｕｉｎ−１（ＳＩＲＴ１）などの調節を受けると知られている。

本発明において、運動類似効果とは、心臓機能改善（収縮力増加）、筋肉のインスリン鋭敏度増加及び酸化リン酸化機能増進、コレステロール減少、脂肪蓄積及び体重減少、血中炎症減少など運動時に発揮される生理効果を意味し、特に制限はない。

本発明において、ＡＭＰＫ活性化が必要な疾患とは、ＡＭＰＫの非活性化によって生じうる多様な疾患であって、特に制限はなく、例を挙げれば、代謝疾患、心血管疾患、炎症疾患などであり得る。

本発明において、代謝疾患（Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ）とは、ブドウ糖、脂肪、タンパク質などの代謝異常で祈願する疾病を意味し、例を挙げれば、高脂血症、糖尿病、肥満、動脈硬化、脂肪肝などが挙げられる。

本発明において、「薬学組成物」は、既存の治療活性成分、その他の補助剤、薬剤学的に許容可能な担体などの成分をさらに含みうる。前記薬剤学的に許容可能な担体は、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、及びエタノールなどを含む。

前記組成物は、それぞれ通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、座剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使われる。

本発明において、「投与量」は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与回数、投与方法、排泄率及び疾患の重症度などによって、その範囲が多様に調節されうるということは当業者には明白である。

本発明において、「個体」とは、疾病の治療を必要とする対象を意味し、より具体的には、ヒトまたは非ヒトである霊長類、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット（ｒａｔ）、犬、猫、馬及び牛などの哺乳類を意味する。

本発明において、「薬学的有効量」は、投与される疾患の種類及び重症度、患者の年齢及び性別、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出比率、治療期間、同時使われる薬物を含んだ要素、及びその他の医学分野によく知られた要素によって決定され、前記要素をいずれも考慮して副作用なしに最大効果が得られる量で、当業者によって容易に決定されうる。

本発明の組成物は、目的組織に到達することができる限り、「投与方法」には制限もない。例を挙げれば、経口投与、動脈注射、静脈注射、経皮注射、鼻腔内投与、経気管支投与または筋肉内投与などが含まれる。一日投与量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、望ましくは、０．００１〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日一回ないし数回分けて投与することが望ましい。

本発明では、α１−ＡＲ効能剤が、α１−ＡＲ刺激によってＡＭＰＫを活性化させるものと独立して、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現を増加させて心臓機能を向上させることを確認したところ、これは、運動訓練が心臓断片短縮を４０〜５０％まで増加させ、収縮及び弛緩両者の速度をいずれも向上させるためである。

したがって、α１−ＡＲ効能剤は、心臓収縮の直接的刺激に対する三重効果及びその運動効果を通じて、また、心臓、筋肉及び肝を含む多器官でのα１−ＡＲ刺激による運動類似ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ活性化という間接的効果を通じて心臓機能を向上させることによって、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で運動耐性の向上に寄与すると判断される。

このように、α１−ＡＲ刺激によってＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ活性化という心臓運動類似効果が表われ、付加的にＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現増加という他の運動類似プログラムを作動させるＡＭＰＫ−独立的心臓運動効果が表われるという事実は、本発明で初めて明らかにしたものである。

具体的に、本発明では、α１−ＡＲ刺激効果が、心筋細胞、骨格筋細胞で運動類似遺伝子の発現に及ぼす効果を分析し、それをヒトの代謝症候群と類似した症状を示すように誘導されたラット（ＳＨＲ）を使用して、インビボで心臓、骨格筋及び肝に及ぼす効果と比較した。

また、α１−ＡＲ刺激効果が、心臓機能／サイズ、炎症性サイトカイン、活性酸素種レベル、アディポネクチン、ＡＴＰレベル、ＳＤＨ酵素の活性度、脂肪レベル、及びアンジオテンシンＩＩ ＡＴ−１受容体の発現などに及ぼす効果を観察した。

その結果、ヒトの代謝症候群に該当するように誘導されたラット（ＳＨＲ）は、初期段階で血圧が持続的に上昇するが、α１−ＡＲ効能剤によってα１−ＡＲを刺激時に、心臓、骨格筋、肝でＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αの活性化及び発現増加を引き起こし、心臓肥大または追加的な血圧上昇なしに心臓収縮性を増加させるという事実を明らかにした。

また、α１−ＡＲ刺激時に、血液では、炎症性サイトカイン、ＲＯＳ、及びコレステロールレベルが減少し、心筋でＡＭＰＫ刺激に対するＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１α活性化の比率は、骨格筋と肝での数値よりもさらに高いということを確認した。このような結果は、運動類似ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ活性化と関連し、α１−ＡＲ刺激による筋肉収縮効果とは独立したことであることを意味し、薬理学的に刺激された心筋収縮作用が心臓ＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ−ＰＧＣ１α活性化に寄与するという点を初めて報告したものである。

また、本発明では、α１−ＡＲ効能剤が、他の運動類似効果誘発薬物（アテノロール）に比べて、さらに効果的であるという事実を明らかにしたが、これは、α１−ＡＲ効能剤が心臓収縮性を向上させる二重効果を有する一方に、他の薬物は、心臓筋肉収縮に対する直接的な収縮作用なしに運動類似効果のみを発揮するためである。また、他の運動類似剤は、それぞれの機能を高めるために、多様な薬物を混合して使われているが、α１−ＡＲ効能剤は、１種の物質でも、このような運動効果を多器官に同時多発的に表わすという長所がある。

また、本発明では、ミドドリンで処理されたラットで左心室拍出係数がアテノロール処理された動物ほど増加したが、心臓でのリン酸化されたＡＭＰＫは、実験グループの間に差があることを明らかにした。α１−ＡＲが心臓に対して友好的な効果を表わすにもかかわらず、α１−ＡＲ刺激の程度が長期的予後面では重要であると判断されるが、これは、心臓α１−ＡＲドライブの高度に持続した補強が収縮性機能障害、漸進的繊維化及び母細胞タンパク質遺伝子の再活性化に対して病理的リモデリングを引き起こすためである。

また、本発明では、α１−ＡＲ刺激にもかかわらず、心臓肥大が表われないということを明らかにしたが、これは、アンジオテンシンＩＩの抑制作用、刺激性自己消化作用（ａｕｔｏｐｈａｇｙ）などに対するＡＭＰＫの効果に起因すると見られる。さらに、本発明によれば、左心室質量は、アテノロール処理された群でよりもミドドリン処理された群でさらに小さく、これは、心臓ＡＴＩ発現の差として説明される。

また、本発明では、インビトロ及びインビボ実験を通じて、筋肉運動とは無関係に、α１−ＡＲ刺激が骨格筋でＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ−ＰＧＣ１αの発現を活性化させるという点を初めて明らかにした。このような運動関連遺伝子発現が、持久的運動（ｅｎｄｕｒａｎｃｅ ｅｘｅｒｃｉｓｅ）を保持するための適応反応のうちの１つであるという点に対しては既に報告されている。

また、本発明では、α１−ＡＲ刺激時に、ＲＯＳレベルが減少し、肝でもＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ−ＰＧＣ１α活性化が誘導され、代謝／生化学的反応／炎症反応に対して全身的効果を表わし、総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、及びＨＤＬ−コレステロールレベルが著しく減少するということを確認した。

また、本発明では、α１−ＡＲ刺激時に、インスリンによるブドウ糖吸収が増加し、脂肪細胞への分化及び脂肪合成／蓄積が抑制され、体重及び腹部脂肪が減少し、炎症抑制効果があるということを確認したので、これにより、糖尿病、肥満、炎症などの疾患に有効であるということが分かる。

また、本発明では、α１−アドレナリン受容体効能剤としてミドドリンの以外に、これと類似した多様な化合物を新規合成して、骨格筋細胞でα１−ＡＲ刺激によるＡＭＰＫ活性化、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現誘導を確認することによって、制限されない多様なα１−ＡＲ効能剤が運動類似効果を起こしうるということを検証した。

以下、本発明の理解を助けるために、実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものであり、実施例によって、本発明の内容が限定されるものではない。

実施例１：実験方法
１−１．試料
ＴＲＩｚｏｌ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｐｏｗｅｒ ｃＤＮＡ合成キット及びＭａｘｉｍｅ ＰＣＲ ＰｒｅＭｉｘキットは、ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｅｏｎｇｎａｍ−ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ−ｄｏ，Ｋｏｒｅａ）から購入した。ＰＲＥＰ^ＴＭタンパク質抽出溶液及び予め染色されたタンパク質サイズマーカーは、ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。抗ＡＭＰＫα（全体形態のαサブユニット）、及び抗ホスホ−ＡＭＰＫα（Ｔｈｒ１７２でリン酸化）１次抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。抗ウサギ２次抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｃｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅキットは、Ｂｉｏ−ｒａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｘ線フィルムは、Ａｇｆａ（Ｍｏｒｔｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から購入し、現像及び固定キットは、Ｋｏｄａｋ（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）から購入した。ラットアディポネクチン検出ＥＬＩＳＡキットは、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）から購入した。

１−２．骨格筋／心筋細胞でＡＭＰＫに対するα１−ＡＲ刺激のインビトロ効果
インビトロ実験で、筋肉のα１−ＡＲ刺激が運動効果と関連があるが否かを確認するために、運動時に増加する代表タンパク質であるＡＭＰＫ発現を先に確認し、骨格筋、心筋及び肝でＡＭＰＫと共に、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現が増加するという前提下に下記のようにインビボ動物実験を進行した。

１−３．細胞培養及び動物実験
細胞培養
Ｃ２Ｃ１２（ｍｏｕｓｅ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）細胞の培養は、３７℃ ＣＯ_２培養器内で６ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に細胞を分注して、１０％ ＦＢＳ、１％抗生剤含有培地（ＤＭＥＭ ｍｅｄｉａ）で８０％程度飽和されるまで育てた後、１％ ＦＢＳ含有培地に培地を取り替えて、３日間分化させた後、１％ ＦＢＳ含有培地に取り替えた後、薬物を処理した後、２４時間後に実験を進行した。

動物実験
自発性高血圧ラット（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ Ｒａｔ；ＳＨＲ）は、遺伝性高血圧が発現される実験動物であって、ヒトの原発性高血圧と最も類似した高血圧を発現させると知られている。ＳＨＲは、ほとんど４〜６週齢に血圧が上昇し始めて、８〜１２週齢に本格的な高血圧が発現される。ＳＨＲは、心肥大、心不全及び腎障害のような高血圧性標的臓器の損傷をよく伴うために、原発性高血圧、特に、心臓病変を有した高血圧に対する動物モデルとして関連研究に幅広く使われている。

３週齢の自発性高血圧ラット（ＳＨＲｓ）を標準化された条件下で保管したので（２１℃、４１％〜６２％の湿度）、規則的な昼／夜（１０／１４時間）サイクルを加え、水及び実験室の餌に自在に近付くようにした。あらゆる動物実験は、大韓民国の高麗大学校動物科学規則に符合して行った（ＫＵＩＡＣＵＣ−２０１２−１００）。実験過程及び収容条件は、高麗大学校動物実験委員会の承認を受けた。

適応１週後に、ラットを下記のように、４個群のうち１つ（群当たり６匹ラット）に割り当てた：グループＩ（基底対照群、４週齢に犠牲）、グループＩＩ（４週間ミドドリン投与）、グループＩＩＩ（４週間アテノロール（ａｔｅｎｏｌｏｌ）投与）、及びグループＩＶ（４週間薬剤投与ない対照群）。グループＩ及びグループＩＶは、如何なる薬物もなしに標準保持の餌を与え（Ｋ−Ｈ４ペレット、Ｓｓｎｉｆｆ）、グループＩＩは、飲用水中ミドドリンと共に（０．２ｍｇ／ｋｇ／ｄ）同じ餌を与え、グループＩＩＩは、飲用水中アテノロールと共に（１ｍｇ／ｋｇ／ｄ）同じ餌を与えた。

血圧は、Ｖｉｓｉｔｅｃｈ ＢＰ２０００ ｓｙｓｔｅｍ（Ｖｉｓｉｔｅｃｈ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を使用して、しっぽ切断体プレチスモグラフィーによって毎７日間測定した。

グループＩ中の動物は、４週齢で安楽死させた一方、他のグループのラットは、４週間処方した後、８週齢で安楽死させた。血液サンプルは、下大静脈から採取し、心臓、大動脈、肝、骨格筋肉、及び内臓脂肪は、きれいに切開して重量を測った。回収された臓器は、−８０℃冷蔵庫または浸漬固定のための１０％ホルマリン中に保管した。

１−４．心臓超音波（ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ）検査
Ｚｏｌｅｔｉｌ（８ｍｇ／ｋｇ）及びｘｙｌｚｉｎｅ（２ｍｇ／ｋｇ）を筋肉注射して麻酔させた以後に、ラットを左側に寝かせ、Ｍモードエコー映像を得た。あらゆる検査は、１２ＭＨｚトランスデューサを備えたＶｉｖｉｄ ７（ＧＥ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して行った。乳頭筋レベルで左心室に対する最適２次元短縮映像を獲得した以後に、Ｍモードトレーシングを、同時に心電図記録を行いながら、１００ｍｍ／ｓの速度で記録した。Ｍモードトレーシングに対する少なくとも３回連続心臓サイクルからＡｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ方法の変形方法を使用して、心臓壁の厚さ、体積、及び質量を測定した。

１−５．血液生化学、炎症マーカー、活性酸素種、ＡＴＰ及びアディポネクチンの測定
総コレステロール、ＨＤＬ−コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、及びトリグリセリドの濃度を測定するために、酵素発色法（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ；Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。また、プロトコルによってサイトカイン（インターロイキン（ＩＬ）−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、及びＴＮＦ−α）に対して、４−ｐｌｅｘ ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ ｐａｎｅｌ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、炎症性マーカーに対する血清分析を行った。獲得は、Ｌｕｍｉｎｅｘ １００プラットフォーム上で行われ、データは、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ分析器を使用して分析した。活性酸素種及びアディポネクチンは、ＥＬＩＳＡキット（ＭＢＳ８１５４９４，Ｍｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を使用して測定した。測定された血液アディポネクチンレベルを内臓脂肪重量（ｇ）に対して修正した。

１−６．組織のＡＴＰ及びＲＯＳ測定のためのＥＬＩＳＡ方法
０．０２ｇの肝組織を５００μＬのＰＢＳ中で均質化した。均質液を１５００ｕｇ（または、５０００ｒｐｍ）で１５分間遠心分離した以後に、上澄み液に対して測定を行った。基準物質またはサンプル１００μＬを抗体予めコーティングされたマイクロ適正プレート中の適当なウェルに注いだ後、残余溶液１０μＬをサンプルに添加した。５０μＬのコンジュゲートを各ウェルに添加し、混合した後、カバーを覆ったプレートを３７℃で１時間培養した。それぞれ５０μＬの基質Ａ及びＢをそれぞれのウェルに添加し、３７℃で１５分間培養した。それぞれのウェルに停止液を添加した後、マイクロプレート判読器を使用して４５０ｎｍで光学密度を測定した。

１−７．骨格筋のＳＤＨ酵素活性度の測定方法
ウェル当たりＰＢＳ溶液１ｍｌ当たりタンパク質分解酵素阻害剤カクテル１０μＬを添加して、ウェル当たり５００μＬずつ準備し、１Ｍリン酸緩衝溶液２５μＬＸ２５＝６２５μＬ、０．２Ｍコハク酸ナトリウム１２５μＬＸ２５＝３１２５μＬ、ＮＢＴ ２５μＬＸ２５＝６２５μＬ、Ｄ．Ｗ ２３５μＬＸ２５＝５８７５μＬを混ぜて作った培養溶液をウェル当たり４１０μＬ準備して、反応２０分前に３７℃に温めておいた。骨格筋肉組織０．０２ｇ当たり、前記であらかじめ準備したＰＢＳ ５００μＬを入れ、破砕機で磨くが、短い時間分けて磨いて、温度が上昇して酵素が破壊されないように準備した。１３０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離後、上澄み液を収得して新たなチューブに移した。培養溶液４１０μＬをあらかじめチューブに入れて置き、サンプル９０μＬを入れて酵素反応させた。さらに他のチューブにＤ．Ｗ ４１０μＬを入れ、サンプル９０μＬを入れ、希釈液の吸光度を測定した。予め準備した酵素反応のチューブと他のチューブとをそれぞれ３７℃水湯煎に入れ、３０分間反応させた後、氷にチューブを挿入して反応を終了させた後、９６ウェルプレートに２００μＬずつ分注して、吸光度５５０ｎｍで測定し、結果値を次のような式に適用して、コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）の酵素活性度を計算した。

酵素活性度＝（酵素反応吸光度値−酵素液希釈液吸光度値）／タンパク質定量値（ブラッドフォード５９５ｎｍ）

１−８．大動脈及び心臓でｍＲＮＡ発現を定量するための逆転写重合酵素連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
全長ＲＮＡを製造社の使用指針によってＴｒｉＺｏｌ試薬を使用して抽出した。相補的なＤＮＡは、Ｐｏｗｅｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを使用して全長ＲＮＡから合成し、アンジオテンシンＩＩタイプＩ受容体（ＡＴ１Ｒ）、内皮一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、ｇｐ９１−ｐｈｏｘ（ＮＡＤＰＨ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、及びＧＡＰＤＨに対する重合酵素連鎖反応は、ＰＣＲ Ｐｒｅｍｉｘキットを使用して行った。

１−９．ウェスタンブロット
タンパク質抽出物のタンパク質含量は、ブラッドフォード法を使用して測定した。抽出されたタンパク質（２０ｕｇ〜３０ｕｇ）を１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にローディングした。ウェスタンブロット分析は、ＡＭＰＫα、リン酸化されたＡＭＰＫα、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αに対する１次抗体を使用して行った。映像は、Ｋｏｄａｋ ＧＢＸ現像機及び固定試薬を使用して手動で得た。

１−１０．統計的分析
血圧の場合、得られた血圧記録の全体を分析した（４週齢ないし８週齢になった３個動物群に対する測定）。血圧数値は、ＡＮＯＶＡを使用して比較し、ｐ数値＜０．０５である場合を有意なものと見なした。連続的変数は、平均±標準偏差（ＳＤ）で記録した。４個群にわたった変数の全般的差値は、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓテストを使用して分析した。２つの群の間の差値は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ−テストを使用して評価した。０．０５未満のｐ−数値は、統計的に有意なものと見なした。あらゆる統計的分析は、ＳＰＳＳ（ｖｅｒ．２０．０；ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して行った。

実施例２：実験結果
２−１．骨格筋／心筋細胞でα１−ＡＲ刺激時に、ＡＭＰＫのリン酸化に対するインビトロ効果
ＡＭＰＫ及びＡＭＰＫリン酸化（活性化）に対するα１−ＡＲ（α１−アドレナリン受容体）刺激効果をインビトロで確認するために、ラット骨格筋細胞株（Ｌ６）とマウス心筋細胞株（ＨＬ１）とにα１−ＡＲ効能剤であるミドドリンを処理した。

その結果、図１の（Ａ）及び図１の（Ｂ）に示すように、骨格筋細胞のＡＭＰＫがα１−ＡＲ刺激によって発現され、リン酸化されたＡＭＰＫ発現がミドドリンの濃度によって増加したので、α１−ＡＲ刺激がＡＭＰＫの活性化に関与するということが分かった。また、ミドドリン投与によるα１−ＡＲ刺激は、骨格筋の以外に心筋細胞でも同じ態様でＡＭＰＫの発現及びリン酸化反応が表われた。

したがって、骨格筋肉でミドドリンが作用して表われる変化（ＡＭＰＫ活性化）が心筋でも、既存に知られた心筋収縮機能向上と共に表わすために（ＡＭＰＫ活性化＋心筋収縮増加）、α１−ＡＲ刺激で追加的な心筋運動効果が表われているということが分かる。すなわち、インビトロ実験で今まで単純に心筋細胞の収縮力のみ増加する可能性のみ知られているが、本実施例では、骨格筋及び心筋細胞でＡＭＰＫ増加及びリン酸化が増加して運動効果関連作用が予想された。

２−２．インビボ動物モデルで心臓機能／体重／血圧に対するα１−ＡＲ効能剤の投与効果
ミドドリン投与時に、インビボ骨格筋でも、ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αが増加するならば、骨格筋で運動効果が既に証明されたＡＭＰＫ−ＰＰＡＲδ−ＰＧＣ１α同時発現カスケードが心筋収縮機能向上に影響を与えると見なすことができるので、前記実施例２−１のインビトロ効果でさらにインビボで心臓機能、体重を確認した。

心臓機能／体重
下記表１に示すように、８週齢ラットのエコー心拍動データから、ミドドリン投与ラットグループＩＩ及びアテノロール投与ラットグループＩＩＩの左心室性能が、未投与対照グループＩＶの当該数値よりもさらに高いと表われた。

また、左心室質量は、グループＩＩで最も低かったが、心臓質量は、グループの間で有意な差異点が観察されず、グループＩＩＩが最も高い体重を示した。

２−３．心筋、骨格筋、大動脈、肝でＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αタンパク質発現
骨格筋でα１−ＡＲの存在を確認するために、基底４週齢対照群ラット（Ｉ）、ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）の骨格筋でα１−ＡＲのタンパク質発現状態をウェスタンブロッティングで確認した結果、図２Ａに示すように、グループＩＶでα１−ＡＲが最も高い発現を示した。

また、心筋、骨格筋、肝でＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αタンパク質の発現状態をそれぞれウェスタンブロッティングで確認した結果、図２Ｂ（心筋）、図２Ｃ（骨格筋）及び図２Ｄ（肝）に示すように、心筋の場合に、リン酸化されたＡＭＰＫタンパク質の発現は、グループＩがグループＩＶよりも高く（ｐ＜０．０５）、ミドドリン処理グループＩＩは、対照群グループＩＶよりも心筋、骨格筋で顕著に高いＡＭＰＫ発現を示したが、アテノロール処理グループＩＩＩは、同じ年齢の対照群グループＩＶと比較する時、当該器官でさらに高いＡＭＰＫタンパク質の発現を示していない。

特異な点は、心筋では、ＡＭＰＫ増加に比べて、ＰＧＣ−１αとＰＰＡＲ−δとの増加が遥かに大きいが、骨格筋では、ＡＭＰＫ増加に比べて、ＰＧＣ−１αとＰＰＡＲ−δとの増加が遥かに少ないという点である。これは、心筋の運動効果が、ＡＭＰＫ活性化と共に直接にＰＧＣ−１αとＰＰＡＲ−δとの発現を増加させるのに対して、骨格筋は、運動を相対的に多くしていなかったために、比較的ＡＭＰＫに比べて、ＰＧＣ−１αとＰＰＡＲ−δとが増加しないということを意味する。

２−４．大動脈及び心臓でアンジオテンシンＩＩ ＡＴ−１受容体、ｅＮＯＳ、ＳＯＤ、ＮＡＤＰＨ、ＴＮＦ−α、ＭＣＰ遺伝子発現
大動脈及び心筋組織で、基底４週齢ラット（Ｉ）、ミドドリン投与したラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）に対して、それぞれ血管収縮、一酸化窒素生成、酸化的ストレス、及び炎症と関連した遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルをノーザンブロットで確認した。

その結果、図３Ａに示すように、大動脈でアンジオテンシンＩＩ ＡＴ１ＲのｍＲＮＡ発現は、２種の対照群（グループＩ及びＩＶ）に比べて、グループＩＩ及びＩＩＩでさらに低かった。また、ｅＮＯＳ発現は、グループＩＩで最も低かったが、他のグループと有意な差異点が観察されていない一方、ＳＯＤ発現は、グループＩＩで最も高かった。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼのｇｐ９１−ｐｈｏｘ（Ｎｏｘ−２）ｍＲＮＡ発現は、グループＩでさらに高かったが、薬物投与とは無関係に、８週齢になった自発性高血圧ラットの間で異ならなかった。ＴＮＦ−α発現は、グループＩＩで最も低く、グループＩＩＩでは中間程度であり、グループＩＶでさらに高く、グループＩで最も高かった。

また、図３Ｂに示すように、心筋でアンジオテンシンＩＩ ＡＴ１ＲのｍＲＮＡ発現は、前記大動脈の結果と同様にグループＩＩで最も低く、グループＩＩＩでは中間程度であった。ｅＮＯＳ発現は、グループの間で差がなく、ＳＯＤは、グループＩＶよりもグループＩＩで顕著にさらに高いレベルに発現された。大動脈（血管）組織とは対照的に、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈオキシダーゼのｇｐ９１−ｐｈｏｘ（Ｎｏｘ−２）ｍＲＮＡ発現は、薬物投与とは無関係に、グループの間に差がなかった。ＴＮＦ−αの心筋発現は、ミドドリン投与に反応して減少しなかった。

２−５．サイトカイン、活性酸素種、アディポネクチン、脂肪プロファイルに及ぼすα１−ＡＲ効能剤の投与効果
ミドドリンの臓器投与が、サイトカイン（ＩＬ、ＴＮＦ−α）、活性酸素種（ＲＯＳ）、アディポネクチン（ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）発現及び脂肪プロファイルに及ぼす効果を確認し、その結果を下記表２に示した。

前記表２に示すように、前炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β及びＩＬ−６）のレベルは、グループの間で有意味な差はなく、ＩＬ−１αレベルは、グループＩよりはグループＩＩでさらに低い一方、グループＩＩＩで顕著に増加し、ＴＮＦ−α発現も、他のグループよりもグループＩＩＩで顕著に増加し、ＩＬ−４及びＩＬ−１０は、他のグループに比べて、グループＩＩＩで少し高かった。

また、活性酸素種（ＲＯＳ）レベルは、ミドドリン投与グループＩＩがアテノロール投与グループＩＩＩ及び未投与８週齢対照群ＩＶに比べてさらに低かったが、このような差は、統計的に有意なレベルはなかった。

また、α１−ＡＲ刺激が如何にＡＭＰＫを活性化させるかを確認するために、ＡＭＰＫの上流分子であるアディポネクチンレベルを測定した結果、グループＩＩが、グループＩＶに比べて、内臓脂肪重量当たり著しく高い血清アディポネクチンレベルを示した。

脂肪プロファイルと関連しては、下記表３に示すように、総コレステロール、ＬＤＬ−コレステロール、ＨＤＬ−コレステロールは、薬物投与群（グループＩＩ及びＩＶ）に比べて、対照群（グループＩ及びＩＶ）でさらに高かったが、トリグリセリドレベルは、グループの間にあまり差がなかった。

２−６．ミトコンドリア酸化酵素の発現変化
ミトコンドリア酸化過程（ＴＣＡ回路）酵素であるコハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）酵素活性度を骨格筋で測定した結果、図４Ａに示すように、ミドドリン投与グループＩＩで最も高く増加するということが分かった。

また、ミトコンドリア電子伝達系酵素であるシトクロムｃオキシダーゼ酵素に対して骨格筋組織で免疫組織化学染色した結果、図４Ｂに示すように、ミドドリン投与グループＩＩで最も高く増加するということが分かった。

このような結果から、ミドドリンが、代謝作用に優れていることが分かる。

２−７．組織ＡＴＰレベルの比較
基底４週齢ラット（Ｉ）、ミドドリン投与したラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢対照群ラット（ＩＶ）に対して、心臓、骨格筋及び肝でＡＴＰレベルをＥＬＩＳＡ方法で測定して比較した。

その結果、図５に示すように、ミドドリンまたはアテノロール処理グループの心臓組織ではＡＴＰレベルが、心臓のさらに高い収縮活性にもかかわらず、対照群ＳＨＲｓの数値よりも高く観察された。

２−８．糖尿病治療の効果
マウス骨格筋細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）でインスリンのブドウ糖吸収に及ぼすミドドリン効果を確認した結果、図６に示すように、インスリン単独よりもインスリンとミドドリンとを併合処理する場合、ブドウ糖吸収率が著しく増加するということを確認したので、ミドドリンが糖尿病治療に有効であるということが分かる。

２−９．肥満治療の効果
脂肪細胞の分化抑制

脂肪前駆細胞（３Ｔ３−Ｌ１）にミドドリンを処理した結果、図７Ａに示すように、脂肪細胞への分化が抑制され（左側下段図）、図７Ｂに示すように、脂肪合成／蓄積を抑制するＰＰＡＲ−δ、ｐ−ＡＭＰＫ、ＰＧＣ−１αタンパク質発現が増加した。

体重及び腹部脂肪の減少

ミドドリン投与ラット（ＩＩ）、アテノロール投与ラット（ＩＩＩ）及び未投与８週齢高血圧対照群ラット（ＩＶ）で、それぞれ体重及び腹部脂肪を比較測定した結果、図８に示すように、ミドドリン投与時に体重と腹部脂肪いずれも減少した。

したがって、このような結果から、ミドドリンが、肥満治療に有効であるということが分かる。

２−１０．炎症治療の効果
大食細胞（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）Ｒａｗ ２６４．７にミドドリンを処理した結果、図９に示すように、ＰＰＡＲ−δ、ＡＭＰＫ−α１、マンノース受容体（ＭＲ）のｍＲＮＡ発現が増加し（Ａ）、ヘキソキナーゼＩＩのタンパク質発現は減少するということ（Ｂ）を確認し、動物実験で脾臓の肩甲下部分に集中されている大食細胞でマンノース受容体の発現が増加した抗炎症性特性を確認した。

このように、炎症関連大食細胞で抗炎症作用があるＭ２表現型受容体に該当するマンノース受容体（ＭＲ）の発現は増加し、逆にＭ１表現型大食細胞で増加するヘキソキナーゼＩＩの発現は減少したために、ミドドリンが、炎症治療に有効であるということが分かる。

実施例３：多様なα１−アドレナリン受容体効能剤の効果確認
本実施例では、α１−ＡＲ効能剤としてミドドリンの以外に、これと類似した化合物を新規合成して、骨格筋細胞でα１−ＡＲ刺激によるＡＭＰＫ活性化、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現誘導を確認することによって、制限されない多様なα１−ＡＲ効能剤が運動類似効果を起こしうるということを検証した。

化合物５：２−アミノ−Ｎ−（２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）−３−フェニルプロパンアミド
化合物７：２−アミノ−Ｎ−（２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）プロパンアミド
化合物８：２−アミノ−Ｎ−（２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）アセトアミド塩酸塩
化合物９：２−アミノ−Ｎ−（２−（５−エチル−２−メトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）アセトアミド塩酸塩
化合物１０：２−アミノ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）アセトアミド塩酸塩

具体的に、分化中であるＣ２Ｃ１２細胞に、下記の化合物を濃度別に（１０ｕＭ、３０ｕＭ、５０ｕＭ）処理した後、ＡＭＰＫの活性型（リン酸化型）であるｐ−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αの発現程度をウェスタンブロットで確認した。

その結果、化合物５の場合、図１０に示すように、中間濃度である３０ｕＭでＡＭＰＫの活性型（リン酸化型）であるｐ−ＡＭＰＫ及びＰＰＡＲ−δの発現が対照群（未処理群）に比べて有意に増加するということを確認した。

また、化合物７の場合、図１１に示すように、ｐ−ＡＭＰＫとＰＰＡＲ−δとのタンパク質発現が濃度依存的に増加する傾向を示し、特に、ｐ−ＡＭＰＫの場合、１０ｕＭ処理群と５０ｕＭ処理群とで対照群と比較して有意に増加し、ＰＰＡＲ−δは、３０ｕＭ処理群で対照群と比較して有意に増加するということを確認した。

また、化合物８の場合、図１２に示すように、ｐ−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αが全体として増加したが、特に、５０ｕＭ濃度でｐ−ＡＭＰＫとＰＧＣ−１αとの発現量が有意に増加するということを確認した。

また、化合物９の場合、図１３に示すように、ｐ−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、ＰＧＣ−１αが全体として増加したが、特に、３０ｕＭ及び５０ｕＭ濃度でｐ−ＡＭＰＫとＰＰＡＲ−δとの発現量が有意に増加するということを確認した。

また、化合物１０の場合、図１４に示すように、ｐ−ＡＭＰＫは、３０ｕＭ及び５０ｕＭ濃度で、そして、ＰＰＡＲ−δは、１０ｕＭ及び５０ｕＭ濃度で、それぞれ有意にタンパク質発現が増加するということを確認した。

以上の結果によれば、α１−ＡＲ効能剤によるα１−ＡＲ刺激は、運動なしにも、骨格筋、肝及び血管に運動類似効果という有益な変化を招き、心臓肥大または血圧上昇を伴わずとも、左心室の拍出係数を向上させ、炎症を減少させ、自発性高血圧ラットの初期生涯のうち、初期高血圧時期に生化学的反応を変化させるということが分かる。これは、直接に刺激された心臓筋肉収縮、心臓運動類似効果、及びＡＭＰＫ活性化と関連する。

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、当業者ならば、本発明の技術的思想や必須的な特徴を変更せずとも、他の具体的な形態に容易に変形が可能であるということを理解できるであろう。したがって、前述した実施例は、あらゆる面で例示的なものであり、限定的ではないということを理解しなければならない。

Claims (9)

1. α１−アドレナリン受容体効能剤（ａｇｏｎｉｓｔ）またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む運動類似効果誘導用組成物であって、
   前記α１−アドレナリン受容体効能剤は、（ＲＳ）−Ｎ−［２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル］グリシンアミドと、２−アミノ−Ｎ−（２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）−３−フェニルプロパンアミドと、２−アミノ−Ｎ−（２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）プロパンアミドと、２−アミノ−Ｎ−（２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）アセトアミド塩酸塩と、２−アミノ−Ｎ−（２−（５−エチル−２−メトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）アセトアミド塩酸塩と、２−アミノ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）アセトアミド塩酸塩と、からなる群から選択される１つ以上の化合物であり、
   前記運動類似効果は、骨格筋細胞の代謝量の増加であり、
   前記運動類似効果は、骨格筋細胞内のミトコンドリアのＴＣＡ（ｔｒｉｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）回路の活性化、及び骨格筋細胞内のミトコンドリアの生合成の増加によって達成されることを特徴とする運動類似効果誘導用組成物。
2. 前記α１−アドレナリン受容体効能剤は、ＡＭＰＫ活性化を誘導することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
3. 前記α１−アドレナリン受容体効能剤は、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現を誘導することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
4. （ａ）インビトロで細胞にα１−アドレナリン受容体効能剤を処理する段階と、
   （ｂ）リン酸化−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、及びＰＧＣ−１αの発現を測定する段階と、
   （ｃ）効能剤未処理群に比べて、前記リン酸化−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現が増加する場合、処理効能剤を薬物として選定する段階と、
   を含む、α１−アドレナリン受容体効能剤を利用した運動類似効果誘導用物質のスクリーニング方法であって、
   前記運動類似効果は、骨格筋細胞の代謝量の増加であることを特徴とするスクリーニング方法。
5. 前記段階（ｂ）で、発現は、ウェスタンブロッティング、抗体免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ、質量分析法、ＲＴ−ＰＣＲ、競争的ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＲＰＡまたはノーザンブロッティングを用いて測定することを特徴とする請求項４に記載のスクリーニング方法。
6. 前記段階（ａ）で、細胞は、骨格筋、心筋、肝、脂肪、及び膵臓からなる群から選択される組織の細胞であることを特徴とする請求項４に記載のスクリーニング方法。
7. α１−アドレナリン受容体効能剤またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む代謝性疾患の予防または治療用薬学的組成物であって、
   前記α１−アドレナリン受容体効能剤は、（ＲＳ）−Ｎ−［２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル］グリシンアミドと、２−アミノ−Ｎ−（２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）−３−フェニルプロパンアミドと、２−アミノ−Ｎ−（２−（２，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）プロパンアミドと、２−アミノ−Ｎ−（２−（３，５−ジメトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）アセトアミド塩酸塩と、２−アミノ−Ｎ−（２−（５−エチル−２−メトキシフェニル）−２−ヒドロキシエチル）アセトアミド塩酸塩と、２−アミノ−Ｎ−（２−ヒドロキシ−２−フェニルエチル）アセトアミド塩酸塩と、からなる群から選択される１つ以上の化合物であり、
   前記代謝性疾患は、高脂血症及び動脈硬化からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とする薬学的組成物。
8. （ａ）インビトロで細胞にα１−アドレナリン受容体効能剤を処理する段階と、
   （ｂ）リン酸化−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ、及びＰＧＣ−１αの発現を測定する段階と、
   （ｃ）効能剤未処理群に比べて、前記リン酸化−ＡＭＰＫ、ＰＰＡＲ−δ及びＰＧＣ−１αの発現が増加する場合、処理効能剤を薬物として選定する段階と、
   を含む、代謝性疾患の予防または治療用薬物のスクリーニング方法であって、
   前記代謝性疾患は、高脂血症及び動脈硬化からなる群から選択される１つ以上であることを特徴とするスクリーニング方法。
9. 前記段階（ａ）で、前記細胞は、骨格筋、肝、脂肪及び膵臓からなる群から選択される組織の細胞であることを特徴とする請求項８に記載の代謝性疾患の予防または治療用薬物のスクリーニング方法。