JP6723980B2 - Colitis suppressant - Google Patents
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Description
本特許出願は、先に出願された日本国特許出願である特願２０１５−０３８３０２号（出願日：２０１５年２月２７日）に基づく優先権の主張を伴うものであり、かかる先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本願発明の開示の一部とされる。 This patent application is accompanied by a claim of priority based on Japanese Patent Application No. 2015-038302 (filing date: February 27, 2015), which was previously filed in Japan. The entire disclosure content of the present invention is made a part of the disclosure of the present invention by reference.
技術分野
本発明は、ラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする大腸炎抑制剤に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a colitis suppressive agent containing a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus as an active ingredient.
背景技術
大腸炎は、大腸におこる炎症性疾患であり、大腸炎には、自己免疫性疾患である炎症性腸疾患、特発性疾患であるベーチェット症、虚血性腸炎、および感染症性腸炎などが含まれる。炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｂｏｗｅｌ Ｄｉｓｅａｓｅ）は、潰瘍性大腸炎とクローン病の２つに大別され、これらは共に日本の特定疾患に指定されている。これらの病因は不明であり、腸内細菌の関与や免疫機能の異常などが病因として考えられている。現在のところ、潰瘍性大腸炎の発症は、日本において、人口１０万人あたり１００人程度と、米国における半分以下であり、クローン病の発症は、日本において、人口１０万人あたり２７人程度と、米国における約１０分の１であるが、将来には、日本においても、生活の欧米化に伴い、炎症性腸疾患の罹患率は増加すると考えられている。 BACKGROUND ART Colitis is an inflammatory disease that occurs in the large intestine. Colitis includes inflammatory bowel disease, which is an autoimmune disease, Behcetosis, ischemic enteritis, and infectious enteritis, which are idiopathic diseases. included. Inflammatory bowel disease is roughly divided into ulcerative colitis and Crohn's disease, both of which are designated as specific diseases in Japan. The etiology of these is unknown, and the involvement of intestinal bacteria and abnormal immune functions are considered as etiological factors. At present, the incidence of ulcerative colitis is about 100 in 100,000 population in Japan and less than half in the United States, and the incidence of Crohn's disease is about 27 in 100,000 population in Japan. Although it is about one-tenth in the United States, it is considered that the prevalence of inflammatory bowel disease will increase in Japan as well as in Westernization in the future.
潰瘍性大腸炎とクローン病では、治療が困難であり、根本的な治療方法は確立されていない。内科療法として、潰瘍性大腸炎には、薬物療法（５−アミノサリチル酸薬（５−ＡＳＡ）などのサルファ剤、プレドニゾロンなどのステロイド剤、免疫調節剤・抑制剤など）が主体的に用いられ、クローン病には、栄養療法・食事療法（完全静脈栄養療法、経腸栄養療法、食餌療法）も併用されている。 Ulcerative colitis and Crohn's disease are difficult to treat, and a fundamental treatment method has not been established. As medical therapy, drug therapy (sulfa drugs such as 5-aminosalicylic acid drug (5-ASA), steroid drugs such as prednisolone, immunomodulators/suppressors, etc.) is mainly used for ulcerative colitis, and cloned. Nutrition and diet (total parenteral nutrition, enteral nutrition, diet) are also used for the disease.
一方、炎症性腸疾患をはじめとする大腸炎では、外的刺激から腸粘膜を保護するために、哺乳動物の腸管で働いている種々の防御機構が破綻することにより発症すると考えられており、腸管保護剤の開発が進められている。例えば、特許文献１：特開２０１０−８３８８１号公報には、ラクトバチルス ブレビス ＳＢＣ８８０３菌株の加熱死菌体の経口投与によって、ＤＳＳ（デキストラン硫酸ナトリウム）により誘発される潰瘍性大腸炎類似の腸管炎症が抑制されたことが報告されている。 On the other hand, in colitis including inflammatory bowel disease, in order to protect the intestinal mucosa from external stimuli, it is believed that various defensive mechanisms working in the intestinal tract of mammals are broken down to develop. Development of an intestinal tract protective agent is in progress. For example, in Patent Document 1: Japanese Unexamined Patent Publication No. 2010-83881, there is an intestinal inflammation similar to ulcerative colitis induced by DSS (sodium dextran sulfate) by oral administration of heat-killed cells of Lactobacillus brevis SBC8803 strain. It has been reported that it was suppressed.
また、特許文献２：特許第５１１６１９４号公報には、ラクトバチルス属細菌のラクトバチルス カゼイ ＹＩＴ９０２９、ラクトバチルス ガッセリ ＹＩＴ０１６８の菌体または菌体由来多糖画分を有効成分とする炎症性腸疾患予防治療剤が報告されている。 In addition, Patent Document 2: Japanese Patent No. 5116194 discloses a prophylactic/therapeutic agent for inflammatory bowel disease containing a bacterial cell or a bacterial cell-derived polysaccharide fraction of Lactobacillus casei YIT9029 and Lactobacillus gasseri YIT0168 belonging to the genus Lactobacillus. Has been reported.
一方で、これらのラクトバチルス属の大腸炎抑制効果は十分ではなく、また特定の菌株が用いられているのみである。このように、日常的に安全に簡単に摂取できる乳酸菌を有効成分とする効果の高い大腸炎抑制剤は報告されていない。 On the other hand, the Lactobacillus genus colitis is not sufficiently effective in suppressing colitis, and only specific strains are used. As described above, a highly effective colitis suppressive agent containing lactic acid bacteria as an active ingredient that can be safely and easily ingested on a daily basis has not been reported.
本発明は、安全で優れた大腸炎抑制効果を有する大腸炎抑制剤およびその製造方法を提供することを目的とする。 It is an object of the present invention to provide a safe and excellent colitis suppressive agent and a method for producing the same.
本発明者らは、今般、インビトロにて共に培養される大腸細胞において、特にヒートショックプロテイン７０の発現増強活性を示すラクトバチルス属乳酸菌が、安全で優れた大腸炎抑制作用を有することを見出した。本発明は、かかる知見に基づくものである。 The present inventors have now found that lactobacilli belonging to the genus Lactobacillus, which exhibit a heat shock protein 70 expression-enhancing activity, have a safe and excellent suppressive effect on colitis in colon cells co-cultured in vitro. .. The present invention is based on such findings.
本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）大腸細胞におけるヒートショックプロテイン（ＨＳＰ）７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする、大腸炎抑制剤。
（２）ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）である、（１）に記載の大腸炎抑制剤。
（３）ラクトバチルス属乳酸菌が、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株、およびラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株から選択されるものである、（１）または（２）に記載の大腸炎抑制剤。
（４）ラクトバチルス属乳酸菌が、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞のそれと比較して１．５倍以上に増加させることができる、（１）〜（３）のいずれかに記載の大腸炎抑制剤。
（５）大腸炎が炎症性腸疾患である、（１）〜（４）のいずれかに記載の大腸炎抑制剤。
（６）炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎である、（５）に記載の大腸炎抑制剤。
（７）便性を改善するための、（１）〜（６）のいずれかに記載の大腸炎抑制剤。
（８）大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を含有させることを特徴とする、大腸炎抑制剤の製造方法。
（９）大腸炎抑制剤の製造における、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用。
（１０）大腸炎を抑制するための、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用。
（１１）大腸炎を抑制するための、ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌。
（１２）大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、それを必要とする対象に摂取させることを含んでなる、大腸炎の抑制方法。According to the present invention, the following inventions are provided.
(1) An agent for suppressing colitis, which comprises a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus having an activity of enhancing expression of heat shock protein (HSP) 70 in colon cells as an active ingredient.
(2) The colitis inhibitor according to (1), wherein the lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus is Lactobacillus johnsonii.
(3) The colitis suppressive agent according to (1) or (2), wherein the lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus is selected from Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain, Lactobacillus johnsonii OLL204255 strain, and Lactobacillus johnsonii OLL2978 strain.
(4) Lactobacillus lactic acid bacteria increase the expression level of HSP70 in colon cells co-cultured in vitro by 1.5 times or more as compared with that of colon cells cultured without the addition of Lactobacillus lactic acid bacteria. The colitis inhibitor according to any one of (1) to (3), which can be increased.
(5) The colitis inhibitor according to any one of (1) to (4), wherein the colitis is an inflammatory bowel disease.
(6) The colitis suppressive agent according to (5), wherein the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis.
(7) The colitis suppressive agent according to any one of (1) to (6), for improving fecal properties.
(8) A method for producing an agent for suppressing colitis, which comprises containing a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus having an activity of enhancing HSP70 expression in colon cells.
(9) Use of a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus having an activity of enhancing expression of HSP70 in the production of an agent for suppressing colitis.
(10) Use of a lactobacillus of the genus Lactobacillus having an activity of enhancing expression of HSP70 for suppressing colitis.
(11) A lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus, which has an activity of enhancing expression of HSP70 for suppressing colitis.
(12) A method for suppressing colitis, which comprises ingesting an effective amount of a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus having an activity of enhancing expression of HSP70 in colon cells to a subject in need thereof.
本発明の大腸炎抑制剤によれば、大腸炎、特に炎症性腸疾患を効果的に抑制することができる。本発明の大腸炎抑制剤は、ラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とすることから、大腸炎を安全に抑制し、かつ便性を改善する上で有利に利用することができる。 The agent for suppressing colitis of the present invention can effectively suppress colitis, particularly inflammatory bowel disease. Since the colitis suppressive agent of the present invention contains lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus as an active ingredient, it can be advantageously used for safely suppressing colitis and improving fecal properties.
大腸炎抑制剤
本発明の大腸炎抑制剤は、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とすることを特徴としている。ＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌が、顕著な大腸炎抑制作用を有することは意外な事実である。 Colitis suppressive agent The colitis suppressive agent of the present invention is characterized by containing a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus, which has an activity of enhancing expression of HSP70 in colon cells. It is a surprising fact that lactobacilli belonging to the genus Lactobacillus, which have an activity of enhancing the expression of HSP70, have a remarkable suppressive effect on colitis.
ＨＳＰ７０は、熱や紫外線などにより発現が誘導されるタンパク質の１種であり、例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質である。また、ＨＳＰ７０は、ＨＳＰＡ１Ａ（エイチエスピーエーワンエー）がコードするタンパク質であり、ＨＳＰＡ１Ａの遺伝子配列は、例えば、配列番号２を参照することで特定できる。よって、本発明の大腸炎抑制剤は、大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とすることを特徴としてもよい。 HSP70 is a kind of protein whose expression is induced by heat, ultraviolet rays, etc., and is, for example, a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. HSP70 is a protein encoded by HSPA1A (HSPA1A), and the gene sequence of HSPA1A can be identified by referring to SEQ ID NO: 2, for example. Therefore, the colitis suppressive agent of the present invention may be characterized by using a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus having an activity of enhancing expression of HSPA1A in colon cells as an active ingredient.
ラクトバチルス属乳酸菌におけるＨＳＰ７０の発現増強活性の有無は、本願明細書の実施例の例１（インビトロ試験）の記載の通り、ＨＳＰ７０をコードするＨＳＰＡ１Ａの発現量を指標とした比較試験により判定することができる。かかる比較試験では、ラクトバチルス属乳酸菌と共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量が、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量と比較して高い場合、ラクトバチルス属乳酸菌はＨＳＰ７０の発現増強活性を有するものとされる。 The presence or absence of HSP70 expression-enhancing activity in Lactobacillus lactobacillus can be determined by a comparative test using the expression level of HSPA1A encoding HSP70 as an index, as described in Example 1 (in vitro test) of the examples of the present specification. You can In such a comparative test, when the expression amount of HSPA1A in the colon cells cultured with Lactobacillus lactic acid bacteria is higher than the expression amount of HSPA1A in the colon cells cultured without adding the Lactobacillus lactic acid bacteria, Lactobacillus Lactic acid bacteria of the genus are considered to have HSP70 expression enhancing activity.
ＨＳＰＡ１Ａの発現量は、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、大腸細胞におけるハウスキーピング遺伝子（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ））の発現量を基準として算出することができる。 The expression level of HSPA1A can be calculated based on the expression level of the housekeeping gene (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)) in colon cells as described in Example 1 of the present specification. it can.
本発明の好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量と比較して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．７倍以上、さらに好ましくは１．８倍以上、さらに好ましくは１．９倍以上、さらに好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは３．０倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、さらにより好ましくは４．０倍以上に増加させることができる。 According to a preferred embodiment of the present invention, the Lactobacillus lactic acid bacterium has the same expression level of HSP70 in the large intestine cells co-cultured in vitro as the expression amount of HSP70 in the large intestine cells cultured without the addition of the lactobacillus lactic acid bacterium. Compared with, preferably 1.5 times or more, more preferably 1.7 times or more, further preferably 1.8 times or more, further preferably 1.9 times or more, further preferably 2.0 times or more, It can be increased to preferably 2.5 times or more, more preferably 3.0 times or more, further preferably 3.5 times or more, and still more preferably 4.0 times or more.
本発明の好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量を、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量と比較して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．７倍以上、さらに好ましくは１．８倍以上、さらに好ましくは１．９倍以上、さらに好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは３．０倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、さらにより好ましくは４．０倍以上に増加させることができる。 According to a preferred aspect of the present invention, the Lactobacillus lactic acid bacterium has an expression level of HSPA1A in the large intestine cells co-cultured in vitro, and an expression amount of HSPA1A in the large intestine cells cultured without the addition of the Lactobacillus lactic acid bacterium. Compared with, preferably 1.5 times or more, more preferably 1.7 times or more, further preferably 1.8 times or more, further preferably 1.9 times or more, further preferably 2.0 times or more, It can be increased to preferably 2.5 times or more, more preferably 3.0 times or more, further preferably 3.5 times or more, and still more preferably 4.0 times or more.
本発明のより好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、インビトロにて共に培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量（ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現量で割ることによって、実験群間のばらつきを補正した値）が、前記ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰＡ１Ａの発現量（ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）の発現量で割ることによって、実験群間のばらつきを補正した値）と比較して、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは１．７倍倍以上、さらに好ましく１．８倍以上、さらに好ましくは１．９倍以上、さらに好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上、さらに好ましくは、３．０倍以上、さらに好ましくは３．５倍以上、さらにより好ましくは４．０倍以上に増加させることができる。 According to a more preferred embodiment of the present invention, the Lactobacillus lactic acid bacterium has an expression level of HSPA1A in a large intestine co-cultured in vitro (divided by an expression level of a housekeeping gene (GAPDH) to obtain variation among experimental groups). Is a value obtained by dividing the expression level of HSPA1A (the expression level of the housekeeping gene (GAPDH)) in the colon cells cultured without adding the lactobacillus of Lactobacillus, thereby correcting the variation between the experimental groups. ), preferably 1.5 times or more, more preferably 1.7 times or more, further preferably 1.8 times or more, further preferably 1.9 times or more, further preferably 2.0 times or more, It can be increased to more preferably 2.5 times or more, further preferably 3.0 times or more, further preferably 3.5 times or more, still more preferably 4.0 times or more.
ＨＳＰ７０の発現増強活性の測定に用いられる大腸細胞は、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、Ｃａｃｏ−２細胞が好ましい。 As the large intestine cells used for measuring the HSP70 expression enhancing activity, Caco-2 cells are preferable as described in Example 1 of the present specification.
本発明のより好ましい態様によれば、ラクトバチルス属乳酸菌は、例えば、ラクトバチルス ジョンソニ、ラクトバチルス カゼイ、ラクトバチルス ガッセリ、ラクトバチルス ヘルベティカスなどであり、好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）である。そして、ラクトバチルス属乳酸菌は、好ましくは、生菌体であり、これを摂取することにより、腸内環境が改善され、排便の回数、便の量、その形、色あるいは臭いなどの便性を改善することができる。 According to a more preferred embodiment of the present invention, the lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus is, for example, Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus casei, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus helveticus, or the like, preferably Lactobacillus johnsonii (L. johnsonii). .. The lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus is preferably a live bacterium, and by ingesting this, the intestinal environment is improved, and the number of stools, the amount of stool, its shape, its stool properties such as its color and odor can be improved. Can be improved.
ラクトバチルス ジョンソニは、グラム陽性の桿菌であり、ホモ乳酸発酵の形式、好気的条件にて発育性を有する。そして、ラクトバチルス ジョンソニは、ＭＲＳ寒天培地（ＢＤ）平板上に、それを塗布し、アネロパック・ケンキ（三菱ガス化学）を用いた嫌気的条件にて３７℃、４８時間で培養すると、円形、白色、扁平状コロニーを形成する。また、ラクトバチルス ジョンソニは、大腸炎を効果的に抑制する上で、特に有利に使用することができる。 Lactobacillus johnsonii is a gram-positive bacillus, and has the ability to grow in the form of homolactic fermentation and under aerobic conditions. Then, Lactobacillus johnsonii was coated on an MRS agar medium (BD) plate, and cultured at 37° C. for 48 hours under anaerobic conditions using Aneropack Kenki (Mitsubishi Gas Chemical Co., Ltd.) to give a round, white color. , Form flat colonies. In addition, Lactobacillus johnsonii can be used particularly advantageously in effectively suppressing colitis.
ラクトバチルス ジョンソニは、好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株であり、より好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株、さらに好ましくは、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株である。これらは１種類の単独のものを有効成分として用いてもよいし、２種類以上を混合したものを有効成分として用いてもよい。 The Lactobacillus johnsonii is preferably Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain, Lactobacillus johnsonii OLL204255 strain, Lactobacillus johnsonii OLL2978 strain, more preferably Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain, Lactobacillus johnsonii OLL20325 and further LOL20525, and LOL20525. Johnsoni OLL203565 strain. One of these may be used alone as an active ingredient, or a mixture of two or more may be used as an active ingredient.
ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株は、２０１５年２月３日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−０２００３（識別の表示：Lactobacillus johnsonii OLL203565）として寄託されている。 The Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain was established on February 3, 2015 at the Patent Microorganism Depositary Center of the Institute for Product Evaluation Technology, Incorporated Administrative Agency (2-5-8 122 Kazusa Kama feet, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818). The deposit number is deposited as NITE BP-0203 (indication of identification: Lactobacillus johnsonii OLL203565).
ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株は、２０１５年２月３日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−０２００４（識別の表示：Lactobacillus johnsonii OLL204255）として寄託されている。 The Lactobacillus johnsoni OLL204255 strain was established on February 3, 2015 at the Japan Patent Evaluation Microorganisms Depositary Center for Product Evaluation Technology (Institute of Industrial Science and Technology) (2-5-8122, Kazusa Kama feet, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818). The deposit number is deposited as NITE BP-02004 (indication of identification: Lactobacillus johnsonii OLL204255).
ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株は、２０１５年２月３日付けで、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室）に、受託番号がＮＩＴＥ ＢＰ−０２００２（識別の表示：Lactobacillus johnsonii OLL2978）として寄託されている。 The Lactobacillus johnsoni OLL2978 strain was established on February 3, 2015 at the Patent Microorganism Depositary Center, National Institute of Technology and Evaluation, Institute for Product Evaluation Technology (2-5-8 122 Kazusa Kama feet, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818). The deposit number is deposited as NITE BP-0202 (indication of identification: Lactobacillus johnsonii OLL2978).
本発明の大腸炎抑制剤は、ラクトバチルス属乳酸菌をそのまま用いてもよく、ラクトバチルス属乳酸菌と共に経口上で許容可能な他の成分を併用してもよい。 As the colitis suppressor of the present invention, Lactobacillus lactic acid bacteria may be used as they are, or other orally acceptable components may be used in combination with Lactobacillus lactic acid bacteria.
経口上で許容可能な他の成分は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤等の添加剤や、内科療法用の薬剤などである。 Other orally acceptable components are not particularly limited as long as they do not impair the effects of the present invention, and examples thereof include excipients, stabilizers, preservatives, wetting agents, emulsifiers, lubricants, sweeteners, and coloring agents. It is an additive such as a fragrance, a fragrance, a buffering agent, an antioxidant, a pH adjusting agent, or a medicine for medical therapy.
本発明の大腸炎抑制剤の形態は、特に制限されず、粉末状、錠剤状、カプセル状またはドリンク剤状であってよい。 The form of the agent for suppressing colitis of the present invention is not particularly limited, and may be powder, tablet, capsule or drink.
本発明の大腸炎抑制剤の形態は、ラクトバチルス属乳酸菌が大腸炎の抑制のための有効量となるように、１回の摂取量の単位から構成されることが好ましい。本発明の大腸炎抑制剤の１回の摂取量の単位は、ラクトバチルス属乳酸菌を、１×１０７〜１×１０９ＣＦＵ／ｍｌで、１００ｍｌ以上で含有することが好ましく、２００ｍｌ以上で含有することがより好ましい。The form of the colitis suppressive agent of the present invention is preferably composed of a unit of a single intake so that the lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus becomes an effective amount for suppressing colitis. The unit of a single dose of the colitis suppressive agent of the present invention is 1×10 7 to 1×10 9 CFU/ml of lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus, preferably 100 ml or more, and preferably 200 ml or more. More preferably.
本発明の大腸炎抑制剤の形態は、１回の摂取量当たりの単位で包装されて提供されることが好ましい。本発明の大腸炎抑制剤の１回の摂取量当たりの単位包装の形態は、ソフトパック、プラスチック容器などの包材で、一定量を規定する形態が挙げられ、それら包材などの表面には、１回の摂取量当たりの成分表示や、大腸炎の抑制などの用途表示を付していてもよい。かかる単位包装の形態は、サプリメント、医薬製剤などを好適に例示できる。 The form of the colitis suppressive agent of the present invention is preferably packaged and provided in a unit of one intake. The form of the unit package of the colitis suppressive agent of the present invention per intake amount is a packaging material such as a soft pack or a plastic container, and a certain amount of the packaging material may be specified. It may be labeled with a component per intake or indication of use such as suppression of colitis. Suitable forms of such unit packaging include supplements and pharmaceutical preparations.
本発明の大腸炎抑制剤の形態は、徐放性製剤にしてもよい。本発明の大腸炎抑制剤の形態を徐放性製剤にすることは、ラクトバチルス属乳酸菌が経口摂取されてから、それらを生きたままで大腸細胞に到達させる上で好ましい。 The form of the colitis inhibitor of the present invention may be a sustained release preparation. It is preferable to make the form of the colitis suppressive agent of the present invention into a sustained-release preparation in order to allow the lactobacillus of the genus Lactobacillus to be orally ingested and reach the colon cells alive.
本発明の大腸炎抑制剤は、ラクトバチルス属乳酸菌を、所望により経口上許容な他の成分と共に混合して簡易に製造することができる。したがって、本発明の別の態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を含有させることを特徴とする、大腸炎抑制剤の製造方法が提供される。 The colitis suppressive agent of the present invention can be easily produced by mixing Lactobacillus lactic acid bacteria with other orally acceptable components, if desired. Therefore, according to another aspect of the present invention, there is provided a method for producing an agent for suppressing colitis, which comprises containing a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus having an activity of enhancing HSP70 expression in colon cells.
本発明の製造方法は、ラクトバチルス属乳酸菌と大腸細胞を共にインビトロにて培養し、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量が、予め設定した閾値よりも高いラクトバチルス属乳酸菌を選択する工程を含んでいてもよい。 The production method of the present invention comprises a step of culturing Lactobacillus lactic acid bacteria and large intestine cells together in vitro, and selecting a Lactobacillus lactic acid bacterium in which the expression level of HSP70 in large intestine cells is higher than a preset threshold value. Good.
前記の選択する工程において、ＨＳＰ７０の発現量を測定する方法は、特に制限されず、ＨＳＰ７０の発現量を直接的または間接的に測定する手法を用いることができる。かかる測定方法として、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロット、ＲＮＡシークエンシングなどが挙げられる。 In the step of selecting, the method for measuring the expression level of HSP70 is not particularly limited, and a method of directly or indirectly measuring the expression level of HSP70 can be used. Examples of such measurement methods include real-time PCR, Northern blot, RNA sequencing and the like.
また、前記の選択する工程において、予め設定した閾値は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、例えば、ラクトバチルス属乳酸菌を添加しないで培養される大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現量とすることができる。かかるＨＳＰ７０の発現量の閾値は、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、ＨＳＰＡ１Ａの発現量を指標として測定してもよい。さらに、ＨＳＰＡ１Ａの発現量は、大腸細胞におけるハウスキーピング遺伝子の発現量を基準として算出してもよい。かかるハウスキーピング遺伝子として、例えば、本願明細書の実施例の例１に記載の通り、ＧＡＰＤＨを用いることが好ましいが、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（ＨＰＲＴ１）、ベータアクチン（ＡＣＴＢ）などを用いてもよい。 Further, in the step of selecting, the preset threshold value is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and for example, the expression level of HSP70 in colon cells cultured without adding Lactobacillus lactic acid bacteria, can do. The threshold value of the expression level of HSP70 may be measured using the expression level of HSPA1A as an index, as described in Example 1 of the present specification. Furthermore, the expression level of HSPA1A may be calculated based on the expression level of the housekeeping gene in colon cells. As such a housekeeping gene, for example, GAPDH is preferably used as described in Example 1 of the present specification, but hypoxanthine phosphoribosyl transferase 1 (HPRT1), beta actin (ACTB) and the like may also be used. Good.
さらに、前記の選択する工程において、ラクトバチルス属乳酸菌と大腸細胞を共に培養する方法は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、当業者であれば適宜設定することができる。かかる培養条件（温度、培地、培養時間）として、例えば、大腸細胞がＣａｃｏ−２細胞である場合、３７℃、高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地、ＣＯ２環境下で、２４時間が挙げられる。Furthermore, the method of culturing Lactobacillus lactic acid bacteria and large intestine cells together in the above-mentioned step is not particularly limited as long as the effects of the present invention are not impaired, and those skilled in the art can appropriately set. Such culture conditions (temperature, medium, culture time) include, for example, when the colon cells are Caco-2 cells, 37° C., high glucose Dulbecco's modified Eagle medium, and CO 2 environment for 24 hours.
本発明の別の態様によれば、本発明の大腸炎抑制剤では、大腸炎抑制剤を含んでなる組成物を提供することができる。すなわち、本発明の大腸炎抑制剤では、そのまま単独で使用することもできるが、大腸炎抑制機能が発揮される限りにおいて、食品や医薬品などの種々の経口摂取用（経口投与用）の組成物に対して、原料（素材）や添加剤などとして含ませることもでき、大腸炎抑制効果を有する組成物を得ることができる。よって、本発明の一つの実施態様によれば、本発明の大腸炎抑制剤を含んでなる組成物が提供される。 According to another aspect of the present invention, the colitis inhibitor of the present invention can provide a composition comprising the colitis inhibitor. That is, the colitis suppressive agent of the present invention can be used alone as it is, but as long as the colitis suppressing function is exhibited, various oral ingestion (oral administration) compositions such as foods and pharmaceuticals On the other hand, it can be contained as a raw material (material) or an additive, etc., and a composition having an effect of suppressing colitis can be obtained. Therefore, according to one embodiment of the present invention, there is provided a composition comprising the colitis inhibitor of the present invention.
本発明の一つの態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする組成物を提供することができる。本発明の組成物は、食品組成物または医薬組成物であってよい。かかる態様は、上述した大腸炎抑制剤の記載に準じて実施することができる。 According to one aspect of the present invention, it is possible to provide a composition containing a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus having an activity of enhancing HSP70 expression in colon cells as an active ingredient. The composition of the present invention may be a food composition or a pharmaceutical composition. Such an aspect can be carried out according to the description of the colitis suppressive agent described above.
食品組成物とは、医薬組成物以外のものであって、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、固体成形物など、経口摂取可能な形態であればよく特に限定されない。具体的には、例えば、即席麺、レトルト食品、缶詰、電子レンジ食品、即席スープ・みそ汁類、フリーズドライ食品などの即席食品類；清涼飲料、果汁飲料、野菜飲料、豆乳飲料、コーヒー飲料、茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、アルコール飲料などの飲料類；パン、パスタ、麺、ケーキミックス、パン粉などの小麦粉製品；飴、キャラメル、チューイングガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、デザート菓子などの菓子類；ソース、トマト加工調味料、風味調味料、調理ミックス、たれ類、ドレッシング類、つゆ類、カレー・シチューの素類などの調味料；加工油脂、バター、マーガリン、マヨネーズなどの油脂類；乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料、アイスクリーム類、クリーム類などの乳製品；農産缶詰、ジャム・マーマレード類、シリアルなどの農産加工品；冷凍食品などが挙げられる。好ましくは、食品は、乳製品であり、より好ましくは乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料またはアイスクリーム類である。 The food composition is not limited to a pharmaceutical composition, and is not particularly limited as long as it is an orally ingestible form such as a solution, a suspension, an emulsion, a powder, and a solid molded product. Specifically, for example, instant noodles, retort foods, canned foods, microwave foods, instant soups, miso soups, freeze-dried foods and other instant foods; soft drinks, fruit juice drinks, vegetable drinks, soy milk drinks, coffee drinks, tea Beverages such as beverages, powdered beverages, concentrated beverages, alcoholic beverages; bread products such as bread, pasta, noodles, cake mix, and bread crumbs; candy, caramel, chewing gum, chocolate, cookies, biscuits, cakes, pies, snacks, crackers, Confectioneries such as Japanese sweets and desserts; sauces, tomato processing seasoning, flavor seasoning, cooking mix, seasonings such as sauces, dressings, sauces, curry and stew bases; processed oils and fats, butter, margarine, Fats and oils such as mayonnaise; dairy products such as milk drinks, yogurt, lactic acid bacteria drinks, ice creams and creams; canned agricultural products, processed agricultural products such as jams and marmalades, cereals; frozen foods and the like. Preferably, the food product is a dairy product, more preferably a milk drink, yogurt, lactic acid bacteria drink or ice cream.
また食品には、健康食品（サプリメント含む）、機能性食品、栄養補助食品、機能性表示食品、特定保健用食品、病者用食品、乳幼児用調整粉乳、妊産婦もしくは授乳婦用粉乳、または疾病リスク低減表示を付した食品のような分類のものも包含される。 In addition, foods include health foods (including supplements), functional foods, dietary supplements, foods with functional claims, foods for specified health uses, foods for the sick, infant formula, milk powders for pregnant or lactating women, or disease risk. Also included are food items with reduced labeling.
本発明の好ましい態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌を有効成分とする、大腸炎抑制用乳製品、好ましくは大腸炎抑制用乳飲料、ヨーグルト類、乳酸菌飲料またはアイスクリーム類が提供される。かかる態様は、上述した大腸炎抑制剤の記載に準じて実施することができる。 According to a preferred embodiment of the present invention, a lactobacillus lactic acid bacterium having an activity of enhancing expression of HSP70 in colon cells is used as an active ingredient, and a dairy product for suppressing colitis, preferably a milk drink for suppressing colitis, yogurt, a lactic acid bacterium drink. Or ice cream is provided. Such an aspect can be carried out according to the description of the colitis suppressive agent described above.
医薬組成物とは、製剤化のために許容されうる添加剤を併用して、常法に従い、経口製剤または非経口製剤として調製したものである。経口製剤の場合には、錠剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、徐放剤などの固形製剤、溶液、懸濁液、乳濁液などの液状製剤の形態をとることができる。また、非経口製剤の場合には、注射剤や座剤の形態をとることができる。簡易性の点からは、経口製剤であることが好ましい。製剤化のために許容されうる添加剤としては、例えば、賦形剤、安定剤、防腐剤、湿潤剤、乳化剤、滑沢剤、甘味料、着色料、香料、緩衝剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤などが挙げられる。本発明の医薬組成物には、大腸炎の抑制を必要とする疾患、例えば、炎症性腸疾患、ベーチェット症、虚血性腸炎および感染症性腸炎のための医薬組成物、より具体的には予防用組成物および治療用組成物が含まれる。 The pharmaceutical composition is a preparation prepared as an oral preparation or a parenteral preparation according to a conventional method in combination with an additive acceptable for formulation. In the case of oral preparations, it should take the form of solid preparations such as tablets, powders, fine granules, granules, capsules, pills, sustained-release preparations, and liquid preparations such as solutions, suspensions and emulsions. You can Further, in the case of a parenteral preparation, it can be in the form of an injection or a suppository. From the viewpoint of simplicity, an oral preparation is preferable. Acceptable additives for formulation include, for example, excipients, stabilizers, preservatives, wetting agents, emulsifiers, lubricants, sweeteners, colorants, flavors, buffers, antioxidants, pH. Examples include regulators. The pharmaceutical composition of the present invention includes a pharmaceutical composition for diseases requiring suppression of colitis, for example, inflammatory bowel disease, Behcet's disease, ischemic enteritis and infectious enteritis, more specifically, prevention. And therapeutic compositions are included.
また、本発明の別の態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、それを必要とする対象に摂取させることを含んでなる、大腸炎の抑制方法が提供される。ここで、「抑制」には、確立された病態を治療することだけでなく、将来に確立される可能性がある病態を予防する概念も含まれる。さらに本発明の「抑制」には、非治療的な概念、例えば、大腸における炎症に起因または関連する症状または状態の改善または緩和も含まれる。したがって、別の態様によれば、大腸炎の抑制は、大腸における炎症に起因または関連する症状または状態の改善または緩和であり、好ましくは非治療的である。 Further, according to another aspect of the present invention, suppression of colitis, which comprises ingesting an effective amount of Lactobacillus lactobacillus having an activity of enhancing expression of HSP70 in colon cells to a subject in need thereof A method is provided. Here, “suppression” includes not only the treatment of established pathological conditions, but also the concept of preventing pathological conditions that may be established in the future. In addition, "inhibition" according to the present invention also includes non-therapeutic concepts such as amelioration or alleviation of symptoms or conditions caused by or associated with inflammation in the large intestine. Thus, according to another aspect, suppression of colitis is an amelioration or alleviation of symptoms or conditions caused by or associated with inflammation in the large intestine, preferably non-therapeutic.
大腸炎の抑制方法は、ラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、上述した大腸炎抑制剤における１回の摂取量の単位と同様に設定や調整することができる。 In the method for suppressing colitis, the effective amount of lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus can be set or adjusted in the same manner as the unit of the intake amount of the above-mentioned agent for suppressing colitis.
ラクトバチルス属乳酸菌の有効量を、それを必要とする対象に摂取させる方法は、本発明の効果を妨げない限り、特に限定されず、例えば、経口摂取や経腸摂取などであり、好ましくは経口摂取である。 A method of ingesting an effective amount of Lactobacillus lactic acid bacteria to a subject in need thereof is not particularly limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and is, for example, oral intake or enteral intake, and preferably oral. Ingestion.
本発明のラクトバチルス属乳酸菌の摂取計画は、特に限定されず、対象の年齢、性別、症状および状態に応じて、当業者が適宜設定することができる。本発明の対象に対して、１回の経口摂取量の単位を、例えば、１日当たり１〜１０回で投与してもよいが、好ましくは、１日当たり１〜３回で投与することであり、より好ましくは、１日当たり１回で投与することである。また、本発明の大腸炎抑制剤は、食事とともに摂取することができる。 The lactobacillus lactic acid bacterium intake plan of the present invention is not particularly limited and can be appropriately set by those skilled in the art according to the age, sex, symptoms and condition of the subject. For the subject of the present invention, one unit of oral intake may be administered, for example, 1 to 10 times per day, but preferably 1 to 3 times per day, More preferably, it is administered once a day. Moreover, the colitis suppressive agent of the present invention can be taken with meals.
本発明の大腸炎として、例えば、炎症性腸疾患、ベーチェット症、虚血性腸炎および感染症性腸炎であり、好ましくは、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎、クローン病）であり、より好ましくは、潰瘍性大腸炎である。 Examples of the colitis of the present invention include, for example, inflammatory bowel disease, Behcet's disease, ischemic enteritis and infectious enteritis, preferably inflammatory bowel disease (ulcerative colitis, Crohn's disease), and more preferably , Ulcerative colitis.
本発明の対象として、哺乳動物、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、霊長類、ヒトであり、好ましくは、ヒトであり、より好ましくは、大腸炎を患う患者である。また、本発明の対象は、健常者であってもよい。かかる健常者の例としては、大腸炎を患う患者と診断されないものの、大腸における炎症に起因または関連する症状または状態を有するか、あるいはそれらの症状または状態を生じる恐れのある者であることが好ましい。なお、大腸炎を患う患者か否かは、例えば、潰瘍性大腸炎は、Katsuyoshi Matsuoka and Tsung-Chun Lee, Guidelines for the Management of ulcerative colitis in Japan, IBP Research 4: 189-239, 2010（特に（１４）頁の２、（１６）頁の図１参照）等、クローン病は、Fumiaki Ueno et. al. Evidence-based clinical practice guidelines for Crohn's disease, integrated with formal consensus of experts in Japan, J Gastroenterol (2013) 48: 31-72（特に３８頁のＩＩ、４３頁のＩＩ−８、４４頁の表５参照）等、公知の診断方法に基づき診断することができる。 The subject of the present invention is mammals such as rodents, dogs, cats, cows, primates, and humans, preferably humans, and more preferably patients suffering from colitis. Further, the subject of the present invention may be a healthy person. An example of such a healthy person is preferably a person who is not diagnosed with a patient suffering from colitis but has symptoms or conditions caused by or related to inflammation in the large intestine, or who may have those symptoms or conditions. .. Whether or not the patient suffers from colitis, for example, ulcerative colitis, Katsuyoshi Matsuoka and Tsung-Chun Lee, Guidelines for the Management of ulcerative colitis in Japan, IBP Research 4: 189-239, 2010 (especially ( 14), page 2 and (1) on page (16)), etc., Fumiaki Ueno et. al. Evidence-based clinical practice guidelines for Crohn's disease, integrated with formal consensus of experts in Japan, J Gastroenterol (2013 ) 48: 31-72 (particularly II on page 38, II-8 on page 43, and Table 5 on page 44).
本発明の一つの態様によれば、大腸炎抑制剤の製造における、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の使用が提供される。また、本発明の一つの態様によれば、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌の、大腸炎を抑制するための使用が提供される。本発明の好ましい一つの態様によれば、該使用は、非治療的使用である。かかる使用は、上述した大腸炎抑制剤および大腸炎の抑制方法の記載に準じて実施することができる。 According to one aspect of the present invention, there is provided use of a lactic acid bacterium belonging to the genus Lactobacillus having an activity of enhancing expression of HSP70 in colon cells in the production of a colitis inhibitor. Also, according to one aspect of the present invention, there is provided use of a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus, which has an activity of enhancing HSP70 expression in colon cells, for suppressing colitis. According to one preferred aspect of the invention, the use is a non-therapeutic use. Such use can be carried out according to the description of the colitis suppressive agent and the method for suppressing colitis described above.
本発明の一つの態様によれば、大腸炎を抑制するための、大腸細胞におけるＨＳＰ７０の発現増強活性を有するラクトバチルス属乳酸菌が提供される。かかる態様は、上述した大腸炎抑制剤の記載に準じて実施することができる。 According to one aspect of the present invention, there is provided a lactic acid bacterium of the genus Lactobacillus having an activity of enhancing HSP70 expression in colon cells for suppressing colitis. Such an aspect can be carried out according to the description of the colitis suppressive agent described above.
本発明を以下の例によって詳細に説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。 The present invention is explained in detail by the following examples, but the present invention is not limited thereto.
例１：ＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現誘導試験（インビトロ試験）
（１）生菌懸濁液とＣａｃｏ−２細胞の調製
ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２９７８株、ラクトバチルス ジョンソニＯＬＬ２０３５６５株、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株を、Ｄｉｆｃｏ（商標）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ ＭＲＳ ｂｒｏｔｈ培地（ＢＤ）を用いて、３７℃、嫌気条件下にて１回の継代で培養した。そして、各菌を遠心分離処理（８，０００ｒｐｍ、５分間）して沈殿させ、リン酸緩衝液（ＰＢＳ、 Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した後に、分光光度計（Ｕ−２８１０ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ， ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて、波長６５０ｎｍで濁度（ＯＤ）を測定した。ここで、ＰＢＳは、ＰＢＳ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔｓ）タブレット（ＴａＫａＲａ社）を蒸留水に溶解して調製した。その後に、ＰＢＳを用いて、各菌がＯＤ＝５となるように調整し、生菌懸濁液を調製した。 Example 1: HSPA1A gene expression induction test (in vitro test)
(1) Preparation of live bacterial suspension and Caco-2 cells Lactobacillus johnsonii OLL2978 strain, Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain, Lactobacillus johnsonii OLL204255 strain, and Difco (trademark) Lactobacilli MRS broth medium (BD) 37 The cells were cultured at 1°C under anaerobic conditions at ℃. Then, each bacterium was centrifuged (8,000 rpm, 5 minutes) to be precipitated, washed with a phosphate buffer (PBS, Phosphate Buffered Saline), and then using a spectrophotometer (U-2810 Spectrophotometer, HITACHI). Then, the turbidity (OD) was measured at a wavelength of 650 nm. Here, PBS was prepared by dissolving PBS (Phosphate Buffered Salts) tablets (TaKaRa) in distilled water. Thereafter, PBS was used to adjust each bacterium to OD=5, and a viable cell suspension was prepared.
ヒト結腸癌由来細胞であるＣａｃｏ−２細胞（ＤＳファーマバイオメディカル社）を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのグルタミンとなるように配合した、高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ−ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、 Ｄ６５４６， Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いて、３７℃、５％のＣＯ２の環境下（ＮＡＰＣＯ Ｓｅｒｉｅｓ ５４００ ＣＯ２ Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて培養した。Caco-2 cells (DS Pharma Biomedical), which is a human colon cancer-derived cell, were mixed so as to have 10% FBS and 2 mM glutamine, and high glucose Dulbecco's Modified Eagle's Medium. with -high glucose, D6546, Sigma-Aldrich, Inc.), 37 ° C., under 5% CO 2 environment (NAPCO Series 5400 CO 2 Incubator, and cultured at Thermo Scientific).
生菌懸濁液を投与する前日に、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように、Ｃａｃｏ−２細胞を６ｗｅｌｌプレート（ＴＰＰ社）に継代した。On the day before the administration of the viable cell suspension, Caco-2 cells were subcultured on a 6-well plate (TPP) so that the concentration of the cells was 1.0×10 5 cells/well.
（２）ＨＳＰ遺伝子の発現誘導試験
生菌懸濁液を２０μｌ／ｗｅｌｌで、前記の継代後のＣａｃｏ−２細胞を含む６ｗｅｌｌプレートに添加し、３７℃、５％のＣＯ２の環境下にて２４時間で共培養した。この共培養を終了した直後に、これら培養液（培地）を吸引除去し、そこに、ＲＮＡ ｌａｔｅｒ （Ａｍｂｉｏｎ社）を添加し、細胞を浸漬した。これら細胞から、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＲＮＡ ＩＩ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ）により、ＲＮＡを抽出してから、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ， ＴａＫａＲａ社）を用いて、逆転写反応を行った。ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ， ＴａＫａＲａ社）を用いて、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＴＰ−８００（ＴａＫａＲａ）により、リアルタイムＰＣＲを行い、Ｃａｃｏ−２細胞のＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現解析を行った。(2) HSP gene expression induction test A viable cell suspension was added at 20 μl/well to a 6-well plate containing Caco-2 cells after the above passage, and the mixture was placed in an environment of 37° C. and 5% CO 2. For 24 hours. Immediately after the completion of this co-culture, these culture solutions (medium) were removed by suction, and RNA later (Ambion) was added thereto to immerse the cells. From these cells, RNA was extracted with NucleoSpin RNA II (MACHEREY-NAGEL), and then a reverse transcription reaction was performed with PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time, TaKaRa). Using SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus, TaKaRa), real-time PCR was performed using Thermal Cycler Dice Real Time System TP-800 (TaKaRa), and HS analysis of Ca1A cells was carried out.
リアルタイムＰＣＲで用いたプライマーと反応液の組成をそれぞれ表１と表２に示す。 The compositions of the primers and reaction solution used in real-time PCR are shown in Table 1 and Table 2, respectively.
リアルタイムＰＣＲの反応条件は、（９５℃、３０秒間） → （９５℃、５秒間 →
６０℃、３０秒間）×４０サイクル → ９５℃、１５秒間 → ６０℃、３０秒間 → ９５℃、１５秒間 → ４℃とした。The reaction conditions for real-time PCR are (95°C, 30 seconds) → (95°C, 5 seconds →
60° C., 30 seconds)×40 cycles→95° C., 15 seconds→60° C., 30 seconds→95° C., 15 seconds→4° C.
対照群として、生菌懸濁液の代わりに、ＰＢＳを投与し、共培養したものを用いた。 As a control group, instead of the viable cell suspension, PBS was administered and co-cultured.
結果を図１に示す。 The results are shown in Figure 1.
図１に示されるように、対照群と比較して、ラクトバチルス ジョンソニの生菌の投与群では、ＨＳＰＡ１Ａ遺伝子の発現上昇が見られた。 As shown in FIG. 1, an increase in HSPA1A gene expression was observed in the Lactobacillus johnsonii live bacteria-administered group as compared to the control group.
例２：インビボ試験
ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株をマウスに投与し、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ、分子量： ３６，０００〜５０，０００Ｄａ、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）で誘発される大腸炎への抑制効果を、動物実験により検討した。 Example 2: In vivo test Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain was administered to mice, and the dextran sulfate sodium (DSS, molecular weight: 36,000-50,000 Da, MP Biomedicals) suppressive effect on colitis-induced colitis was tested in animals. It was examined by.
生菌懸濁液では、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の １×１０８ｃｆｕを、ＰＢＳの ２００μｌに懸濁して調製した。そして、この生菌懸濁液を、ゾンデにより毎日で強制経口投与した。なお、ＤＳＳ水を自由飲水とした。A viable cell suspension was prepared by suspending 1×10 8 cfu of Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain in 200 μl of PBS. Then, this live bacterial suspension was orally administered by gavage on a daily basis. The DSS water was freely drinkable.
ＢＡＬＢ／ｃマウス（４週齢、オス、チャールスリバー社）を用いて、各群を１０匹ずつとした。ＤＳＳ水（２．０ｗ／ｖ％）の投与の１週間前から、生菌懸濁液をマウスに毎日で投与した。ＤＳＳ水の投与の初日を１日目として１週間で（ＤＳＳ水の投与後の７日目まで）、ＤＳＳ水と生菌懸濁液の混合物を毎日で投与した。 BALB/c mice (4 weeks old, male, Charles River) were used to make 10 mice in each group. From 1 week before the administration of DSS water (2.0 w/v%), the live bacterial suspension was administered to the mice daily. A mixture of DSS water and a viable cell suspension was administered every day for 1 week (up to 7 days after administration of DSS water) with the first day of administration of DSS water as the first day.
対照群として、ＤＳＳ水の代わりに、蒸留水を投与したものと、生菌懸濁液の代わりに、ＰＢＳを投与したもの、ＤＳＳと生菌懸濁液の代わりに、蒸留水とＰＢＳを投与したものを用いた（図２参照）。 As a control group, distilled water was administered instead of DSS water, PBS was administered instead of viable cell suspension, and distilled water and PBS were administered instead of DSS and viable cell suspension. What was done was used (refer to FIG. 2).
ＤＳＳの投与期間中には、マウスの体重の測定値と炎症スコアを毎日で記録した。 Mouse body weight measurements and inflammation scores were recorded daily during the DSS administration period.
炎症スコアでは、下痢と血便のスコアを付けて、表３に従って、スコアを０から３までで評価した。 For the inflammation score, diarrhea and bloody stool were scored, and the score was evaluated from 0 to 3 according to Table 3.
ＤＳＳの投与期間の終了後（８日目）に、マウスを解剖し、大腸を採取して、それらの長さと重量を測定した。解剖時の炎症スコアとして、下痢と血便のスコアの合計を平均したものについて、ＤＳＳの投与群間で比較した。 After the end of the DSS administration period (day 8), the mice were dissected, the large intestine was collected, and their length and weight were measured. As the inflammation score at the time of dissection, the average of the sum of diarrhea and bloody stool scores was compared between the DSS administration groups.
マウスの体重、大腸の長さ・大腸の単位長さ当たりの重量では、Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｔｅｓｔで群間を比較した。炎症スコアでは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔで群間を比較した。統計処理の結果、ｐ＜０．０５のときに、有意であると判断した。グラフでは、平均値±標準偏差（ＳＤ）で示した。 The mouse weight, the length of the large intestine, and the weight per unit length of the large intestine were compared between the groups by Tukey's test. The inflammation score was compared between the groups by the Mann-Whitney U test. As a result of statistical processing, it was judged to be significant when p<0.05. In the graph, the mean value ± standard deviation (SD) is shown.
それぞれの結果を図３〜５に示す。 The respective results are shown in FIGS.
図３に示されるように、ＤＳＳで誘発される大腸炎により、マウスの体重が減少するが、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与により、マウスの体重の減少が抑制されることを確認できた。なお、Ｇ１：蒸留水＋ＰＢＳの投与群、 Ｇ２：蒸留水＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群、 Ｇ３：ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群、 Ｇ４：ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群である。 As shown in FIG. 3, it was confirmed that DSS-induced colitis reduces the body weight of mice, but that administration of Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain suppresses the decrease in body weight of mice. In addition, G1: distilled water+PBS administration group, G2: distilled water+Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain administration group, G3: DSS+PBS administration group, G4: DSS+ Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain administration group.
図４に示されるように、ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群と比較して、ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群では、炎症スコアが有意に減少していた。 As shown in FIG. 4, the inflammation score was significantly reduced in the DSS+ Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain-administered group as compared to the DSS+PBS-administered group.
図５に示されるように、ＤＳＳの投与群では、大腸の長さが短縮されていた。また、蒸留水＋ＰＢＳの投与群と比較して、ＤＳＳ＋ＰＢＳの投与群では、単位長さ当たりの重量が有意に増加したが、ＤＳＳ＋ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の投与群では、有意差が見られなかった。 As shown in FIG. 5, the colon length was shortened in the DSS-administered group. The weight per unit length was significantly increased in the DSS+PBS administration group as compared with the distilled water+PBS administration group, but no significant difference was observed in the DSS+Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain administration group. ..
結論として、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の生菌を投与することで、ＤＳＳで誘発される大腸炎が抑制されることを確認できた。 In conclusion, it was confirmed that DSS-induced colitis was suppressed by administering a live bacterium of Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain.
ここにはデータを示さないが、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株の代わりに、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０４２５５株を用いた場合にも、ラクトバチルス ジョンソニ ＯＬＬ２０３５６５株と同様にして、ＤＳＳで誘発される大腸炎が抑制される傾向があることを確認した。 Although data are not shown here, when Lactobacillus johnsonii OLL204255 strain is used instead of Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain, DSS-induced colitis is suppressed in the same manner as Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain. It was confirmed that there is a tendency to
Claims (13)
A lactobacillus lactic acid bacterium having an activity of enhancing expression of HSP70 for suppressing colitis, which is selected from the group consisting of Lactobacillus johnsonii OLL203565 strain, Lactobacillus johnsonii OLL204255 strain, and Lactobacillus johnsonii OLL2978 strain. Lactic acid bacteria .
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