JP6723541B2 - Imaging microfluidic flow cell assembly and method of use thereof - Google Patents
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Description
本発明は撮像用マイクロ流体フローセルアセンブリ及びその使用方法に関する。 The present invention relates to imaging microfluidic flow cell assemblies and methods of use thereof.
本発明は全体として、試料を封入して、その後の試薬の試料への制御送達、例えば、多重インサイチュバイオマーカー染色及び色素循環を使用する載置された生体試料の分析を可能にする、マイクロ流体フローセルサブアセンブリの作製及び使用に関する。 The present invention is generally a microfluidic that encapsulates a sample and allows for subsequent controlled delivery of reagents to the sample, eg, analysis of a mounted biological sample using multiple in situ biomarker staining and dye cycling. Related to the making and use of flow cell subassemblies.
多重インサイチュバイオマーカー分析のために、スライドグラスに載置された組織試料又は組織マイクロアレイ(TMA)は複数の分子プローブにより染色され、バイオマーカーの発現又は空間分布を定量的又は定性的に調査される必要がある。染色及びデータ収集工程は、通常、エラーが起こりやすい、時間のかかる手作業の技術を使用して実施される。染色後、後続の撮像(データ収集)の間試料を湿潤したままに保つために、試料の上にカバースリップを置く必要がある。カバースリップはその後、次の染色ラウンドの前に取り外す必要がある。カバースリップを載せ、カバースリップを外すこの過程は、試料の喪失又はスライドグラス上の試料の移動をもたらす可能性があり、このことは下流の分析を混乱させる。染色は概して、染色試薬を試料に塗工し、この染色試薬を所定のインキュベーション期間の間放置させることによって実施される。したがって、染色時間はバルク溶液から試料への染色成分の分子拡散により決定される。インキュベーションの間に試料の上部において試薬を活発に混合する方法は、試料全体にわたって確実に均一に染色し、染色成分と試料との間の相互作用を促進することを目的としている。このような方法は、染色の均一性に影響を与える流体分離領域を有さない、バルク流体移動の誘導に頼るので、試薬容積に下限がある。 For multiplex in situ biomarker analysis, tissue samples or tissue microarrays (TMA) mounted on glass slides are stained with multiple molecular probes to quantitatively or qualitatively investigate biomarker expression or spatial distribution There is a need. The staining and data collection steps are usually performed using error-prone, time-consuming manual techniques. After staining, a coverslip needs to be placed over the sample to keep it wet during subsequent imaging (data collection). The coverslips should then be removed before the next staining round. This process of placing and removing the coverslip can result in sample loss or sample migration on the glass slide, which confuses downstream analysis. Staining is generally performed by applying a staining reagent to the sample and allowing the staining reagent to stand for a predetermined incubation period. Therefore, the staining time is determined by the molecular diffusion of the staining component from the bulk solution into the sample. The method of actively mixing the reagents on top of the sample during the incubation is aimed at ensuring uniform staining throughout the sample and facilitating the interaction between the staining components and the sample. Such methods rely on the induction of bulk fluid movement, which does not have fluid separation regions that affect staining uniformity, and thus has a lower reagent volume limit.
したがって、試薬送達及びデータ収集のための最適な条件を提供しながらインサイチュ多重バイオマーカー分析のワークフローを自動化し得るシステムの必要性が存在する。少容積の試薬の試薬送達を制御する1つの方法は、流体チャネルを使用することによって、試料に近い領域に試薬を限定することである。拡散距離は、チャネルの高さにより決定され、新しい(十分に混合された)試薬がチャネルの中を流動して、試料の近くで最適な試薬濃度を維持することができる。 Therefore, there is a need for a system that can automate the workflow of in situ multiple biomarker analysis while providing optimal conditions for reagent delivery and data collection. One way to control the reagent delivery of small volumes of reagents is to limit the reagents to the area close to the sample by using fluid channels. The diffusion length is determined by the height of the channel, allowing fresh (well mixed) reagent to flow through the channel to maintain optimal reagent concentration near the sample.
概して、マイクロ流体フローセルは、2つの実質的に平らな基盤層に挟まれた1以上のシーリング層を備える。このシーリング層は、流体チャネルの形状を作り出し、チャネル壁の一部を形成し、通常チャネルの厚さを画成する。このシーリング層は、固体材料の外側を画成された形状に切り出すか、もしくはモールド成形することによって、又は固体化する液体材料を一方の基板の上にプリントすることによって形成することができる。2つの基盤は、流体チャネルを封入し、上下のチャネル壁として機能する。漏れ止めシールは、基板の間にシーリング層をクランプすることによって、及び/又はシーリング層を基板の1つもしくは両方に接着することによって作製される。 Generally, microfluidic flow cells comprise one or more sealing layers sandwiched between two substantially flat base layers. This sealing layer creates the shape of the fluid channel, forms part of the channel wall, and usually defines the thickness of the channel. This sealing layer can be formed by cutting or molding the outside of a solid material into a defined shape, or by printing a solidifying liquid material on one substrate. The two substrates enclose the fluid channels and act as upper and lower channel walls. The leak tight seal is made by clamping the sealing layer between the substrates and/or by adhering the sealing layer to one or both of the substrates.
さらに、フローセルの構築は、包み込まれた試料を伝統的な撮像装置を通して検出及び分析することができる方法には限界が存在することを指示している。特に、取り込んだ画像の焦点を合わせ、質を調整する、並びにフローセルと撮像装置の対物レンズとの位置合わせする手段を提供する、フローセルを介した試料の撮像方法が必要である。 Furthermore, the construction of the flow cell indicates that there are limitations to the way in which the encapsulated sample can be detected and analyzed through traditional imaging equipment. In particular, there is a need for a method of imaging a sample through a flow cell that provides a means for focusing, quality adjusting, and aligning the flow cell with the objective lens of the imaging device of the captured image.
したがって、広範囲の基板材料が可能であり、撮像装置及び方法論へのアクセスを容易にしながら、いずれの基板によっても流体接続される必要がないマイクロ流体フローセルが必要である。 Accordingly, there is a need for a microfluidic flow cell that allows a wide range of substrate materials and facilitates access to imagers and methodologies while not needing to be fluidly connected by any substrate.
本発明は、主要な基板の外側に流体接続を有する、フローセル内に組み立て得るマイクロ流体サブアセンブリを提供することによって、前述の欠点を克服する。 The present invention overcomes the aforementioned shortcomings by providing a microfluidic subassembly that can be assembled in a flow cell with fluidic connections outside the primary substrate.
本発明の一態様に従って、積層平面アセンブリを有するマイクロ流体サブアセンブリを開示する。この積層平面アセンブリは、接着層、透明基板層及び各層が互いに接着されるガスケット層を備え、接着層及びガスケット層は基板層の範囲を超えて延在する。さらに、基板層の境界の外側に位置する1以上の流体ポートが存在する。構成により、基板層は、いずれの方向にも曲がってサブアセンブリの内部寸法を変更することのできる可撓性の透明蓋を形成する。 In accordance with one aspect of the present invention, a microfluidic subassembly having a laminated planar assembly is disclosed. The laminated planar assembly comprises an adhesive layer, a transparent substrate layer and a gasket layer where each layer is adhered to each other, the adhesive layer and the gasket layer extending beyond the extent of the substrate layer. In addition, there are one or more fluid ports located outside the boundaries of the substrate layer. By construction, the substrate layer bends in either direction to form a flexible transparent lid that can change the internal dimensions of the subassembly.
本発明のさらに別の態様に従って、上記のサブアセンブリを備え、マイクロ流体フローセルサブアセンブリに接着された固体支持体をさらに備えたマイクロ流体フローセルを開示する。 In accordance with yet another aspect of the invention, there is disclosed a microfluidic flow cell comprising the above subassembly, further comprising a solid support adhered to the microfluidic flow cell subassembly.
本発明の別の態様に従って、固体支持体に結合された生体試料を、記載のマイクロ流体フローセルを使用して分析する方法を開示する。この方法は、フローセルと撮像装置の対物レンズとの位置を合わせることによってフローセルの固体支持体に担持された試料の取り込み画像の質を調整するステップ、及びフローセル中の流体の量を調節して、その中心点から±約200μmの範囲で可撓性の蓋を撓ませるステップ、を含む。 According to another aspect of the invention, a method of analyzing a biological sample bound to a solid support using the described microfluidic flow cell is disclosed. The method comprises adjusting the quality of the captured image of the sample carried on the solid support of the flow cell by aligning the flow cell with the objective lens of the imager, and adjusting the amount of fluid in the flow cell. Flexing the flexible lid within a range of about ±200 μm from its center point.
本発明のさまざまな他の特色及び有利性は、下記の詳細な説明及び図面から明らかになると思われる。 Various other features and advantages of the present invention will be made apparent from the following detailed description and the drawings.
これらの図面は、本発明を実施するために現在企図される実施形態を例示するものである。 These drawings illustrate embodiments presently contemplated for carrying out the invention.
特許請求する発明の主題をより明確かつ簡潔に記載するために、下記の説明及び添付の特許請求の範囲に使用される特定の用語に対して、下記の定義が提供される。 In order to more clearly and concisely describe the claimed subject matter, the following definitions are provided for certain terms used in the following description and appended claims.
単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「前記(the)」は、文脈が特に他のことを明確に示さない限り、複数の指示対象を含む。本明細書及び特許請求の範囲を通してここで使用される、概略を表す言葉(Approximating language)は、関連する基本的機能に変化をもたらすことなく、差し支えない程度に変動できる任意の量的表現を修飾するために適用することができる。したがって、「約」などの用語により修飾された値は、指定された正確な値に限定されるものではない。特に他のことが明記されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に使用される原料、分子量などの特性、反応条件などの量を表現するすべての数字は、すべてにおいて「約」という用語により修飾されていると理解するべきである。したがって、特に反対のことが示されない限り、上記の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメーターは、本発明により得ることが探求されている所望の特性に依存して変動し得る近似値である。少なくとも、各数値パラメーターは、少なくとも報告された有効数字を考慮して、普通の四捨五入技術の適用により解釈されるべきである。 The singular forms "a", "an" and "the" include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. As used herein throughout the specification and claims, the approximate term (Approximating language) modifies any quantitative expression that can be varied to the extent that it does not change the associated basic function. Can be applied to Thus, values modified by terms such as "about" are not limited to the exact values specified. Unless otherwise specified, all numbers used in the specification and claims to describe amounts such as raw materials, properties such as molecular weight, reaction conditions, etc. are all modified by the term "about". Should be understood as being done. Therefore, unless indicated to the contrary, the numerical parameters recited in the above description and the appended claims may vary depending on the desired properties sought to be obtained by the present invention. It is a value. At a minimum, each numerical parameter should be construed by the application of ordinary rounding techniques, taking into account at least the reported significant figures.
本明細書において使用する場合、「生体試料」という用語は、インビボ又はインビトロ由来の生体組織又は体液の試料を含む生体対象から得られた試料を指す。このような試料は、限定するものではないが、ヒトを含む哺乳動物から分離された全細胞、組織、分画及び細胞、血液試料全体又はその一部並びに他の生体体液であってよい。生体試料は、固体支持体上に載置又は固定されてよく、例えば、顕微鏡用スライドグラス上に載置された組織切片、組織マイクロアレイもしくは血液塗抹であってよく、又はサブアセンブリが固体支持体に接着された後でフローセルに導入されてもよい。 As used herein, the term "biological sample" refers to a sample obtained from a biological subject, including a sample of biological tissue or fluid of in vivo or in vitro origin. Such samples may be whole cells, tissues, fractions and cells isolated from mammals, including, but not limited to, humans, whole or part blood samples and other biological fluids. The biological sample may be mounted or fixed on a solid support, for example, a tissue section mounted on a microscope slide, a tissue microarray or a blood smear, or a subassembly on the solid support. It may be introduced into the flow cell after being adhered.
本明細書において使用する場合、「消耗品」という用語は、単回使用又は限定使用のために設計された使い捨て部品を指す。ある状況においては、消耗品は使用されている系の有効寿命より短い有効寿命を有することがあり、他の状況においては、消耗品は、使用が意図される系から分離する部品であり、分離して保存され、製造されてよい。 As used herein, the term "consumables" refers to disposable parts designed for single use or limited use. In some situations, consumables may have a useful life that is less than the useful life of the system in which they are used; in other situations, consumables are parts that separate from the system in which they are intended to be used. May be stored and manufactured.
特定の実施形態では、マイクロ流体サブアセンブリは、連続して、色素により染色され、任意の高解像度顕微鏡で撮像され、蛍光レポーターが不活性化又は失活され、その後このサイクルが反復されるように、生体試料を封入する手段を提供する。本明細書において使用する場合、マイクロ流体サブアセンブリは、組立てフローセルの中心にあるチャンバーを作り出すマイクロ流体チャンバーとも称され得る。本明細書において使用する場合、マイクロ流体サブアセンブリはサブアセンブリとも称され得る。特定の実施形態では、サブアセンブリは、サブアセンブリが単回使用又は限定使用のために設計されたような消耗品である。 In certain embodiments, the microfluidic subassemblies are sequentially stained with dye and imaged with any high-resolution microscope to inactivate or inactivate the fluorescent reporter, after which the cycle is repeated. , Providing means for encapsulating a biological sample. As used herein, a microfluidic subassembly may also be referred to as a microfluidic chamber that creates a chamber at the center of the assembled flow cell. As used herein, microfluidic subassemblies may also be referred to as subassemblies. In certain embodiments, the subassembly is a consumable such that the subassembly is designed for single use or limited use.
サブアセンブリ装置は、試料をチャンバー内に封入する手段を提供する。特定の実施形態では、試料は、標準的顕微鏡用スライドグラスなどの固体支持体に載置された生体試料であり、試料は後続の処理ステップの間管理された環境下に維持される。生体試料は、固体支持体上に配置され、その後フローセルの形成をもたらすサブアセンブリ装置に封入されてよい。特定の実施形態では、生体試料は、限定するものではないが、全細胞、組織切片、組織マイクロアレイ又は血液試料を含み得る。特定の実施形態では、組織切片は固定組織試料であってよい。特定の実施形態では、サブアセンブリを備えるフローセルは、リアルタイム又はほぼリアルタイムの分析のために、サブアセンブリが恒久的に固体支持体に結合されるような消耗品であってよい。特定の実施形態では、組立てフローセルは、将来の試験又は分析のための試料のアーカイブとして機能してもよい。 The subassembly device provides a means of enclosing the sample within the chamber. In certain embodiments, the sample is a biological sample mounted on a solid support, such as a standard microscope slide, and the sample is maintained in a controlled environment during subsequent processing steps. The biological sample may be placed on a solid support and then encapsulated in a subassembly device that results in the formation of a flow cell. In certain embodiments, biological samples can include, but are not limited to, whole cells, tissue sections, tissue microarrays or blood samples. In certain embodiments, the tissue section may be a fixed tissue sample. In certain embodiments, the flow cell comprising the subassembly may be a consumable such that the subassembly is permanently bonded to a solid support for real-time or near real-time analysis. In certain embodiments, the assembled flow cell may serve as an archive of samples for future testing or analysis.
生体試料は、フローセル形成の後で、生体試料をセル内に流動させ、化学的又は生物学的手段、静電相互作用、非特異的吸着、誘電泳動力、磁力、光学ピンセット、微細構造による物理的捕捉又は類似の手段により生体試料を捕捉することによって、固体支持体に結合させることもできる。特定の実施形態では、封入された試料を含有するフローセルは、その後の分析のためにそのまま保管されてもよい。 The biological sample is made by flowing the biological sample into the cell after the formation of the flow cell, and using chemical or biological means, electrostatic interaction, non-specific adsorption, dielectrophoretic force, magnetic force, optical tweezers, physical by microstructure. It can also be attached to a solid support by capturing a biological sample by dynamic capture or similar means. In certain embodiments, the flow cell containing the encapsulated sample may be stored as is for subsequent analysis.
一実施形態では、サブアセンブリを使用して形成されたマイクロ流体フローセルは、物理的にクランプして、固体支持体へのシールを維持する、又はそのシールの完全性を維持する必要はない。 In one embodiment, the microfluidic flow cell formed using the subassembly need not be physically clamped to maintain a seal to the solid support, or maintain the integrity of the seal.
特定の実施形態では、フローセルの内容物は、フローセルと通信しているさまざまな光学的、電気的、磁気的又は電気機械的装置を使用して、インサイチュ分析することができる。別の実施形態では、物質は後続の分析のためにフローセルの外に輸送することができる。一実施形態では、フローセルは、米国特許出願第2009253163号及び米国特許第7629125号に記載の多重組織染色及び撮像のために使用される。さらに他の実施形態では、フローセルは、他の細胞分析技術又は抽出方法を含むか、もしくは含まない形態学を伴う技術の組合せに使用することができる。分析技術としては、限定するものではないが、DNAの分析又は増幅、RNAの分析又は増幅、核酸シークエンシング、タンパク質分析、抗原賦活化、ヘマトキシリン及びエオシン染色(H&E)、免疫蛍光染色(IF)、免疫組織化学染色(IHC)、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)又は他の組織学的及び形態学的染色技術を挙げることができる。 In certain embodiments, the contents of the flow cell can be analyzed in situ using various optical, electrical, magnetic or electromechanical devices in communication with the flow cell. In another embodiment, the substance can be transported out of the flow cell for subsequent analysis. In one embodiment, the flow cell is used for multiple tissue staining and imaging as described in US Patent Application No. 20099253163 and US Patent No. 7629125. In yet other embodiments, the flow cell can be used in combination with techniques involving morphology with or without other cell analysis techniques or extraction methods. Analytical techniques include, but are not limited to, DNA analysis or amplification, RNA analysis or amplification, nucleic acid sequencing, protein analysis, antigen retrieval, hematoxylin and eosin staining (H&E), immunofluorescent staining (IF), Mention may be made of immunohistochemical staining (IHC), fluorescent in situ hybridization (FISH) or other histological and morphological staining techniques.
サブアセンブリの代表的実施形態は、図1A及び1B及び1Cに示される。サブアセンブリ装置(100)は、接着層(110)、基板層(120)及びガスケット層(130)を備える積層平面アセンブリからなり、ガスケット層及び接着層は、基板層を超えて延在している。これらの層は共に接着し、接着層及びガスケット層の外側境界に沿って位置する穴を有し、流体の入口/出口ポート(140)を形成する。流体の入口/出口ポートは、本明細書においてポートとも称され得る。図1Bは、ガスケット(130)側から見たサブアセンブリを示し、図1Cは接着層(110)側から見たサブアセンブリを示す。 Representative embodiments of subassemblies are shown in FIGS. 1A and 1B and 1C. The subassembly device (100) comprises a laminated planar assembly comprising an adhesive layer (110), a substrate layer (120) and a gasket layer (130), the gasket layer and the adhesive layer extending beyond the substrate layer. .. These layers adhere together and have holes located along the outer boundaries of the adhesive layer and the gasket layer to form fluid inlet/outlet ports (140). Fluid inlet/outlet ports may also be referred to herein as ports. 1B shows the subassembly as seen from the gasket (130) side, and FIG. 1C shows the subassembly as seen from the adhesive layer (110) side.
基板層(120)、特定の実施形態では、基板材料はガラスで構成されてよいが、プラスチック、金属、ケイ素、セラミック、絶縁体、シリコーン又はこれらの組合せで構成されてもよい。特定の実施形態では、好ましい材料はガラスであり、又は基板はカバーガラススリップである。特定の実施形態では、例えば、基板がカバースリップである場合、このカバースリップはケイ酸塩ガラスもしくはホウケイ酸ガラスなどのガラス、又はポリオレフィンから作られる、正確な光透過性を有するNUNC(商標)ブランドThermanox(登録商標)カバースリップなどのスペシャリティープラスチックからなり得る。例えば蛍光顕微鏡のために紫外線透過性が要求される場合、石英ガラスカバースリップもまた使用することができる。 The substrate layer (120), in certain embodiments, the substrate material may be composed of glass, but may also be composed of plastic, metal, silicon, ceramic, insulator, silicone or combinations thereof. In certain embodiments, the preferred material is glass or the substrate is a cover glass slip. In certain embodiments, for example, where the substrate is a coverslip, the coverslip is made of glass, such as silicate or borosilicate glass, or polyolefin, and is NUNC™ brand with precise light transmission. It may consist of specialty plastics such as Thermanox® coverslips. Quartz glass coverslips can also be used if UV transmission is required, for example for fluorescence microscopy.
サブアセンブリ(100)は、図2に示すように固体支持体(150)に接着可能である。図2の実施例において、組織マイクロアレイが固体支持体に載置される。効率的にサブアセンブリを接着させることにより、境界全体に沿ってシールされたマイクロ流体フローセル(160)が形成される。このことは、組立てフローセルを両側から示す図2B及び2Cにおいてさらに示され、図2Bはガスケット側から表したフローセルであり、2Cは固体支持体側から表している。いくつかの実施形態では、サブアセンブリの総厚は、約25から約1200μmであるように設計することができ、この厚さは、約20から約1000μmの間のガスケット及び約5から約200μmの間の接着層を組合せた厚さである。 The subassembly (100) can be adhered to a solid support (150) as shown in FIG. In the example of FIG. 2, a tissue microarray is mounted on a solid support. Efficiently adhering the subassemblies forms a sealed microfluidic flow cell (160) along the entire boundary. This is further illustrated in Figures 2B and 2C, which show the assembled flow cell from both sides, with Figure 2B being the flow cell from the gasket side and 2C from the solid support side. In some embodiments, the total thickness of the subassembly can be designed to be about 25 to about 1200 μm, the thickness being between about 20 and about 1000 μm gasket and about 5 to about 200 μm. The combined thickness of the adhesive layers in between.
特定の実施形態では、基板(120)の一方又は両方及び固体支持体(150)は、特定の範囲の波長において透明である。したがって、フローセル内の材料/構造の光学的分析は、落射照明又は両方が透過性である場合の透過照明のいずれかによって達成することができる。組立てフローセルが多重組織染色及び分析に使用できる実施形態では、透過性基板及び固体支持体の両方を使用することによって、落射蛍光撮像及び透過明視野撮像の両方が可能になる。これは、蛍光に基づく分子病理学並びに例えば、ジアミノベンジジン(DAB)染色又はヘマトキシリン及びエオシン色素(H&E)発色染色に基づく従来の明視野撮像を可能にする。 In certain embodiments, one or both of the substrates (120) and the solid support (150) are transparent at a particular range of wavelengths. Therefore, optical analysis of materials/structures within the flow cell can be accomplished either by epi-illumination or by transillumination when both are transmissive. In embodiments where the assembled flow cell can be used for multiple tissue staining and analysis, the use of both a transparent substrate and a solid support allows both epifluorescence imaging and transmission brightfield imaging. This enables fluorescence-based molecular pathology and conventional brightfield imaging based on, for example, diaminobenzidine (DAB) staining or hematoxylin and eosin dye (H&E) chromogenic staining.
本明細書において使用する場合、「共に接着する」又は「接着可能」という用語は、部品又は材料が共に連結され、材料の接合面においてシールを形成することを指す。接着は、結合を形成するための化学的接着剤の使用を指し、化学的接着剤としては、限定するものではないが、シリコーン、エポキシ、アクリル系、室温硬化材料(RTV)、熱可塑性物質又はこれらの組合せが挙げられる。接着は、1つの材料を別の材料の上にオーバーモールド成形して、2つの材料の接合面において機械的又は化学的相互作用によりシールを作ることによっても達成することができる。特定の実施形態では、接着は、圧力、温度又は光もしくは照射に対する曝露などの外部条件の適用を介して達成することができる。接着は、分離の際に凝集破壊が起こるほど強力な結合を接合面にもたらし得る。他の事例では、接着は、接合面が再配置できるような、又は結合が一時的結合と考えられるような、最小限の力で破壊され得る結合を接合面にもたらし得る。 As used herein, the term "glued together" or "gluable" refers to the joining together of parts or materials to form a seal at the mating surfaces of the materials. Adhesion refers to the use of chemical adhesives to form bonds, including, but not limited to, silicones, epoxies, acrylics, room temperature curable materials (RTVs), thermoplastics or These combinations may be mentioned. Adhesion can also be achieved by overmolding one material over another to create a seal by mechanical or chemical interaction at the interface of the two materials. In certain embodiments, adhesion can be achieved through the application of pressure, temperature or external conditions such as exposure to light or radiation. Adhesion can provide a bond to the mating surface that is so strong that cohesive failure occurs upon separation. In other cases, adhesion may result in a bond that can be broken with minimal force such that the bond surface can be repositioned or the bond is considered a temporary bond.
特定の実施形態では、固体支持体は、試料が得られたフローセルに封入されるように、固定された生体試料を担持する。流体入口/出口ポート(140)は、基板(120)又は固体支持体(150)のいずれにも貫通孔が必要ないように、基板(120)を超えて延在するように構成される。 In certain embodiments, the solid support carries an immobilized biological sample such that the sample is enclosed in the resulting flow cell. The fluid inlet/outlet port (140) is configured to extend beyond the substrate (120) such that no through holes are required in either the substrate (120) or the solid support (150).
特定の実施形態では、接着材料は接着性を有し、限定するものではないが、シリコーン、アクリル系、エポキシ、室温硬化材料(RTV)、熱可塑性物質又はこれらの組合せなどの化学的接着剤を含む。特定の他の実施形態では、接着材料は、接着テープ、シリコーン、熱可塑性エラストマー、パラフィンワックス、プリント接着材料又はプラスチックフィルムであってもよい。さらに他の実施形態では、接着材料は、光、熱又は圧力の適用が接着を強化する、光、熱、化学物質又は圧力感受性接着剤であってよい。さらに他の実施形態では、接着材料は、表面のプラズマ活性化、例えば空気又は酸素の補助により、基板、固体支持体、ガスケット又はこれらの組合せに接着される。 In certain embodiments, the adhesive material is adhesive, including but not limited to chemical adhesives such as silicone, acrylics, epoxies, room temperature curable materials (RTVs), thermoplastics, or combinations thereof. Including. In certain other embodiments, the adhesive material may be adhesive tape, silicone, thermoplastic elastomer, paraffin wax, printed adhesive material or plastic film. In yet other embodiments, the adhesive material may be a light, heat, chemical or pressure sensitive adhesive where the application of light, heat or pressure enhances the adhesion. In yet other embodiments, the adhesive material is adhered to the substrate, solid support, gasket, or combination thereof with the aid of plasma activation of the surface, such as air or oxygen.
流体入口及び出口ポートは、接着材料が基板の端を超えて延在することによって作られる。特定の実施形態では、基板の外側の接着材料は、ガスケット材料によりキャップされてよい。ガスケット材料は、限定するものではないが、シリコーン、熱可塑性エラストマー、接着テープ、ゴム又はプラスチックで構成され得る。フローセル内又はその外につながる流体入口及び出口ポートは、これらのポートがガスケット構造に組み込まれるように、ガスケット材料中に存在する貫通穴で構成され得る。さらに他の実施形態では、ポートは、ガスケット層とは異なる材料であってよく、ガスケットに組み込まれて、層の間を通る開放口を提供する。 The fluid inlet and outlet ports are made by the adhesive material extending beyond the edge of the substrate. In certain embodiments, the adhesive material on the outside of the substrate may be capped with a gasket material. The gasket material may be composed of, but not limited to, silicone, thermoplastic elastomer, adhesive tape, rubber or plastic. The fluid inlet and outlet ports leading into or out of the flow cell may consist of through holes present in the gasket material so that these ports are incorporated into the gasket structure. In still other embodiments, the port can be a different material than the gasket layers and is incorporated into the gasket to provide an open port through the layers.
特定の実施形態では、流体入口及び出口ポートは、試薬がその間を流動可能なマイクロ流体チャネルを含有する薄膜流体コネクターを備える。このコネクターは、積層平面アセンブリとの流体接続によってマイクロ流体フローセルに直接結合することができ、それ自体が、外部のマクロスケール流体装置と組立てフローセルとの間の少容積の使い易い流体接続、例えば、ポンプ、バルブ及びリザーバを提供する。 In certain embodiments, the fluid inlet and outlet ports comprise thin film fluid connectors containing microfluidic channels through which reagents can flow. The connector can be directly coupled to a microfluidic flow cell by a fluidic connection with a laminated planar assembly, which itself provides a small volume, easy-to-use fluidic connection between an external macroscale fluidic device and an assembled flow cell, such as Provide pumps, valves and reservoirs.
特定の実施形態では、マイクロ流体チャネルに加えて、薄膜は試薬の切り替えを容易にするマイクロバルブを収容でき、試薬貯蔵ウェルをポリマー薄膜に直接組み込み又は連結可能にし、特定の工程ステップの間のフローセルの分離を提供する。バルブはフローセルを分離して、漏れ止めシールを提供し、液体蒸発を防止し、又は所望の圧力又は真空レベルを保持できる。バルブはフローセルの充填をさらに容易にすることができ、フローセルはバルブの開放前に真空を構成できる。 In certain embodiments, in addition to microfluidic channels, the membrane can house microvalves that facilitate reagent switching, allowing reagent storage wells to be directly incorporated into or coupled to polymer membranes, and flow cells during particular process steps. To provide isolation. The valve can separate the flow cell to provide a leak tight seal, prevent liquid evaporation, or hold the desired pressure or vacuum level. The valve can further facilitate filling of the flow cell and the flow cell can establish a vacuum prior to opening the valve.
特定の実施形態では、薄膜コネクターは、概して1mm未満の厚さを有する可撓性プラスチックで構成されてよい。可撓性プラスチックは、限定するものではないが、Kapton(登録商標)(DuPont)などのポリイミドフィルム、環状オレフィンコポリマー(COC)、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリカーボネート(PC)、Teflon(登録商標)(DuPont)などのポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、ポリスチレン(PS)、ポリエチレン(PE)、ポリスルホン(polysuflone)(PSU)、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)、ポリプロピレン(PP)、感熱性もしくは感圧性接着剤、熱可塑性エラストマー又はシリコーンエラストマーフィルムであってよい。特定の実施形態では、プラスチックは、使用する試薬による分解に抵抗する十分な耐化学性を有する。 In certain embodiments, the thin film connector may be constructed of flexible plastic having a thickness of generally less than 1 mm. Flexible plastics include, but are not limited to, polyimide films such as Kapton® (DuPont), cyclic olefin copolymers (COC), polyethylene terephthalate (PET), polymethylmethacrylate (PMMA), polycarbonate (PC). , Teflon (registered trademark) (DuPont) and other polytetrafluoroethylene (PTFE), polystyrene (PS), polyethylene (PE), polysulfone (polysuflone) (PSU), polyvinyl chloride (PVC), polyether ether ketone (PEEK) ), polypropylene (PP), heat or pressure sensitive adhesives, thermoplastic elastomers or silicone elastomer films. In certain embodiments, the plastic has sufficient chemical resistance to resist degradation by the reagents used.
特定の実施形態では、コネクターは、共に積層され、所望のマイクロ流体特色を形成する複数のプラスチック層から作製される。特定の実施形態では、これらの層の1以上は、いったんこれらの層が共に積層されると、封入されたマイクロ流体チャネルを作る、予備形成スロット又は切り出されるか、もしくは形成された溝を有する。これらの層は共に直接熱結合されてもよく、又は限定するものではないが、感圧接着剤、Bステージ型接着剤、グルー、化学的中間層又はこれらの組合せを含む接着性中間層を使用して結合されても、いずれでもよい。化学的中間層は、例えば、薄層に用いられる化学的プライマーであってよく、表面に共有結合することができる。 In certain embodiments, the connector is made up of multiple plastic layers that are laminated together to form the desired microfluidic feature. In certain embodiments, one or more of these layers have preformed slots or cut out or formed grooves that create encapsulated microfluidic channels once the layers are laminated together. These layers may be directly heat bonded together or use adhesive interlayers including, but not limited to, pressure sensitive adhesives, B-stage adhesives, glues, chemical interlayers or combinations thereof. Or they may be combined with each other. The chemical intermediate layer can be, for example, a chemical primer used in the lamina and can be covalently attached to the surface.
図3は、1つのこのような積層板(300)を使用するアセンブリを示す。図に示すように、チャネル積層板は、上層及び下層(310)、感圧接着剤(320)及びシリコーンガスケット(330)などのKapton(登録商標)のさまざまな層により形成される。チャネルは、予備形成層(340)に存在してよい。取付具(350)は、組み立ての間に個別の層を位置合わせするために使用して、位置合わせの再現性及び厳しい公差を可能にすることができる。これは、チャネルと流体連絡可能な流体ポートを含有する、ポリマー薄膜コネクター(360)内に封入された流体チャネルをもたらす。 FIG. 3 shows an assembly using one such laminate (300). As shown, the channel laminate is formed by various layers of Kapton®, such as top and bottom layers (310), pressure sensitive adhesive (320) and silicone gasket (330). The channels may be present in the preformed layer (340). The fixture (350) can be used to align the individual layers during assembly, allowing reproducibility of alignment and tight tolerances. This results in a fluid channel encapsulated within a polymeric thin film connector (360) that contains fluid ports in fluid communication with the channel.
図4に示すように、特定の実施形態では、薄膜コネクターは、サブアセンブリ(420)の一部としてフローセルのガスケット材料(410)(図4A)にまず結合され得る。得られたサブアセンブリは次いで、生体試料(430)(図4B)に接着され、マイクロ流体フローセル(440)を形成することができる。特定の他の実施形態では、膜コネクターはガスケット材料それ自体の一部であってよく、その場合、ガスケットが単一の部品構築体としてフローセルサブアセンブリを超えて延在するか、又はガスケット材料の一部が又はマイクロ流体チャネルを含む積層板の一部を形成する。 As shown in FIG. 4, in certain embodiments, the thin film connector may first be bonded to the flow cell gasket material (410) (FIG. 4A) as part of the subassembly (420). The resulting subassembly can then be adhered to the biological sample (430) (FIG. 4B) to form the microfluidic flow cell (440). In certain other embodiments, the membrane connector may be part of the gasket material itself, in which case the gasket extends beyond the flow cell subassembly as a single component construction, or Some or form part of a laminate containing microfluidic channels.
特定の実施形態では、接着中間層は、場合により中間層の中を切り通すマイクロ流体特色を有し得る。特定の実施形態では、バルブはシリコーン膜及び対応するマイクロ流体チャネル及びバルブシートの組合せにより形成することができる。 In certain embodiments, the adhesive interlayer may optionally have a microfluidic feature that cuts through the interlayer. In certain embodiments, valves can be formed by a combination of silicone membranes and corresponding microfluidic channels and valve seats.
特定の実施形態では、薄膜電子素子を構築するための十分に開発された方法をマイクロ流体チャネルの構築方法と組合せて、流体素子及び電子素子の統合を実現でき、加熱/冷却、電磁波の発生/変換/センシング、圧力/真空の発生/変換/センシング及び流動/電気のセンシング素子を可能にする。 In certain embodiments, well-developed methods for building thin film electronic devices can be combined with methods for building microfluidic channels to achieve integration of fluidic and electronic devices, heating/cooling, generation of electromagnetic waves/ Enables conversion/sensing, pressure/vacuum generation/conversion/sensing and flow/electricity sensing elements.
特定の実施形態では、薄膜流体コネクターは、消耗品マイクロ流体フローセルのシリコーンガスケット層に直接結合されてもよい。又は、薄膜流体コネクターは、感圧接着剤によりフローセルカバースリップの端に結合され、フローセルガスケット層の必要性を排除することもできる。 In certain embodiments, the thin film fluid connector may be directly bonded to the silicone gasket layer of the consumable microfluidic flow cell. Alternatively, the thin film fluid connector may be bonded to the ends of the flow cell coverslip with a pressure sensitive adhesive, eliminating the need for a flow cell gasket layer.
特定の実施形態では、薄膜コネクターのアライメントフィーチャは、例えば、いつ顕微鏡に載置されたかなどの簡易登録を機器において可能にする。このコネクターは、流体シールとフローセル載置との間の分離を可能にし、使用の容易さを強化する。 In certain embodiments, the alignment features of the thin film connector allow for easy registration in the instrument, such as when it was mounted on the microscope. This connector allows for separation between the fluid seal and the flow cell mount, enhancing ease of use.
特定の実施形態では、薄膜コネクターは別の流体接続が可能なように設計される。単独接続として機能する1つのポートが使用されてもよく、他の設計は、複数の入口及び出口ポートを可能にしてもよい。他の実施形態では、このポートは、流動を指示又は管理するために使用される流動チャネル又はバルブとインターフェイスで連結される。さらに他の実施形態では、図5に示すように、コネクターは、組み込まれた試薬ウェル(510)及びバルブ(520)により構成され、複数の入口及び最小希釈のフローセル内への試薬の流動を提供する。 In certain embodiments, the thin film connector is designed to allow another fluid connection. One port that functions as a single connection may be used, and other designs may allow multiple inlet and outlet ports. In other embodiments, this port interfaces with a flow channel or valve used to direct or manage flow. In yet another embodiment, as shown in FIG. 5, the connector is configured with an integrated reagent well (510) and valve (520) to provide multiple inlets and flow of reagents into a minimally diluted flow cell. To do.
特定の実施形態では、バルブは、薄膜コネクターに直接組み込まれても、又はコネクターと流体接続して、フローセル内外への試薬の流動を管理されてもよい。 In certain embodiments, the valve may be incorporated directly into the membrane connector or in fluid connection with the connector to control the flow of reagents into and out of the flow cell.
特定の実施形態では、電気トレースはポリマー薄膜に組み込むことができ、センシング及び加熱素子並びに先に記載の流体チャネルと密接に結合された電子素子となり得、加熱/冷却、電磁波、発生/変換/センシング、圧力/真空の発生/変換センシング及び流動/電気センシング素子が可能になる。薄膜検出器、例えばOLEDもまた、光のセンシング及び検出のために組み込まれてもよい。 In certain embodiments, electrical traces can be incorporated into polymer thin films and can be sensing and heating elements and electronic elements that are intimately coupled to the fluid channels described above, such as heating/cooling, electromagnetic waves, generation/transformation/sensing. It enables pressure/vacuum generation/conversion sensing and flow/electric sensing elements. Thin film detectors, such as OLEDs, may also be incorporated for light sensing and detection.
特定の実施形態では、薄膜は可撓性であってよく、この薄膜が3次元の流体経路を可能にし、接続の間もしくは接続のある位置の間の距離が一様ではない間隙充填(gap filingを可能にする、又は異なるサイズの異なる装置の間の切り替え又は挿入を可能にするこのことは図6に示され、流体モジュール(例えば、フローセル)が、曲げられた(A)、ねじられた(B)、又は直列に配置され、多重モジュールを可能にするように積み重ねられた(C)、薄膜流体接続により配列されることをさらに可能にする。これは、限定するものではないが、180°の接続を含む。 In certain embodiments, the membrane may be flexible, allowing the three-dimensional fluid path and providing non-uniform gap filling between connections or locations of connections. This allows for switching or insertion between different devices of different sizes, which is shown in FIG. 6, where the fluid module (eg, flow cell) is bent (A), twisted ( B), or arranged in series and stacked to allow for multiple modules (C) further arranged to be arranged by thin film fluid connections, which include, but are not limited to, 180°. Including the connection of.
図7A及び7Bに示すように、特定の他の実施形態では、ガスケット層(130)は、ポート(140)と組立てフローセル(160)との間の試薬の流動を遮断するバルブとして機能でき、フローセル内の内容物の分離を提供する。バルブは、基板とポート(140)(図7C)との間のチャネル領域(170)においてガスケットを固体支持体(150)と接触させるように、ガスケットを変形することによって閉じられる。この変形は、限定するものではないが、固体構造をガスケットに対して押し、ガスケットの特定の部位に局所的に空気圧を印加する動きを含む方法により誘導できる。ガスケットを変形させ、ガスケットを固体支持体に対してシーリングする他の方法も使用され得る。 As shown in FIGS. 7A and 7B, in certain other embodiments, the gasket layer (130) can function as a valve that blocks the flow of reagents between the port (140) and the assembled flow cell (160). Provides isolation of the contents within. The valve is closed by deforming the gasket so that it contacts the solid support (150) in the channel region (170) between the substrate and port (140) (FIG. 7C). This deformation can be induced by methods that include, but are not limited to, the movement of pushing a solid structure against the gasket and locally applying air pressure to a particular location on the gasket. Other methods of deforming the gasket and sealing the gasket to the solid support may also be used.
図8Aは、流体接続取付具が高さのあるリング又はシーリング装置取付具(200)をさらに含む、流体接続が達成される一実施形態を示す。図に示すように、マイクロ流体フローセルを高さのあるシーリング表面(190)に接触させることにより、ガスケット層に対するシールが形成される(図8B)。取付具上のレッジ(195)はガスケット圧縮距離を限定でき、固体支持体を撮像装置の顕微鏡対物レンズなどの外部実体に記録させる水準面を提供する。 FIG. 8A illustrates one embodiment in which a fluid connection is achieved, wherein the fluid connection fitting further comprises a ring or sealing device fitting with height (200). As shown, the microfluidic flow cell is contacted with the elevated sealing surface (190) to form a seal against the gasket layer (FIG. 8B). The ledge (195) on the fixture can limit the gasket compression distance and provides a leveling surface that allows the solid support to be recorded by an external entity such as the microscope objective of the imager.
図9Aは、ガスケット(130)及びレッジ(195)をより詳細に示す、高さのあるシーリング装置の一つの図である。ガスケット(130)は、高さのある表面に対して配置される。 FIG. 9A is a view of one of the height sealing devices showing the gasket (130) and ledge (195) in greater detail. The gasket (130) is placed against a raised surface.
特定の実施形態では、圧縮の量は、ガスケットの厚さ及び高さのあるシールとレッジとの間の距離により決定される。例えば、組立てフローセルの総厚が約525μmであり、シールとレッジとの間の距離が約500μmであった場合、圧縮距離は約25μmであるように設計される。 In certain embodiments, the amount of compression is determined by the thickness of the gasket and the distance between the tall seal and the ledge. For example, if the total thickness of the assembled flow cell was about 525 μm and the distance between the seal and the ledge was about 500 μm, then the compression distance would be designed to be about 25 μm.
別の実施形態では、圧縮公差は、接着層に形成されたチャネルの上のガスケット領域を完全に取り囲むシールを形成することによって低減でき(図9B)、これにより、ガスケットが固体支持体に向かって撓むのを防止できる。これは図9Bに例示され、フローチャネルはガスケット層(130)を底面として形成され得る。これにより、コネクターの流動抵抗に悪影響を与えずに、製作公差による可変圧縮が可能になる。 In another embodiment, the compression tolerance can be reduced by forming a seal that completely surrounds the gasket area above the channel formed in the adhesive layer (FIG. 9B), which causes the gasket to face the solid support. Bending can be prevented. This is illustrated in Figure 9B, where the flow channels may be formed with the gasket layer (130) as the bottom surface. This allows variable compression due to manufacturing tolerances without adversely affecting the flow resistance of the connector.
特定の実施形態では、ガスケットは、少なくとも5μm及び30μm以下で圧縮されるように設計される。他の実施形態では、圧縮距離は、少なくとも5μmであるように設計されるが、最大距離は、圧縮がガスケットを変形させなければ、200μmまであり得る。図に表されるように、ガスケットと流体コネクターとの間の強固なシールを作製するためには、ガスケットの表面の粗度/変化より大きい距離でガスケットが圧縮されることが望ましい。いくつかの実施形態では、ガスケットは、ガスケットが変形して、固体支持体表面に対してシールする(基板を超えて延在するチャネルを遮断する)ほど強く圧縮されるべきではない。ガスケットの圧縮は、好ましくはチャネルの高さの半分未満でなければならない。ガスケットの表面粗度を、非常になめらかなマスターモールドを使用したモールド成形の後で<1μmであると仮定すれば、厚さ/表面の変動は支配的パラメーターである。ガスケットの厚さの変動は±5−10μmのオーダーであってよく、同様の公差が流体コネクターのステップサイズにも予想される。特定の実施形態では、標的ガスケットは、25μm±12.5μmに画成されてよい。 In certain embodiments, the gasket is designed to be compressed by at least 5 μm and 30 μm or less. In other embodiments, the compression distance is designed to be at least 5 μm, but the maximum distance can be up to 200 μm if compression does not deform the gasket. As shown in the figure, in order to make a strong seal between the gasket and the fluid connector, it is desirable that the gasket be compressed at a distance greater than the roughness/variation of the gasket surface. In some embodiments, the gasket should not be compressed so strongly that the gasket deforms and seals against the solid support surface (blocking channels extending beyond the substrate). The compression of the gasket should preferably be less than half the height of the channel. Assuming that the gasket surface roughness is <1 μm after molding using a very smooth master mold, thickness/surface variation is the dominant parameter. Variations in gasket thickness may be on the order of ±5-10 μm, and similar tolerances are expected for fluid connector step sizes. In certain embodiments, the target gasket may be defined at 25 μm±12.5 μm.
特定の実施形態では、固体支持体(150)生体試料を含有してよい。特定の実施形態では、サブアセンブリ(100)の基板(120)との結合力は、組立て装置(160)がシールを維持するためにクランプされる必要がなければ十分であると思われる。必要な結合力は、正常な流動条件下で起こる圧力降下、基板及び固体支持体の可撓性、正常な動作温度並びにサブアセンブリ材料及び固体支持体と接触する化学物質に依存すると思われる。 In certain embodiments, a solid support (150) biological sample may be included. In certain embodiments, the bond strength of the subassembly (100) with the substrate (120) may be sufficient if the assembly device (160) does not need to be clamped to maintain a seal. The required cohesive strength will depend on the pressure drop that occurs under normal flow conditions, the flexibility of the substrate and solid support, the normal operating temperature and the chemicals in contact with the subassembly material and solid support.
サブアセンブリ(100)及び関連する組立てフローセル(160)の高さは、試料の厚さに基づいて決定することができる。試料が組織切片である場合、試料は約1μmから約100μmの間の厚さを有すると思われる。いくつかの実施形態では、組織切片は最大25mm×50mmの面積を占めてよい。これは、1μLから1000μL、好ましくは25μLから200μLの範囲の少量のセル内容積又はサブアセンブリの保持容量をもたらし、サブアセンブリの寸法により決定される。サブアセンブリは、試料の寸法の違いに応じて異なった設計にし、試料を封入したままでセル内容積を最小化することができる。特定の実施形態では、寸法公差は、互換性のある自動装置又は試薬容積の調節に関連すると思われる。例えば、特定の実施形態では、壁の幅又は高さの寸法公差は±10μmであり得る。他の実施形態では、公差は±6.25μmであり得、さらに他の実施形態では、公差は±5μmであり得る。公差は、自動装置の使用をさらに補助し得るものである。 The height of the subassembly (100) and associated assembly flow cell (160) can be determined based on the thickness of the sample. If the sample is a tissue section, the sample will have a thickness of between about 1 μm and about 100 μm. In some embodiments, the tissue section may occupy an area of up to 25 mm x 50 mm. This results in a small in-cell volume or subassembly holding volume in the range of 1 μL to 1000 μL, preferably 25 μL to 200 μL, and is determined by the dimensions of the subassembly. The subassemblies can be designed differently depending on the size of the sample to minimize the internal cell volume while still enclosing the sample. In certain embodiments, dimensional tolerances are believed to be associated with compatible automated equipment or reagent volume adjustments. For example, in certain embodiments, the wall width or height dimensional tolerance may be ±10 μm. In other embodiments, the tolerance may be ±6.25 μm, and in yet other embodiments, the tolerance may be ±5 μm. Tolerances can further aid the use of automated equipment.
サブアセンブリ(100)が機械的に可撓性である場合、流体が組立てフローセルの中を流動する時にサブアセンブリ(100)は曲がってもよい。機械的に可撓性の原因は、接着層、ガスケット、基板又はこれらの組合せによる。例えば、特定の実施形態では、基板(120)は、軟質可撓性ポリマーフィルム又は破壊せずに変形する十分な曲げ弾性率を有するガラスであってよい。他の実施形態では、ガスケットは、ガラスカバースリップ上にオーバーモールドされ、それによってこのガラスカバースリップが基板層(120)になってもよい。 If the subassembly (100) is mechanically flexible, the subassembly (100) may bend as fluid flows through the assembly flow cell. The cause of mechanical flexibility is due to the adhesive layer, gasket, substrate or combinations thereof. For example, in certain embodiments, the substrate (120) may be a soft flexible polymer film or glass having a sufficient flexural modulus to deform without breaking. In other embodiments, the gasket may be overmolded onto a glass coverslip, which then becomes the substrate layer (120).
したがって、特定の実施形態では、基板は可撓性材料層として機能可能である。流動が正圧で誘導される場合、可撓性材料層は、固体支持体から遠ざかるように曲がり、フローセルの中心においてより大きなチャンバー容積を効率的に作り出す。これらの場合、流動抵抗は中心においてより小さく、中心ではより多くの流動が起こる。流動が負圧で誘導される場合、可撓性材料層は固体支持体に向いて曲がり、フローセルの中心においてより小さなチャンバー容積を効率的に作り出す。このことは、フローセルの外側の端がより小さい流動抵抗を有し、より多くの流動がこれらの領域において起こることを意味する。したがって、可撓性材料は、流動コントローラーとして機能し得る。特定の実施形態では、固体支持体(150)は可撓性であり、同様の様式で機能的であり得る。 Thus, in certain embodiments, the substrate can function as a layer of flexible material. When the flow is induced with positive pressure, the layer of flexible material bends away from the solid support, effectively creating a larger chamber volume in the center of the flow cell. In these cases, the flow resistance is smaller in the center and more flow occurs in the center. When the flow is induced with negative pressure, the flexible material layer bends towards the solid support, effectively creating a smaller chamber volume in the center of the flow cell. This means that the outer edge of the flow cell has a smaller flow resistance and more flow occurs in these areas. Therefore, the flexible material may act as a flow controller. In certain embodiments, the solid support (150) is flexible and can be functional in a similar fashion.
特定の実施形態では、この切り替え可能な流動抵抗を使用して、連続的な正圧及び負圧により前後に流動することによって、フローセル全体に確実に均一な流体送達が可能である。流体は、フローセルの中心域を優先的に流動し、その後セルの外縁を優先的に流動する。このことは、組織染色が非常に幅の広いフローセルで実施され、均一な染色が重量である分子病理学応用にとって特に有用である。 In certain embodiments, this switchable flow resistance can be used to ensure forward and backward flow with continuous positive and negative pressure to ensure uniform fluid delivery throughout the flow cell. The fluid preferentially flows in the central region of the flow cell and then preferentially at the outer edge of the cell. This is particularly useful for molecular pathology applications where tissue staining is performed in a very wide flow cell and uniform staining is heavy.
切り替え可能な流動抵抗はさらに、フローセルの中心に確実に気泡を進入させないように使用することができる。例えば、フローセルと流体送達との間の流体接続を作製する場合、空気を接続接合面において導入する可能性がある。このような接続を作製後、負圧により流動させることによって、系の中のすべての空気がフローセルの外縁に沿って流動し、その後セルから出て行く。基板が可撓性ではなかった場合、空気はフローセルの中心に進入すると思われ、セルの寸法及び流動特性に依存して捕捉され得る。これらの気泡は流体流動を遮断し、セル内の内容物への均一な流体送達を妨げることがある。さらに、機械的可撓性材料を使用することは、フローセル全体にわたる流動抵抗の変化を調節して、より均一な流体送達並びに系の始動及びセル中の空気の捕捉の防止を容易にする優先的流動を達成することができる。 The switchable flow resistance can also be used to ensure that no bubbles enter the center of the flow cell. For example, when making a fluid connection between a flow cell and a fluid delivery, air may be introduced at the connection interface. After making such a connection, negative pressure flow causes all the air in the system to flow along the outer edge of the flow cell and then out of the cell. If the substrate was not flexible, air would likely enter the center of the flow cell and may be trapped depending on the cell size and flow characteristics. These bubbles block fluid flow and can prevent uniform fluid delivery to the contents within the cell. In addition, the use of mechanically flexible materials regulates changes in flow resistance throughout the flow cell, facilitating more uniform fluid delivery and system startup and prevention of air entrapment in the cell. Flow can be achieved.
特定の実施形態では、可撓性材料層又は蓋として機能する基板及び/又はガスケットの可撓性は、マイクロ流体フローセル内において最適な高倍率撮像を提供する方法をさらに提供する。したがって、好ましい実施形態では、例えば、基板がカバースリップ又はカバースリップ材料を含む場合、基板は、適切な波長範囲における撮像のために透明である。したがって、フローチャンバーは、可撓性の透過性の蓋と共に得られ、この蓋は試料に対して引き下げて、従来のカバースリップ固体支持体をシミュレーションし、マイクロ流体チャンバーを損傷又は取り外さずに画像の質を改良することができる。 In certain embodiments, the flexibility of the substrate and/or gasket that acts as a layer of flexible material or lid further provides a way to provide optimal high magnification imaging within a microfluidic flow cell. Thus, in a preferred embodiment, the substrate is transparent for imaging in the appropriate wavelength range, for example when the substrate comprises a coverslip or coverslip material. Thus, the flow chamber is obtained with a flexible, permeable lid that is pulled down against the sample to simulate a conventional coverslip solid support and allow for imaging of the image without damaging or removing the microfluidic chamber. The quality can be improved.
特定の実施形態では、可撓性材料層は、チャンバーが加圧又は減圧された場合、試料から遠ざかるように押される、又は試料に向かって曲がるように構成される。これは、マイクロ流体系における典型的動作である、フローセルチャンバー由来の流体、ガス又は液体の添加又は除去によって容易に達成される。入口のポンプ及び出口のポンプを用いて、これらのポンプは蓋の曲率に大幅な影響を与えずに、ユニゾンで運転して液体を流動させることができる。曲げが望ましい場合、ポンプは、不一致の速度で、又は逆方向に動作するように作製して、正又は負の曲率を得ることができる。負圧下のチャンバーを用いて、蓋を試料に向かって(又は対抗して)引き下げ、試料と蓋との間の流体の高さを低減する。このことにより、撮像系が画像撮影する流体の深さが低減され、画像の質が改良される。特定の解像度/コントラストにおいて、マイクロ流体チャネルの撮像の際に、流体の中の光散乱及び準最適光結合のために不都合を被ることがある。したがって、撮像の間フローチャンバー中の流体の総高をさらに低減させるために流体を正常に流動させながら、可撓性の蓋は、試料全域にわたるマイクロ流体チャンバーを作り出す。 In certain embodiments, the layer of flexible material is configured to be pushed away from the sample or bend toward the sample when the chamber is pressurized or evacuated. This is readily accomplished by the addition or removal of fluids, gases or liquids from the flow cell chamber, which is typical of microfluidic systems. With an inlet pump and an outlet pump, these pumps can be operated in unison to flow liquid without significantly affecting the curvature of the lid. If bending is desired, the pump can be made to operate at mismatched speeds or in opposite directions to obtain positive or negative curvature. A chamber under negative pressure is used to pull the lid down (or against) the sample, reducing the height of fluid between the sample and the lid. This reduces the depth of fluid imaged by the imaging system and improves image quality. At certain resolutions/contrasts, imaging of microfluidic channels may suffer from light scattering in the fluid and suboptimal optical coupling. Thus, the flexible lid creates a microfluidic chamber across the sample while allowing the fluid to flow normally during imaging to further reduce the total height of the fluid in the flow chamber.
図10は、倍率×20の対物レンズによるヒト組織切片の撮像の結果である。連続画像は、50μmの凸状の過充填フローセルから約−50μmの凹状のアンダーフィルフローセルまでのさまざまな進行時点における進行を示す。測定は、顕微鏡の焦点を変えることにより測定された約のz−高さである。ゼロ点はほぼ平坦なフローセルガラス表面に相当する。図に示されるように、画像の質は、試料と可撓性の蓋との間の液体の高さに影響を与えるチャンバー中の圧力変化に基づいて変化する。 FIG. 10 shows the result of imaging a human tissue section with an objective lens of ×20. Serial images show the progression at various time points from a 50 μm convex overfilled flow cell to a -50 μm concave underfilled flow cell. The measurement is about z-height measured by changing the focus of the microscope. The zero point corresponds to a nearly flat flow cell glass surface. As shown, the image quality changes based on the pressure change in the chamber that affects the height of the liquid between the sample and the flexible lid.
特定の実施形態では、カバースリップはケイ酸塩ガラスもしくはホウケイ酸ガラスなどのガラス、又は正確な光透過性を有するNUNC(商標)ブランドのThermanox(登録商標)カバースリップなどのスペシャリティープラスチックからなり得る。例えば蛍光顕微鏡のために紫外線透過性が要求される場合、石英ガラスカバースリップもまた使用することができる。 In certain embodiments, the coverslip may be made of glass, such as silicate glass or borosilicate glass, or specialty plastics such as NUNC™ brand Thermanox® coverslips that have precise light transmission. .. Quartz glass coverslips can also be used if UV transmission is required, for example for fluorescence microscopy.
特定の実施形態では、可撓性の蓋の変形は、フローセルの体積容量に依存する。特定の実施形態では、蓋の撓みは、使用する材料に関係すると思われ、例えば材料がシリコーンである場合、材料が可撓性透過性の袋として機能することによって大幅な可撓性が得られる。特定の実施形態では、蓋の撓みは、約±200μmである。好ましい実施形態では、撓みは−50から+200μmの間であり、最も好ましくは−50から+100μmの間であり、−20から+50μmのz高さの変化をもたらし得る。したがって、可撓性の蓋の変形は、フローチャンバー内の流体の高さを最小化して、流体により引き起こされる球面収差を最小化することによって、試料の最適な撮像(最大の解像度及びコントラスト)を可能にする。 In certain embodiments, the deformation of the flexible lid depends on the volumetric capacity of the flow cell. In certain embodiments, the flexing of the lid may be related to the material used, for example when the material is silicone, the material acts as a flexible permeable bag to provide significant flexibility. .. In a particular embodiment, the deflection of the lid is about ±200 μm. In a preferred embodiment, the deflection is between −50 and +200 μm, most preferably between −50 and +100 μm, which may result in a z-height change of −20 to +50 μm. Therefore, the deformation of the flexible lid minimizes the height of the fluid in the flow chamber and thus minimizes the spherical aberration caused by the fluid, thus providing optimal imaging of the sample (maximum resolution and contrast). enable.
特定の実施形態では、好ましい変形は、試料と可撓性の蓋との間に液体がほとんどないことである。したがって一実施形態では、撓みは、接着層の厚さ−試料の厚さ(25umの高さのチャンバー及び4umの組織切片に対して約20um)の範囲である。 In certain embodiments, a preferred variation is that there is little liquid between the sample and the flexible lid. Thus, in one embodiment, the deflection is in the range of adhesion layer thickness-sample thickness (about 20 um for a 25 um high chamber and 4 um tissue section).
特定の実施形態では、組立てフローセル(160)は、チャンバー内を流動し得る流体又は再水和される乾燥試薬を収容できるプラスチックカートリッジと整合させることができる。特定の分子病理学用途において、このような試薬カートリッジを使用して、特定の試験用のバイオマーカーを予めパックした特定のパネルを収容することができる。このカートリッジは、使用者によりカスタマイズされた試薬を添加するように設計することもできる。 In certain embodiments, the assembled flow cell (160) can be aligned with a plastic cartridge that can contain a fluid that can flow in the chamber or a dry reagent that is rehydrated. In certain molecular pathology applications, such reagent cartridges can be used to house specific panels pre-packed with biomarkers for specific tests. The cartridge can also be designed to add user-customized reagents.
特定の実施形態では、組立てフローセルは、サブアセンブリ及び固体支持体を備え、この固体支持体は生体試料を担持している。試料は、固体支持体に結合されたサブアセンブリにより完全に封入される。特定の実施形態では、接着は、恒久的又は半恒久的に固体支持体に結合されたサブアセンブリをもたらし、それによって、サブアセンブリの取り外しがフローセルを消耗し、試料のさらなる分析のために新しいフローセルのアセンブリを必要とする恐れがある。フローセルが再使用可能である必要はないが、単一の固体支持体に取り付けたままで消耗可能な部品であり得るような、単純な装置構造が低コストの製造を可能にする。 In certain embodiments, the assembled flow cell comprises a subassembly and a solid support, the solid support carrying a biological sample. The sample is completely enclosed by the subassembly bound to the solid support. In certain embodiments, gluing results in a subassembly permanently or semi-permanently bonded to a solid support, whereby removal of the subassembly consumes the flow cell and a new flow cell for further analysis of the sample. Assembly may be required. Although the flow cell does not need to be reusable, the simple device structure allows low cost manufacturing, as it can be a consumable part that remains attached to a single solid support.
特定の実施形態では、フローセルは、撮像装置ステージ、例えば顕微鏡、温度管理系又は流体装置などの装置の別の部品の取付け点と適合するように構成された1以上の取付け点を備える。特定の実施形態では、取付け点は、フローセルと撮像装置の対物レンズと位置が合うように構成される。 In certain embodiments, the flow cell comprises one or more attachment points configured to match attachment points of another part of the device, such as an imager stage, eg, microscope, thermal management system or fluidic device. In certain embodiments, the attachment point is configured to align with the flow cell and the objective lens of the imager.
特定の実施形態では、生体試料を封入する得られたフローセルは、さまざまな試薬及び撮像工程に曝露され得る。特定の実施形態では、封入された試料を含有するフローセルは、その後の分析のために、又は初期工程の後の事後分析のためにそのまま保管されてもよい。他の実施形態では、サブアセンブリは、生体試料以外の材料を担持する固体支持体に接着されてもよい。例えば、固体支持体は、限定するものではないが、化学物質、機械的構造又はこれらの組合せを含有してもよい。特定の実施形態では、材料は、表面に結合された化学品、ポリマー及び機械的構造、例えば、限定するものではないが、マイクロ電気機械的センサー、アクチュエーター及び流動遮断素子であってもよい。得られたマイクロ流体フローセルはその後、含有される材料の分析又は機能化に使用できる。 In certain embodiments, the resulting flow cell encapsulating the biological sample may be exposed to various reagents and imaging steps. In certain embodiments, the flow cell containing the encapsulated sample may be stored as is for subsequent analysis, or for post hoc analysis after the initial steps. In other embodiments, the subassembly may be adhered to a solid support that carries materials other than biological samples. For example, the solid support may include, but is not limited to, chemicals, mechanical structures or combinations thereof. In certain embodiments, the material may be surface-bound chemicals, polymers and mechanical structures such as, but not limited to, microelectromechanical sensors, actuators and flow blocking elements. The resulting microfluidic flow cell can then be used for analysis or functionalization of the contained material.
特定の実施形態では、フローセルは、限定するものではないが、DNAの分析又は増幅、RNAの分析又は増幅、核酸シークエンシング、タンパク質分析、抗原賦活化、ヘマトキシリン及びエオシン染色(H&E)、免疫蛍光染色(IF)、免疫組織化学染色(IHC)、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)又は他の組織学的及び形態学的染色技術を含む組織又は細胞分析に使用することができる。 In certain embodiments, the flow cell includes, but is not limited to, DNA analysis or amplification, RNA analysis or amplification, nucleic acid sequencing, protein analysis, antigen retrieval, hematoxylin and eosin staining (H&E), immunofluorescent staining. It can be used for tissue or cell analysis, including (IF), immunohistochemical staining (IHC), fluorescence in situ hybridization (FISH) or other histological and morphological staining techniques.
特定の実施形態では、組織切片に対するDNA蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)又はRNA FISHが、マイクロ流体チャンバーにおいて実施できる。したがって、特定の実施形態では、接着フローセルを組織スライドに適用して、マイクロ流体チャンバーが作り出される。次いで、試薬の流動、場合により(蒸発防止又は加圧を可能にするために)フローセルのシーリング及び必要に応じてフローセルの温度調節により、FISHが組織に対して実施される。この工程が完了後、チャンバーは場合により封入剤で満たされ、組織はフローセル中で撮像可能になる。フローセルは、後続の工程ステップ又は貯蔵のために組織スライド上に留まる。 In certain embodiments, DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) or RNA FISH on tissue sections can be performed in a microfluidic chamber. Thus, in certain embodiments, an adhesive flow cell is applied to a tissue slide to create a microfluidic chamber. FISH is then performed on the tissue by flowing the reagents, optionally sealing the flow cell (to allow evaporation prevention or pressurization) and optionally adjusting the temperature of the flow cell. After this step is complete, the chamber is optionally filled with encapsulant and the tissue can be imaged in the flow cell. The flow cell remains on the tissue slide for subsequent process steps or storage.
フローセルは、組織に対して安全な一貫した手段で、信頼できる気密なチャンバーを作り出す。この取り組みもまた、その後のチャンバーの取り外しを必要としない。フローセルを流体素子の自動化に使用して、FISH工程を実施することができ、この例は図11の工程マップに示される。このステップは、限定するものではないが、水によるすすぎ(A)、ペプシン消化(B)、水によるすすぎ(C)、PBS洗浄(D)、ホルマリン固定(E)、PBS+MgCL2洗浄(F)、PBS洗浄(G)、アルコール脱水(H)、さまざまな条件におけるプローブのインキュベーション(I及びJ)、SSC及びNP40の溶液によるその後の洗浄(K)、DAPI染色(L)、SSC洗浄(M)並びに撮像(N)を含む。 The flow cell creates a reliable, airtight chamber in a consistent and safe way to the tissue. This approach also does not require subsequent chamber removal. The flow cell can be used to automate a fluidic device to perform a FISH process, an example of which is shown in the process map of FIG. This step includes, but is not limited to, water rinse (A), pepsin digestion (B), water rinse (C), PBS wash (D), formalin fixation (E), PBS+MgCL2 wash (F), PBS. Wash (G), alcohol dehydration (H), probe incubation in various conditions (I and J), subsequent wash with solution of SSC and NP40 (K), DAPI staining (L), SSC wash (M) and imaging. (N) is included.
したがって、他の実施形態では、マイクロ流体フローの固体支持体に結合された生体試料の分析の一般的方法は、(a)試料と、組織学、形態学又は分子分析を伴う技術に対応する試薬とを、試薬を流体コネクターを通して流動させることによって接触させるステップ、(b)生体試料からのシグナルを検出するステップ、並びに(c)試料の組織学的、形態学的又は分子的成分を分析するステップ、を含む。他の実施形態では、試料からのシグナルを不活性化して、この工程ステップを反復してもよい。 Thus, in another embodiment, a general method for analysis of a biological sample bound to a microfluidic flow solid support is: (a) sample and reagents corresponding to techniques involving histology, morphology or molecular analysis. Are contacted by flowing a reagent through a fluid connector, (b) detecting a signal from a biological sample, and (c) analyzing histological, morphological or molecular components of the sample. ,including. In other embodiments, the signal from the sample may be inactivated and this process step repeated.
マイクロ流体フローセル内に封入され、半自動熱流体系に整合された組織マイクロアレイを用いて実験を実施した。全DNA FISH工程が、マイクロ流体フローセル中での実施及びこの系を使用した検証に成功した。 Experiments were performed with tissue microarrays enclosed in a microfluidic flow cell and matched to a semi-automatic thermofluidic system. The whole DNA FISH process has been successfully performed in a microfluidic flow cell and validated using this system.
マイクロ流体フローセルは、自動化及び反復性の利益を免疫組織化学(IHC)処理にもたらし、したがって同じ利益がDNA FISHに適用される。マイクロ流体フローセル中のIHCの自動化と比較して、DNA FISHの自動化は、熱及び多種多様な試薬の添加のためより複雑である。 Microfluidic flow cells bring automation and repeatability benefits to immunohistochemistry (IHC) processing, and therefore the same benefits apply to DNA FISH. Compared to IHC automation in microfluidic flow cells, DNA FISH automation is more complicated due to heat and the addition of a wide variety of reagents.
DNA FISH工程は、スライドを1時間、60℃において焼き、その後スライドをきれいにし、水和及び抗原賦活化の試料調製をフローセル組立ての前に含んだ。フローセルにおけるDNA FISHプロトコルは、Abbot Laboratoriesにより供給されたVysisの市販のプローブのHer2/CEP17遺伝子マーカー用に最適化した。 The DNA FISH step involved baking slides for 1 hour at 60° C., then cleaning slides and hydrating and antigen-stimulating sample preparation prior to flow cell assembly. The DNA FISH protocol in the flow cell was optimized for the Her2/CEP17 gene marker of the Vysis commercial probe supplied by Abbott Laboratories.
フローセルプロトコルは、試薬希釈の最小化及び気泡捕捉の回避のために各ステップの間にパージ及び始動のステップを含んだ。パージ及び始動ステップは、フローセルの入口から、チュービングライン(tubing line)に液体がなくなるまで吸引し、CO2エアガンを手作業で使用してフローセルから空気をパージし、すべての液体残留物を出口に押し出して、CO2エアガンを手作業で使用して空気を出口チュービングからパージするステップ、及び、フローセルを次の試薬により始動させるステップからなる。CO2によるパージ、その後の急速な始動が、気泡と比較して高いCO2泡の水への溶解度のため、気泡の捕捉を防止する。CO2パージの自動化は当業者には明らかであると思われる。 The flow cell protocol included purging and starting steps between each step to minimize reagent dilution and avoid bubble trapping. The purge and start-up steps include suctioning from the inlet of the flow cell until there is no liquid in the tubing line and manually using a CO 2 air gun to purge air from the flow cell and leaving any liquid residue at the outlet. extrusion, the step of the CO 2 air gun using manually purge air from the outlet tubing, and, comprising the step of starting the flow cell by the following reagents. Purging with CO 2 followed by rapid startup prevents entrapment of bubbles due to the higher solubility of CO 2 bubbles in water compared to bubbles. Automation of CO2 purging would be apparent to one of ordinary skill in the art.
実験の構成は、加熱系と連動した順方向流体流動のためのシリンジポンプからなった。各試薬を、指定の流速で指定の時間、プロトコルに従って連続して流動させた。その後フローセルを流動構成から取り外し(下記にさらに記載)、試薬シリンジを次の試薬に交換し、系のチュービングを再始動した。フローセルをまず液体を引き抜く(シリンジを使用して吸引を適用)ことによって空にして、その後、フローセルをCO2でパージして液体を系から押し出し、フローセル中の大気をCO2(より容易に水に溶解し、フローセル中に捕捉される気泡を最小化する)と置き換えた。この取り組みは自動ではなかったが、試薬希釈はフローセル内部で1つの試薬を別の試薬に完全に交換するためにより大きな試薬容積を必要とするので、試薬希釈を最小化するために用いた。 The experimental set up consisted of a syringe pump for forward fluid flow in conjunction with the heating system. Each reagent was allowed to flow continuously according to the protocol at the specified flow rate for the specified time. The flow cell was then removed from the flow configuration (further described below), the reagent syringe was replaced with the next reagent, and system tubing was restarted. The flow cell is emptied by first withdrawing the liquid (applying suction using a syringe), then purging the flow cell with CO 2 to force the liquid out of the system and removing the atmosphere in the flow cell from CO 2 (more easily to water). To minimize air bubbles trapped in the flow cell). This approach was not automatic, but was used to minimize reagent dilution because reagent dilution requires a larger reagent volume to completely replace one reagent with another inside the flow cell.
圧力下で水が沸騰した結果、セル中に気泡形成が観察され得ることは注目に値する。FISHプローブは通常、普通ホルムアミド、デキストラン及びクエン酸緩衝食塩水(SSC)の混合物からなる特殊なバッファー希釈される。このようなバッファーは水より高い沸点を有し、このことが80℃におけるDNA FISHインキュベーションの間の沸騰を防止するはずである。フローセル設計は溶液成分の蒸発を防止する。 It is noteworthy that bubbling of water under pressure can result in the formation of bubbles in the cell. FISH probes are usually diluted in a special buffer consisting of a mixture of formamide, dextran and citrate buffered saline (SSC). Such a buffer has a higher boiling point than water, which should prevent boiling during DNA FISH incubation at 80°C. The flow cell design prevents evaporation of solution components.
DNA FISHの実演に利用されるフローセルを図4に示す。これらのフローセルは、試薬流動のためのチュービングに容易に接続するための薄膜流体コネクターを組み込んだ。この場合、ポンプ系への接続は、チュービングと薄膜コネクターとの間の開閉磁気接続により作製した。このコネクターは、入口、Kaptonにより製造された薄いマイクロ流体チャネル及び接着層並びにフローセルに結合された出口を有する。入口はガスケットとして機能する薄いシリコーン層を有する。磁石(約2,000−2,700ガウス)を互いに引き合うようにコネクターの両側に配置して、コネクターをしっかりクランプし、ガスケット層の助けにより緊密なシールを形成する。 The flow cell used for the demonstration of DNA FISH is shown in FIG. These flow cells incorporated a thin film fluid connector for easy connection to tubing for reagent flow. In this case, the connection to the pump system was made by an opening and closing magnetic connection between the tubing and the thin film connector. The connector has an inlet, a thin microfluidic channel manufactured by Kapton and an adhesive layer, and an outlet coupled to a flow cell. The inlet has a thin silicone layer that acts as a gasket. Magnets (about 2,000-2,700 Gauss) are placed on each side of the connector to attract each other to clamp the connector tightly and form a tight seal with the help of the gasket layer.
磁気補助流体接続は、ぴったりと合う小さい内径のチュービング及び環状磁石の内側接着からなる。これらのコネクターは、図12Aに示すように、薄膜コネクターの入口側に対して配置され、より小さな円筒形磁石が薄膜コネクターの反対側に配置される。これらの磁石は薄膜コネクターへチュービングを引きつけ、結合し、2つの間に堅いシールを作り出す。磁石は、図12Bに示すように、チャンバーを封鎖するためにも使用される。この場合、同様の磁気強度を有する小型の固体円筒形磁石を使用して、入口及び出口に対して堅いシールを作り出し、どのような流体漏出も防止する。この取り組みはDNA FISHに使用した。 The magnetic auxiliary fluid connection consists of a snug fit small inside diameter tubing and an inner bond of an annular magnet. These connectors are placed against the inlet side of the thin film connector, with smaller cylindrical magnets placed on the opposite side of the thin film connector, as shown in FIG. 12A. These magnets attract and bond the tubing to the thin film connector, creating a tight seal between the two. The magnet is also used to seal the chamber, as shown in Figure 12B. In this case, a small solid cylindrical magnet with similar magnetic strength is used to create a tight seal for the inlet and outlet and prevent any fluid leakage. This approach was used for DNA FISH.
図13に示す画像は、消化で始まり、封入剤の適用とその後の撮像で終わる、マイクロ流体フローセルにおけるDNA FISH実験の成功を明示している。 The image shown in FIG. 13 demonstrates the success of the DNA FISH experiment in a microfluidic flow cell, starting with digestion and ending with application of encapsulant followed by imaging.
図13に示すように、画像はDAPI、CERP17及びHer2染色を含む。核は適切に消化されたように見え、FISHプローブは正確にハイブリダイズされ、蛍光シグナルがCEP17及びHer2チャネルの両方に存在した。 As shown in FIG. 13, the images include DAPI, CERP17 and Her2 staining. The nuclei appeared to be properly digested, the FISH probe hybridized correctly, and fluorescent signals were present on both CEP17 and Her2 channels.
本発明は、好ましい実施形態に関して記載してきたが、明白に述べられたものの他にも等価物、代替物及び変形が可能であり、それらは添付の特許請求の範囲内にあることが認知される。 While this invention has been described in terms of a preferred embodiment, it is recognized that equivalents, alternatives and modifications, in addition to those expressly stated, are within the scope of the appended claims. ..
100 サブアセンブリ装置、サブアセンブリ
110 接着層
120 基板層、基板
130 ガスケット、ガスケット層
140 流体の入口/出口ポート
150 固体支持体
160 マイクロ流体フローセル、組立てフローセル、組立て装置
170 チャネル領域
190 突出シーリング表面
195 レッジ
200 シーリング装置取付具
300 積層板、積層板層
310 上層及び下層
320 感圧接着剤
330 シリコーンガスケット
340 予備形成層
350 アセンブリ取付具
360 ポリマー薄膜コネクター
410 フローセルガスケット材料
420 サブアセンブリ
430 固体支持体
440 マイクロ流体フローセル
510 試薬ウェル
520 バルブ
100 Subassembly Device, Subassembly 110 Adhesive Layer 120 Substrate Layer, Substrate 130 Gasket, Gasket Layer 140 Fluid Inlet/Outlet Port 150 Solid Support 160 Microfluidic Flow Cell, Assembly Flow Cell, Assembly Device 170 Channel Region 190 Overhanging Sealing Surface 195 Ledge 200 Sealing Device Fixture 300 Laminate, Laminate Layer 310 Top and Bottom Layer 320 Pressure Sensitive Adhesive 330 Silicone Gasket 340 Preformed Layer 350 Assembly Fixture 360 Polymeric Thin Film Connector 410 Flow Cell Gasket Material 420 Subassembly 430 Solid Support 440 Microfluidic Flow cell 510 Reagent well 520 Valve
Claims (16)
a)マイクロ流体サブアセンブリであって、当該サブアセンブリが、
積層平面アセンブリであって、接着層と、透明基板層と、ガスケット層とを含み、
前記基板層が、一方の側で前記ガスケット層に接続され、他方の側で前記接着層に接続され、接着層及びガスケット層が基板層の範囲を超えて延在し、前記ガスケット層及び前記接着層の少なくとも一方が少なくとも1つの開口部を含む、積層平面アセンブリ、及び
基板層の境界の外側の位置で前記ガスケット層及び/又は前記接着層に配置された流体入口ポート及び出口ポート、ならびに入口ポートに接続された1つのポンプおよび出口ポートに接続された1つのポンプ
を備える、サブアセンブリと、
b)前記マイクロ流体サブアセンブリに接着した固体支持体と、
を備え、
前記基板層が、前記ポンプによるチャンバへの流体の添加又はチャンバからの流体の除去を通して正圧を印加することによって前記固体支持体から遠ざかるように曲がり、負圧を印加することによって前記固体支持体に向いて曲がり、かつその中心点から±200μmの範囲で撓み、前記固体支持体に担持される試料の取り込み画像の質を調整するように構成された、前記基板層と前記固体支持体との間にチャンバの可撓性の透明蓋を形成する、フローセル。 A microfluidic flow cell, the flow cell comprising:
a) a microfluidic subassembly, the subassembly comprising:
A laminated planar assembly comprising an adhesive layer, a transparent substrate layer, and a gasket layer,
The substrate layer is connected to the gasket layer on one side and the adhesive layer on the other side, the adhesive layer and the gasket layer extending beyond the range of the substrate layer, the gasket layer and the adhesive A laminated planar assembly, wherein at least one of the layers comprises at least one opening, and a fluid inlet port and an outlet port disposed on the gasket layer and/or the adhesive layer at a position outside the boundary of the substrate layers, and an inlet port A subassembly comprising one pump connected to the pump and one pump connected to the outlet port;
b) a solid support adhered to the microfluidic subassembly,
Equipped with
The substrate layer bends away from the solid support by applying a positive pressure through the addition or removal of fluid from the chamber by the pump, and the solid support by applying a negative pressure. bend facing, and that from the center point try Deflection in the range of ± 200 [mu] m, which is configured to adjust the quality of the captured image of the sample being supported on the solid support, and the substrate layer and the solid support A flow cell that forms a flexible, transparent lid of the chamber between.
フローセルと撮像装置の対物レンズとの位置を合わせるステップ、及び
フローセル中の液体の量を調節して、その中心点から±200μmの範囲で可撓性の蓋を撓ませるステップ
を含む方法。 A method for adjusting the quality of a captured image of a sample carried on a solid support of a flow cell according to claim 11.
A method comprising aligning a flow cell with an objective lens of an imaging device, and adjusting the amount of liquid in the flow cell to deflect the flexible lid within a range of ±200 μm from its center point.
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