JP6721881B2 - Cell scaffold material, cell model, and method for producing cell scaffold material - Google Patents
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Description
本発明は、細胞足場材料、細胞モデル、及び細胞足場材料の製造方法に関する。 The present invention relates to a cell scaffold material, a cell model, and a method for producing a cell scaffold material.
近年、生体を構成している細胞は、細胞外マトリクス（Extracellular Matrix、以下ＥＣＭ）の化学・力学特性を認識し、細胞機能を変化させていることが明らかになってきた。細胞は、細胞表面のタンパク質を介してECMと結合、接着し、ECMの硬さを認識していると考えられているが、そのメカニズムの詳細は不明である。特に、力学特性に関しては、生体組織の弾性率が不均一であることや加齢とともに弾性率が変化することが報告されているが、このような特性変化が細胞・組織に及ぼす影響は明らかになっていない（非特許文献１）。例えば、中枢神経系を構成する神経細胞やグリア細胞は、疾患や外傷による損傷を受けると再生が困難な組織であることが知られており、その原因の一端が損傷部位周辺のECM力学特性の変化である可能性が示唆されているが、未だ明らかになっていない（非特許文献２）。上記の、中枢神経系の再生も含め、再生医療の分野では、組織再生の際に細胞の足場となる基材が必要となるため、その基材の力学特性が細胞組織に与える影響を解明することは、基材の材料設計に重要となる。 In recent years, it has become clear that cells constituting a living body recognize the chemical/mechanical properties of extracellular matrix (ECM) and change the cell function. It is thought that cells bind and adhere to ECM via cell surface proteins and recognize the hardness of ECM, but the details of the mechanism are unknown. In particular, regarding mechanical properties, it has been reported that the elastic modulus of biological tissue is non-uniform and that elastic modulus changes with aging, but the effect of such characteristic changes on cells and tissues is clear. No (Non-Patent Document 1). For example, nerve cells and glial cells that make up the central nervous system are known to be tissues that are difficult to regenerate when damaged by disease or trauma, and one of the causes is the ECM mechanical properties around the damaged site. Although it is suggested that this may be a change, it has not been clarified yet (Non-Patent Document 2). In the field of regenerative medicine, including the regeneration of the central nervous system described above, a base material that serves as a scaffold for cells is required during tissue regeneration, and thus the effect of the mechanical properties of the base material on the cell tissue is clarified. This is important for the material design of the base material.
このような観点から、ポリジメチルシロキサン（Polydimethylsiloxane、PDMS）を代表とするエラストマや、水溶性高分子から構成されるハイドロゲルといった、ソフトマテリアルからなるフィルムの力学特性を制御し、フィルムの硬さに対する細胞応答を調べる方法が提案されている。今後は、加齢や、組織損傷などによる生体内の動的な力学特性変化を再現することで、組織再生の際に用いられる足場材料の力学特性をスクリーニングするためのin vitroモデルとして利用することが期待される。 From such a viewpoint, the mechanical properties of a film made of a soft material such as an elastomer typified by polydimethylsiloxane (PDMS) and a hydrogel composed of a water-soluble polymer are controlled to control the hardness of the film. Methods for examining cellular responses have been proposed. In the future, it will be used as an in vitro model for screening the mechanical properties of scaffold materials used for tissue regeneration by reproducing dynamic mechanical property changes in vivo due to aging and tissue damage. There is expected.
脳組織のようにＥＣＭの深さが組織構造の重要な指標となる場合など、細胞が認識可能なＥＣＭ力学特性の深さを明らかにする必要がある。そのためには、厚さが制御された足場材料が求められる。
従来、様々な弾性率の足場材料上で細胞培養が行われてきたが、生体組織の弾性率は不均一であるため、生体内での細胞のＥＣＭ力学特性認識をin vitroで再現・検討するためには、同一基板上で弾性率が異なる領域を有する足場材料を用いることが望ましい。
また、生体内では外的刺激などで弾性率が変化するのに対し、これまでの足場材料は弾性率を変化させることが困難であった。ＥＣＭの力学特性に対する細胞・組織の応答をより詳細に調べるためには、細胞培養下においてin situで弾性率を変化させることができる機能的な足場材料が求められる。
It is necessary to clarify the depth of ECM mechanical properties that can be recognized by cells, such as when the depth of ECM is an important index of tissue structure as in brain tissue. Therefore, a scaffold material having a controlled thickness is required.
Conventionally, cell culture has been performed on scaffold materials with various elastic moduli, but since the elastic moduli of biological tissues are non-uniform, we will reproduce and study ECM mechanical property recognition of cells in vivo in vitro. Therefore, it is desirable to use a scaffold material having regions having different elastic moduli on the same substrate.
Further, in the living body, the elastic modulus is changed by an external stimulus or the like, whereas it has been difficult for the conventional scaffold materials to change the elastic modulus. In order to investigate the response of cells/tissues to the mechanical properties of ECM in more detail, a functional scaffold material capable of changing the elastic modulus in situ in cell culture is required.
このような問題を解決するために、本発明は、フィルム状であり、光照射により力学特性を変化させることが可能な細胞足場材料を提供する。また本発明は、フィルム状であり、弾性率が異なる領域を有する細胞足場材料を提供する。また本発明は、前記細胞足場材料と前記細胞足場材料で培養される細胞とを備える細胞モデルを提供する。また本発明では前記細胞足場材料の製造方法を提供する。 In order to solve such a problem, the present invention provides a cell scaffolding material which is in the form of a film and whose mechanical properties can be changed by light irradiation. The present invention also provides a cell scaffold material having a film shape and regions having different elastic moduli. The present invention also provides a cell model including the cell scaffold material and cells cultured in the cell scaffold material. The present invention also provides a method for producing the cell scaffold material.
本発明の一態様は、高分子化合物を含む網目構造を有するフィルム状のゲルを備え、前記ゲルは領域Ａと領域Ｂとを有し、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低い、細胞足場材料である。 One embodiment of the present invention includes a film-like gel having a network structure containing a polymer compound, the gel having a region A and a region B, the elastic modulus of the region B is lower than the region A, Cell scaffolding material.
本発明の一態様は、上記細胞足場材料であって、前記高分子化合物が、ポリアクリルアミド系樹脂を含む。 One aspect of the present invention is the above-mentioned cell scaffolding material, wherein the polymer compound includes a polyacrylamide resin.
本発明の一態様は、上記細胞足場材料であって、前記ゲルが、光異性化構造を有し光照射によって二本鎖が解離及び／又は形成する核酸を含む。 One embodiment of the present invention is the above-mentioned cell scaffolding material, wherein the gel contains a nucleic acid having a photoisomerization structure and having double strands dissociated and/or formed by light irradiation.
本発明の一態様は、上記細胞足場材料と、上記細胞足場材料で培養される細胞と、を備える、細胞モデルである。 One aspect of the present invention is a cell model including the above-mentioned cell scaffold material and cells cultured in the above cell scaffold material.
本発明の一態様は、上記細胞モデルであって、前記細胞が神経細胞及び／又はグリア細胞を含む。 One embodiment of the present invention is the above-mentioned cell model, wherein the cells include nerve cells and/or glial cells.
本発明の一態様は、高分子化合物を含む網目構造を形成するフィルム状のゲル、又は前記ゲルの構成材料を含有する足場材料組成物の一部の領域に光照射して領域Ａと領域Ｂとに分け、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率を低下させる光照射工程を有し、前記網目構造は、光照射により前記網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものである、細胞足場材料の製造方法である。 One embodiment of the present invention is to irradiate a partial region of a film-like gel forming a network structure containing a polymer compound or a scaffold material composition containing a constituent material of the gel with a region A and a region B. And a light irradiation step of lowering the elastic modulus of the region B than that of the region A, and the network structure is one in which a chemical bond forming the network structure is generated or broken by the light irradiation. A method for producing a cell scaffold material.
本発明の一態様は、上記細胞足場材料の製造方法であって、前記光照射工程の前に、光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分を含む再膨潤液に、前記ゲルを含浸させる再膨潤工程を有する。 One aspect of the present invention is a method for producing the above-mentioned cell scaffold material, wherein, before the light irradiation step, a re-swelling liquid containing a component in which a chemical bond constituting itself is generated or cleaved by light irradiation, It has a re-swelling step of impregnating the gel.
本発明によれば、光照射により力学特性を変化させることが可能な細胞足場材料を提供できる。
また本発明によれば、弾性率が異なる領域を有する細胞足場材料を提供できる。
また本発明によれば、前記細胞足場材料と前記細胞足場材料で培養される細胞とを備える細胞モデルを提供できる。
また本発明によれば、前記細胞足場材料の製造方法を提供できる。
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the cell scaffold material which can change a mechanical characteristic by light irradiation can be provided.
Further, according to the present invention, a cell scaffold material having regions having different elastic moduli can be provided.
Further, according to the present invention, it is possible to provide a cell model including the cell scaffold material and cells cultured with the cell scaffold material.
Further, according to the present invention, a method for producing the cell scaffold material can be provided.
以下、本発明の細胞足場材料、細胞モデル、及び細胞足場材料の製造方法の実施形態を説明する。 Hereinafter, embodiments of the cell scaffold material, the cell model, and the method for producing the cell scaffold material according to the present invention will be described.
≪細胞足場材料≫
（１）細胞足場材料の第一の実施形態
本実施形態の細胞足場材料は、高分子化合物を含む網目構造を形成するフィルム状のゲルを備え、前記網目構造は、光照射により網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものであり、前記ゲルへ光照射によって 領域Ａと領域Ｂとが分けられたとき、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低くなるよう変化するものである。
≪Cell scaffolding material≫
(1) First Embodiment of Cell Scaffolding Material The cell scaffolding material of the present embodiment includes a film-like gel that forms a network structure containing a polymer compound, and the network structure forms a network structure by light irradiation. When the gel is irradiated with light, the elastic modulus of the region B is lower than that of the region A when the region A and the region B are separated from each other. is there.
前記網目構造は、ゲルを構成する分散質の少なくとも一部として、実施形態に係るゲルに含有される。網目構造は、ゲルの分散質の少なくとも一部又は全部を構成可能で、光照射により網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものあれば特に制限されるものではない。 The network structure is contained in the gel according to the embodiment as at least a part of the dispersoid constituting the gel. The network structure is not particularly limited as long as it can form at least a part or all of the dispersoid of the gel and that the chemical bonds forming the network structure are generated or broken by irradiation with light.
光照射により網目構造の化学結合が生成又は切断されることにより、光照射された部分の網目構造が生成又は変化する。これにより、光照射によって領域Ａと領域Ｂとが分けられたとき、領域Ａと領域Ｂとで、弾性率の値に違いが生じる。
領域Ａへの光照射により化学結合が生成されるとすると、領域Ａの網目構造の結合が密になり、領域Ａよりも領域Ｂの弾性率が低くなる。
領域Ｂへの光照射により化学結合が切断されるとすると、領域Ｂの網目構造の結合が疎になり、領域Ａよりも領域Ｂの弾性率が低くなる。
By generating or breaking the chemical bond of the network structure by light irradiation, the network structure of the light-irradiated portion is generated or changed. Thereby, when the area A and the area B are divided by the light irradiation, the values of the elastic modulus are different between the area A and the area B.
If a chemical bond is generated by irradiation of the region A with light, the bond of the network structure of the region A becomes dense, and the elastic modulus of the region B becomes lower than that of the region A.
If the chemical bond is broken by the light irradiation to the region B, the bond of the network structure of the region B becomes sparse, and the elastic modulus of the region B becomes lower than that of the region A.
ここでの化学結合の種類としては、網目構造の形成に寄与するものであれば特に制限されず、例えば、共有結合、配位結合、イオン結合、水素結合等が挙げられる。 The type of chemical bond here is not particularly limited as long as it contributes to the formation of a network structure, and examples thereof include a covalent bond, a coordinate bond, an ionic bond, and a hydrogen bond.
領域Ａと領域Ｂとは、光照射の有無、強度、照射時間、波長などの種々の光照射条件により分けることができる。これらの光照射条件を選択することで、フィルムの形状や力学特性の制御が容易に行える。 The region A and the region B can be divided according to various light irradiation conditions such as presence/absence of light irradiation, intensity, irradiation time, and wavelength. By selecting these light irradiation conditions, the shape and mechanical properties of the film can be easily controlled.
光の波長は、ゲルを構成する成分の種類等に応じて適宜定めればよく、２００〜５００ｎｍ程度とできる。 The wavelength of light may be appropriately determined according to the type of the components that make up the gel, and may be about 200 to 500 nm.
光照射により領域Ａと領域Ｂを分けることは、該領域に対して局所的に光照射を行うことにより実施できる。該領域に対し局所的に光を照射する方法は、特に制限されるものでなく、フォトマスクを利用する方法の他、光ファイバーやレーザーを用いて局所的に光を照射する方法等を用いることができる。 The division of the region A and the region B by light irradiation can be performed by locally irradiating the region with light. The method of locally irradiating the region with light is not particularly limited, and a method of locally irradiating light with an optical fiber or a laser may be used in addition to the method of using a photomask. it can.
本発明および明細書におけるゲルの「弾性率」は原子間力顕微鏡を用いて、実施例に記載の方法により測定できる。 The "elastic modulus" of the gel in the present invention and the specification can be measured by an atomic force microscope by the method described in Examples.
領域Ｂの弾性率は、例えば、１０Ｐａ以上８００Ｐａ未満であってよく、５０〜７００Ｐａであってよい。領域Ａの弾性率は、例えば、８００〜３００００Ｐａであってよく、９００〜２００００Ｐａであってよい。弾性率を上記値とすることで、ＥＣＭ力学特性を模倣することができる。
特に、実施形態の細胞足場材料を中枢神経系のモデルに適用する場合では、領域Ｂの弾性率が脳組織の弾性率１００〜５００Ｐａであり、領域Ａの弾性率が脳組織損傷時の弾性率１０００〜１００００Ｐａの範囲にあるフィルムを作製することで、ＥＣＭ力学特性を模倣することができる。
The elastic modulus of the region B may be, for example, 10 Pa or more and less than 800 Pa, and may be 50 to 700 Pa. The elastic modulus of the region A may be, for example, 800 to 30,000 Pa, or 900 to 20,000 Pa. By setting the elastic modulus to the above value, the ECM mechanical characteristics can be imitated.
In particular, when the cell scaffold material of the embodiment is applied to a model of the central nervous system, the elastic modulus of the region B is 100 to 500 Pa of the brain tissue, and the elastic modulus of the region A is the elastic modulus at the time of brain tissue damage. ECM mechanical properties can be mimicked by making films in the range of 1000-10,000 Pa.
上記の観点から、領域Ａと領域Ｂとの弾性率の差は、１００〜９９００Ｐａであってよく、５００〜５０００Ｐａであってよい。 From the above viewpoint, the difference in elastic modulus between the region A and the region B may be 100 to 9900 Pa, and may be 500 to 5000 Pa.
網目構造は１つの成分から構成されていてもよく、２つ以上の成分から構成されていてもよい。 The network structure may be composed of one component or may be composed of two or more components.
網目構造を構成する成分の一例として、高分子化合物が挙げられる。高分子化合物は、前記網目構造の少なくとも一部又は全部を構成する。
高分子化合物は、合成高分子、生体高分子等であってもよい。合成高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）等のシリコーン、（３，４−エチレンジオキシチオフェン）／ポリ（４−スチレンスルホン酸）（ＰＥＤＯＴ−ＰＳＳ）、ポリピロール系高分子、ポリアニリン系高分子、ポリヒドロキシエチルアクリレートなどのアクリル系高分子などを挙げることができる。生体高分子としては、例えば、デキストラン、アルギン酸等の多糖類；ゼラチン、シルクフィブロインなどのタンパク質；キトサン、コラーゲンなどの細胞外マトリクスなどが挙げられる。
A polymer compound is mentioned as an example of the component which comprises a network structure. The polymer compound constitutes at least a part or all of the network structure.
The polymer compound may be a synthetic polymer, a biopolymer or the like. Examples of synthetic polymers include silicones such as polyethylene glycol (PEG), polyacrylamide, and polydimethylsiloxane (PDMS), (3,4-ethylenedioxythiophene)/poly(4-styrenesulfonic acid) (PEDOT-PSS). ), a polypyrrole-based polymer, a polyaniline-based polymer, and an acrylic-based polymer such as polyhydroxyethyl acrylate. Examples of biopolymers include polysaccharides such as dextran and alginic acid; proteins such as gelatin and silk fibroin; extracellular matrices such as chitosan and collagen.
これらのなかでも、高分子化合物はポリアクリルアミド系樹脂又はアクリル系樹脂を含むことが好ましく、透明性が良好でありモノマーと架橋剤との混合比で弾性率を容易に制御可能であるとの観点から、ポリアクリルアミド系樹脂を含むことがより好ましい。
ポリアクリルアミド系樹脂を構成するモノマーとしては、アミノ基を有する（メタ）アクリル酸エステルモノマーが挙げられ、アクリルアミド、メタクリルアミド等を例示できる。ポリアクリルアミド系樹脂は、上記モノマーの重合体であってよく、上記モノマーの重合体と該モノマーと共重合可能な他のモノマーとの共重合体であってよい。
アクリル系樹脂を構成するモノマーとしては、（メタ）アクリル酸エステルモノマーが挙げられ、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ヒドロキシメチル、（メタ）アクリル酸２−ヒドロキシエチル等の水酸基含有モノマー等を例示できる。ポリアクリルアミド系樹脂は、上記モノマーの重合体であってよく、上記モノマーの重合体と該モノマーと共重合可能な他のモノマーとの共重合体であってよい。
Among these, it is preferable that the polymer compound contains a polyacrylamide resin or an acrylic resin, and the transparency is good, and the elastic modulus can be easily controlled by the mixing ratio of the monomer and the crosslinking agent. Therefore, it is more preferable to include a polyacrylamide resin.
Examples of the monomer constituting the polyacrylamide resin include (meth)acrylic acid ester monomers having an amino group, and acrylamide, methacrylamide, etc. can be exemplified. The polyacrylamide resin may be a polymer of the above-mentioned monomer or a copolymer of the polymer of the above-mentioned monomer and another monomer copolymerizable with the above-mentioned monomer.
Examples of the monomer that constitutes the acrylic resin include (meth)acrylic acid ester monomers, such as methyl (meth)acrylate, ethyl (meth)acrylate, hydroxymethyl (meth)acrylate, and (meth)acrylic acid 2-. Examples thereof include hydroxyl group-containing monomers such as hydroxyethyl. The polyacrylamide resin may be a polymer of the above-mentioned monomer or a copolymer of the polymer of the above-mentioned monomer and another monomer copolymerizable with the above-mentioned monomer.
実施形態に係るゲルが含有する高分子化合物は、１種のみでもよいし、２種以上でもよい。 The polymer compound contained in the gel according to the embodiment may be only one kind or two or more kinds.
網目構造を構成する成分の一例として、架橋剤が挙げられる。架橋剤は前記高分子化合物同士を架橋し、網目構造を形成又は複雑化させる役割を果たし得る。
架橋剤は特に限定されるものではないが、メチレンビスアクリルアミドやエチレンビスアクリルアミド等のアクリルアミド系架橋剤が好ましい。アクリルアミド系架橋剤は、上記ポリアクリルアミド系樹脂と組み合わせて好適に用いることができる。
実施形態に係るゲルが含有してもよい架橋剤は、１種のみでもよいし、２種以上でもよい。
A crosslinking agent is mentioned as an example of the component which comprises a network structure. The cross-linking agent may serve to cross-link the polymer compounds with each other to form or complicate a network structure.
The cross-linking agent is not particularly limited, but an acrylamide-based cross-linking agent such as methylene bis acrylamide or ethylene bis acrylamide is preferable. The acrylamide cross-linking agent can be preferably used in combination with the polyacrylamide resin.
The gel according to the embodiment may contain only one type or two or more types of crosslinking agents.
光照射により網目構造において生成又は切断される化学結合は、網目構造の任意の位置にあってよい。
例えば、化学結合が生成される場合、生成される化学結合は、高分子化合物の一部として生成されてよい。このような反応として、該化学結合が生成されることにより高分子化合物の主鎖又は側鎖が伸長する反応が挙げられる。又は、生成される化学結合は、高分子化合物の一部として生成されなくともよい。このような反応として、架橋剤が高分子化合物同士を架橋する反応が挙げられる。
例えば、化学結合が切断される場合、切断される化学結合の位置は高分子化合物の一部であってよい。このような反応として、該化学結合が切断されることにより高分子化合物の鎖が分解する反応が挙げられる。又は、切断される化学結合の位置は高分子化合物の一部でなくともよい。このような反応として、架橋剤が分解し、高分子化合物同士の架橋が外れる反応が挙げられる。
The chemical bond generated or broken in the network structure by irradiation with light may be at any position in the network structure.
For example, if a chemical bond is created, the created chemical bond may be created as part of the polymeric compound. Examples of such a reaction include a reaction in which the main chain or side chain of the polymer compound is elongated by the formation of the chemical bond. Alternatively, the generated chemical bond does not have to be generated as a part of the polymer compound. Examples of such a reaction include a reaction in which a cross-linking agent cross-links polymer compounds.
For example, if the chemical bond is broken, the position of the broken chemical bond may be part of the polymeric compound. Examples of such a reaction include a reaction in which a chain of a polymer compound is decomposed by breaking the chemical bond. Alternatively, the position of the chemical bond to be cleaved may not be a part of the polymer compound. An example of such a reaction is a reaction in which a crosslinking agent is decomposed and cross-linking between polymer compounds is released.
ゲルは、光照射により、自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分、又は該成分に由来する構造を含んでよい。由来するとは、該成分が網目構造を形成する際に必要な変化を受けたことを言う。化学結合が生成されることで網目構造の少なくとも一部の構造が形成される。化学結合が切断されることで網目構造の少なくとも一部が切断される。該成分としては、前記高分子化合物であってもよく、高分子化合物の原材料であってもよく、架橋剤であってもよい。 The gel may contain a component in which a chemical bond constituting itself is generated or broken by light irradiation, or a structure derived from the component. Derived means that the component has undergone the necessary changes in forming the network structure. The generation of the chemical bond forms at least a part of the network structure. At least a part of the network structure is cut by breaking the chemical bond. The component may be the above-mentioned polymer compound, a raw material of the polymer compound, or a crosslinking agent.
光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分として、光照射によって自らを構成する化学結合が生成または切断される官能基を有する成分が挙げられる。自らを構成する化学結合とは、自らと化学結合相手間との結合である。光照射によって化学結合が生成される官能基としては、下記式（１−Ａ）で表される構造を有するベンゾフェノン誘導体や、下記式（１−Ｂ）で表される構造を有するケイ皮酸誘導体などが挙げられる。光照射によって化学結合が切断される官能基として、例えば、下記式（１−Ｃ）で表されるニトロフェニル基を有する光解離性架橋剤や、下記式（１−Ｄ）で表される光解離性架橋剤などが挙げられる。 Examples of the component that produces or breaks a chemical bond that constitutes itself by light irradiation include a component having a functional group that produces or breaks a chemical bond that constitutes itself by light irradiation. The chemical bond constituting itself is a bond between itself and a chemical bond partner. As a functional group in which a chemical bond is generated by light irradiation, a benzophenone derivative having a structure represented by the following formula (1-A) or a cinnamic acid derivative having a structure represented by the following formula (1-B) And so on. As a functional group whose chemical bond is cleaved by light irradiation, for example, a photodissociative cross-linking agent having a nitrophenyl group represented by the following formula (1-C) or a light represented by the following formula (1-D) Examples include dissociative cross-linking agents.
また、光照射により自らを構成する化学結合が生成される物質として、例えば光重合開始剤によって重合されるモノマー等の、高分子化合物の原材料が挙げられる。
光重合開始剤としては、下記式（２−Ａ）で表されるリチウムフェニル−２，４，６−トリメチルベンゾイルホスフィネート（ＬＡＰ）、下記式（２−Ｂ）で表される２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９）、下記式（２−Ｃ）で表されるＥｏｓｉｎＹ、下記式（２−Ｄ）で表されるＮ−ビニルピロリドン（ＮＭＰ）、下記式（２−Ｅ）で表されるトリエタノールアミン（ＴＥＯＡ）が例示できる。
In addition, examples of the substance that forms a chemical bond that constitutes itself upon irradiation with light include raw materials for polymer compounds such as monomers that are polymerized by a photopolymerization initiator.
Examples of the photopolymerization initiator include lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) represented by the following formula (2-A) and 2-hydroxy-represented by the following formula (2-B). 4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (Irgacure2959), EosinY represented by the following formula (2-C), N-vinylpyrrolidone (NMP represented by the following formula (2-D) ) And triethanolamine (TEOA) represented by the following formula (2-E) can be exemplified.
また、光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分としては、任意の波長の光照射によって分子構造が可逆的に変化する光異性化構造が挙げられる。当該構造を有する異性化分子としては、アゾベンゼン分子又はアゾベンゼン誘導体分子が挙げられる。
ゲルは、光異性化構造を有し光照射によって二本鎖が解離及び／又は形成する核酸を含んでもよい。当該核酸としては、アゾベンゼン又はアゾベンゼン誘導体から一つの水素原子を除いた基を有する核酸が挙げられ、アゾベンゼン又はアゾベンゼン誘導体から一つの水素原子を除いた基を有するＤＮＡ二重らせん（アゾＤＮＡ）が好ましい（図１）。アゾベンゼン又はアゾベンゼン誘導体は核酸の架橋剤として導入されたものとみなすこともできる。アゾＤＮＡは波長３６０ｎｍ前後の光を吸収すると解離し、波長４００ｎｍ以上の光を吸収すると再形成することが知られている。この性質を利用し、ゲルへの局所的な光照射によって可逆的な弾性率制御が可能となる。
In addition, examples of the component that produces or breaks the chemical bond constituting itself by light irradiation include a photoisomerization structure in which the molecular structure reversibly changes by light irradiation of an arbitrary wavelength. Examples of the isomerized molecule having the structure include azobenzene molecule and azobenzene derivative molecule.
The gel may contain a nucleic acid having a photoisomerization structure and having double strands dissociated and/or formed by irradiation with light. Examples of the nucleic acid include a nucleic acid having a group obtained by removing one hydrogen atom from azobenzene or an azobenzene derivative, and a DNA double helix (azo DNA) having a group obtained by removing one hydrogen atom from an azobenzene or azobenzene derivative is preferable. (Figure 1). Azobenzene or an azobenzene derivative can also be considered to have been introduced as a cross-linking agent for nucleic acids. It is known that azo DNA dissociates when it absorbs light having a wavelength of around 360 nm, and reforms when it absorbs light having a wavelength of 400 nm or more. By utilizing this property, reversible elastic modulus control is possible by locally irradiating the gel with light.
本実施形態の細胞足場材料は、ゲルを構成する分散媒の少なくとも一部として、液体成分を含有することができる。液体成分は、細胞培養に用いることのできるものであればよく、水、バッファー、液体培地等が挙げられる。液体成分は水を含有するものであることが好ましい。分散媒に水を含有するゲルはハイドロゲルと呼ばれる。 The cell scaffolding material of the present embodiment can contain a liquid component as at least a part of the dispersion medium forming the gel. The liquid component may be any one that can be used for cell culture, and examples thereof include water, buffer, liquid medium and the like. The liquid component preferably contains water. A gel containing water as a dispersion medium is called a hydrogel.
本実施形態の細胞足場材料は、上記成分のいずれにも該当しないその他の添加剤を含有してもよい。添加剤としては、防腐剤、酸化防止剤、着色料、増粘剤、架橋促進剤、糖類、ビタミン類、抗生物質、細胞接着分子等が挙げられる。
細胞接着分子としては、ポリリジン、フィブロネクチン、コラーゲン、ビトロネクチン、エラスチン、ヒアルロン酸、ラミニン等が挙げられる。細胞接着分子は、ゲルの最表面に配置されてもよい。ゲル表面に修飾された細胞接着分子により、任意の細胞を効果的に接着可能とできる。
本実施形態の細胞足場材料は、神経細胞及び／又はグリア細胞の培養に好適に使用される。そのため、これらの培養に有用なラミニンやＮ−カドヘリンなどの細胞接着因子等の成分を含むことができる。
The cell scaffold material of the present embodiment may contain other additives that do not correspond to any of the above components. Examples of the additives include preservatives, antioxidants, colorants, thickeners, crosslinking accelerators, sugars, vitamins, antibiotics, cell adhesion molecules and the like.
Examples of cell adhesion molecules include polylysine, fibronectin, collagen, vitronectin, elastin, hyaluronic acid, laminin and the like. The cell adhesion molecule may be arranged on the outermost surface of the gel. The cell adhesion molecule modified on the gel surface enables effective adhesion of arbitrary cells.
The cell scaffold material of the present embodiment is preferably used for culturing nerve cells and/or glial cells. Therefore, components such as cell adhesion factors such as laminin and N-cadherin useful for these cultures can be included.
実施形態に係るゲルは、フィルム状である。フィルム形状は特に限定されるものではなく、シート状、板状等の形状であることができる。
フィルム状のゲルの厚みは、１〜１０００μｍであってもよく、５〜５００μｍであってもよく、１０〜１００μｍであってもよい。
The gel according to the embodiment has a film shape. The film shape is not particularly limited, and may be a sheet shape, a plate shape, or the like.
The thickness of the film-like gel may be 1 to 1000 μm, 5 to 500 μm, or 10 to 100 μm.
フィルム状のゲルは、単層であってもよく、複層であってもよい。複層の場合、各層は同一の種類及び／又は厚みのゲルが用いられていてもよく、互いに異なる種類及び／又は厚みのゲルが用いられていてもよい。 The film-like gel may be a single layer or multiple layers. In the case of multiple layers, each layer may use gels of the same type and/or thickness, or gels of different types and/or thicknesses may be used.
細胞足場材料は、フィルム状のゲルのみからなるものであってもよく、ゲルの他にその他の構造物を備えていてもよい。
その他の構造物としては、細胞培養に適用可能なものであれば特に制限はなく、ディッシュ、マルチディッシュ、フラスコ等の培養容器や、基板等を例示できる。一例として、細胞培養容器と、フィルム状のゲルを備え、培養容器内にゲルが配置された細胞足場材料が挙げられる。別の一例として、基板と、フィルム状のゲルを備え、基板上にゲルが積層された細胞足場材料が挙げられる。
The cell scaffolding material may be composed only of a film-like gel, or may have other structures in addition to the gel.
Other structures are not particularly limited as long as they can be applied to cell culture, and examples include culture vessels such as dishes, multi-dishes, and flasks, substrates, and the like. As an example, a cell scaffold material including a cell culture container and a film-like gel, in which the gel is arranged in the culture container, can be mentioned. As another example, there is a cell scaffolding material including a substrate and a film-like gel, and the gel is laminated on the substrate.
培養容器及び基板の材質としては、金属、樹脂、セラミック、プラスチック、木材、布、紙、ガラス等が挙げられる。 Examples of the material of the culture container and the substrate include metal, resin, ceramic, plastic, wood, cloth, paper, glass and the like.
培養容器及び基板の表面は、骨格内にＳｉ原子を含むシラン化合物等によって、表面修飾されていてもよい。 The surfaces of the culture container and the substrate may be surface-modified with a silane compound containing Si atoms in the skeleton.
（２）細胞足場材料の第二の実施形態
本実施形態の細胞足場材料は、高分子化合物を含むフィルム状のゲルを備え、前記ゲルは領域Ａと領域Ｂとを有し、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低いものである。
本実施形態の細胞足場材料に係るゲルは、上記第一実施形態の細胞足場材料の前記ゲルの一部の領域に光照射して領域Ａと領域Ｂとに分け、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率を低下させることで、得ることができる。
(2) Second Embodiment of Cell Scaffolding Material The cell scaffolding material of this embodiment comprises a film-like gel containing a polymer compound, and the gel has a region A and a region B, and Also has a low elastic modulus in the region B.
The gel according to the cell scaffolding material of the present embodiment is divided into a region A and a region B by irradiating a partial region of the gel of the cell scaffolding material of the first embodiment with the region more than the region A. It can be obtained by lowering the elastic modulus of B.
細胞足場材料を構成する成分や。細胞足場材料の構造としては、上記第一実施形態の細胞足場材料で説明したものが挙げられ、説明を省略する。 The components that make up the cell scaffolding material. The structure of the cell scaffolding material may be the same as that described in the cell scaffolding material of the first embodiment, and the description thereof will be omitted.
領域Ａ及び領域Ｂの面積は、それぞれ独立に０．０００１〜１０００ｍｍ２であってよく、０．００２５〜５００ｍｍ２であってよく、０．０１〜１０ｍｍ２であってよい。 The area of the region A and the region B are each independently be a 0.0001～1000Mm 2, may be 0.0025～500Mm 2, may be 0.01 to 10 mm 2.
領域Ａと領域Ｂとは、同一平面上に配置されていることが好ましい。領域Ａと領域Ｂとは、縦方向や横方向等に互い違いに並んでいることが好ましい。領域Ａと領域Ｂとの並びのパターンは、領域Ａと領域Ｂとが互い違いに並んだ、縞状、市松模様状、同心円状とすることができる。領域Ａと領域Ｂとは互いの境界を共有するよう直接に接して配置されていることが好ましい。領域Ａ及び領域Ｂの短手方向の長さは０．０５〜５０ｍｍとしてもよく、０．１〜５ｍｍとしてもよい。このような構成とすることで、領域Ａと領域Ｂとの間で培養される細胞特性の差が検出されやすい。また、神経細胞及び／又はグリア細胞を含む細胞の培養に使用される場合には、グリア細胞は高弾性領域（領域Ａ）で接着しやすく、神経細胞は低弾性領域（領域Ｂ）で接着しやすいため、両者を共培養する際に、接着領域の住み分けが可能になる。 It is preferable that the area A and the area B are arranged on the same plane. It is preferable that the regions A and B are alternately arranged in the vertical direction, the horizontal direction, and the like. The pattern of the arrangement of the regions A and B can be a striped pattern, a checkered pattern, or a concentric pattern in which the regions A and B are alternately arranged. It is preferable that the regions A and B are arranged so as to be in direct contact with each other so as to share the boundary with each other. The length of the area A and the area B in the lateral direction may be 0.05 to 50 mm, or 0.1 to 5 mm. With such a configuration, it is easy to detect the difference in the characteristics of the cells to be cultured between the area A and the area B. When used for culturing cells containing nerve cells and/or glial cells, glial cells easily adhere in the high elasticity region (region A), and nerve cells adhere in the low elasticity region (region B). Since it is easy, the cohesion of the both allows the adhesion areas to be segregated.
なお、本実施形態の細胞足場材料は、上記方法で得られたものに限定されるものではない。 The cell scaffold material of this embodiment is not limited to the material obtained by the above method.
以上に説明した第一〜第二の実施形態の細胞足場材料によれば、フィルム状であるため厚さが制御され、厚さの安定性に優れる。また、実施形態の細胞足場材料は、領域Ａよりも領域Ｂの弾性率が低い、又は低くなるよう変化するので、高弾性領域Ａと低弾性領域Ｂとの両方で細胞を培養でき、これまで明らかとなっていなかった、細胞・組織がＥＣＭ力学特性を認識・応答するメカニズムの解明が期待できる。 According to the cell scaffolding materials of the first and second embodiments described above, the thickness is controlled because of the film shape, and the thickness stability is excellent. Further, the cell scaffold material of the embodiment has a lower elastic modulus in the region B than the region A, or changes so as to be lower, so that cells can be cultured in both the high elastic region A and the low elastic region B. It can be expected to elucidate the mechanism by which cells and tissues recognize and respond to ECM mechanical properties that have not been clarified.
≪細胞足場材料の製造方法≫
（１）細胞足場材料の製造方法の第一の実施形態
本実施形態の製造方法として、上記第一の実施形態の細胞足場材料の製造方法について説明する。
<< Manufacturing method of cell scaffolding material >>
(1) First Embodiment of Manufacturing Method of Cell Scaffolding Material As a manufacturing method of the present embodiment, a manufacturing method of the cell scaffolding material of the first embodiment will be described.
第一の実施形態の細胞足場材料は、前記ゲルの構成材料である各成分を混合して、これら各成分を含有する足場材料組成物をフィルム状にゲル化させることで製造できる。
各成分としては、上記に例示した高分子化合物及び／又はその原材料、並びに液体成分を含み、必要により、上記に例示した架橋剤、添加剤等の各種成分を含んでもよい。高分子化合物、高分子化合物の原材料及び架橋剤は、上記に例示した自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分であってよい。
高分子化合物の原材料が、光重合開始剤によって重合されるモノマー等の原材料を含む場合、足場材料組成物は、該当する光重合開始剤を含むことが好ましい。
The cell scaffolding material of the first embodiment can be produced by mixing the respective components which are the constituent materials of the gel and gelling the scaffolding material composition containing these respective components into a film.
Each component includes the above-exemplified polymer compound and/or raw material thereof, and a liquid component, and may optionally include various components such as the above-described crosslinking agent and additive. The polymer compound, the raw material of the polymer compound, and the cross-linking agent may be components that generate or break the chemical bond constituting itself exemplified above.
When the raw material of the polymer compound includes a raw material such as a monomer that is polymerized by the photopolymerization initiator, the scaffold material composition preferably includes the corresponding photopolymerization initiator.
足場材料組成物をフィルム状にゲル化させる方法の一例としては、培養容器や基板等の上に足場材料組成物を注ぎ、その上で硬化させることを例示できる。
ゲルを硬化させるため、必要に応じ足場材料組成物に対し光照射を行ってもよい。当該光照射は、ゲル全体を硬化させる目的でなされるものであり、光照射して領域Ａと領域Ｂとに分けることには該当しない操作である。
An example of a method of gelling the scaffold material composition into a film is to pour the scaffold material composition onto a culture container, a substrate or the like and then cure the composition.
If desired, the scaffold material composition may be irradiated with light to cure the gel. The light irradiation is performed for the purpose of curing the entire gel and is an operation that does not correspond to dividing the region A and the region B by light irradiation.
図２は、その上で足場材料組成物を硬化させるガラス基板の模式図である。図２（Ａ）は、表面にスペーサーを有するガラス基板の上面図であり、図２（Ｂ）は図２（Ａ）の側面図である。ガラス基板の両端にスペーサーを配置することで、フィルム状のゲルの厚みを均一にすることができる（図２（Ａ），（Ｂ））。また、配置する複数のスペーサーの厚みを互いに異なるものとすることで、フィルム状のゲルの厚みに勾配をつけることができる（図２（Ｃ））。
スペーサーの厚みの範囲は、ガラス基板への影響がなく、かつ、ゲルの膨潤による皺構造形成の影響が少ない、１０〜５０μｍが望ましい。
スペーサーの素材として、厚さが均一で耐水性を有していればよいが、例として、サランラップ（登録商標、旭化成、１１μｍ）、スコッチテープ（登録商標、３Ｍ、５０μｍ）、ＰＥＴ基材片面接着テープ（日東電工，１０，２０，３０μｍ）が挙げられる。また、ＳＵ−８等のネガティブフォトレジストを用いて任意のスペーサー厚としてもよい。
FIG. 2 is a schematic diagram of a glass substrate on which the scaffold material composition is cured. 2A is a top view of a glass substrate having a spacer on its surface, and FIG. 2B is a side view of FIG. 2A. By disposing spacers at both ends of the glass substrate, the thickness of the film-like gel can be made uniform (FIGS. 2A and 2B). In addition, by making the thicknesses of the plurality of spacers different from each other, the thickness of the film-like gel can be made to have a gradient (FIG. 2C).
The range of the thickness of the spacer is preferably 10 to 50 μm, which does not affect the glass substrate and is less affected by the formation of the wrinkle structure due to the swelling of the gel.
As the material for the spacer, it is sufficient if the thickness is uniform and it has water resistance. For example, Saran wrap (registered trademark, Asahi Kasei, 11 μm), Scotch tape (registered trademark, 3M, 50 μm), PET substrate single-sided Tapes (Nitto Denko, 10, 20, 30 μm) can be mentioned. Further, a negative photoresist such as SU-8 may be used to give an arbitrary spacer thickness.
（２）細胞足場材料の製造方法の第二の実施形態
本実施形態の製造方法として、上記第二の実施形態の細胞足場材料の製造方法について説明する。
(2) Second Embodiment of Manufacturing Method of Cell Scaffolding Material As a manufacturing method of the present embodiment, a manufacturing method of the cell scaffolding material of the second embodiment will be described.
（光照射工程）
本実施形態の製造方法は、光照射工程を有する。
光照射工程は、高分子化合物を含む網目構造を形成するフィルム状のゲル、又は前記ゲルの構成材料を含有する足場材料組成物の一部の領域に光照射して領域Ａと領域Ｂとに分け、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率を低下させる工程である。
第二実施形態のゲルは、第一実施形態のゲルに光照射工程を施すことにより製造できる。当該ゲル、足場材料組成物、及び光の照射については、上記の≪細胞足場材料≫および細胞足場材料の製造方法の第一の実施形態において例示したものが挙げられ、説明を省略する。
光照射して領域Ａと領域Ｂとに分けることについては以下の例が挙げられる。
１）領域Ａに光Ｌを照射し、光Ｌが照射されていない領域を領域Ｂとし、光Ｌによって領域Ａの弾性率を高める。
２）領域Ｂに光Ｌを照射し、光Ｌが照射されていない領域を領域Ａとし、光Ｌによって領域Ｂの弾性率を低下させる。
(Light irradiation process)
The manufacturing method of the present embodiment has a light irradiation step.
In the light irradiation step, a film-like gel forming a network structure containing a polymer compound or a partial region of a scaffold material composition containing a constituent material of the gel is irradiated with light to form regions A and B. In other words, the elastic modulus of the region B is lower than that of the region A.
The gel of the second embodiment can be manufactured by subjecting the gel of the first embodiment to a light irradiation step. Regarding the gel, the scaffold material composition, and the irradiation of light, those exemplified in the above-mentioned <<Cell scaffold material>> and the first embodiment of the method for producing the cell scaffold material are mentioned, and the description thereof will be omitted.
The following examples can be given for dividing the area A and the area B by irradiating with light.
1) The region L is irradiated with the light L, the region not irradiated with the light L is defined as the region B, and the light L increases the elastic modulus of the region A.
2) The region L is irradiated with the light L, the region not irradiated with the light L is defined as the region A, and the elasticity of the region B is reduced by the light L.
ゲルに対し光照射工程を行って細胞足場材料の備えるゲルを得てもよく、足場材料組成物に対し光照射工程を行って細胞足場材料の備えるゲルを得てもよい。足場材料組成物に対する前記光照射工程のみで、足場材料組成物がゲル化しない場合には、領域Ａと領域Ｂとの弾性率の違いが打ち消されないよう、足場材料組成物全体を硬化する操作を行ってもよい。 The gel of the cell scaffold material may be obtained by performing a light irradiation step on the gel, and the gel of the cell scaffold material may be obtained by performing a light irradiation step on the scaffold material composition. An operation of curing the entire scaffold material composition so that the difference in elastic modulus between the region A and the region B is not canceled when the scaffold material composition does not gel only in the light irradiation step for the scaffold material composition. You may go.
（再膨潤工程）
本実施形態の製造方法は、さらに再膨潤工程を有していてもよい。
再膨潤工程は、前記照射工程の前に、光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分を含む再膨潤液にゲルを含浸させる工程である。
(Reswelling process)
The manufacturing method of the present embodiment may further include a re-swelling step.
The re-swelling step is a step of impregnating the gel with a re-swelling solution containing a component that forms or breaks a chemical bond constituting itself by light irradiation before the irradiation step.
光照射により自らを構成する化学結合が生成又は切断される成分については、上記≪細胞足場材料≫で例示したものが挙げられる。当該成分は高分子化合物の原材料を含んでもよい。高分子化合物の原材料が、光重合開始剤によって重合されるモノマー等の原材料を含む場合、再膨潤液は、該当する光重合開始剤を含むことが好ましい。
再膨潤させたゲルの任意の領域に光照射を行うことで、ゲルの弾性率を局所的に変化させることが可能となる。再膨潤液の組成は、ゲルが膨潤する溶媒に溶解する分子でることが好ましい。再膨潤液中の分子組成によって、ゲルに様々な機能を付与することが可能となる。
Examples of the component that produces or breaks the chemical bond that constitutes itself upon irradiation with light include those exemplified above in <<Cell scaffolding material>>. The component may include a raw material of a polymer compound. When the raw material of the polymer compound contains a raw material such as a monomer polymerized by the photopolymerization initiator, the re-swelling liquid preferably contains the corresponding photopolymerization initiator.
By irradiating an arbitrary region of the re-swollen gel with light, the elastic modulus of the gel can be locally changed. The composition of the re-swelling liquid is preferably a molecule that is soluble in the solvent in which the gel swells. The molecular composition of the re-swelling liquid makes it possible to impart various functions to the gel.
実施形態の細胞足場材料の製造方法によれば、実施形態の細胞足場材料を容易に製造できる。 According to the method for producing a cell scaffold material of the embodiment, the cell scaffold material of the embodiment can be easily produced.
≪細胞モデル≫
本実施形態の細胞モデルは、本発明の細胞足場材料と、前記細胞足場材料で培養される細胞と、を備えるものである。
培養材料としては、上記の≪細胞足場材料≫において例示したものが挙げられ、説明を省略する。
細胞は、細胞足場材料のゲルの表面に位置していてもよく、ゲルの内部に位置していてもよい。
細胞としては、特に制限されるものではなく、動物細胞、植物細胞等の細胞や、微生物が挙げられる。前記細胞は、組織、器官等の細胞集合体を構成していてもよい。
実施形態の細胞モデルは、中枢神経系モデルとして好適に用いることができる。細胞は、神経細胞及び／又はグリア細胞を含むことが好ましい。
≪Cell model≫
The cell model of the present embodiment includes the cell scaffold material of the present invention and cells cultured with the cell scaffold material.
Examples of the culture material include those exemplified in the above <<Cell scaffold material>>, and the description thereof will be omitted.
The cells may be located on the surface of the gel of the cell scaffold material or may be located inside the gel.
The cells are not particularly limited and include cells such as animal cells and plant cells, and microorganisms. The cells may form cell aggregates such as tissues and organs.
The cell model of the embodiment can be preferably used as a central nervous system model. The cells preferably include nerve cells and/or glial cells.
一態様として、細胞モデルの製造方法は、前記細胞モデルの第一の実施形態の細胞培養基材のゲルの一部の領域に光照射して領域Ａと領域Ｂとに分け、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率を低下させる光照射工程を含む、方法である。これにより、細胞足場材料と、前記細胞足場材料で培養される細胞と、を備え、前記ゲルは領域Ａと領域Ｂとを有し、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低い細胞モデルを製造することができる。光が照射される領域には、予め細胞が含まれていてもよく、含まれていないくともよい。 As one aspect, in the method for producing a cell model, a part of the gel of the cell culture substrate of the first embodiment of the cell model is irradiated with light to be divided into a region A and a region B, and Also includes a light irradiation step of lowering the elastic modulus of the region B. Thus, a cell model including a cell scaffold material and cells cultured in the cell scaffold material, wherein the gel has a region A and a region B, and the elastic modulus of the region B is lower than that of the region A. Can be manufactured. The region irradiated with light may or may not contain cells in advance.
実施形態の細胞モデルによれば、領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低い、又は低くなるよう変化するので、生体内のＥＣＭの力学特性を模倣し、細胞・組織が外部環境の力学特性を認識するメカニズムを解明するためのin vitroモデルとすることができる。特に、疾患や外的損傷の再生が困難な中枢神経系に注目し、中枢神経系のＥＣＭ力学特性を模倣した細胞モデルを提供でる。神経細胞またはグリア細胞の培養下、in situでゲルの力学特性変化を実現することで疾患・外傷のモデルとし、組織再生に最適な足場材料の力学特性をスクリーニングするための細胞モデルとして利用可能である。
再生医療の観点からは、中枢神経系の疾患・損傷モデルとすることで、組織再生に最適な足場材料の力学特性をスクリーニングできる。
According to the cell model of the embodiment, the elastic modulus of the region B is lower than that of the region A, or changes so that the elastic modulus of the region B becomes lower. It can be used as an in vitro model for elucidating the mechanism of recognizing sucrose. In particular, we focus on the central nervous system where it is difficult to reproduce diseases and external damages, and provide a cell model that mimics the ECM mechanical properties of the central nervous system. It can be used as a model for diseases and trauma by realizing changes in mechanical properties of gels in situ in culture of nerve cells or glial cells, and can be used as a cell model for screening the mechanical properties of scaffold materials optimal for tissue regeneration. is there.
From the viewpoint of regenerative medicine, it is possible to screen the mechanical properties of the scaffold material most suitable for tissue regeneration by using it as a central nervous system disease/injury model.
以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の設計等も含まれる。 Although the embodiment of the present invention has been described in detail above with reference to the drawings, the specific configuration is not limited to this embodiment, and includes a design and the like within a range not departing from the gist of the present invention.
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples.
＜弾性率測定方法＞
実施例で得られた各ゲルの弾性率は、下記方法により求めた。
原子間力顕微鏡を用い、温度２５℃の測定条件で測定を行った。なお、当該測定は、ヒトの体液とほぼ等張に調整したPBS水溶液中で行われるものとする。
<Method of measuring elastic modulus>
The elastic modulus of each gel obtained in the examples was determined by the following method.
The measurement was performed using an atomic force microscope under the measurement conditions of a temperature of 25°C. In addition, the said measurement shall be performed in the PBS aqueous solution adjusted to about isotonic with the human body fluid.
［参考例１］弾性率が一定のハイドロゲルフィルム（定弾性フィルム）の製造
図３は、参考例１の定弾性フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
３−（トリメチルシリル）プロピルメタクリレートで表面修飾されたガラス基板（以下、「シラン化ガラス基板」という。）の両端に、スペーサーとしてサランラップ（登録商標）を配置した（図２（Ａ）参照）。アクリルアミドを５重量％、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミド（以下、「ビスアクリルアミド」という。）を０．０５重量％又は０．５重量％、及び光重合開始剤ＬＡＰを１ｍＭ含む溶液（以下、「足場材料組成物」という。）を、シラン化ガラス基板中央に滴下した。足場材料組成物のビスアクリルアミド濃度を０．０５重量％とした場合、低弾性ゲル（１００〜３００Ｐａ）が生成され、０．５重量％とした場合、高弾性ゲル（１〜３ｋＰａ）が生成された。この基板に、カバーガラス（以下、「シール基板」という。）を上面からのせ、足場材料組成物をシラン化ガラス基板とシール基板とで挟み込んだ。波長３６０ｎｍのバンドパスフィルターを用い、１０ｍＷ／ｃｍ２で１０分間、足場材料組成物へ光照射し、ハイドロゲルフィルムとした。光照射終了後、ＰＢＳ溶液に浸漬し、未反応の成分を除去した。シール基板を取り除き、ハイドロゲルフィルム表面にポリ−Ｄ−リジンを提示するためのクロスリンカーとして２ｍＭのｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ６-（４‘-ａｚｉｄｏ-２’-ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏ）ｈｅｘａｎｏａｔｅ（以下、「ｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ」という。）溶液を１００ｕｌハイドロゲルフィルム表面に滴下した。波長３３０ｎｍバンドパスフィルターを介してハイドロゲルフィルムへ１０分間光照射した。１ｍｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジン（以下、「ＰＤＬ」という。）溶液を１００ｕｌ滴下し、ハイドロゲルフィルム表面にＰＤＬ分子を修飾し、ポリアクリルアミドを含むゲルからなる定弾性フィルムを得た。
Reference Example 1 Production of Hydrogel Film with Constant Elastic Modulus (Constant Elastic Film) FIG. 3 is a diagram schematically showing a production procedure of the constant elastic film of Reference Example 1.
Saran wrap (registered trademark) was arranged as a spacer at both ends of a glass substrate surface-modified with 3-(trimethylsilyl)propyl methacrylate (hereinafter referred to as "silanized glass substrate") (see FIG. 2A). A solution containing 5% by weight of acrylamide, 0.05% by weight or 0.5% by weight of N,N'-methylenebisacrylamide (hereinafter referred to as "bisacrylamide"), and 1 mM of a photopolymerization initiator LAP (hereinafter, referred to as " The "scaffold material composition") was dropped onto the center of the silanized glass substrate. When the bisacrylamide concentration of the scaffold material composition is 0.05% by weight, a low elastic gel (100 to 300 Pa) is produced, and when it is 0.5% by weight, a highly elastic gel (1 to 3 kPa) is produced. It was A cover glass (hereinafter referred to as “seal substrate”) was placed on the substrate from above, and the scaffold material composition was sandwiched between the silanized glass substrate and the seal substrate. Using a bandpass filter having a wavelength of 360 nm, the scaffold material composition was irradiated with light at 10 mW/cm 2 for 10 minutes to obtain a hydrogel film. After the light irradiation was completed, it was immersed in a PBS solution to remove unreacted components. As a cross-linker for removing the sealing substrate and presenting poly-D-lysine on the surface of the hydrogel film, 2 mM of sulfosuccinimidyl 6-(4′-azido-2′-nitrophenylamino)hexanoate (hereinafter referred to as “sulfo-SANPAH”). ) The solution was dropped on the surface of 100 ul hydrogel film. The hydrogel film was irradiated with light through a bandpass filter having a wavelength of 330 nm for 10 minutes. 100 μl of a 1 mg/ml poly-D-lysine (hereinafter referred to as “PDL”) solution was dropped to modify the PDL molecule on the surface of the hydrogel film to obtain a constant elastic film made of a gel containing polyacrylamide.
［実施例１］同一基板上で異なる弾性率の領域を有するハイドロゲルフィルム（パターン化フィルム）の製造
図４は、実施例１のパターン化フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
金またはアルミのフォトマスクを基板の片面に有するシール基板（以下、「フォトマスク付きシール基板」という。）を用い、足場材料組成物のビスアクリルアミド濃度を０．５重量％とした以外は、参考例１のハイドロゲルフィルムと同様にして、パターン化フィルムを得た。得られたパターン化フィルムでは、光照射の際のマスク下の部分の弾性率が３００〜５００Ｐａの低弾性領域、マスクのない部分の弾性率が２ｋ〜５ｋＰａの高弾性領域であることを確認した（図５）。
Example 1 Production of Hydrogel Film (Patterned Film) Having Regions of Different Elastic Modulus on the Same Substrate FIG. 4 is a diagram schematically showing the production procedure of the patterned film of Example 1.
Other than using a seal substrate having a gold or aluminum photomask on one surface of the substrate (hereinafter referred to as "photomask-attached seal substrate") and setting the bisacrylamide concentration of the scaffold material composition to 0.5% by weight. A patterned film was obtained in the same manner as the hydrogel film of Example 1. In the obtained patterned film, it was confirmed that the elastic modulus of the portion under the mask upon light irradiation was a low elastic region of 300 to 500 Pa, and the elastic modulus of the portion without the mask was a high elastic region of 2 k to 5 kPa. (Fig. 5).
［実施例２］光解離性官能基を架橋剤としたパターン化フィルム（光反応性パターン化フィルム）の製造
図６は、実施例２の光反応性パターン化フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
アクリルアミドを５重量％、ビスアクリルアミドを０．０５重量％、上記式（１−D）で表される化合物（光解離性架橋剤）を０．４５重量％、並びに重合開始剤としてＥｏｓｉｎＹを０．０１ｍＭ、ＴＥＯＡを１０重量％、及びＮＶＰを３７．５ｕＭの割合で含む溶液（以下、「光解離性官能基含有足場材料組成物」という。）を、シラン化ガラス基板中央に滴下した。この基板に、シール基板を上面からのせ、光解離性官能基含有足場材料組成物をシラン化ガラス基板とシール基板とで挟み込んだ。波長４００ｎｍのハイパスフィルタを介して１０分間、光解離性官能基含有足場材料組成物へ光照射し、ハイドロゲルフィルムとした。ＰＢＳ溶液で未反応の成分を取り除き、ハイドロゲルフィルムと基板を反転させ、基板の上面（ハイドロゲルフィルムと接していない面）にフォトマスクを設置した。波長３６０ｎｍの光を１０分間、ハイドロゲルフィルムへ照射し、ＰＢＳ溶液に再度浸漬した。シール基板を取り除き、２ｍＭのｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ溶液を１００ｕｌハイドロゲルフィルム表面に滴下した。波長４００ｎｍのハイパスフィルタを使用して、ハイドロゲルフィルムへ３０分間光照射した。その後は、前述の参考例１と同様にＰＤＬをハイドロゲル表面に修飾し、光反応性パターン化フィルムとした。
[Example 2] Production of patterned film (photoreactive patterned film) using a photolabile functional group as a cross-linking agent Fig. 6 schematically shows a production procedure of the photoreactive patterned film of Example 2. It is a figure.
Acrylamide was 5% by weight, bisacrylamide was 0.05% by weight, the compound represented by the above formula (1-D) (photodissociative crosslinking agent) was 0.45% by weight, and EosinY as a polymerization initiator was 0.1% by weight. A solution containing 01 mM, TEOA at 10% by weight, and NVP at a ratio of 37.5 uM (hereinafter, referred to as “photodissociable functional group-containing scaffold material composition”) was dropped onto the center of the silanized glass substrate. A seal substrate was placed on the substrate from above, and the photolabile functional group-containing scaffold material composition was sandwiched between the silanized glass substrate and the seal substrate. The photodissociable functional group-containing scaffold material composition was irradiated with light through a high-pass filter having a wavelength of 400 nm for 10 minutes to prepare a hydrogel film. Unreacted components were removed with a PBS solution, the hydrogel film and the substrate were inverted, and a photomask was placed on the upper surface of the substrate (the surface not in contact with the hydrogel film). The hydrogel film was irradiated with light having a wavelength of 360 nm for 10 minutes, and immersed again in the PBS solution. The seal substrate was removed, and a 2 mM sulfo-SANPAH solution was dropped on the surface of 100 ul hydrogel film. The high-pass filter having a wavelength of 400 nm was used to irradiate the hydrogel film with light for 30 minutes. After that, PDL was modified on the surface of the hydrogel in the same manner as in Reference Example 1 to obtain a photoreactive patterned film.
［実施例３］フィルムの再膨潤によるパターン化フィルム（再膨潤パターン化フィルム）の製造
図７は、実施例３の再膨潤パターン化フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
上述と参考例１と同様の方法で、ポリアクリルアミドを含むゲルからなる定弾性フィルムを作製した。この定弾性フィルムを再膨潤溶液（アクリルアミドを５重量％、ビスアクリルアミドを０．０５重量％、及び光重合開始剤としてＬＡＰを１ｍＭ含む溶液）に１晩以上浸漬し、ハイドロゲルフィルムを膨潤させ、再膨潤フィルムとした。この再膨潤フィルム上にフォトマスクを設置して、再膨潤フィルムへ波長３６０ｎｍの光を照射した。ＰＢＳ溶液に浸漬し、未反応の再膨潤溶液を取り除くことで、再膨潤パターン化フィルムを得た。
[Example 3] Production of patterned film by re-swelling of film (reswelling patterned film) Fig. 7 is a diagram schematically showing a production procedure of the re-swelling patterned film of Example 3.
By the same method as described above and in Reference Example 1, a constant elastic film made of a gel containing polyacrylamide was produced. This constant elastic film was immersed in a re-swelling solution (a solution containing 5% by weight of acrylamide, 0.05% by weight of bisacrylamide, and 1 mM of LAP as a photopolymerization initiator) for one night or more to swell the hydrogel film, It was a re-swelling film. A photomask was placed on this re-swelling film, and the re-swelling film was irradiated with light having a wavelength of 360 nm. A re-swelling patterned film was obtained by immersing in a PBS solution and removing the unreacted re-swelling solution.
［実施例４］光異性化分子を用いた光応答性パターン化フィルム（光応答性フィルム）の製造
図８は、実施例４の光応答性フィルムの製造手順を模式的に示す図である。
アクリルアミドを５重量％、ビスアクリルアミドを０．０５重量％、アゾＤＮＡを２．９ｍＭ、並びに重合開始剤としてＥｏｓｉｎＹを０．０１ｍＭ、ＴＥＯＡを１０重量％、及びＮＶＰを３７．５ｕＭの割合で含む溶液（以下、「光異性化分子含有足場材料組成物」という）を、シラン化ガラス基板中央に滴下した。この基板に、シール基板を上面からのせ、光異性化分子含有足場材料組成物をシラン化ガラス基板とシール基板とで挟み込んだ。波長４００ｎｍのハイパスフィルタを介して１０分間、光異性化分子含有足場材料組成物へ光照射し、ハイドロゲルフィルムとした。光照射終了後、ＰＢＳ溶液に浸漬し、未反応の成分を取り除いた。２ｍＭのｓｕｌｆｏ−ＳＡＮＰＡＨ溶液１００ｕｌをハイドロゲルフィルム表面に滴下し、波長４００ｎｍのハイパスフィルタを使用して、３０分間光照射した。その後は、参考例１のハイドロゲルフィルムと同様にＰＤＬをハイドロゲル表面に修飾し、光応答性フィルムを得た。次いで光応答性フィルム基板の底面（光応答性フィルムと接していない面）にフォトマスクを設置した。３６０ｎｍの光を光応答性フィルムへ１０分間照射することで、光照射部分が低弾性領域、未照射の領域が高弾性領域となった。
[Example 4] Production of photoresponsive patterned film (photoresponsive film) using photoisomerizable molecule Fig. 8 is a diagram schematically showing a production procedure of the photoresponsive film of Example 4.
A solution containing 5% by weight of acrylamide, 0.05% by weight of bisacrylamide, 2.9 mM of azo DNA, 0.01 mM of EosinY as a polymerization initiator, 10% by weight of TEOA, and 37.5 uM of NVP. (Hereinafter, referred to as “photoisomerization molecule-containing scaffold material composition”) was dropped on the center of the silanized glass substrate. The seal substrate was placed on the substrate from above, and the photoisomerizable molecule-containing scaffold material composition was sandwiched between the silanized glass substrate and the seal substrate. The photoisomerizable molecule-containing scaffold material composition was irradiated with light through a high-pass filter having a wavelength of 400 nm for 10 minutes to obtain a hydrogel film. After the irradiation with light was completed, it was immersed in a PBS solution to remove unreacted components. 100 ul of 2 mM sulfo-SANPAH solution was dropped on the surface of the hydrogel film, and light irradiation was performed for 30 minutes using a high pass filter having a wavelength of 400 nm. After that, PDL was modified on the surface of the hydrogel in the same manner as the hydrogel film of Reference Example 1 to obtain a photoresponsive film. Then, a photomask was placed on the bottom surface (the surface not in contact with the photoresponsive film) of the photoresponsive film substrate. By irradiating the light-responsive film with light of 360 nm for 10 minutes, the light-irradiated portion became a low elasticity region and the unirradiated region became a high elasticity region.
Claims (7)
前記ゲルは領域Ａと領域Ｂとを有し、前記領域Ａよりも前記領域Ｂの弾性率が低い、細胞足場材料。 A film-like gel having a network structure containing a polymer compound,
The gel has a region A and a region B, and the elastic modulus of the region B is lower than that of the region A, which is a cell scaffold material.
前記網目構造は、光照射により前記網目構造を構成する化学結合が生成又は切断されるものである、細胞足場材料の製造方法。 A film-like gel forming a network structure containing a polymer compound or a part of a culture material composition containing a constituent material of the gel is irradiated with light to be divided into a region A and a region B. A light irradiation step of lowering the elastic modulus of the region B than
The method for producing a cell scaffolding material, wherein the network structure is one in which a chemical bond constituting the network structure is generated or broken by light irradiation.
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