JP6716087B2 - 分析方法及び分析装置 - Google Patents

Description

本発明は分析方法及び分析装置に関する。

リン脂質は構造中にリン酸エステル部位を有する脂質の１種であり、グリセリンを骨格とするグリセロリン脂質と、スフィンゴシンを骨格とするスフィンゴリン脂質とに大別される。前者のグリセロリン脂質は、グリセリンに脂肪酸とリン酸が結合し、さらにリン酸にアルコールがエステル結合した構造を有する。グリセロリン脂質を構成する脂肪酸はグリセリンの１位及び２位に結合するために、脂肪酸の種類やリン酸に結合するアルコールの種類や結合位置を考慮したグリセロリン脂質の分子種は非常に多岐にわたる。

このように多岐にわたる脂質の分子種を分離分析する方法としては、種々の試料から脂質画分を抽出した後、得られた脂質画分について例えば液体クロマトグラフィなどの分析手法を用いて分離分析することが一般的である。

ところで、試料中に含まれている成分を分析するための方法として、２つの分離カラムとトラップカラムを用いて、第１の分離カラムから溶出された成分をトラップカラムに捕捉させた後、捕捉させた成分をさらに第２の分離カラムで分離する２次元クロマトグラフィが知られている。この方法では、第１の分離カラムと第２の分離カラムにはそれぞれ特性の異なる分離カラムが用いられ、それぞれの分離カラムにおいてそれぞれ特性の異なる移動相（溶離液）が用いられる。例えば、試料中の脂質を分離分析する場合、まず第１の分離カラムで脂質を順相クロマトグラフィにて各脂質画分（例えば、トリグリセライド画分、フォスファチジルエタノールアミン画分、フォスファチジルコリン画分、飽和脂肪酸画分など）に分離して、各画分ごとにトラップカラムに捕捉させる。その後、捕捉した脂質画分を第２の分離カラムで逆相クロマトグラフィにて分析することが多い。これまでに、こうした複数の分離カラムと１又は２以上のトラップカラムを備えた多次元のクロマトグラフ装置が数々と提案されている（例えば特許文献１や特許文献２参照）。これらの装置においては、トラップカラムには、第１の分離カラムが接続された接続側に第２の分離カラムが接続される。従って、捕捉された成分を第２の分離カラムで分離させる際、トラップカラムには、第１の分離カラムからトラップカラムへの供給方向と同じ方向に第２の分離カラムで使用される移動相が供給され、捕捉された成分がトラップカラムから第２の分離カラムに送り出される。

特開２００２−２７１２７２号公報 特開２００８−９６４５５号公報

しかしながら、これらの多次元クロマトグラフ装置で、多成分を含む試料を分析した場合には、検出ピークがブロードになったり、検出ピークにテーリングが観察され、十分な分離度や十分な検出感度が得られないことがあった。試料が、リン脂質、特にグリセロリン脂質など類似する分子構造を有する成分を多数含む場合には、複数の成分の検出ピークが重なりやすく、第２の分離カラムにおける分離条件の設定が極めて困難であった。そのため、第１の分離カラムで分離された各脂質画分を構成する分子種の特定が困難になるという問題があった。

本発明が解決しようとする課題は、多次元クロマトグラフィにおいて検出ピークの重なりなどを少なくして、検出感度や検出精度を高めることである。

本発明では、トラップカラムに捕捉された成分を分離カラムに移動させる際に、トラップカラムに成分を捕捉させる際の移動相の送出方向と逆方向に移動相を送出し、トラップカラムに捕捉した成分を第２の分離カラムに移動させることにした。

本発明によると、トラップカラムからの移動時において、トラップカラムに捕捉された成分の送出方向における拡散が少なくなる。この結果、トラップカラムに接続された分離カラムにおける分離度が向上し、検出感度が向上する。

図１は本発明の一実施形態に係る分析装置の概略構成図であって、トラップカラムに成分を捕捉させる際の状態を示した図である。 図２は図１の分析装置において、捕捉させた成分をトラップカラムから移動させる際の状態を示した図である。 図３は本発明の一実施例に係るリン脂質の分析に用いられた分析装置の概略構成図である。 図４はトラップカラムに第２の移動相を逆方向に送出した場合と正方向に送出した場合を比較した２次元めのクロマトグラムである。上のチャートは逆方向に送出した場合を、下のチャートは正方向に送出した場合を示す。 図５は図３に示す分析装置を用いて大豆レシチンを分析した際における１次元めのクロマトグラムである。図中の矢印は、トラップカラムに捕捉させたリン脂質の１種であるホスファチジルコリン画分を示す。標準物質（Standard）の略語はそれぞれ次の物質を示す。TAG：中性脂質、VE：トコフェロール、FFA：遊離脂肪酸(C16:0)、CF：シクロアルテニルフェルレート、Cer：グルコシルセラミド、PE：ホスファチジルエタノールアミン、LPE：リゾホスファチジルエタノールアミン、PC：ホスファチジルコリン、LPC：リゾホスファチジルコリン 図６は図５におけるＰＣ画分のクロマトグラム（２次元めのクロマトグラフ）である。 図７は図３に示す分析装置を用いて筋子乳化油を分析した際における１次元めのクロマトグラムである。図中の矢印はトラップカラムに捕捉させるＰＣ画分を示す。 図８は図７におけるＰＣ画分のクロマトグラム（２次元めのクロマトグラフ）である。

本発明に係る分析方法は、成分を捕捉させたトラップカラムから分離カラムに前記成分を移動させて分離分析する方法において、前記トラップカラムに前記成分を捕捉させるための移動相の送出方向と逆方向に移動相を送出して前記成分を分離カラムへ移動させることを特徴とする。トラップカラムから移動された成分を分離カラムで分離する方法はいわゆる２次元クロマトグラフィや多次元クロマトグラフィとして公知である。２次元クロマトグラフィは、第１の分離カラムで分離された成分をトラップカラムに捕捉させ、その後、捕捉された成分をトラップカラムから第２の分離カラムに送り出し、第２の分離カラムでさらに分離する方法である。本発明では、このようなトラップカラムを利用した分析方法において、第２の分離カラムに捕捉させた成分をトラップカラムから移動させる際に、第１の分離カラムで分離された成分をトラップカラムに捕捉させるために用いられる移動相の送出方向（本明細書では「正方向」と言う。）と逆方向に第２の移動相を送り出す。

本発明において使用される分離カラム（第１の分離カラム、第２の分離カラムなど）やトラップカラムは、カラムクロマトグラフィ用の分離カラムやトラップカラムとして使用され得るカラムであれば特に限られない。分離カラムは例えば高速液体クロマトグラフィ、ガスクロマトクロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィで使用され得る分離カラムである。第１の分離カラムからトラップカラムに成分を捕捉させる際に使用される移動相やトラップカラムから第２の分離カラムに捕捉した成分を移動させる際に使用される第２の移動相も特に制約されるものでなく、捕捉させる成分、トラップカラム、分離カラムそれぞれの特性に応じて適宜選択される。なお、本発明において「第１の分離カラム」「第２の分離カラム」の用語は分離カラムの個数を制限するものではない。つまり、第１の分離カラムの次にトラップカラムが接続され、その後にトラップカラムと第２の分離カラムが接続されていればよく、それぞれ１つのカラムが用いられる場合に限定されない。例えば、１つの第１の分離カラムと１つの第２の分離カラムと２以上のトラップカラムが用いられる場合や、１つの第１の分離カラムと、１つのトラップカラムと２つ以上の第２の分離カラムが用いられ、組成の異なる複数の第２の移動相によりトラップカラムから第２の分離カラムに保持された成分が送り出される場合、第２の分離カラムの次に第２のトラップカラムと第３の分離カラムが用いられる場合なども含まれる。

図１は本発明の一実施形態に係る分析装置の概略構成図である。この分析装置は高速液体クロマトグラム分析装置である。分析装置は、１つの第１の分離カラム１と、１つの第２の分離カラム２と、１つのトラップカラム３と、前記第１の分離カラム１と前記トラップカラム２を接続する第１の流路１０と、前記トラップカラム３と前記第２の分離カラム２を接続する第２の流路１１と、前記トラップカラム３と前記第１の流路１０の接続と前記トラップカラム３と前記第２の流路１１の接続を切り替える切替手段としての切替バルブ（例えばスイッチングバルブ）４と、第１の分離カラム１に第１の移動相を送り出す送出装置としての第１の送液ポンプ５と、第２の分離カラム２に第２の移動相を送り出す送出装置としての第２の送液ポンプ６を備える。

切替バルブ４は、前記第１の流路１０との接続に切り替えている場合、つまり第１の分離カラム１とトラップカラム３を接続する場合には、トラップカラム３と廃液流路１２を接続する。また、切替バルブ４は、第２の流路１１と第２の送液ポンプ６を、トラップカラム３を介することなく接続する（図１参照）。そして、当該切替バルブ４は、前記第２の流路１１との接続に切り替えている場合、つまり、トラップカラム３と第２の分離カラム２を接続する場合には、トラップカラム３の第１の流路１１が接続される接続口と反対側の接続口に、第２の送出ポンプ６を接続する。また、切替バルブ４は、第１の流路１０と廃液流路１２を、トラップカラム３を介することなく接続する（図２参照）。従って、後者が選択された場合、トラップカラム３には第２の移動相が逆方向に送り出され、トラップカラム３に捕捉されていた成分は第２の移動相によって第２の分離カラム２に供給される。

第１の流路１０には第１の検出器７と、送出装置としてのメークアップポンプ９から供給されるメークアップ溶媒を混合するミキシングチューブ（図示せず）が備えられる。ミキシングチューブは必須のものではなく、必要に応じて備えられる。第１の検出器７は、成分をＵＶ検出器のような非破壊的に成分を検出する検出器であって、第１の分離カラム１で分離された成分を検知する。

第２の分離カラム２から出た流路には第２検出器８が備えられる。第２の検出器８は破壊的又は非破壊的に成分を検出する検出器であって、第２の分離カラム２で分離された成分を検知する。第２の検出器２は、例えばＵＶ検出器であり、蛍光検出器であり、電気化学検出器であり、質量分析装置であり、コロナ荷電化粒子検出器（Corona CAD：Corona Charged Aerosol Detector）であり得る。

分析される試料が第１の分離カラム１に導入されると、第１の移動相によって第１の分離カラム１で試料は幾つかの成分に分離される。分離された成分は第１の検出器７によって検出される。分析開始当初は、図２に示すように切替バルブ４は、第２の流路１１との接続に切り替えられており、第１の流路１０と廃液流路１２が接続され、第１の移動相はトラップカラム３を通過することなく廃液として処理される。その後、トラップカラム３に捕捉させるべき画分が第１の検出器７で検出されると、切替バルブ４の操作により図１に示すように第１の流路１０との接続に切り替えられ、第１の流路１０とトラップカラム３が接続される。この結果、所望する画分が図１の矢印方向に流れる移動相によって移動し、トラップカラム３に捕捉される。次いで所望する画分がトラップカラム３に保持された後、切替バルブ４の操作により第２の流路１１との接続に切り替えられると、第２の流路１１とトラップカラム３が接続される。このとき、トラップカラム３には図２に示す矢印方向に第２の移動相が流れ、トラップカラム３に保持されていた成分は第２の分離カラム２に移動する。そして、第２の分離カラム２で分離された成分は、第２の検出器８で検出される。あるいは、捕捉させるべき成分の保持時間（リテンションタイム）に合わせ、タイマーを利用した時間制御によって切替バルブ４による切り替えを行わせることもできる。なお、捕捉させるべき成分の保持時間が分かっている場合には第１の検出器７が備えられない場合もある。

この分析装置では、トラップカラム３に保持された成分は、上記のとおりトラップカラム３を逆方向に流れる第２の移動相によってトラップカラム３から第２の分離カラム２に送り出される。従って、第１の移動相の移動方向に拡散して捕捉されていた成分は、拡散度合いが小さくなって第２の分離カラム２に導入される。その結果、第２の分離カラム２におけるテーリングやピークの広がりは減少する。本発明の分析方法は、リン脂質など比較的極性の高い脂質を分離分析する際には分離度や検出感度が著しく向上する。特に、ホスファチジルコリン（ＰＣ）やホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）などに代表されるリン脂質の分子種の分離分析において、正方向に移動相を送り出す場合に比べて多数の分子種が検出される。本発明における分析試料はリン脂質などの極性脂質を含む試料、例えば、各種動物（ヒトを含む）の動物の血液、動物や魚類の卵油などの食品などが好ましい試料であるが、これらに限られず、多次元クロマトグラフィの対象となる試料であれば特に限定されることはない。

なお、図１に示す分析装置では、トラップカラム３には第２の分離カラム２で使用される第２の移動相が供給されるが、本発明においては第２の分離カラム２で使用される第２の移動相と異なる組成の移動相を用いて、トラップカラム３に保持された成分を第２の分離カラム２に送り出すこともできる。

次に下記の実施例に基づいて本発明に係る分析方法をさらに具体的に説明するが、下記の実施例はあくまでも例示であり本発明に係る分析方法や分析装置は下記の実施例に限定されない。

図３に示す高速液体クロマトグラフ分析装置を使って、市販の大豆レシチン（ナカライ社製）に含まれるホスファチジルコリン（ＰＣ）の分子種を分析した。分析装置は、第１の検出器としてＵＶ検出器７が、第２の検出器としてＵＶ検出器８と質量分析器（ＭＳ）１２とコロナ荷電化粒子検出器（ＣＡＤ）１３が用いられており、第２の分離カラム２で分離された成分はＵＶ検出器８で検出された後、その一部は質量分析器１２で分析が行われ、残りはコロナ荷電化粒子検出器１３で検出される。また、当該分析装置では、切替バルブ３は予め求められている脂質画分の保持時間に基づいてタイマー制御されており、所望する脂質画分に応じて、第１の流路１０とトラップカラム３の接続と、トラップカラム３と第２の流路１１の接続を切り替える。

１次元めのクロマトグラフィは、シリカゲルが充填された第１の分離カラム１（YMC-PVAsil、4.6X250mmL、5μm：ワイエムシィ社）と、第１の移動相としてヘキサン：t−ブチルメチルエーテル：メタノール系のグラジエント溶媒を使用する順相クロマトグラフィ（カラム温度30℃、流量1ml/min）とし、２次元めのクロマトグラフィは、ＯＤＳが充填された第２の分離カラム２（YMC-triartC18、4.6X250mmL、3μm：ワイエムシィ社）と、第２の移動相としてアセトニトリル：メタノール：20mM酢酸アンモニウム水溶液（25:68.5:6.5v/v）を使用する逆相クロマトグラフィ（カラム温度40℃、流量1ml/min）とし、波長210nmで検出した。また、トラップカラム３にはＯＤＳカラム（YMC PropacC18、4.6X50mmL、5μm、ワイエムシィ社）を用いた。そして、メークアップ溶媒として50％アセトニトリル水溶液を用いた。メークアップ溶媒は、ＰＣ画分が溶出されるヘキサン：t−ブチルメチルエーテル：メタノール＝2：28：70の組成の第１の移動相に対して４：１（メークアップ溶媒：第１の移動相）の比率となるように加えられ、当該溶出画分をトラップカラム３に捕捉した。また、比較として第２の移動相を正方向にトラップカラムを送出して分析を行った。得られた２次元めのクロマトグラム（ＣＡＤによる）を図４に示した。この結果、正方向に送液した場合に比べて分離度がよくなり、検出可能な分子種が増えた。また、リテンションタイムもわずかながら早くなった。

次に大豆レシチン（ナカライ社製）について実施例１と同じ分析条件にてホスファチジルコリン（ＰＣ）分子種の同定を行った。この分析結果を図５、図６及び表１に示す。図６に示すようにトラップカラム３に捕捉されたＰＣ分子種として２６の検出ピークが検出され、表１に示すように質量分析器１２によって各ピークの分子種は概ね特定することができた。なお、表１に示すＲはホスファチジルコリンを構成する脂肪酸の分子種を示す（表２においても同じ）。２次元めのクロマトグラフィにおいて各種検出ピークの分離度は極めて良好であって（図６参照）、多数のＰＣ分子種が検出された。

市販の筋子乳化油中のホスファスジルコリン（ＰＣ）を実施例１と同じ分析条件で分析した。その結果を図７、８及び表２に示した。ここでも極めて良好な分離度が得られ、筋子の乳化油からは約４０種のＰＣ分子種が検出された（図８参照）。筋子油中に含まれるホスファチジルコリン中の分子種構成は、大豆レシチン中のそれと大きく異なることが示された。

このように本発明の方法によると、２次元めのクロマトグラフィにおいて分離度が飛躍的に向上し、リン脂質など比較的極性の高い脂質を構成する分子種を数多く同定できる。

本発明は多成分を含む試料を精度よく分離分析する手法を提供する。

１ 第１の分離カラム
２ 第２の分離カラム
３ トラップカラム
６ 第２の送液ポンプ
１０ 第１の流路
１１ 第２の流路

Claims (2)

1. 第１の分離カラムと、
   第２の分離カラムと、
   トラップカラムと、
   前記第１の分離カラムと前記トラップカラムを接続する第１の流路と、
   前記トラップカラムと前記第２の分離カラムを接続する第２の流路と、
   前記第１の流路の接続と前記第２の流路の接続を切り替える唯一の切替手段と、
   を備え、
   前記第２の流路の接続が選択された際、前記第１の流路が接続される前記トラップカラムの接続側と反対側に、前記トラップカラムに保持された成分を送り出す移動相の供給装置が接続される分析装置を用いて分離分析を行う方法であって、
   前記第１の分離カラムを用いた順相クロマトグラフィにより分離したリン脂質を前記トラップカラムに捕捉させた後、当該トラップカラムから、前記順相クロマトグラフィにおける移動相の送出方向と逆方向に移動相を送出して溶出させたリン脂質を前記第２の分離カラムを用いた逆相クロマトグラフィで分離分析する方法。
2. ２つの分離カラムを用いた脂質の２次元クロマトグラフィによる分析方法であって、第１の分離カラムで脂質を各脂質画分に分離した後に、所望する脂質画分をトラップカラムに捕捉し、次いでトラップカラムから溶出した前記脂質画分を第２の分離カラムで分子種分析を行うことを特徴とする請求項１に記載の分析方法。

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