JP6703218B1 - How to assess skin condition - Google Patents
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Abstract
角層試料中のポリアミンを選択的に染色する方法、及びポリアミン量を指標として皮膚のキメを評価する方法を提供することを課題とする。解決手段として、角層試料中に存在するポリアミンに、選択的に５（６）−カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステル（Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｐｒｏｐａｇｙｌ ｅｓｔｅｒ）で蛍光標識する工程を含むことを特徴とする蛍光顕微鏡観察用角層試料の調製方法を提供する。It is an object of the present invention to provide a method for selectively staining polyamines in a horny layer sample and a method for evaluating the texture of skin using the amount of polyamines as an index. As a means for solving the problems, a fluorescence microscope characterized by including a step of selectively labeling a polyamine present in a horny layer sample with 5(6)-carboxytetramethylrhodamine glycine propagyl ester A method for preparing an observation stratum corneum sample is provided.
Description
本発明は、皮膚角層中のポリアミンを指標として皮膚の状態を評価する方法に関する。 The present invention relates to a method for evaluating the condition of skin using polyamine in the stratum corneum of the skin as an index.
ポリアミンは体内でアミノ酸から合成される２つ以上のアミノ基を持つ物質である。全ての動物やヒトの細胞内で成長期に盛んに合成されている（非特許文献１）。細胞増殖時の核酸合成特にＲＮＡと強く結合し、ＲＮＡ構造を変化させ、成長期の多岐にわたる段階でタンパク質合成促進を行っている（非特許文献２）。
それ以外にも抗炎症作用（非特許文献３）、抗酸化作用（非特許文献４）、糖化抑制（非特許文献５）、寿命延長（非特許文献６）など様々な機能を有している。これらのことから、ポリアミンが細胞の生命現象に欠くべからざる物質であることが周知である。
加齢によって体内のポリアミン濃度が低下すること（非特許文献７）また、ポリアミンの合成には、一連の合成系酵素が必要であるが、この酵素は、加齢に伴って酵素活性が低下することが知られている（非特許文献８）。Polyamines are substances that have two or more amino groups synthesized from amino acids in the body. It is actively synthesized in the cells of all animals and humans during the growth period (Non-Patent Document 1). Nucleic acid synthesis during cell growth, in particular, strongly binds to RNA, changes the RNA structure, and promotes protein synthesis at various stages during the growth period (Non-Patent Document 2).
Other than that, it has various functions such as anti-inflammatory action (Non-Patent Document 3), antioxidant action (Non-Patent Document 4), glycation inhibition (Non-Patent Document 5), and life extension (Non-Patent Document 6). .. From these facts, it is well known that polyamine is an indispensable substance for cell life phenomenon.
Aging reduces the concentration of polyamines in the body (Non-Patent Document 7). Further, a series of synthetic enzymes are required for the synthesis of polyamines, and the enzyme activity of these enzymes decreases with aging. It is known (Non-Patent Document 8).
全身各臓器におけるポリアミンの存在量は既知である。例えば皮膚においては、真皮、表皮共に存在する。真皮、表皮のポリアミン（スペルミン、スペルミジン、プトレスシン）存在量も知られている(非特許文献９)。しかし、皮膚角層におけるポリアミンの量についての報告はない。
また、皮膚角層におけるポリアミンを特異的に検出する方法は、見当たらない。また皮膚角層におけるポリアミンの機能についても報告がない。
一方、近年癌の研究に伴って、細胞のポリアミンの研究が進んでおり、細胞の生存に悪影響を及ぼさない生体のポリアミン染色方法が提案されている（非特許文献１０）。この染色方法は、生細胞の生染色技術であって、皮膚角層のように生細胞と死細胞が混在する組織の染色に適用可能か不明である。The amount of polyamine present in each organ of the whole body is known. For example, in the skin, both the dermis and the epidermis are present. The abundance of polyamines (spermine, spermidine, putrescine) in the dermis and epidermis is also known (Non-Patent Document 9). However, there is no report on the amount of polyamine in the stratum corneum.
Further, no method for specifically detecting polyamine in the stratum corneum of the skin is found. In addition, there is no report on the function of polyamines in the stratum corneum.
On the other hand, in recent years, along with the research on cancer, research on polyamines in cells has been advanced, and a method for staining polyamines in a living body that does not adversely affect the survival of cells has been proposed (Non-Patent Document 10). It is unclear whether this staining method is a technique for viable staining of live cells and is applicable to the staining of tissues in which live cells and dead cells coexist, such as the stratum corneum of the skin.
角層は、皮膚を構成する４層のうち、最外層に位置し、角質、角質層ともいう組織であるが、この角層を採取して染色を行なって、組織観察することで皮膚の構造や機能、構成成分の作用効果なども判明しつつある。例えば、角層の形状を評価するには、粘着性のテープで角層を剥離させて採取し、この角層をそのまま、もしくは採取した角層をスライドガラスに転写して、角層を青色１号、紫色４０１号、緑色２０１号、黄色４号、黄色５号、黄色４０７号、赤色１０２号、橙色２０５号、ブリリアントグリーン、ヘマトキシリンなどの色素と有機酸とアルコールを用いた試薬や、コンゴレッド色素で染色し、観察する方法が行われている（特許文献１〜２）。
また、角層中に存在する物質から肌状態を評価する染色方法として、蛍光標識抗体を用いてＡＧＥｓ（ａｄｖａｎｃｅｄ ｇｌｙｃａｔｉｏｎ ｅｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の存在量を指標として皮膚状態を評価する方法やＴＡＲＣ（Ｔｈｙｍｕｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ）の発現量を指標としてアトピー性皮膚炎の局所病態を評価する方法が記載されている（特許文献３〜４）。
特許文献５には、ヒドラジノ基含有蛍光物質によりカルボニル化した角層タンパク質を検出し、皮膚疾患の有無を検査する方法が記載されている。
このように皮膚角層を染色することで、皮膚の状態を判別する指標が開発されている。The stratum corneum is the outermost layer of the four layers that make up the skin, and is also called the stratum corneum or stratum corneum. The stratum corneum is collected and stained to observe the tissue structure. The functions, effects, and the effects of the constituents are becoming clear. For example, in order to evaluate the shape of the stratum corneum, the stratum corneum is peeled off with an adhesive tape and collected, and this stratum corneum is directly or transferred to a slide glass, and the stratum corneum 1 No. 4, purple No. 401, green No. 201, yellow No. 4, yellow No. 5, yellow No. 407, red No. 102, orange No. 205, brilliant green, reagents using organic acids and alcohols such as hematoxylin, and Congo Red A method of observing by dyeing is performed (Patent Documents 1 and 2).
Further, as a staining method for evaluating the skin condition from a substance existing in the horny layer, a method for evaluating the skin condition using a fluorescent labeled antibody with the abundance of AGEs (advanced glycation end products) as an index, and TARC (Thymus and activation). -Regulated chemokine) is used as an index to evaluate a local pathological condition of atopic dermatitis (Patent Documents 3 to 4).
Patent Document 5 describes a method of detecting the presence or absence of a skin disease by detecting a horny layer protein that is carbonylated by a hydrazino group-containing fluorescent substance.
By staining the stratum corneum of the skin in this way, an index for distinguishing the state of the skin has been developed.
皮膚において、「肌理」または「キメ」という指標は、皮膚の表面形態が乱れている肌状態をあらわす場合に使用されている。健康な皮膚の表面では、皮溝、皮丘によって規定されるキメ（肌理）が形成され、光学的にも規則的である。しかし、肌荒れした皮膚の表面では、キメが乱れて、さらには鱗屑（スケーリング）が発生し光学的に不規則になり、肉眼でもその乱れを認知できるようになる。また、肌触りもスムースさに欠け、かさついた感触になる。
肉眼的にはスケーリングの程度、炎症反応による紅斑の程度をスコア化することが、当業者間では行なわれている。また表面形態をデジタルマイクロスコープで撮影して、画像解析によりスケーリング部分のみ抽出して評価をする、あるいは皮膚の測色により赤みの程度を定量化することが行なわれている。また、肌荒れに伴う表面形態の変化は、レプリカ法などによって計測することも可能である。さらに、肌荒れに伴う角層水分量の低下やバリア機能の低下は、角層コンダクタンスや経表皮水分蒸散量の測定など、皮膚を傷つけないで測定する機器を用いた非侵襲的な方法により評価する様々な方法が提案されている（特許文献６〜１２）。しかし必ずしも実感に即した評価方法が未だ提供されていないのが現状である。また評価にあたっても長年の経験が必要であり、習熟に専門的な訓練が必要であった。このキメの状態を客観的に評価測定する方法が求められている。In the skin, the index “texture” or “texture” is used when the skin condition in which the surface morphology of the skin is disturbed is expressed. On the surface of healthy skin, a texture (texture) defined by a skin groove and a cuticle is formed, which is also optically regular. However, on the rough surface of the skin, the texture is disturbed, and scales (scaling) are generated to make it optically irregular, and the disturbance can be recognized even with the naked eye. Also, it lacks smoothness and feels bulky.
It is done by those skilled in the art to score the degree of scaling macroscopically and the degree of erythema due to inflammatory reaction. In addition, the surface morphology is photographed with a digital microscope and only the scaled portion is extracted by image analysis for evaluation, or the degree of redness is quantified by colorimetry of the skin. Further, the change in surface morphology due to rough skin can be measured by a replica method or the like. In addition, the decrease in stratum corneum water content and barrier function due to rough skin is evaluated by a non-invasive method using a device that does not damage the skin, such as measurement of stratum corneum conductance and transepidermal water loss. Various methods have been proposed (Patent Documents 6 to 12). However, the current situation is that evaluation methods that match actual feelings have not yet been provided. In addition, many years of experience were required for evaluation, and specialized training was required for proficiency. There is a demand for a method of objectively evaluating and measuring the texture state.
本発明者らは、皮膚角層におけるポリアミンの量に着目し、角層のポリアミン量が皮膚のキメの指標となりうることを見出し、本発明をなした。
すなわち、本発明は角層中のポリアミン量を測定して皮膚状態を評価する方法であり、 その１つとしてポリアミンを選択的に染色し、皮膚角層試料を調製する方法、及び調製した試料を用いた皮膚角層のポリアミン量を測定する方法、さらにはポリアミン量の測定結果に基づく皮膚のキメを評価する方法を提供することを課題とする。The present inventors have paid attention to the amount of polyamine in the stratum corneum of the skin, have found that the amount of polyamine in the stratum corneum can be an index of skin texture, and have made the present invention.
That is, the present invention is a method for evaluating the skin condition by measuring the amount of polyamine in the stratum corneum, one of which is a method for selectively staining polyamine to prepare a stratum corneum sample, and a prepared sample. It is an object of the present invention to provide a method for measuring the amount of polyamine in the stratum corneum, and a method for evaluating the texture of the skin based on the measurement result of the amount of polyamine.
本発明の主な構成は、次のとおりである。
（１）角層試料中に存在するポリアミン量を測定して、皮膚状態を評価する方法。
（２）角層試料中に存在するポリアミンを、染色する工程を含むことを特徴とする角層試料の調製方法。
（３）染色する工程が、５（６）−カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステル（Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐｒｏｐａｇｙｌ ｅｓｔｅｒ）を含む溶液に、角層試料を浸漬する工程である（２）に記載の角層試料の調製方法。
（４）角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである（２）又は（３）に記載の角層試料の調製方法。
（５）５（６）−カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルで蛍光標識された角層試料を、蛍光顕微鏡観察することによって選択的に蛍光標識された皮膚角層のポリアミンの蛍光量を測定して皮膚状態を評価する方法。
（６）ポリアミン量の測定が、画像解析の手法による蛍光輝度の測定である（５）に記載の皮膚状態を評価する方法。
（７）皮膚状態の評価が、皮膚表面形態を表す物性値としてキメの粗さ・キメの形状・キメの流れにくさ・キメスコアから選択されるいずれか１以上の項目である（５）または（６）に記載の皮膚状態を評価する方法。
（８）皮膚状態の評価が、目視によるキメスコアである（５）または（６）に記載の皮膚状態を評価する方法。
（９）角層試料の水抽出物から化学的分析方法により検出したポリアミン量を指標として皮膚状態を評価する方法。
（１０）角層試料がテープストリッピング法によって採取されたものである（１）又は（５）〜（９）のいずれかに記載の皮膚状態を評価する方法。The main configuration of the present invention is as follows.
(1) A method of evaluating the skin condition by measuring the amount of polyamine present in the stratum corneum sample.
(2) A method for preparing a stratum corneum sample, which comprises a step of dyeing a polyamine existing in the stratum corneum sample.
(3) The horny layer sample according to (2), wherein the step of dyeing is a step of immersing the horny layer sample in a solution containing 5(6)-carboxytetramethylrhodamine lysine propargyl ester (Carboxytetramethyrylrhodamine Glycine propagyl ester). Preparation method of.
(4) The method for preparing a stratum corneum sample according to (2) or (3), wherein the stratum corneum sample is collected by a tape stripping method.
(5) 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine lysine Propagyl ester The horny layer sample fluorescently labeled was observed by a fluorescence microscope to measure the fluorescence amount of the polyamine in the selectively horny skin horny layer. To evaluate skin condition.
(6) The method for evaluating the skin condition according to (5), wherein the measurement of the amount of polyamine is the measurement of fluorescence brightness by a method of image analysis.
(7) The evaluation of the skin condition is any one or more items selected from texture roughness, texture shape, texture flow difficulty, and texture score as a physical property value representing the skin surface morphology (5) or ( The method for evaluating the skin condition according to 6).
(8) The method for evaluating the skin condition according to (5) or (6), wherein the evaluation of the skin condition is a visual score.
(9) A method of evaluating the skin condition using the amount of polyamine detected by a chemical analysis method from a water extract of a horny layer sample as an index.
(10) The method for evaluating the skin condition according to (1) or (5) to (9), wherein the stratum corneum sample is obtained by a tape stripping method.
本発明により、皮膚角層のポリアミンを検出又は選択的に染色する方法が提供される。またポリアミンを選択的に観察可能な、角層試料の調製方法及び調製した試料を用いた皮膚状態を評価する方法が提供される。本発明の方法は、角層中のポリアミンに選択的に蛍光色素が結合しているので、ポリアミンの観察が極めて容易である。したがって、角層中におけるポリアミンの状態を容易に観察することが可能である。また観察画像を画像解析することでポリアミン量を容易に計測でき、これを基準として皮膚のキメを客観的な数値として解析評価することができる。この皮膚のキメ評価は、従来の方法と異なり、検査担当者の専門的な訓練の必要がなく、短時間で評価測定が可能となるため利便性が高い。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides a method for detecting or selectively staining polyamines in the stratum corneum of the skin. Also provided are a method for preparing a stratum corneum sample and a method for evaluating a skin condition using the prepared sample, which enables selective observation of polyamine. In the method of the present invention, since the fluorescent dye is selectively bound to the polyamine in the stratum corneum, the observation of polyamine is extremely easy. Therefore, it is possible to easily observe the state of polyamine in the stratum corneum. Moreover, the amount of polyamine can be easily measured by image analysis of the observed image, and the texture of the skin can be analyzed and evaluated as an objective numerical value based on this. Unlike the conventional method, this skin texture evaluation does not require specialized training of a person in charge of inspection, and evaluation measurement can be performed in a short time, which is highly convenient.
本願は、皮膚より採取した角層試料を、ポリアミン染色試薬により観察可能な状態とした角層試料を調製する方法の発明である。ポリアミン染色試薬とは、５（６）−Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ−Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐｒｏｐａｇｙｌ ｅｓｔｅｒで、グリシンプロパギルエステルがポリアミンと特異的に反応し、５（６）カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）を標識することにより、蛍光観察可能な状態とする。標識する色素は、５（６）カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）に限らず、蛍光色素、発光色素、着色色素のいずれでも良い。例えば、メロシアニン（Ｍｅｒｏｃｙａｎｉｎｅ）、ペリレン（ｐｅｒｙｌｅｎｅ）、アクリジン（ａｃｒｉｄｉｎｅ）、ルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）、ローダミン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ）、クマリン（ｃｏｕｍａｒｉｎ）、フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｓｃｅｉｎ）、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）などの色素があげられる。さらに、この試料の観察画像を画像解析にすることで皮膚角層のポリアミン量を蛍光輝度によって数値化して、皮膚の状態を評価することが、本発明の第２の発明である。さらにまた本発明の第３の発明は、観察画像の画像解析情報により、得られるポリアミン量を指標として皮膚のキメを評価するものである。以下に、更に詳細に説明を加える。
なお、本発明でいう「キメ」とは、ヒトの肌表面に本来存在する「皮溝」と呼ばれる溝と、その溝に囲まれ隆起した「皮丘」とからなる網目構造である。美しく、健康的な肌に見せるためには、キメを細かく目立たなくすることが重要なポイントである。キメは、加齢に伴って粗くなり、キメが流れて不規則、不明瞭となっていく傾向はあるものの、若年者でもキメが不明瞭な場合があることから、必ずしも老化とキメの粗さが直接影響するわけではない。このようにキメの形状は個人差が大きく、各人の持って生まれた皮膚形態であるといえる。The present application is an invention of a method for preparing a stratum corneum sample which is made observable by a polyamine staining reagent, the stratum corneum sample being collected from the skin. The polyamine staining reagent is 5(6)-Carboxytetramethylthrhodamine-Glycine Propagyl ester, and glycine propargyl ester specifically reacts with polyamine to label 5(6)carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) for fluorescence observation. Make it possible. The dye to be labeled is not limited to 5(6)carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), but may be any of a fluorescent dye, a luminescent dye, and a coloring dye. For example, merocyanine, perylene, acridine, luciferin, rhodamine, coumarin, fluoroscein, umbelliferone, and the like are umbelliferone. .. Furthermore, the second invention of the present invention is to evaluate the skin condition by converting the observed image of this sample into an image to quantify the amount of polyamine in the stratum corneum of the skin by the fluorescence brightness. Furthermore, the third aspect of the present invention is to evaluate the texture of the skin using the obtained polyamine amount as an index based on the image analysis information of the observed image. The details will be described below.
The "texture" in the present invention has a mesh structure composed of a groove called "skin groove" originally existing on the surface of human skin and a "skin ridge" that is surrounded by the groove and rises. In order to make your skin look beautiful and healthy, it is important to make the texture fine and inconspicuous. Texture tends to become rough with age, and tends to become irregular and unclear due to flowing texture, but even young people may have unclear texture, so aging and roughness of texture are not always necessary. Does not directly affect. In this way, the shape of the texture has great individual differences, and it can be said that it is the skin morphology created by each person.
前記皮膚角層試料の採取、角層試料の処理及び角層試料の調製、画像解析データ取得と、皮膚状態の評価は、以下のように行うことが好ましい。
（工程１）角層剥離手段を用いて、皮膚より角層試料を採取する。
（工程２）工程１で採取した角層試料を、剥離面を上方にして透明板に貼り付ける。
（工程３）ポリアミンに対して特異的な結合能を有する５（６）−カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルを含む溶液を滴下した後、一定時間静置する。
（工程４）工程３で得られた角層試料を水によって洗浄する。
（工程５）工程４で洗浄した角層試料を風乾して蛍光顕微鏡観察試料（標本）とする。
（工程６）工程５で得られた蛍光顕微鏡観察試料を、励起光５６０ｎｍ、蛍光光５８０ｎｍの観察条件で蛍光顕微鏡観察して蛍光画像データとして取得する。
（工程７）工程６で取得した蛍光画像の蛍光輝度をピクセルごとに黒から白の順序の０〜２５５グレーレベルで表示し試験試料のポリアミンの指標とする。
（工程８）工程８は、次のＡ又はＢいずれかの方法によってキメスコアを決定する工程である。
Ａ．多数の被験者から採取した角層試料の前記ポリアミンの指標値と、被験者の皮膚のキメの粗さ、キメの形状、キメの流れにくさ、キメスコアに基づく相関式から回帰直線をもとめ、この回帰直線から工程６で得られたポリアミン指標に対応する被験者の皮膚のキメの粗さ、キメの形状、キメの流れにくさ、キメスコアを決定する。
Ｂ．多数の被験者から採取した角層試料の前記ポリアミンの指標値と目視評価スコアに基づく相関式から回帰直線をもとめ、この回帰直線から工程６で得られたポリアミン指標に対応する被験者のキメスコアを決定する。The collection of the stratum corneum sample, the treatment of the stratum corneum sample, the preparation of the stratum corneum sample, the acquisition of image analysis data, and the evaluation of the skin condition are preferably performed as follows.
(Step 1) A stratum corneum sample is collected from the skin using a stratum corneum peeling means.
(Step 2) The stratum corneum sample collected in Step 1 is attached to a transparent plate with the release surface facing upward.
(Step 3) After dropping a solution containing 5(6)-carboxytetramethylrhodamine lysine propargyl ester having a specific binding ability to polyamine, the mixture is allowed to stand for a certain period of time.
(Step 4) The stratum corneum sample obtained in Step 3 is washed with water.
(Step 5) The stratum corneum sample washed in Step 4 is air-dried to obtain a fluorescence microscope observation sample (specimen).
(Step 6) The fluorescence microscope observation sample obtained in Step 5 is observed under a fluorescence microscope under the observation conditions of excitation light of 560 nm and fluorescence light of 580 nm to obtain fluorescence image data.
(Step 7) The fluorescent brightness of the fluorescent image acquired in Step 6 is displayed for each pixel at a gray level of 0 to 255 in the order of black to white, and is used as an index of the polyamine of the test sample.
(Step 8) Step 8 is a step of determining the texture score by the following method A or B.
A. Index value of the polyamine of the stratum corneum sample collected from a large number of subjects, and the roughness line of the skin of the subject, texture shape, texture flow difficulty, the regression line from the correlation equation based on the texture score, this regression line The roughness of the skin of the subject, the shape of the texture, the difficulty of flowing the texture, and the texture score corresponding to the polyamine index obtained in Step 6 are determined.
B. A regression line is obtained from a correlation formula based on the index value of the polyamine of the horny layer samples collected from many subjects and the visual evaluation score, and the texture score of the subject corresponding to the polyamine index obtained in step 6 is determined from this regression line. .
工程１の角層剥離手段は、バイオプシーや粘着テープを用いる方法のいずれであっても良い。被験者の負担を考慮すると粘着テープを用いる方法が好ましい。粘着テープを用いる方法は、テープストリッピング法と呼ばれる。
テープストリッピング法は、粘着性テープを皮膚に貼り付けた後、剥がして皮膚の表層を採取する方法である。
粘着剤としては、天然ゴム、ポリイソブチレン、ポリブタジエン、シリコーンゴム、ポリイソプレン、スチレン−イソプレン−スチレンブロック共重合体等の合成ゴム、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル酸エステル共重合体等の合成樹脂等が用いられている。テープストリッピング法に用いる粘着テープは市販されており、これを使用しても良い。The stratum corneum peeling means in step 1 may be any method using biopsy or an adhesive tape. Considering the burden on the subject, the method using an adhesive tape is preferable. A method using an adhesive tape is called a tape stripping method.
The tape stripping method is a method in which an adhesive tape is attached to the skin and then peeled off to collect the surface layer of the skin.
As the adhesive, natural rubber, polyisobutylene, polybutadiene, silicone rubber, polyisoprene, synthetic rubber such as styrene-isoprene-styrene block copolymer, synthetic resin such as polypropylene, polystyrene, acrylic ester copolymer, etc. are used. Has been. Adhesive tapes used in the tape stripping method are commercially available and may be used.
工程２において、工程１で採取した角層試料を、剥離面を上方にして透明板に貼り付ける場合の透明板は、顕微鏡観察に適したガラス製あるいはアクリル製のものを用いることが好ましい。 In step 2, when the stratum corneum sample collected in step 1 is attached to the transparent plate with the peeling surface facing upward, it is preferable to use a transparent plate made of glass or acrylic suitable for microscopic observation.
工程３で用いる５（６）−カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルを含む溶液は、市販されている細胞用のポリアミン染色試薬を用いることができる。５（６）−カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルはグリシンプロパギルエステルが特異的にポリアミンに結合する特性を利用して、生細胞などの組織内に存在するポリアミンに結合することで、ポリアミンに赤色蛍光を付するものである。このような染色試薬としては、「ＰｏｌｙａｍｉｎｅＲＥＤ」（フナコシ株式会社）を例示することができる。 As the solution containing 5(6)-carboxytetramethylrhodamine glycine propargyl ester used in step 3, a commercially available polyamine staining reagent for cells can be used. 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine lysine propargyl ester utilizes the property of glycine propargyl ester to specifically bind to polyamines, and thereby binds to polyamines existing in tissues such as living cells to give polyamines. It has red fluorescence. As such a staining reagent, "Polyamine RED" (Funakoshi Co., Ltd.) can be exemplified.
工程４における洗浄は、工程３で用いたポリアミン染色用試薬の、角層中のポリアミンと未反応の５（６）−カルボキシテトラメチルローダミングリシンプロパギルエステルを除去するために行なうものである。充分量の水を用いて少なくとも１〜１０回程度（好ましくは３〜５回）繰り返し洗浄する。洗浄に用いる水は、純水、イオン交換水、蒸留水、水道水等があげられるが、純水が好ましい。 The washing in step 4 is carried out in order to remove the polyamine staining reagent used in step 3 from the unreacted 5(6)-carboxytetramethylrhodamine lysine propargyl ester in the stratum corneum. It is repeatedly washed with a sufficient amount of water at least about 1 to 10 times (preferably 3 to 5 times). Examples of water used for washing include pure water, ion-exchanged water, distilled water, tap water, and the like, with pure water being preferred.
工程５においては、前記工程４終了後、試料の水分を風乾させた後、顕微鏡観察用の試料（標本）とする。なお、長期間試料を保存する場合に用いる水溶性の封入剤（グリセリン系、クロラール系、ゼラチン系、特殊封入剤）によって封入標本としても良い。 In step 5, after the step 4 is finished, the sample is air-dried to obtain a sample (specimen) for microscopic observation. A water-soluble mounting medium (glycerin-based, chloral-based, gelatin-based, special mounting medium) used when storing a sample for a long period of time may be used as a sealed sample.
工程６においては、前記工程５で用いた標本を蛍光顕微鏡により観察する。このとき、励起光５６０ｎｍ、蛍光光５８０ｎｍの条件で蛍光顕微鏡観察して蛍光データを取得する。蛍光データの取得は、あるいは標本をビデオスコープ等でモニターに写し出し、剥離採取した角層試料に含まれているポリアミンの量を蛍光輝度として確認する。このとき、ポリアミンは、赤色の蛍光を発し、蛍光輝度がすなわちポリアミン量の指標となる。この特異的な蛍光は、ポリアミン量と１対１の対応があることが確認されている（非特許文献１０参照）。 In step 6, the sample used in step 5 is observed with a fluorescence microscope. At this time, fluorescence data is acquired by observing under a fluorescence microscope under the conditions of excitation light of 560 nm and fluorescence light of 580 nm. For the acquisition of fluorescence data, the sample is displayed on a monitor with a videoscope or the like, and the amount of polyamine contained in the exfoliated and collected horny layer sample is confirmed as the fluorescence brightness. At this time, the polyamine emits red fluorescence, and the fluorescence brightness serves as an index of the amount of polyamine. It has been confirmed that this specific fluorescence has a one-to-one correspondence with the amount of polyamine (see Non-Patent Document 10).
工程７において、上記工程６における蛍光顕微鏡に観察によって、確認評価したい標本の観察画像を選択して、デジタルカメラ等を用いて画像データとしてコンピュータに取り込む。そして取得した観察画像の取り込みデータを、画像処理によって数値化したデータを取得する。画像処理は、公知の画像処理システムであればどのようなシステムであっても使用可能である。このような画像処理システムとしては、本発明にあっては、「ＩｍａｇｅＪ」が適切な画像処理システムとして使用可能である。「ＩｍａｇｅＪ」は、オープンソースでパブリックドメインの画像処理ソフトウェアである。当業者であれば、容易に入手可能である。
前記ポリアミン類の存在に由来する、蛍光画像の輝度をピクセル（画素）ごとに黒から白の順序の０〜２５５グレーレベルで表示する。なお、グレーレベルの閾値の設定は、各画像の角層が写っていない部分（バックグラウンド）のグレーレベルの平均輝度をａとし、角層の重層部分（積層した部分）のグレーレベルの平均輝度値をｂとし、グレーレベルａ以上、ｂ未満の平均輝度値を、角層のポリアミン出力データとなるように、グレーレベル閾値を設定する。
かくして出力された画像データの画素数あたりの平均輝度値をポリアミン量の指標とする。In step 7, the observation image of the sample to be confirmed and evaluated is selected by observation with the fluorescence microscope in step 6, and the image is taken into the computer as image data using a digital camera or the like. Then, the captured data of the acquired observation image is digitized by image processing to be acquired. The image processing can be used with any known image processing system. As such an image processing system, "ImageJ" can be used as an appropriate image processing system in the present invention. "ImageJ" is open source, public domain image processing software. Those skilled in the art can easily obtain it.
The brightness of the fluorescent image, which is derived from the presence of the polyamines, is displayed for each pixel at a gray level of 0 to 255 in the order of black to white. Note that the gray level threshold is set such that the average brightness of the gray level of the part where each layer of the image is not reflected (background) is a, and the average brightness of the gray level of the multi-layered part (layered part) of the layers is The gray level threshold value is set so that the value is b and the average luminance value of gray level a or more and less than b becomes the polyamine output data of the stratum corneum.
The average luminance value per pixel number of the image data thus output is used as an index of the amount of polyamine.
工程８においてはＡ、Ｂいずれかの工程を採用できる。
工程８のＡでは、皮膚表面形態を表す物性値として「キメの粗さ」、「キメの形状」、「キメの流れにくさ」、「キメスコア」について測定するものである。例えば、特開２０１７−１４０２０６号公報に記載の、肌理評価システムがあげられる。
工程８のＢでは、従来の皮膚の表面形態を表す物性値として、目視によるキメ評価を採用するものである。
以下、肌理評価システムを用いた皮膚表面形態を表す物性値として、肌理パラメータを算出する方法を工程に沿って説明する。また目視によるキメ評価値を、ポリアミンを指標として決定する方法について説明する。In step 8, either step A or step B can be adopted.
In step 8A, "texture roughness", "texture shape", "texture flow difficulty", and "texture score" are measured as physical property values representing the skin surface morphology. For example, there is a texture evaluation system described in JP-A-2017-140206.
In Step 8B, visual texture evaluation is adopted as the conventional physical property value indicating the surface morphology of the skin.
Hereinafter, a method of calculating a texture parameter as a physical property value representing a skin surface morphology using a texture evaluation system will be described along with steps. In addition, a method of determining the texture evaluation value by visual observation using polyamine as an index will be described.
（１）複数者の肌拡大画像撮影
まず、複数者の肌の拡大画像を撮像する。この撮像装置は、レンズ部と照光部とを備える。撮像した画像に影が生じると、モノクロ画像とした時に影部分が実際よりも濃くなり、濃淡値から算出する肌理パラメータに狂いが生じるため、レンズ部を取り囲むように複数の照光部を配置することが好ましい。例えば、ＬＥＤ等の点光源からなる複数の照光部を、レンズ部を中心とする円周上にｎ回回転対象（ｎ≧３）に配置することが好ましい。また、照光部は、同心円である２個以上の円周上に配置することもでき、全円周上を照光部とすることもできる。このような撮像装置としては、デジタル式のマイクロスコープが望ましく、例えば、ｉ−ＳＣＯＰＥ（株式会社モリテックス製）をあげることができる。
撮像箇所は、小じわ、しわ等が存在しない滑らかな部分が好ましく、例えば頬、額などがあげられる。また、反射光が強くなるテカリ（油脂）を拭き取り、女性の場合はメイク等を落としてから撮像する。(1) Imaging of Skin Enlarged Images of Multiple Persons First, enlarged images of skin of multiple persons are captured. This imaging device includes a lens unit and an illumination unit. If a shadow appears in the captured image, the shadow part will be darker than it actually is when it is made into a monochrome image, and the texture parameters calculated from the gray value will be incorrect.Therefore, place multiple illuminators around the lens part. Is preferred. For example, it is preferable to arrange a plurality of illuminating parts each including a point light source such as an LED so as to be rotated n times (n≧3) on the circumference around the lens part. Further, the illuminating section can be arranged on two or more circumferences that are concentric circles, or the entire circumference can be the illuminating section. As such an imaging device, a digital microscope is desirable, and for example, i-SCOPE (manufactured by Moritex Co., Ltd.) can be cited.
The imaging portion is preferably a smooth portion free of fine wrinkles, wrinkles, and the like, and examples thereof include cheeks and foreheads. In addition, the shiny (oil and fat) that makes the reflected light stronger is wiped off, and in the case of a woman, the makeup or the like is removed before the image is taken.
（２）モノクロ画像変換
撮像した画像は、画像データとしてコンピュータに取りこみ、拡大画像をモノクロ画像に変換する。ここで、モノクロ画像とは、多階調単色画像を意味する。モノクロ画像の色調は特に制限されず、例えば、赤成分（Ｒ）、緑成分（Ｇ）、青成分（Ｂ）のいずれかを用いることができる。画像の濃淡が最も明確に判断できるため、緑成分（Ｇ）を用いることが好ましい。また、モノクロ画像に変換する前、または後に、ノイズ低減のためのスムージング処理、照明ムラを補正するうねり取り処理等を行うことができる。(2) Monochrome image conversion The captured image is taken into a computer as image data and the enlarged image is converted into a monochrome image. Here, the monochrome image means a multi-tone monochromatic image. The color tone of the monochrome image is not particularly limited, and for example, any of the red component (R), green component (G), and blue component (B) can be used. It is preferable to use the green component (G) because the shade of the image can be determined most clearly. Further, before or after conversion into a monochrome image, smoothing processing for noise reduction, undulation processing for correcting uneven illumination, and the like can be performed.
（３）工程８Ａによる肌理パラメータ算出と評価
このモノクロ画像の各画素（ｘ、ｙ）における濃淡を表す数値Ｚ（ｘ、ｙ）から肌理の状態と相関を有する肌理パラメータとして、Ｓａ’、ＰＳｍ’、Ｓｔｒ’を算出する。
Ｓａ’：画面全体のＺ（ｘ、ｙ）の絶対値の平均値を計算して、Ｓａ’とした。
ＰＳｍ’：情報によりノイズ除去を行った後、最大値の１／１０の値を正のしきい値、最小値の１／１０の値を負のしきい値とし、画面内に縦８本、横６本のサンプリングラインを等間隔にとり、サンプリングライン上でスキャンして、負のしきい値以下になる点から次に負のしきい値以下になる点までの距離を求めた。縦ごと、横ごとにこの値を平均し、最後に縦と横の値の平均をＰＳｍ’とした。
Ｓｔｒ’：画像中心部の１２０×１２０画素の領域を切り出し、この領域から計算した自己相関係数（ＡＣＦ）の最大値の０．３倍をしきい値として、長軸半径と短軸半径を求め、この比（長軸半径／短軸半径）をＳｔｒ’とした。
本発明における、「キメの粗さ」とは、表面粗さパラメータである算術平均高さ（ＩＳＯ ２５１７８）に相当し、前記算出したＳａ’（肌の凹凸に関する疑似算術平均高さ）として、数値が大きいほどキメが粗い状態を意味する。また、「キメの形状」とは表面粗さパラメータの輪郭曲線要素の平均長さ（ＪＩＳ Ｂ０６０１−２００１）に相当し、前記算出したＰＳｍ’（疑似輪郭曲線要素の平均長さ）として数値が小さいほどキメが細かい状態を意味する。「キメの流れにくさ」とは表面粗さパラメータの表面性状のアスペクト比（ＩＳＯ ２５１７８）に相当し、前記算出したＳｔｒ’（疑似表面性状のアスペクト比）として、数値が小さいほどキメが流れている状態を意味する。なお、「キメスコア」とは、肌の拡大画像の肌理の細かさ、規則正しさ、等方性を専門判定者が総合的に数値化した目視スコア実測値（１〜１０の１０段階を数値化）を目的変数、前記算出したＳａ’、ＰＳｍ’、Ｓｔｒ’を説明変数として得られた重回帰式から求められる目視スコア理論値であり、下記式にあてはめ算出した。キメスコアは、数値が大きいほど目視スコアの数字が高く、キメがよいことを意味する。
キメスコア＝Ａ×Ｓａ’＋Ｂ×ＰＳｍ’＋Ｃ×Ｓｔｒ’＋Ｄ（ただし、Ａ、Ｂ、Ｃは係数、Ｄは定数である。） (3) Texture parameter calculation and evaluation in step 8A Sa′ and PSm′ are texture parameters having a correlation with the texture state from the numerical value Z(x, y) representing the shade at each pixel (x, y) of this monochrome image. , Str′ are calculated.
Sa': The average value of the absolute values of Z(x, y) on the entire screen was calculated and set as Sa'.
PSm′: After noise removal by information, 1/10 of the maximum value is a positive threshold value, 1/10 of the minimum value is a negative threshold value, and 8 vertical lines are displayed in the screen. Six horizontal sampling lines were arranged at equal intervals, and scanning was performed on the sampling lines to obtain the distance from the point at which the negative threshold value was reached or less to the point at which the next negative threshold value was reached. This value was averaged vertically and horizontally, and finally the average of the vertical and horizontal values was taken as PSm'.
Str′: A 120×120 pixel area in the center of the image is cut out, and the major axis radius and the minor axis radius are set with 0.3 times the maximum value of the autocorrelation coefficient (ACF) calculated from this area as a threshold value. This ratio (major axis radius/minor axis radius) was defined as Str'.
In the present invention, the "texture roughness" corresponds to the arithmetic average height (ISO 25178) which is a surface roughness parameter, and is a numerical value as the calculated Sa' (pseudo arithmetic average height regarding unevenness of skin). A larger value means a rougher texture. The "texture shape" corresponds to the average length of the contour curve element (JIS B0601-2001) of the surface roughness parameter, and the calculated PSm' (average length of the pseudo contour curve element) has a small numerical value. It means that the texture is fine. "Difficulty in flow of texture" corresponds to the aspect ratio (ISO 25178) of the surface texture of the surface roughness parameter. As the calculated Str' (aspect ratio of pseudo surface texture), the smaller the value, the more texture flows. Means the state of being. In addition, the "texture score" is a visual score actual measurement value (10 steps of 1 to 10 are numerically expressed) in which a professional judge comprehensively quantifies the fineness of texture, regularity, and isotropy of an enlarged image of skin. Is the objective variable and the visual score theoretical value obtained from the multiple regression equation obtained using the calculated Sa', PSm', and Str' as explanatory variables, and was calculated by applying the following equation. As for the texture score, the larger the numerical value is, the higher the visual score is, which means that the texture is good.
Texture score=A×Sa′+B×PSm′+C×Str′+D (where A, B and C are coefficients and D is a constant).
前記工程１〜６で得られた角層ポリアミンの蛍光輝度情報と二次回帰式を求めておき、得られた回帰式と測定しようとする被験者の角層ポリアミンの蛍光輝度情報データによって、皮膚の「キメの粗さ」、「キメの形状」、「キメの流れにくさ」、「キメスコア」の評価を行なう。 The fluorescence luminance information of the stratum corneum polyamine obtained in steps 1 to 6 and the quadratic regression equation are obtained in advance, and the obtained regression equation and the fluorescence luminance information data of the stratum corneum polyamine of the subject to be measured are used to measure the skin "Roughness of texture", "shape of texture", "difficulty of flow of texture", and "score of texture" are evaluated.
（４）工程８Ｂの目視評価
工程８のＢでは、従来の皮膚の表面形態を表す物性値として、目視によるキメ評価を採用する。これを、被験者の角層ポリアミンの蛍光輝度情報データと相関を回帰分析によって評価する。(4) Visual Evaluation of Step 8B In Step 8B, visual texture evaluation is adopted as the physical property value indicating the surface morphology of the conventional skin. This is evaluated by regression analysis of the correlation with the fluorescent brightness information data of the stratum corneum polyamine of the subject.
以上の工程を経ることで、短時間で、角層中のポリアミンを選択的に染色し、皮膚角層試料を調製でき、調製した試料を用いた皮膚角層のポリアミン量を測定し、さらにはポリアミン量の測定結果に基づく皮膚のキメを評価することができる。 Through the above steps, in a short time, the polyamine in the stratum corneum can be selectively dyed to prepare a skin stratum corneum sample, and the amount of polyamine in the skin stratum corneum using the prepared sample is measured. The texture of the skin can be evaluated based on the measurement result of the amount of polyamine.
なお、皮膚角層のポリアミン量を検出する方法は上記以外にもあり、適宜選択してよい。例えば、高速液体クロマトグラフ法などの化学的分析方法、免疫組織染色方法などの生化学的分析方法、化学的特徴を利用してポリアミン残基に蛍光標識する方法が例示でき、それらのいずれであっても良い。化学的分析方法や生化学的分析方法は剥離した角層試料をホモジネートし、これによりポリアミンを水抽出したものを試料とする。抽出方法は、たとえば凍結融解法、超音波破砕法、ホモジネート法等を介して可溶性画分とする方法があげられる。ポリアミン残基に蛍光標識する方法は、剥離した角層を試料とする。 The method for detecting the amount of polyamine in the stratum corneum of skin is not limited to the above, and may be appropriately selected. For example, a chemical analysis method such as high performance liquid chromatography, a biochemical analysis method such as an immunohistological staining method, and a method of fluorescently labeling a polyamine residue by utilizing chemical characteristics can be exemplified. May be. In the chemical analysis method and the biochemical analysis method, the exfoliated stratum corneum sample is homogenized, and the polyamine is extracted with water as a sample. Examples of the extraction method include a freeze-thaw method, an ultrasonic crushing method, a homogenate method and the like to obtain a soluble fraction. The method of fluorescently labeling the polyamine residue uses the exfoliated stratum corneum as a sample.
以下に試験例を示し、本発明を具体的に説明する。
＜試験１＞
本試験においては、皮膚角層のポリアミン量を染色により検出する方法によって角層中のポリアミンを直接観察した例を示す。
１．蛍光顕微鏡観察用試料の調製
皮膚の角層剥離用粘着テープとして２．５ｃｍ×２．５ｃｍの角質チェッカー（アサヒバイオメッド社）を用いた。
年齢４６歳〜５５歳の女性被験者１９名の頬部より前記の角質チェッカーを用いて、テープストリッピング法により角層を採取した。
採取した角層を透明スライドガラス上にのせ、ＰｏｌｙａｍｉｎｅＲＥＤ（フナコシ株式会社）を５００μｌジメチルスルフォオキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し１６４０μＭに調製した。この希釈液は、小分け分注して−２０℃保存した。
この凍結保存試薬を、使用直前に、さらに蒸留水にて１０００倍に希釈（１．６４μＭ）し、染色に用いた。
角層チェッカーの角層採取面に、前記１．６４μＭのＰｏｌｙａｍｉｎｅＲＥＤ染色液を５０ｍｌ滴下し、３０秒反応させた後、精製水を用いて充分洗浄した。風乾後、観察試料とした。The present invention will be specifically described below with reference to test examples.
<Test 1>
In this test, an example in which the polyamine in the stratum corneum is directly observed by a method of detecting the amount of polyamine in the stratum corneum of the skin is shown.
1. Preparation of Sample for Fluorescence Microscope Observation As an adhesive tape for peeling the stratum corneum of the skin, a 2.5 cm×2.5 cm keratin checker (Asahi Biomed) was used.
The stratum corneum was collected from the cheeks of 19 female subjects aged 46 to 55 years by the tape stripping method using the above-mentioned keratin checker.
The collected stratum corneum was placed on a transparent slide glass, and Polyamine RED (Funakoshi Co., Ltd.) was dissolved in 500 μl dimethyl sulfoxide (DMSO) to prepare 1640 μM. This diluted solution was divided into small aliquots and stored at -20°C.
Immediately before use, this cryopreserved reagent was further diluted 1000-fold with distilled water (1.64 μM) and used for staining.
50 ml of the 1.64 μM Polyamine RED staining solution was dropped onto the horny layer checker surface of the horny layer checker, reacted for 30 seconds, and then thoroughly washed with purified water. After air drying, it was used as an observation sample.
２．蛍光顕微鏡観察
Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６３蛍光顕微鏡を用いて、顕微鏡付属の蛍光ユニットＷＩＧフィルターで励起波長：５６０ｎｍ、蛍光波長：５８５ｎｍで、視野倍率１０〜２０倍で観察し、デジタルカメラにより画像を撮影した。2. Fluorescence Microscope Observation Using an Olympus BX63 fluorescence microscope, observation was performed with a fluorescence unit WIG filter attached to the microscope at an excitation wavelength of 560 nm and a fluorescence wavelength of 585 nm at a visual field magnification of 10 to 20, and an image was taken with a digital camera.
３．画像解析
得られた画像を、米国国立衛生研究所 （ＮＩＨ）で公開されているＩｍａｇｅＪマニュアルにしたがって画像解析を行った。蛍光を有する角層細胞の領域を抽出するため、背景部分及び角層の重層部分を除いて、蛍光測定閾値を設定した。この閾値の輝度の平均した数値を、１画像あたりの輝度値とした。3. Image analysis The obtained images were subjected to image analysis according to the ImageJ manual published by the National Institutes of Health (NIH). In order to extract the region of the corneal cells having fluorescence, the fluorescence measurement threshold was set excluding the background part and the stratified part of the cornea. The averaged value of the brightness of this threshold value was defined as the brightness value per image.
４．結果
全１９例の被験者の、角層の蛍光観察画像及び、被験者の個体番号、並びに画像の輝度を図１に示した。なお各画像は、蛍光顕微鏡観察にあたって、従来専門の研究員が行なっている観察基準に沿って、目視による蛍光強度評価１（低い）、評価２（普通）、評価３（強い）の３段階に分類した。4. Results The fluorescence observation images of the horny layer, the individual numbers of the subjects, and the brightness of the images of all 19 subjects are shown in FIG. In addition, each image is classified into three levels of visual fluorescence intensity evaluation 1 (low), evaluation 2 (normal), and evaluation 3 (strong) according to the observation standard that has been conventionally conducted by a researcher specialized in fluorescence microscope observation. did.
また、被験者のＩＤ、目視評価、画像の輝度を下記の表１に一覧表として示した。 In addition, the subject ID, visual evaluation, and image brightness are listed in Table 1 below.
このデータを、Ｘ軸を目視判定評価値、Ｙ軸を輝度値とした二次元配置でプロットしたところ図２に示すような散布図を得た。
図２から、皮膚角層のポリアミン染色の画像から読み取ることのできた蛍光輝度の値は、蛍光顕微鏡観察における目視評価に代替できるものと考えられた。
すなわち、皮膚角層の５（６）−Ｃａｒｂｏｘｙｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｐｒｏｐａｇｙｌ ｅｓｔｅｒで蛍光染色したとき、顕微鏡画像の輝度を画像解析処理によって読み取るだけで、熟練した研究者と同等に、角層試料中のポリアミン量の多寡を瞬時に読み取ることが可能となった。When this data was plotted in a two-dimensional arrangement with the visual evaluation value on the X axis and the luminance value on the Y axis, a scatter diagram as shown in FIG. 2 was obtained.
From FIG. 2, it was considered that the value of the fluorescence luminance that could be read from the image of the stratum corneum stained with polyamine could be substituted for the visual evaluation in the fluorescence microscope observation.
That is, when fluorescent staining is performed on the skin stratum corneum with 5(6)-Carboxytetramethylthrhodamine Glycine Propagyl ester, the brightness of the microscopic image is simply read by image analysis processing, and the level of the polyamine amount in the stratum corneum sample is equivalent to that of a skilled researcher. It became possible to read the amount of information instantly.
＜試験２（皮膚角層ポリアミンを指標とする皮膚のキメ評価）＞
試験１で被験者とした１９名について、角層試料採取部位の近傍におけるキメの状態を特開２０１７−１４０２０６号公報に記載の肌理評価システムを参考に、マイクロスコープを用いたキメ評価を行った。
（１）評価方法
マイクロスコープ（株式会社モリテックス製）、撮像ソフト（アイスコープビューワー Ｖｅｒ３．０）を用いて拡大画像の撮像を行った。得られた画像は画像データとしてコンピュータに取りこみ、緑成分のみ抜き出し２５６諧調のモノクロ画像に変換した。３次関数でフィッティングして、うねり取り処理（うねり面のＺ座標を０とする）を行った。
このモノクロ画像の各画素における濃淡を示す値（Ｚ（ｘ、ｙ））から、肌理パラメータＳａ’、ＰＳｍ’、Ｓｔｒ’を算出し、下記重回帰式を用いてキメスコアを算出した。
キメスコア＝−３８．６４９×Ｓａ’−０．２８７×ＰＳｍ’＋２．８８４×Ｓｔｒ’＋１９．４６０
１）キメの粗さ：前記算出したＳａ’（肌の凹凸に関する疑似算術平均高さ）を測定値として、数値が大きいほどキメが粗い状態を意味する。
２）キメの形状：前記算出したＰＳｍ’（疑似輪郭曲線要素の平均長さ）を測定値として、数値が小さいほどキメが細かい状態を意味する。
３）キメの流れにくさ：前記算出したＳｔｒ’（疑似表面性状のアスペクト比）を測定値として、数値が小さいほどキメが流れている状態を意味する。
４）キメスコア：キメの目視スコアの理論値であり前記重回帰式にあてはめ算出した結果を測定値として、数値が大きいほど目視スコアの数字が高く、キメがよいことを意味する。<Test 2 (Evaluation of texture of skin using stratum corneum polyamine as an index)>
With respect to the 19 subjects who were test subjects in Test 1, the texture state in the vicinity of the stratum corneum sampling site was evaluated with reference to the texture evaluation system described in JP-A-2017-140206.
(1) Evaluation method A magnified image was captured using a microscope (manufactured by Moritex Co., Ltd.) and imaging software (Eyescope Viewer Ver3.0). The obtained image was taken into a computer as image data and only the green component was extracted and converted into a 256-tone monochrome image. Fitting with a cubic function was performed to perform waviness removal processing (the Z coordinate of the waviness surface is set to 0).
The texture parameters Sa′, PSm′, and Str′ were calculated from the value (Z(x, y)) indicating the shading in each pixel of this monochrome image, and the texture score was calculated using the following multiple regression equation.
Texture score=−38.649×Sa′−0.287×PSm′+2.884×Str′+19.460
1) Texture roughness: The calculated value is Sa' (pseudo arithmetic average height related to skin irregularities), and the larger the value, the rougher the texture.
2) Texture shape: The calculated PSm' (average length of pseudo contour curve element) is a measured value, and the smaller the value, the finer the texture.
3) Difficulty in flow of texture: The calculated value is Str' (aspect ratio of pseudo surface texture), and the smaller the value, the more the texture flows.
4) Texture score: The theoretical value of the visual score of the texture, and the larger the numerical value, the higher the visual score, and the better the texture.
（２）評価結果
各項目の測定結果及び蛍光輝度値を下記の表２に示す。(2) Evaluation results Table 2 below shows the measurement results and fluorescence brightness values of each item.
表２に示す各項目の測定データ、及び試験１で得た、角層のポリアミン染色による蛍光輝度データを重回帰分析することで、前記の１）キメの粗さ、２）キメの形状、３）キメの流れにくさ、４）キメスコアとの相関係数を求めた。
各項目の相関係数及び回帰直線の回帰式は次のとおりである。By multiple regression analysis of the measurement data of each item shown in Table 2 and the fluorescence brightness data obtained by polyamine staining of the horny layer obtained in Test 1, the above 1) texture roughness, 2) texture shape, 3 ) Difficulty in flow of texture, 4) Correlation coefficient with texture score was determined.
The correlation coefficient of each item and the regression equation of the regression line are as follows.
キメの粗さと蛍光輝度の相関係数Ｒ＝−０．４３２
回帰式：ｙ＝−０．０００５ｘ＋０．１８６１
キメの形状と蛍光輝度の相関係数Ｒ＝−０．２１６
回帰式：ｙ＝−０．０３７９ｘ＋２６．５０２
キメの流れにくさと蛍光輝度の相関係数Ｒ＝０．３１２
回帰式：ｙ＝０．００２ｘ＋０．３２８
キメスコアと蛍光輝度の相関係数Ｒ＝０．３７２
回帰式：ｙ＝０．０４６７ｘ＋−１．９２６Correlation coefficient between texture roughness and fluorescence brightness R=-0.432
Regression formula: y=-0.0005x+0.1861
Correlation coefficient R=−0.216 between texture shape and fluorescence brightness
Regression formula: y=-0.0379x+26.502
Correlation coefficient R = 0.312 between texture flow difficulty and fluorescence brightness
Regression formula: y=0.002x+0.328
Correlation coefficient R = 0.372 between texture score and fluorescence brightness
Regression formula: y=0.0467x+-1.926
また、各評価項目と輝度データの二次元配置の散布図、回帰直線を図３〜６に示す。
各項目の相関係数Ｒと図３〜６から、キメの粗さと蛍光輝度は逆相関、キメの形状と蛍光輝度は逆相関、キメの流れにくさと蛍光輝度は正の相関、キメスコアと蛍光輝度は正の相関であることがわかった。3 to 6 show scatter plots of two-dimensional arrangements of each evaluation item and luminance data, and regression lines.
From the correlation coefficient R of each item and FIGS. 3 to 6, the texture roughness and the fluorescence brightness are inversely correlated, the texture shape and the fluorescence brightness are inversely correlated, the texture flow difficulty and the fluorescence brightness are positively correlated, and the texture score and fluorescence are The brightness was found to be a positive correlation.
＜試験３（皮膚角層ポリアミン（ポリアミン平均輝度値）と目視キメ評価（キメ目視スコア）の相関試験）＞
（１）試験方法
２６歳〜４９歳の男性の左右頬部より、角層チェッカー（アサヒバイオメッド社）を用いた角層を、同部位よりＳＫＩＮ ＣＡＳＴ（アール・エス・アイ社）を用いたレプリカを、各１５検体採取した。
角層のポリアミン染色は、０．５枚の角層チェッカーの角層採取面にＤＭＳＯで調製した１．６４μＭのＰｏｌｙａｍｉｎｅＲＥＤ（フナコシ株式会社）を滴下し、３０秒反応させた後に蒸留水中で洗浄、風乾後に、オールインワン蛍光顕微鏡 ＢＺ−Ｘ８００（株式会社キーエンス）で画像を撮影した。
取得した画像から、Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）を用いて、背景部分及び角層の重層部分を除く蛍光測定閾値の範囲内の画素を抽出し、角層ポリアミン染色の平均輝度値を算出した。また、採取した皮膚のレプリカはマイクロスコープ（ＶＬ−７ＥＸII、スカラ株式会社製）を用いて３０倍の拡大画像の撮像を行い、得られた画像からキメの目視スコアを作成した。
キメの目視スコアとは、キメが細かく、規則正しく、等方性であると、キメの状態がいいと判断される。この拡大画像のキメの細かさ、規則正しさ、等方性を、専門判定者が総合的に数値化して目視スコア実測値を作成したものをいう。このスコア数値が高い程肌が滑らかであり、見た目の肌年齢が若いことを表している。なお目視スコアとレプリカ画像を対応させたものを図７に示す。
そして同一部位で得られたポリアミン染色の平均輝度値とキメの目視スコア相関を評価計算した。<Test 3 (Correlation test of stratum corneum polyamine (polyamine average luminance value) and visual texture evaluation (texture visual score))>
(1) Test method The stratum corneum using a stratum corneum checker (Asahi Biomed Co., Ltd.) was used from the left and right cheeks of men aged 26 to 49, and SKIN CAST (R.S.I. Corp.) was used from the same region. 15 samples of each replica were collected.
Polyamine staining of the stratum corneum is performed by adding 1.64 μM Polyamine RED (Funakoshi Co., Ltd.) prepared with DMSO to the stratum corneum collecting surface of 0.5 stratum corneum checker, allowing it to react for 30 seconds, and then washing in distilled water. After air drying, an image was taken with an all-in-one fluorescence microscope BZ-X800 (Keyence Corporation).
From the acquired image, using Image J (NIH), pixels within the range of the fluorescence measurement threshold excluding the background portion and the stratified portion of the stratum corneum were extracted, and the average luminance value of the stratum corneum polyamine stain was calculated. In addition, a 30-fold magnified image of the collected skin replica was captured using a microscope (VL-7EXII, manufactured by SCARA Corporation), and a visual score of texture was created from the obtained image.
The visual score of the texture is judged to be good if the texture is fine, regular and isotropic. The fineness of the texture, regularity, and isotropy of this enlarged image are comprehensively quantified by a professional judge to create a visual score actual measurement value. The higher the score, the smoother the skin, and the younger the skin age is. The correspondence between the visual score and the replica image is shown in FIG.
Then, the correlation between the average brightness value of the polyamine dye obtained at the same site and the visual score score of texture was evaluated and calculated.
（２）結果
下記表３に輝度値/画像（平均輝度値）とキメの目視スコアを示す。(2) Results Brightness value/image (average brightness value) and visual score of texture are shown in Table 3 below.
表３のデータに基づくキメ目視スコア（ｙ）と平均輝度値（ｘ）の相関係数及び回帰式は次のとおりである。
キメ目視スコアとポリアミン平均輝度値の相関係数Ｒ＝０．７７
回帰式：ｙ＝０．０６６４ｘ−１．０２３３
このように、キメ目視スコアと皮膚角層のポリアミン平均輝度値は、高い相関性があることが分かった。The correlation coefficient and regression equation between the texture visual score (y) and the average luminance value (x) based on the data in Table 3 are as follows.
Correlation coefficient R=0.77 between texture visual score and polyamine average luminance value
Regression formula: y=0.0664x-1.0233
As described above, it was found that the visual texture score and the polyamine average luminance value of the stratum corneum of the skin have a high correlation.
以上の試験１、試験２、試験３の結果から、角層中のポリアミン量の多寡を、５（６）−カルボキシテトラメチルローダミンで蛍光標識することで容易に測定することが可能となった。またこの５（６）−カルボキシテトラメチルローダミンで角層中のポリアミンを選択的に蛍光標識すると、蛍光量を指標として皮膚のキメを容易に評価できることが明らかとなった。 From the results of Test 1, Test 2, and Test 3 described above, it was possible to easily measure the amount of polyamine in the stratum corneum by fluorescently labeling with 5(6)-carboxytetramethylrhodamine. Further, it was revealed that by selectively fluorescently labeling the polyamine in the horny layer with this 5(6)-carboxytetramethylrhodamine, the texture of the skin can be easily evaluated using the fluorescence amount as an index.
＜試験４（化学分析による角層中のポリアミン量の測定）＞
（１）試験方法
６歳〜４９歳の男女２０名の左右頬部より各１枚、角層チェッカー（アサヒバイオメッド社）により角層を採取した。採取した角層の角層テープは、１枚を４等分し、１．７５枚を抽出に、０．２５枚を染色による定量に用いた。
１）ポリアミン定量
ガラスビーズを入れた蒸留水５００μｌへ採取した角層テープを入れ、ビーズ式細胞破砕装置（株式会社トミー精工）を用い、４５００ｒｐｍ１８０ｓｅｃの条件で角層中タンパク質を抽出した。本角層抽出液にＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析）用誘導体化処理を行った。誘導体化処理はダンシルクロリドのアセトン溶液（１０ｍｇ／ｍｌ）３００μｌを添加し、攪拌後、飽和炭酸ナトリウム水溶液５０μｌを添加し、再び攪拌後に室温にて一晩静置した。翌日、プロリン水溶液（１００ｍｇ／ｍｌ）５０μｌを添加し、室温で３０分間静置後、トルエン５００μｌを加えて攪拌し、遠心後に分取したトルエン層を窒素により乾固し、アセトン：水＝１：１混液１００μｌに溶解した。誘導化処理サンプルをＬＣ−ＭＳで分析し、ポリアミンを定量した。ＬＣ−ＭＳ分析条件を以下に示す。<Test 4 (measurement of amount of polyamine in horny layer by chemical analysis)>
(1) Test Method One piece each from the left and right cheeks of 20 men and women aged 6 to 49 years old, and the stratum corneum was collected by a stratum corneum checker (Asahi Biomed). One piece of the collected stratum corneum tape was divided into four equal parts, 1.75 were used for extraction, and 0.25 were used for quantification by staining.
1) Polyamine Quantitative The horny layer tape was put in 500 μl of distilled water containing glass beads, and the protein in the horny layer was extracted using a bead-type cell disruption device (Tomy Seiko Co., Ltd.) under the conditions of 4500 rpm and 180 sec. This horny layer extract was subjected to a derivatization treatment for LC-MS (liquid chromatography mass spectrometry). For the derivatization treatment, 300 μl of an acetone solution of dansyl chloride (10 mg/ml) was added, and after stirring, 50 μl of a saturated sodium carbonate aqueous solution was added. After stirring again, the mixture was allowed to stand at room temperature overnight. On the next day, 50 μl of an aqueous proline solution (100 mg/ml) was added, and after standing at room temperature for 30 minutes, 500 μl of toluene was added and stirred, and after centrifugation, the separated toluene layer was dried to nitrogen, and acetone:water=1:1. It was dissolved in 100 μl of one mixed solution. The derivatized samples were analyzed by LC-MS to quantify polyamines. The LC-MS analysis conditions are shown below.
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ１２０ ２．０ ｘ １００ｍｍ ５μｍ （株式会社大阪ソーダ）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．０１Ｍ 酢酸アンモニウム／水
移動相Ｂ：アセトニトリル
イオン化法：ＥＳＩ（正イオン検出モード）
検出法：ＳＩＭモード
ｍ／ｚ：５５５（プトレシン）、８４５（スペルミジン）、１１３５（スペルミン）Column: Capcell Pak UG120 2.0 x 100 mm 5 μm (Osaka Soda Co., Ltd.)
Column temperature: 40°C
Mobile phase A: 0.01 M ammonium acetate/water Mobile phase B: Acetonitrile ionization method: ESI (positive ion detection mode)
Detection method: SIM mode m/z: 555 (putrescine), 845 (spermidine), 1135 (spermine)
上記角層抽出液より一部を分取し、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ ｋｉｔ （Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）を用いて角層中総タンパク量の測定を行った。同時に精製ウシ血清アルブミンを標準品として検量線を作成し、吸光度からタンパク量を算出した。ＬＣ−ＭＳによる各ポリアミン （プトレシン、スペルミジン、スペルミン）の合計値を総蛋白量で除した値を、総ポリアミン量とした。 A part of the horny layer extract was collected and the total amount of protein in the horny layer was measured using a Pierce BCA protein assay kit (Thermo SCIENTIFIC). At the same time, a calibration curve was prepared using purified bovine serum albumin as a standard, and the amount of protein was calculated from the absorbance. The value obtained by dividing the total value of each polyamine (putrescine, spermidine, spermine) by LC-MS by the total protein amount was defined as the total polyamine amount.
２）ポリアミン染色
上記で述べたとおり、分割した０．２５枚の角層チェッカーの角層採取面にＤＭＳＯで調整した１．６４μＭのＰｏｌｙａｍｉｎｅＲＥＤ（フナコシ株式会社）を滴下し、３０秒反応させた後に蒸留水中で洗浄、風乾後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６３蛍光顕微鏡、ＷＩＧフィルター（励起波長：５６０ｎｍ、蛍光波長５８５ｎｍ）で観察して画像を取得した。
取得した画像は、Ｉｍａｇｅ Ｊ（ＮＩＨ）を用いて、背景部分及び角層の重層部分を除く蛍光測定閾値の範囲内の画素を抽出し、１画像あたりの角層のポリアミン染色の平均輝度値を算出し、３視野の平均を分析値と比較した。2) Polyamine Staining As described above, 1.64 μM Polyamine RED (Funakoshi Co., Ltd.) adjusted with DMSO was dropped on the horny layer collecting surface of the divided 0.25 horny layer checker, and after reacting for 30 seconds. After washing in distilled water and air-drying, an image was acquired by observing with an Olympus BX63 fluorescence microscope and WIG filter (excitation wavelength: 560 nm, fluorescence wavelength 585 nm).
The acquired image was extracted using Image J (NIH) to extract pixels within the fluorescence measurement threshold range excluding the background portion and the stratified portion of the stratum corneum, and the average luminance value of polyamine staining of the stratum corneum per image was calculated. Calculated and compared the average of 3 fields of view with the analytical value.
（２）結果
２０名の角層をポリアミン染色による平均輝度値及び化学分析を行った結果を下記の表４に示す。(2) Results The average brightness value and chemical analysis result of polyamine staining of the horny layer of 20 persons are shown in Table 4 below.
表４に基づいて得られた散布図を図９に示す。
相関を確認したところ、輝度値と総ポリアミン量に相関関係が見られた（図９）。この結果より、角層ポリアミン染色の輝度値は、ポリアミンの化学的分析値に代替できることが明らかとなった。すなわち、角層中のポリアミンを化学的分析を行うことで皮膚のキメの状態を評価可能である。
The scatter plot obtained based on Table 4 is shown in FIG.
When the correlation was confirmed, a correlation was found between the luminance value and the total amount of polyamine (FIG. 9). From this result, it was clarified that the brightness value of the stratum corneum polyamine stain can be replaced with the chemical analysis value of polyamine. That is, the texture of the skin can be evaluated by chemically analyzing the polyamine in the stratum corneum.
Claims (10)
The method for evaluating the skin condition according to any one of claims 1 or 5 to 9, wherein the stratum corneum sample is obtained by a tape stripping method.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024051337A1 (en) * | 2022-09-09 | 2024-03-14 | 上海家化联合股份有限公司 | Apparatus for detecting autofluorescence of skin, and method for assessing anti-saccharification effect |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010151480A (en) * | 2008-12-24 | 2010-07-08 | Fancl Corp | Method for assessing risk of wrinkle formation |
| JP2010271163A (en) * | 2009-05-21 | 2010-12-02 | Pola Chem Ind Inc | Method of evaluating skin condition |
| JP2011107027A (en) * | 2009-11-19 | 2011-06-02 | Pola Chemical Industries Inc | Judging method of skin |
| US20130337085A1 (en) * | 2010-12-13 | 2013-12-19 | L'oreal | Use of ide as a biomarker for a scalp condition |
| JP2015158518A (en) * | 2015-06-09 | 2015-09-03 | 株式会社ファンケル | Evaluation method of texture |
| JP2016510878A (en) * | 2013-03-15 | 2016-04-11 | ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー | Non-invasive measurement method of metabolites for skin health |
-
2020
- 2020-03-11 JP JP2020515992A patent/JP6703218B1/en active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010151480A (en) * | 2008-12-24 | 2010-07-08 | Fancl Corp | Method for assessing risk of wrinkle formation |
| JP2010271163A (en) * | 2009-05-21 | 2010-12-02 | Pola Chem Ind Inc | Method of evaluating skin condition |
| JP2011107027A (en) * | 2009-11-19 | 2011-06-02 | Pola Chemical Industries Inc | Judging method of skin |
| US20130337085A1 (en) * | 2010-12-13 | 2013-12-19 | L'oreal | Use of ide as a biomarker for a scalp condition |
| JP2016510878A (en) * | 2013-03-15 | 2016-04-11 | ザ プロクター アンド ギャンブルカンパニー | Non-invasive measurement method of metabolites for skin health |
| JP2015158518A (en) * | 2015-06-09 | 2015-09-03 | 株式会社ファンケル | Evaluation method of texture |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 浦上 豊志 ほか: "ポリアミンおよびヌクレオチド含有トルラ酵母エキスの美肌効果−ランダム化二重盲検並行群間比較試験−", 薬理と治療, vol. 46(6), JPN7020001147, 2018, pages 1035 - 1040, ISSN: 0004255752 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2024051337A1 (en) * | 2022-09-09 | 2024-03-14 | 上海家化联合股份有限公司 | Apparatus for detecting autofluorescence of skin, and method for assessing anti-saccharification effect |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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