JP6692676B2 - ネフロネクチンを含むう蝕治療剤 - Google Patents
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Description
本発明は、ネフロネクチンを有効成分として含有するう蝕治療剤に関する。
現在、深い虫歯に対する歯髄保存療法（直接覆髄法）ではシール材料として水酸化カルシウム製剤が用いられ、その上からさらにセメント材で蓋をする。しかし、水酸化カルシウム製剤は、その高いアルカリ性のため歯髄の炎症反応や形成された修復象牙質の不均一性をもたらす。その結果、象牙質の再生を伴った良い治療成績が得られないことも多い。
近年、メタケイ酸ナトリウムを主成分とするバイオセラミック（生体用セラミックス）材である、MTA(Mineral Trioxide Aggregate)が使用され始め治療成績が向上した。しかし、価格の高さや変色の面で問題がある。
歯の細胞外環境因子としてのネフロネクチンの分子機能解析研究課題番号：20890163科研費のホームページ文献１：https://kaken.nii.ac.jp/d/p/20890163.ja.html
歯の細胞外環境因子としての基底膜分子の機能解析Research Project Number:09J03228科研費のホームページ文献2：https://kaken.nii.ac.jp/d/p/09J03228.en.html
第74回日本矯正歯科学会大会予稿集、学展-122(p208)
歯髄保存療法においては、水酸化カルシウムに比べて安全かつ強力に象牙質再形成を誘導する生体親和性の高い新たな材料が求められている。
本発明の目的は、歯髄保存療法において用いることができる、水酸化カルシウムに比べて安全かつ強力に象牙質再形成を誘導する生体親和性の高い新たな材料を提供することである。
ところで、発明者はこれまでに、象牙質タンパク質Phosphophoryn中のRGDペプチドが象牙芽細胞様細胞の分化と石灰化を促進することを見出しており、該ペプチドが新たな歯髄のシール材になり得る候補であると報告している（特許文献１）。
今回、本発明者らは、ネフロネクチンが象牙芽細胞の増殖と分化を促進することを見出し、この知見に基づいて本発明を完成させた。
本発明は、以下の通りである
［１］ネフロネクチンを有効成分として含有するう蝕治療剤。
［２］象牙質の修復に用いられる［１］に記載のう蝕治療剤。
［３］虫歯および／または欠損歯の修復に用いられる［１］に記載のう蝕治療剤。
［４］虫歯および／または欠損歯の象牙質の修復に用いられる［１］に記載のう蝕治療剤。
［５］歯髄保存療法において用いられる［１］〜［４］のいずれかに記載のう蝕治療剤。
［６］薬学的に許容し得る担体および／またはキャリアーをさらに含有する［１］〜［５］のいずれかに記載のう蝕治療剤。
［１］ネフロネクチンを有効成分として含有するう蝕治療剤。
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［４］虫歯および／または欠損歯の象牙質の修復に用いられる［１］に記載のう蝕治療剤。
［５］歯髄保存療法において用いられる［１］〜［４］のいずれかに記載のう蝕治療剤。
［６］薬学的に許容し得る担体および／またはキャリアーをさらに含有する［１］〜［５］のいずれかに記載のう蝕治療剤。
本発明によれば、水酸化カルシウムに比べて安全かつ強力に象牙質再形成を誘導する生体親和性の高い新たな材料を提供することができ、この材料は、う蝕治療剤、特に歯髄保存療法におけるう蝕治療剤として有効である。
本発明は、ネフロネクチンを有効成分として含有するう蝕治療剤に関する。
ネフロネクチン(nephronectin)は、幹細胞由来の基底膜分子の一つであり、腎臓の発生に不可欠な因子として知られていた非コラーゲン性の細胞外マトリックスタンパク質であり、カルシウム結合性を示す。さらにネフロネクチンは、マウス胚において体の種々の部分に発現していることが判明し、歯胚においても発現していることが報告されている（Morimura N et al., J Biol Chem 2001;276:42172-81）。
そこで本発明者らでは、象牙芽細胞様細胞MDPC-23に対するネフロネクチンの添加効果を調べ、以下のような結果を得た(詳細は実施例参照)。
即ち、ネフロネクチン0.1〜10μg／mLで表面をコーティングしたポリスチレン製培養容器でMDPC-23細胞を培養したところ、何もコーティングしていない培養容器で培養したものと比べて、以下の結果が得られた。
・Dose依存的（特に10μg／mL）に細胞の増殖を促進した。
・細胞形態には変化は無かった。
・10μg／mLのコーティングで、細胞の増殖だけではなく細胞の分化も促進した（象牙質関連の諸遺伝子の発現、および石灰化の指標であるアルカリホスファターゼの発現が上昇した）。
・同時並行での実験は行っていないが、発明者が以前にDentin phosphophorynのRGDペプチドを用いて行った時の濃度と比較すると1/100程度の濃度で同等の効果が認められた。
即ち、ネフロネクチン0.1〜10μg／mLで表面をコーティングしたポリスチレン製培養容器でMDPC-23細胞を培養したところ、何もコーティングしていない培養容器で培養したものと比べて、以下の結果が得られた。
・Dose依存的（特に10μg／mL）に細胞の増殖を促進した。
・細胞形態には変化は無かった。
・10μg／mLのコーティングで、細胞の増殖だけではなく細胞の分化も促進した（象牙質関連の諸遺伝子の発現、および石灰化の指標であるアルカリホスファターゼの発現が上昇した）。
・同時並行での実験は行っていないが、発明者が以前にDentin phosphophorynのRGDペプチドを用いて行った時の濃度と比較すると1/100程度の濃度で同等の効果が認められた。
このような結果から、ネフロネクチンを有効成分として含有する組成物は、虫歯および／または欠損歯などの象牙質の修復に用いることができるう蝕治療剤となることが判明した。
本発明のう蝕治療剤は、好ましくは、歯の象牙質の修復に用いられる。
本発明のう蝕治療剤は、好ましくは、虫歯および／または欠損歯の修復に用いられる。
さらに本発明の歯修復剤は、好ましくは、虫歯および／または欠損歯などの象牙質の修復に用いられる。
本発明のう蝕治療剤は、好ましくは、歯髄保存療法における象牙質の修復に用いられる。
本発明のう蝕治療剤は、好ましくは、虫歯および／または欠損歯の修復に用いられる。
さらに本発明の歯修復剤は、好ましくは、虫歯および／または欠損歯などの象牙質の修復に用いられる。
本発明のう蝕治療剤は、好ましくは、歯髄保存療法における象牙質の修復に用いられる。
本発明のう蝕治療剤におけるネフロネクチンは、ネフロネクチンの少なくとも一部であることができるが、ネフロネクチン自体であることが好ましい。ネフロネクチンのアミノ酸配列は、図1および配列表の配列番号1に示す。
ネフロネクチンは、市販品として、例えば、recombinant mouse nephronectin（R&D systems社）が入手可能である。
本発明のう蝕治療剤は、ネフロネクチンに加えて、薬学的に許容し得る担体および／またはキャリアーをさらに含有することができる。そのような薬学的に許容し得る担体および／またはキャリアーの例としては、架橋処理を施したtype I collagen（生体吸収性を調整したコラーゲン）、ハイドロキシアパタイト、ポリ乳酸、β-Tricalcium Phosphate (TCP)、α-TCP,ポリグリコール酸などから選ばれる少なくとも一つを含む担体を挙げることができる。但し、これらは例示を目的とするもので、これらに限定される意図ではない。
本発明のう蝕治療剤は、上記担体および／またはキャリアーに所定量のネフロネクチンを混合または結合させて調製することができる。本発明のう蝕治療剤におけるネフロネクチンの含有量は、担体、キャリアーの種類およびう蝕治療剤の使用対象等により適宜決定できるが、例えば、ネフロネクチンを1-100μg/mLの範囲で含むことができる。但し、この範囲は例示を目的とするもので、これに限定される意図ではない。
本発明のう蝕治療剤は、例えば、架橋処理を施したtype I collagen（生体吸収性を調整したコラーゲン）に、精製したネフロネクチンを架橋結合させたNpnt-Col-1複合体であることができる。この複合体は、実際の治療に際しては、歯の露髄面に直接覆髄を行うことができる。
本発明の歯修復剤は、上記歯の露髄面への直接覆髄以外に、例えば、間接覆髄への応用等の使用方法も可能である。本発明の歯修復剤は、歯髄が露出していなくてもう蝕除去後の象牙質上に貼付することにより、歯髄細胞を活性化して象牙質形成を誘導させることができる。
以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。但し、実施例は本発明の例示であって、本発明は実施例に限定される意図ではない。
実施例
実験材料
ネフロネクチン：市販品（R&D systems社）
実験材料
ネフロネクチン：市販品（R&D systems社）
実験方法：
実験方法の概要を図2に示す。
象牙芽細胞株（MDPC-23）を、10％ウシ胎児血清（FBS, Gibco, Canada）含有Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)を用いて37℃、5% CO2条件下で培養した。細胞の石灰化誘導のため、第5日目から、培地を50μg/mLアスコルビン酸,10mM β−グリセロリン酸含有DMEMに交換した。
実験方法の概要を図2に示す。
象牙芽細胞株（MDPC-23）を、10％ウシ胎児血清（FBS, Gibco, Canada）含有Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM)を用いて37℃、5% CO2条件下で培養した。細胞の石灰化誘導のため、第5日目から、培地を50μg/mLアスコルビン酸,10mM β−グリセロリン酸含有DMEMに交換した。
細胞増殖能測定：
MDPC-23の増殖は、Cell Counting Kit-8 (CCK-8,同仁化学)を用いて測定した。ネフロネクチンを16時間コーティングしたウェル(96 well plate, non-tissue culture polystyrene)の上にMDPC-23細胞を播種した(500/well, DMEM+5%FBS)。1、2、4、6日培養した。培養後、テトラゾリム塩であるWST-8を各ウェルに10μL添加し、1時間45分間培養後、細胞内脱水素酵素によってWST-8が還元されて生成する水溶性ホルマザンの450nmにおける吸光度を、マルチプレートリーダー（Bio-Rad, USA）で測定した。結果を図3に示す。
MDPC-23の増殖は、Cell Counting Kit-8 (CCK-8,同仁化学)を用いて測定した。ネフロネクチンを16時間コーティングしたウェル(96 well plate, non-tissue culture polystyrene)の上にMDPC-23細胞を播種した(500/well, DMEM+5%FBS)。1、2、4、6日培養した。培養後、テトラゾリム塩であるWST-8を各ウェルに10μL添加し、1時間45分間培養後、細胞内脱水素酵素によってWST-8が還元されて生成する水溶性ホルマザンの450nmにおける吸光度を、マルチプレートリーダー（Bio-Rad, USA）で測定した。結果を図3に示す。
細胞形態：
ネフロネクチンを16時間コーティングしたウェル(12 well plate, non-tissue culture polystyrene)の上にMDPC-23細胞を播種した(2.5×104/well, DMEM+5%FBS)(D0)。細胞形態(D2 & D3)の撮影は位相差顕微鏡を用いて行われた。結果を図4に示す。
ネフロネクチンを16時間コーティングしたウェル(12 well plate, non-tissue culture polystyrene)の上にMDPC-23細胞を播種した(2.5×104/well, DMEM+5%FBS)(D0)。細胞形態(D2 & D3)の撮影は位相差顕微鏡を用いて行われた。結果を図4に示す。
ALP活性測定：
ネフロネクチンを16時間コーティングしたウェル(12 well plate, non-tissue culture polystyrene)の上にMDPC-23細胞を播種した(2.5×104/well, DMEM+5%FBS)。培養して3日及び7日後に、LabAssay ALPキット（和光純薬）を用いてALP活性を測定した。なおALP活性は、Pierce BSA Protein Assayで測定した各ウェルの総蛋白質あたりの活性(Unit/μg protein)として算出した。結果を図5に示す。
ネフロネクチンを16時間コーティングしたウェル(12 well plate, non-tissue culture polystyrene)の上にMDPC-23細胞を播種した(2.5×104/well, DMEM+5%FBS)。培養して3日及び7日後に、LabAssay ALPキット（和光純薬）を用いてALP活性を測定した。なおALP活性は、Pierce BSA Protein Assayで測定した各ウェルの総蛋白質あたりの活性(Unit/μg protein)として算出した。結果を図5に示す。
遺伝子発見：
ネフロネクチンを16時間コーティングしたウェル(12 well plate, non-tissue culture polystyrene)の上にMDPC-23細胞を播種した(2.5×104/well,DMEM+5%FBS)。7日及び9日間培養した細胞回収後、acid guanidinium-phenol-chloroform(AGPC)法によりtotal RNAの抽出を行った。RNA量を吸光光度計にて測定し、oligo(dT)プライマー(Invitrogen)を用いてcDNAを作製した。得られたcDNAより、Taq DNA polymerase (Invitrogen)と特異的プライマーを用いたPCR法により象牙質形成関連遺伝子であるBSP, ALP, OCN, OPN, DMP-1, Runx-2の発現を検討した。Internal controlとしては、β-actinを採用した。
ネフロネクチンを16時間コーティングしたウェル(12 well plate, non-tissue culture polystyrene)の上にMDPC-23細胞を播種した(2.5×104/well,DMEM+5%FBS)。7日及び9日間培養した細胞回収後、acid guanidinium-phenol-chloroform(AGPC)法によりtotal RNAの抽出を行った。RNA量を吸光光度計にて測定し、oligo(dT)プライマー(Invitrogen)を用いてcDNAを作製した。得られたcDNAより、Taq DNA polymerase (Invitrogen)と特異的プライマーを用いたPCR法により象牙質形成関連遺伝子であるBSP, ALP, OCN, OPN, DMP-1, Runx-2の発現を検討した。Internal controlとしては、β-actinを採用した。
本実験に用いた特異的な遺伝子プライマー配列および予想されるreal time PCR産物のサイズは、表1に示した。なお、real time PCRの反応条件は表2に示した。real time PCRの結果は図6および7に示す。RT-PCRの結果は図8に示す。
石灰化能の検討：
ネフロネクチンを16時間コーティングしたウェル(12 well plate, non-tissue culture polystyrene)の上にMDPC-23細胞を播種した(2.5×104/well,DMEM+5%FBS)。細胞培養10日後、細胞を10% formalin neutral buffer solution(和光純薬)て、20分間固定後十分水洗した。1％アリザリンレッドＳ(pH4.1)染色液で10分間染色し(37℃)、蒸留水で3回洗浄後、digital imaging system(フナコシ)を用いて染色写真を撮影した。また、石灰化沈着物の定量は、10% cetylpyridinium chloride (CPC)による溶出液をマルチプレートリーダー（Bio-Rad, USA）にて波長570nmで測定し、optical densityで示した。結果は図9に示す。
ネフロネクチンを16時間コーティングしたウェル(12 well plate, non-tissue culture polystyrene)の上にMDPC-23細胞を播種した(2.5×104/well,DMEM+5%FBS)。細胞培養10日後、細胞を10% formalin neutral buffer solution(和光純薬)て、20分間固定後十分水洗した。1％アリザリンレッドＳ(pH4.1)染色液で10分間染色し(37℃)、蒸留水で3回洗浄後、digital imaging system(フナコシ)を用いて染色写真を撮影した。また、石灰化沈着物の定量は、10% cetylpyridinium chloride (CPC)による溶出液をマルチプレートリーダー（Bio-Rad, USA）にて波長570nmで測定し、optical densityで示した。結果は図9に示す。
統計方法：
実験結果のすべての数値は平均値±標準偏差で示した。また、得られたデータは、Tukey's multiple comparison testにより、有意水準5%における有意差検定を行った。
実験結果のすべての数値は平均値±標準偏差で示した。また、得られたデータは、Tukey's multiple comparison testにより、有意水準5%における有意差検定を行った。
結果のまとめ：
何もコーティングしていない培養容器で培養したものと比べて、以下の結果が得られた。
・Dose依存的（特に10μg／mL）に細胞の増殖を促進した。
・細胞形態には変化は無かった。
・10μg／mLのコーティングで、細胞の増殖だけではなく細胞の分化も促進した（象牙質関連の諸遺伝子の発現、および石灰化の指標であるアルカリホスファターゼの発現が上昇した）。
・同時並行での実験は行っていないが、発明者が以前にDentin phosphophorynのRGDペプチドを用いて行った時の濃度と比較すると1/100程度の濃度で同等の効果が認められた。
何もコーティングしていない培養容器で培養したものと比べて、以下の結果が得られた。
・Dose依存的（特に10μg／mL）に細胞の増殖を促進した。
・細胞形態には変化は無かった。
・10μg／mLのコーティングで、細胞の増殖だけではなく細胞の分化も促進した（象牙質関連の諸遺伝子の発現、および石灰化の指標であるアルカリホスファターゼの発現が上昇した）。
・同時並行での実験は行っていないが、発明者が以前にDentin phosphophorynのRGDペプチドを用いて行った時の濃度と比較すると1/100程度の濃度で同等の効果が認められた。
本発明は、歯科治療用の材料に関する分野に有用である。
配列番号1:ネフロネクチンのアミノ酸配列
配列番号2、3：BSP遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号4、5：ALP遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号6、7：OCN遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号8、9：OPN遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号10、11：DMP-1遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号12、13：Runx-2遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号14、15：β-actin(Internal control) 遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号2、3：BSP遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号4、5：ALP遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号6、7：OCN遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号8、9：OPN遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号10、11：DMP-1遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号12、13：Runx-2遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
配列番号14、15：β-actin(Internal control) 遺伝子リアルタイムRT-PCR プライマ塩基配列
Claims (6)
- 配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むネフロネクチンを有効成分として含有するう蝕治療剤。
- 歯の象牙質の修復に用いられる請求項１に記載のう蝕治療剤。
- 虫歯および／または欠損歯の修復に用いられる請求項１に記載のう蝕治療剤。
- 虫歯および／または欠損歯の象牙質の修復に用いられる請求項１に記載のう蝕治療剤。
- 歯髄保存療法において用いられる請求項１〜４のいずれかに記載のう蝕治療剤。
- 薬学的に許容し得る担体および／またはキャリアーをさらに含有する請求項１〜５のいずれかに記載のう蝕治療剤。
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