JP6692089B2 - 抗酸化能測定用リポソーム、抗酸化能測定方法及びリポソーム - Google Patents
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Description
一般式1で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
一般式2で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比75〜95:25〜5で含まれる、
ことを特徴とする。
一般式1で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
一般式2で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比75〜95:25〜5で含まれるリポソームに、対象物質を接触させ、および前記リポソームを酸化させる工程と、
前記リポソームの酸化の度合を測定する工程と、
を含む。
一般式1で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
一般式2で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比75〜95:25〜5で含まれる、
ことを特徴とする。
・α成分のR1及びR2:アラキドン酸、β成分のR3及びR4:ミリスチン酸
・α成分のR1及びR2:アラキドン酸、β成分のR3及びR4:パルミチン酸
・α成分のR1及びR2:アラキドン酸、β成分のR3及びR4:ステアリン酸
・α成分のR1及びR2:α−リノレン酸、β成分のR3及びR4:ミリスチン酸
・α成分のR1及びR2:α−リノレン酸、β成分のR3及びR4:パルミチン酸
・α成分のR1及びR2:α−リノレン酸、β成分のR3及びR4:ステアリン酸
・α成分のR1及びR2:リノール酸、β成分のR3及びR4:ミリスチン酸
・α成分のR1及びR2:リノール酸、β成分のR3及びR4:パルミチン酸
・α成分のR1及びR2:リノール酸、β成分のR3及びR4:ステアリン酸
(a)前述のリポソームに、対象物質を接触させ、およびリポソームを酸化させる工程と、
(b)リポソームの酸化の度合を測定する工程と、
を含む。
種々のリポソームを作製し、酸化の度合について評価した。
α成分(極性基:ホファチジルコリン基)として、以下に示される化合物を使用した。
・DAPC(20−4):ジアラキドニルホスファチジルコリン
・DLNPC(18−3):ジリノレノイルホスファチジルコリン
・DLPC(18−2):ジラウロイルホスファチジルコリン
・DMPE(14−0):ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン
・DPPE(16−0):ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン
・DSPE(18−0):ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
・DMPC(14−0)(コリン型):ジミリストイルホスファチジルコリン
・DMP(14−0)(リン酸型):ジミリストイルホスファチジル酸
・DMPS(14−0)(セリン型):ジミリストイルホスファチジルセリン
・DMPOH(14−0)(グリセロール型):ジミリストイルホスファチジルグリセロール
β成分としてDMPE(14−0)(以下、DMPEとする)を用いて、種々のDMPE含有濃度のリポソームを作製し、β成分の含有濃度がリポソームの酸化に与える影響について検討した。
・DMPE25; DMPE(β成分):DAPC(α成分)=25:75
・DMPE15; DMPE(β成分):DAPC(α成分)=15:85
・DMPE5 ; DMPE(β成分):DAPC(α成分)=5:95
・DMPE2 ; DMPE(β成分):DAPC(α成分)=2:98
・DMPE0 ; DMPE(β成分):DAPC(α成分)=0:100
・DMPE25:DMPE(β成分)(10mg/mL)110μL、DAPC(α成分)(10mg/mL)320μL、10μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で18時間以上乾燥させた。脱ガスした5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液を1mL添加して、約20秒間ボルテックスした後、エクストルーダー(Avanti Mini−Extruder;Avanti Polar Lipids社)(30nmフィルター)を一定温度(42〜47℃)になるように加温して、リポソームを作製した。リポソーム溶液のフィルター膜の通過回数は12回とした。電極による電位測定時に、5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液で2倍に希釈した。
・DMPE15:DMPE(β成分)(10mg/mL)27μL、DAPC(α成分)(10mg/mL)160μL、5μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で18時間以上乾燥させた。脱ガスした5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液を0.44mL添加して、上記同様にリポソームを作製した。電極による電位測定時に、5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液で2倍に希釈した。
・DMPE5:DMPE(β成分)(10mg/mL)11μL、DAPC(α成分)(10mg/mL)160μL、5μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で18時間以上乾燥させた。脱ガスした5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液を0.40mL添加して、上記同様にリポソームを作製した。電極による電位測定時に、5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液で2倍に希釈した。
・DMPE2:DMPE(β成分)(10mg/mL)2.7μL、DAPC(α成分)(10mg/mL)120μL、2.8μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で18時間以上乾燥させた。脱ガスした5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液を0.58mL添加して、上記同様にリポソームを作製した。電極による電位測定時に希釈せずにそのまま使用した。
・DMPE0:DAPC(α成分)(10mg/mL)160μL、3.7μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で18時間以上乾燥させた。脱ガスした5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液を0.75mL添加して、上記同様にリポソームを作製した。電極による電位測定時に希釈せずにそのまま使用した。
次に、α成分の鎖長及び二重結合の数がリポソームの酸化に与える影響について検証した。
・DLNPC(18−3):DMPE(β成分)(10mg/mL)110μL、DLNPC(18−3)(α成分)(10mg/mL)320μL、10μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で18時間以上乾燥させた。脱ガスした5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液を1mL添加して、上記同様にリポソームを作製した。
・DLPC(18−2):DMPE(β成分)(10mg/mL)110μL、DLPC(18−2)(α成分)(10mg/mL)320μL、10μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で18時間以上乾燥させた。脱ガスした5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液を1mL添加して、上記同様にリポソームを作製した。
次に、β成分の鎖長がリポソームの酸化に与える影響について検証した。
・DPPE(16−0):DPPE(16−0)(β成分)(10mg/mL)110μL、DAPC(20−4)(α成分)(10mg/mL)320μL、10μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・DSPE(18−0):DSPE(18−0)(β成分)(10mg/mL)110μL、DAPC(20−4)(α成分)(10mg/mL)320μL、10μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
次に、β成分の極性基部分がリポソームの酸化に与える影響について検討した。
・DMPE:DMPE(14−0)(β成分)(10mg/mL)110μL、DAPC(20−4)(α成分)(10mg/mL)320μL、10μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・DMP:DMP(14−0)(β成分)(10mg/mL)110μL、DAPC(20−4)(α成分)(10mg/mL)320μL、10μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・DMPC:DMPC(14−0)(β成分)(10mg/mL)110μL、DAPC(20−4)(α成分)(10mg/mL)320μL、10μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・DMPOH:DMPOH(14−0)(β成分)(10mg/mL)110μL、DAPC(20−4)(α成分)(10mg/mL)320μL、10μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
・DMPS:DMPS(14−0)(β成分)(10mg/mL)110μL、DAPC(20−4)(α成分)(10mg/mL)320μL、10μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れて、上記同様にリポソームを作製した。
市販の抗酸化剤8種類について、実施例1にて作製したリポソームとヒトLDLとで抗酸化能を比較した。
作製したリポソームの保存性について検討した。
異なる方法によって作製されたリポソームの酸化の度合について評価した。
DMPE(β成分)(10mg/mL)3.6μL、DAPC(α成分)(10mg/mL)160μL、3.6μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で18時間以上乾燥させた。脱ガスした5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液を0.390mL添加して、上記同様にリポソームを作製し、A液とした。電極による電位測定時、緩衝溶液で1.88倍に希釈して使用した。
DMPE(β成分)(10mg/mL)160μL、3.6μLコレステロール(1mg/mL)をナスフラスコに入れてエバポレーターで溶媒を留去して、凍結乾燥機で18時間以上乾燥させた。脱ガスした5μMグリシンを含むPBS緩衝溶液を0.390mL添加して、60℃で超音波処理によりリポソーム(脂質懸濁液)を作製し、DMPE液とした。
A液80μLに緩衝溶液55μL、DMPE液15μLを混合して、A液+DMPE溶液とした。
Claims (9)
- 一般式1で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
一般式2で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比75〜95:25〜5で含まれる、
ことを特徴とする抗酸化能測定用リポソーム。 - R1、R2は、二重結合を2〜4有する炭素数18〜20の直鎖状の不飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項1に記載の抗酸化能測定用リポソーム。 - R3及びR4は、炭素数14〜16の直鎖状の飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項1又は2に記載の抗酸化能測定用リポソーム。 - 一般式1で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
一般式2で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比75〜95:25〜5で含まれるリポソームに、対象物質を接触させ、および前記リポソームを酸化させる工程と、
前記リポソームの酸化の度合を測定する工程と、
を含む抗酸化能測定方法。 - R1、R2は、二重結合を2〜4有する炭素数18〜20の直鎖状の不飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項4に記載の抗酸化能測定方法。 - R3及びR4は、炭素数14〜16の直鎖状の飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項4又は5に記載の抗酸化能測定方法。 - 一般式1で示されるジアシルホスファチジルコリンと、
一般式2で示されるジアシルホスファチジルエタノールアミンと、
を構成成分として含み、前記ジアシルホスファチジルコリンと前記ジアシルホスファチジルエタノールアミンとが重量比75〜95:25〜5で含まれる、
ことを特徴とするリポソーム。 - R1、R2は、二重結合を2〜4有する炭素数18〜20の直鎖状の不飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項7に記載のリポソーム。 - R3及びR4は、炭素数14〜16の直鎖状の飽和脂肪酸残基である、
ことを特徴とする請求項7又は8に記載のリポソーム。
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