JP6647734B2 - 心的外傷後ストレス障害治療薬のスクリーニング方法 - Google Patents
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Description
る「こころの病気」は、一種の社会問題となっており、それらの病を患う人数には年々増加傾向が見られる。前記心的外傷後ストレス障害(PTSD)は生涯有病率が約10%と言われ、WHOの予測によれば、その患者数が今後、劇的に増加することが示唆されている。
また、記憶を想起させる工程では、固定化され、保持されている長期記憶が短期記憶と同様、不安定な状態へと戻されていることが示されている。このような想起後の不安定な記憶を脳内に再貯蔵する「再固定化」と呼ばれるプロセスが存在し、この記憶の「再固定化」には「固定化」と同様、海馬における遺伝子発現が必要であることが知られている。
そして、脳にて形成された記憶は、この記憶が形成されてからある一定の期間は海馬に依存して想起される一方、その期間を超えて脳内貯蔵された「古い(昔の)記憶」は、海馬に依存せず、大脳皮質に依存して想起されることが知られている。一方、恐怖記憶の場合には、恐怖体験を伴わずに恐怖記憶を思い出すだけの状態が維持されると、恐怖記憶に反応して恐怖を感じる必要がないことを記憶し、恐怖記憶が抑制される、記憶の「消去」が起こる。この「消去」は持続エクスポージャー療法(PE)の生物学的基盤であると知られている。
そして、最近の記憶、すなわち海馬に依存して想起される記憶の安定性を解析するため、前記トレーニングの24時間後に再度同一のチャンバー内にマウスを3分間戻し、恐怖記
憶を想起させた(再エクスポージャー)。この再エクスポージャーの直前に、タンパク質合成阻害剤であるアニソマイシン(ANI)をマウスの腹腔内に投与し、恐怖記憶が破壊されるかを観察した。
その結果、このような最近の記憶の場合には3分間チャンバーに戻すことで、当該記憶
の破壊が観察された。一方、古い記憶、すなわち海馬に依存せずに想起される記憶の安定性を解析するため、前記トレーニングの8週間後に再度同一のチャンバー内にマウスを3分間または10分間戻し、恐怖記憶を想起させた(再エクスポージャー)。この再エクスポージャーの直前に、タンパク質合成阻害剤であるアニソマイシン(ANI)をマウスの腹腔内に投与し、恐怖記憶が破壊されるかを観察した。
その結果、3分間チャンバーに戻した場合には、タンパク質合成阻害による恐怖記憶の破壊は観察されなかった。これに対し、10分間チャンバーに戻し、恐怖記憶を長く想起させた場合には、恐怖記憶の破壊が観察された。この解析から、古い恐怖記憶に関しては、長い時間想起されることで、記憶の「再固定化」が誘導されることが明らかとなった。
知られ、この事実から前記持続エクスポージャー療法(PE)にD-サイクロセリンの投与を併用した治療法の研究が行われている。
その結果、前記メマンチンの投与により、海馬における神経新生が亢進され、成熟したばかりの若い神経細胞が記憶形成能力の向上に寄与していることが初めて明らかとなった。
すなわち、本発明は、恐怖条件付け文脈学習課題に供された非ヒト動物における恐怖記憶が海馬非依存的な記憶へと変換された状態において、当該非ヒト動物に対し、前記恐怖記憶を想起させて海馬依存性を復活させる、すなわち、海馬における遺伝子発現を誘導させる第一工程と、この第一工程後、当該非ヒト動物に対して海馬における神経新生を促す被検物質を投与する第二工程と、を含み、該非ヒト動物に対して被検物質が与える影響を、該非ヒト動物における恐怖記憶の忘却を指標として検出する、心的外傷後ストレス障害(PTSD)の治療薬のスクリーニング方法を提供するものである。
また、このスクリーニング方法において、前記第一工程は、前記非ヒト動物を恐怖条件付け文脈学習課題に供した後8週間後に行うことができる。
更に、このスクリーニング方法における前記第一工程において、前記非ヒト動物を前記恐怖条件付け文脈学習課題に用いたチャンバーに10分間戻すことができる。
また、このスクリーニング方法において、前記遺伝子は初期応答遺伝子とすることができる。
更に、このスクリーニング方法において、前記非ヒト動物が齧歯類動物とすることができる。
また、心的外傷後ストレス障害(PTSD)の治療法である、持続エクスポージャー療法(PE)の治療時間の短縮化を図るためにも用いられ得る。
恐怖記憶の形成は、昆虫から高等生物に至るすべての生物に備わる本能的行動の一つである。このため、恐怖条件付け文脈課題(Contextual Fear Conditioning Test)は、記
憶形成のメカニズムを明らかにするための最適なモデルと考えられている。この恐怖条件付け文脈課題(Contextual Fear Conditioning Test)において、恐怖条件付けされた記
憶の再固定化の増強が見られた場合、心的外傷後ストレス障害(PTSD)と関係していると考えられている。
前述の如く、本発明者により、海馬に依存して想起される恐怖記憶の場合にはトレーニングと同一のチャンバーにマウスを3分間戻し、恐怖記憶を想起させることで、タンパク質合成阻害剤であるアニソマイシン(ANI)の腹腔内への投与による当該記憶の破壊が観察された。また、前記メマンチンの投与により、海馬における神経新生が亢進され、成熟したばかりの若い神経細胞が記憶形成能力の向上に寄与することが明らかとなっている。一方、新たに産生された神経細胞は成熟すると神経回路に組み込まれ、これにより神経回路に蓄積されていた記憶が忘却されてしまう可能性があるとの見解がある(Meltzer etal., Trends in Neuroscience, 2005; Weisz & Argibay, Cognition, 2012)。これらの点から、本発明者は、前記メマンチンと海馬依存的な恐怖記憶の忘却との関係性について検討した。加えて、本発明者の知見(非特許文献3)に基づき、成熟したばかりの若い神経細胞を連続的に産生させるため、メマンチンを連続的に投与した際の海馬依存的な恐怖記憶の忘却についても検討した。
スが示したすくみ反応(Freezing)の時間の割合を測定し、この割合を恐怖記憶の指標とした。マウスのすくみ反応時間(Freezing Time)の割合が長い程、マウスに強い恐怖記憶が形成されたと評価できる。
実験例1の結果により、前記メマンチンの投与に起因して海馬依存的な恐怖記憶が忘却されることが明らかになったことから、前記メマンチンの投与と、海馬依存的でなく、大脳皮質に依存して想起される記憶(以下、「古い記憶」という)の忘却との関連性について、検討を行った。
本発明者により、海馬依存的な恐怖記憶(recent memory)の再固定化には、海馬における初期応答遺伝子の発現、すなわち海馬の活性化が必要であることが明らかとなっている((Suzuki, A., Mukawa, T., Tsukagoshi, A., Frankland, P.W. & *Kida, S. Activation of LVGCCs and CB1 receptors required for destabilization of reactivated contextual fear memories. Learn. Mem. 15, 426-33,2008 ,Mamiya, N., Fukushima, H., Suzuki, A., Matsuyama, Z., Homma, S., Frankland, P.W. & * Kida, S. Brain region-specific gene expression activation required for reconsolidation and extinction of contextual fear memory.)。
本実験例3では、免疫組織化学染色を用い、古い記憶の想起時に、海馬においてc-fos遺伝子の発現レベルを指標として、前記転写調節因子CREBによる遺伝子発現が誘導されるか否か、すなわち海馬が活性化されるか否かについて検討を行った。尚、本実験例3に用いた動物、及び実験器具は実験例1と同一である。
この対照たる第一コントロール群として、床面に電線が配置されたチャンバー(条件刺激:CS)にマウスを3分間入れ、非条件刺激(US)である電気ショックを与えずにトレーニングを行った。このトレーニングから4週間後、テストとして再度トレーニングと同一のチャンバーにマウスを3分間戻したものを用いた。
第二コントロール群としては、床面に電線が配置されたチャンバー(条件刺激:CS)にマウスを3分間入れ、非条件刺激(US)である電気ショックを与えずにトレーニングを行った。このトレーニングから4週間後、テストとして再度トレーニングと同一のチャンバーにマウスを10分間戻したものを用いた。
第三コントロール群としては、床面に電線が配置されたチャンバー(条件刺激:CS)にマウスを3分間入れ、入れてから148秒後に0.4mAの電気ショックを2秒間与えてトレーニング(恐怖条件付け)を行った。このトレーニングから4週間後、テスト(再エクスポージャー)として再度トレーニングと同一のチャンバーにマウスを3分間戻し、恐怖記憶を想起させたものを用いた。
さらに、このことから、古い記憶の再固定化には、海馬における遺伝子発現が必要であるものと考えられた。
また、実験群(D)におけるc-fos陽性細胞数が、恐怖記憶を想起させる時間を3分間とした第三コントロール群(C)のそれよりも高い値を示していることから、古い記憶は、短い時間の想起では十分ではないものの、長い時間想起させることにより、海馬に依存するようになることが明らかとなった。すなわち、海馬依存的でない古い記憶に関しては、長い時間想起させることにより、海馬依存性が復活したと判断できる。
実験例3の結果により、古い記憶であろうとも長い時間想起させることにより、海馬依存性が復活すると考えられたことから、タンパク質合成阻害剤であるアニソマイシン(ANI)の局所注入法を用い、海馬における遺伝子発現阻害の影響について検討を行った。
実験例3の結果により、古い記憶であろうとも長い時間想起させることにより、海馬依存性が復活すると考えられたことから、ニューロン活性阻害剤であるリドカイン(Lido)を用い、古い記憶を長時間想起させた後、当該記憶の海馬依存性が復活しているかについて検討を行った。
この対照たるコントロール群としては、チャンバーに10分間戻して恐怖記憶を想起させ(再エクスポージャー)、且つ、その24時間後に溶媒(VEH)を海馬にカニューレを用いて局所注入したマウス群を用いた(図10中のA, C, E, G)。前記リドカイン(Lido)の投与量は、62μg(総量0.5μl)/sideとした。各コントロール群には、同容量の溶媒(VEH)を投与した。
そして、テスト2として、テスト1の24時間後に再度各群のマウスをトレーニングと同一のチャンバーに5分間戻し、マウスのすくみ反応時間(Freezing Time)の割合を測定した。前記リドカイン(Lido)あるいは溶媒(VEH)は、各群のマウスをチャンバーに戻す10分前に局所注入した。
更に、テスト3として、テスト2の24時間後に再度各群のマウスをトレーニングと同一のチャンバーに5分間戻し、マウスのすくみ反応時間(Freezing Time)の割合を測定した。このテスト3の前には、どちらの群においても、リドカイン(Lido)あるいは溶媒(VEH)は局所注入しなかった。
尚、本実験例5において、実験群及びコントロール群は11匹のマウスを用い、結果は平均値 ± 標準誤差で示した。各データの比較はT検定を用いて統計学的解析を行い、p<0.05の場合、有意に差があると判断した。
また、テスト2における実験群(F)が示したすくみ反応時間の割合は、テスト2におけるコントロール群(E)が示したすくみ反応時間の割合に比べても、有意に低下した。
更に、テスト2における実験群(F)が示したすくみ反応時間の割合は、ニューロン活性阻害剤であるリドカイン(Lido)を局所注入せずに行ったテスト3における実験群(H)が示したすくみ反応時間の割合と比べても有意に低い値を示した。
これらは、古い記憶を長時間想起させた場合に遺伝子発現が誘導された結果(実験例3)と海馬における遺伝子発現を阻害して記憶が破壊された結果(実験例4)に合致して、長時間の想起によって記憶の海馬依存性が復活していたため、リドカイン(Lido)の投与による海馬不活性化により、記憶が想起されなかったと考えられる。
尚、本実験例5では、ニューロン活性阻害剤としてリドカイン(Lido)を用いているが、このニューロン活性阻害剤としては特に限定されず、海馬を不活性化させることができるものであれば、他の公知の阻害剤を用いてもよい。かかる場合、例えば、非NMDA型(AMPA型・カイニン酸型)受容体アンタゴニストであるCNQX(6-シアノ-7-ニトロキノキサリンジオン-2,3-ジオン)などを用いることもできる。
実験例1により、海馬依存的な恐怖記憶であれば、その恐怖記憶が海馬依存性を示す期間内に、メマンチンを投与することで、当該恐怖記憶が忘却されることが明らかとなった。一方、実験例2の結果により、古い恐怖記憶の場合、記憶の忘却に寄与するメマンチンを投与したとしても、当該恐怖記憶の忘却が観察されなかった。実験例3及び実験例4の結果により、本発明者は、古い記憶については長い時間(10分間)想起させることで、その記憶の海馬依存性が復活することを明らかにした。これらのことから、本発明者は、古い恐怖記憶であっても、この古い恐怖記憶を長時間想起させた後、メマンチンを投与することにより当該記憶が忘却されると考え、検討を行った。
下、「第一コントロール群」という)と、チャンバーに戻す時間を10分間とし、その後溶媒(Saline)を投与したマウス群(以下、「第二コントロール群」という)を用いた。
(A)第一コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(B)第二コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(C)第一メマンチン投与群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(D)第二メマンチン投与群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(E)第一コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(F)第二コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(G)第一メマンチン投与群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(H)第二メマンチン投与群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(I)第一コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(J)第二コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(K)第一メマンチン投与群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(L)第二メマンチン投与群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
尚、本実験例6において、第一コントロール群及び第一メマンチン投与群は10匹、第二コントロール群は12匹、第二メマンチン投与群は13匹のマウスを用い、結果は平均値± 標準誤差で示した。各データの比較はT検定を用いて統計学的解析を行い、p<0.05の場合、有意差があると判断した。
実験例6により、神経新生を促進させるメマンチンを投与することにより、海馬依存性が復活した古い記憶が忘却されることが明らかとなったことを受け、
長時間の想起後の再固定化誘導が前記メマンチンによる古い恐怖記憶の忘却に必要であるかの検討を行った。
本実験例7の実験手順は、主として、実験例6の実験手順と同一であり、トレーニング後のテスト1(再エクスポージャー)の5分前にカルシニューリン活性阻害剤をマウスに腹腔内投与することにより、古い記憶が不安定な状態に戻されることを阻害させる工程を行う点、及び全ての群のマウスにおいて、前記テスト1でのチャンバーに戻す時間を10分間とした点が実験例6と異なる(図13参照)。このため、以下の説明では同一の工程に関してはその説明を省略する。
また、コントロール群として、テスト1の5分前に溶媒(VEH)を腹腔内投与し、更に前記テスト1においてチャンバーに戻す時間を10分間とし、その後溶媒(Saline)を投与したマウス群(以下、「第一コントロール群」)と、テスト1の5分前にカルシニューリン活性阻害剤であるFK506を腹腔内投与し、更に前記テスト1においてチャンバーに戻す時間を10分間とし、その後溶媒(Saline)を投与したマウス群(以下、「第二コントロール群」)と、テスト1の5分前に溶媒(VEH)を腹腔内投与し、更に前記テスト1においてチャンバーに戻す時間を10分間とし、その後メマンチンを投与したマウス群(以下、「第三コントロール群」)と、を用いた。
(A)第一コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(B)第二コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(C)第三コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(D)実験群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(E)第一コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(F)第二コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(G)第三コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(H)実験群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(I)第一コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(J)第二コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(K)第三コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(L)実験群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
また、テスト2時における実験群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合は、第一コントロール群及び第二コントロール群のそれと同程度の値を示した。これに対し、テスト2時における第三コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合は、他の群のそれに比べて有意に低い値を示した。
尚、本実験例7において、全ての群において10匹のマウスを用い、結果は平均値± 標準誤差で示した。各データの比較はT検定を用いて統計学的解析を行い、p<0.05の場合、有意差があると判断した。
尚、本実験例7では、カルシニューリン活性阻害剤でとしてFK506を用いているが、このカルシニューリン活性阻害剤としては特に限定されず、想起後の記憶不安定化を阻害するができるものであれば、他の公知の阻害剤を用いてもよい。かかる場合、例えば、シクロポリンAなどを用いることができる。
実験例6の結果により、古い記憶に関しては、チャンバーに3分間戻して恐怖記憶を想起させただけでは、メマンチンを4週間連続的に投与したとしても恐怖記憶は忘却されず、チャンバーに10分間戻し、長い時間恐怖記憶を想起させて(i)海馬依存性を復活させ、且つ、(ii)その後にメマンチンを4週間連続的に投与することにより、忘却されることが明らかとなった。
この結果から、海馬依存的と言われる学習課題である、受動的回避課題(Passive avoidance test)を用いて、海馬依存的な恐怖記憶とメマンチンの関係性についても検討を行った。
実験群のマウスに関しては、トレーニングの24時間後にメマンチンを投与し、更にその後一週間毎に、合計で四回(4週)メマンチンを投与した。
コントロール群のマウスに関しては、トレーニングの24時間後に溶媒(Saline)を投与し、更にその後一週間毎に、合計で四回(4週)溶媒(Saline)を投与した。
これらメマンチン及び溶媒(Saline)の投与から一週間経過した後、テストとして、同様の装置の明箱に各群のマウスを再び入れた。
そして、テストにおいて、トレーニング時と同様にcrossover latencyを測定した。
尚、本実験例8において、実験群は11匹、コントロール群は10匹のマウスを用い、結果は平均値 ± 標準誤差で示した。各データの比較はT検定を用いて統計学的解析を行い、p<0.05の場合、有意差があると判断した。
前述の如く、メマンチンは海馬における神経新生を亢進させる。そして、実験例6の結果により、チャンバーに10分間戻し、長い時間恐怖記憶を想起させて(i)海馬依存性を復活させ、且つ、(ii)その後にメマンチンを4週間連続的に投与することにより、恐怖記憶が忘却されることが明らかとなった。ここで、海馬における神経新生を亢進させる事物として、「運動課題(ランニング:Running)」が知られている(Nat Neurosci. 1999 Mar;2(3):266-70.Running increases cell proliferation and neurogenesis in the adult mouse dentate gyrus.van Praag H1, Kempermann G, Gage FH.)。このため、本発明者は、古い恐怖記憶を長時間想起させて海馬依存性を復活させた後、運動課題を用いて海馬における神経新生を促すことにより、当該記憶が忘却されると考え、検討を行った。
すなわち、本実験例8では、海馬における神経新生を促す手段としてRunning wheel(株式会社マルカン製)を用い、運動させることで海馬における神経新生を促した。
(1)トレーニング後のテスト1(再エクスポージャー)においてチャンバーに戻す時間を10分間とし、その後に運動課題に供した群(以下、「ランニング群」という)
(2)トレーニング後のテスト1(再エクスポージャー)を行わず、且つ、運動課題に供しない群(以下、「第一コントロール群」という)
(3)トレーニング後のテスト1(再エクスポージャー)を行わず、且つ、運動課題に供した群(以下、「第二コントロール群」という)
(4)トレーニング後のテスト1(再エクスポージャー)においてチャンバーに戻す時間を3分間とし、且つ、運動課題に供しない群(以下、「第三コントロール群」という)
(5)トレーニング後のテスト1(再エクスポージャー)においてチャンバーに戻す時間を3分間とし、その後に運動課題に供した群(以下、「第四コントロール群」という)
(6)トレーニング後のテスト1(再エクスポージャー)においてチャンバーに戻す時間を10分間とし、且つ、運動課題に供しない群(以下、「第五コントロール群」という)
)は、テスト1(再エクスポージャー)時の各群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合を、(K)乃至(P)は、テスト時の各群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合を示す。
(A)第一コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(B)第二コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(C)第三コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(D)第四コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(E)第五コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(F)ランニング群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(G)第三コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(H)第四コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(I)第五コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(J)ランニング群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(K)第一コントロール投与群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(L)第二コントロール投与群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(M)第三コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(N)第四コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(O)第五コントロール群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
(P)ランニング群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合
これに対し、テスト2時におけるランニング群が示したすくみ反応時間(Freezing Time)の割合は、他の群のそれに比べて有意に低い値を示した。
尚、本実験例9において、第一コントロール群、第三コントロール群及び第五コントロール群は12匹、第二コントロール群は9匹、第四メコントロール群は11匹、ランニング群は11匹のマウスを用い、結果は平均値 ± 標準誤差で示した。各データの比較はT検定を用いて統計学的解析を行い、p<0.05の場合、有意差があると判断した。
Claims (5)
- 恐怖条件付け文脈学習課題に供された非ヒト動物における恐怖記憶が海馬非依存的な記憶へと変換された状態において、当該非ヒト動物に対し、前記恐怖条件付け文脈学習課題に用いたチャンバーに当該非ヒト動物を少なくとも10分間戻し、前記恐怖記憶を想起させて海馬における遺伝子発現を誘導させる第一工程と、
この第一工程後、当該非ヒト動物に対して海馬における神経新生を促す被検物質を腹腔内に連続的に投与する第二工程と、を含み、
当該非ヒト動物に対して被検物質が与える影響を、当該非ヒト動物における恐怖記憶の忘却を指標として検出する、心的外傷後ストレス障害の治療薬のスクリーニング方法。 - 前記第一工程は、前記非ヒト動物を恐怖条件付け文脈学習課題に供した後8週間後に行う、請求項1記載のスクリーニング方法。
- 前記第二工程における投与が、少なくとも週一回×4週間の連続的な投与である、請求項1又は2記載のスクリーニング方法。
- 前記遺伝子が、初期応答遺伝子である、請求項1〜3のいずれか一項記載のスクリーニング方法。
- 前記非ヒト動物が、齧歯類動物である、請求項1〜4のいずれか一項記載のスクリーニング方法。
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